JPH0655155B2 - 蛋白質の製造方法 - Google Patents
蛋白質の製造方法Info
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- JPH0655155B2 JPH0655155B2 JP61021198A JP2119886A JPH0655155B2 JP H0655155 B2 JPH0655155 B2 JP H0655155B2 JP 61021198 A JP61021198 A JP 61021198A JP 2119886 A JP2119886 A JP 2119886A JP H0655155 B2 JPH0655155 B2 JP H0655155B2
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- Japan
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- dna
- yeast
- gap
- gene
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、改良酵母プロモーターを利用した蛋白質の製
造方法に関する。
造方法に関する。
酵母において、異種遺伝子の発現はＨＢｓＡｇ、ＩＦＮ
αなどで行われている。酵母プロモーターの制御機構は
グルコース抑制などの例を除くと一般にポジテイブなコ
ントロールであることが知られており、このポジテイブ
なコントロールに関与するプロモーター側の制御因子と
して翻訳開始点の数百ベース上流に位置しシスに機能す
るアップストリーム・アクチベーション・サイト（ＵＡ
Ｓ）の存在が示唆されている。｛エル・ガランテ、セル
（Ｌ．Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｃｅｌｌ）、３６，７９９，
１９８４｝。
αなどで行われている。酵母プロモーターの制御機構は
グルコース抑制などの例を除くと一般にポジテイブなコ
ントロールであることが知られており、このポジテイブ
なコントロールに関与するプロモーター側の制御因子と
して翻訳開始点の数百ベース上流に位置しシスに機能す
るアップストリーム・アクチベーション・サイト（ＵＡ
Ｓ）の存在が示唆されている。｛エル・ガランテ、セル
（Ｌ．Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｃｅｌｌ）、３６，７９９，
１９８４｝。
また、このＵＡＳを他のＵＡＳと置換することによつて
そのプロモーターが本来おかれていた制御系から解除さ
れ新たに置きかえられたＵＡＳに関係する制御下に支配
されることが示されている｛エル・ガランテら、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミック・サイエンス・
アメリカ（Ｌ．Ｇｕａｒｅｎｔｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，７
４１０，１９８２）；エル・ガランテら、セル（Ｌ．Ｇ
ｕａｒｅｎｔｅ ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ），３６，５０
３，１９８４；ケー・ストルール，プロシーディング・
ナショナル・アカデミック・サイエンス（Ｋ．Ｓｔｒｕ
ｈｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，
７８６５，１９８４）｝。従つて酵母プロモーターの改
良を行う場合、一つの方法としてＵＡＳの置換による制
御系の変更あるいはＤＮＡの欠失による制御系からの解
除及びプロモーターの小型化が考えられる。酵母プロモ
ーターの一つとして、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターがあ
り、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の産生プ
ロスミドに利用されている｛（ビトラー・ジー・エーお
よびエガン・ケー・エム，ジーン（Ｂｉｔｌｅｒ，Ｇ．
Ａ ＆ Ｅｇａｎ，Ｋ．Ｍ．Ｇｅｎｅ），３２，２６３
−２７４，１９８４に記載のＧＡＰ−ＤＨプロモーター
を用いたベクターからサツカロミセス・セレビシエにお
ける異種遺伝子の発現 （Expression of heterologous genes in Sacchoromyce
s cerevisiae from vector utilizing the glyceraldeh
yde -3- phosphate dehydrogenase gene promoter）、
特願昭５９−２１０８８８号に記載の酵母発現ベクター
及びその使用方法など｝。
そのプロモーターが本来おかれていた制御系から解除さ
れ新たに置きかえられたＵＡＳに関係する制御下に支配
されることが示されている｛エル・ガランテら、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミック・サイエンス・
