WO2013154312A1 - Laci 단백질 변이체를 이용한 독성 단백질의 생산 방법 - Google Patents

Laci 단백질 변이체를 이용한 독성 단백질의 생산 방법 Download PDF

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WO2013154312A1
WO2013154312A1 PCT/KR2013/002919 KR2013002919W WO2013154312A1 WO 2013154312 A1 WO2013154312 A1 WO 2013154312A1 KR 2013002919 W KR2013002919 W KR 2013002919W WO 2013154312 A1 WO2013154312 A1 WO 2013154312A1
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laci
protein
expression
coli
variant
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PCT/KR2013/002919
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김지현
윤성호
김성근
이대희
권순경
오태광
김오철
정해영
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한국생명공학연구원
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing toxic proteins using LacI ( lac inhibitor) protein variants, and more particularly, among the 75th, 192th, 197th or 225th amino acids of LacI protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a LacI protein variant mutated by one or more amino acids, a gene encoding the LacI protein variant, a recombinant vector comprising the gene, a host cell transformed with the recombinant vector and a gene encoding a toxic protein are inserted into the recombinant expression vector. It relates to a method for producing a toxic protein comprising the step of transforming the host cell after the expression.
  • E. coli is a widely used host for recombinant protein production due to its fast growth rate, easy handling and various host / vector systems.
  • some protein expression, in particular membrane protein expression is low and sometimes results in host toxicity, which is a major disorder in the art.
  • various methods have been attempted, including target protein high speed expression screening, target protein mutant construction or host manipulation.
  • host manipulation is a promising method of increasing membrane protein expression levels without target protein modification.
  • various methods have been tried for host manipulations such as spontaneous mutagenesis, transposon mutagenesis, chemical / mutD5 mutagenesis, ASKA library overexpression, membrane protein biosynthetic pathway manipulation, chaperone pathway manipulation, glucose uptake.
  • spontaneous mutant strains were selected using the Walker strategy (Shaw AZ, Miroux B (2003) Methods Mol Biol 228: 23-35) to identify other factors that reduce toxicity.
  • the lac suppressor mutation was found to be a mutation hotspot for colonies that survive under Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside (IPTG) induced conditions.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside
  • Gene swapping analysis concluded that LacI protein variants allow for continued growth of the host under membrane protein induction conditions, which may be due to delays in toxic membrane protein induction kinetics.
  • Rhamnose (Rhanose) promoter derived from E. coli, which regulates the expression of the lacI mutant gene, a system capable of precisely regulating lamnose concentration-dependently was established.
  • Korean Patent Publication No. 199595-7002242 discloses a 'recombinant production method of saporin-containing protein'
  • US Patent No. 7390645 discloses a lactose inhibitor protein with increased operator DNA binding affinity.
  • no method for producing toxic proteins using LacI protein variants has been found.
  • the present invention is derived from the above requirements, and the present inventors have specificity of C43 (DE3) through sequencing of the membrane protein hyperexpressing bacteria C41 (DE3) and C43 (DE3) derived from the BL21 (DE3) strain. It was found that the gene directly involved in the resistance of the membrane protein expression was lacI , and through the C43 (DE3) genome analysis, the lacI mutation, which is a direct regulator of membrane protein expression, was A75T; A75T and G225S; V192F; Or has a R197S protein mutation site, which is structurally close to the IPTG binding site, which mitigates the binding of the IPTG inducer to cause delayed induction kinetics, thus inhibiting growth while expressing membrane proteins It was confirmed not to receive.
  • Escherichia coli cytosine transporter (CodB) and Escherichia coli F-ATPase which are toxic proteins in LacI protein variant-containing E. coli, which precisely regulate the expression of the lacI mutation gene by the Rha promoter derived from E. coli, which is regulated by Rhamnose.
  • subunit b results of experiments the transfection toxicity targeting (Ecb), CodB are several types of E.
  • the present invention provides LacI protein variants in which at least one amino acid of the 75th, 192th, 197th or 225th amino acids of the LacI protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is mutated.
  • the present invention also provides a gene encoding the LacI protein variant.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the gene.
  • the present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector.
  • the present invention also provides a method of producing a toxic protein comprising inserting a gene encoding a toxic protein into a recombinant expression vector and transforming the host cell to express the gene.
  • the present invention provides a method of expressing a toxic protein but not affecting cell growth, and in particular, the expression of lacI mutant gene is precisely controlled in a concentration-dependent manner of rhamnose using a Rha promoter regulated by rhamnose, By optimizing the expression of the target protein to be produced in E. coli cells to increase the amount of production, the usefulness in the expression of recombinant toxic proteins in host cells, including E. coli.
  • Figure 1 shows variant screening and identification of mutants that are resistant to toxic membrane protein overproduction in C41 (DE3).
  • C41 (DE3) transformed with fluorescence-bound E. coli F-ATPase subunit b was cultured in LB (100 ⁇ g / ml ampicillin, 0.1 mM IPTG) plates to obtain fluorescence colonies.
  • the mutants were streaked on LB (containing 100 ⁇ g / ml ampicillin) and LB (100 ⁇ g / ml ampicillin, containing 0.7 mM IPTG) plates to determine the extent of growth and fluorescence, and the lacI site was targeted sequencing. The variation was analyzed.
  • FIG. 3 shows the introduction of lacI gene mutation and membrane protein expression found in C43 (DE3) bacteria C41 (DE3).
  • C41mlacI was prepared by introducing the V192F mutation found in C43 (DE3) into C41 (DE3).
  • Each bacterium was transformed with E. coli F-ATPase subunit b with fluorescence bound and then plated onto LB (100 ⁇ g / ml ampicillin) and LB (100 ⁇ g / ml ampicillin, 0.7 mM IPTG) plates.
  • Figure 4 shows the growth curve for overproduction of bovine OGCP in BL21 (DE3) and BL21 (DE3) mlacI.
  • BL21 (DE3) BL21
  • Red arrow Induction point.
  • GFP green fluorescence protein
  • FIG. 6 shows GFP production assays regulated by variant LacI or T7 lysozyme co-expression.
  • GFP expression is induced by 0.4 mM IPTG and variants LacI Or T7 lysozyme at 37 ° C. with varying concentrations of L-rhamnose (0, 1/4 3 , 1/4 2 , 1/4, 1, and 4 mM).
  • RFU represents the intensity of fluorescence relative to the control.
  • Figure 7 shows the results of single cell fluorescence analysis in BL21 (DE3) containing pMH-frGFP or pMW7-frGFP controlled by variant LacI.
  • GFP expression was induced by 0.7 mM IPTG and variant LacI was induced by varying L-rhamnose concentrations (4, 1, 1/4, 1/4 2 , 1/4 3 , 0 mM) at 37 ° C.
  • L-rhamnose concentrations 4, 1, 1/4, 1/4 2 , 1/4 3 , 0 mM
  • fluorescence was measured by flow cytometry (a) and fluorometer (b) (the X axis of (a) represents the relative intensity of fluorescence and the Y axis represents the number of cells with the corresponding intensity of fluorescence). Means).
  • RFU represents the intensity of fluorescence relative to the control.
  • Figure 10 is the result of measuring the number of colonies of the transformed E. coli obtained when transforming pMW7-CodB-frGFP expressing E. coli cytosine transporter to different E. coli.
  • CodB expression was induced with 0.7 mM IPTG and wild-type LacI and variant LacI expression were induced with various concentrations of L-rhamnose (horizontal axis of the graph, mM).
  • Blue lacI expression + IPTG induce codB expression; red, lacI expression + IPTG do not induce codB expression; yellow green, lacI variant expression + IPTG induce codB expression; purple, lacI variant expression + IPTG induce codB expression Not)
  • FIG. 11 shows C41 (DE3) transformed with pMW7-Ecb-frGFP, a high copy number plasmid expressing Escherichia coli F-ATPase b-subunit (Ecb) under T7 promoter control, inducing medium (LB plate + 100 ⁇ g / ml Ampicillin + 0.7 mM IPTG), C41 (DE3) comprising pMW7-Ecb-frGFP and pACYC-mlacI, when plated in inducible medium without variant LacI co-expression, transformants expressed variant LacI expression It caused a strong inhibition of, did not grow, and resulted in host cell death.
  • the transformants were grown in induction medium (LB + 100 ⁇ g / ml ampicillin + 0.7 mM IPTG + L-rhamnose) and the colonies were fluorescent This indicates that the membrane protein is expressed by host cell resistance.
  • FIG. 12 shows that when DH5 ⁇ transformed with pMH-Ecb-frGFP, a medium copy number plasmid expressing Escherichia coli F-ATPase b-subunit (Ecb) under tac promoter control, was toxic upon addition of 0.7 mM IPTG, variant LacI co Shown are the results of fluorescence transformants appearing upon expression. From these results, the toxicity caused by overexpression of toxic proteins is mitigated by variant LacI co-expression, indicating that this system is applicable to other lac operator based systems.
  • Ecb Escherichia coli F-ATPase b-subunit
  • Figure 13 shows BL21 (DE3) transformed with pMW7-Ecb-frGFP growth deficient in LB (+100 ⁇ g / ml ampicillin) plates.
  • LB (+100 ⁇ g / ml ampicillin
  • the present invention provides a LacI protein variant wherein one or more amino acids of the 75th, 192th, 197th or 225th amino acids of the LacI (lac repressor) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: to provide.
  • LacI protein of the present invention may preferably be an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (NCBI GenBank Accession No. ACT42198.1), but is not limited thereto.
  • LacI protein variant according to an embodiment of the present invention is preferably A75T (75th amino acid mutated from alanine to threonine), V192F (192th amino acid mutated from valine to phenylalanine), R197S (197th amino acid from arginine to serine Mutant) or G225S (the 225th amino acid mutated from glycine to serine), more preferably A75T; A75T and G225S; Or R197S, most preferably V192F protein variant, but is not limited thereto.
