DE69535739T2

DE69535739T2 - Methode zur Kontrolle genetischer Expressionen

Info

Publication number: DE69535739T2
Application number: DE69535739T
Authority: DE
Inventors: Masayuki Tatebayashi-shi Yabuta; Seiko Konosu-shi Miura; Kazuhiro Ohra-gun Ohsuye
Original assignee: Asubio Pharma Co Ltd
Current assignee: Asubio Pharma Co Ltd
Priority date: 1994-06-01
Filing date: 1995-05-31
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2015-06-01
Also published as: JP3723240B2; HUT72398A; EP0685560A2; HU217580B; KR100380703B1; US5622840A; KR960001124A; ATE391182T1; EP0685560B1; EP0685560A3; HU9501578D0; IL113932A0; IL113932A; JPH0848697A; DK0685560T3; DE69535739D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Kontrolle der Genexpression unter Verwendung des Escherichia coli-Lactose-Repressorgens mit einer temperaturempfindlichen Mutation. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Genexpression unter Verwendung des Verfahrens zur Kontrolle der Genexpression und genauer gesagt ein Verfahren zur Kontrolle der Genexpression durch Kontrolle der Temperatur zur Kultivierung von Wirtszellen.
2. VERWANDTER STAND DER TECHNIK
Eine Expressionskontrollgenregion des E. coli-Lactose-Operons, d. h., eine Genregion von einem lac-Gen, kodierend ein Repressorprotein zu einem Promotor/Operator ist eine der Kontrollgenregionen, die besonders häufig für die Expression eines Gens verwendet wird, das stromabwärts von der Kontrollgenregion lokalisiert ist. Der Grund hierfür ist, dass, wenn eine induzierende Substanz, wie Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) in Wirtszellen existiert, der Lactoserepressor nicht an die Lactoseoperatorregion binden kann und die Transkription von dem Lactosepromotor auftritt, was eine Transkriptionskontrolle während der Genexpression ermöglicht.
Verschiedene Klonierungsvektoren und Genexpressionsvektoren zur Produktion nützlicher Substanzen werden aufgrund der Tatsache verwendet, dass eine Genexpression erfolgreich durch Addition eines induzierenden Mittels, wie IPTG, zu einem Kulturmedium durchgeführt werden kann. Beispielsweise werden Mitglieder der pUC-Reihe, wie pUC18 usw., als Genklonierungsvektor, der M13-Phagenreihe zur Bestimmung einer Nukleotidsequenz der DNA, λgt11 usw. für ein cDNA-Klonieren verwendet. In letzter Zeit wurde dieses Expressionskontrollsystem ebenfalls bei Studien unter Verwendung tierischer Zellen verwendet (Ulrich Deuschele et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86, S. 5400–5404, 1989; Mickey C.-T. Hu et al., Mol Cell. Biol. Bd. 10, S. 6141–6151, 1990).
Zusätzlich wurde dieses Expressionskontrollsystem für die Erzeugung nützlicher Substanzen verwendet (Mercedes Zazo et al., Gene, Bd. 113, S. 231–238, 1992). Dieses System hat jedoch darin Nachteile, dass IPTG als teures induzierendes Mittel dem Kulturmedium zugefügt werden muss, um die Expression der Gene zu induzieren. Insbesondere wenn dieses System für die Erzeugung nützlicher Substanzen in industriellem Umfang verwendet wird, erhöht die Verwendung von IPTG die Produktionskosten.
Dementsprechend besteht ein Bedarf an einem industriell nützlichen neuen Verfahren zur Kontrolle der Expression eines Gens. Dementsprechend soll im Hinblick auf die Expression eines gewünschten Gens die Entwicklung eines Systems zur Kontrolle der Expression eines Gens ohne Verwendung eines teuren Induktionsmittels, wie IPTG, und eines Verfahrens zur Expression eines Gens unter Verwendung dieses Kontrollsystems gesucht werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der gegenwärtige Erfinder hat als Ergebnis einer Suche nach Repressorproteinen in dem Expressionskontrollgen des E. coli-Lactoseoperons ein neues Lactoserepressorprotein aufgefunden. Dieses Repressorprotein bindet den Operator und inhibiert die Transkription bei niedriger Temperatur, ist jedoch bei hoher Temperatur inaktiviert und kann den Operator nicht binden und daher ist das Repressorprotein ein temperaturempfindliches mutiertes Repressorprotein. Die vorliegende Erfindung verwendet das obige neue Repressorprotein.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Lactoserepressorprotein bereit, wobei mindestens die Aminosäure an der Position, korrespondierend zu Position 265 und optional eine Aminosäure an Position 94, 241 oder 300 im Wildtyp-E. coli-Lactoserepressor durch eine andere Aminosäure ersetzt ist als diejenige im Wildtyp-Lactoserepressor.
Der oben erwähnte Ersatz der Aminosäuren kann eine Mutation an der 94sten Aminosäure Valin zu Methionin, eine Mutation an der 241sten Aminosäure Alanin zu Threonin, eine Mutation an der 265sten Aminosäure Glycin zu Asparaginsäure und/oder eine Mutation an der 300sten Aminosäuresäure zu Asparagin, Phenylalanin oder Prolin beinhalten. Ein Beispiel für die Aminosäuresequenz eines mutierten Lactoserepressorproteins ist in SEQ ID Nr. 20 dargestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Gen bereit, das das oben erwähnte temperaturempfindliche Lactoserepressorprotein kodiert (Lactaserepressorproteingen). Ein Beispiel für eine Nucleotidsequenz dieses Gens ist in SEQ ID Nr. 20 dargestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zur Kontrolle der Expression eines Gens bereit, das ein gewünschtes Protein (gewünschte Gen) in einer Wirtszelle kodiert, enthaltend das Lactoserepressorproteingen und das gewünschte Gen, gekennzeichnet durch eine Kontrolle der Expression des gewünschten Gens durch Regulation einer Funktion des Lactoserepressorproteins durch Veränderung der Temperatur zur Kultivierung der Wirtszelle.
Bei diesem Verfahren wird das Lactoserepressorproteingen in ein Chromosom des Wirts oder in eine extrachromosomale Einheit, wie ein Plasmid, beispielsweise einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor, eingeführt. Die Wirtszellen beinhalten beispielsweise Prokaryonten, z. B. Bakterien, wie E. coli, und Eukaryonten, beispielsweise niedere Eukaryonten, wie Pilze, Hefe, und höherer Eukaryonten, wie Säugerzellen, Insektenzellen oder ähnliches. Im gegenwärtigen Verfahren wird die Expression des gewünschten Gens bei einer Raumtemperatur von beispielsweise 30°C oder niedriger reprimiert und die Expression des gewünschten Gens wird bei einer höheren Temperatur, beispielsweise 35°C oder einer höheren Temperatur, beispielsweise 37°C oder einer höheren Temperatur dereprimiert.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Expression eines Gens bereit, das ein gewünschte Protein kodiert (gewünschtes Gen), gekennzeichnet durch Kontrolle der Expression des gewünschten Gens durch Regulation einer Funktion des Lactoserepressorproteins durch Veränderung einer Temperatur zur Kultivierung von Wirtszellen, die mit einem Expressionsvektor transformiert sind, umfassend das Lactoserepressorproteingen und das gewünschte Gen. Bei diesem Verfahren sind die Wirtszellen und die Kontrolle der Kultivierungstemperatur wie oben beschrieben.
KURZE ERKLÄRUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Grafik, die eine Wirkung einer Kulturtemperatur auf eine β-Galactosidaseproduktion darstellt.
2 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pY01 von den Plasmiden pMC9-1 und pMW119.
3 zeigt eine Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese, die die Wirkungen der Kulturtemperatur und eines Induktionsmittels auf die Produktion eines Proteins darstellt.
4 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pMC9-SalI.
5 zeigt ein Verfahren für die Konstruktion verschiedener Plasmide, enthaltend eine ortsgerichtete Mutation an der 300sten Position.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Plasmid pMC9, das ein lacI-Gen trägt, das ein Lactoserepressorprotein kodiert, wird mit dem Mutagen Hydroxylamin behandelt, um eine Mutation im lacI-Gen einzuführen. Das so behandelte Plasmid wird verwendet, um den lacI-Gen-mutierten MYW3110-Stamm, der von E. coli K12 abstammt, zu transformieren. Die transformierten Zellen werden auf Agarplatten inoku liert, die Ampicillin und 5-Brom-4-chlor-3-indoly1-β-D-galactopyronosid (X-gal) enthalten und bei 38°C über Nacht kultiviert.
Nach der Kultur werden blaue Kolonien selektiert und auf dieselben beiden Platten inokuliert und eine Platte wird bei 30°C und eine andere bei 38°C über Nacht inkubiert. Durch dieses Screening-Verfahren werden 7 temperaturempfindliche Mutanten erhalten, die eine weiße Farbe bei 30°C und eine blaue Farbe bei 38°C zeigen. Um zu bestätigen, dass die so erhaltenen Mutationen innerhalb des lacI-Gens auf dem Plasmid aufgetreten sind, wurden die Plasmide von jeder temperaturempfindlichen Mutante isoliert und die Nucleotidsequenz des lacI-Gens wurde bestimmt.
Im Ergebnis wurde festgestellt, dass der 300ste Serinrest des Lactoserepressorproteins in einen Asparaginrest umgewandelt wurde, der 241ste Alaninrest in einen Threoninrest, der 265ste Glycinrest in einen Asparaginsäurerest und der 94ste Valinrest in einen Methioninrest. Die Mutationen an diesen Positionen sind nicht in den so weit als temperaturempfindliche Mutationen berichteten Mutationen beinhaltet und die oben erwähnte mutierte Sequenz ist eine neue, die durch die vorliegende Erfindung erstmalig isoliert und identifiziert wurde.
Als nächstes wurden diese isolierten Lactoserepressorgene mit den temperaturempfindlichen Mutationen getestet um zu bestimmen, ob diese mutierten Gene verwendet werden können, um die Expression eines Gens zu kontrollieren. Zunächst wurde das mutierte lacI-Gen mit der oben erwähnten Mutation in ein Plasmid mit einer Kompatibilität mit einem Colicin E1-abgeleiteten Plasmid, beispielsweise pMW119 inseriert, um die neuen Plasmide pY01, pY02 und pY016 zu konstruieren. Als nächstens kann als Beispiel für ein exprimierendes Protein ein Fusionsprotein eines menschlichen Calcitonin-Vorläuferpeptids erwähnt werden. Das Plasmid pG97S4DhCT(GRRR), isoliert von einem Stamm, der das oben erwähnte Fusionsprotein erzeugt, wird durch Transformation in E. coli MYW3110/pY01, MYW3110/pY02 und MYW3110/pY016, enthaltend das Plasmid pY01, pY02 bzw. pY016 eingeführt, um Transformanten zu erhalten.
Merke, E. coli W3110, enthaltend das Plasmid pG97S4DhCT[G], das im wesentlichen dasselbe ist wie das Plasmid pG97S4Dh[GRRR] wurde als Escherichia coli SBM323 bezeichnet und beim National Institute of Bioscience and Human Technolgy Agency of Industrial Science and Technologie unter dem Budapester Vertrag am 8. August 1991 hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer FERN BP-3503. Der Unterschied zwischen den Plasmiden pG97S4DhCT[GRRR] und pG97S4DhCT[G] ist nur derjenige, dass pG97S4DhCT[G] ein Fusionsprotein kodiert, worin das gewünschte Protein ein Glycin am C-Terminus aufweist, während pG97S4DhCT[GRRR] das Fusionsprotein kodiert, worin das gewünschte Protein drei zusätzliche Argininreste nach dem Glycin aufweist.
Die so erhaltenen Transformanten wurden bei 30°C und dann weiter bei 37°C kultiviert, um die Produktion des Proteins zu testen (insbesondere des Fusionsproteins). Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Produktion des Proteins bei 30°C nicht induziert wurde, während die Produktion bei 37°C induziert wurde und daher wurde belegt, dass das Repressorprotein mit der temperaturempfindlichen Mutation und das hierfür kodierende Gen verwendet werden kann, um die Expression eines Gens zu kontrollieren.
Es wird betrachtet, dass die Positionen der oben erwähnten Mutationen die Positionen auf der hochdimensionalen Struktur des Lactoserepressorproteins sind, die gegenüber Temperaturveränderungen hoch labil sind. Anders ausgedrückt wird betrachtet, dass die Positionen der Mutationen wichtig sind, um die hochdimensionale Struktur des Lactoserepressorproteins zu erhalten. Dementsprechend wird erwartet, dass weitere temperaturempfindliche Mutanten des Lactoserepressorproteins durch Insertion anderer Aminosäurereste in die Positionen erhalten werden können, an der die Mutation auftrat.
So wurden mutierte lacI-Gene, worin das Kodon für die 300ste Aminosäure des Lactoserepressorproteins durch ein Kodon für eine der 18 Aminosäuren ersetzt worden war, durch in vitro-Mutagenese erhalten und die Temperaturempfindlichkeit der mutierten lacI-Gene wurde getestet. Im Ergebnis zeigten die mutierten Gene, worin das Kodon der 300sten Aminosäure durch ein Kodon einer anderen Aminosäure ersetzt wird, insbesondere Phenylalanin oder Prolin, den temperaturempfindlichen Phänotyp.
