HU217580B - Hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszor-fehérjék és eljárások gének expresszálására, valamint génexpresszió szabályozására a mutáns represszorok alkalmazásával - Google Patents

Hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszor-fehérjék és eljárások gének expresszálására, valamint génexpresszió szabályozására a mutáns represszorok alkalmazásával Download PDF

Info

Publication number
HU217580B
HU217580B HU9501578A HU9501578A HU217580B HU 217580 B HU217580 B HU 217580B HU 9501578 A HU9501578 A HU 9501578A HU 9501578 A HU9501578 A HU 9501578A HU 217580 B HU217580 B HU 217580B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
temperature
amino acid
lactose repressor
lactose
Prior art date
Application number
HU9501578A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT72398A (en
HU9501578D0 (en
Inventor
Seiko Miura
Kazuhiro Ohsuye
Masayuki Yabuta
Original Assignee
Suntory Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suntory Ltd. filed Critical Suntory Ltd.
Publication of HU9501578D0 publication Critical patent/HU9501578D0/hu
Publication of HUT72398A publication Critical patent/HUT72398A/hu
Publication of HU217580B publication Critical patent/HU217580B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát hőmérséklet-érzékeny műtáns laktózrepresszőr-fehérjék képezik, melyekben a vad típűsú laktózrepresszőr-fehérje 94.,241., 265. és 300. aminősav-pőzíciói közül legalább egyben egyaminősav a vad típűsútól eltérőre van cserélve. A találmány tárgyátképezik a műtáns laktózrepresszőr- fehérjéket kódőló gének is. A találmány tárgyát képezi tővábbá egy eljárás génexpressziószabályőzására a találmány szerinti műtáns laktózrepresszőrgénekalkalmazásával, valamint egy eljárás gének expresszálására az említettgénexpresszió szabályőzására szőlgáló eljárás alkalmazásával. Atalálmány tárgyát képező eljárásők szerint a génexpreszsziótközelebbről a gazdasejttenyészet hőmérsékletének váltőztatása útjánszabályőzzák. ŕ