  • A75T analyzed in the membrane protein resistant mutants of the invention A75T and G225S; Or the R197S protein mutation site is structurally close to the IPTG binding site, which alleviates the binding of IPTG to LacI protein, leading to delayed induction kinetics, thus resulting in host cell expression while expressing membrane or toxic proteins. Do not suffer from growth inhibition.
  • the present invention also provides a gene encoding the LacI protein variant.
  • the gene encoding the LacI protein variant according to an embodiment of the present invention may be the ACT, ACC, ACA or ACG gene encoding the 75th amino acid in the case of A75T, more preferably ACG, V192F
  • the gene encoding the 192th amino acid may be TTT or TTC, more preferably TTC
  • in the case of R197S gene encoding the 197th amino acid may be TCT, TCC, TCA, TCG, AGT or AGC
  • more preferably AGT in the case of G225S gene encoding the 225th amino acid may be TCT, TCC, TCA, TCG, AGT or AGC, more preferably may be AGT, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising a gene encoding the LacI protein variant.
  • Recombinant refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can express genes or gene fragments that are not found in their natural form in either the sense or antisense form.
  • Recombinant cells can also express genes found in natural cells, but the genes are modified and reintroduced into cells by artificial means.
  • vector is used to refer to a DNA fragment (s), a nucleic acid molecule, that is delivered into a cell. Vectors can replicate DNA and be reproduced independently in host cells.
  • carrier is often used interchangeably with “vector”.
  • expression vector refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and a suitable nucleic acid sequence necessary to express a coding sequence operably linked in a particular host organism.
  • the recombinant vector into which the gene encoding the LacI protein variant is inserted may be a vector capable of inducing LacI mutation in the wild-type LacI protein coding gene in the host cell to be transformed, preferably by homologous recombination. It may be a vector causing a lacI mutant gene, but is not limited thereto.
  • the vector may include an Rha promoter derived from E. coli. Specifically, at least one amino acid of the 75th, 192th, 197th or 225th amino acids of the LacI protein consisting of the Rhamnose (Rha) promoter derived from E. coli and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 operably linked to the promoter provided is a recombinant vector comprising a gene encoding a mutated LacI protein variant.
  • the Rha promoter is a promoter that can more precisely regulate the expression of the gene encoding the LacI protein variant, depending on rhamnose concentration, but may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. This is not restrictive.
  • the present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector.
  • the host cell capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention in a prokaryotic cell while being stable can be used in any host cell known in the art, for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1. , Bacillus genus strains, such as E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serratia marcensons, and various Pseudomonas Enterobacteria such as species and strains.
  • E. coli JM109 E. coli BL21
  • Bacillus genus strains such as E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium,
  • Methods for carrying vectors of the present invention into host cells include CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)), Hana method (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)) and electroporation methods (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)) and the like. Can be.
  • the host cell may be preferably a prokaryotic cell, more preferably a bacterium, even more preferably may be E. coli, even more preferably MG1655, BL21 (DE3), C41 (DE3) or C43 (DE3) strains, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a method of producing a toxic protein comprising inserting a gene encoding a toxic protein into a recombinant expression vector and transforming the host cell to express the gene.
  • the host cell is a host cell transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding a LacI protein variant, a host that expresses a recombinant toxic protein but does not inhibit growth of the host cell.
  • Cells preferably E. coli, most preferably E. coli MG1655, BL21 (DE3), C41 (DE3) or C43 (DE3), but is not limited thereto.
  • the concentration of rhamnose, which is an inducer for the Rha promoter operation may be 0.015 to 4 mM, but is not limited thereto.
  • the toxic protein is a protein causing toxicity to cells when expressed in excess, E. coli F-ATPase subunit b ( E. coli F-ATPase subunit b), small mitochondria 2- Bovine mitochondrial 2-oxoglutarate / malate carrier protein, Bacillus PS3 alanine / H + carrier, human CCR5, human CCR3, or human CCR3 or Human CXCR4, preferably Escherichia coli F-ATPase subunit b, but is not limited thereto.
  • E. coli F-ATPase subunit b E. coli F-ATPase subunit b
  • small mitochondria 2- Bovine mitochondrial 2-oxoglutarate / malate carrier protein E. coli F-ATPase subunit b
  • Bacillus PS3 alanine / H + carrier E. coli F-ATPase subunit b
  • human CCR5, human CCR3, or human CCR3 or Human CXCR4 preferably Escherichia
  • the recombinant expression vector into which the gene encoding the toxic protein is inserted is a linear or circular DNA molecule composed of fragments encoding polypeptides of the toxic protein operably linked to additional fragments provided for transcription of the expression vector. Such additional fragments include promoter and termination code sequences.
  • Expression vectors also include one or more replication initiation points, one or more selection markers, polyadenylation signals, and the like. Expression vectors are generally derived from plasmid or viral DNA, or may contain elements of both.
  • E. coli and plasmids used in the present invention are summarized in Table 1.
  • E. coli BL21 (DE3), C41 (DE3), C43 (DE), and pMW7-OGCP-frGFP, pMW7-Ecb-frGFP plasmids were described by Miroux B et al. (Miroux B, Walker JE (1996) J Mol Biol 260: 289-298) It was used as supplied from.
  • the oligomers used in the present invention are summarized in Table 2.
  • the L-Rhamnose promoter region was PCR amplified from the genomic DNA of Escherichia coli K-12 MG1655 using RhamL-F and RhamL-R primers.
  • the amplified L-rhamnose promoter was inserted into pACYCDuet-1 (Novagen) plasmid using restriction enzymes of NdeI and XhoI to prepare pACYC-rham plasmid.
  • Variant lacI gene was PCR amplified with lacI-F and lacUV5-R primers using genomic DNA of E.
  • LacI was PCR amplified by using genomic DNA of Escherichia coli BL21 (DE3) as a template using lacI-F and lacI-R primers, and then cloned into pACYC-rham plasmid after digestion with NdeI and NarI restriction enzymes. As a result, the pAR-lacI plasmid was completed, and the cloning result was confirmed by Sanger sequencing.
  • the coding sequence of the fluorescent protein was determined according to Waldo GS (Waldo GS (2003) Methods Mol Biol 230: 343-359). At this time, NdeI / BamHI position was added before the fluorescent protein sequence to bind the target protein to the N-terminal, and HindIII position was added after the fluorescent protein sequence to allow subcloning of the synthesized fluorescent protein with NdeI / HindIII. It was. This planned gene sequence was synthesized in Bioneer. The synthesized fluorescent protein was subcloned at the NdeI / HindIII position of the pMW7-Ecb-frGFP plasmid to prepare pMW7-frGFP.
  • pMW7-Ecb-frGFP was used as a template for the T7 promoter primer ((5'-taatacgactcactataggg-3 '; SEQ ID NO: 12) and Ecb (NSBamHI) -R ( PMW7-Ecb-frGFP was constructed by PCR with 5'-ggggatcccagttcagcgacaagtttat-3 '; SEQ ID NO: 13) and subcloning to the NdeI / BamHI position of pMW7-frGFP Finally, the cloned plasmid was identified for sequencing. It was.
  • PCR was amplified using frGFP-F and frGFP-R primers and pMW7-Ecb-frGFP plasmids as templates to produce fluorescent proteins as target proteins.
  • the amplified GFP gene was digested with NdeI and HindIII restriction enzymes and inserted into pMW7-Ecb-frGFP and pMAL-c2X plasmids, respectively, to prepare pMW7-frGFP and pMH-frGFP plasmids.
  • Another protein of interest was the cytosine transporter (CodB), a membrane protein of Escherichia coli.
  • CodB gene was PCR amplified from genomic DNA of Escherichia coli K-12 MG1655 using codB-F and codB-R primers, digested with NdeI and BamHI restriction enzymes, cloned into pMW7-Ecb-frGFP plasmid, and then pMW7-codB-frGFP Plasmids were prepared.
  • T7lacI-F (5'-ttgctccgggctatgaaata-3 '; SEQ ID NO: 14) and lacI-R (5'-gttttcccagtcacgacgtt-3'; SEQ ID NO: 6) specific for DE3 were used and the lac operon was used.
  • lacIF 5'-cagtgaacaacgggtgattg-3 '; SEQ ID NO: 15
  • lacI-R (5'-gttttcccagtcacgacgtt-3'; SEQ ID NO: 6) specific for lac operon. .
  • C41 (DE3) mlacI was produced as follows.
  • the region was first recombined.
  • the prepared C41 (DE3) mlacI was confirmed by sequencing whether the correct mutation.
  • BL21 (DE3) mlacI was produced in the same manner as C41 (DE3) mlacI.
  • C43 (DE3) wtlacI was derived from T7lacIS-F (5'-ccggcgttatttcttgatgt-3 '; SEQ ID NO: 18) and T7lacIS-R (5'-cggtatcgtcgtatcccact-3'; SEQ ID NO: 19 from BL21 (DE3) genomic DNA for secondary recombination. It is manufactured in the same way as C41 (DE3) mlacI, except that
  • Genomic DNA of the E. coli C41 (DE3) / C43 (DE3) strain was purified, and genome sequences up to 12.2 and 9.5 times were decoded by 454 pyrosequencing using the GS FLX platform of Roche.
  • a strain of C41 (DE3) / C43 (DE3) modified with a membrane protein high expression strain the 454 pyrosequence reads obtained were obtained from the E. coli BL21 (DE3) standard. Based on the sequence (CP001509).
  • Single sequencing (SNP) search was performed using the mapping software of gsAssembler (version 2.0.00), and variants such as insertion and deletion were used to de novo assembly the 454 pyro sequencing leads into the same assembler.
