JPS6362194B2

JPS6362194B2 -

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Publication number: JPS6362194B2
Application number: JP58585A
Authority: JP
Priority date: 1985-01-07
Filing date: 1985-01-07
Publication date: 1988-12-01
Also published as: JPS61162167A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明はセルラーゼ生産能の改良されたトルナ
フテート耐性をもつアクレモニウム・セルロリテ
イカス（Acremonium cellulolyticus）TN株に
関するものである。〔従来技術〕セルラーゼはセルロースをグルコース、セロビ
オースやセロオリゴ糖に加水分解する酵素反応系
を触媒する酵素群の総称であり、その作用様式に
より、C₁酵素（アビセラーゼ、セロビオヒドロ
ラーゼ、FPアーゼ、エキソ―β―グルカナーゼ
などともいう）、C_x酵素（CMCアーゼ、エンド―
β―グルカナーゼともいう）とβ―グルコシダー
ゼ（セロビアーゼともいう）など種々の名称で呼
ばれる酵素が存在する。セルラーゼはこれら複数
の酵素が調和のとれた相互作用をすることによ
り、セルロースを、最終的にはその構成種である
グルコースにまで分解する。近年、セルラーゼはバイオマス資源の有効利用
の観点から注目され、盛んに研究されているが、
従来、よく研究されてきた、トリコデルマ・レー
ゼイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビ
リデ（Trichoderma viride）やアスペルギルス
（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）
属などの微生物によるセルラーゼの生産は、その
生産能力が充分でなく、また、セルラーゼ自体の
分解力も充分でないため、セルロースを完全にグ
ルコースまで分解することができず、セロビオー
スやセロオリゴ糖を多量に生成残存するなどの問
題があつた。本発明者らは、先に結晶性セルロースに対する
分解力が優れ、且つグルコースの糖化能力の優れ
たセルラーゼ生産菌を求めて、広く自然界から微
生物の検索を行つてきた結果、土壌中より分離
し、アクレモニウム・セルロリテイカス
（Acremonium cellulolyticus）と同定した糸状
菌の生産するセルラーゼが、結晶性セルロースに
対する分解力が強いこと、またこの酵素はβ―グ
ルコシダーゼ活性が、従来よく知られているセル
ラーゼ生産菌に比べ著しく強いため、セルロース
を、殆んど完全にグルコースにまで分解できる。
極めて糖化性の優れた酵素であることを認め、特
許出願した（特許出願番号昭58−38432）。〔目的〕更に、この微生物によるセルラーゼの生産能を
高めるため、本微生物の改良について種々検討を
加えてきた結果、トルナフテート｛Tolnaftate，
（ｍ，Ｎ―Dimethyl thiocarbanilic acid ０―２
―naphthyl ester）｝に対して耐性を示す突然変
異株（Acremonium cellulolyticus TNと命名）
がセルラーゼ生産能を顕著に増大していることを
認めた。第１表は、Acremonium cellulolyticus
の親株とTN株によるセルラーゼ生産能の一例を
示している。

