JPH0238B2

JPH0238B2 -

Info

Publication number: JPH0238B2
Application number: JP60000584A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Mitsuishi; Hitoshi Yamabe; Yoshuki Takasaki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-01-07
Filing date: 1985-01-07
Publication date: 1990-01-05
Also published as: JPS61162196A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明はトルナフテートに対して耐性をもつ新
規微生物アクレモニウム・セルロリテイカスTN
（Acremonium celllulolyticus TN）の生産する
セルラーゼによるセラルロースの処理方法に関す
るものである。〔従来技術〕セルラーゼはセルロースをグルコース、セロビ
オースやセロオリゴ糖に加水分解する酵素反応系
を触媒する酵素群の総称であり、その作用様式に
より、C₁酵素（アビセラーゼ、セロビオヒドロ
ラーゼ、FPアーゼ、エキソ−β−グルカナーゼ
などともいう）、Cx酵素（CMCアーゼ、エンド
−β−グルカナーゼともいう）とβ−グルコシダ
ーゼ（セロビアーゼともいう）など種々の名称で
呼ばれる酵素が存在する。セルラーゼはこれら複
数の酵素が調和のとれた相互作用をすることによ
り、セルロースを、最終的にはその構成種である
グルコースにまで分解する。近年、セルラーゼはバイオマス資源の有効利用
の観点から注目され、盛んに研究されているが、
従来、よく研究されてきた、トリコデルマ・レー
ゼイ（Trechoderma reesei）、トリコデルマ・
ビリデ（Trechoderma viride）やアスペルギル
ス（Aspergillus）属、ペニシリウム
（Penicillium）属などの微生物によるセルラーゼ
の生産は、その生産能力が充分でなく、また、セ
ルラーゼ自体の分解力も充分でなく、また、セル
ラーゼ自体の分解力も充分でないため、セルロー
スを完全にグルコースまで分解することができ
ず、セロビオースやセロオリゴ糖を多量に生成残
存するなどの問題があつた。本発明者らは、結晶性セルロースに対する分解
力が優れ、且つグルコースの糖化能力の優れたセ
ルラーゼ生産菌を求めて、広く自然界から微生物
の検索を行つてきた結果、土壌中より分離し、ア
クレモニウム・セルロリテイカス
（Acremonium cellulolyticus）と同定した糸状
菌の生産するセルラーゼが結晶性セルロースに対
する分解力が強いこと、またこの酵素はβ−グル
コシダーゼ活性が、従来よく知られているセルラ
ーゼ生産菌に比べ著しく強いため、セルロース
を、殆んど完全にグルコースにまで分解できる、
極めて糖化性の優れた酵素であることを認め、特
許出願した（特許出願番号昭58−38432（特開昭59
−166082号））しかし、セルラーゼの生産能は充
分でないため、セルロースの糖化に使用できるよ
うな価格でセルラーゼを製造することはできなか
つた。〔目的〕そこで、この微生物によるセルラーゼの生産能
を高めるための微生物の改良方法について種々検
討を行なつてきた結果、NTG（ニトロソグアニジ
ン）処理またはUV（紫外線）処理した突然変異
株の中から、トルナフテート｛tolnaftate、（ｍ，
Ｎ−dimethylthiocarbanilic acid ０−２−
naphthyl ester）｝に対する耐性により選択した
変異株（Acremonium cellulolyticus TNと命
名）が、セルラーゼ生産能が単位培地当り約３培
に増強していることを認めた。そして、この酵素
を用い、セルロースの糖化を行なつたところ、親
株の培養液に対し、約1/3の使用量で、セルロー
スをほぼ完全にグルコースまで分解できることを
認めた。第１表はAcremonium cellulolyticusの親株と
TN株によるセルラーゼ生産能の比較の一例を示
している。