アメリカ（Ｌ．Ｇｕａｒｅｎｔｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，７
４１０，１９８２）；エル・ガランテら、セル（Ｌ．Ｇ
ｕａｒｅｎｔｅ ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ），３６，５０
３，１９８４；ケー・ストルール，プロシーディング・
ナショナル・アカデミック・サイエンス（Ｋ．Ｓｔｒｕ
ｈｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，
７８６５，１９８４）｝。従つて酵母プロモーターの改
良を行う場合、一つの方法としてＵＡＳの置換による制
御系の変更あるいはＤＮＡの欠失による制御系からの解
除及びプロモーターの小型化が考えられる。酵母プロモ
ーターの一つとして、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターがあ
り、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の産生プ
ロスミドに利用されている｛（ビトラー・ジー・エーお
よびエガン・ケー・エム，ジーン（Ｂｉｔｌｅｒ，Ｇ．
Ａ ＆ Ｅｇａｎ，Ｋ．Ｍ．Ｇｅｎｅ），３２，２６３
−２７４，１９８４に記載のＧＡＰ−ＤＨプロモーター
を用いたベクターからサツカロミセス・セレビシエにお
ける異種遺伝子の発現 （Expression of heterologous genes in Sacchoromyce
s cerevisiae from vector utilizing the glyceraldeh
yde -3- phosphate dehydrogenase gene promoter）、
特願昭５９−２１０８８８号に記載の酵母発現ベクター
及びその使用方法など｝。
例えばＨＢｓＡｇ産生プロスミドｐＧＧ５はＧＡＰ−Ｄ
Ｈプロモーター、ＨＢｓＡｇ構造遺伝子、ＧＡＰ−ＤＨ
ターミネーター、大腸菌での複製開始点、マーカー遺伝
子（大腸菌におけるアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ
ｃ）、酵母におけるロイシン遺伝子）及び酵母での複製
開始点によつて構築された。
Ｈプロモーター、ＨＢｓＡｇ構造遺伝子、ＧＡＰ−ＤＨ
ターミネーター、大腸菌での複製開始点、マーカー遺伝
子（大腸菌におけるアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ
ｃ）、酵母におけるロイシン遺伝子）及び酵母での複製
開始点によつて構築された。
本発明者らはＧＡＰ−ＤＨプロモーターにおいてＴＡＴ
Ａボツクスより約２５ｂｐ上流に位置する制限酵素部位
ＸｍｎＩ（−１６４）より上流領域を欠失してもなお強
いプロモーター活性が維持される事を見出し本発明に至
った。
Ａボツクスより約２５ｂｐ上流に位置する制限酵素部位
ＸｍｎＩ（−１６４）より上流領域を欠失してもなお強
いプロモーター活性が維持される事を見出し本発明に至
った。
（問題点を解決するための手段〕 本発明は、ＧＡＨ−ＤＨプロモーターにおいて、ＧＡＰ
−ＤＨ蛋白質の開始コドンの上流−２５ｂｐから−１６
４ｂｐまでの領域のＤＮＡ配列をプロモーターとして利
用することを特徴とする蛋白質の製造方法である。
−ＤＨ蛋白質の開始コドンの上流−２５ｂｐから−１６
４ｂｐまでの領域のＤＮＡ配列をプロモーターとして利
用することを特徴とする蛋白質の製造方法である。
本発明は、ＧＡＨ−ＤＨプロモーターのプロモーター活
性を維持できるＤＮＡ配列（断片）を初めて調整し、そ
の配列を特定できたことに由来する。
性を維持できるＤＮＡ配列（断片）を初めて調整し、そ
の配列を特定できたことに由来する。
本発明の改良ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの作製方法は次
の通りである。
の通りである。
本発明で使用するＧＡＰ−ＤＨプロモーターは公知であ
り、その塩基配列は開示されている。このため改良に用
いられる原料は、公知の方法に準じて調整される。例え
ば参考例１に示したように酵母染色体ＤＮＡにより容易
に調整される。
り、その塩基配列は開示されている。このため改良に用
いられる原料は、公知の方法に準じて調整される。例え
ば参考例１に示したように酵母染色体ＤＮＡにより容易
に調整される。
ＧＡＰ−ＤＨプロモーター遺伝子は、単離後または担持
されたプラスミドのままで特定の制限酵素によつて切断
し、欠失処理がなされる。欠失は、ＧＡＰ−ＤＨ蛋白質
の開始コドンの上流、特に好ましくは−１６４ｂｐ付近
で行なう。好適な制限酵素はＸｍｎＩが例示される。さ
らに開始コドンの上流−２５ｂｐ付近で制限酵素によつ
て切断し、欠失処理ができる。
されたプラスミドのままで特定の制限酵素によつて切断
し、欠失処理がなされる。欠失は、ＧＡＰ−ＤＨ蛋白質
の開始コドンの上流、特に好ましくは−１６４ｂｐ付近
で行なう。好適な制限酵素はＸｍｎＩが例示される。さ
