JP2573488B2 - β−マンナナ−ゼ含有組成物及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規なβ−マンナナーゼ含有組成物及びその
製造法、更に詳細には、例えばマンナンに作用して医薬
として有用なβ−1,4−マンノビオース（以下、単にマ
ンノビオースということがある）を選択的に産生するこ
とのできるβ−マンナナーゼ含有組成物及びその製造法
に関する。

（従来の技術及びその問題点） マンナンは、マンノースを主な構成成分とする多糖類
の総称であって、植物組織及び酵母の細胞壁等に存在
し、大部分はＤ−マンノースがβ−1,4−グリコシド結
合している。また、マンノビオースは、Ｄ−マンノース
がβ−1,4−グリコシド結合で２個結合した２糖類で、
例えばマンナンを酸素又は酸で部分的に加水分解し、加
水分解液から精製・単離することにより得られる。

従来、このβ−1,4−グリコシド結合を切断する酵素
としては、例えばアスペルギルス属、バチルス属、トリ
コデルマ属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等に
属する微生物が産生するβ−マンナナーゼが知られてい
る。

しかしながら、従来知られているβ−マンナナーゼは
活性が低く、これをマンナン等に作用させた場合、いず
れも加水分解あるいは部分加水分解の結果、マンノビオ
ース以外にＤ−マンノース、マンノトリオース、その他
のオリゴ糖が生成し、更に糖化率も悪く、特にマンノビ
オースのみ生産する目的には有利なものとは云えなかっ
た。

最近、放線菌であるストレプトミセス・エスピー（St
reptomyces sp.）No.17が産生するβ−マンナナーゼ
は、従来のβ−マンナナーゼに比べマンノビオースを多
量に生成することが報告された〔Japanese Journal of
Tropical Agriculture,29 （３）,167−172（1985）〕
が、このβ−マンナナーゼによりコプラマンナンを加水
分解して、Ｄ−マンノース12重量％（以下、単に％で示
す）、マンノビオース71％、マンノトリオース９％、オ
リゴ糖８％の糖組成物を得ているにすぎない。つまりス
トレプトミセス・エスピーNo.17の産生するβ−マンナ
ナーゼは、活性が低くマンノビオースの生産効率が悪
い、マンノビオースと共晶を形成するマンノトリオー
スの生産量が多いため、マンノビオースの単離が困難で
ある、及びマンノトリオース同様分離が困難なガラク
トマンノオリゴ糖を生成する等の欠点を有していた。

また、酸による部分加水分解による方法は、マンノビ
オースのみ製造する目的には不適当である点で、従来の
β−マンナナーゼによる方法と同様の欠点を有してい
た。

（問題点を解決するための手段） 本発明者は、かかる実情において、マンノビオースの
製造に更に適した活性を有するβ−マンナナーゼ含有組
成物を産生する微生物を自然界から検索した結果、フィ
リピンの土壌から分離したペニシリウム（Penicilliu
m）属に属する微生物が、マンナンに対し高い分解活
性を有するβ−マンナナーゼ含有組成物を産生するこ
と、これをマンナン又はマンナン含有天然物に作用さ
せた場合、驚くべきことにマンノトリオースをほとんど
生成せずマンノビオースを選択的に生成すること、か
つ、このβ−マンナナーゼ含有組成物はβ−ガラクト
シダーゼ活性を有するため、コプラマンナンのようなガ
ラストマンナンをマンノビオースにまで加水分解するこ
とができ、ガラクトマンノオリゴ糖を生成しないことを
見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、次の理化学的性質、 作用 β−マンナナーゼ活性及びβ−ガラクトシダーゼ活性
を有し、マンナンに作用して、主としてβ−1,4−マン
ノビオースを生成し、マンノトリオースをほとんど生成
しない。

基質特異性 マンナン、ガラクトマンナンに特異的に作用するが、
キシラン、セルロースには作用しない。

至適pH及び安定pH範囲 至適pHは約5.8、安定pH範囲は約４〜約８である。

至適温度 約40〜約60℃ pHによる失活の条件（30℃） pH5.8で３時間保持した時の活性を100％とするとき、
pH2で約65％、pH4で約90％及びpH8で約95％の活性があ
る。

温度による失活の条件（pH5.8） 温度50℃で３時間保持した時の活性を100％とすると
き、40℃で約100％、70℃で約40％の活性がある。

を有することを特徴とする、β−マンナナーゼ含有組成
物及びその製造法を提供するものである。

本発明のβ−マンナナーゼ含有組成物は、ペニシリウ
ム属に属するβ−マンナナーゼ生産菌を培養し、培養物
からβ−マンナナーゼ含有組成物を得ることにより製造
される。