〔構成〕

すなわち、本発明は、トルナフテートに対し耐
性をもつ新規微生物アクレモニウム・セルロリテ
イカス（Acremonium cellulolyticus）TNをセ
ルロースを含む培地で培養し、培養物から得られ
るセルラーゼをセルロースまたはセルロース含有
物に作用させることを特徴とするセルロースの糖
化方法に関するものである。以下に、本発明の内容を更に具体的に示す。本発明において使用されるトルナフテート耐性
株は以下のようにして造成され。アクレモニウム・セルロリテイカス（FERMP−
6867）をツアペツク（Czapek）培地（NaNo₃0.3
％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄・7H₂O5×10^-2％、
KCl5×10^-2％、FeSO₄・7H₂O1×10^-3％、グル
コース１％）に懸濁し、これにNTG（ニトロソグ
アニジン）を０〜３×10^-2％濃度となるように加
え、室温で0.5〜３時間インキユベート後、遠心
分離して菌体を回収し、Czapek培地で充分洗滌
後、同培地に懸濁した。該菌懸濁物の一部を４×
10_- ³〜２×10^-5％トルナフテートを含むCzapek
平板培地（NaNO³0.3％、K₂HPO₄、0.1％、
MgSC₄・7H₂O5×10^-2％、KCl5×10^-2％、
FeSO₄・7H₂O1×10^-3％、グルコース１％、寒天
1.5％、ストレプトマイシン2.5×10^-2％、ペニシ
リンG2.5×10^-2％のPH5.6）に散布し、30℃でイ
ンキユベートした。生育してくるトルナフテート
耐性株を上記同組成の斜面培地に釣菌し保持し
た。このようにして得られたトルナフテート耐性
株中に、高頻度でセルラーゼ生産増進強株が認め
られた。なお、４×10^-2〜１×10^-2％のトルナフ
テートを含むCzapeck平板培地上に親株および耐
性株の菌体懸濁液を散布して、30℃で培養したと
ころ、耐性菌は比較的良好に生育するが、親株は
全く生育が認められなかつた。本菌の菌学的性質は親株に対して認識できるほ
どの差異は認められないが、以下にTN株の菌学
的性質の概要を記載する。生育：麦芽エキス寒天培地上では生育は速く、
30℃７日で直径70mmに達する。集落は最初白色で
後にやや黄色味をおびる。気生菌糸はゆるく盛り
上がり羊毛状を呈し、時に縄状の菌糸束を形成す
る。培養後期には集落裏面は桃褐色ないし赤褐色
を呈する。ツアペツク寒天培地上でもほぼ同様の
生育を示すが気生菌糸の盛り上がりはより少い。
生育PH範囲は3.5〜6.0で最適PHは４付近、生育温
度範囲は15℃〜43℃で、最適生育温度は30℃付近
である。形態：菌糸の直径は0.5〜2.5μｍ、無色で菌糸
には隔壁が認められる。また、菌糸表面は滑面で
ある。分生子：分生子形成能は非常に不安定でツアペ
ツク寒天および麦芽エキス寒天培地による継代培
養により容易に消失した。分離時における観察で
は、分生子柄は気生菌糸側面より突出し、無色で
ある。分生子は亜球形（2.5〜５×２〜4.5μｍ）
で滑面、無色で連鎖は非常にゆるく分散しやす
い。本菌株はアクレモニウム・セルロリテイカス
TN（Acremonium cellulolyticus TN）微工研
条寄第685号として寄託されている。本菌により生産されるセルラーゼの性質を以下
に記載する。 (A) アビセラーゼの酵素的性質 (1) 作用セルロース末、アビセル、脱脂綿など結晶
性の高い不溶性セルロースに対し作用してグ
ルコース、セロビオース等の還元糖を生成す
る。 (2) 作用PH範囲及び最適作用PH 本酵素の作用PH範囲は２〜８、最適作用PH
は約4.5に認められた。 (3) 安定PH クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で45℃で20
時間放置したときの安定PH範囲は約3.5〜約
６であつた。 (4) 作用温度範囲及び最適作用温度本酵素は約90℃までの高温に作用するが、
１％アビセル、0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）
の下で10分間反応させたときの最適作用温度
は約65℃に認められた。 (5) 熱安定性本酵素を0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下
で、各温度で10分間加熱処理した結果、本酵
素は約60℃までの温度ではほとんど失活せ
ず、65℃、10分間の加熱で約50％、そして70