Description

A találmány tárgyát hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszor-fehéijék képezik, melyekben a vad típusú laktózrepresszor-fehérje 94., 241., 265. és 300. aminosavpozíciói közül legalább egyben egy aminosav a vad típusútól eltérőre van cserélve. A találmány tárgyát képezik a mutáns laktózrepresszor-fehérjéket kódoló gének is.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás génexpresszió szabályozására a találmány szerinti mutáns laktózrepresszorgének alkalmazásával, valamint egy eljárás gének expresszálására az említett génexpresszió szabályozására szolgáló eljárás alkalmazásával. A találmány tárgyát képező eljárások szerint a génexpressziót közelebbről a gazdasejttenyészet hőmérsékletének változtatása útján szabályozzuk.
Az E. coli laktózoperonjának egyik génexpressziót szabályozó régiója a lac-gén azon régiója, amely a promoter/operátor régió represszorfehérjéjét kódolja, egyike azoknak a szabályozó génrégióknak, melyeket a leggyakrabban alkalmaznak gének expresszálására, mely géneket a szabályozórégiótól 3’-irányban helyeznek el. Az említett régiót azért alkalmazzák elterjedten, mert amennyiben indukálószer, mint például izopropilβ-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) van jelen a gazdasejtben, a laktózrepresszor nem tud a laktózoperátor-régióhoz kötődni, aminek következtében a laktózpromoterről megindul a transzkripció, ami lehetővé teszi a génexpresszió során a transzkripciós szabályozást.
Különböző hasznos termékek előállítására alkalmas, fenti szabályozórégiót tartalmazó klónozó vektorokat és génexpressziós vektorokat alkalmaznak azon az elven, hogy a génexpresszió sikeresen végrehajtható, amennyiben a táptalajhoz indukálószert, például IPTG-t adunk. Ilyen vektorok példáiként megemlíthetjük a pUC-sorozat tagjait, például a pUC-18-at stb. mint génklónozó vektorokat, az M13-fágalapú sorozatot, mely DNS-szekvenciameghatározásra szolgál, valamint a ygtll-et és hasonlókat, melyek cDNS-klónozásra szolgálnak. Legújabban ezt az expressziós szabályozórendszert állati sejtekben végrehajtott kísérletekben is alkalmazták [Ulrich Deuschele és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5400 (1989), Mickey C.-T. Hu és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 10, 6141 (1990)].
Az említett expressziós szabályozórendszert ezenfelül hasznos termékek előállítására is alkalmazzák [Mercedes Zazo és munkatársai: Gene 113, 231 (1992)]. Mindazonáltal az említett rendszernek az a jelentős hátránya, hogy drága indukálószert (IPTG-t) kell adni a tenyészethez a kívánt gén expressziójának beindítása céljából. Ez a hátrány különösen akkor jelentős, ha az említett expressziós rendszert ipari méretekben alkalmazzák valamely hasznos termék előállítására, mivel ilyenkor az IPTG alkalmazása megnöveli a termelési költségeket.
Az elmondottak értelmében sürgős igény van új, iparilag alkalmazható génexpresszió szabályozására alkalmas rendszerek kidolgozására. A fenti igényt valamely kívánt gén expressziójának szempontjából egy olyan génexpresszió szabályozására alkalmas rendszer kifejlesztése elégítené ki, amelyben nem lenne szükség semmilyen drága indukálószer - mint például az IPTG - alkalmazására, valamint szükség van olyan eljárásra is, amely az említett génexpressziós szabályozórendszer alkalmazásával lehetővé teszi kívánt gének expresszálását.
Az E. coli laktózoperonjának expressziós szabályozógénje által kódolt represszorfehéije tanulmányozása során találtunk egy új mutáns laktózrepresszor-fehéijét. Ez a represszorfehérje alacsony hőmérsékleten hozzákötődik az operátorhoz, és meggátolja a transzkripciót, magas hőmérsékleten azonban inaktiválódik, és nem képes az operátorhoz kötődni, tehát ez az új represszorfehéije egy hőmérséklet-érzékeny represszorfehérje-mutáns. A találmány szerinti eljárásban ezt az új represszorfehéijét alkalmazzuk.
Az elmondottak értelmében a találmány tárgyát képezi egy laktózrepresszor-fehérje, amelyben a vad típusú laktózrepresszor-fehéije 94., 241., 265. és 300. aminosavpozíciói közül legalább egyben egy aminosav a vad típusútól eltérőre van cserélve.
Az említett aminosavcsere lehet többek között a 94. valin metioninra cserélődése, a 241. alanin treoninra cserélődése, a 265. glicin aszparaginsavra cserélődése és/vagy a 300. szerin aszparaginra, fenil-alaninra vagy prolinra cserélődése. A mutáns laktózrepresszorfehérje aminosavsorrendjének egy lehetséges példáját megadjuk a 20. azonosító számú szekvencia mellett.
A találmány tárgyát képezi továbbá az említett hőmérséklet-érzékeny laktózrepresszor-fehéijét kódoló gén (laktózrepresszor-fehéije gén). Az említett gén nukleotidszekvenciájának egy lehetséges példája a 20. azonosító számú szekvencia. A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás valamely kívánt fehéije (kívánt gén) expressziójának szabályozására valamely gazdasejtben, mely gazdasejt tartalmazza az említett laktózrepresszorfehéije gént, valamint a kívánt gént, mely eljárás szerint a kívánt gén expresszióját a laktózrepresszor-fehéije működésének szabályozása útján szabályozzuk oly módon, hogy a gazdasejttenyészet hőmérsékletét változtatjuk.
A fenti eljárás szerint a laktózrepresszor-fehéije génjét a gazdasejt kromoszómájába vagy valamely extrakromoszomális genetikai állományába - például egy plazmidba - juttatjuk. A plazmid lehet például klónozó vektor vagy expressziós vektor. A gazdasejtek lehetnek többek között prokarióták, például baktériumok, mint az E. coli, valamint eukarióták, mint például az alacsonyabb rendű eukarióták, például gombák és élesztők, valamint magasabb rendű eukarióták, mint például emlőssejtek, rovarsejtek és hasonlók. A találmány szerinti eljárásban a kívánt gén expressziója szobahőmérsékleten, például 30 °C-on gátolva van, magasabb hőmérsékleten azonban, például 35 °C-on vagy még magasabb hőmérsékleten, például 37 °C-on vagy ennél is magasabb hőmérsékleten a kívánt gén expressziójának gátlása feloldódik.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás valamely kívánt fehérjét kódoló gén (kívánt gén) expresszálására, mely eljárás szerint a kívánt gén expresszióját úgy szabályozzuk, hogy a laktózrepresszor-fehérje génjét és a kívánt gént tartalmazó expressziós vektorral transzformált gazdasejttenyészet hőmérsékletének vál2
HU 217 580 Β toztatása útján a laktózrepresszor-fehérje működését szabályozzuk. Az eljárásban alkalmazott gazdasejtek és hőmérsékletértékek megegyeznek a fent megadottakkal.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábrán látható grafikon a tenyészet hőmérsékletének hatását mutatja β-galaktozidáz-termelődésre.
A 2. ábra a pYOl-plazmid pMC9-l és pMW119plazmidokból történő előállításának vázlatát mutatja.
A 3. ábrán egy SDS-gélelektroforézises kísérlet eredményeit láthatjuk, amelyből a tenyészet hőmérsékletének, valamint egy indukálószemek egy fehérje termelődésére kifejtett hatásai figyelhetők meg.
A 4. ábrán a pMC9-SalI-plazmid előállítási eljárásának vázlatát láthatjuk.
Az 5. ábrán a 300. pozícióban helyspecifikus mutációt tartalmazó különböző plazmidok előállítására alkalmas eljárás vázlatát láthatjuk.
A laktózrepresszor-fehéijét kódoló lacl-gént hordozó pMC9-plazmidot hidroxil-amin-mutagénnel kezeljük, és ily módon mutációkat hozunk létre a lacl-génben. Az így előállított plazmidot a mutáns lacl-gént tartalmazó E. coli KI2 törzsből származó MYW3110-törzs transzformálására használjuk. A transzformált sejteket ampicillint és 5-bróm-4-klór-3-indolil^-D-galaktopironozidot (Xgalt) tartalmazó agaralapú táptalajjal töltött lemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán keresztül a lemezeket 38 °C-on inkubáljuk.
Az éjszaka elteltével a kék kiónokat kiválasztjuk, és mindegyiket két azonos lemezre oltjuk, melyek közül az egyiket 30 °C-on, a másikat pedig 38 °C-on tartjuk egy éjszakán keresztül. Az ismertetett eljárással sikerült hét hőmérséklet-érzékeny mutánst izolálnunk, melyek 30 °C-on tartva fehérek maradtak, 38 °C-on inkubálva pedig kék színűek lettek. Annak igazolására, hogy a kapott mutációk valóban a plazmidon lévő lacl-génben történtek-e, mindegyik hőmérséklet-érzékeny mutáns klónból plazmidot izoláltunk, és az izolált plazmidokban meghatároztuk a lacl-gén szekvenciáját.
A szekvenciameghatározás eredményeképpen azt találtuk, hogy a laktózrepresszor-fehérje 300. pozíciójában található szerin aszparaginná, a 241. pozícióban található alanin treoninná, a 265. pozícióban található glicin aszparaginsavvá, a 94. pozícióban található valin pedig metioninná mutált. A felsorolt pozíciókban található mutációkat eddig nem írták le hőmérséklet-érzékeny mutációkként. Az említett mutánsszekvencia új, a szekvenciát jelen találmány kidolgozása során elsőként izoláltuk.
A következő lépésben megvizsgáltuk, hogy az izolált hőmérséklet-érzékeny mutációkat hordozó laktózrepresszorgének alkalmasak-e génexpresszió szabályozására. Először a fent említett mutációt tartalmazó mutáns lacl-gént kolicin-El-eredetű plazmidokkal (például pMWl 19-plazmiddal) kompatibilis plazmidba építettük, és ily módon előállítottuk a pYOl-, pY02- és pY016-plazmidot. Expresszálandó fehérjeként választhatunk például egy humán kalcitonin prekurzor peptidből származó fúziós fehérjét.
A pG97S4DhCT[GRRR]-plazmidot, melyet egy olyan törzsből izoláltunk, mely a fent említett fúziós proteint termelte, transzformáció útján bejuttattuk a következő E. coli törzsekbe: MYW3110/pY01, MYW3110/pY02 és MYW3110/pY016, melyek sorrendben a pYOl, pY02 és pY016 jelű plazmidokat tartalmazták, és transzformánsokat izoláltunk.