ペニシリウム属に属するβ−マンナナーゼ生産菌とし
ては、例えばペニシリウム・パープルゲナム（Penicill
ium purpurogenum）、ペニシリウム・クリソゲナム（P.
chrysogenum）、ペニシリウム・エクスパンサム（P.exp
ansum）、ペニシリウム・フニクロサム（P.funiculosu
m）、ペニシリウム・イサリフォーム（P.isariiform
e）、ペニシリウム・オクロ−クロロン（P.ochro−chlo
ron）、ペニシリウム・ピスカリウム（P.piscarium）、
ペニシリウム・バルクロサム（P.verruculosum）、ペニ
シリウム・フォートマンニ（P.wortmanni）等が挙げら
れる。例えば、ペニシリウム・パープルゲナムNo.618は
本発明者が見出した新菌株であって、次の菌学的性質を
有する。

（１）培地における生育状態 麦芽寒天培地 麦芽寒天培地での生育は５℃では全く起こらず、25℃
では７日間でコロニーの直径が３〜4cmに達する。性状
はビロード状である。14日間でコロニーの直径は７〜8c
mに達し、中心部より順次分生子形成し、それに従って
くすんだ黄緑色、かんらん緑色、灰緑色等を生ずる。集
落裏面に一部赤色部があり、りんご様の芳香がする。37
℃の生育では７日間ではコロニーの直径が５〜6cmに達
する。14日間ではコロニーの直径が８〜9cmに達し、良
く分生子形成し、色は黄緑から灰緑色になる。コロニー
の裏面は中心部が赤色である。

ツァペック寒天培地 ツァペック寒天培地での生育は５℃では全く起こらな
い。25℃では７日間でコロニーは直径１〜2cmに達し、
性状はビロード状である。14日間ではコロニーの直径が
３〜4cmに達するが分生子は形成しない。37℃の生育は
７日間ではコロニーの直径が１〜2cmである。14日間で
コロニーは４〜5cmに達し中心部が灰緑色となる。

ワックスマン氏寒天培地 ワックスマン氏寒天培地での生育は５℃では起こらな
い。25℃では７日間でコロニーの直径が４〜5cmに達
し、コロニーの性状は白いビロード状である。14日間で
はコロニーの直径は７〜8cmに達し、分生子部分の色は
灰緑色で、コロニーの裏面は赤色である。37℃の生育で
は７日間でコロニーの直径が４〜5cmに達し、性状はビ
ロード状である。14日間でコロニーの直径は７〜8cmに
達し、コロニーの分生子部分は灰緑色となる。

ポテト・デキストロース寒天培地 ポテト・デキストロース寒天培地での生育は５℃では
起こらない。25℃では７日間でコロニーの直径は５〜6c
mに達し、性状は白いうすいビロード状である。14日間
ではコロニーの直径は８〜9cmに達する。37℃の生育で
は７日間でコロニーの直径が５〜6cmに達し、性状は白
いビロード状である。14日間でコロニーの直径は８〜9c
mに達する。分生子の形成は少ない。

（２）生理的、生態的性質 最適生育条件 pH5〜７ 温度32〜37℃ 生育の範囲 pH4〜８ 温度15〜45℃ その他、顕著な特徴 マンナン含有培地での培養によりβ−マンナナーゼを
菌体外に生産する。

（３）顕微鏡的所見 分生子柄 滑面で直径は100〜150×2.5〜３μである。

ペニシリ 対称の複輪生体である。

メトレ ４〜６本の束生を持ち、直径は10〜15×３μである。

フィアライド ４〜６本の輪生を持ち直径は10〜12×２〜2.5μであ
る。

分生子 形状は亜球形で直径は2.5〜３×2.5〜３μである。

以上の菌学的性質を「ア・マニュアル・オブ・ザ・ペ
ニシリア（A MANUAL OF The PENICILLIA）」（1949）
〔ケネス ビー．レーパー及びチャールズ トム（KENN
ETH B.RAPER and CHARLES THOM）〕、「ザ・ジーナス・
ペニシリウム・アンド・イッツ・テレオモルフィック・
ステーツ・ユーペニシリウム・アンド・タラロミセス
（The genus PENICILLIUM and it's teleomorfhic stat
es eupenicillium and talaromyces）」（1979）〔ジョ
ン アイ．ピット（JHON I.PITT）〕及び「菌類図鑑
（下）」（1978）（椿啓介他）に照合し、その菌種を検
索したところ、本菌株は、ペニシリウム・パープルゲナ
ムに属する。