Es wurde bestätigt, dass die temperaturempfindlichen Mutationsstellen des isolierten Repressorproteins der vorliegenden Erfindung, d. h., die Aminosäurereste, an den 94sten, 241sten, 265sten und 300sten Positionen des Lactoserepressorproteins wichtig sind, um die hochdimensionale Struktur des Proteins zu erhalten. Dementsprechend kann eine temperaturempfindliche Mutation durch Ersatz der Aminosäurereste an den oben erwähnten Positionen durch andere Aminosäurereste eingeführt werden. In den hiernach dargestellten Beispielen wurde die Produktion des Proteins tatsächlich überprüft und es wurde dargestellt, dass die Repressorgene der vorliegenden Erfindung, die die temperaturempfindliche Mutation involvieren, zur Kontrolle der Expression eines gewünschten Gens verwendet werden können.
Aminsäuresequenzen der Lactoserepressorproteine, die zu der vorliegenden Erfindung in Bezug stehen und Nucleotidsequenzen hierfür sind in der SEQ ID Nr. 20 dargestellt. Unter diesen Aminosäuresequenzen ist die Amino säuresequenz, worin die 94ste Xaa Val ist, die 241ste Xaa Ala ist, die 265ste Xaa Gly ist und die 300ste Xaa Ser ist, die Aminosäuresequenz des Wildtyp-Lactoserepressorproteins. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die 265ste Xaa Asp und optional die 94ste Xaa Met; die 241ste Xaa ist Thr, die 300ste Xaa ist Asn, Phe oder Pro.
Wie oben beschrieben, wird vernünftigerweise betrachtet, dass nicht nur die Lactoserepressorproteine, worin die Position 265 und optional eine der Positionen 94, 241 und 300 mutiert ist, sondern auch Lactoserepressorproteine, worin zwei Positionen, d. h., die Position 94 und 265 mutiert sind; Lactoserepressorproteine, worin drei Positionen mutiert sind, d. h., die Positionen 94, 241 und 265 oder die Positionen 241, 265 und 300, wie auch ein Lactoserepressorprotein, worin alle vier Positionen mutiert sind, d. h., die die Positionen 94, 241, 265 und 300 temperaturempfindlich sind und sich im Umfang der vorliegenden Erfindung befinden.
Wie aus der Tastsache ablesbar ist, dass die 300sten Aminosäure Serin durch Asparagin, Phenylalanin oder Prolin ersetzt werden kann, ist die Aminosäure, die eine native Aminsäure an einer bestimmten Position ersetzt, nicht auf eine Aminosäure begrenzt. Obwohl die 265ste native Aminosäure Glycin durch Asparaginsäure ersetzt werden kann, kann die 241ste native Aminosäure Alanin durch Threonin und die 94ste native Aminosäure Valin durch Methionin ersetzt werden, Aminosäuren, die die nativen Aminosäuren an den oben erwähnten Positionen ersetzen, sind nicht auf die oben beschriebenen begrenzt.
Gemäß demselben Verfahren wie für den Ersatz der 300sten Position beschrieben, können nämlich Aminosäuren, die die 265ste, 241ste und 94ste Position ersetzen, bestimmt werden. Insbesondere wird eine ortspezifische Mutation durchgeführt, um die nativen Aminosäuren an den oben erwähnten Positionen zu ersetzen, und DNA, die das ortsmutierte Repressorprotein kodiert, wird synthetisiert. Als nächstes können gemäß demselben Verfahren, wie für die 300ste Positionsmutation beschrieben, die Aminosäuren, die an den oben erwähnten Positionen lokalisiert sind, durch eine Aminosäure ersetzt werden, die den Lactoserepressor temperaturempfindlich macht.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Erfindung von Genen, die die oben erwähnten verschiedenen Lactoserepressorproteine kodieren. Dieses Gene haben verschiedene Nucleotidsequenzen aufgrund der Redundanz der genomischen Kodons. Diese Gene können so synthetisiert werden, dass sie Nucleotidsequenzen aufweisen, die auf der Basis der Aminosäuresequenzen entworfen wurden. Alternativ können diese Gene durch ortsgerichtete Mutagenese der Kodons der DNA, die die nativen Aminosäuren oder nicht-nativen Aminosäuren kodieren, die sich von den gewünschten Aminosäuren unterscheiden, erhalten werden. Eine DNA, die ein Lactoserepressorprotein mit mehr als einer Mutation kodiert, kann chemisch synthetisiert werden oder durch ortspezifische Mutation erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zur Kontrolle der Expression eines Gens bereit, das ein gewünschtes Protein kodiert (gewünschtes Gen), wobei die gegenwärtigen temperaturempfindlichen Lactoserepressorproteine verwendet werden. Dieses Verfahren kann durchgeführt werden, indem ein temperaturempfindliches Lactoserepressorgen und eine Lactoseoperatorgenregion, verbunden mit einem Gen, das ein gewünschtes Protein kodiert (gewünschtes Gen) in derselben Zelle enthalten sind und indem die Kulturtemperatur kontrolliert wird. Das Regressorgen und das gewünschte Gen können auf demselben Gen oder auf unterschiedlichen Genen existieren.
Beispielsweise können das Regressorgen und das gewünschte Gen auf demselben extrachromosomalen Gen existieren. Hier bedeutet extrachromosomales Gen ein selbst-replizierbares Plasmid, einen Phagen, ein Virus usw.
Temperaturempfindliche Lactoserepressorproteine der vorliegenden Erfindung reprimieren die Expression eines gewünschten Gens, verbunden mit einem Lactoseoperator bei einer Kultivierungstemperatur von bis zu 30°C, beispielsweise 20 bis 30°C, während sie die Expression des gewünschten Gens, verbunden mit dem Lactoseoperator bei einer Kulturtemperatur von 35°C oder mehr, beispielsweise 37°C oder mehr, nicht reprimieren. Dementsprechend kann ein gewünschtes Gen durch Züchten von Wirtszellen bei einer Temperatur von 30°C oder weniger exprimiert werden und durch Erhöhung der Temperatur auf 35°C oder mehr, beispielsweise 37°C oder mehr.
In der vorliegenden Erfindung verwendete Wirtszellen können alle Zellen sein, die konventionell für die Expression eines gewünschten Gens durch Genrekombinationsverfahren verwendet werden. Beispielsweise können prokaryontische Zellen, wie z. B. Bakterien, wie Escherichia coli, Bacillus, wie Bacillus brevis; und niedere eukaryontische Zellen, beispielsweise Hefe, wie Saccharomyces, wie Saccharomyces cerevisiae, alkohol assimilierende Hefe, wie Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida boidinii und weiter filamentöse Pilze, wie Aspergillus, verwendet werden.
Zusätzlich können höhere eukaryontische Zellen, wie beispielsweise tierische Zelle, wie COS-Zellen, CHO-Zellen (Chinesische Hamster-Ovarzellen), BHK-Zellen (Baby-Hamster-Nierenzellen) und Insektenzellen, wie SF9-Zellen und ähnliche verwendet werden.
Obwohl die hiernach dargestellten Beispiele einen Lactosepromotor verwenden, können auch andere geeignete Promotoren in der vorliegenden Er findung verwendet werden. Das vorliegende Repressorgen kann nämlich auf Systeme angewandt werden, die die Expression eines gewünschten Gens unter Verwendung von Expressionsvektoren oder Klonierungsvektoren (beispielsweise Plasmiden, Phagen usw.) kontrollieren, umfassend jedes geeignete Promotorregiongen und ein Lactoseoperatorregiongen, das stromabwärts von dem Promotorregiongen positioniert ist. Geeignete Promotorregionen, die nicht der Lactosepromotor sind, beinhalten tac, trc, lacUV5 usw., obwohl sie nicht auf diese begrenzt sind.
Jedes Protein und jedes Peptid, das durch Genrekombination erzeugt werden kann, kann durch das vorliegende Verfahren erzeugt werden. Diese Proteine oder Peptide beinhalten beispielsweise biologisch aktive Peptide, wie Insuline, Wachstumshormone, diuretische Peptide (insbesondere C-Typ-natriuretische Peptide; CNP), Calcitonine, Parathyroidhormone (PTH1-34, PTH1-84 usw.), biologisch aktive Proteine, wie Zelldifferenzierungswachstumsfaktoren, Zellwachstums-inhibierende Faktoren und weitere physiologisch wichtige Enzyme.
Das temperaturempfindliche Lactoserepressorproteingen der vorliegenden Erfindung kann durch Insertion in eine extrachromosomale Einheit, wie ein Plasmid oder ein Chromosom eines Wirts zur Kontrolle der Expression eines gewünschten Gens verwendet werden. Die hiernach beschriebenen Beispiele verwenden Plasmide.
Die vorliegende Erfindung ist von einem industriellen Standpunkt aus betrachtet sehr wichtig, das die temperaturempfindlichen mutierten Lactoserepressorgene die Expression eines Gens, das ein gewünschtes Peptid oder Protein kodiert, bereitstellen, ohne dass ein teures Induktionsmittel, wie IPTG, verwendet werden muss.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird weiter in den vorliegenden Beispielen erklärt, obwohl sie nicht darauf begrenzt sein soll.
BEISPIEL 1
Konstruktion eines Lactoserepressor-mutierten Stamms, abstammend von E. coli W3110
Unser Zweck in dieser Erfindung ist die Isolation temperaturempfindlicher Mutanten des lacI-Gens und ihre Anwendung zur Kontrolle einer gewünschten Genexpression. Um ein Lactoserepressorgen (lacI-Gen) zu isolieren, das eine temperaturempfindliche Mutation aufweist, konstruierten wir zunächst einen lacI^–Wirtsstamm wie folgt. Es ist bekannt, dass wenn der Lactoserepressor mutiert wird, β-Galactosidase konstitutiv exprimiert wird (konstitutiver Phänotyp) und als Verfahren zur Isolation einer solchen Mu tante ist ein Screening-Verfahren unter Verwendung von Phenyl-β-D-galactosid bekannt (J. H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Laboratory Manual, S. 131–134, Cold Spring Harbor Laboratory, 1992).
Gemäß diesem Verfahren wurden Zellen des Elternstamms von E. coli W3110 (erhältlich als ATCC 14948) auf Agarplatten, die Phenyl-β-D-galactosid als Kohlenstoffquelle enthielten, ausplattiert und zwei Tage bei 37°C kultiviert. Nach der Kultur wurden die Kolonien isoliert und eine Lactoserepressormutante, die eine konstitutive Expression von β-Galactosidase zeigte, wurde gewählt und als E. coli MYW3110 gezeichnet.
BEISPIEL 2
Isolation eines Lactoserepressorgens mit einer temperaturempfindlichen Mutation
Das Plasmid pMC9 ist ein Derivat von pBR322 und liegt in E. coli Y1089 vor (Huynh, T. V. et al., (1985) DNA Cloning, Bd. 1, IRL Press Limited, Oxford, England, S. 49–78; erhältlich von Invitrogen; Katalog-Nr. 789-02).
10 μg pMC9 wurden zu 1 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) zugefügt, enthaltend 100 M NaCl, 2 mM EDTA und 1 M Hydroxylamin und die Reaktion wurde bei 65°C für 30 Minuten durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde gegen 5 1 TE (10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) dialysiert und eine Ethanolausfällung wurde gemäß einem konventionellen Verfahren durchgeführt und das resultierende Präzipitat wurde in 20 μl TE gelöst. 4 μl der Lösung wurden verwendet, um E. coli MYW3110 gemäß dem konventionellen Calciumchloridverfahren zu transformieren.
Die Transformanten wurden auf L-Agarplatten (Polypepton 10 g, NaCl 5 g, Hefeextrakt 5 g und Agar 15 g in 1 1 deionisiertem Wasser), supplementiert mit 40 μg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indoryl-β-D-galactopyranosid (X-gal) und 50 μg/ml Ampicillin ausplattiert und über Nacht bei 38°C kultiviert. Unter den Transformanten wurden diejenigen Kolonien, die eine blaue Farbe auf diesem Medium bereitstellten, selektiert und die Kolonien wurden auf zwei Agarplatten mit der oben erwähnten Zusammensetzung inokuliert und eine Agarplatte wurde bei 30°C über Nacht und eine andere Agarplatte bei 38°C über Nacht inkubiert.
Im Ergebnis wurden 7 Transformanten, die eine weiße Farbe bei 30°C und eine blaue Farbe bei 38°C bereitstellten, erhalten. Um zu bestätigen, dass die temperaturempfindliche Mutation auf dem lacI-Gen existiert, wurde das Plasmid von jeder Transformante gemäß dem konventionellen alkalischen Denaturierungsverfahren isoliert und das Plasmid wurde verwendet, um wiederum E. coli MYW3110 zu transformieren, um zu bestätigen, dass die Trans formante denselben Phänotyp zeigte. Die Plasmide wurden als pMC9-1, pMC9-2, pMC9-6, pMC9-16, pMC9-17, pMC9-22 und pMC9-24 bezeichnet.