  • the results were searched by comparing the contigs with the reference sequence BL21 (DE3) information using the phred / phrap / consed program (http://www.phrap.org).
  • C43 (DE3)
  • an additional 890 sequencing sequence was obtained using Illumina's Solexa Genome Analyser II, due to a homopolymer error in the 454 pyrosequencing reaction. This is to remove abnormally detected mutations and to improve the accuracy of analysis using high throughput technology. Variants were explored by mapping Solexa reads to the BL21 (DE3) standard sequence (CP001509) using the CLC genomics workbench program. All the mutated regions searched for were amplified by PCR and reconfirmed by the Sanger method.
  • Fluorescence of GFP or protein fused with GFP was measured using a fluorometer. In more detail, 500 ⁇ l of the culture solution was collected and centrifuged for 5 minutes at 13,000 rpm. The cells were recovered, dissolved in PBS, and 100 ⁇ l was dispensed on a 96-well black plate (Perkin Elmer). The fluorescence of the cells was measured at 485 nm excitation wavelength and 535 nm emission wavelength using Fusion Alpha-Fluorescence Microplate Analyzer (Perkin Elmer). It was. In addition, GFP-fused proteins were analyzed using FACSCalibur (BD Biosciences).
  • the culture medium was recovered only by centrifugation, washed twice with 10% glycerol, suspended in 400ul 10% glycerol to complete the water-soluble cells.
  • Electroporation was performed by giving a pulse of 2.5V to a 2mm cuvette, including the completed 50ul water-soluble cells and 200ng plasmid.
  • 1 ml of LB was added to the transformed mixture, and the cells were recovered for 1 hour at 37 ° C. and 200 rpm. Only 100 ⁇ l was collected from the mixture, diluted 10-fold and plated in various concentrations of L-rhamnose-containing medium. .
  • the C41 (DE3) and C43 (DE3) genomes were sequenced to find mutations in resistant bacteria that occur when the toxic membrane proteins, bovine OGCP and E. coli F-ATPase subunit b, are expressed using the T7 expression system.
  • Table 3 yehU , lac UV5, rbsD mutations are common in C41 (DE3) and C43 (DE3), but C41 (DE3) specific proY , ycgO , yhhA , melB mutations were detected.
  • the Rbs operon was revived with the deletion of the IS 3 component. Except for proY , all mutations were nonsynonymous.
  • C43 (DE3) specific mutation points are as follows; The locations and patterns of mutations occurring upstream of fur, yibJ , yjcO and yncG , upstream of dcuS , lacI and cydA , and ⁇ ccmF to ompC and ⁇ yjiV to yjjN were varied.
  • yibJ is a synonymous mutation and there was a mutation upstream of yncG .
  • lacI and yjcO mutations were nonsynonymous. small indels were seen in fur (GTC trinucleotide overlap), dcuS (CGCCG deletion).
  • the IS component contains mutations that include IS 1 insertion into the upstream region of cydA , IS 4 deletion from the promoter region of lon , and IS 1 -associated large deletions from ⁇ ccmF to ompC and ⁇ yjiV to yjjN . Was enhanced.
  • C41 (DE3) transformed with pMW-Ecb-frGFP was plated on LB plates containing ampicillin and IPTG.
  • three colonies (mutant 1, 2 and variant 3 of FIG. 1) were selected that showed similar growth and fluorescence as C43 (DE3).
  • two lacI genes residing on DE3 and lac operon in the mutant strain were sequenced because LacI protein is one of the direct regulators of recombinant protein overexpression.
  • all mutant strains had mutations in the lacI gene as in FIG. 1B. All mutations were nonsynonymous.
  • Mutant 1 had a lacI mutation in the DE3 region unlike Mutant 2, and additionally, lacI in the lac operon region was also mutated. These results may mean that variant 1 may originate from variant 2.
  • All mutations in the C43 (DE3) type mutagen are in close proximity within the IPTG binding site (FIG. 2).
  • R 197 is directly involved in the formation of hydrogen bonds with IPTG hydroxyl groups.
  • R197S amino acid mutations generated in Mutant 3 may interfere with IPTG hydrogen bond formation.
  • the A75 amino acids involved in IPTG stabilization were also mutated to threonine in Mutant 1 and Mutant 2.
  • C43 (DE3) has a V192F amino acid mutation between S191 and S193 which is directly involved in IPTG hydrogen bonding.
  • BL21 (DE3) strains are known to be inhibited in growth during the overproduction of bovine OGCP.
  • Four colonies were inoculated after transforming the BL21 (DE3) strain and the BL21 (DE3) mlacI strain with plasmids expressing bovine OGCP.
  • BL21 (DE3) strains were inhibited in growth and OD 600 stopped around 1.0.
  • the BL21 (DE3) mlacI strain showed continuous growth of OD 600 to near 3.0 under the same conditions (FIG. 4).
  • a pAR-mlacI plasmid regulated by L-Rhamnose was constructed.
  • This plasmid is a plasmid derived from pACYC and has a p15A ori, so it does not compete with a foreign protein expression plasmid with ColE1 or pMB1 origin, so it can exist as two plasmids in E. coli cells.
  • a pAR-lacI plasmid in which wild-type lacI was also controlled by L-rhamnose was prepared for the control experiment of variant lacI .
  • GFP and CodB were selected as cytotoxic proteins, and each protein was cloned into pMW7 controlled by the T7 promoter with a high copy number plasmid and pMAL-c2X plasmid controlled by the tac promoter with medium copy number, pMW7-frGFP. , pMH-frGFP and pMW7-CodB-frGFP plasmids were prepared.
  • LacI variants with varying concentrations of L-Ranose was stronger in fluorescence measurements than when wild-type LacI was expressed.
  • pMH-frGFP when the variant lacI was expressed with 4 mM L-rhamnose, the LacI variant was expressed very slowly and induced for 5 hours, resulting in fluorescence of almost 6% of the maximum fluorescence intensity. Wild type LacI showed 33% inhibition (FIGS. 5B and 5C).
  • pMW7-frGFP expression of wild-type LacI had little effect on GFP production, whereas LacI variants showed a dynamic range of regulation. 37% of maximal fluorescence was inhibited during 5 hours of expression (FIGS. 5E and 5F).
  • pMW7-frGFP plasmid lacks a lac operator before the T7 promoter, minimal expression was lower than that of pMH-frGFP plasmid.
  • the pMW7-frGFP plasmid showed a fluorescence slightly lower than the maximum fluorescence intensity due to the low expression of LacI due to the low concentration of L-rhamnose (19% of the maximum fluorescence).
  • LacI variants were found to be more effective regulators than wild type LacI.
  • Lemo21 (DE3) is E. coli BL21 (DE3) derived from E. coli is widely used in the production of toxic proteins.
  • Lemo21 (DE3) can co-express T7 lysozyme variant (lysY), which inhibits T7 RNA polymerase activity, with toxic proteins to prevent the overproduction of toxic proteins, thereby inhibiting cytotoxicity and producing toxic proteins properly.
  • E. coli of the Lemo21 (DE3) system is precisely regulated lysY by L-Ranose but, unlike LacI variant E. coli, which regulates T7 RNA polymerase at the transcription stage, in the posttranslation step.
  • GFP was selected and tested as a toxic protein to compare the toxic protein production of E.
  • LacI variant and lysY were expressed with L-Ranose at various concentrations (1/4 3 , 1/4 2 , 1/4, 1, 4 mM) under conditions expressing toxic GFP protein with 0.4 mM IPTG ( 6).
  • GFP was produced by controlling the expression of LacI variant by L-Ranose, GFP production was controlled depending on the concentration of L-Ranose.
  • Lemo21 (DE3) has a relatively narrow range of control of GFP production depending on the concentration of L-rhamnose. That is, the amount of GFP produced by various concentrations of L-rhamnose did not show a significant difference.
  • cytosine transporter (codB) of E. coli is highly cytotoxic when expressed in E. coli cells. This codB was intended to be produced in E. coli expressing LacI variants. When CodB was expressed with 0.7 mM IPTG for 6 hours, E. coli cell growth was inhibited by 50% under the condition that LacI variants were not co-expressed. However, co-expression of LacI variants at various concentrations of L-Rhamnose resulted in 100% cell growth, and the expression of LacI variants with 1 mM L-Rhamnose increased the production of codB fused with GFP by 4.5-fold. (FIG. 8).
  • LacI variants can increase not only the production of toxic proteins but also the efficiency of transforming E. coli plasmids into which the genes encoding toxic proteins are inserted.
  • a gene having a gene encoding a highly toxic protein is inserted into an E. coli plasmid having a leaky expression and transformed into E. coli, it is difficult to obtain E. coli plasmid introduced because the toxic protein is expressed without an inducing agent.
  • transgenic toxicity was tested by selecting E. coli codB as a toxic protein.
  • Plasmids were used pMW7-codB-frGFP and pMH-codB-frGFP, and E. coli was transformed using BL21 (DE3), MG1655, C41 (DE3) and C43 (DE3) (Fig. 9 and Fig. 10).
  • LacI variants were added to the medium at various concentrations of L-Ranose to induce expression.
  • the transformed Escherichia coli was obtained only in the condition of expressing LacI variant in pMW7-codB-frGFP, and dozens of transformed Escherichia coli were obtained in the case of pMH-codB-frGFP without expression of LacI variant.
  • hundreds of transformed Escherichia coli were obtained (FIGS. 9 and 10). Similar results were confirmed for E. coli F-ATPase subunit b (Ecb) (FIGS. 11, 12 and 13).

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Abstract

본 발명은 LacI 단백질 변이체, 상기 LacI 단백질 변이체를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용하여 독성 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, lacI 변이 유전자의 발현을 람노스에 의해 조절되는 Rha 프로모터를 이용하여 람노스의 농도 의존적으로 정밀하게 조절하며, 이에 의해 대장균 세포 내에서 생산하고자 하는 목적 단백질의 발현을 최적화함으로써 그 생산량을 증대시킬 수 있으므로, 대장균을 포함한 숙주세포에서 재조합 독성 단백질 발현에 그 유용성이 매우 크다.