更に、本菌株は、近似するペニシリウム・パープルゲ
ナム・ストール（Penicillium perpurogenum stall）と
比較すると、ペニシリウム・パープルゲナム・ストール
は、37℃での培養では25℃での培養に比べ生育が悪く、
また、麦芽寒天培地で集落裏面は無色でツァペック培地
で裏面が赤くなると上記文献に記載されているが、本菌
株では、逆に37℃で生育状態が良く、また麦芽寒天培地
で集落裏面に赤い色素を生産する点で相異する。

従って、本発明者は、本菌株をペニシリウム・パープ
ルゲナムNo.618と命名し、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第9189号（FERM P−9189）として寄託
した。

本発明のβ−マンナナーゼ含有組成物を得るには、ペ
ニシリウム属に属する微生物を栄養源含有培地に接種し
て好気的に培養し、培養液、特に好ましくは培養ろ液を
採取する。

培養に使用される栄養源としては、例えばコプラミ
ル、ヤシ殻等由来のマンナン等が好ましい。コプラミル
とは、ココナツヤシより油脂を搾油した残渣で通常マン
ナンを約45〜50％含有している。窒素源としては、例え
ば尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酵母エ
キス、ペプトン、コーンステープリカー等を使用するこ
とができる。培地としては、更にリン酸二水素カリウ
ム、硫酸マグネシウム等の無機塩類を含むものが好適に
使用される。

培養は、好ましくは培養温度30〜40℃、特に好ましく
は32〜37℃、初発pH5〜６で振盪培養等により行なうこ
とができる。かかる条件で培養を行なえば、培養ろ液の
β−マンナナーゼ活性は、通常培養５日前後で最高に達
する。

かくして得られるβ−マンナナーゼ含有組成物を、マ
ンナン又はマンナン含有天然物に作用させれば、マンノ
ビオースを主成分とする加水分解液が得られる。

マンナンとしては、例えばココナツヤシ殻、ぞうげヤ
シ殻、針葉樹等に由来するものが挙げられる。また、マ
ンナン含有天然物としては、例えばココナツヤシ殻、ぞ
うげヤシ殻等のマンナンを含有するものであれば何れを
も使用できるが、大量に生産され容易に入手できるもの
としてコプラミルが特に好適である。

かくして得られた加水分解液には、マンノトリオース
がほとんど含まれないため、主としてＤ−マンノースの
除去を行なえば、Ｄ−マンノースを除去した後加水分解
液を濃縮、結晶化処理することにより、通常純度が98％
以上のマンノビオースが単離できる。

（作用） 本発明のβ−マンナナーゼ含有組成物が、これをマン
ナン等に作用させた場合に、後記参考例に示す如く、マ
ンノビオースを極めて選択的に生成する作用機序は次の
ようであると考えられる。すなわち、本発明のβ−マン
ナナーゼ含有組成物のβ−マンナナーゼはエンド型β−
マンナナーゼと考えられる。そして、このエンド型β−
マンナナーゼはマンナンをランダムに切断する。しか
し、一旦生成したマンノビオースには全く作用せず、マ
ンノトリオースへの作用性がやや弱い。一方、マンノー
ス単位に切断されたものは再結合によって２糖以上の糖
に合成される。このため、通常は、最終的にはマンノビ
オースとマンノトリオースの混合物が生成する。

しかしながら、本発明のβ−マンナナーゼ含有組成物
の活性は極めて高いため、マンノトリオースの生成量が
少なくなっている。このβ−マンナナーゼ含有組成物の
活性は、例えばこれにマンナン等のみ加えることにより
作用させる場合、8u/培養液ml以上であることが好まし
く、活性の低下に従いマンノトリオースの生成量は増加
する。

このことは、例えば後記参考例２において、培養液を
希釈し、酵素活性を低下させた以外は実施例１と同様に
マンナンに作用させたところ、48時間加水分解後のろ液
中の糖含有量が減少したのみならず、マンノトリオース
含有率が増加したことによって裏づけられる。

（実施例） 次に実施例、参考例及び比較例により本発明を説明す
る。

なお、本発明のβ−マンナナーゼ含有組成物の活性は
次に示す方法で測定した。

pH5.8のマックルベインバッファー水溶液4ml、蒸溜水
5mlと粉砕した脱脂コプラミル150mgを15分間50℃でイン
キュベートし、被検液1mlを加え50℃で30分間反応させ
た。反応液に生じた還元糖をソモギー法により定量す
る。被検液1mlが１分間に還元糖1mgを遊離する時の値を
１単位（ｕ）と定義する。