らに開始コドンの上流−２５ｂｐ付近で制限酵素によつ
て切断し、欠失処理ができる。
小型化されたプロモーターのＤＮＡ配列決定は、マクサ
ム・ギルバートの方法に準じて行い、第１図に示す塩基
配列を得た。この塩基配列は、既知のものと同一である
が、非常に小型化されている。
ム・ギルバートの方法に準じて行い、第１図に示す塩基
配列を得た。この塩基配列は、既知のものと同一である
が、非常に小型化されている。
この小型化されたＧＡＰ−ＤＨプロモーターは、既知の
制限酵素とリガーゼによる処理によつてプラスミドに挿
入、修復される。
制限酵素とリガーゼによる処理によつてプラスミドに挿
入、修復される。
かくして得られた小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの下
流に、有用な生理活性物質をコードする遺伝子を挿入
し、組換えプラスミドをコードする遺伝子を挿入し、組
換えプラスミドを得、酵母を形質転換し、さらに発現を
させることにより、目的の蛋白質を効果的に生産するこ
とができる。
流に、有用な生理活性物質をコードする遺伝子を挿入
し、組換えプラスミドをコードする遺伝子を挿入し、組
換えプラスミドを得、酵母を形質転換し、さらに発現を
させることにより、目的の蛋白質を効果的に生産するこ
とができる。
なお本発明において多くの技法、反応及び分析方法は当
業界においてよく知られている。特にことわらない限
り、全ての酵素は商業的供給源、例えば宝酒造；ニュー
イングランド バイオラブス（ＮＥＢ）｛Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）｝，マサチュ
ーセツツ，米国；アマーシヤム（Ａｍｅｒｓｈａｍ），
英国及びベセスダ リサーチ ラボラトリーズ｛Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ （ＢＲＬ）｝，メイランド、米国から入手するこ
とができる。
業界においてよく知られている。特にことわらない限
り、全ての酵素は商業的供給源、例えば宝酒造；ニュー
イングランド バイオラブス（ＮＥＢ）｛Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）｝，マサチュ
ーセツツ，米国；アマーシヤム（Ａｍｅｒｓｈａｍ），
英国及びベセスダ リサーチ ラボラトリーズ｛Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ （ＢＲＬ）｝，メイランド、米国から入手するこ
とができる。
酵素反応のための緩衝液及び反応条件は特に断わらない
限り各酵素の製造者の推奨に従つて使用した。
限り各酵素の製造者の推奨に従つて使用した。
フアージを用いた大腸菌の形質転換法、プラスミドを用
いた大腸菌の形質転換法、プラークハイプリダイゼーシ
ョン法、電気泳動法及びＤＮＡのゲルからの回収法は
「モレキュラー クローニング」コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）に記載されてい
る方法により行つた。酵母の形質転換法は「酵母遺伝学
の方法」コールド スプリング ハーバー ラボラトリ
ー（「Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ」）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８１）に記載されている方
法により行つた。
いた大腸菌の形質転換法、プラークハイプリダイゼーシ
ョン法、電気泳動法及びＤＮＡのゲルからの回収法は
「モレキュラー クローニング」コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）に記載されてい
る方法により行つた。酵母の形質転換法は「酵母遺伝学
の方法」コールド スプリング ハーバー ラボラトリ
ー（「Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ」）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８１）に記載されている方
法により行つた。
かくして得られた小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーターは、
酵母において、効率的な生理活性物質の発現を可能と
し、しかも従来にない小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーター
の使用によつてＤＮＡの組換え操作をより簡便なものと
した。又、本発明で使用されるプロモーターは、小型化
されたことにより、より容易にプロモーターのハイブリ
ッド化処理が可能となり、より高生産率のプロモーター
の作製が期待できる。さらに本発明で使用されるプロモ
ーターは、酢酸培地中でもなお強いプロモーター活性の
維持が期待できる。
酵母において、効率的な生理活性物質の発現を可能と