Megjegyezzük, hogy a pG97S4DhCT(G)-plazmidot tartalmazó E. coli W3110 törzset (az említett plazmid lényegében azonos a pG97S4Dh[GRRR]-plazmiddal) Escherichia coli SBM323-nak neveztük és a Budapesti Szerződés értelmében deponáltuk a „National Institute of Bioscience and Humán Technology Agency of Industrial Science and Technology”-nél, 1991. augusztus 8-án, ahol a törzs a FERM BP-3503 deponálási számot kapta. A pG97S4DhCT[GRRR]-plazmid csak annyiban különbözik a pG97S4DhCT(G)-plazmidtól, hogy az utóbbi olyan fúziós proteint kódol, melyben a kívánt fehéije C-terminális aminosava glicin, míg az előbbi plazmid olyan fúziós fehérjét kódol, amelyben a kívánt fehérje az említett glicinen túl még három addicionális argininnel is rendelkezik.
Az előállított transzformánsokat 30 °C-on tenyésztettük, majd fehérje (speciálisan fúziós fehérje) termeltetése céljából tovább tenyésztettük őket 37 °C-on. A kísérletek eredményeképpen azt találtuk, hogy a fehérje termelődése 30 °C-on nem indukálódott, 37 °Con azonban igen, ily módon igazoltuk, hogy a hőmérséklet-érzékeny mutációt tartalmazó represszorfehérje, valamint az azt kódoló gén alkalmas gének expreszsziójának szabályozására.
Érdemes megjegyezni, hogy a fent említett mutációs pozíciók a laktózrepresszor-fehéije magasabb rendű térszerkezetében olyan helyeken találhatók, melyek hőmérsékleti változásokkal szemben rendkívül labilisak. Más szóval azt mondhatjuk, hogy a mutációs pozíciók fontosak a laktózrepresszor-fehéije magasabb rendű térszerkezetének megőrzése szempontjából. Az elmondottak értelmében várható, hogy az említett mutációs pozíciókban egyéb aminosavcseréket végrehajtva újabb hőmérséklet-érzékeny laktózrepresszor-fehéije mutánsokat állíthatunk elő.
A fentiek alapján in vitro mutagenezissel előállítottunk olyan mutáns laktózrepresszor-fehéijéket, melyekben a 300. pozícióban levő kodont tizennyolc különböző aminosav kodonjaira cseréltük, majd a kapott mutáns lacl-gének hőmérséklet-érzékenységét teszteltük. Azt találtuk, hogy azok a mutáns gének, melyekben a 300. aminosav kodonját valamely más aminosav kodonjára cseréltük (különösen fenil-alanin- vagy prolin-kodon esetén), hőmérséklet-érzékeny fenotípusúnak bizonyultak.
Igazoltuk, hogy a találmány szerinti izolált represszorfehéije hőmérséklet-érzékeny mutációiért felelős helyei, azaz a laktózrepresszor-fehéije 94., 241., 265. és 300. pozícióban lévő aminosavai fontosak a fehéije magasabb rendű térszerkezetének fennmaradása szempontjából. Az elmondottak értelmében oly módon alakíthatunk ki hőmérséklet-érzékeny mutációkat, hogy a felsorolt pozíciók valamelyikében az ott található aminosavat más aminosavra cseréljük. Az alábbiakban bemutatott
HU 217 580 Β példákban fehérjetermeltetési kísérletekkel igazoltuk, hogy a találmány szerinti hőmérséklet-érzékeny mutációt tartalmazó represszorgének alkalmasak valamely kívánt gén expressziójának szabályozására.
A 20. szekvenciaazonosító számon megadjuk a találmány tárgyát képező laktózrepresszor-fehérjék aminosavsorrendjét és nukleotidszekvenciáját. A megadott aminosavsorrendek közül az felel meg a vad típusú laktózrepresszor-fehérje aminosavsorrendjének, ahol a 94. pozícióban a jelölt Xaa valinnak felel meg, a 241. Xaa alanin, a 265. Xaa glicin, a 300. Xaa pedig szerin. A találmány egy megvalósítási módja szerint a 94. Xaa metionin; egy másik megvalósítási mód szerint a 241. Xaa treonin; egy másik megvalósítási mód szerint a 265. Xaa aszparaginsav; egy további megvalósítási mód szerint pedig a 300. Xaa aszparagin, fenilalalin vagy prolin.
A fentiek értelmében logikusan feltételezhető, hogy nemcsak azok a laktózrepresszor-fehérjék hőmérsékletérzékenyek, melyekben a 94., 241., 265. és 300. aminosavak közül csak egy szenvedett mutációt, hanem azok is, melyek két pozícióban - például a 94. és 241., a 94. és 256. vagy a 94. és 300. pozícióban tartalmaznak mutációkat; valamint azok a laktózrepresszor-fehéqék is, melyek három pozícióban, például a 94., 241. és 265. a
94., 241. és 300. vagy a 241., 265. és 300. pozícióban tartalmaznak mutációkat; valamint azok a laktózrepresszor-fehérjék is, melyek mind a négy említett pozícióban, azaz a 94., 241., 265. és 300. pozícióban mutációkat tartalmaznak. Mindezek a mutáns laktózrepreszszor-fehérjék a találmány tárgyát képezik.
Abból a tényből, hogy a 300. pozícióban lévő szerin aminosavat mind aszparaginra, mind fenil-alaninra, mind prolinra kicserélhetjük, megállapítható, hogy egy adott pozícióban a natív aminosav nem csak egy kiválasztott aminosavra cserélhető. Az elmondottak értelmében, bár a 265. natív glicin aminosavat aszparaginsavra cserélhetjük, a 241. natív alanin aminosavat treoninra cserélhetjük, és a 94. natív valin aminosavat metioninra cserélhetjük, az említett pozíciókban nem kizárólag az említett aminosavakra lehet cserélni az ott található natív aminosavakat.
A fent ismertetett eljárás, melynek segítségével meghatároztuk, hogy a 300. pozícióban melyek a megfelelő aminosavcserék, alkalmas arra is, hogy eldöntsük, hogy a 265., 241. és 94. pozícióban melyek a megfelelő cserék. Közelebbről, helyspecifikus mutációkkal kicseréljük a fent említett pozíciókban található natív aminosavakat, majd olyan DNS-t szintetizálunk, mely a helyspecifikus mutációkat tartalmazó represszorfehérjéket kódolja. A következő lépésben a 300. pozícióban végrehajtott mutáció esetén ismertetett eljárás szerint a fent említett pozíciókban található aminosavak olyan aminosavakra cserélhetők, melyek a laktózrepresszort hőmérséklet-érzékennyé teszik.
A találmány tárgyát képezik továbbá a különböző fenti laktózrepresszor-fehéqéket kódoló gének. A genetikai kód degeneráltsága folytán ezek a találmány szerinti gének különböző nukleotidszekvenciájúak lehetnek. Ezeket a géneket előállíthatjuk szintetikus úton is oly módon, hogy a kívánt aminosavsorrendet kódoljuk. Ettől eltérően, a találmány szerinti géneket előállíthatjuk az adott DNS-szekvencia megfelelő kodonjainak helyspecifikus mutagenezise útján is, mely kodonok a kívánt aminosavaktól eltérő natív vagy nemnatív aminosavakat kódolnak. Az egynél több mutációt tartalmazó laktózrepresszor-fehérjéket kódoló DNS-eket előállíthatjuk kémiai szintézis vagy helyspecifikus mutáció útján.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás valamely kívánt fehérjét kódoló gén (kívánt gén) expreszsziójának szabályozására a találmány szerinti hőmérséklet-érzékeny laktózrepresszor-fehéije alkalmazásával. Az említett, találmány tárgyát képező eljárás szerint ellenőrzött hőmérsékleten olyan sejteket tenyésztünk, melyek tartalmazzák mind a hőmérséklet-érzékeny laktózrepresszor génjét, mind pedig a kívánt fehérjét kódoló génhez (kívánt génhez) kapcsolt laktózoperátor-génrégiót. A represszorgén és a kívánt gén elhelyezkedhet egymással összekapcsoltan, de egymástól elkülönülten is.
A represszorgén és a kívánt gén elhelyezkedhet például ugyanazon az extrakromoszomális génen. Az „extrakromoszomális gén” kifejezés a leírásban használt értelemben önállóan replikálódó plazmidot, fágot, vírust vagy hasonlót jelent.
A találmány szerinti hőmérséklet-érzékeny laktózrepresszor-fehérjék gátolják a laktózoperátorhoz kapcsolt kívánt gén expresszióját 30 °C-nál nem magasabb tenyésztési hőmérsékleten, például 20 és 30 °C között, ezzel szemben a találmány szerinti represszorfehérjék 35 °C fölötti, például 37 °C-os vagy magasabb tenyésztési hőmérsékleten nem gátolják a laktózoperátorhoz kapcsolt, kívánt gén expresszi óját. Az elmondottak értelmében egy kívánt gén expresszálását végezhetjük oly módon, hogy a gazdasejteket 30 °C-on vagy alacsonyabb hőmérsékleten tenyésztjük, majd a tenyésztési hőmérsékletet 35 °C-ra vagy magasabbra, például 37 °C-ra vagy magasabbra növeljük.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott gazdasejtek lehetnek bármilyen rekombináns technológiában általánosan, kívánt gének expresszáltatására alkalmazott sejtek. Lehetnek például prokarióta sejtek, mint például baktériumok: Escherichia coli, Bacillus, mint például Bacillus brevis; alacsonyabb rendű eukarióta sejtek, például élesztősejtek: Saccharomyces, például Saccharomyces cerevisiae, alkoholasszimiláló élesztők, például Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida boidinii, valamint fonalas gombák, mint például az Aspergillus.
Az elmondottakon túl alkalmazhatunk még magasabb rendű eukarióta sejteket is, például állati sejteket, mint például COS-sejteket, CHO-sejteket (azaz aranyhörcsög-petefészeksejteket), BHK-sejteket (azaz újszülött hörcsög vesesejteket), valamint rovarsejteket, mint például SF9-sejteket és hasonlókat.
Bár a későbbiekben bemutatott példákban laktózpromotert alkalmazunk, a találmány szerinti eljárásban alkalmazható bármely más megfelelő promoter is. Az elmondottak értelmében a találmány szerinti represszorgén alkalmazható olyan rendszerekben, melyek egy kívánt gén expresszióját bármely olyan expressziós vektor
HU 217 580 Β vagy klónozó vektor (például plazmid, fág stb.) alkalmazásával valósítják meg, melyek tartalmaznak egy megfelelő promoterrégiót, valamint egy laktózoperátor-régiót, amely a promoterrégiótól 3’-irányban van elhelyezve. A laktózpromoteren kívül alkalmas promoterrégiók példáiként - anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk - megemlítjük még a tac-, a trc-, valamint a lacUV5-promotereket és hasonlókat.
A találmány szerinti eljárással előállítható minden olyan fehéqe és peptid, melyeket egyéb genetikai rekombinációs eljárásokkal elő lehet állítani. Ezek a fehéqék és peptidek lehetnek például biológiailag aktív peptidek, például inzulinok, növekedési hormonok, diuretikus peptidek (különösen a C típusú nátriuretikus peptid; CNP) kalcitoninok, paratiroid hormonok (PTH1-34, PTH1-84 stb.), biológiailag aktív fehéqék, mint például sejtdifferenciációs növekedési faktorok, sejtnövekedést gátló faktorok, valamint fiziológiailag fontos enzimek.
A találmány szerinti hőmérséklet-érzékeny laktózrepresszor-fehérje gén alkalmazható mind extrakromoszomális genetikai anyagba - például plazmidba - történő inszertálás, mind pedig a gazdasejt kromoszómájába történő inszertálás útján valamely kívánt gén expresszálására. Az alábbiakban bemutatott példákban plazmidokat alkalmazunk. A találmány ipari szempontból rendkívül jelentős, mivel a találmány szerinti hőmérséklet-érzékeny, mutáns laktózrepresszorgén lehetővé teszi, hogy valamely kívánt peptidet vagy fehéqét kódoló gén expresszálását drága indukálószer - mint például IPTG - alkalmazása nélkül valósítsuk meg.