〔構成〕

本発明は、セルラーゼ生産能の増強されたトル
ナフテート耐性をもつアクレモニウム・セルロリ
テイカス（Acremonium cellulolyticus）TN株
に関するものである。以下、本発明の内容を更に
具体的に示す。本発明のトルナフテート耐性株は以下のように
して造成される。アクレモニウム・セルロリテイカス（FERMP
―6867）をツアペツク（Czapek）培地
（NaNO₃0.3％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄・7H₂O5
×10^-2％、KCl5×10^-2％、FeSO₄・7H₂O1×10^-3
％、グルコース１％）に懸濁し、これにNTG（ニ
トロソグアニジン）を０〜３×10^-2％濃度となる
ように加え、室温で0.5〜３時間インキユベート
後、遠心分離して菌体を回収し、Czapek培地で
充分洗滌後、同培地に懸濁した。該菌懸濁物の一
部を４×10^-2〜２×10^-5％トルナフテートを含む
Czapek平板培地（NaNO₃0.3％、K₂HPO₄0.1％、
MgSO₄・7H₂O5×10^-2％、KCl5×10^-2％、
FeSO₄・7H₂O1×10^-3％、グルコース１％、寒天
1.5％、ストレプトマイシン2.5×10^-2％、ペニシ
リンG2.5×10^-2％、PH5.6）に散布し、30℃でイ
ンキユベートした。生育してくるトルナフテート
耐性株を上記同組成の斜面培地に釣菌し保存し
た。このようにして得られたトルナフテート耐性
株中に、高頻度でセルラーゼ生産増強株が認めら
れた。なお、４×10^-2〜１×10^-2％のトルナフテ
ートを含むCzapeck平板培地上に親株および耐性
株の菌体懸濁液を散布して、30℃で培養したとこ
ろ、耐性菌は比較的良好に生育するが、親株は全
く生育が認められなかつた。本菌株は親株であるアクレモニウム・セルロリ
テイカスに対し、トルナフテート耐性を有する点
及びグルコシダーゼ活性が高い点で異なり、新規
なアクレモニウム・セルロリテイカスの変異株と
認められる。なお、その他の菌学的性質を以下に示す。生育：麦芽エキス寒天培地上では生育は速く、
30℃７日で直径70mmに達する。集落は最初白色で
後にやや黄色味をおびる。気生菌糸はゆるく盛り
上がり羊毛状を呈し、時に縄状の菌糸束を形成す
る。培養後期には集落裏面は桃褐色ないし赤褐色
を呈する。ツアペツク寒天培地上でもほぼ同様の
生育を示すが気生菌糸の盛り上がりはより少い。
生育PH範囲は3.5〜6.0で最適PHは４付近、生育温
度範囲は15℃〜43℃で、最適生育温度は30℃付近
である。形態：菌糸の直径は0.5〜2.5μm、無色で菌糸に
は隔壁が認められる。また、菌糸表面は滑面であ
る。分生子：分生子形成能は非常に不安定でツアペ
ツク寒天および麦芽エキス寒天培地による継代培
養により容易に消失した。分離時における観察で
は、分生子柄は気生菌糸側面より突出し、無色で
ある。分生子は亜球形（2.5〜５×２〜4.5μm）で
滑面、無色で連鎖は非常にゆるく分散しやすい。本菌株はアクレモニウム・セルロリテイカス
（Acremonium cellulolyticus）TN株（微工研条
寄第685号）として寄託されている。本菌により生産されるセルラーゼの性質を以下
に記載する。 (A) アビセラーゼの酵素的性質 (1) 作用セルロース末、アビセル、脱脂綿など結晶性の
高い不溶性セルロースに対し作用してグルコー
ス、セロビオース等の還元糖を生成する。 (2) 作用PH範囲及び最適作用PH 本酵素の作用PH範囲は２〜８、最適作用PHは約
4.5に認められた。 (3) 安定PH クエン酸―リン酸塩緩衝液の下で45℃で20時間
放置したときの安定PH範囲は約3.5〜約６であつ
た。 (4) 作用温度範囲及び最適作用温度本酵素は約90℃までの高温に作用するが、１％
アビセル、0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下で10
分間反応させたときの最適作用温度は約65℃に認
められた。 (5) 熱安定性本酵素を0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下で、
各温度で10分間加熱処理した結果、本酵素は約60
℃までの温度ではほとんど失活せず、65℃、10分
間の加熱で約50％、そして70℃、10分間の加熱で
