JPH0112476B2

JPH0112476B2 -

Info

Publication number: JPH0112476B2
Application number: JP58385A
Authority: JP
Inventors: Yoshuki Takasaki; Hitoshi Yamabe; Yasushi Mitsuishi
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-01-07
Filing date: 1985-01-07
Publication date: 1989-03-01
Also published as: JPS61162179A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明は、糸状菌によるセルラーゼの製造方法
に関するものである。〔従来技術〕セルラーゼはセルロースをグルコースまたはセ
ロビオースなどセロオリゴ糖分まで分解する酵素
反応系を触媒する酵素群の総称であり、その作用
様式により、C₁−酵素、Cx−酵素とβ−グリコ
シダーゼあるいはエクソーβ−グルカナーゼ、エ
ンドーβ−グルカナーゼとセロビアーゼなど種々
の名称で呼ばれる、少なくとも３種以上の酵素群
から構成されている。近年、セルラーゼはバイオマス資源の有効利用
の観点から注目され、セルロースの糖化が盛んに
研究されているが、従来、セルラーゼ生産菌とし
てよく知られているトリコデルマ属、アスペルギ
ルス属、ペニシリウム属などの微生物はセルラー
ゼの生産能が十分でないため、酵素の生産コスト
が高く、バイオマス資源の糖化に使用するに至つ
ていない。本発明者らは、先に、結晶性セルロースに対す
る分解力とグルコースへの転換能が優れ、且つ熱
安定性にも優れたセルラーゼ生産菌｛アクレモニ
ウム（Acremonium）属菌｝を分離した。そし
て本菌の生産するセルラーゼを工業的に使用すべ
く、微生物の培養方法について鋭意研究を続けて
きた結果、セルラーゼを生産する糸状菌をベタイ
ンの存在下で培養すると、セルラーゼの生産量、
特に、エンド−β−グルカナーゼ｛（カルボキシ
メチルセルラーゼ（CMCアーゼ）｝とβ−グリコ
シダーゼの生産量が顕著にも増加できることを認
めた。本発明は、この知見にもとずいてなされた
ものである。〔目的〕従つて、本発明の目的は、セルラーゼの改良生
産方法を提供することにある。〔構成〕本発明はセルラーゼ生産能をもつ糸状菌を培養
して、セルラーゼを生産するに際し、ベタインの存在下で培養することを特徴とするセ
ルラーゼの生産方法に関するものである。以下に本発明の詳細を説明する。ベタインはトリアルキルアミノ酸の総称であり
第四級アンモニウムを含む両性電解質である。ベ
タインは動物、植物に広く存在し、特にサトウダ
イコンの糖蜜中に豊富に存在しているが、グリシ
ンからの化合物によつても容易に得ることができ
る。ベタインは、培地に対し、0.01％以下の添加で
十分効果を示すが、通常0.01〜１％程度添加する
と、無添加の場合に比べセルラーゼ、特にカルボ
キシメチルセルラーゼとβ−グルコシダーゼの生
産量が10〜50％増加する。本発明に使用される糸状菌としては、トリコデ
ルマ属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ス
ポロトリクム属などのセルラーゼ生産菌の他、本
発明者らにより新たに分離されたアクレモニウム
属のセルラーゼ生産菌などを挙げることができる
が本発明では例示菌として、アクレモニウム・セ
ルロリテイカスTN（Acremonium
celluloliticus）を使用する。本菌は、FERMBP
−685として工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている。本菌の菌学的性質の概要は下記の通りである。生育：麦芽エキス寒天上では生育は速く、30℃
７日で直径70mmに達する。集落は最初白色で後に
やや黄色味をおびる。気生菌糸はゆるく盛り上が
り羊毛状を呈し、時に縄状の菌糸束を形成する。
培養後期には集落裏面は桃褐色ないし赤褐色を呈
する。ツアペツク寒天上でもほぼ同様の生育を示
すが気生菌糸の盛り上がりはより少い。生育PH範
囲は3.5〜6.0で最適PHは４付近、生育温度範囲は
15℃〜43℃で、最適生育温度は30℃付近である。形態：菌糸の直径は0.5〜2.5μｍ、無色で菌糸
には隔壁が認められる。また、菌糸表面は滑面で
ある。分生子：分生子形成能は非常に不安定でツアペ
ツク寒天および麦芽エキス寒天培地による継代培
養により容易に消失した。分離時における観察で
は、分生子柄は気生菌糸側面より突出し、無色で
ある。分生子は亜球形（2.5〜５×２〜4.5μｍ）
で滑面、無色で連鎖は非常にゆるく分散しやす
い。以上の菌学的性質について、W.Gamsの
「Cephalosporium artige Schimmelpilge」p84、
G.Fisher（1971年）及びC.H.Dickinson、Mycol.
Papers115p10（1968年）を参照し、本菌をアクレ
モニウム・セルロリテイカスTN（Acremonium