A találmány szerinti megoldást az alábbi példák útján kívánjuk még részletesebben szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
1. példa
Laktózrepresszor-mutáns törzs előállítása E. coli
W3110 törzsből kiindulva
A találmány szerinti megoldás célja a lacl-gén hőmérséklet-érzékeny mutánsainak izolálása, valamint az izolált mutánsok alkalmazása valamely kívánt gén expreszszálására. Annak érdekében, hogy képesek legyünk hőmérséklet-érzékeny mutációt tartalmazó laktózrepresszorgén (lacl-gént) izolálni, először is előállítottunk egy lacl gazdatörzset az alábbiak szerint. Ismeretes, hogy amennyiben a laktózrepresszor mutációt szenved, a β-galaktozidázgén konstitutív módon expresszálódik (konstitutív fenotípus), és ismeretes egy fenil-p-Dgalaktozid alkalmazásán alapuló szelekciós eljárás is ilyen mutánsok izolálására [J. H. Miller és munkatársai: , A- Short Course in Bacterial Genetics” Laboratory Manual 131-134. oldal, Cold Spring Harbor Laboratory (1992)].
A fenti eljárás szerint az E. coli W3110 szülői törzs (hozzáférhető az ATCC 14948 nyilvántartási számon) sejtjeit agarlemezekre szélesztettük, melyek szénforrásként fenil-3-D-galaktozidot tartalmaztak, majd a lemezeket két napon keresztül 37 °C-on inkubáltuk. Az inkubálás után izoláltuk a kinőtt kolóniákat, és kiválasztottunk egy laktózrepresszor-mutáns kolóniát, mely a β-galaktozidázt konstitutív módon expresszálta, és E. coli MYW3110-nek neveztük el.
2. példa
Hőmérséklet-érzékeny mutációt tartalmazó laktózrepresszorgén izolálása
A pMC9-plazmid a pBR322-plazmid származéka és jelen van az E. coli Y1089 törzsben (Huynh, T. V. és munkatársai: „DNA Cloning”, I. kötet, IRL Press Limited, Oxford, England, 49-78. old; beszerezhető az in vitro-géntől; katalógusszám: 789-02).
pg pMC9-plazmidot 1 ml 100 mmol/1 NaCl-t, 2 mmol/1 EDTA-t és 1 mol/1 hidroxil-amint tartalmazó 50 mmol/1 foszfátpufferhez (pH=7,0) adtunk, majd a reakciót 65 °C-on 30 percig végeztük. A reakcióelegyet ezután 5 1 TE-pufferrel (10 mmol/1 Tris-HCl, pH=8,0, 1 mmol/1 EDTA) szemben dializáltuk, majd közismert eljárás szerint etanolos kicsapást végeztünk, és a kapott csapadékot 20 μΐ TE-pufferban feloldottuk. A kapott oldat 4 μΐ-ével E. coli MYW3110 sejteket transzformáltunk a közismert CaCl2-os eljárással.
A transzformánsokat L-agar (polipepton: 10 g, NaCl: 5 g, élesztőkivonat: 5 g és agar: 15 g, 1 1 ioncserélt vízben oldva) tartalmú lemezekre szélesztettük. A táptalaj tartalmazott még 40 pg/ml 5-bróm-4-klór-3indolil^-D-galaktopiranozidot (X-gal-t), valamint 50 pg/ml ampicillint is. A lemezeket egy éjszakán át 38 °C-on inkubáltuk. Az ismertetett táptalajon kéknek mutatkozó transzformáns kolóniákat kiválogattuk, majd mindegyiket két, a fentiekkel azonos összetételű táptalajt tartalmazó lemezre oltottuk, melyek közül az egyiket egy éjszakán át 30 °C-on, a másikat pedig egy éjszakán át 38 °C-on inkubáltuk.
Az ismertetett eljárással hét olyan transzformánst tudtunk izolálni, melyek 30 °C-on fehérnek, 38 °C-on pedig kéknek bizonyultak. Annak érdekében, hogy igazoljuk, hogy a hőmérséklet-érzékeny mutációt a plazmidon található lacl-gén hordozza, a közismert lúgos denaturáláson alapuló eljárással mindegyik transzformánsból plazmidot izoláltunk, és az izolált plazmidokkal E. coli MYW3110 sejteket transzformáltunk annak igazolására, hogy a transzformánsok azonos fenotípusúak. A transzformánsokból izolált plazmidok elnevezései a következők: pMC9-l, pMC9-6, pMC9-16, pMC9-17, pMC9-22 és pMC9-24.
3. példa
A mutáció helyének azonosítása
A fent említett plazmidokban (pMC9-l, pMC9-2, pMC9-6, pMC9-16, pMC9-17, pMC9-22 és pMC9-24) található lacl-génekben a mutáció pozícióját a következő kísérlettel határoztuk meg. A plazmidokat ultracentrifugálásos módszerrel tisztítottuk, majd a „T7 Sequencing TM” reagenskészlet (Pharmacia) alkalmazásával szekvenáltuk kémiailag szintetizált láncindító oligonukleotidokat alkalmazva. A 20 tagú láncindító oligonukleotidok szekvenciái a következők voltak:
1. láncindító; 5’-GCAACGCCAATCAGCAAC-3’ (szekvenciaazonosító szám: 1);
2. láncindító: 5’-GGGTGTCTGGTCAGAGAC-3’ (szekvenciaazonosító szám: 2);
3. láncindító; 5’-ATCGTTGGCAACCAGCATCGCA-3’ (szekvenciaazonosító szám: 3);.
HU 217 580 Β
4. láncindító; 5’-CGCCGTCGCAAATTGTCG-3’ (szekvenciaazonosító szám: 4);
5. láncindító; 5’-CTCCCATGAAGACGGTACG-3’ (szekvenciaazonosító szám: 5);
6. láncindító; 5’-GCAATGCGCGCCATTACC-3’ (szekvenciaazonosító szám: 6);
7. láncindító; 5’-CATCGAATGGCGCAAAA-3’ (szekvenciaazonosító szám: 7).
Amennyiben a lacl-gén transzlációs iniciációs kodonjának (GTG) első „G”-jét tekintjük az 1. sorszámú nukleotidnak, az 1. láncindító szekvenciája megfelel a 183-200. nukleotidok szekvenciájának, a 2. láncindító szekvenciája megfelel a 448-465. nukleotidok szekvenciájának, a 3. láncindító szekvenciája megfelel a
720-741. nukleotidok szekvenciájának, a 4. láncindító 15 szekvenciája megfelel a 224-241. nukleotidok szekvenciájának, az 5. láncindító szekvenciája megfelel a 483-501. nukleotidok szekvenciájának, a 6. láncindító szekvenciája megfelel a 757-774. nukteotidok szekvenciájának, és a 7. láncindító szekvenciája megfelel a 20
-72—56 nukleotidok szekvenciájának, mely szekvenciarészlet a transzlációs startkodontól 5’-irányban helyezkedik el. 5’-végi láncindítóként az 1., a 3. és a 7. láncindítót alkalmaztuk, 3’-irányú láncindítóként pedig a 5 4. és 6. láncindítót alkalmaztuk. Az izolált gének DNSszekvenciáját, valamint a gének által kódolt aminosavsorrendet a 20. azonosító számú szekvenciaként mutatjuk be.
Az 1. táblázatban összehasonlítjuk az általunk izolált lacl-géneket a J. H. Miller által leírt [„A Short Course in 10 Bacterial Genetics, Handbook Section” 16, Cold Spring Harbor Laboratory (1992)] vad típusú lacl-génnel. Az 1. táblázatból látható, hogy a pMC91-, pMC917- és pMC924-plazmidokban a 300. szerin aminosavat kódoló AGC-kodon aszparagint kódoló AAC-kodonra mutálódott; a pMC916- és pMC922-plazmidokban a 241. alanin aminosavat kódoló GCG-kodon treonint kódoló ACG-kodonra mutálódott; a pMC912-plazmidban a 265. glicin aminosavat kódoló GGT-kodon aszparaginsavat kódoló GAT-kodonra mutálódott; és a pMC916-plazmidban a 94. valin aminosavat kódoló GTG-kodon metionint kódoló ATG-kodonra mutálódott.
1. táblázat
A hőmérséklet-érzékeny lacl-génekben található mutációk pozíciói
Plazmid Aminosavszám Vad típus Mutáns
Aminosav Kodon Aminosav Kodon
pMC9-l pMC9-17 pMC9-24 300 Szerin AGC Aszparagin AAC
pMC9-16 pMC9-22 241 Alanin GCG Treonin ACG
pMC9-2 265 Glicin GGT Aszparaginsav GAT
pMC9-6 94 Valin GTG Metionin ATG
J. H. Miller és munkatársai [J. M. Bioi. 212, 295 (1990)] számos laktózrepresszor-mutánst leírnak. A találmány szerinti laktózrepresszorok hőmérséklet-érzékenységét okozó mutációk pozíciói különböznek a Miller és munkatársai által leírt mutációs pozícióktól, a találmány szerinti mutáns laktózrepresszor-molekulák új molekulák.
Ismeretes, hogy a laktózrepresszorok két egymástól különböző funkciójú doménnal rendelkeznek. Az egyik domént a fehéije 59 N-terminális aminosava képezi, és ez a dómén kötődik az operátor DNS-szakaszhoz, a többi aminosav az úgynevezett „core”-régiót alkotja, mely egyrészt szükséges az oligomerkialakuláshoz, másrészt pedig felelős az indukálószer - például IPTG - megkötéséért. A találmány szerinti represszorgénekben a laktózrepresszor-fehéije 94., 241., 265. és 300. aminosavait kódoló kodonok szenvedtek mutációt. Valamennyi mutáció a „core”-régióban található. Az elmondottak értelmében magasabb hőmérsékleten az említett mutációk nagy valószínűséggel alkalmatlanná teszik a represszorfehéqét a tetramerképződésre, vagy olyan strukturális változást idéznek elő a represszorfehéijében, melynek következtében a fehéije olyan szerkezetet vesz fel, mintha indukálószert kötött volna.
A következő lépésben a pMC9-l-, pMC9-2- és pMC9-16-plazmidokat — melyek a hőmérséklet-érzékeny mutáció szempontjából előnyös tulajdonsággal rendelkeztek, tovább vizsgáltuk.
4. példa
A tenyésztési hőmérséklet változtatásának hatása a hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszorfehérje viselkedésére
A fenti 3. példában a hőmérséklet-érzékeny laktózrepresszor-mutánsokat az alacsonyabb hőmérséklet-tartományhoz tartozó 30 °C-on és a magasabb hőmérséklet-tartományhoz tartozó 38 °C-on vizsgáltuk. Fontos azonban meghatározni a transzformánsok előnyös tenyésztési körülményeit, különös tekintettel a kritikus hőmérséklet meghatározására, ami alatt génexpresszió nem indukálódik, ami fölött viszont indukálódik a génexpresszió. Éppen ezért előállítottunk egy inokulumtenyészetet oly módon, hogy a transzformánst 30 °C-on tenyésztettük, majd a tenyészetet vizsgálati táptalajban 30 °C-on, 35 °C-on, 37 °C-on 40 °C-on, 42 °C-on és 45 °C-on továbbtenyésztettük, hogy meghatározhassuk a fent említett kritikus hőmérsékletet. A génexpresszió mér6
HU 217 580 Β tékének indikátora a gazdasejt kromoszómája által kódolt β-galaktozidáz aktivitása volt.
A végrehajtott kísérleteket az alábbiakban részletezzük: az E. coli MYW3110/pMC9—1, az E. coli MYW3110/pMC9-2 és az E. coli MYW3110/pMC9-16 törzseket egymástól elkülönítve 3-3 ml 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L-táptalajra oltottuk, majd a tenyészeteket egy éjszakán át 30 °C-on tartottuk. Az éjszaka elteltével megmértük a tenyészetek OD660értékeit, majd a tenyészetekből egy bizonyos térfogattal 2-2 ml 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L-táptalajt oltottunk be, és a beoltott tenyészeteket 3 órán keresztül 30, 35, 37,40,42 és 45 °C-on tartottuk. A tenyészetek beoltásához felhasznált térfogatot úgy határoztuk meg, hogy a felhasznált térfogat mérőszámának és az inokulumtenyészet OD660-értékének szorzata 0,5-et adjon.