Description

LACI 단백질 변이체를 이용한 독성 단백질의 생산 방법
본 발명은 LacI(lac 억제자) 단백질 변이체를 이용한 독성 단백질의 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 LacI 단백질의 75번째, 192번째, 197번째 또는 225번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 돌연변이된 LacI 단백질 변이체, 상기 LacI 단백질 변이체를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 독성 단백질을 코딩하는 유전자를 재조합 발현 벡터에 삽입한 후 상기 숙주세포에 형질전환하여 상기 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 독성 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
대장균(E. coli)은 빠른 생육 속도, 용이한 취급 및 다양한 숙주/벡터 시스템으로 인해 재조합 단백질 제조를 위해 널리 사용되는 숙주이다. 그러나 일부 단백질 발현, 특히 막 단백질의 발현은 낮은 수준이고, 때때로 숙주 독성을 초래하며, 이는 해당 분야에서 주된 장애이다. 그러한 문제를 해결하기 위해 표적 단백질 고속 발현 스크리닝, 표적 단백질 돌연변이체 구축 또는 숙주 조작을 포함하는 다양한 방법이 시도되었다. 이들 중에서, 숙주 조작은 표적 단백질 변형 없이 막 단백질 발현 수준을 증가시키는 유망한 방법이다. 이를 위해 자발적 돌연변이 유발, 트랜스포존 돌연변이유발, 화학물질/mutD5 돌연변이유발, ASKA 라이브러리 과발현, 막 단백질 생합성 경로 조작, 샤페론 경로 조작, 글루코오스 이용억제와 같은 숙주 조작을 위한 다양한 방법들이 시도되었다. 전통적으로, Walker 균주인 대장균 C41(DE3) 및 C43(DE3)가 막 단백질 및 여타 독성 단백질 과발현을 위해 널리 사용되는 시판 숙주이다(Dumon-Seignovert et al. (2004) Protein Expr Purif 37: 203-206). 이들은 막 단백질의 과발현에 의해 유발되는 독성을 극복한 대장균 BL21(DE3)의 자발적 돌연변이 유도체이다. 그러나 독성 탈출에 수반되는 메커니즘은 거의 이해되고 있지 않다.
본 발명에서는 독성을 감소시키는 여타 요인들을 규명하기 위해, Walker 전략(Shaw AZ, Miroux B (2003) Methods Mol Biol 228: 23-35)를 이용함으로써 자발적 돌연변이 균주들을 선별했다. 돌연변이들 중에서, lac 억제자 돌연변이가 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactoside) 유도 조건에서 생존하는 콜로니들의 돌연변이 호발부위(mutation hotspot)임을 발견했다. 유전자 스와핑 분석(gene swapping analysis)에 의하면, LacI 단백질 변이체는 막단백질 유도 조건에서 숙주의 지속적인 생장을 가능하게 하고, 이는 독성 막 단백질 유도 역학의 지연에 기인하는 것일 수 있다고 결론지었다. 또한, 본 발명에서는 lacI 변이 유전자의 발현을 람노스에 의해 조절되는 대장균 유래의 람노스(Rhamnose; Rha) 프로모터를 이용하여 람노스 농도 의존적으로 정밀하게 조절할 수 있는 시스템을 구축하였다.
한편, 한국공개특허 제1995-7002242호에서는 '사포린 함유 단백질의 재조합 생산방법'이 개시되어 있고, 미국등록특허 제7390645호에서는 오퍼레이터 DNA 결합 친화도가 증가된 락토오스 억제자 단백질'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 LacI 단백질 변이체를 이용한 독성 단백질의 생산 방법에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 BL21(DE3) 균주로부터 유래된 막단백질 고발현균인 C41(DE3) 및 C43(DE3)의 서열분석을 통하여 C43(DE3)의 특이적인 막 단백질 발현 내성에 직접적으로 관여하는 유전자가 lacI인 것을 찾아내었고, C43(DE3) 유전체 분석을 통해 막 단백질 발현에 직접적인 조절자인 lacI 돌연변이는 A75T; A75T 및 G225S; V192F; 또는 R197S 단백질 변이 위치를 갖는 것으로, 이 위치는 구조적으로 IPTG 결합 부위에 근접해 있고, 이는 IPTG 유도제의 결합성을 경감시켜 지연된 유도 역학(delayed induction kinetics)를 유발하고, 따라서 막 단백질을 발현하면서 성장 저해를 받지 않게 하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자는 람노스에 의해 조절되는 대장균 유래의 Rha 프로모터에 의해 lacI 변이 유전자의 발현을 정밀하게 조절하는 LacI 단백질 변이체 함유 대장균에서 독성 단백질인 대장균 사이토신 수송체(CodB) 및 대장균 F-ATPase 서브유닛 b(Ecb)를 대상으로 형질전환 독성을 실험한 결과, CodB가 삽입된 플라스미드의 카피 수의 구별 없이 lacI 변이 유전자의 발현 조절에 의해 여러 종류의 대장균(MG1655, BL21(DE3), C41(DE3), C43(DE3) 등)에서 야생형 LacI와 비교하여 적게는 15배 많게는 1000배 정도의 CFU(colony forming unit)의 차이를 보이는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 LacI 단백질의 75번째, 192번째, 197번째 또는 225번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 돌연변이된 LacI 단백질 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 LacI 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 독성 단백질을 코딩하는 유전자를 재조합 발현 벡터에 삽입한 후 상기 숙주세포에 형질전환하여 상기 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 독성 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 독성 단백질을 발현시키면서도 세포 생장에 영향을 주지 않는 방법을 제공하며, 특히 lacI 변이 유전자의 발현을 람노스에 의해 조절되는 Rha 프로모터를 이용하여 람노스의 농도 의존적으로 정밀하게 조절하며, 이에 의해 대장균 세포 내에서 생산하고자 하는 목적 단백질의 발현을 최적화함으로써 그 생산량을 증대시킬 수 있는 내용에 관한 것으로, 대장균을 포함한 숙주세포에서 재조합 독성 단백질 발현에 그 유용성이 매우 크다.
도 1은 C41(DE3)에서 독성의 막 단백질 과량생산에 내성을 지니는 변이균 선별 및 변이 양상확인을 나타낸다. 형광이 결합된 E. coli F-ATPase 서브유닛 b가 형질전환된 C41(DE3)를 LB (100㎍/ml 앰피실린, 0.1mM IPTG) 플레이트에서 배양하여 형광을 나타내는 콜로니(colony)를 획득하였다. 이 변이균들을 LB (100㎍/ml 앰피실린 함유) 및 LB (100㎍/ml 앰피실린, 0.7 mM IPTG 함유) 플레이트에 스트리킹하여 생장 및 형광 정도를 측정하였고, lacI 지점을 타겟 시퀀싱(targeted sequencing) 하여 변이 양상을 분석하였다.
도 2는 E. coli의 LacI 단백질에서 IPTG 결합 포켓 주변 구조 분석을 나타낸다.
도 3은 C41(DE3)균에 C43(DE3)에서 발견한 lacI 유전자 변이 도입 및 막 단백질 발현 확인을 나타낸다. C41(DE3)에 C43(DE3)에서 발견한 V192F 변이를 도입하여 C41mlacI를 제작하였다. 각각의 균에 형광이 결합된 E. coli F-ATPase 서브유닛 b를 형질전환한 후 LB (100㎍/ml 앰피실린) 및 LB (100㎍/ml 앰피실린, 0.7 mM IPTG) 플레이트에 도말하였다.
도 4는 BL21(DE3) 및 BL21(DE3)mlacI에서 소 OGCP를 과량 생산시 생장곡선을 나타낸다. 소 OGCP가 형질전환된 BL21(DE3) 혹은 BL21(DE3)mlacI의 단일 콜로니 4개씩을 각각 LB(100㎍/ml 앰피실린 함유)에 접종 후 약 OD600=0.6 근처에서 0.7mM IPTG로 유도하였다. Red arrow: 유도점.
도 5는 변이체 LacI공동 발현에 의해 조절되는 균주 생장 및 GFP(green fluorescence protein) 생산을 나타낸다. GFP 발현은 0.7 mM IPTG에 의해 유도되고 LacI 단백질은 37℃에서 다양한 농도의 L-람노스(0, 1/43, 1/42, 1/4, 1, and 4 mM)에 의해 유도되었다. (a) 변이체 또는 야생형 LacI 공동 발현에 의해 조절되는 pMH-frGFP을 포함하는 대장균 BL21(DE3)의 세포 생장 프로파일; (b) 야생형 LacI 공동 발현에 의해 조절되는 pMH-frGFP을 포함하는 BL21(DE3)의 GFP 생산; (c) 변이체 LacI 공동 발현에 의해 조절되는 pMH-frGFP을 포함하는 BL21(DE3)의 GFP 생산; (d) 야생형 LacI 공동 발현 또는 변이체 LacI 공동 발현에 의해 조절되는 pMW7-frGFP을 포함하는 BL21(DE3)의 세포 생장 프로파일; (e) 야생형 LacI 공동 발현에 의해 조절되는 pMW7-frGFP을 포함하는 BL21(DE3)의 GFP 생산; (f) 변이체 LacI 공동 발현에 의해 조절되는 pMW7-frGFP을 포함하는 BL21(DE3)의 GFP 생산. RFU(relative fluorescence units)는 대조군에 대한 상대적인 형광의 세기를 나타낸다. 에러 바는 독립적인 형질전환 콜로니로부터 평균 표준 오차를 나타낸다.