し、しかも従来にない小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーター
の使用によつてＤＮＡの組換え操作をより簡便なものと
した。又、本発明で使用されるプロモーターは、小型化
されたことにより、より容易にプロモーターのハイブリ
ッド化処理が可能となり、より高生産率のプロモーター
の作製が期待できる。さらに本発明で使用されるプロモ
ーターは、酢酸培地中でもなお強いプロモーター活性の
維持が期待できる。
以下に本発明を詳細に説明するために参考例・実施例を
記載するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
記載するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
参考例１ 酵母ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子のクローニング 酵母染色体ＤＮＡより酵母ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子配列を有
するＤＮＡを次のようにして調製した。
するＤＮＡを次のようにして調製した。
酵母サツカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cere
viciae）ＧＲＦ１８（leu,trp,his,met）よりデイー・
アール・クライヤー（Ｄ．Ｒ．Ｃｒｙｅｒ）ら「細胞生
物学の方法」（「Method in Cell Biology」）第１８
巻，第３節，３９頁，アカデミツクプレス，ニューヨー
ク（１９７５）の方法に従つて染色体ＤＮＡを調製し
た。
viciae）ＧＲＦ１８（leu,trp,his,met）よりデイー・
アール・クライヤー（Ｄ．Ｒ．Ｃｒｙｅｒ）ら「細胞生
物学の方法」（「Method in Cell Biology」）第１８
巻，第３節，３９頁，アカデミツクプレス，ニューヨー
ク（１９７５）の方法に従つて染色体ＤＮＡを調製し
た。
この染色体ＤＮＡ２０μｇを制限酵素ＨｉｎｄIII（宝
酒造社製、以下同じ）１０単位（Ｕ）を用いて完全消化
し、同じくＨｉｎｄIII１Ｕを用いて完全消化したラム
ダフアージcharon２８（ｂ１００７、ＫＨ５４、Ｎ１Ｎ
５）ＤＮＡ１μｇと連結した。連結にはＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造社製、以下同じ）を用い、推奨されている
方法に従つて１６℃で１晩反応させることによつて連結
を行つた。以下に述べるＤＮＡの連結にも同じ方法を用
いた。この連結したＤＮＡをインビトロパッケージング
キツト（Amersham社製）を用いてパッケージング後、大
腸菌ＬＥ３９２株（Ｆ-、hsdＲ５１４（rK -，mK -）、su
pＥ４４，lacＹ１、galＫ２、galＴ２、metＢ１、trp１
２５５、λ-）に感染させ４０，０００個のプラークを
得た。パッケージング方法はAmersham社の推奨する方法
に従つて行い、大腸菌への感染はMolecular Cloning
（前述）に従つて行つた。
酒造社製、以下同じ）１０単位（Ｕ）を用いて完全消化
し、同じくＨｉｎｄIII１Ｕを用いて完全消化したラム
ダフアージcharon２８（ｂ１００７、ＫＨ５４、Ｎ１Ｎ
５）ＤＮＡ１μｇと連結した。連結にはＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造社製、以下同じ）を用い、推奨されている
方法に従つて１６℃で１晩反応させることによつて連結
を行つた。以下に述べるＤＮＡの連結にも同じ方法を用
いた。この連結したＤＮＡをインビトロパッケージング
キツト（Amersham社製）を用いてパッケージング後、大
腸菌ＬＥ３９２株（Ｆ-、hsdＲ５１４（rK -，mK -）、su
pＥ４４，lacＹ１、galＫ２、galＴ２、metＢ１、trp１
２５５、λ-）に感染させ４０，０００個のプラークを
得た。パッケージング方法はAmersham社の推奨する方法
に従つて行い、大腸菌への感染はMolecular Cloning
（前述）に従つて行つた。
この４０，０００個のプラークをニトロセルロースフイ
ルターに固定後32Ｐを用いてラベルした合成ＤＮＡとハ
イブリダイズさせることによりスクリーニングを行つた
（プラークハイブリダイゼイシヨン法）。プラークハイ
ブリダイゼイシヨン法はMolecular Cloning（前述）に
従つて行つた。その結果強くハイブリダイズし、しかも
制限酵素マツピングも一致する２つのフアージを得た。
ルターに固定後32Ｐを用いてラベルした合成ＤＮＡとハ
イブリダイズさせることによりスクリーニングを行つた
（プラークハイブリダイゼイシヨン法）。プラークハイ
ブリダイゼイシヨン法はMolecular Cloning（前述）に
従つて行つた。その結果強くハイブリダイズし、しかも
制限酵素マツピングも一致する２つのフアージを得た。
このフアージＤＮＡ１０μｇをＨｉｎｄIII２Ｕで完全
消化することにより、2.1ｋｂの酵母染色体由来のＤＮ
Ａ断片を調製した。2.1ｋｂの酵母染色体由来のＤＮＡ
断片を調製した。2.1ｋｂＤＮＡ断片はＨｉｎｄIII完全
消化後のＤＮＡの低融点アガロース（ＢＲＬ社製）で電
気泳動後2.1ｋｂＤＮＡ断片を切り出し、ＢＲＬ社製の
推奨する方法に従つて６５℃１０分の熱処理後フエノー
ル抽出し水層をエタノール沈澱することによつて得た。
以下ＤＮＡ断片の回収にこの方法を用いた。
消化することにより、2.1ｋｂの酵母染色体由来のＤＮ
Ａ断片を調製した。2.1ｋｂの酵母染色体由来のＤＮＡ
断片を調製した。2.1ｋｂＤＮＡ断片はＨｉｎｄIII完全
消化後のＤＮＡの低融点アガロース（ＢＲＬ社製）で電
気泳動後2.1ｋｂＤＮＡ断片を切り出し、ＢＲＬ社製の
推奨する方法に従つて６５℃１０分の熱処理後フエノー
ル抽出し水層をエタノール沈澱することによつて得た。
以下ＤＮＡ断片の回収にこの方法を用いた。
この2.1ｋｂＨｉｎｄIIIＤＮＡ断片１μｇを大腸菌の代
表的なプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ１μｇをＨｉｎｄ
III１Ｕを用いて完全消化したものとＴ４ＤＮＡリガー
ゼ５Ｕを用いて連結し、大腸菌ＨＢ１０１株（Ｆ-、hsd
Ｓ２０（rB -，mB -）、recＡ１３，ara−１４、proＡ
２、lacＹ１、galＫ２、rpsＬ２０（Ｓｍr）、xy１−
５、mtl−１、sup−１、supＥ４４、λ-）を形質転換
し、リクローニングを行つた。大腸菌のプラスミドによ
る形質転換法はMolecular Cloning（前述）に従つて行
つた。リクローニングによつて得たプラスミドをｐＧＡ
Ｐ３０１と命名した。
表的なプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ１μｇをＨｉｎｄ
III１Ｕを用いて完全消化したものとＴ４ＤＮＡリガー
ゼ５Ｕを用いて連結し、大腸菌ＨＢ１０１株（Ｆ-、hsd
Ｓ２０（rB -，mB -）、recＡ１３，ara−１４、proＡ
２、lacＹ１、galＫ２、rpsＬ２０（Ｓｍr）、xy１−
５、mtl−１、sup−１、supＥ４４、λ-）を形質転換
し、リクローニングを行つた。大腸菌のプラスミドによ
る形質転換法はMolecular Cloning（前述）に従つて行
つた。リクローニングによつて得たプラスミドをｐＧＡ
Ｐ３０１と命名した。
参考例２ ＨＢｓＡｇ発現用ベクターの作成 酵母中でＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）を発
現するためのＧＡＰ−ＤＨプロモーターを用いるプラス
ミドベクターｐＧＧ５を第２〜３図に示すようにして構
築した。以下、図に従つて説明する。
現するためのＧＡＰ−ＤＨプロモーターを用いるプラス
ミドベクターｐＧＧ５を第２〜３図に示すようにして構
築した。以下、図に従つて説明する。
ｐＧＡＰ３０１ＤＮＡ４μｇをＴａｑＩ（ＮＥＢ社製）
１Ｕを用いて完全消化し電気泳動法によつて分離するこ
とによりＧＡＰ−ＤＨ遺伝子１の翻訳開始点の塩基を＋
１としたとろの−６７６から−２５までの６５２ｂｐの
ＧＡＰ−ＤＨプロモーター２のＤＮＡ断片３を調製し
た。
１Ｕを用いて完全消化し電気泳動法によつて分離するこ
とによりＧＡＰ−ＤＨ遺伝子１の翻訳開始点の塩基を＋
１としたとろの−６７６から−２５までの６５２ｂｐの
ＧＡＰ−ＤＨプロモーター２のＤＮＡ断片３を調製し
た。
このＤＮＡ断片３をＤＮＡポリメラーゼＩ（PolI）（宝
酒造社製）１Ｕと0.1μｇｄＮＴＰ（デオキシＮＴＰ）
を用いて処理し、接着末端を平滑末端とした。
酒造社製）１Ｕと0.1μｇｄＮＴＰ（デオキシＮＴＰ）
を用いて処理し、接着末端を平滑末端とした。
このＤＮＡ断片をｐＵＣ９１μｇをＳｍａＩ（宝酒造社
製）１Ｕを用いて完全消化したものに図に示す方向でＴ
４ＤＮＡリガーゼ５Ｕを用いて連結した。このＤＮＡを
大腸菌ＨＢ１０１に形質転換した結果得られたプラスミ
ドをｐＧＧ２と命名した。
製）１Ｕを用いて完全消化したものに図に示す方向でＴ
４ＤＮＡリガーゼ５Ｕを用いて連結した。このＤＮＡを
大腸菌ＨＢ１０１に形質転換した結果得られたプラスミ
ドをｐＧＧ２と命名した。
次にｐＧＡＰ３０１１０μｇをＳａ１Ｉ（宝酒造社製）
３Ｕ、及びＨｉｎｄIII（宝酒造社製）３Ｕを用いて完
全消化し、電気泳動で分離することによりＧＡＰ−ＤＨ
遺伝子のターミネーター配列４を含む１４０ｂｐＤＮＡ
断片５を調製した。又、ｐＧＧ２ＤＮＡ１μｇをＳａ１
Ｉ（宝酒造社製）１Ｕ及びＨｉｎｄIII１Ｕを用いて消
化し、電気泳動によつて3.4ｋｂＤＮＡ断片を調製し
た。この3.4ｋｂＤＮＡ断片と１４０ｂｐＤＮＡ断片と
をＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）５Ｕを用いて連結
し、得られたプラスミドをｐＧＧ３と命名した。ｐ“Ｐ
ｒｅＳ”ＤＮＡ４μｇをＸｈｏＩ（宝酒造社製）１Ｕ及
びＳａ１Ｉ（宝酒造社製）１Ｕを用いて完全消化し電気
泳動によつて1.3ｋｂＤＮＡ断片６を調製してくること