A tenyészetek β-galaktozidázaktivitásának értékeit ONPG (O-nitrofenil-β-D-galaktozid) szubsztrát alkalmazásával Miller és munkatársai módszere alapján határoztuk meg [Experiment in Molecular Genetics, 352-355, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)]. A kísérletek eredményeit az 1. ábrán láthatjuk. Az ábrán látható, hogy az E. coli MYW3110/pMC9-l, az E. coli MYW3110/pMC9-2 és az E. coli MYW3110/ /pMC9-16 törzsek 30 °C-on lényegében nem mutattak β-galaktozidázaktivitást, ami arra utal, hogy a β-galaktozidázgén expressziója gátolva volt, míg 35 vagy 37 °C-os hőmérsékleten a β-galaktozidázgén expreszsziója megindult.
A génexpresszió indukálásának kritikus hőmérséklete, azaz az a hőmérséklet, melyen a laktózrepresszor működésképtelenné válik, az E. coli MYW3110/ /pMC9-l és az£. coli MYW3110/pMC9-2 törzsek esetén 35 °C-nak és az E. coli MYW3110/pMC9-16 törzs esetén 37 °C-nak bizonyult. Valamennyi fent említett baktériumtörzs esetén a lacZ-gén maximális expreszszióját 40 °C-on tapasztaltuk. Az elmondottak értelmében kijelenthetjük, hogy a találmány szerinti mutáns laktózrepresszorgén kielégíthetőén alkalmazható valamely kívánt gén expresszálására 37 °C-on, amely hőmérséklet elfogadottan a legkedvezőbb hőmérséklet gazdasejtek tenyésztésére, és ezt a hőmérsékletet alkalmazzák a gazdasejtek mind kísérleti, mind ipari méretű tenyésztésére is.
5. példa
Génexpresszió szabályozása hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszorgén alkalmazásával, kívánt fúziós protein termeltetése esetén A fenti 4. példában a hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszorgén alkalmazásával a gazdasejt kromoszómáján található β-galaktozidázgén expresszióját szabályoztuk. Az 5. példa a találmány szerinti megoldás egy másik megvalósítási módját illusztrálja, mégpedig egy eljárást kívánt gén expresszálására hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszor alkalmazásával, a transzformáns tenyésztési hőmérsékletének szabályozása útján.
Az alább ismertetendő kísérletben a találmány szerinti hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszorgént - kívánt fehérjeként - egy β-galaktozidázszármazékból és egy humán kalcitonin prekurzor pepiidből álló fúziós protein expressziójának szabályozására kívántuk alkalmazni. A kísérletet egy expressziós plazmid alkalmazásával hajtottuk végre, mely expressziós szabályozó génrégióként a laktózoperon promoter/operátor régióját tartalmazta, valamint ettől az expressziós szabályozó génrégiótól 3’-irányban tartalmazta az említett fúziós proteint kódoló gént is.
Első lépésben a pMC91-plazmidot EcoRI-gyel hasítottuk az 1,7 kb hosszúságú, hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszorgén-régió izolálása céljából. Az izolált génszakaszt a pMWl 19-plazmid (pSClOlplazmidból származó replikációs origót tartalmazó kis kópiaszámú plazmid, Nippon Gene) EcoRI helyére inszertáltuk, és így állítottuk elő a pYOl-plazmidot (2. ábra). Ugyanezt az eljárást alkalmaztuk a pYOW-, pY02- és a pY016-plazmidok pMC9-, pMC9-2- és pMC9-16-plazmidokból történő előállítására is.
A pG97S4DhCT[GRRR]-plazmiddal - mely a laktóz promoter/operátor (lacPO) régiótól 3’-irányban egy E. coli β-galaktozidázszármazékból és egy humán kalcitonin prekurzor peptidből álló fúziós proteint tartalmazott - pMC9-, pMC9-2- és pMC9-16-plazmidokat tartalmazó E. coli sejteket transzformáltunk, és ily módon a következő ampicillin- és tetraciklinrezisztens E. coli törzseket kaptuk:
E. coli MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pYOW;
E. coli NNWS 110/pG97S4DhCT[GRRR], pY01;
E. coli MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pY02; valamint
E. coli MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pY016.
A kapott törzseket 50 pg/ml ampicillint és 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-táptalajban egy éjszakán át 30 °C-on tenyésztettük, és ily módon inokulumtenyészeteket állítottunk elő. Az inokulumtenyészetekkel két-két azonos összetételű táptalajt oltottunk be a beoltott táptalaj mennyiségének 5%-át kitevő inokulumtérfogattal. A beoltott tenyészetek egyikét 15 órán keresztül 30 °C-on tenyésztettük, míg a másikat 15 órán keresztül 37 °C-on, A vad típusú laktózrepresszorgént tartalmazó E. coli MYW3110/pG974DhCT[GRRR], pYOW törzset végkoncentrációban 5 mmol/1 IPTG-vel indukáltuk. A tenyésztés befejeztével a táptalajt lecentrifugáltuk, majd a tenyésztett sejtek által termelt fúziós protein mennyiségét SDS-16%-PAGE-eljárással (nátrium-dodecil-szulfát alkalmazásával végrehajtott gélelektroforézis, 16%-os poliakrilamidgélben) határoztuk meg, és összehasonlítottuk a fúziós protein expreszsziójának mértékét a különböző hőmérsékleteken. A kísérletek eredményeit a 3. ábrán láthatjuk.
Amint az a 3. ábrán látható, a vad típusú laktózrepresszorgént tartalmazó E. coli MYW3100/pG97S4DhCT[GRRR], pYOW törzs csak IPTG hozzáadása után termelte a fúziós proteint. Az E. coli MYW3100/pG97S4DhCT[GRRR], pYOl; az E. coli MYW3100/pG97S4DhCT[GRRR], pY03; valamint az E. coli MYW3100/pG97S4DhCT[GRRR], pY016 törzsek nem expresszálták a fúziós proteint, amennyiben 30 °C-on tenyésztettük őket, 37 °C-on tenyésztve azonban expresszálták a fúziós proteint, mégpedig az IPTG7
HU 217 580 Β vei indukált, vad típusú laktózrepresszort tartalmazó törzzsel összehasonlítható mennyiségben.
Az elmondottakból kitűnik, hogy a találmány szerinti hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszorgén alkalmas egy fúziós protein expressziójának szabályozására, mely protein egy olyan expressziós plazmidról expreszszálódott, amely expressziós szabályozó génrégióként a laktózoperon promoter/operátor régióját tartalmazta, valamint ettől a régiótól 3’-irányban a β-galaktozidázszármazékból és humán kalcitonin prekurzor pepiidből álló fúziós proteint kódoló gént.
Az elmondottak értelmében a találmány szerinti hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszorgének alkalmasak génexpresszió szabályozására olyan expressziós rendszerben, amely a laktózoperátor-génrégió és egy laktózrepresszorgén kombinációját tartalmazza.
6. példa
A mutációs helyeken történő aminosavcserék hatása a hőmérséklet-érzékenységre Belátható, hogy a laktózrepresszor általunk hőmérséklet-érzékeny mutációs pozícióiként azonosított 94.,
241., 265. és 300. aminosavpozíciói fontosak a represzszorfehérje szerkezetének stabilitása szempontjából.
Ésszerűnek látszik az a feltételezés, hogy azok a mutáns fehéqék, melyekben a mutációs pozíciókban az aminosavak a 3. példa szerint azonosított aminosavakhoz képest ki vannak cserélve, szintén hőmérséklet-érzékenyek le5 hetnek az aminosavcsere minőségétől függő mértékben. Az elmondottak értelmében előállítottunk és jellemeztünk 18 különböző gént, melyek a 300. pozícióban 18 különböző aminosavat tartalmazó mutáns laktózrepresszor-fehéijét kódoltak. A mutáns géneket úgy állítot10 tűk elő, hogy a laktózrepresszorgénben PCR (polimeráz láncreakció) alkalmazásával helyspecifikus mutációkat hoztunk létre. Első lépésben előállítottuk a pMC-9-SalIplazmidot, amelyben a lacl-génben kialakítottunk egy Sáli restrikciós hasítóhelyet oly módon, hogy a lacl-gén
903. „G’nukleotidját „C”-nukleotidra cseréltük, amely csere az aminosavsorrendben változást nem idézett elő.
A 8. és 9. láncindító oligonukleotidokat, melyek az 5’végi Sall-hasítóhely kialakítására szolgáltak, kémiailag szintetizáltuk. Az A DNS-fragmenst a pMC9-l-plazmidot templátként használva PCR-reakcióval állítottuk elő a 9. és 10. láncindítók kombinációban történő alkalmazásával; a B DNS-fragmenst pedig a pMC9-l-plazmidot templátként alkalmazva állítottuk elő PCR-reakcióval, a 8. és 11. láncindítókat alkalmazva kombinációban.
8. láncindító; 5’-GGG GCA AAC CAA CGT CGA CCG CTT GCT GCA (szekvenciaazonosító szám: 8) Sáli
9. láncindító; 5’-TGC AGC AAG CGG TCG ACG TTG GTT TGC CCC (szekvenciaazonosító szám: 9) Sáli
10. láncindító; 5’-GGG AAT AAG GGC GAC ACG GA (szekvenciaazonosító szám: 10)
11. láncindító; 5’-CAC GGT GCC TGA CTG CGT T (szekvenciaazonosító szám: 11).
A PCR-reakciókat a következő összetételű reakcióelegy 50 μΐ-ében hajtottuk végre: 1 mmol/1 láncindítók, 1 mmol/1 templát-DNS, 50 mmol/1 HC1, 10 mmol/1 Tris-HCl, pH = 8,3, 1,5 mmol/1 MgCl2, 1,01% zselatin, 200 mmol/1 dNTP (dATP, dGTP, dCTP és dTTP keveréke). A reakcióelegyhez 2,5 egység Taq DNS-polimerázt adtunk, és 30 ciklust végeztünk, ciklusonként 1 percig 94 °C-on, 2 percig 72 °Con és 2 percig 55 °C-on tartva a reakcióelegyet. Az eredményül kapott A DNS-fragmenst Miül és Sáli restrikciós enzimekkel hasítottuk, az eredményül kapott B DNS-fragmenst pedig Sáli és HindlII restrikciós enzimekkel hasítottuk.
A kapott DNS-fragmenseket összekevertük a pMC9plazmidból Miül- és HindlII-emésztéssel előállított
4,7 kb-os DNS-fragmenssel, majd az elegyet T4 DNSligázzal összeligáltuk. A kapott ligációs eleggyel E. coli MYW3110 törzset transzformáltunk, a transzformánsokat 50 fig/ml ampicillintartalmú L-agart tartalmazó lemezekre szélesztettük, majd a lemezeket egy éjszakán át 30 °C-on inkubáltuk, ily módon előállítva az E. coli MTW3110/pMC9-SalI törzset (4. ábra).
A következő lépésben, abból a célból, hogy a 300. aminosavpozícióban mutációt hozzunk létre, megszintetizáltuk a 12. és 19. láncindító oligonukleotidot és ezeket a 10. láncindítóval kombinációban alkalmazva a pMC9-plazmidon mint templát-DNS-en PCR-reakciókat hajtottunk végre.
A mutációk létrehozására használt láncindító oligonukleotidok szekvenciái
12. láncindító; 5’-AAG CGG TCG TCG ACÁC(AGC)|G GTT TGC CC<
13. láncindító; 5’-AAG CGG TCG AC1C T(GCT)|G GTT TGC CCC
14. láncindító; 5’-AAG CGG TCG AC)C A(ACT)|G GTT TGC CCC
15. láncindító; 5’-AAG CGG TCG ACjA G(CGT)|3 GTT TGC CCC
16. láncindító; 5’-AAG CGG TCG AC|G T(ACG)|G GTT TGC CCC
17. láncindító; 5’-AAG CGG TCG ACG AA]G GTT TGC CCC
18. láncindító; 5’-AAG CGG TCG AC|CCA|G GTT TGC CCC
19. láncindító; 5’-AAG CGG CG ACfTAlTG GTT TGC CCC I IA 300. aminosav kodonja