参考例１ β−マンナナーゼ生産菌、ペニシリウム・パープルゲ
ナムNo.618は、次の方法により分離した。

フィリピンの土壌0.5gを滅菌水10mlで懸濁し、その0.
5mlを滅菌水10mlに懸濁し、更にその0.5mlを滅菌水10ml
に懸濁し、その一滴をシャーレ中のマンナン寒天培地に
滴下し、表面に広げる。生えてきたコロニー中周囲に透
明帯（マンナン溶解部分）のあるものを分離、採取し、
約500検体をスラント化した。この各スラントを100ml坂
口フラスコで振盪培養を行ないβ−マンナナーゼ活性を
測定し、活性のあるものを50検体選択した。更に100ml
坂口フラスコで振盪培養を行ないβ−マンナナーゼ活性
を測定し、最も活性のある本菌を得た。

実施例１ コプラミル４％、KH₂PO₄ 1％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、
ペプトン0.9％、酵母エキス0.2％、コーンステープリカ
ー0.5％からなる液体培地（pH5.4）100mlを500ml坂口フ
ラスコに採取し、定法により加熱殺菌した。これにペニ
シリウム・パープルゲナムNo.618の１白金耳を接種し、
35℃で５日間振盪培養した。この培養液をろ過した後マ
ンナンの加水分解活性を測定したところ14.8u/培養液ml
であった。

参考例２ ５のジャファーメンターにコプラミル４％、KH₂PO₄
1％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、ペプトン0.9％、酵母エキ
ス0.2％、コーンステープリカー0.5％からなる液体培地
（pH5.4）３を入れ、定法により加熱殺菌した。これ
を実施例１と同じ方法で調整した培養液300mlを種菌と
して接種した後、35℃で４日間培養した。この培養液の
酵素活性を測定したところ16.2u/培養液mlであった。

この培養液をろ過したところ2.8のろ過液が得られ
た。このろ過液にコプラミル280gを加え、pH5.8、50℃
で48時間加水分解した後ろ過したところ2.5のろ過液
を得た。このろ過液を液体クロマトグラフィーで分析し
たところ下記の糖組成であった。

Ｄ−マンノース 1.2％ マンノビオース 84.2％ マンノトリオース 1.9％ その他の単糖 12.7％ 参考例３ 参考例２で得られた加水分解ろ過液１にパン酵母2g
を加え35℃で２日間培養した。この資化液をろ過した後
糖組成を分析したところ次の通りであった。

Ｄ−マンノース 0.1％ マンノビオース 91.5％ マンノトリオース 2.1％ その他の単糖 6.3％ このろ過液を75％迄濃縮したところ59gの濃縮液が得
られた。この濃縮液に30mlのエタノールを加え１日間結
晶化させたところ23.5gのマンノビオースが得られた。
このものの純度は98.1％、融点191〜192℃であった。

参考例４ 参考例２で得られた加水分解ろ過液１を定法により
イオン交換樹脂で脱塩した後50％迄濃縮したところ88g
の濃縮液が得られた。

次にポリスチレンスルフォン酸型陽イオン交換樹脂SK
・IBS（三菱化成工業（株）製、50〜100メッシュ）300m
lをジャケット付きカラム（内径2.4cm×長さ80cm）に充
填し、これに５％塩酸水溶液を流し水洗した後、次いで
５％水酸化ナトリウム水溶液を流し水洗して樹脂をナト
リウム型とした。このカラムを60℃に保温しながら上記
で調製した濃縮液30gを塔上部より供給し、次いで水で
連続的に溶出してフラクションコレクターにより分画し
た。この際の溶出液の流速は100ml/時で、各分画容量は
10mlであった。各フラクションを液体クロマトグラフィ
で分析した。その結果を第１表及び第１図に示す。

このフラクションNo.14〜22を集めた液の糖組成は次
の通りであった。

Ｄ−マンノース 0.6％ マンノビオース 90.5％ マンノトリオース 2.5％ その他の単糖 6.4％ この液を75％迄濃縮したところ12.3の濃縮液が得られ
た。この濃縮液にエタノール6mlを加え１日間結晶化し
たところ7.6gのマンノビオースが得られた。純度は98.2
％、融点191〜192℃であった。

比較例１ 実施例１において、β−マンナナーゼ生産菌として、
ペニシリウム・パープルゲナムNo.618の代りにストレプ
トミセス・エスピーNo.17を用いた以外は実施例１と同
様に操作して培養液を得た。次いでこの培養液を種菌と
して用いて参考例２と同様にして培養液を得た。この培
養液のβ−マンナナーゼ活性は5.3u/培養液mlであっ
た。