BEISPIEL 3
Bestimmung der Position der Mutation
Um die Position der Mutation auf dem lacI-Gen der oben erwähnten Plasmide pMC9-1, pMC9-2, pMC9-6, pMC9-16, pMC9-17, pMC9-22 und pMC9-24 zu bestimmen, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Das Plasmid wurde durch das Ultrazentrifugationsverfahren gereinigt und unter Verwendung eines T7 Sequencing TM-Kit (Pharmacia) mit chemisch synthetisierten Primern synthetisiert. Die 20 mer-Primer waren die folgenden:
Für das Sequenzieren verwendete Primer
Primer 1; 5'-GCAACGCCAATCAGCAAC-3' (SEQ ID Nr. 1)
Primer 2; 5'-GGGTGTCTGGTCAGAGAC-3' (SEQ ID Nr. 2)
Primer 3; 5'-ATCGTTGGCAACCAGCATCGCA-3' (SEQ ID Nr. 3)
Primer 4; 5'-CGCCGTCGCAAATTGTCG-3' (SEQ ID Nr. 4)
Primer 5; 5'-CTCCCATGAAGACGGTACG-3' (SEQ ID Nr. 5)
Primer 6; 5'-GCAATGCGCGCCATTACC-3' (SEQ ID Nr. 6)
Primer 7; 5'-CATCGAATGGCGCAAAA-3' (SEQ ID Nr. 7)
Wenn das erste "G" des Translationsinitiationskodons GTG des lacI-Gens als Nucleotidnummer 1 genommen wird, korrespondiert Primer 1 zu den Nucleotidnummern 183 bis 200, der Primer 2 zu den Nucleotidnummern 448 bis 465, Primer 3 zu den Nucleotidnummern 720 bis 741, Primer 4 zu den Nucleotidnummern 224 bis 241, Primer 5 zu den Nucleotidnummern 483 bis 501, Primer 6 zu den Nucleotidnummern 757 bis 774 und Primer 7 zu den Nucleotidnummern –72 bis –56 stromaufwärts zum Translationsstartkodon. Als obere Primer wurden die Primer 1 bis 3 und 7 verwendet und als untere Primer wurden die Primer 4 bis 6 verwendet. Die DNA-Sequenzen der isolierten Gene und Aminosäuresequenzen, die durch die Gene kodiert werden sind in SEQ ID Nr. 20 dargestellt.

Ein Vergleich der mutierten lacI-Gene, die von den vorliegenden Erfindern isoliert wurden, mit dem Wild-lacI-Gen, wie beschrieben von H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, Handbook Section 16, Cold Spring Harbor Laboratory 1992) ist in Tabelle 1 dargestellt. Wie in Tabelle 1 dargestellt, wurde in den Plasmiden pMC9-1, pMC9-17 und pMC9-24 das Kodon AGC, das die 300ste Aminosäure Serin kodierte, zum Kodon AAC mutiert, das Asparagin kodiert; in den Plasmiden pMC9-16 und pMC9-22 wurde das Kodon GCG, das die 241ste Aminosäure Alanin kodiert, zu dem Kodon ACG, kodierend für Threonin, mutiert; in Plasmid pMC9-2 wurde das Kodon GGT, das die 265ste Aminosäure Glycin kodiert, zu dem Kodon GAT, kodierend Asparagin säure, mutiert und in Plasmid pMC9-6 wurde das Kodon GTG, das die 94ste Aminosäure Valin kodiert, zu dem Kodon ATG, kodierend Methionin, mutiert. TABELLE 1 Positionen der Mutation auf dem temperaturempfindlichen lacI-Gen

Plasmid	Aminosäure Nr.	Wildtyp		Mutant
Plasmid	Aminosäure Nr.	Aminosäure	Kodon	Aminosuäre	Kodon
pMC9-1 pMC9-17 pMC9-24	300	Serin	AGC	Asparagin	AAC
pMC9-16 pMC9-22	241	Alanin	GCG	Threonin	ACG
pMC9-2	265	Glycin	GGT	Asparaginsäure	GAT
pMC9-6	94	Valin	GTG	Methionin	ATG

Verschiedene Mutanten des Lactoserepressors werden von J. H. Miller et al., J. M. Biol. (1990), Bd. 212, S. 295–318 berichtet. Die Positionen der Mutation, die die Temperaturempfindlichkeit der vorliegenden Erfindung bereitstellen, unterscheiden sich von denjenigen von Miller et al. und die vorliegenden mutierten Lactoserepressoren sind neu.
Es ist bekannt, das der Lactoserepressor zwei funktionale Domänen mit unterschiedlichen Funktionen aufweist. Nämlich, die N-terminalen 59 Aminosäurereste des Proteins, die an die Operator-DNA binden und der verbleibende "Kern"-Bereich des Proteins, der sowohl für die Oligomerbildung als auch die Bindung an ein Induktionsmittel, wie IPTG, benötigt wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Regressorgen existieren Mutationen auf den Kodons, die die 94ste, 241ste, 265ste und 300sten Aminosäurereste des Lactoserepressorproteins kodieren. Die Region, die diese Mutationen enthält, korrespondiert zu der "Kern"-Region. Dementsprechend werden bei höherer Temperatur diese Mutationen mit hoher Wahrscheinlichkeit zu einer Unfähigkeit zur Tetramerbildung führen oder eine strukturelle Veränderung des Repressorproteins auslösen, wobei die Struktur simuliert wird, die durch Bindung an ein Induktionsmittel gebildet wird.
Als nächstes wurden die Plasmide pMC9-1, pMC9-2 und pMC9-16, die bevorzugte Eigenschaften in Bezug auf eine temperaturempfindliche Mutation aufwiesen, weiter getestet.
BEISPIEL 4
Beziehung zwischen dem temperaturempfindlichen mutierten Lactoserepressor und der Kulturtemperatur
In dem oben beschriebenen Beispiel 3 wurden die Eigenschaften der temperaturempfindlichen Mutationen des Lactoserepressors bei 30°C, was eine niedrigere Temperatur repräsentiert, und bei 38°C, was eine höhere Temperatur repräsentiert, untersucht. Es wird von weiterer Wichtigkeit zur Bestimmung bevorzugter Kulturbedingungen für eine Transformante betrachtet, eine kritische Temperatur zu bestimmen, unter derer die Expression nicht induziert wird und über derer die Expression induziert wird. Daher wurde eine Inokulumkultur, die durch Kultivierung der Transformante bei 30°C hergestellt worden war, weiter in einem Testkulturmedium bei einer Temperatur von 35°C, 37°C, 40°C, 42°C oder 45°C kultiviert, um die oben erwähnte kritische Temperatur unter Verwendung einer Indikator-E-galactosidaseaktivität, exprimiert durch das Wirtschromosom zu bestimmen.