() Kevert nukleotidok
Új aminosavak: Cys, Arg, Gly (szekvenciazonosító szám: 12) Új aminosavak: Glu, Gin, Lys (szekvenciazonosító szám: 13) Új aminosavak: Met, Val, Leu (szekvenciazonosító szám: 14) Új aminosavak: Thr, Pro, Alá (szekvenciazonosító szám: 15) Új aminosavak: His, Asp, Tyr (szekvenciazonosító szám: 16) Új aminosav: Phe (szekvenciazonosító szám: 17)
Új aminosav: Trp (szekvenciazonosító szám: 18)
Új aminosav: Ile (szekvenciazonosító szám: 19)
HU 217 580 Β
Mindkét PCR-rel előállított PCR-fragmenst BssHII-vel és Sall-gyel emésztettük egy 0,15 kb-os fragmens izolálása céljából, melyet azután összekevertünk a pMC9-SalI-plazmid egy 1,0 kb-os SalI-BamHIffagmensével és egy 4,9 kb-os BamHI-BssHII-fragmensével, majd az elegyet T4 DNS-ligázzal összeligáltuk. A ligációs eleggyel E. coli MYW3110 törzset transzformáltunk, majd a transzformánsokat 50 pg/ml ampicillintartalmú L-agar-lemezekre szélesztettük, és a lemezeket egy éjszakán át 30 °C-on inkubáltuk. A kapott transzformánsokból izoláltuk a pMC9-300A-plazmidot és a pMC9-300Y-plazmidot (5. ábra). Az izolált plazmidokat a 3. példában ismertetett módon megszekvenáltuk, és igazoltuk, hogy a kívánt mutációs helyen a kívánt kodon található, mely a kívánt mutáns aminosavat kódolja.
A kapott transzformánsokat ezután két különböző, Xgalt és ampicillint is tartalmazó L-agar-lemezre szélesztettük, majd miután az egyik lemezt egy éjszakán át 30 °C-on, a másikat pedig 37 °C-on tartottuk, megvizsgáltuk a kifejlődött kolóniák színét. Azt találtuk, hogy a 300. aminosavpozícióban sorrendben fenil-alanin és prolin kodont tartalmazó mutáns lacl-gént expresszáló E. coli MYW3110/pMC9-300F és E. coli MYW3110/ /pMC9-300P-kolóniák 30 °C-on tenyésztve fehérnek, 37 °C-on tenyésztve pedig kéknek bizonyultak.
Az elmondottak alapján igazoltnak tekinthetjük, hogy a 3. példa szerint azonosított mutáns aminosavon, az aszparaginon kívül más aminosavak, például a fenilalanin és a prolin jelenléte is hőmérséklet-érzékeny mutációt eredményez, és azt is igazoltuk, hogy az azonosított mutációs pozícióban aminosavhelyettesítéssel új hőmérséklet-érzékeny mutánsokat kapunk. Az elmondottak értelmében a 300. pozíción kívül a 94., 241. és 265 pozíciókban történő aminosavhelyettesítés - a
3. példa szerint azonosított aminosavaktól eltérő aminosavakkal - is hőmérséklet-érzékeny laktózrepresszorok keletkezését eredményezheti, ezért az ilyen mutáns laktózrepresszorok szintén a találmány tárgyát képezik. Ezenfelül az ilyen proteineket vagy peptideket kódoló gének, az ilyen gének alkalmazásával végrehajtott génexpresszió-szabályozási eljárások, valamint eljárások kívánt gének expresszáltatására az említett eljárás alkalmazásával szintén a találmány tárgyát képezik.
A találmány tárgyát képező hőmérséklet-érzékeny mutáns represszorgének lehetővé teszik valamely kívánt fehérjét kódoló gén expresszáltatását drága indukálószer, például IPTG alkalmazása nélkül, éppen ezért a találmány szerinti gének alkalmasak valamely kívánt gén kutatására és klónozására, valamint alkalmasak valamely kívánt fehérje ipari méretekben történő termeltetésére is.
Az Escherichia coli SBM 323 törzset a Budapesti Szerződés előírásainak megfelelően letétbe helyeztük a „National Institute of Bioscience and Technology”-nál, (melyet azelőtt „Fermentation Research Institute Agence of Industrial Science and Technology”-nak neveztek), 1-3, Higashi 1-chome, Tsukubashi, Ibarakiken, 305, Japán; 1991. augusztus 8-án, ahol a FERM BP-3503 deponálási számot kapta.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADA TAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 18 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ SA: GCAACGCCAA TCAGCAAC
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 18 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ
SA: GGGTGTCTGG TCAGAGAC
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 22 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ
SA: ATCGTTGGCA ACCAGCATCG CA
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 18 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ
SA: CGCCGTCGCA AATTGTCG
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 19 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ
SA: CTCCCATGAA GACGGTACG
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 18 bázis TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ SA: GCAATGCGCG CCATTACC A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázis TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ SA: CATCGAATGG CGCAAAA A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HU 217 580 Β
HOSSZA: 30bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GGGGCAAACC AACGTCGACC GCTTGCTGCA A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 30 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TGCAGCAAGC GGTCGACGTT GGTTTGCCCC
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázis TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GGGAATAAGG GCGACACGGA All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 19 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CACGGTGCCT GACTGCGTT
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AAGCGGTCGA CACVGGTTTG CCCC A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 26 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AAGCGGTCGA CCTBGGTTTG CCCC A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS : szintetikus DNS-szekvencia
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AAGCGGTCGA CCAHGGTTTG CCCC A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AAGCGGTCGA CAGBGGTTTG CCCC A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24bázis TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁ20 SA: AAGCGGTCGA CGTVGGTTTG CCCC
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24bázis
TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AAGCGGTCGA CGAAGGTTTG CCCC
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24bázis TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AAGCGGTCGA CCCAGGTTTG CCCC A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADA40 TAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24bázis TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS-szekvencia A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AAGCGGTCGA CTATGGTTTG CCCC A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1083 bázis TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős szálú
SAJÁTSÁG: a laktózrepresszor-fehérje aminosavsorrendje, valamint az azt kódoló nukleotidszekvencia.
A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTG AAA CCA GTA ACG TTA TAC GAT GTC GCA GAG TAT GCC GGT GTC Met Lys Pro Va1 Thr Leu Tyr Asp Va1 Alá Glu Tyr Alá Gly Va1
10 15
HU 217 580 Β
TCT TAT CAG ACC GTT TCC CGC GTG GTG AAC CAG GCC AGC CAC GTT
Ser Tyr Gin Thr Val 20 Ser Arg Val Va 1 As n 25 Gin Al a Ser Hi s Va 1 30
TCT GCG AAA ACG CGG GAA AAA GTG GAA GCG GCG ATG GCG GAG CTG
Ser Al a Lys Thr Arg 35 Glu Ly s Va 1 Glu Al a 40 Alá Me t Al a Glu Leu 45
AAT TAC ATT CCC AAC CGC GTG GCA CAA CAA CTG GCG GGC AAA CAG
Asn Tyr I le Pro As n 50 Arg Val Alá Gin Gin 55 Leu Al a Gly Ly s Gin 60
TCG TTG CTG ATT GGC GTT GCC ACC TCC AGT CTG GCC CTG CAC GCG
Ser Leu Leu I le Gly 65 Va 1 Al a Thr Ser Ser 70 Leu Al a Leu Hi s Al a 75
CCG TCG CAA ATT GTC GCG GCG ATT AAA TCT CGC GCC GAT CAA CTG
Pro Ser Gin I le Val 80 Al a Al a I le Ly s Ser 85 Arg Al a As p Gin Leu 90
GGT GCC AGC NNN GTG GTG TCG ATG GTA GAA CGA AGC GGC GTC GAA
Gly Al a Ser Xaa Val 95 Val Ser Me t Val Glu 100 Arg Ser Gly Val Glu 105
GCC TGT AAA GCG GCG GTG CAC AAT CTT CTC GCG CAA CGC GTC AGT
Al a Cy s Ly s Al a Al a 110 Va 1 Hi s Asn Leu Leu 115 Al a Gin Arg Va 1 Ser 120
GGG CTG ATC ATT AAC TAT CCG CTG GAT GAC CAG GAT GCC ATT GCT
Gly Leu I le I le Asn 125 Tyr Pro Leu Asp As p 130 Gin Asp Al a I le Al a 135
GTG GAA GCT GCC TGC ACT AAT GTT CCG GCG TTA TTT CTT GAT GTC
Val Glu Al a Al a Cy s 140 Thr Asn Va 1 Pro Al a 145 Leu Phe Leu As p Va 1 150
TCT GAC CAG ACA CCC ATC AAC AGT ATT ATT TTC TCC CAT GAA GAC
Ser As p G1 n Thr Pro 155 I le Asn Ser I le I le 160 Phe Ser Hi s Glu As p 165
GGT ACG CGA CTG GGC GTG GAG CAT CTG GTC GCA TTG GGT CAC CAG
Gly Thr Arg Leu Gly 170 Val Glu Hi s Leu Va 1 175 Al a Leu Gly Hi s Gin 180
CAA ATC GCG CTG TTA GCG GGC CCA TTA AGT TCT GTC TCG GCG CGT
Gin I le Al a Leu Leu 185 Al a Gly Pro Leu Ser 190 Ser Val Ser Al a Arg 195
CTG CGT CTG GCT GGC TGG CAT AAA TAT CTC ACT CGC AAT CAA ATT
Leu Arg Leu Al a Gly 200 Trp Hi s Lys Tyr Leu 205 Thr Arg Asn Gin I le 210
CAG CCG ATA GCG GAA CGG GAA GGC GAC TGG AGT GCC ATG TCC GGT
Gin Pro I le Al a Glu 215 Arg Glu Gly Asp Trp 220 Ser Al a Me t Ser Gly 225
TTT CAA CAA ACC ATG CAA ATG CTG AAT GAG GGC ATC GTT CCC ACT
Phe Gin Gin Thr Me t 230 Gin Me t Leu Asn Glu 235 Gly I le Va 1 Pro Thr 240
NNN ATG CTG GTT GCC AAC GAT CAG ATG GCG CTG GGC GCA ATG CGC
Xaa Me t Leu Va 1 Al a 245 Asn As p Gin Me t Al a 250 Leu Gly Al a Me t Arg 255
GCC ATT ACC GAG TCC GGG CTG CGC GTT NNN GCG GAT ATC TCG GTA
Al a I le Thr Glu Ser 260 Gly Leu Arg Val Xa a 265 Al a Asp I le Ser Val 270
GTG GGA TAC GAC GAT ACC GAA GAC AGC TCA TGT TAT ATC CCG CCG
Va 1 Gly Tyr As p As p 275 Thr Glu As p Ser Ser 280 Cy s Tyr I le Pro Pro 285
TCA ACC ACC ATC AAA CAG GAT TTT CGC CTG CTG GGG CAA ACC NNN
Ser Thr Thr I 1 e Ly s 290 Gin As p Phe Arg Le u 295 Leu Gly Gin Thr Xaa 300
GTG GAC CGC TTG CTG CAA CTC TCT CAG GGC CAG GCG GTG AAG GGC
Va 1 As p Arg Leu Leu 305 Gin Le u Ser Gin Gly 310 Gin Al a Va 1 Ly s Gly 315
HU 217 580 Β
AAT CAG CTG TTG CCC GTC TCA CTG GTG AAA AGA AAA ACC ACC CTG
Asn Gin Leu Leu Pro Va 1 Ser Leu Val Ly s Arg Ly s Thr Thr Leu
320 325 330
GCG CCC AAT ACG CAA ACC GCC TCT CCC CGC GCG TTG GCC GAT TCA
Al a Pro Asn Thr Gin Thr Al a Ser Pro Arg Al a Leu Al a As p Ser
335 340 345
TTA ATG CAG CTG GCA CGA CAG GTT TCC CGA CTG GAA AGC GGG CAG
Le u Me t Gin Leu Al a Arg G1 n Val Ser Arg Leu Glu Ser Gly Gin
350 355 360
TGA