cellulolyticus）と同定した。本菌の生産するセルラーゼの酵素的性質は下記
に示す通りである。 (A) アビセラーゼの酵素的性質 (1) 作用セルロース末、アビセル、脱脂綿など結晶
性の高い不溶性セルロースに対し作用してグ
ルコース、セロビオース等の還元糖を生成す
る。 (2) 作用PH及び最適作用PH 本酵素の作用PH範囲は２〜８、最適作用PH
は約4.5に認められた。 (3) 安定PH クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で45℃で20
時間放置したときの安定PH範囲は約3.5〜約
６であつた。 (4) 作用温度範囲及び最適作用温度水酵素は約90℃までの高温に作用するが、
１％アビセル、0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）
の下で10分間反応させたときの最適作用温度
は約65℃に認められた。 (5) 熱安定性本酵素を0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下
で、各温度で10分間加熱処理した結果、本酵
素は約60℃までの温度ではほとんど失活せ
ず、65℃、10分間の加熱で約50％、そして70
℃、10分間の加熱で約80％失活した。 (6) 阻害剤各種金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水銀
イオンおよび銅イオンにより強く阻害され
る。また、SH阻害剤であるパラクロルマー
キユリーベンゾエイトによつても１ｍＭで約
80％の阻害を受ける。 (7) 精製法本酵素は培養濾液からホロフアイバー（ア
ミコンHI−P5）により脱塩濃縮してのち、
DEAE−セフアロース（CL−6B）によるカ
ラムクロマトグラフイー（NaCl ０→1Mグ
ラジエント）と同カラムによる再クロマトグ
ラフイー（NaCl ０→0.6M）により、より
精製することができる。 (8) 分子量 Bio−gel（Ａ 0.5ｍ）カラムによるゲル濾
過法により測定した分子量は約140000であつ
た。 (9) 活性測定法 0.1M酢酸緩衝液に0.5％濃度のアビセル懸
濁物（PH4.5）0.5mlに適量の酵素液を加え、
蒸留水で全量1.0mlとし、50℃で反応を行つ
た。そして生成する還元糖はソモギー・ネル
ソン法により測定した。この条件で、１分間に1μmolのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を１単位
とした。 (B) CMCアーゼの酵素的性質 (1) CMCアーゼの多成分性 CMCアーゼはデイスク電気泳動的に少く
とも４成分に分離され、それぞれは分子量と
等電点により区別される。CMCアーゼは
分子量約160000で等電点5.08、以下同様に
は約160000、4.95、は約120000、4.60、
は約120000、4.48であり、これらアイソザイ
ムの複合物よりCMCアーゼは成つている。 (2) カルボキシメチルセルロース（CMC）等
の可溶性セルロース誘導体に作用し、これを
グルコース及びセロビオース等に分解する成
分（CMCアーゼおよび）とグルコース
を極くわずかしか生成せずセロビオース以上
のセロオリゴ糖に分解する作用を持つ成分
（CMCアーゼ、）が存在する。 (3) 作用PH及び最適作用PH CMCアーゼ複合体の作用PH範囲は、ほぼ
２〜８にわたり最適作用PHは約4.5に認めら
れた。 (4) 安定PH クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で45℃で20
時間放置したときのCMCアーゼ複合体の安
定PH範囲は約3.5〜約６であつた。 (5) 作用温度範囲及び最適作用温度このCMCアーゼ複合体は約90℃までの高
温に作用するが、１％CMC、0.05M酢酸緩
衝液（PH4.5）の下で10分間反応させたとき
の最適作用温度は約65℃に認められた。 (6) 熱安定性本酵素を0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下
で、各温度で10分間加熱処理した結果、本酵
素は約60℃までの温度ではほとんど失活せ
ず、65℃、10分間の加熱で約40％、そして70
℃、10分間の加熱で約70％失活した。 (7) 阻害剤各種金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水銀
イオンおよび銅イオンにより強く阻害され
る。 (8) 精製法水酵素は培養濾液からホロフアイバー（ア
ミコンHI−P5）により脱塩濃縮してのち、
DEAE−セフアロース（CL−6B）によるカ
ラムクロマトグラフイー（NaCl0→1Mグラ
ジエント）と同カラムによる再クロマトグラ
フイー及びクロマトフオーカスシングにより
各成分に精製できる。 (9) 活性測定法 0.1M酢酸緩衝液に溶解させた１％CMC溶
液（PH4.5）0.5mlに、適量の酵素液を加え、
蒸留水で全量1.0mlとし、50℃で反応を行つ
た。そして、生成する還元糖はソモギー・ネ
