JPH07194388A - ヒト血清アルブミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 遺伝子操作により調製されたヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）産生性宿主を２１〜２９℃の温度条件下
で培養することを特徴とするヒト血清アルブミンの製造
方法。 【効果】 遺伝子操作により得られたＨＳＡ産生性宿主
を２１〜２９℃の範囲にある特定温度条件下に培養する
ことにより、ＨＳＡの産生量およびＨＳＡ産生性宿主の
増殖度が増大し、同時にＨＳＡの着色度の低下を図るこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子操作により形質
転換された宿主を培養することによるヒト血清アルブミ
ン（以下ＨＳＡという）の製造方法の改良に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＨＳＡは、血漿の主要な蛋白構成成分で
あり、医薬として、例えば大量出血、ショックや熱傷患
者あるいは低蛋白血症、胎児性赤芽球症等の治療薬とし
て使用されている。

【０００３】現在ＨＳＡは、主として採取した血液の分
画からの産物として製造されている。しかし、この製造
法では不経済でありかつ原料の血液の供給が困難であ
る。また、血液は肝炎ウイルスのように好ましくない物
質を含んでいるという問題がある。

【０００４】近年組換ＤＮＡ技術の出現によって、多種
多様の有用なポリペプチドの微生物や細胞による生産が
可能となり、ＨＳＡについても遺伝子組換技術による大
量生産の研究開発が活発に行われている。しかし、その
生産収量は低く、いかに高純度で低コストの工業的生産
技術を確立できるかが問題となっている。

【０００５】遺伝子操作により調製されたＨＳＡ産生性
宿主を培地で培養するに当たり、従来は特に宿主が酵母
の場合３０℃で培養することが通常行われていた（特開
平３−８３５９５号、同４−２９９９８４号公報等）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる技術的
背景の下に、特に培養条件の改良によってＨＳＡの生産
量をより増大させることを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく研究を重ねた結果、遺伝子操作により調製
されたＨＳＡ産生性宿主を培地で培養するに当たり、２
１〜２９℃の温度条件下で行うことにより、ＨＳＡ産生
性宿主の増殖度およびＨＳＡ産生量が増大するとともに
ＨＳＡの着色度の抑制が図られることを見出し、本発明
を完成するに到った。

【０００８】本発明において用いられる遺伝子操作によ
り調製されたＨＳＡ産生性宿主は、遺伝子操作を経て調
製され、かつＨＳＡを産生し得るものであれば特に限定
されず、既に公知文献記載のものの他、今後開発される
ものであっても適宜利用することができる。具体的に
は、遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性とされた菌（例え
ば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細胞などが挙げら
れる。特に、本発明においては、宿主として、酵母、就
中サッカロマイセス属、ピキア属もしくはクルベロマイ
セス属が使用されることが好ましい。また、栄養要求性
株や抗生物質感受性株が使用できる。さらにまた、Ｇ４
１８感受性株であるサッカロマイセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２株（a, his 4, leu
2, can 1) 、ピキア・パストリス（Pichia pastoris)Ｇ
ＴＳ１１５(his 4) 、クルベロマイセス・ラクティス
（Kluyveromyces lactis）ＭＷ９８−８Ｃ（α, uraA,
arg, lysK ⁺ , pKD1°) 等が好適に用いられる。

【０００９】これらのＨＳＡ産生性宿主の調製方法およ
びその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳ
Ａの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手
法を採用することによって実施される。例えばＨＳＡ産
生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法としては、
例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法
（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０５１５号、
同５８−１５０５１７号の各公報）、新規なヒト血清ア
ルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５
号、特開平１−９８４８６号の各公報）、合成シグナル
配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報）、
血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−
１６７０９５号公報）、組換えプラスミドを染色体上に
組込む方法（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士
を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公報）、メ
タノール含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型Ａ
ＯＸ ₂ プロモーターを用いる方法（特開平６−９０７６
８号、特開平４−２９９９８４号公報）、枯草菌による
ＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公報）、酵母
によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号、同６
３−３９５７６号、同６３−７４４９３号の各公報）、
ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９
０号公報）などが例示される。

【００１０】このうち、メタノール含有培地中で変異を
起こさせる方法は、具体的には以下のように行う。すな
わち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的
にはＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５
１）のＡＯＸ₁ 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ₁ プロモ
ーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有する
プラスミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１
０４２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノー
ル培地中での増殖能は弱い。そこで特開平４−２９９９
８４号公報に記載の方法に従い、この形質転換体をメタ
ノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能
な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度として
は、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は合成
培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１
５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。

【００１１】また、ＨＳＡ産生性宿主の培養方法（すな
わちＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度
のグルコースを適度に少量づつ供給し、産生菌体に対す
る高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る
方法（特開平３−８３５９５号公報）、培地中に脂肪酸
を添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特開平４−２
９３４９５号公報）などが例示される。

【００１２】さらにＨＳＡの分離採取方法としては、上
記の各公報に記載された方法の他に加熱処理によるプロ
テアーゼの不活化（特開平３−１０３１８８号公報）、
陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群よ
り選ばれた少なくとも一つを用いてＨＳＡと着色成分と
を分離することによる着色抑制方法（特開平４−５４１
９８号公報）などが例示される。

【００１３】形質転換宿主の培養に用いられる培地は、
通常この分野で既知の培地が使用され、培養条件は一般
的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然培
地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、合
成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素源
として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養素
として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩と
してＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕな
どが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イーストナ
イトロジエンのベース（Difco 社製）、２％グルコー
ス〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ
液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco 社
製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、２％グルコ
ース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基
性、弱酸性でよい。好ましくはｐＨ５．７〜６．５であ
る。また、メタノール資化性宿主の場合は、メタノール
含有培地を用いることができる。この場合メタノール濃
度は０．０１〜５％程度である。

【００１４】培養温度に関して、特にＨＳＡの産生量を
指標にした場合の好適な範囲は、２１〜２９℃、好まし
くは２１〜２８℃、より好ましくは２１〜２５℃、さら
に好ましくは２１〜２３℃である。２９℃より高い温度
で培養を行う場合は、菌体増殖やＨＳＡ産生が抑制さ
れ、さらにＨＳＡ着色度が上昇してしまう等の問題が生
じ、また２１℃より低い温度で培養を行う場合も、菌体
増殖やＨＳＡ産生が抑制されるなど好ましくない。一
方、２１℃程度までは培養温度の低下に従って菌体増殖
度及びＨＳＡ産生量が上昇する傾向が見られるものの、
培養自体が発熱を伴うことから、２３℃より低い温度で
培養を行う場合は冷却装置等が別途必要となる等、温度
管理にコストや手間がかかり実際面においては好ましく
ない。特に発明の企業化を図るに際しては、ＨＳＡの産
生量の増大およびＨＳＡ着色度の抑制といった効果と共
に、コストや手間等の経済性をも重要なファクターとし
て勘案する必要がある。そこで、かかる観点から総合的
に判断した場合の好適な培養温度は２３〜２８℃であ
り、より好ましくは２５〜２７℃である。

【００１５】上記培養温度下で、ＨＳＡ産生性宿主を培
養すれば、例えば酵母の場合、従来の３０℃での培養に
比べ、ＨＳＡ産生量を１．２〜１．５倍増大させること
ができるとともに、ＨＳＡの着色度も１０〜３０％低下
させることができる。

【００１６】培養時間は１〜１０００時間程度であり、
培養は静置または振盪、攪拌、通気下に回分培養法や半
回分培養法あるいは連続培養法により実施される。な
お、当該培養に先立って前培養を行うことが好ましい。
この際の培地としては、例えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ
液体培地が使用される。前培養の培養条件は次の通りで
ある。すなわち、培養時間は１０〜１００時間、温度は
酵母では３０℃程度、細菌では３７℃程度が好ましい。

【００１７】かくして培養終了後、ＨＳＡは培養濾液ま
たは菌体、細胞からそれぞれ公知の分離、精製手段によ
り採取される。

【００１８】

【実施例】以下に具体例によって、本発明を説明する。 実施例１ （１）使用菌株の調製 特開平２−１０４２９０号公報に記載のＡＯＸ₁ プロモ
ーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットをもつプ
ラスミドｐＨＳＡ１１３から、ＨＳＡ遺伝子の５’ノン
コード領域を除去したＨＳＡ発現プラスミドｐＰＧＰ１
を作成した。ｐＰＧＰ１は、正常ＨＳＡのアミノ酸配列
をコードするｃＤＮＡを有する［正常ＨＳＡのアミノ酸
配列および正常ＨＳＡをコードする染色体ＤＮＡ配列
は、J. Biol. Chem., 261, 6747-6757(1986)に記載され
ている。］。そして、特開平２−１０４２９０号公報に
述べられている方法に従い、ピキアパストリス（Pichia
pastoris)ＧＴＳ１１５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ₁ 遺伝子
領域を、ＨＳＡ発現プラスミドｐＰＧＰ１をＮｏｔ１制
限酵素で切断して得られる断片で置換して、形質転換体
ＰＣ４１３０を得た。この株はＡＯＸ₁ 遺伝子が存在し
ないためにメタノールを炭素源とする培地での増殖能が
低くなっている（Ｍｕｔ−株）。

【００１９】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ₅₄₀ ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ₅₄₀ ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０⁷ cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％（寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養してコロニー
の有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布し
た２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２
０個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株
はほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すな
わち、このプレートではコロニーが生じるということは
メタノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が
得られたことを示している。生じたコロニーの内の１つ
を適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。

【００２０】ＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロ
モーター [変異型。天然ＡＯＸ２プロモーター (YEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol., 9, 1316-
1323(1989) 中、開始コドン上流２５５番目の塩基がＴ
からＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラスミ
ドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス（Pichiapa
storis)ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ４
２−３株を得た（特開平４−２９９８４号公報）。