Claims (22)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Hőmérséklet-érzékeny laktózrepresszor-fehérje, amelyben a vad típusú laktózrepresszor 94., 241., 265. és 300. aminosavpozíciói közül legalább egyben a vad típusú aminosav egy vad típusútól eltérőre van cserélve, és amennyiben a 300. aminosav ki van cserélve, akkor Asn, Phe vagy Pro aminosavra van cserélve.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti laktózrepresszor-fehérje, amelyben a 94. aminosav metionin.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti laktózrepresszor-fehérje, amelyben a 241. aminosav treonin.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti laktózrepresszor-fehérje, amelyben a 265. aminosav aszparaginsav.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti laktózrepresszor-fehérje, amelyben a 300. aminosav aszparagin, fenil-alanin vagy prolin.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti hőmérséklet-érzékeny laktózrepresszor-fehérje, melynek aminosavsorrendje a
    20. szekvenciaazonosító szám szerinti.
  7. 7. Hőmérséklet-érzékeny laktózrepresszor-fehérjét kódoló gén, amelyben a vad típusú laktózrepresszorgén
    94., 241., 265. és 300. aminosavpozíciói közül legalább egyben az aminosav kodonja a vad típusú laktózrepresszorban található aminosavtól eltérő aminosavat kódolóra van cserélve, és amennyiben a 300. aminosav kodonja ki van cserélve, akkor Asn, Phe vagy Pro aminosavat kódolóra van cserélve.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti gén, amely a 94. aminosavpozícióban metionint kódol.
  9. 9. A 7. igénypont szerinti gén, amely a 241. aminosavpozícióban treonint kódol.
  10. 10. A 7. igénypont szerinti gén, amely a 265. aminosavpozícióban aszparaginsavat kódol.
  11. 11. A 7. igénypont szerinti gén, amely a 300. aminosavpozícióban aszparagint, fenil-alanint vagy prolint kódol.
  12. 12. A 7. igénypont szerinti gén, amely a 20. szekvenciaazonosító szám szerinti aminosav-sorrendű represzszorfehérjét kódol.
  13. 13. Eljárás valamely kívánt fehéijét kódoló gén (kívánt gén) expressziójának szabályozására valamely 7-12. igénypontok bármelyike szerinti hőmérséklet-érzékeny laktózrepresszor-fehéije gént és a kívánt gént tartalmazó gazdasejtben, azzal jellemezve, hogy a kívánt gén expresszióját a laktózrepresszor-fehéije működése útján szabályozzuk azáltal, hogy a gazdasejttenyészet hőmérsékletét változtatjuk.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként a laktózrepresszor-fehérje gént
  15. 15 a kívánt gént is tartalmazó plazmidba inszertáltan vagy a kromoszómába inszertáltan tartalmazó gazdasejtet alkalmazunk.
    15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként a kívánt gént is tartalmazó
    20 klónozó vektorba vagy expressziós vektorba inszertált laktózrepresszorgént tartalmazó gazdasejtet alkalmazunk.
  16. 16. A 13-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként emlőssejtet,
    25 prokariótasejtet, gombasejtet, élesztősejtet vagy rovarsejtet alkalmazunk.
  17. 17. A 13-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként olyan hőmérséklet-érzékeny mutációt tartalmazó laktózrepresszor30 fehérje génjét hordozó gazdasejtet alkalmazunk, mely laktózrepresszor-fehérje lehetővé teszi a kívánt gén expresszióját 35 °C-on vagy annál magasabb hőmérsékleten.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez35 ve, hogy gazdasejtként olyan hőmérséklet-érzékeny mutációt tartalmazó laktózrepresszor-fehéije génjét hordozó gazdasejtet alkalmazunk, mely laktózrepresszorfehéije lehetővé teszi a kívánt gén expresszióját 37 °Con vagy annál magasabb hőmérsékleten.
    40
  19. 19. Eljárás valamely kívánt fehéijét kódoló gén (kívánt gén) expresszálására, azzal jellemezve, hogy a kívánt gén expresszióját az 1 -6. igénypontok bármelyike szerinti laktózrepresszor-fehérje működésének szabályozása útján szabályozzuk oly módon, hogy a lak45 tózrepresszor-fehérje génjét és a kívánt gént tartalmazó expressziós vektorral transzformált gazdasejtek tenyészetének hőmérsékletét változtatjuk.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként emlőssejtet, prokariótasejtet, gomba50 sejtet, élesztősejtet vagy rovarsejtet alkalmazunk.
  21. 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként a kívánt gén expresszióját 35 °C-on vagy a fölött lehetővé tévő hőmérséklet-érzékeny mutációt tartalmazó laktózrepresszor-fehérje gén55 jével transzformált gazdasejteket alkalmazunk.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként a kívánt gén expresszióját 37 °C-on vagy a fölött lehetővé tévő hőmérséklet-érzékeny mutációt tartalmazó laktózrepresszor-fehéije gén60 jével transzformált gazdasejteket alkalmazunk.
HU9501578A 1994-06-01 1995-05-31 Hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszor-fehérjék és eljárások gének expresszálására, valamint génexpresszió szabályozására a mutáns represszorok alkalmazásával HU217580B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP14073694 1994-06-01
JP20031194A JP3723240B2 (ja) 1994-06-01 1994-08-03 遺伝子発現の制御方法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9501578D0 HU9501578D0 (en) 1995-07-28
HUT72398A HUT72398A (en) 1996-04-29
HU217580B true HU217580B (hu) 2000-02-28