によつてＨＢｓＡｇ遺伝子７を含むＤＮＡを得た。ｐＧ
Ｇ３ＤＮＡ１μｇをＳａ１Ｉ（宝酒造社製）で完全消化
したＤＮＡ断片とＨＢｓＡｇを含む1.3ｋｂ断片とをＴ
４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）５Ｕを用いて連結し得
られたプラスミドをｐＧＧ４｛第２図（Ｂ）｝と命名し
た。
３Ｕ、及びＨｉｎｄIII（宝酒造社製）３Ｕを用いて完
全消化し、電気泳動で分離することによりＧＡＰ−ＤＨ
遺伝子のターミネーター配列４を含む１４０ｂｐＤＮＡ
断片５を調製した。又、ｐＧＧ２ＤＮＡ１μｇをＳａ１
Ｉ（宝酒造社製）１Ｕ及びＨｉｎｄIII１Ｕを用いて消
化し、電気泳動によつて3.4ｋｂＤＮＡ断片を調製し
た。この3.4ｋｂＤＮＡ断片と１４０ｂｐＤＮＡ断片と
をＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）５Ｕを用いて連結
し、得られたプラスミドをｐＧＧ３と命名した。ｐ“Ｐ
ｒｅＳ”ＤＮＡ４μｇをＸｈｏＩ（宝酒造社製）１Ｕ及
びＳａ１Ｉ（宝酒造社製）１Ｕを用いて完全消化し電気
泳動によつて1.3ｋｂＤＮＡ断片６を調製してくること
によつてＨＢｓＡｇ遺伝子７を含むＤＮＡを得た。ｐＧ
Ｇ３ＤＮＡ１μｇをＳａ１Ｉ（宝酒造社製）で完全消化
したＤＮＡ断片とＨＢｓＡｇを含む1.3ｋｂ断片とをＴ
４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）５Ｕを用いて連結し得
られたプラスミドをｐＧＧ４｛第２図（Ｂ）｝と命名し
た。
ＨＢｓＡｇ遺伝子を酵母内で発現させるためには、酵母
内で自己増殖するＤＮＡ上にＨＢｓＡｇが存在すること
が望ましいが、ｐＧＧ４は酵母内で自己複製できない。
そこでｐＧＧ４を用いた大腸菌、酵母シヤトルベクター
ＪＤＢ２１９｛ジエー・デイー・ベツグス、ネイチヤー
（Ｊ．Ｄ．Ｂｅｇｇｓ、ｎａｔｕｒｅ）、２７５、１０
４｝ＤＮＡ５μｇをＨｉｎｄIIIで完全消化し、3.4ｋｂ
ＤＮＡ断片を調製した。大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２
２ＤＮＡ１μｇをＨｉｎｄIIIを用いて完全消化し、3.4
ｋｂＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼ５Ｕを用いて凍結
した。このようにしてＨｉｎｄIII部位２カ所を持つシ
ヤトルベクターｐＧＬ５を作成した。ｐＧＬ５の２カ所
のＨｉｎｄIII部位のうちの一方をＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社製）を用いて平滑末端にすることにより１カ
所のＨｉｎｄIII部位を持つプラスミドｐＧＬ６（第３
図）を作成した。
内で自己増殖するＤＮＡ上にＨＢｓＡｇが存在すること
が望ましいが、ｐＧＧ４は酵母内で自己複製できない。
そこでｐＧＧ４を用いた大腸菌、酵母シヤトルベクター
ＪＤＢ２１９｛ジエー・デイー・ベツグス、ネイチヤー
（Ｊ．Ｄ．Ｂｅｇｇｓ、ｎａｔｕｒｅ）、２７５、１０
４｝ＤＮＡ５μｇをＨｉｎｄIIIで完全消化し、3.4ｋｂ
ＤＮＡ断片を調製した。大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２
２ＤＮＡ１μｇをＨｉｎｄIIIを用いて完全消化し、3.4
ｋｂＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼ５Ｕを用いて凍結
した。このようにしてＨｉｎｄIII部位２カ所を持つシ
ヤトルベクターｐＧＬ５を作成した。ｐＧＬ５の２カ所
のＨｉｎｄIII部位のうちの一方をＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社製）を用いて平滑末端にすることにより１カ
所のＨｉｎｄIII部位を持つプラスミドｐＧＬ６（第３
図）を作成した。
ｐＧＬ５は、酵母２μＤＮＡ由来の複製開始点と酵母の
マーカー遺伝子であるＬＥＵ２遺伝子を3.4ｋｂＨｉｎ
ｄIIIＤＮＡ断片上に持ち、もう一方のＤＮＡ断片上に
大腸菌の複製開始点と大腸菌のマーカー遺伝子であるテ
トラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃ）をもつ。酵母複製開
始点とＬＥＵ２遺伝子とを得るためにｐＧＬ５ＤＮＡ２
μｇをＨｉｎｄIII１Ｕを用いて完全消化後、電気泳動
によつて3.2ｋｂ断片を調製した。ｐＧＧ４ＤＮＡ１μ
ｇをＨｉｎｄIII１Ｕを用いて完全消化後、3.2ｋｂＤＮ
Ａ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼ５Ｕを用いて連結しプラス
ミドｐＧＧ５を作成した｛第２図（Ｂ）｝。これによつ
てＧＡＰ−ＤＨプロモーターとして充分な長さ（６５２
ｂｐ）のプロモーター領域とＨＢｓＡｇ遺伝子とＧＡＰ
−ＤＨターミネーターを含む酵母内ＨＢｓＡｇ産生用ベ
クターｐＧＧ５｛第２図（Ｂ）｝が作成できた。
マーカー遺伝子であるＬＥＵ２遺伝子を3.4ｋｂＨｉｎ