Es wurden nämliche E. coli MYW3110/pMC9-1, E. coli MYW3110/pMC9-2 und E. coli MYW3110/pMC9-16 separat auf 3 ml L-Medium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin inokuliert und über Nacht bei 30°C kultiviert. Der OD660-Wert der Kultur wurde gemessen und ein Volumen der Kultur, worin ein Wert von OD660 der Kultur mal dem Volumen der Kultur 0,5 beträgt, wurde auf 2 ml L-Medium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin bei einer Temperatur von 30, 35, 37, 40, 42 oder 45°C 3 Stunden inokuliert.
Eine exprimierte β-Galactosidaseaktivität wurde unter Verwendung von ONPG(O-Nitrophenyl-β-D-galactosid) als Substrat gemäß dem Miller et al.-Verfahren (Experiment in Molecular Genetics, S. 352–355, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) gemessen. Ein Ergebnis ist in 1 dargestellt. Wie sich aus 1 ablesen lässt, erzeugten E. coli MYW3110/pMC9-1, E. coli MYW3110/pMC9-2 und E. coli MYW3110/pMC9-16 substantiell keine β-Galactosidaseaktivität bei 30°C, was zeigte, dass die Expression des A-Galactosidasegens reprimiert war, während bei einer Temperatur von 35 bis 37°C die Expression des β-Galactosidasegens auftrat.
Die kritische Temperatur, bei der die Expression des Gens induziert wird, d. h., die Temperatur, bei der der Lactoserepressor nicht funktionell wird, beträgt 35°C für E. coli MYW3110/pMC9-1, E. coli MYW3110/pMC9-2 und 37°C für E. coli MYW3110/pMC9-16. Alle oben beschriebenen E. coli-Stämme induzierten die maximale Expression des lacZ-Gens bei einer Temperatur von 40°C. Dementsprechend kann das gegenwärtige temperaturempfindliche mutierte Lactoserepressorgen zufriedenstellend für die Expression eines gewünschten Gens bei 37°C verwendet werden, was als beste Temperatur für das Wachstum von Wirtszellen betrachtet wird und für experimentelle oder Kulturen in großem Umfang von Wirtszellen verwendet wird.
BEISPIEL 5
Kontrolle der Genexpression unter Verwendung des temperaturempfindlichen mutierten Lactoserepressorgens zur Produktion nützlicher Fusionsproteine
Das oben beschriebene Beispiel 4 betrifft die Kontrolle der Expression des β-Galactosidasegens auf einem Wirtschromosom unter Verwendung des temperaturempfindlichen mutierten Lactoserepressorgens. Das gegenwärtige Beispiel 5 ist auf ein anderes Objekt der vorliegenden Erfindung gerichtet, d. h., ein Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens durch Kontrolle einer Kulturtemperatur für eine Transformante unter Verwendung des temperaturempfindlichen mutierten Lactoserepressors.
Die vorliegenden Erfinder versuchten nämlich, das gegenwärtige temperaturempfindliche mutierte Lactoserepressorgen zu verwenden, um die Expression eines Fusionsproteins zu kontrollieren, das ein β-Galactosidasederivat und ein menschliches Calcitonin-Vorläuferpeptid umfasste, als Beispiel eines gewünschten Proteins, durch ein Expressionsplasmid, umfassend eine Promotor/Operatorregion des Lactoseoperons als Expressionskontrollgenregion und eines Gens, kodierend das Fusionsprotein, stromabwärts von der Expressionskontrollgenregion.
Als erstes wurde das Plasmid pMC9-1 mit EcoRI gespalten, um eine temperaturempfindliche mutierte Lactoserepressorgenregion von 1,7 kb zu isolieren, die dann in die EcoRI-Stelle von pMW119 inseriert wurde (ein low copy Plasmid mit einem Replikationsursprung, der von pSC101 abstammte, Nippon Gene) um pY01 zu konstruieren (2). Gemäß demselben Verfahren wie oben beschrieben, wurden die Plasmide pMC9, pMC9-2 und pMC9-16 verwendet, um die pYOW, PY02 und pY016 zu konstruieren.
Das Plasmid pG97S4DhCT[GRRR], das ein Fusionsprotein kodierte, umfassend ein E. coli β-Galactosidasederivat und das menschliche Calcitonin-Vorläuferpeptid, stromabwärts von dem Lactosepromotor/Operator (lacPO) wurde verwendet, um E. coli-Zellen zu transformieren, die das Plasmid pMC9, pMC9-2 oder pMC9-16 enthielten, wie oben konstruiert, um Ampicillin- und Tetracyclin-resistente E. coli MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pYOW, E. coli MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pY01; E. coli MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pY02; und E. coli MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pY016 zu erhalten.
Diese Stämme wurden auf L-Medium kultiviert, supplementiert mit 50 μg/ml Ampicillin und 10 μg/ml Tetracyclin bei 30°C über Nacht, um eine Inokulumkultur herzustellen und die Inokulumkultur wurde auf zwei Medien mit derselben Zusammensetzung wie oben beschrieben in einer Menge von 5% in Bezug auf das Medium inokuliert. Eins der Medien wurde 15 Stunden bei 30°C inkubiert und das andere 15 Stunden bei 37°C. E. coli MYW3110/pG974DhCT[GRRR], pYOW mit dem Wildtyp-Lactoserepressorgen wurde durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 5 mM IPTG induziert. Nach der Kultur wurde das Kulturmedium zentrifugiert und das in den kultivierten Zellen erzeugte Fusionsprotein wurde durch SDS-16% PAGE (Natriumdodecylsulfat 16% Polyacrylamid-Gelelektrophorese) gemessen, um die Expression des Fusionsproteins bei unterschiedlichen Temperaturen zu vergleichen. Ein Ergebnis ist in 3 dargestellt.
Wie sich aus 3 ablesen lässt, erzeugte E. coli MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pYOW mit dem Wildtyp-Lactoserepressorgen das Fusionsprotein nur, wenn IPTG zugefügt wurde. E. coli MYW3110/PG97S4DhCT[GRRR], pY01; E. coli MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pY03; und E. coli MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pY016 exprimierten das Fusionsprotein nicht, wenn sie bei 30°C kultiviert wurden, exprimierten das Fusionsprotein jedoch, wenn sie bei 37°C exprimiert wurden und zwar in einer Menge, die vergleichbar war zu der Menge des Stamms mit dem Wildtyp-Lactoserepressor, wenn er mit IPTG induziert wurde.