【００２１】（２）培地組成 前培養には、ＹＰＤ培地（２％バクトペプトン、１％イ
ーストエキストラクト、２％グルコース) を使用した。
バッチ培地の組成を表１に、フィード培地の組成を表２
に示す。

【００２２】

【表１】

【００２３】

【表２】

【００２４】（３）３リットル容ファーメンターを用い
た培養方法 前培養 凍結ストックバイアルより、１mlをＹＰＤ培地５０mlを
含むバッフル付きの３００ml容三角フラスコに植菌し、
３０℃、２４時間振盪培養した。培養２４時間後の培養
液１４mlをバッチ培地７００mlに植菌した。 本培養 バッチ培地７００mlに前培養液１４mlを植菌し、３リッ
トル容ミニジャーファーメンターを用いて通気攪拌培養
した。培養温度は、１５、２１、２３、２５、２７、２
８、３０℃の各温度に設定した。攪拌速度の下限を２０
０ｒｐｍ、上限を１０００ｒｐｍに設定した。溶存酸素
濃度が飽和濃度の５０％程度を保持するように制御しな
がら回分培養した。回分培養において培地中のグリセロ
ールが消費された時点よりフィード培地の添加を開始し
た。ｐＨは６．２に定値制御した。消泡は、必要に応じ
て消泡剤を培地中に適宜添加することで実施した。培養
は３６０時間行った。

【００２５】（４）１２００リットル容ファーメンター
を用いた培養方法 前々培養 グリセロール凍結ストック菌株１mlを２００mlのＹＰＤ
培地を含むバッフル付１，０００ml容三角フラスコに植
菌、３０℃にて２４時間振盪培養した。 前培養 ＹＰＤ培地５リットルを含む１０リットル容ジャーファ
ーメンターに前々培養液を植菌し、３０℃で２４時間通
気攪拌培養した。通気は、溶存酸素濃度が飽和溶存酸素
濃度の５０％程度を保持するように制御した。また、前
培養においてはｐＨ制御は行なわなかった。

【００２６】本培養 バッチ培養用培地２５０リットルに前培養液を植菌し、
１，２００リットル用ファーメンターを用いて通気攪拌
培養を行った。培養温度は２３，２５，２７，２９，３
０℃の各温度に設定した。溶存酸素濃度が飽和溶存酸素
濃度の５０％〜３０％程度を保持するように、攪拌速度
を制御しながら回分培養を開始した。回分培養において
培地中のグリセロールが消費された時点よりフィード培
地の添加を開始した。ｐＨは５．８５に定値制御した。
消泡は、消泡剤を培地中に適宜添加することで実施し
た。なお、培養は３６０時間行った。

【００２７】試験例１ 菌体濃度の測定 実施例１の各培養温度における培養において、任意の培
養時間で培養液をサンプリングし、蒸留水で測定時のＯ
Ｄ₅₄₀ 値が０．３以下となるよう適当に希釈したのち分
光光度計（ＵＶ２００型、島津製）を用いて５４０ｎｍ
における吸光度を測定した。本実験において、吸光度か
ら乾燥菌体量への変換はＯＤ₅₄₀ 値／５．２とした。各
培養温度での最大菌体濃度を表３および表４に示す。

【００２８】試験例２ ＨＳＡ産生量および着色度の
評価 実施例１の各培養温度における培養において、任意の培
養時間で培養液をサンプリングし、15,000ｒｐｍで５分
間遠心した。得られた上清をウルトラフリーＣ３ＨＶに
より清澄濾過後、ＨＰＬＣによるゲル濾過分析を実施し
た。 カラム ：東ソー ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０
００ＳＷ_X1 移動相 ：0.3M NaCl, 50mM Na-Phosphat
e, 0.1% NaN_3, pH6.5 流速 ：0.7 ml/min. インジェクション量 ：50μｌ 検出 ：Ａ_28O 、Ａ₃₅₀ （２波長）

【００２９】表３および表４にＨＳＡ産生量ならびに着
色度の評価も合わせて示す。産生量は３０℃での培養の
ＨＳＡ産生総量（ｇ）を１００としたときの各温度での
産生総量（ｇ）を％表示した。また、着色度は、培養終
了直前時（３５９時間後）にサンプリングした培養液に
ついて、350nm 、280nm それぞれの波長での吸光度の比
（Ａ₃₅₀ ／Ａ_28O ）にて評価した。

【００３０】

【表３】

【００３１】

【表４】

【００３２】

【発明の効果】以上説明したように、本発明は、遺伝子
操作により調製されたＨＳＡ産生性宿主を２１〜２９℃
のもとで培養することを特徴とするものであり、当該方
法によれば、ＨＳＡの産生量およびＨＳＡ産生性宿主の
増殖度が増大し、同時にＨＳＡの着色度の低下を図るこ
とができるという効果がある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 大屋 智資 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 應田 豊雄 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 大村 孝男 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子操作により調製されたヒト血清ア
   ルブミン産生性宿主を２１〜２９℃の温度条件下で培養
   することを特徴とするヒト血清アルブミンの製造方法。