ｄIIIＤＮＡ断片上に持ち、もう一方のＤＮＡ断片上に
大腸菌の複製開始点と大腸菌のマーカー遺伝子であるテ
トラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃ）をもつ。酵母複製開
始点とＬＥＵ２遺伝子とを得るためにｐＧＬ５ＤＮＡ２
μｇをＨｉｎｄIII１Ｕを用いて完全消化後、電気泳動
によつて3.2ｋｂ断片を調製した。ｐＧＧ４ＤＮＡ１μ
ｇをＨｉｎｄIII１Ｕを用いて完全消化後、3.2ｋｂＤＮ
Ａ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼ５Ｕを用いて連結しプラス
ミドｐＧＧ５を作成した｛第２図（Ｂ）｝。これによつ
てＧＡＰ−ＤＨプロモーターとして充分な長さ（６５２
ｂｐ）のプロモーター領域とＨＢｓＡｇ遺伝子とＧＡＰ
−ＤＨターミネーターを含む酵母内ＨＢｓＡｇ産生用ベ
クターｐＧＧ５｛第２図（Ｂ）｝が作成できた。
実施例１ ＧＡＰ−ＤＨプロモーター領域の限定 ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子のプロモーター領域がどこにあるか
不明であるため、各種制限酵素を用いてプロモーター領
域を限定していつた。ｐＧＧ４２μｇを制限酵素Ｘｍｎ
１（ＮＥＢ社製）１ＵとＨｉｎｄIII（宝酒造社製）１
Ｕで完全消化し電気泳動で1.8ｋｂのＤＮＡ断片（ＧＡ
Ｐ−ＤＨプロモーター（−１６４ｂｐ〜）、ＨＢｓＡｇ
遺伝子、ＧＡＰターミネーターを含む）を調製した。ｐ
ＧＬ６１μｇをＰｖｕII（宝酒造社製）１ＵとＨｉｎｄ
III（宝酒造社製）１Ｕで完全消化し電気泳動で5.6ｋｂ
ＤＮＡ断片を調製した。1.8ｋｂのＤＮＡ断片と5.6ｋｂ
ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用
いて連結し第１図に示したＧＡＰ−ＤＨプロモーターを
有するプラスミドをｐＧＧ６と命名した（第４図）。
不明であるため、各種制限酵素を用いてプロモーター領
域を限定していつた。ｐＧＧ４２μｇを制限酵素Ｘｍｎ
１（ＮＥＢ社製）１ＵとＨｉｎｄIII（宝酒造社製）１
Ｕで完全消化し電気泳動で1.8ｋｂのＤＮＡ断片（ＧＡ
Ｐ−ＤＨプロモーター（−１６４ｂｐ〜）、ＨＢｓＡｇ
遺伝子、ＧＡＰターミネーターを含む）を調製した。ｐ
ＧＬ６１μｇをＰｖｕII（宝酒造社製）１ＵとＨｉｎｄ
III（宝酒造社製）１Ｕで完全消化し電気泳動で5.6ｋｂ
ＤＮＡ断片を調製した。1.8ｋｂのＤＮＡ断片と5.6ｋｂ
ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用
いて連結し第１図に示したＧＡＰ−ＤＨプロモーターを
有するプラスミドをｐＧＧ６と命名した（第４図）。
次にｐＧＧ６及びｐＧＧ５を用いて酵母サツカロミセス
・セレビシエ（Saccharomyces cereviciae）ＧＲＦ１８
（α、ｈｉｓ、ｌｅｕ、ｔｒｐ、ｍｅｔ）を形質転換し
た。得られた形質転換体をロイシンを含まない最小培地
平板｛0.7％イースト ナイトロジエン ベース（Yeast
Nitrogen Base）（Difco）、２％デキストロース、1.5
％寒天｝で純化した。純化したｐＧＧ６／サツカロミセ
ス・セレビシエＧＲＦ１８を上記最小培地（寒天は除
く）で３０℃２日間振盪培養したものを前培養として同
最小培地８０ｍに１％植菌し３０℃２日間培養した。
遠心により集菌し生理食塩水で１回洗浄後緩衝液（５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH7.5、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に
懸濁した。この緩衝液トミー精工社製超音波発生装置Ｕ
Ｒ−２００Ｐを用いて氷冷下、レベル１０にて９分間処
理した後０℃、１３，０００×ｇ１０分間遠心し得られ
た上清のＨＢｓＡｇ活性をアンチヘブセル（ミドリ十字
社製）によるＲＰＨＡ法にて測定した（表１）。
・セレビシエ（Saccharomyces cereviciae）ＧＲＦ１８
（α、ｈｉｓ、ｌｅｕ、ｔｒｐ、ｍｅｔ）を形質転換し
た。得られた形質転換体をロイシンを含まない最小培地
平板｛0.7％イースト ナイトロジエン ベース（Yeast
Nitrogen Base）（Difco）、２％デキストロース、1.5
％寒天｝で純化した。純化したｐＧＧ６／サツカロミセ
ス・セレビシエＧＲＦ１８を上記最小培地（寒天は除
く）で３０℃２日間振盪培養したものを前培養として同
最小培地８０ｍに１％植菌し３０℃２日間培養した。
遠心により集菌し生理食塩水で１回洗浄後緩衝液（５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH7.5、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に
懸濁した。この緩衝液トミー精工社製超音波発生装置Ｕ
Ｒ−２００Ｐを用いて氷冷下、レベル１０にて９分間処
理した後０℃、１３，０００×ｇ１０分間遠心し得られ