Dementsprechend wurde bestätigt, dass das temperaturempfindliche Lactoserepressorgen der vorliegenden Erfindung zur Kontrolle der Expression eines Fusionsproteins durch ein Expressionsplasmid verwendet werden kann, umfassend eine Promotor/Operatorregion des Lactoseoperons als Expressionskontrollgenregion und ein Gen, kodierend ein Fusionsprotein, umfassend das β-Galactosidasederivat und das menschliche Calcitonin-Vorläuferpeptid, stromabwärts von der Expressionskontrollregion.
Dementsprechend können die temperaturempfindlichen mutierten Lactoserepressorgene der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Expression in einem Expressionssystem zu kontrollieren, das eine Kombination des Lactoseoperatorgenbereichs und ein Lactoserepressorgen umfasset.
BEISPIEL 6
Wirkung eines Aminosäureersatzes an der Mutationsstelle auf die Temperaturempfindlichkeit
Es wird angenommen, dass die Aminosäurepositionen 94, 241, 265 und 300, die von gegenwärtigen Erfindern als temperaturempfindliche Mutationspositionen des Lactoserepressors identifiziert wurden, wichtig sind, um die Struktur des Repressorproteins zu erhalten. Es wird daher angenommen, dass mutierte Proteine, worin die Aminosäurereste an den Mutationsstellen des Repressorproteins durch andere Aminosäurereste ersetzt sind als diejenigen, die in Beispiel 3 identifiziert wurden, eine Temperaturempfindlichkeit, abhängig von der Art der Aminosäure, zeigen.
Dementsprechend wurden 18 Gene, die mutierte Lactoserepressorproteine kodierten, worin die 300ste Position durch eine von 18 unterschiedlichen Aminosäuren ersetzt war, konstruiert und charakterisiert. Es wurde nämlich eine ortsgerichtete Mutation in das Lactoserepressorgen durch PCR-(Polymerasekettenreaktion) eingeführt. Zunächst wurde das Plasmid pMC9-SalI, worin eine SalI-Restriktionsstelle in das lacI-Gen eingeführt worden war, konstruiert, indem das 903te Nucleotid "G" des lacI-Gens in "C" verändert wurde, ohne die Aminosäure zu verändern.
Die Primer 8 und 9, die so entworfen waren, dass sie eine SalI-Spaltungsstelle an der 5'-Seite bereitstellten, wurden chemisch synthetisiert. Der Primer 9 in Kombination mit dem Primer 10 wurde in der PCR unter Verwendung von pMC9-1 als Matrizen-DNA zur Herstellung eines DNA-Fragments A verwendet und der Primer 8 in Kombination mit Primer 11 in einer PCR unter Verwendung von pMC9-1 als Matrizen-DNA zur Herstellung des DNA-Fragments B.
Primer 8; 5'-GGG GCA AAC CAA CGT CGA CCG CTT GCT GCA (SEQ ID Nr. 8) SalI
Primer 9; 5'-TGC AGC AAG CGG TCG ACG TTG GTT TGC CCC (SEQ ID Nr. 9) SalI
Primer 10; 5'-GGG AAT AAG GGC GAC ACG GA (SEQ ID Nr. 10)
Primer 11; 5'-CAC GGT GCC TGA CTG CGT T (SEQ ID Nr. 11)
Die PCR wurde in 50 μl einer Reaktionsmischung durchgeführt, umfassend 1 μmol Primer, 1 μg Matrizen-DNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine, 200 μM dNTP (Mischung von dATP, dGTP, dCTP und dTTP) wozu 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase zugefügt wurden, durch 30 Zyklen für 1 Minute bei 94°C, 72°C für 2 Minuten und 55°C für 2 Minuten. Das resultierende DNA-Fragment A wurde mit den Restriktionsenzymen MluI und SalI gespalten und das resultierende DNA-Fragment B mit dem Restriktionsenzymen SalI und HindIII.
Die so erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit einem 4,7 kb DNA-Fragment vermischt, das durch Spaltung von pMC9 mit MluI und HindIII hergestellt worden war und sie wurden unter Verwendung von T4-DNA-Liagse ligiert. Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli MYW3110 zu transformieren, der dann auf L-Agarplatten, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, ausplattiert wurde, und die Transformanten wurden bei 30°C über Nacht kultiviert, um E. coli MTW3110/pMC9-SalI zu konstruieren (4).
Als nächstes wurden die Primer 12 bis 19 zur Einführung einer Mutation an der 300sten Aminosäureposition synthetisiert und in Kombination mit Primer 10 verwendet, um eine PCR unter Verwendung von pMC9 als Matrizen-DNA durchzuführen.
Jedes durch PCR hergestellte DNA-Fragment wurde mit BssHII und SalI gespalten, um ein Fragment von 0,15 kb zu isolieren, das dann mit einem 1,0 kb SalI-BamHI-Fragment vermischt wurde und einem 4,9 kb BamHI-BssHII-Fragment von pMC9-SalI und sie wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert. Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli MYW3110 zu transformieren, der dann auf eine L-Agarplatte, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, ausplattiert und über Nacht bei 30°C kultiviert wurde. Von den so erhaltenen Transformanten wurden die Plasmide pMC9-300A bis pMC9-300Y (siehe 5) isoliert und gemäß demselben Verfahren wie in Beispiel 3 beschrieben sequenziert und es wurde bestätigt, dass ein korrektes Kodon, kodierend die beabsichtigte Aminosäure, an die beabsichtigte Mutationsstelle eingeführt wurde.
Die so erhaltenen Transformanten wurden auf eine Agarplatte plattiert, enthaltend X-gal und Ampicillin und nach Kultivierung bei 30 und 37°C über Nacht wurde die Farbe der entwickelten Kolonien beobachtet. Im Ergebnis waren die Kolonien von E. coli MYW3110/pMC9-300F und E. coli MYW3110/pMC9-300P mit einem mutierten lacI-Gen, in das Kodons für Phenyl alanin bzw. Prolin als 300ste Aminosäure eingeführt worden waren, für die 30°C-Kultur weiß und für die 37°C-Kultur blau.
Dementsprechend wurde bestätigt, dass andere Aminosäuren als Asparagin, identifiziert als mutierte Aminosäure in Beispiel 3, d. h., Phenylalanin und Prolin eine temperaturempfindliche Mutation bereitstellen und es wurde belegt, dass ein Aminosäureersatz an dieser Stelle neue temperaturempfindliche Mutationen bereitstellt.