従って、本発明のβ−マンナナーゼ含有組成物は、ス
トレプトミセス・エスピーNo.17の培養液に比べ３倍以
上のβ−マンナナーゼ活性を有することが明らかとなっ
た。

更にこの培養液をろ過し2.7のろ液を得た。このろ
液にコプラミル140℃を加え、pH6.8、40℃で48時間加水
分解した後ろ過したところ、2.5のろ液を得た。この
ろ液の糖組成は下記のようであった。

Ｄ−マンノース 10.5％ マンノビオース 63.5％ マンノトリオース 9.8％ オリゴ糖 11.2％ その他の単糖 5.0％ 従って、本発明のβ−マンナナーゼ含有組成物を用い
れば、マンノトリオース及びオリゴ糖（主にガラクトマ
ンノオリゴ糖）をほとんど含まない糖液を製造できるこ
とが明らかとなった。

（発明の効果） 叙上の如く、本発明のβ−マンナナーゼ含有組成物
は、ペニシリウム属の微生物由来のβ−マンナナーゼを
含有するものと考えられるため、マンナン等を加水分解
してマンノビオースを選択的に生成し、ほとんどマンノ
トリオース及びガラクトマンノオリゴ糖を生成しない。
従って、加水分解後の糖組成物から、簡易な操作で高純
度のマンノビオースを得ることができる。

マンノビオースは、従来試薬として市販されておら
ず、従って用途開発研究が行なわれてなかった。近年、
動物細胞壁に存在する糖鎖の研究が進み、糖鎖が抗原抗
体に関与していることが判明した。この糖鎖中にはマン
ノビオース骨格が存在しており、マンノビオースが安価
に製造出来るならばこの糖鎖の合成原料として使用でき
る。更に転移酵素を使用することによりマンノースを含
む新規な糖を製造することができ、医薬品として有用で
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例４における糖を含む濃縮液の溶出曲線を
示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:80） (72)発明者 島田 規男 東京都足立区大谷田１−１−２−1004 (72)発明者 竹村 元宏 北本市下石戸下615−８

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の理化学的性質、 作用 β−マンナナーゼ活性及びβ−ガラクトシダーゼ活性を
   有し、マンナンに作用して、主としてβ−1,4−マンノ
   ビオースを生成し、マンノトリオースをほとんど生成し
   ない。 基質特異性 マンナン、ガラクトマンナンに特異的に作用するが、キ
   シラン、セルロースには作用しない。 至適pH及び安定pH範囲 至適pHは約5.8、安定pH範囲は約４〜約８である。 至適温度 約40〜約60℃ pHによる失活の条件（30℃） pH5.8で３時間保持した時の活性を100％とするとき、pH
   2で約65％、pH4で約90％及びpH8で約95％の活性があ
   る。 温度による失活の条件（pH5.8） 温度50℃で３時間保持した時の活性を100％とすると
   き、40℃で約100％、70℃で約40％の活性がある。 を有することを特徴とする、β−マンナナーゼ含有組成
   物。
2. 【請求項２】ペニシリウム属に属するβ−マンナナーゼ
   生産菌を培養し、培養物から次の理化学的性質、 作用 β−マンナナーゼ活性及びβ−ガラクトシダーゼ活性を
   有し、マンナンに作用して、主としてβ−1,4−マンノ
   ビオースを生成し、マンノトリオースをほとんど生成し
   ない。 基質特異性 マンナン、ガラクトマンナンに特異的に作用するが、キ
   シラン、セルロースには作用しない。 至適pH及び安定pH範囲 至適pHは約5.8、安定pH範囲は約４〜約８である。 至適温度 約40〜約60℃ pHによる失活の条件（30℃） pH5.8で３時間保持した時の活性を100％とするとき、pH
   2で約65％、pH4で約90％及びpH8で約95％の活性があ
   る。 温度による失活の条件（pH5.8） 温度50℃で３時間保持した時の活性を100％とすると
   き、40℃で約100％、70℃で約40％の活性がある。 を有する、β−マンナナーゼ含有組成物を得ることを特
   徴とするβ−マンナナーゼ含有組成物の製造法。
3. 【請求項３】ペニシリウム属に属するβ−マンナナーゼ
   生産菌がペニシリウム・パープルゲナムNo.618（微工研
   菌寄第9189号）である特許請求の範囲第２項記載のβ−
   マンナナーゼ含有組成物の製造法。