た上清のＨＢｓＡｇ活性をアンチヘブセル（ミドリ十字
社製）によるＲＰＨＡ法にて測定した（表１）。
第１図はＧＡＰ−ＤＨ小型化プロモーターの塩基配列
（−２５から−１６４ｂｐ）を示し、第２図（Ａ）およ
び第２図（Ｂ）はＧＡＰ−ＤＨプロモーターを担持する
プラスミドｐＧＧ５の調製を説明する図であり、第３図
はｐＧＬ５およびｐＧＬ６の調製を説明する図、第４図
はＧＡＰ−ＤＨ小型化プロモーターを担持するＨＢｓＡ
ｇ産生用プラスミドの作成を説明する図である。 符号の説明
（−２５から−１６４ｂｐ）を示し、第２図（Ａ）およ
び第２図（Ｂ）はＧＡＰ−ＤＨプロモーターを担持する
プラスミドｐＧＧ５の調製を説明する図であり、第３図
はｐＧＬ５およびｐＧＬ６の調製を説明する図、第４図
はＧＡＰ−ＤＨ小型化プロモーターを担持するＨＢｓＡ
ｇ産生用プラスミドの作成を説明する図である。 符号の説明
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 須山 忠和 京都府綴喜郡田辺町松井ヶ丘４−３−７ (56)参考文献 特開 昭59−210888（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，1981 Ｐ. 317−334
Claims (1)
- 【請求項１】酵母グリセルアルデヒド−３−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ−ＤＨ）プロモーターにお
いて、以下の塩基配列のＤＮＡ配列をプロモーターとし
て利用することを特徴とする蛋白質の製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES198686113675T ES2028779T3 (es) | 1985-10-03 | 1986-10-03 | Promotor de levadura y procedimiento para preparar proteina heterologa. |
| EP86113675A EP0218209B1 (en) | 1985-10-03 | 1986-10-03 | Yeast promoter and process for preparing heterologous protein |
| DE8686113675T DE3683821D1 (de) | 1985-10-03 | 1986-10-03 | Hefepromotor und verfahren zur herstellung eines heterologen proteins. |
| US07/397,347 US5021339A (en) | 1985-10-03 | 1989-08-24 | Yeast promoter truncated GAP-DH |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60-219191 | 1985-10-03 | ||
| JP21919185 | 1985-10-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62175180A JPS62175180A (ja) | 1987-07-31 |
| JPH0655155B2 true JPH0655155B2 (ja) | 1994-07-27 |
Family
ID=16731633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61021198A Expired - Lifetime JPH0655155B2 (ja) | 1985-10-03 | 1986-02-04 | 蛋白質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0655155B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04121194A (ja) * | 1990-09-11 | 1992-04-22 | Tax Adm Agency | アスペルギルスオリゼの新規プロモーター |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341116C (en) * | 1983-02-22 | 2000-10-17 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein |
-
1986
- 1986-02-04 JP JP61021198A patent/JPH0655155B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８１Ｐ．３１７−３３４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62175180A (ja) | 1987-07-31 |
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