Daher stellen zusätzlich zu der 300sten Position ein Ersatz der Aminosäure an ein oder mehreren Positionen 94, 241 und 265 mit einer anderen Aminosäure als der in Beispiel 3 identifizierten, temperaturempfindliche Lactoserepressoren bereit und daher sind solche mutierten Lactoserepressoren in der vorliegenden Erfindung beinhaltet. Zusätzlich sind ein Gen, das diese Proteine oder Peptide kodiert, ein Verfahren zur Kontrolle der Expression unter Verwendung des Gens und ein Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens unter Verwendung des Verfahrens in der vorliegenden Erfindung beinhaltet.
Die temperaturempfindlichen mutierten Repressorgene der vorliegenden Erfindung stellen die Expression eines Gens bereit, kodierend ein gewünschtes Protein, ohne Verwendung eines teuren Induktionsmittels, wie IPTG usw., und sind daher für eine Forschung und ein Klonieren eines gewünschten Gens nützlich und für eine Massenproduktion des gewünschten Proteins von einem industriellen Standpunkt aus betrachtet.
Escherichia coli SBM 323 wurde beim National Institute of Bioscience and Technology (früher Fermentation Research Insitute Agency of Industrial Science and Technology), 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan unter dem Budapester Vertrag am 8. August 1991, als FERM BP-3503 hinterlegt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Temperaturempfindlicher mutierter Lactoserepressor, wobei die Aminosäure an mindestens der Position, korrespondierend zu Position 265 im Wildtyp-E. coli-Lactoserepressor, eine andere Aminosäure ist als diejenige im Wildtyp-Lactoserepressor.
Lactoserepressor gemäss Anspruch 1, worin zusätzlich die Aminosäure an einer oder mehreren der Positionen, korrespondierend zu Positionen 94, 241 und 300 im Wildtyp-E. coli-Lactoserepressor, eine andere Aminosäure als diejenige im Wildtyp-Lactoserepressor ist.
Mutierter Lactoserepressor gemäss Anspruch 1 oder 2, worin die 265. Aminosäure Asparaginsäure ist.
Mutierter Lactoserepressor gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die 94. Aminosäure Methionin ist.
Mutierter Lactoserepressor gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die 241. Aminosäure Threonin ist.
Mutierter Lactoserepressor gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die 300. Aminosäure Asparagin, Phenylalanin oder Prolin ist.
Lactoserepressorprotein gemäss Anspruch 1 mit der in SEQ ID NO: 20 dargestellten Aminosäuresequenz.
Gen, codierend für einen temperaturempfindlichen mutierten Lactoserepressor gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7.
Gen gemäss Anspruch 8, wobei das Gen die in SEQ ID NO: 20 dargestellte Nucleotidsequenz aufweist.
Verfahren zur Kontrolle der Expression eines gewünschten Proteins, codiert durch ein gewünschtes Gen in einer Wirtszelle, enthaltend ein Gen, das einen temperaturempfindlichen mutierten Lactoserepressor codiert, und das gewünschte Gen, wobei das Verfahren die Kontrolle der Expression des gewünschten Gens durch Regulation der Funktion des mutierten Lactoserepressors durch Veränderung der Temperatur zur Kultivierung der Wirtszelle umfasst, wobei der temperaturempfindliche mutierte Lactoserepressor ein solcher ist, der durch Ersatz der Aminosäure an mindestens Position 265 des Wildtyp-E. coli-Lactoserepressors durch eine andere Aminosäure als derjenigen des Wildtyp-Lactoserepressors mutiert ist.
Verfahren gemäss Anspruch 10, wobei der temperaturempfindliche mutierte Lactoserepressor zusätzlich durch Ersatz der Aminosäure an einer oder mehreren der Positionen mutiert ist, korrespondierend zu Positionen 94, 241 oder 300 des Wildtyp-E. coli-Lactoserepressors, und zwar mit einer anderen Aminosäure als der des Wildtyp-Lactoserepressors.
Verfahren gemäss Anspruch 10 oder 11, wobei das Lactoserepressorproteingen ein Insert in einem Plasmid, umfassend das gewünschte Gen, oder in einem Wirtschromosom, umfassend das gewünschte Gen, ist.
Verfahren gemäss Anspruch 10 oder 11, wobei das Lactoserepressorproteingen ein Insert in einem Klonierungsvektor, umfassend das gewünschte Gen, oder in einem Expressionsvektor, umfassend das gewünschte Gen, ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle, prokaryontische Zelle, ein Pilz, eine Hefe oder eine Insektenzelle ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei ein Gen, das einen mutierten Lactoserepressor codiert, der ein Gen bei 35°C oder mehr exprimiert, verwendet wird.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei ein Gen, das einen mutierten Lactoserepressor codiert, der ein Gen bei 37°C oder mehr exprimiert, verwendet wird.
Verfahren zur Expression eines gewünschten Proteins, codiert durch ein gewünschtes Gen, umfassend die Kontrolle der Expression des gewünschten Gens durch Regulation der Funktion eines mutierten Lactoserepressors durch Veränderung der Temperatur zur Kultivierung der Wirtszellen, die mit einem Expressionsvektor transformiert sind, umfassend ein mutiertes Lactoserepressorgen und das gewünschte Gen, wobei der temperaturempfindliche mutierte Lactoserepressor ein solcher ist, der durch Ersatz der Aminosäure an mindestens der Position mutiert ist, die zu Position 265 des Wildtyp-E. coli-Lactoserepressors korrespondiert, und zwar mit einer anderen Aminosäure als der des Wildtyp-Lactoserepressors.
Verfahren gemäss Anspruch 17, wobei der temperaturempfindliche mutierte Lactoserepressor zusätzlich durch Ersatz der Aminosäure an einer oder mehreren der Positionen mutiert ist, die zu Positionen 94, 241 oder 300 des Wildtyp-E. coli-Lactoserepressors korrespondieren, und zwar mit einer anderen Aminosäure als der des Wildtyp-Lactoserepressors.
Verfahren gemäss Anspruch 17 oder 18, wobei das Lactoserepressorproteingen ein Insert in einem Plasmid, umfassend das gewünschte Gen, oder in einem Wirtschromosom, umfassend das gewünschte Gen, ist.
Verfahren gemäss Anspruch 17 oder 18, wobei das Lactoserepressorgen ein Insert in einem Expressionsvektor ist, umfassend das gewünschte Gen.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle, prokaryontische Zelle, ein Pilz, eine Hefe oder eine Insektenzelle ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei ein Gen, das einen mutierten Lactoserepressor codiert, der ein Gen bei 35°C oder mehr exprimieren kann, verwendet wird.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei ein Gen, das einen mutierten Lactoserepressor codiert, der ein Gen bei 37°C oder mehr exprimieren kann, verwendet wird.