도 6은 변이체 LacI 또는 T7 리소자임 공동 발현에 의해 조절되는 GFP 생산 분석을 나타낸다. GFP 발현은 0.4 mM IPTG에 의해 유도되고 변이체 LacI 또는 T7 리소자임은 37℃에서 다양한 농도의 L-람노스(0, 1/43, 1/42, 1/4, 1, and 4 mM)에 의해 유도되었다. (a) 변이체 LacI 공동 발현에 의해 조절되는 pMW7-frGFP를 포함하는 BL21(DE3)의 GFP 생산; (b) pMW7-frGFP을 포함하는 Lemo21(DE3)의 GFP 생산. RFU는 대조군에 대한 상대적인 형광의 세기를 나타낸다.
도 7은 변이체 LacI에 의해 조절되는 pMH-frGFP 또는 pMW7-frGFP을 포함하는 BL21(DE3)에서 단일 세포 형광을 분석한 결과이다. GFP 발현은 0.7 mM IPTG에 의해 유도되었고, 변이체 LacI는 37℃에서 다양한 L-람노스 농도(4, 1, 1/4, 1/42, 1/43, 0 mM)에 의해 유도되었다. 유도 5시간이 지나서, 형광을 유세포 분석(a) 및 플루오로미터(b)로 측정하였다((a)의 X축은 상대적인 형광의 세기를 나타내며, Y축은 해당하는 형광의 세기를 갖는 세포의 수를 의미함). RFU는 대조군에 대한 상대적인 형광의 세기를 나타낸다.
도 8은 변이체 LacI 공동 발현에 의해 유도되는 세포의 성장 및 GFP 생산을 분석한 결과이다. GFP 발현은 0.7 mM IPTG에 의해 유도되었고, 변이체 LacI는 37℃에서 다양한 L-람노스 농도(4, 1, 1/4, 1/42, 1/43, 0 mM)에 의해 유도되었다. 세포 생장은 OD600로 측정되었고, GFP는 플루오로미터로 측정되었다. (A) pMH-CodB-frGFP을 포함하는 MG1655의 성장 곡선은 변이체 LacI 공동 발현에 의해 조절되었다. (B) pMH-CodB-frGFP을 포함하는 GFP 생산은 변이체 LacI 공동 발현에 의해 조절되었다. RFU는 대조군에 대한 상대적인 형광의 세기를 나타낸다.
도 9는 대장균 사이토신 수송체(codB)를 발현시키는 pMH-CodB-frGFP를 서로 다른 대장균에 형질전환시켰을 때 획득한 형질전환 대장균의 콜로니 개수를 측정한 결과이다. 0.7 mM IPTG로 codB 발현을 유도하였고, 다양한 농도의 L-람노스 (그래프의 가로축, mM)로 야생형 LacI와 변이체 LacI 발현을 유도하였다. (파란색, lacI 발현 + IPTG로 codB 발현 유도; 빨간색, lacI 발현 + IPTG로 codB 발현 유도를 하지 않음; 연두색, lacI 변이체 발현 + IPTG로 codB 발현 유도 ; 보라색, lacI 변이체 발현 + IPTG로 codB 발현 유도를 하지 않음)
도 10은 대장균 사이토신 수송체를 발현시키는 pMW7-CodB-frGFP를 서로 다른 대장균에 형질전환 시켰을 때 획득한 형질전환 대장균의 콜로니 개수를 측정한 결과이다. 0.7 mM IPTG로 codB 발현을 유도하였고, 다양한 농도의 L-람노스 (그래프의 가로축, mM)로 야생형 LacI와 변이체 LacI 발현을 유도하였다. (파란색, lacI 발현 + IPTG로 codB 발현 유도; 빨간색, lacI 발현 + IPTG로 codB 발현 유도를 하지 않음; 연두색, lacI 변이체 발현 + IPTG로 codB 발현 유도 ; 보라색, lacI 변이체 발현 + IPTG로 codB 발현 유도를 하지 않음)
도 11은 T7 프로모터 조절하의 대장균 F-ATPase b-서브유닛(Ecb)을 발현하는 high copy number 플라스미드인 pMW7-Ecb-frGFP로 형질전환된 C41(DE3)가 유도성 배지(LB 플레이트+100㎍/ml 앰피실린+0.7mM IPTG)에서 자라지 못하고, pMW7-Ecb-frGFP 및 pACYC-mlacI을 포함하는 C41(DE3)는 변이체 LacI 공동 발현 없이 유도성 배지에 플레이팅했을 때, 형질전환체는 변이체 LacI 발현의 강한 저해를 일으켜 자라지 못했고, 숙주 세포 죽음을 야기하는 결과를 나타낸다. 반면, 변이체 LacI가 L-람노스 첨가에 의해 공동 발현될 때, 형질전환체는 유도 배지(LB+100 ㎍/ml 암피실린+0.7 mM IPTG+L-람노스)에서 자랐고, 콜로니는 형광을 띄었는데, 이는 막 단백질이 숙주 세포 내성에 의해 발현되는 것을 나타낸다.
도 12는 tac 프로모터 조절하의 대장균 F-ATPase b-서브유닛(Ecb)을 발현하는 medium copy number 플라스미드인 pMH-Ecb-frGFP로 형질전환된 DH5α가 0.7 mM IPTG 첨가시 독성을 나타내었지만, 변이체 LacI 공동 발현시 형광의 형질전환체가 나타나는 결과를 보여준다. 상기 결과로부터, 독성 단백질의 과발현에 의해 야기되는 독성은 변이체 LacI 공동 발현에 의해 경감되고 이러한 시스템은 다른 lac 오퍼레이터 기초 시스템에 적용 가능한 것을 나타낸다.
도 13은 pMW7-Ecb-frGFP으로 형질전환된 BL21(DE3)가 LB (+100 ㎍/ml 앰피실린) 플레이트에서 성장 결핍을 나타낸다. 형질전환 독성을 소멸시키기 위해, 1 mM L-람노스 처리하여 변이체 LacI를 공동발현시켰다. 예상했던 것과 마찬가지로, 변이체 또는 야생형 LacI의 공동 발현은 형질전환 독성을 저해시켰다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 LacI(lac repressor) 단백질의 75번째, 192번째, 197번째 또는 225번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 돌연변이된 LacI 단백질 변이체를 제공한다.
본 발명의 LacI 단백질은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열(NCBI 진뱅크 등록번호 ACT42198.1)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 LacI 단백질 변이체는 바람직하게는 A75T(75번째 아미노산이 알라닌에서 트레오닌으로 돌연변이), V192F(192번째 아미노산이 발린에서 페닐알라닌으로 돌연변이), R197S(197번째 아미노산이 아르기닌에서 세린으로 돌연변이) 또는 G225S(225번째 아미노산이 글리신에서 세린으로 돌연변이) 중 하나 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 A75T; A75T 및 G225S; 또는 R197S일 수 있으며, 가장 바람직하게는 V192F 단백질 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 막 단백질 내성 변이균에서 분석된 A75T; A75T 및 G225S; 또는 R197S 단백질 변이 위치는 구조적으로 IPTG 결합 부위에 근접해 있고, 이는 IPTG의 LacI 단백질에 대한 결합성을 경감시켜 지연된 유도 역학(delayed induction kinetics)을 유발하고, 따라서 막 단백질 또는 독성 단백질을 발현하면서도 숙주세포의 성장 저해를 받지 않게 한다.
또한, 본 발명은 상기 LacI 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 LacI 단백질 변이체를 코딩하는 유전자는 바람직하게는 A75T의 경우에 75번째 아미노산을 코딩하는 유전자가 ACT, ACC, ACA 또는 ACG일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 ACG이며, V192F의 경우에 192번째 아미노산을 코딩하는 유전자가 TTT 또는 TTC일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 TTC이며, R197S의 경우에 197번째 아미노산을 코딩하는 유전자가 TCT, TCC, TCA, TCG, AGT 또는 AGC일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 AGT이며, G225S의 경우에 225번째 아미노산을 코딩하는 유전자가 TCT, TCC, TCA, TCG, AGT 또는 AGC일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 AGT일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 LacI 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
상기 LacI 단백질 변이체를 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 벡터는 형질전환 시키고자 하는 숙주세포 내의 야생형 LacI 단백질 코딩 유전자에 LacI 돌연변이를 유발할 수 있는 벡터일 수 있고, 바람직하게는 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 lacI 돌연변이 유전자를 유발시키는 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터에서, 상기 벡터는 대장균 유래의 Rha 프로모터를 포함할 수 있다. 구체적으로, 대장균 유래의 람노스(Rhamnose; Rha) 프로모터 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 LacI 단백질의 75번째, 192번째, 197번째 또는 225번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 돌연변이된 LacI 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터에서, 상기 Rha 프로모터는 LacI 단백질 변이체를 코딩하는 유전자의 발현을 람노스 농도 의존적으로 보다 정밀하게 조절할 수 있는 프로모터로써, 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 숙주세포에서, 상기 숙주세포는 바람직하게는 원핵세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 박테리아일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 대장균일 수 있고, 더더욱 바람직하게는 MG1655, BL21(DE3), C41(DE3) 또는 C43(DE3) 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 독성 단백질을 코딩하는 유전자를 재조합 발현 벡터에 삽입한 후 상기 숙주세포에 형질전환하여 상기 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 독성 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 숙주세포는 LacI 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포로서, 재조합 독성 단백질을 발현하면서도 숙주세포의 성장 저해는 받지 않는 숙주세포이며, 바람직하게는 대장균일 수 있고, 가장 바람직하게는 대장균 MG1655, BL21(DE3), C41(DE3) 또는 C43(DE3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 Rha 프로모터 작동을 위한 유도제인 람노스(rhamnose)의 농도는 0.015 ~ 4mM 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 독성 단백질은 과량으로 발현되면 세포에 독성을 야기하는 단백질로서, 대장균 F-ATPase 서브유닛 b(E. coli F-ATPase subunit b), 소 미토콘드리아 2-옥소글루타레이트/말레이트 운반체 단백질(bovine mitochondrial 2-oxoglutarate/malate carrier protein), 바실러스 PS3 알라닌/H+ 운반체(Bacillus PS3 alanine/H+ carrier), 인간 CCR5(human CCR5), 인간 CCR3(human CCR3) 또는 인간 CXCR4(human CXCR4)일 수 있고, 바람직하게는 대장균 F-ATPase 서브유닛 b일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 독성 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터는 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 독성 단백질의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택 마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
플라스미드, 균주 및 배양 조건
본 발명에서 사용한 대장균 및 플라스미드는 표 1에 정리하였다. 대장균 BL21(DE3), C41(DE3), C43(DE)와 pMW7-OGCP-frGFP, pMW7-Ecb-frGFP 플라스미드는 Miroux B 등(Miroux B, Walker JE (1996) J Mol Biol 260: 289-298)으로부터 공급받아 사용하였다. 대장균은 호기적 조건 하에서 저염의 LB 배지에서 배양하였으며, pMW7 및 pMH 유래 플라스미드를 함유한 대장균은 배지에 앰피실린(100㎍/㎖)을 첨가하였고, pACYC 유래 플라스미드를 갖는 대장균은 배지에 클로람페니콜(30㎍/㎖)을 첨가하였다. 또한, pMW7 유래의 플라스미드에 삽입된 목적 단백질의 leaky expression을 방지하고자 포도당 10g/L를 전배양 배지에 첨가하였다. 본 배양은 전배양액의 접종량을 조절하여 OD600 = 0.05로 맞췄으며 37℃에서 200rpm으로 현탁배양 하였다. 목적 단백질의 발현은 OD600 = 0.4 ~ 0.7 일 때 0.7mM의 IPTG를 첨가하여 유도하였으며, L-람노스(L-rhamnose)에 의해 발현되는 LacI 단백질들은 다양한 농도의 L-람노스를 이용하여 발현을 유도하였다. 대장균 세포는 유도체로 각 단백질의 발현을 유도한 후에 일정 시간이 지나면 회수하여 분석하였다.
표 1
Figure PCTKR2013002919-appb-T000001
pAR-mlacI 및 pAR-lacI 플라스미드 제작
본 발명에서 사용한 올리고머는 표 2에 일부 정리하였다. L-람노스에 의해 LacI 및 변이체 LacI 발현용 플라스미드를 제작하기 위해 L-람노스 프로모터 부위를 대장균 K-12 MG1655의 게놈 DNA로부터 RhamL-F 및 RhamL-R 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 L-람노스 프로모터는 pACYCDuet-1(Novagen) 플라스미드에 NdeI 및 XhoI의 제한효소를 이용하여 삽입되어 pACYC-rham 플라스미드가 제작되었다. 변이체 lacI 유전자는 대장균 C43(DE3) 균주의 게놈 DNA를 이용하여 lacI-F와 lacUV5-R 프라이머로 PCR 증폭한 후, NdeI과 NarI 제한효소로 절단하여 pACYC-rham 플라스미드에 삽입하였다. 그 결과 pAR-mlacI 플라스미드가 완성되었다. LacI는 lacI-F와 lacI-R 프라이머를 이용하여 대장균 BL21(DE3)의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR 증폭한 후 NdeI과 NarI 제한효소로 절단하여 pACYC-rham 플라스미드에 클로닝하였다. 그 결과 pAR-lacI 플라스미드가 완성되었으며, 클로닝 결과는 Sanger 시퀀싱으로 확인하였다.
표 2
Figure PCTKR2013002919-appb-T000002
pMW7-Ecb-frGFP, pMW7-frGFP, pMH-frGFP 및 pMW7-codB-frGFP 플라스미드 제작
형광단백질(GFP, green fluorescent protein)의 코딩 시퀀스(coding sequence)는 Waldo GS(Waldo GS (2003) Methods Mol Biol 230: 343-359)에 따라 결정하였다. 이때 목적 단백질을 N 말단(N-terminal)에 결합하기 위해 형광단백질 서열 앞에 NdeI/BamHI 위치를 추가 하였고 형광단백질 서열 뒤에 HindIII 위치를 추가하여 합성된 형광단백질 전체를 NdeI/HindIII로 서브클로닝이 가능하게 하였다. 이렇게 계획된 유전자 서열을 바이오니아에서 합성하였다. 합성된 형광단백질을 pMW7-Ecb-frGFP 플라스미드의 NdeI/HindIII 위치에 서브클로닝하여 pMW7-frGFP를 제작하였다. E. coli F-ATPase 서브유닛 b 유전자의 종결코돈을 제거하기 위하여 pMW7-Ecb-frGFP를 주형으로 T7 프로모터 프라이머((5'-taatacgactcactataggg-3'; 서열번호 12) 및 Ecb(NSBamHI)-R (5'-ggggatcccagttcagcgacaagtttat-3'; 서열번호 13)으로 PCR한 후 pMW7-frGFP의 NdeI/BamHI 위치에 서브클로닝하여 pMW7-Ecb-frGFP를 제작하였다. 최종적으로 클로닝된 플라스미드는 시퀀싱을 통해 유전자 서열을 확인하였다.
형광 단백질을 목적 단백질로 생산하기 위해 frGFP-F 및 frGFP-R 프라이머와 pMW7-Ecb-frGFP 플라스미드를 주형으로 하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 GFP 유전자를 NdeI 및 HindIII 제한효소로 절단하여 각각 pMW7-Ecb-frGFP 및 pMAL-c2X 플라스미드에 삽입하여 pMW7-frGFP 및 pMH-frGFP 플라스미드를 제작하였다. 또 다른 목적 단백질로 대장균의 막 단백질인 사이토신 수송체(CodB, cytosine transporter)를 선택하였다. CodB 유전자는 codB-F 및 codB-R 프라이머를 이용하여 대장균 K-12 MG1655의 게놈 DNA로부터 PCR 증폭하였고, NdeI 및 BamHI 제한효소로 절단한 후 pMW7-Ecb-frGFP 플라스미드에 클로닝하여 pMW7-codB-frGFP 플라스미드를 제작하였다.
특정지역 변이확인(Targeted Sequencing Analysis)
DE3 유전자상의 lacI를 시퀀싱하기 위해 DE3에 특이적인 T7lacI-F (5'-ttgctccgggctatgaaata-3'; 서열번호 14)과 lacI-R (5'-gttttcccagtcacgacgtt-3'; 서열번호 6)을 사용하였고 lac 오페론상의 lacI를 시퀀싱하기 위해서는 lac 오페론에 특이적인 lacIF (5'-cagtgaacaacgggtgattg-3'; 서열번호 15)과 lacI-R (5'-gttttcccagtcacgacgtt-3'; 서열번호 6)를 사용하여 PCR한 후 시퀀싱하였다.
변이 균주 제작
변이균의 제작은 기본적으로 Red disruption system(Datsenko KA, Wanner BL (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97: 6640-6645)을 이용하였으나 Scarless 변이 치환을 위해 I-SceI을 이용한 double strand break 방식을 응용하였다(Kang et al. (2004) J Bacteriol 186: 4921-4930). I-SceI 제한 효소의 발현은 pREDI 플라스미드를 이용하였다(Datsenko KA, Wanner BL (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97: 6640-6645). 주형 플라스미드인 pKD3-IsceI 제작은 다음과 같이 하였다. pKD3의 콜로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase) 양 옆에 I-SceI 인식 서열을 삽입한 서열을 계획한 후 바이오니아에서 합성하였다. 이때 합성 비용 절감을 위해서 pKD3의 XbaI 사이의 서열은 합성시 제외하였고 제외된 서열은 pKD3에서 PCR한 후 XbaI 위치에 삽입하였다. 제작된 플라스미드는 시퀀싱을 통하여 서열을 확인하였다.
C41(DE3)mlacI는 다음과 같이 제작되었다. pKD3-IsceI을 주형로 lacIKO-F (5'-tcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccggtccatatgaatatcctcc-3'; 서열번호 16)과 lacIKO-R (5'-caaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatggaatacggttagccatttg-3'; 서열번호 17)을 이용하여 C43(DE3)의 lacI 변이를 포함한 영역을 1차 재조합하였다. 이때 DE3 영역에 재조합된 균을 DE3에 특이적인 T7lacI-F (5'-ttgctccgggctatgaaata-3'; 서열번호 14)과 lacI-R (5'-gttttcccagtcacgacgtt-3'; 서열번호 6)로 PCR하여 크기 차이로 골라내었다. 2차 재조합을 위해 C43(DE3)로부터 DE3 영역의 lacI를 T7lacI-F (5'-ttgctccgggctatgaaata-3'; 서열번호 14)와 lacI-R (5'-gttttcccagtcacgacgtt-3'; 서열번호 6)로 PCR한 후 이로부터 T7lacIS-F (5'-ccggcgttatttcttgatgt-3'; 서열번호 18)와 T7lacIS-R (5'-cggtatcgtcgtatcccact-3'; 서열번호 19)를 이용하여 한번 더 PCR하고 이를 2차 재조합에 사용하였다. 제작된 C41(DE3)mlacI는 정확한 변이 여부를 시퀀싱을 통하여 확인하였다.
BL21(DE3)mlacI는 C41(DE3)mlacI와 동일한 방식으로 제작되었다. C43(DE3)wtlacI는 2차 재조합을 위해 BL21(DE3) 게놈 DNA로부터 T7lacIS-F (5'-ccggcgttatttcttgatgt-3'; 서열번호 18)와 T7lacIS-R (5'-cggtatcgtcgtatcccact-3'; 서열번호 19)를 사용한 점을 제외하고는 C41(DE3)mlacI와 동일한 방식으로 제작되었다.
막 단백질 고발현 균주들에 대한 유전체 염기서열 해독
대장균 C41(DE3)/C43(DE3) 균주의 게놈 DNA를 정제하여, Roche사의 GS FLX 플랫폼을 이용한 454 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 방법으로 각각 12.2와 9.5배수에 이르는 유전체 염기서열을 해독하였다. 막 단백질 고발현 균주로 개량된 C41(DE3)/C43(DE3)의 원균주인 대장균 BL21(DE3)로부터의 변이를 탐색하기 위하여, 얻어진 454 파이로시퀀스 리드(pyrosequence read)들을 대장균 BL21(DE3) 표준 시퀀스(CP001509)를 기준으로 맵핑하였다. 단일염기서열변이(SNP)의 탐색에는 gsAssembler(version 2.0.00)의 맵핑 소프트웨어가 이용되었으며, 삽입(insertion)과 결손(deletion)과 같은 변이들은 얻어진 454 파이로시퀀싱 리드들을 동일 어셈블러로 de novo 어셈블리한 결과 컨티그들을 phred/phrap/consed 프로그램(http://www.phrap.org)을 사용하여 기준 시퀀스인 BL21(DE3) 정보와 비교함으로써 탐색하였다.
추가로 C43(DE3)에 대해서는 Illumina사의 Solexa Genome Analyser II를 이용하여 890배수에 이르는 염기서열을 추가로 확보하였는데, 이는 454 파이로시퀀싱 반응에 있어 반복되는 염기서열로 인한 오류(homopolymer error)로 인해 비정상적으로 탐색된 변이를 제거하고 처리량이 높은 기술을 이용해 분석의 정확도를 높이기 위함이다. Solexa read들을 CLC genomics workbench 프로그램을 이용하여 역시 BL21(DE3) 표준 시퀀스(CP001509)를 기준으로 맵핑하는 방법으로 변이들의 탐색이 이루어졌다. 탐색된 모든 변이 영역에 대해서 해당 부분을 PCR로 증폭하여 Sanger 방법으로 염기 서열을 재확인하는 작업을 수행하였다.
GFP 단백질의 형광 측정 및 유세포분석(flow cytometry)
GFP 또는 GFP가 융합된 단백질의 형광은 플루오로미터(fluorometer)를 이용하여 측정하였다. 좀 더 자세히 설명하면, 500㎕의 배양액을 채취하여 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 세포를 회수하여 PBS에 녹인 후 100㎕를 96-well black plate(Perkin Elmer)에 분주한 후 Fusion Alpha-Fluorescence Microplate Analyzer(Perkin Elmer)를 이용하여 세포의 형광을 485nm 여기 파장과 535nm 방출 파장에서 측정하였다. 또한, GFP가 융합된 단백질은 FACSCalibur (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
형질전환 독성 테스트
전 배양과정(2㎖ LB)을 통해 키운 각 균주를 5㎖ LB 볼륨으로 100x로 접종하여 OD600 = 0.5까지 배양하였다. 배양한 배양액은 원심분리를 통해 세포만을 회수하고 10% 글리세롤을 이용하여 2회 세척하여 주고, 400㎕ 10% 글리세롤로 현탁하여 수용성 세포를 완성하였다. 완성된 50㎕의 수용성 세포와 200ng의 플라스미드를 포함하여 2mm 큐벳에 2.5V로 펄스(pulse)를 주어 전기천공을 수행하였다. 형질전환된 혼합액에 1㎖ LB를 추가하여 37℃, 200rpm에서 1시간 동안 세포의 회복과정을 거치고, 혼합액에서 100㎕ 만을 채취한 후 10배로 희석하여 다양한 농도의 L-람노스 포함 배지에 도말하였다.
실시예 1. C41(DE3) 및 C43(DE3) 유전체 분석을 통한 막 단백질 과발현 내성균의 유전적 변이에 대한 특성
T7 발현 시스템을 사용하여 독성 막 단백질인 소 OGCP 및 대장균 F-ATPase 서브유닛 b를 발현하였을 때 발생하는 내성균의 돌연변이를 찾아내기 위해, C41(DE3) 및 C43(DE3) 유전체를 서열분석 하였다. 표 3에 제시된 바와 같이, yehU, lacUV5, rbsD 돌연변이는 C41(DE3) 및 C43(DE3)에서 공통이나, C41(DE3) 특이적인 proY, ycgO, yhhA, melB 돌연변이가 검출되었다. Rbs 오페론은 IS3 구성요소 삭제로 부활되었다. proY를 제외하고는, 모든 돌연변이들이 비동의적(nonsynonymous)이었다. C43(DE3) 특이적 돌연변이 지점은 다음과 같다; fur, yibJ, yjcO, yncG 의 상류 영역, dcuS, lacI, cydA의 상류 영역, ΔccmF~ompC, ΔyjiV~yjjN 발생한 돌연변이의 위치 및 양상은 다양하였다. yibJ 는 동의적(synonymous) 돌연변이이고 yncG의 상류 영역에 돌연변이가 존재하였다. lacI, yjcO 돌연변이는 비동의적(nonsynonymous) 이었다. fur(GTC 트리뉴클레오티드 중첩), dcuS(CGCCG 결실)에서는 작은 삽입-결실이 나타났다. IS 구성요소는 cydA의 상류 영역으로의 IS1 삽입, lon의 프로모터 영역으로부터의 IS4 삭제, ΔccmF~ompC, ΔyjiV~yjjN 에서의 IS1-연관된 큰 결실을 포함하는 변이들은 부모 균주와의 유전체 차이를 증강시켰다.
표 3
Figure PCTKR2013002919-appb-T000003
실시예 2. 막 단백질 과발현 내성 돌연변이 호발부위(mutation hotspot)인 LacI 단백질 변이체
C43(DE3) 내성에 수반되는 돌연변이를 찾아내기 위해, pMW-Ecb-frGFP로 형질전환시킨 C41(DE3)를 앰피실린 및 IPTG를 함유하는 LB 플레이트 상에 도말했다. 살아남은 여러 개의 형광 콜로니들 중에, C43(DE3)와 유사한 생육 및 형광을 나타내는 3개의 콜로니 (도 1의 변이균 1, 2 및 변이균 3)를 선별했다. 표 3의 분석을 토대로, LacI 단백질은 재조합 단백질 과발현의 직접적인 조절자 중 하나이기 때문에, 상기 돌연변이 균주 내 DE3 및 lac 오페론 상에 상주하는 2개의 lacI 유전자를 서열 분석했다. 흥미롭게도, 도 1B에서와 같이 모든 돌연변이 균주들이 lacI 유전자 내에 돌연변이를 가졌다. 모든 돌연변이들이 비동의적(nonsynonymous) 이었다. 변이균 1은 변이균 2와 달리 DE3 영역에 lacI 돌연변이를 가졌고, 추가적으로 lac 오페론 영역 내의 lacI 또한 돌연변이화 되었다. 이러한 결과는 변이균 1이 변이균 2로부터 기원할 수도 있음을 의미할 수 있다. C43(DE3) 형 돌연변이균 내의 모든 돌연변이들은 IPTG 결합 부위 내에 가까이 근접해 있다(도 2). R197은 IPTG 히드록실기와의 수소 결합 형성에 직접적으로 관여된다. 변이균 3에서 발생된 R197S 아미노산 돌연변이는 IPTG 수소 결합 형성을 방해할 수 있다. IPTG 안정화에 수반되는 A75 아미노산은 또한 변이균 1 및 변이균 2에서는 트레오닌으로 돌연변이화 되었다. C43(DE3)는 IPTG 수소 결합에 직접적으로 관여되는 S191 및 S193 사이에 있는 V192F 아미노산 돌연변이를 갖는다. 벌키 페닐알라닌 잔기(bulky phenylalanine residue)는 C43(DE3)에서 S191, S193 기능을 방해할 수 있다. C43(DE3)에서의 지연되는 유도 역학은 Is 표현형과 유사하였고(Wagner et al. (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105: 14371-14376), 상기 돌연변이 균에서의 돌연변이 부위는 Is 표현형에서의 돌연변이 스펙트럼에 속한다(Lewis et al. (1996) Science 271: 1247-1254). LacI 변이체 단독으로도 막 단백질 과발현 내성에 충분한지 알기 위해서, V192F 아미노산 돌연변이를 C41(DE3)에 도입했다. 막단백질 유도 조건 하에, C41(DE3)는 생장하지 못했으나, C41(DE3)mlacI는 생장했고, C43(DE3)와 필적하는 형광을 나타냈다 (도 3). 상기 결과로부터, lacI 돌연변이 단독으로도 막 단백질 과발현 내성을 부여할 수 있다고 결론지었다.
lacI 돌연변이의 효과가 다른 대장균에도 적용되는지 알아보기 위해서 BL21(DE3)균주에 lacI 돌연변이를 도입한 균주를 제작하였다. BL21(DE3) 균주는 소 OGCP를 과대 생산시 생장에 저해를 받는 것으로 알려져 있다. BL21(DE3)균주와 BL21(DE3)mlacI 균주를 소 OGCP를 발현하는 플라스미드로 형질전환 후 4개의 콜로니를 각각 접종하였다. 그리고 OD600이 0.6인 근처에서 IPTG로 소 OGCP를 과대생산 하였을 시 BL21(DE3) 균주는 생장의 저해를 받아 OD600이 1.0 근처에서 멈추었다. 그에 반해 BL21(DE3)mlacI 균주는 같은 조건상에서도 OD600이 3.0 근처까지 지속적으로 생장하는 모습을 보여주었다(도 4).