℃、10分間の加熱で約80％失活した。 (6) 阻害剤各種重合属イオンのうちで１ｍＭ以上の水
銀イオンおよび銅イオンにより強く阻害され
る。また、SH阻害剤であるパラクロルマー
キユリーベンゾエイトによつても１ｍＭで約
80％の阻害を受ける。 (7) 精製法本酵素は培養濾液からホロフアイバー（ア
ミコンHI−P5）により脱塩濃縮してのち、
DEAE−セフアロース（CL−6B）によるカ
ラムクロマトグラフイー（NaCl Ｏ→1Mグ
ラジエント）と同カラムによる再クロマトグ
ラフイー（Nacl Ｏ→0.6M）により、精製
することができる。 (8) 分子量 Bio−gel（Ａ 0.5ｍ）カラムによるゲル濾
過法により測定した分子量は約140000であつ
た。 (9) 活性測定法 0.1M酢酸緩衝液に0.5濃度のアビセル懸濁
物（PH4.5）0.5mlに適量の酵素液を加え、蒸
留水で全量1.0mlとし、50℃で反応を行つた。
そして生成する還元糖はソモギー・ネルソン
法により測定した。この条件で、１分間に1μmolのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を１単位
とした。 (B) CMCアーゼの酵素的性質 (1) CMCアーゼの多成分性 CMCアーゼはデイスク電気泳動的に少く
とも４成分に分離され、それぞれは分子量と
等電点により区別される。CMCアーゼは
分子量約160000で等電点5.08、以下同様に
は約160000、4.95、は約120000、4.60、
は約120000、4.48であり、これらアイソザイ
ムの複合物よりCMCアーゼは成つている。 (2) カルボキシメチルセルロース（CMC）等
の可溶性セルロース誘導体に作用し、これを
グルコース及びセロビオース等に分解する成
分（CMCアーゼおよび）とグルコース
を極くわずかしか生成せずセロビオース以上
のオリゴ糖に分解する作用を持つ成分
（CMCアーゼ、）が存在する。 (3) 作用PH範囲及び最適作用PH CMCアーゼ複合体の作用PH範囲は、ほぼ
２〜８にわたり最適作用PHは約4.5に認めら
れた。 (4) 安定PH クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で45℃で20
時間放置したときのCMCアーゼ複合体の安
定PH範囲は約3.5〜６であつた。 (5) 作用温度範囲及び最適作用温度このCMCアーゼ複合体は約90℃までの高
温に作用するが、１％CMC、0.05M酢酸緩
衝液（PH4.5）の下で10分間反応させたとき
の最適作用温度は約65℃に認められた。 (6) 熱安定性本酵素を0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下
で各温度で10分間加熱処理した結果、本酵素
は約60℃までの温度ではほとんど失活せず、
65℃、10分間の加熱で約40％、そして70℃、
10分間の加熱で約70％失活した。 (7) 阻害剤各種金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水銀
イオンおよび銅イオンにより強く阻害され
る。 (8) 精製法本酵素は培養濾液からホロフアイバー（ア
ミコンHI−P5）により脱塩濃縮してのち、
DEAE−セフアロース（CL−6B）によるカ
ラムクロマトグラフイー（NaCl Ｏ→1Mグ
ラジエント）と同カラムによる再クロマトグ
ラフイー及びクロマトフオーカシングにより
各成分に精製できる。 (9) 活性測定法 0.1M酢酸緩衝液に溶解させた１％CMC溶
液（PH4.5）0.5mlに、適量の酵素液を加え、
蒸留水で全量1.0mlとし、50℃で反応を行つ
た。そして、生成する還元糖はソモギー・ネ
ルソン法により測定した。この条件で、１分間に1μmolのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を１単位
とした。 (C) β−グルコシダーゼの酵素的性質 (1) 作用サシリン、セロビオース、セロトリオー
ス、セロテトラオース、セロペンタオース、
セロヘキサオースのようなセロオリゴ糖に作
用して、これをグルコースに分解する。ま
た、本酵素はアビセルのような高分子セルロ
ースにも作用するがCMCやHEC（ヒドロキ
シエチルセルロース）にはほとんど作用しな
い。サリシン、セロビオース、セロトリオー
ス、セロテトラオース、セロペンタオース及
びセロヘキサオースに対するＫｍ値は、それ
ぞれ3.40、2.26、1.19、0.82、0.52そして0.51