約80％失活した。 (6) 阻害剤各種重金属イオンのうちで1mM以上の水銀イ
オンおよび銅イオンにより強く阻害される。ま
た、SH阻害剤であるパラクロルマーキユリーベ
ンゾエイトによつても1mMで約80％の阻害を受
ける。 (7) 精製法本酵素は培養濾液からホロフアイバー（アミコ
ンHI―P5）により脱塩濃縮してのち、DEAE―
セフアロース（CL―6B）によるカラムクロマト
グラフイー（NaCl ０→1Mグラジエント）と同
カラムによる再クロマトグラフイー（NaCl ０→
0.6M）により、より精製することができる。 (8) 分子量 Bio―gel（A0.5m）カラムによるゲル濾過法に
より測定した分子量は約140000であつた。 (9) 活性測定法 0.1M酢酸緩衝液に0.5％濃度のアビセル懸濁物
（PH4.5）0.5mlに適量の酵素液を加え、蒸留水で
全量1.0mlとし、50℃で反応を行つた。そして生
成する還元糖はソモギー・ネルソン法により測定
した。この条件で、１分間に1μmolのグルコースに相
当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。 (B) CMCアーゼの酵素的性質 (1) CMCアーゼの多成分性 CMCアーゼはデイスク電気泳動的に少くとも
４成分に分離され、それぞれは分子量と等電点に
より区別される。CMCアーゼは分子量約
160000で等電点5.08、以下同様には約160000、
4.95、は約120000、4.60、は約120000、4.48
であり、これらアイソザイムの複合物よりCMC
アーゼは成つている。 (2) カルボキシメチルセルロース（CMC）等の
可溶性セルロース誘導体に作用し、これをグルコ
ース及びセロビオース等に分解する成分（CMC
アーゼおよび）とグルコースを極くわずかし
か生成せずセロビオース以上のセロオリゴ糖に分
解する作用を持つ成分（CMCアーゼ、）が
存在する。 (3) 作用PH範囲及び最適作用PH CMCアーゼ複合体の作用PH範囲は、ほぼ２〜
８にわたり最適作用PHは約4.5に認められた。 (4) 安定PH クエン酸―リン酸塩緩衝液の下で45℃で20時間
放置したときのCMCアーゼ複合体の安定PH範囲
は約3.5〜約６であつた。 (5) 作用温度範囲及び最適作用温度このCMCアーゼ複合体は約90℃までの高温に
作用するが、１％CMC、0.05M酢酸緩衝液（PH
4.5）の下で10分間反応させたときの最適作用温
度は約65℃に認められた。 (6) 熱安定性本酵素を0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下で、
各温度で10分間加熱処理した結果、本酵素は約60
℃までの温度ではほとんど失活せず、65℃、10分
間の加熱で約40％、そして70℃、10分間の加熱で
約70％失活した。 (7) 阻害剤各種金属イオンのうちで1mM以上の水銀イオ
ンおよび銅イオンにより強く阻害される。 (8) 精製法本酵素は培養濾液からホロフアイバー（アミコ
ンHI―P5）により脱塩濃縮してのち、DEAE―
セフアロース（CL―6B）によるカラムクロマト
グラフイー（NaCl0→1Mグラジエント）と同カ
ラムによる再クロマトグラフイー及びクロマトフ
オーカシングにより各成分に精製できる。 (9) 活性測定法 0.1M酢酸緩衝液に溶解させた１％CMC溶液
（PH4.5）0.5mlに、適量の酵素液を加え、蒸留水
で全量1.0mlとし、50℃で反応を行つた。そして、
生成する還元糖はソモギー・ネルソン法により測
定した。この条件で、１分間に1μmolのグルコースに相
当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。 (C) β―グルコシダーゼの酵素的性質 (1) 作用サリシン、セロビオース、セロトリオース、セ
ロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサ
オースのようなセロオリゴ糖に作用して、これを
グルコースに分解する。また、本酵素はアビセル
のような高分子セルロースにも作用するがCMC
やHEC（ヒドロキシエチルセルロース）にはほと
んど作用しない。サリシン、セロビオース、セロ
トリオース、セロテトラオース、セロペンタオー
ス及びセロヘキサオースに対するKm値は、それぞ
れ3.40、2.26、1.19、0.82、0.52そして0.51mMで