실시예 3. 세포 독성을 갖는 단백질 발현용 플라스미드
LacI 변이체를 동시발현하여 세포 독성을 갖는 단백질을 생산하고자, L-람노스에 의해 조절되는 pAR-mlacI 플라스미드를 제작하였다. 이 플라스미드는 pACYC 유래의 플라스미드로 p15A ori를 갖고 있어 ColE1 또는 pMB1 origin을 갖는 외래 단백질 발현용 플라스미드와 경쟁하지 않으므로 대장균 세포 내에서 두 개의 플라스미드로 존재할 수 있다. 또한, 변이체 lacI의 대조군 실험을 위해 야생형 lacI도 동일하게 L-람노스에 의해 조절되는 pAR-lacI 플라스미드를 제작하였다. 세포 독성을 갖는 단백질로는 GFP 및 CodB를 선택하였고, 각 단백질은 high copy number 플라스미드로 T7 프로모터에 의해 조절되는 pMW7과 medium copy number로 tac 프로모터에 의해 조절되는 pMAL-c2X 플라스미드에 클로닝하여 pMW7-frGFP, pMH-frGFP 및 pMW7-CodB-frGFP 플라스미드를 제작하였다.
실시예 4. 세포 독성을 갖는 단백질 생산의 조절
다양한 농도의 L-람노스로 LacI 변이체를 발현시켰을 때 야생형 LacI를 발현시켰을 때보다 측정된 형광의 세기가 더 강했다. pMH-frGFP의 경우 4 mM L-람노스로 변이체 lacI를 발현시켰을 때 LacI 변이체가 매우 천천히 발현되어 5시간 동안 유도한 결과 최대 형광 세기의 거의 6%만의 형광이 나타났다. 야생형의 LacI의 경우 33%의 억제를 보였다(도 5b 및 도 5c). pMW7-frGFP의 경우 야생형 LacI의 발현은 GFP 생산에 거의 효과를 나타내지 않는 반면 LacI 변이체는 dynamic한 조절 범위를 보였다. 5시간의 발현 동안 최대 형광의 37%가 저해되었다(도 5e 및 도 5f). pMW7-frGFP 플라스미드는 T7 프로모터 앞에 lac 오퍼레이터가 없기 때문에 최소 발현은 pMH-frGFP 플라스미드에 비해 더 낮은 발현을 보였다. 또한, pMW7-frGFP 플라스미드는 낮은 농도의 L-람노스에 의해 LacI의 발현양이 적기 때문에 최대 형광 세기보다 약간 낮은 형광을 보였다(최대 형광의 19%). 따라서 LacI 변이체가 야생형 LacI보다 더 효과적인 조절자임을 알 수 있었다.
실시예 5. Lemo21(DE3) 균주와 LacI 변이체 동시 발현 균주의 비교
Lemo21(DE3)는 대장균 BL21(DE3) 유래로 독성 단백질의 생산에 많이 이용되고 있는 대장균이다. Lemo21(DE3)는 T7 RNA 폴리머라제 활성을 저해하는 T7 리소자임 변이체(lysY)를 독성 단백질과 동시 발현시켜 독성 단백질의 과다 생산을 방지하여 세포 독성을 억제하면서 독성 단백질을 적절히 생산할 수 있다. Lemo21(DE3) 시스템의 대장균은 공히 L-람노스에 의해 lysY 정밀하게 조절하고 있지만, T7 RNA 폴리머라제를 전사(transcription) 단계에서 조절하는 LacI 변이체 대장균과는 달리, T7 RNA 폴리머라제를 번역 후(posttranslation) 단계에서 조절한다. 본 발명에서는 Lemo21(DE3) 및 LacI 변이체를 발현시키는 대장균의 독성 단백질 생산을 비교하기 위해 독성 단백질로 GFP를 선택하여 시험해 보았다. 0.4 mM의 IPTG로 독성의 GFP 단백질을 발현시키는 조건에서 다양한 농도(1/43, 1/42, 1/4, 1, 4 mM)의 L-람노스로 LacI 변이체와 lysY를 발현시켰다(도 6). 그 결과 GFP의 생산은 두 균주에서 유사하였으나, L-람노스에 의해 LacI 변이체의 발현을 조절하여 GFP를 생산한 경우에 L-람노스의 농도에 의존적으로 GFP 생산이 조절되었다. 그러나 Lemo21(DE3)의 경우 L-람노스의 농도에 의존하여 GFP의 생산을 조절할 수 있는 범위가 상대적으로 좁았다. 즉, 다양한 농도의 L-람노스에 의해 생산된 GFP의 양이 크게 차이를 보이지 않았다.
실시예 6. LacI 변이체를 발현하는 대장균에서의 균일한 독성 단백질 생산
LacI 변이체를 발현하는 대장균 세포 집단에서 독성 단백질을 생산할 때 집단을 구성하고 있는 개별 대장균 세포 내에서 독성 단백질이 균일하게 생산되는지를 확인하기 위해 유세포분석(flow cytometry)을 실시하였다(도 7). 독성 단백질로는 GFP를 선택하였고, 이를 발현시키는 pMW7-frGFP와 pMH-frGFP 플라스미드를 이용하여, 0.7 mM의 IPTG로 GFP를 5시간 동안 발현시키고, 다양한 농도(1/43, 1/42, 1/4, 1, 4 mM)의 L-람노스로 LacI 변이체의 발현을 조절하였다. 두 종류의 플라스미드 모두 L-람노스의 농도가 증가할수록 형광의 세기가 비례적으로 감소함을 확인할 수 있었다. 이는 플루오로미터로 측정한 형광의 세기의 결과와도 일치함을 알 수 있다. 또한, 형광 그래프(fluorescence graph)가 대칭적이므로 집단 내 개별 대장균 세포에서 독성 단백질인 GFP는 균일하게 생산되고 있음을 알 수 있었다.
실시예 7. 대장균의 사이토신 수송체 발현
대장균의 사이토신 수송체(codB)는 대장균 세포 내에서 발현되었을 때 세포 독성이 강하다는 보고가 있다. 이러한 codB를 LacI 변이체를 발현시키는 대장균에 생산하고자 하였다. CodB를 0.7mM IPTG로 6시간 동안 발현시켰을 때 LacI 변이체가 동시 발현되지 않는 조건 하에서는 대장균의 세포 생육이 50% 저해 받았다. 그러나 LacI 변이체를 L-람노스의 다양한 농도에서 동시 발현시켜 본 결과 세포 생육이 100% 회복되었으며, LacI 변이체를 1mM의 L-람노스로 발현시켰을 때 GFP와 융합된 codB의 생산량도 4.5배 증가하였다(도 8).
실시예 8. 독성 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 플라스미드의 대장균 내 형질전환
LacI 변이체의 발현 조절은 독성 단백질의 생산뿐만 아니라 독성 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 플라스미드를 대장균 내에 형질전환하는 효율을 증대시킬 수 있다. 독성이 강한 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 유전자를 leaky expression을 갖는 대장균용 플라스미드에 삽입하여 대장균에 형질전환할 경우 유도제 없이도 독성 단백질이 발현되어 플라스미드가 도입된 대장균을 확보하기가 어렵다. 그러나 이러한 독성 단백질의 발현을 LacI 변이체의 발현을 조절함으로써 세포 독성을 조절하여 형질전환된 대장균을 최대한으로 획득하는 것이 가능하다. 이를 위해 대장균 codB를 독성 단백질로 선택하여 형질전환 독성을 시험해 봤다. 플라스미드는 pMW7-codB-frGFP와 pMH-codB-frGFP를 사용하였고, 대장균은 BL21(DE3), MG1655, C41(DE3) 및 C43(DE3)를 사용하여 형질전환을 수행하였다(도 9 및 도 10). LacI 변이체는 다양한 농도의 L-람노스로 배지에 첨가하여 발현을 유도하였다. 그 결과 pMW7-codB-frGFP의 경우 LacI 변이체가 발현되는 조건 하에서만 형질전환된 대장균을 얻을 수 있었으며, pMH-codB-frGFP의 경우 LacI 변이체의 발현 없이도 십여 개의 형질전환 대장균을 얻을 수 있었으나 LacI 변이체를 발현시키면 수백개의 형질전환된 대장균을 확보할 수 있었다(도 9 및 도 10). 마찬가지로 대장균 F-ATPase 서브유닛 b(Ecb)에 대해서도 유사한 결과를 확인하였다(도 11, 도 12 및 도 13).

Claims (13)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 LacI 단백질의 75번째, 192번째, 197번째 또는 225번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 돌연변이된 LacI 단백질 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이는 A75T, V192F, R197S 또는 G225S 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 LacI 단백질 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 LacI 단백질 변이체는 유도제에 대한 결합력을 약화시키는 것을 특징으로 하는 LacI 단백질 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 LacI(lac repressor) 단백질 변이체를 코딩하는 유전자.
  5. 제4항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 대장균 유래의 Rha 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 Rha 프로모터는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  8. 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  10. 독성 단백질을 코딩하는 유전자를 재조합 발현 벡터에 삽입한 후 제8항의 숙주세포에 형질전환하여 상기 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 독성 단백질을 생산하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 독성 단백질을 생산하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 Rha 프로모터 작동을 위한 유도제인 람노스(rhamnose)의 농도는 0.015 ~ 4mM인 것을 특징으로 하는 독성 단백질을 생산하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 독성 단백질은 대장균 F-ATPase 서브유닛 b(E. coli F-ATPase subunit b), 소 미토콘드리아 2-옥소글루타레이트/말레이트 운반체 단백질(bovine mitochondrial 2-oxoglutarate/malate carrier protein), 바실러스 PS3 알라닌/H+ 운반체(Bacillus PS3 alanine/H+ carrier), 인간 CCR5(human CCR5), 인간 CCR3(human CCR3) 또는 인간 CXCR4(human CXCR4)인 것을 특징으로 하는 독성 단백질을 생산하는 방법.
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