ｍＭであつた。 (2) 作用PH範囲及び最適作用PH 本酵素の作用PH範囲は２〜８、最適作用PH
は約4.5に認められた。 (3) 安定PH クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で45℃で20
時間放置したときの安定PH範囲は約3.5〜５
であつた。 (4) 作用温度範囲及び最適作用温度本酵素は約90℃までの高温に作用するが、
１％サリシン、0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）
の下で10分間反応させたときの最適作用温度
は約65℃に認められた。 (5) 熱安定性 0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下で、各温
度で10分間加熱処理した結果、本酵素は約60
℃までの温度ではほとんど失活せず、70℃、
10分間の加熱で約40％失活し、そして80℃、
10分間の加熱で約90％以上失活した。 (6) 阻害剤各種重合属イオンのうちで１ｍＭ以上の水
銀イオンおよび銅イオンにより強く阻害され
る。また、グルコース−δ−ラクトンは基質
に対して拮抗阻害剤として作用する。 (7) 精製法本酵素は培養濾液からホロフアイバー（ア
ミコンHI−P5）により脱塩濃縮してのち、
DEAE−セフアロース（CL−6B）によるカ
ラムクロマトグラフイー（NaCl Ｏ→1Mグ
ラジエント）とクロマトフオーカシング（PH
６→４）とBio−gel（Ａ 0.5ｍ）によるゲル
濾過により、電気泳動的に均一なまでに精製
することができる。 (8) 分子量 Bio−gel（Ａ 0.5ｍ）を用いるゲル濾過法
により測定した分子量は約240000であつた。 (9) 活性測定法 0.1M酢酸緩衝液に溶解させた１％サリシ
ン溶液（PH4.5）0.5mlに適量の酵素液を加
え、蒸留水で全量1.0mlとし、50℃で反応を
行つた。そして生成するグルコースをソモギ
ー・ネルソン法により測定した。この条件で、１分間に1μmolのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を１単位
とした。アクレモニウム・セルロリテイカスTN株の培
養は、炭素源として、セルロース、アビセル、
綿、バガス、小麦〓のような純セルロースまたは
セルロース含有物が使用され、これに窒素源とし
て、硝酸塩、アンモニウム塩、尿素のような無機
窒素またはペプトン、酵母エキス、肉エキス、大
豆粕のような有機窒素源のいずれか、または併用
して使用する。更に、これに補足する培地原料と
して、マンガン、亜鉛などの金属塩などが添加さ
れた倍地で行われるが、この培地に対し、ベタイ
ンを0.01〜１％程度添加する。倍養は固体培養ま
たは液体培養のいずれでもよいが通常、20〜40℃
で２〜15日間好気的に培養される。セルラーゼは菌体外に生産される酵素であるの
で、液体培養の場合、培養後、濾過または遠心分
離して得た除菌液について、また、固体培養の場
合は、培養後、水または適当な塩類溶液で抽出し
た酵素液について、硫安または硫酸ナトリウムな
どで沈澱させるが、あるいはアセトン、アルコー
ルのような有機溶媒を添加してセルラーゼを沈澱
させ、分離、乾燥して酵素粉末を得る。本発明のセルラーゼ剤により、セルロースを糖
化する反応は、通常、PH３〜７、望ましくはPH４
〜５、温度は、通常30〜60℃で行なわれる。基質
としては、セルロース末、綿、アビセルのような
純枠のセルロースのみでなく、バガス、ナピヤグ
ラス、稲ワラ、麦ワラ、モミガラなどのセルロー
スに含有物も使用されるが、これら植物原料は糖
化に先立ち、あらかじめ、アルカリ処理、爆砕処
理、放射線処理などの前処理が行なわれる。基質
濃度は、出来るだけ高濃度の方がよく、通常５〜
30％位で行なわれる。次に、実施例により本発明の詳細を説明する。実施例１セルロース４％、K₂HPO₄1.2％、バクトペプ
トン１％、KNO₃0.6％、尿素0.2％、KCl0.16％、
MgSO₄・7H₂O0−12％、ZnSO₄・7H₂O1×10^-3
％、CuSO₄・5H₂O1×10^-3からなる倍地（PH４）
を常法により殺菌後、アクレモニウム・セルロリ
テイカス TN（FERM BP−685）を接種し、30
℃で10日間好気的に培養した。培養後、遠心分離
して得た上澄液について、生産されたセルラーゼ
のアビセラーゼ、CMCアーゼ及びβ−グルコシ
ダーゼ活性を測定した。結果は第２表に示す通り
であつた。