ルソン法により測定した。この条件で、１分間に1μmolのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を１単位
とした。 (C) β−グルコシダーゼの酵素的性質 (1) 作用サリシン、セロビオース、セロトリオー
ス、セロテトラオース、セロペンタオース、
セロヘキサオースのようなセロオリゴ糖に作
用して、これをグルコースに分離する。ま
た、本酵素はアビセルのような高分子セルロ
ースにも作用するがCMCやHEC（ヒドロキ
シエチルセルロース）にはほとんど作用しな
い。サリシン、セロビオース、セロトリオー
ス、セロテトラオース、セロペンタオース及
びセロヘキサオースに対するKm値は、それぞ
れ3.40、2.26、1.19、0.82、0.52そして0.51ｍ
Ｍであつた。 (2) 作用PH及び最適作用PH 本酵素の作用PH範囲は２〜８、最適作用PH
は約4.5に認められた。 (3) 安定PH クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で45℃で20
時間放置したときの安定剤PH範囲は約3.5〜
約５であつた。 (4) 作用温度範囲及び最適作用温度本酵素は約90℃までの高温に作用するが、
１％サリシン、0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）
の下で10分間反応させたときの最適作用温度
は約65℃に認められた。 (5) 熱安定性 0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下で、各温
度で10分間加熱処理した結果、本酵素は約65
℃までの高温ではほとんど失活せず、70℃、
10分間の加熱で約40℃失活し、そして80℃、
10分間の加熱で90％以上失活した。 (6) 阻害剤各種重金属イオンのうち１ｍＭ以上の水銀
イオンおよび銅イオンにより強く阻害され
る。また、グルコノ−δ−ラクトンは基質に
対して拮抗阻害剤として作用する。 (7) 精製法本酵素は培養濾液からホロフアイバー（ア
ミコンHI−P5）により脱塩濃縮したのち、
DEAE−セフアロース（CL−6B）によるカ
ラムクロマトグラフイー（NaCl ０→1Mグ
ラジエント）とクロマトフオーカシング（PH
６→４）とBio−gel（A0.5ｍ）によるゲル濾
過により、電気泳動的に均一まで精製するこ
とができる。 (8) 分子量 Bio−gel（A0.5ｍ）を用いるゲル濾過法に
より測定した分子量は約240000であつた。 (9) 活性測定法 0.1M酢酸緩衝液に溶解させた２％サリシ
ン溶液（PH4.5）0.5mlに適量の酵素液を加
え、蒸留水で全量1.0mlとし、50℃で反応を
行つた。そして生成するグルコースをソモギ
ー・ネルソン法により測定した。この条件で、１分間に1μmolのグルコースに相
当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。セルラーゼ生産菌の培養は、炭素源として、セ
ルロース、アビセル、綿、バガス、小麦〓のよう
な純セルロースまたはセルロース含有物が使用さ
れ、これに窒素源として、硝酸塩、アンモニウム
塩、尿素のような無機窒素またはペプトン、酵母
エキス、肉エキス、大豆粕のような有機窒素源の
いずれか、または併用して使用する。更に、これ
に補足する培地原料として、マンガン、亜鉛など
の金属塩などが添加された培地で行われるが、こ
の培地に対し、ベタインを0.01〜１％程度添加す
る。培養は固体培養または液体培養のいずれでも
よいが通常、20〜40℃で２〜15日間好気的に培養
される。セルラーゼは菌体外に生産される酵素であるの
で、液体培養の場合、培養後、濾過または遠心分
離して得た除菌液について、また、固体培養の場
合は、培養後、水または適当な塩類溶液で抽出し
た酵素液について、硫安または硫酸ナトリウムな
どで沈澱させるか、あるいはアセトン、アルコー
ルのような有機溶媒を添加してセルラーゼを沈澱
させ、分離、乾燥して酵素粉末を得る。次に、実施例により本発明の詳細を説明する。実施例１セルロース４％、K₂HPO₄1.2％、バクトペプ
トン１％、ZnSO₄・7H₂O1×10^-3％、KNO₃0.6
％、MnSO₄・7H₂O1×10^-3％、尿素0.2％、
CuSO₄・5H₂O1×10^-3％、KCl0.16％、MgSO₄・
7H₂O0.12％からなる培地（PH４）および、これ
にベタインを0.03％量添加した培地を、常法によ
り殺菌後、アクレモニウム・セルロリテイカス
TN（FERMBP−685）を接種し、30℃で12日間
好気的に培養した。培養後、遠心分離して得た上
澄液について生産された、セルラーゼのアビセラ
ーゼ、CMCアーゼとβ−グルコシダーゼ活性を
測定した。結果は第１表に示す通りであつた。

〔効果〕

表から明らかなように、ベタインを添加する
と、無添加の場合に比べ、アビセラーゼ、CMC
アーゼ及びβ−グルコシダーゼの生産量が、いず
れも顕著に増加した。

Claims

【特許請求の範囲】

１セルラーゼ生産能を有すアクレモニウム属菌
を培養して、セルラーゼを生産するに際し、ベタ
インの存在下で培養することを特徴とするセルラ
ーゼの生産改良方法。