あつた。 (2) 作用PH範囲及び最適作用PH 本酵素の作用PH範囲は２〜８、最適作用PHは約
4.5に認められた。 (3) 安定PH クエン酸―リン酸塩緩衝液の下で45℃で20時間
放置したときの安定PH範囲は約3.5〜約５であつ
た。 (4) 作用温度範囲及び最適作用温度本酵素は約90℃までの高温に作用するが、１％
サリシン、0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下で10
分間反応させたときの最適作用温度は約65℃に認
められた。 (5) 熱安定性 0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下で、各温度で
10分間加熱処理した結果、本酵素は約65℃までの
高温ではほとんど失活せず、70℃、10分間の加熱
で約40％失活し、そして80℃、10分間の加熱で90
％以上失活した。 (6) 阻害剤各種重金属イオンのうち1mM以上の水銀イオ
ンおよび銅イオンにより強く阻害される。また、
グルコース―δ―ラクトンは基質に対して拮抗阻
害剤として作用する。 (7) 精製法本酵素は培養濾液からホロフアイバー（アミコ
ンHI―P5）により脱塩濃縮したのち、DEAE―
セフアロース（CL―6B）によるカラムクロマト
グラフイー（NaCl ０→1Mグラジエント）とク
ロマトフオーカシング（PH６→４）とBio―gel
（A0.5m）によるゲル濾過により、電気泳動的に
均一なまでに精製することができる。 (8) 分子量 Bio―gel（Ａ 0.5m）を用いるゲル濾過法によ
り測定した分子量は約240000であつた。 (9) 活性測定法 0.1M酢酸緩衝液に溶解させた１％サリシン溶
液（PH4.5）0.5mlに適量の酵素液を加え、蒸留水
で全量1.0mlとし、50℃で反応を行つた。そして
生成するグルコースをソモギー・ネルソン法によ
り測定した。この条件で、１分間に1μmolのグルコースに相
当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。アクレモニウムセルロリテイカスTN株の培養
は、炭素源として、セルロース、アビセル、綿、
バガス、小麦〓のような純セルロースまたはセル
ロース含有物が使用され、これに窒素源として、
硝酸塩、アンモニウム塩、尿素のような無機窒素
またはペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕
のような有機窒素源のいずれか、または併用して
使用する。更に、これに補足する培地原料とし
て、マンガン、亜鉛などの金属塩などが添加され
た培地で行われるが、この培地に対し、ベタイン
を0.01〜１％程度添加する。培養は固体培養また
は液体培養のいずれでもよいが通常、20〜40℃で
２〜15日間好気的に培養される。セルラーゼは菌体外に生産される酵素であるの
で、液体培養の場合、培養後、濾過または遠心分
離して得た除菌液について、また、固体培養の場
合は、培養後、水または適当な塩類溶液で抽出し
た酵素液について、硫安または硫酸ナトリウムな
どで沈澱させるか、あるいはアセトン、アルコー
ルのような有機溶媒を添加してセルラーゼを沈澱
させ、分離、乾燥して酵素粉末を得る。次に、実施例により本発明の詳細を説明する。実施例１セルロース４％、K₂HPO₄1.2％、バクトペプ
トン１％、KNO₃0.6％、尿素0.2％、KCl0.16％、
MgSO₄・7H₂O0.12％、ZnSO₄・7H₂O1×10^- ₃％、
MnSO₄・7H₂O1×10^-3％、CuSO₄・5H₂O1×
10^-3からなる培地（PH４）を常法により殺菌後、
アクレモニウム・セルロリテイカスTN（FERM
BP―685）または親株アクレモニウムセルロリ
テイカス（FERM Ｐ―6867）を接種し、30℃で
10日間好気的に培養した。培養後、遠心分離して
得た上澄液について生産されたセルラーゼのアビ
セラーゼ、CMCアーゼ及びβ―グルコシダーゼ
活性を測定した。結果は第２表に示す通りであつ
た。

【表】表から明らかなように、トルナフテート耐性株
（TN株）のセルラーゼ生産能は、親株に比べ、
CMCアーゼが約３倍に、そしてアビセラーゼと
β―グルコシダーゼは約２倍に増大したものであ
つた。

Claims

【特許請求の範囲】

１トルナフテート耐性をもつアクレモニウム・
セルロリテイカス（Acremoniunm
cellulolyticus）TN株。