【表】表から明らかなように、トルナフテート耐性株
（TN株）のセルラーゼ生産能は親株に比べ、
CMCアーゼが約３倍に、そして、アビセラーゼ
とβ−グルコシダーゼは約２倍に増大したもので
あつた。実施例２セルロース原料としてKCフロツク（Ｗ−100、
山陽国策パルプ製）使用した。 KCフロツク各３ｇに、実施例１の方法により
培養、調製したセルラーゼを、アビセラーゼとし
て、15単位、30単位及び60単位を加え、全量を水
で15mlとして、PH約５、50℃で反応させた。反応
開始95時間目に糖化液の一部をとり、還元糖をソ
モギー・ネルソン法により、そして全糖はアンス
ロン法により定量した。得られた結果を第３表に
示す。

【表】実施例３セルロース原料としてSolka Floc（Bw−200、
James River Co.、Berlin製）を原料として使用
した。 Solka Flocを0.5ｇと１ｇに、実施例１により
調製されたセルラーゼを、アビセラーゼとして40
単位／ｇ基質量加え、全量10mlとしPH4.5、温度
50℃で48時間糖化した。得られた糖液について還
元糖、グルコース量を測定した結果は第４表に示
す通りであつた。

【表】実施例４セルロース原料としてアルカリ膨潤セルロース
（17.5％ NaOHにセルロース末を25℃で４時間
浸漬後、水洗）を終濃度9.0、18.0、27.0％となる
ように反応液に懸濁し、実施例１により調製され
たセルラーゼをアビセラーゼとして、５単位／ｇ
基質量加え、全量を５mlとし、PH4.5、温度50℃
で72時間糖化した。得られた糖液について還元糖
量と全糖量を測定した結果は第５表に示す通りで
あつた。

【表】実施例５セルロース含有物として、過酢酸により脱リグ
ニン処理した牧草のナピヤグラスを、終濃度２、
５、７％となるように反応液に懸濁し、実施例１
により調製されたセルラーゼを、アビセラーゼと
して、20単位／ｇ基質量加え、全量を５mlとし
て、PH4.5、温度50℃で24時間糖化した。得られ
た糖液について、還元糖量と全糖量を測定した結
果は第６表に示す通りであつた。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１トルナフテート耐性をもつアクレモニウム・
セルロリテイカスTN（Acremonium
cellulolyticus TN）を炭素源と窒素源を含む培
地で培養し、培養物から得られるセルラーゼをセ
ルロースまたはセルロース含有物に作用させるこ
とを特徴とするセルロースの糖化法。