Family

ID=26473171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9501578A HU217580B (hu) 1994-06-01 1995-05-31 Hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszor-fehérjék és eljárások gének expresszálására, valamint génexpresszió szabályozására a mutáns represszorok alkalmazásával

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5622840A (hu)
EP (1) EP0685560B1 (hu)
JP (1) JP3723240B2 (hu)
KR (1) KR100380703B1 (hu)
AT (1) ATE391182T1 (hu)
DE (1) DE69535739T2 (hu)
DK (1) DK0685560T3 (hu)
HU (1) HU217580B (hu)
IL (1) IL113932A (hu)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7390645B2 (en) 1997-11-20 2008-06-24 William Marsh Rice University Lactose repressor proteins with increased operator DNA binding affinity
AU1467399A (en) * 1997-11-20 1999-06-15 William Marsh Rice University Lactose repressor proteins with altered ligand responsivity
WO2003048311A2 (en) * 2001-11-29 2003-06-12 Institutes For Pharmaceutical Discovery, Llc Regulated expression of recombinant dna
US20070065906A1 (en) * 2003-03-05 2007-03-22 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Process for producing heterologous protein in e. coli
EP1975232A4 (en) 2005-10-14 2009-07-29 Toray Industries YEAST AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF L-MILKY ACID
JP5329055B2 (ja) * 2006-07-24 2013-10-30 東レ株式会社 変異型ピルビン酸脱炭酸酵素５遺伝子を有する酵母及び乳酸の製造方法
JP5660167B2 (ja) * 2006-07-24 2015-01-28 東レ株式会社 変異型ピルビン酸脱炭酸酵素５遺伝子を有する酵母及び乳酸の製造方法
WO2013154312A1 (ko) * 2012-04-13 2013-10-17 한국생명공학연구원 Laci 단백질 변이체를 이용한 독성 단백질의 생산 방법
KR101419214B1 (ko) * 2013-01-08 2014-07-14 한국생명공학연구원 LacI 단백질 변이체를 이용한 독성 단백질의 생산 방법
US20140193859A1 (en) * 2013-01-08 2014-07-10 Bertram Jacobs Temperature-dependent insertion of genetic material into genomic DNA
WO2023111304A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danmarks Tekniske Universitet Temperature-inducible expression system for thermophilic organisms

Also Published As

Publication number Publication date
ATE391182T1 (de) 2008-04-15
EP0685560A3 (en) 1998-01-07
HUT72398A (en) 1996-04-29
KR100380703B1 (ko) 2003-09-13
IL113932A0 (en) 1995-08-31
US5622840A (en) 1997-04-22
HU9501578D0 (en) 1995-07-28
KR960001124A (ko) 1996-01-25
IL113932A (en) 2005-11-20
DK0685560T3 (da) 2008-07-14
DE69535739D1 (de) 2008-05-15
EP0685560B1 (en) 2008-04-02
EP0685560A2 (en) 1995-12-06
DE69535739T2 (de) 2009-04-16
JP3723240B2 (ja) 2005-12-07
JPH0848697A (ja) 1996-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7803577B2 (en) Tropoelastin derivatives
Kelley et al. Mutational studies with the trp repressor of Escherichia coli support the helix-turn-helix model of repressor recognition of operator DNA.
Ebright et al. Mutations that alter the DNA sequence specificity of the catabolite gene activator protein of E. coli
MIZUNO et al. Isolation and characterization of deletion mutants of ompR and envZ, regulatory genes for expression of the outer membrane proteins OmpC and OmpF in Escherichia coli
NZ303619A (en) methods for optimising secretion of a heterologus polypeptide
HU217580B (hu) Hőmérséklet-érzékeny mutáns laktózrepresszor-fehérjék és eljárások gének expresszálására, valamint génexpresszió szabályozására a mutáns represszorok alkalmazásával
CA2185343A1 (en) Enhanced secretion of polypeptides
JPH04506598A (ja) ヒト血清アルブミンのｎ―末端フラグメント含有融合蛋白質
IE52781B1 (en) Human proinsulin and preproinsulin genes
WO1997001627A1 (en) High-level expression and efficient recovery of ubiquitin fusion proteins from escherichia coli
JPH0838184A (ja) ロドコッカス属細菌由来カナマイシン耐性遺伝子
WO1997012044A9 (en) Pichia secretory leader for protein expression
CA2467142C (en) Improved method for the recombinant production of polypeptides
Osborne et al. The c 1 genes of P1 and P7
US20030013154A1 (en) Pichia secretory leader for protein expression
Rao Movva et al. Cloning and nucleotide sequence of the Salmonella typhimurium pepM gene
US20050204408A1 (en) Tropoelastin derivatives
AU643752B2 (en) Strain RAL-4, useful for production of small proteins and peptides
FI97549C (fi) Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomycessoluissa
Voss et al. Sequence of the tuf A gene encoding elongation factor EF‐Tu from Thermus aquaticus and overproduction of the protein in Escherichia coli
US7193043B1 (en) Tropoelastin derivatives
JP4200627B2 (ja) 変異型チロシンリプレッサー遺伝子とその利用
AU713218B2 (en) Process for the mass production of bovine growth hormone
JP3965819B2 (ja) エルビニア属細菌のチロシンリプレッサー遺伝子
MIYAJTMA et al. A deletion mutant lacking three out of four transfer RNA genes upstream of the coding region of tufB

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: DAIICHI SUNTORY PHARMA CO., LTD., JP

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: DAIICHI SUNTORY PHARMA CO., LTD., JP

HC9A Change of name, address

Owner name: DAIICHI ASUBIO PHARMA CO., LTD., JP

Free format text: FORMER OWNER(S): DAIICHI SUNTORY PHARMA CO., LTD., JP; SUNTORY LTD., JP

HC9A Change of name, address

Owner name: ASUBIO PHARMA CO., LTD., JP

Free format text: FORMER OWNER(S): DAIICHI ASUBIO PHARMA CO., LTD., JP; DAIICHI SUNTORY PHARMA CO., LTD., JP; SUNTORYLTD., JP

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees