KR100380703B1 - 유전자발현의조절방법 - Google Patents

유전자발현의조절방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 야생형 락토스 억제자의 94, 241, 265 또는 300번 위치에서의 하나 이상의 아미노산이 야생형 락토스 억제자의 것 이외의 아미노산으로 치환된 락토스 억제자 단백질, 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 돌연변이체 락토스 억제자는 30℃ 이하의 온도에서는 목적 유전자의 발현을 억제하고, 37℃ 이상의 온도에서는 목적 유전자의 발현을 유도하며, 따라서 IPTG와 같은 값비싼 유도물질을 사용하지 않고도 배양 온도를 변화시킴으로써 발현을 조절할 수 있다.

Description

유전자 발현의 조절방법
본 발명은 온도-민감성 돌연변이를 갖는 에스케리키아 플라이(Escherichia coli) 락토스 억제자 유전자를 사용하는 유전자 발현 조절 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 전술한 유전자 발현 조절 방법을 사용하는 유전자 발현 방법, 특히 숙주 세포 배양 온도의 조절에 의한 유전자 발현 조절 방법에 관한 것이다.
에스케리키아 콜라이 락토스 오페론의 발현 조절 유전자 영역, 즉, 억제자 단백질을 암호화하는 lac 유전자로부터 프로모터/오퍼레이터에 이르는 유전자 영역은 조절 유전자 영역의 하부에 위치한 유전자를 발현시키는데 가장 빈번하게 사용되고 있는 조절 유전자 영역중 하나이다. 이는 이소프로필 β -D-티오갈락토피라노시드(IPTG)와 같은 유도 물질이 숙주 세포에 존재하는 경우, 락토스 억제 물질이 락토스 오퍼레이터 영역에 결합할 수 없고 락토스 프로모터에서부터 전사가 일어나며 이에 의하여 유전자 발현 중에 전사 조절이 가능해지기 때문이다.
IPTG와 같은 유도 물질을 배양 배지에 첨가함으로써 유전자 발현이 성공적으로 수행될 수 있다는 사실에 힘입어 유용한 물질을 생산하기 위한 각종 클로닝 벡터 및 유전자 발현 벡터가 사용되고 있다. 예를 들면, 유전자 클호닝 벡터로서 pUC18 등과 같은 pUC 계열의 요소, DNA의 뉴클레오타이드 서열 결정을 위한 M13 파아지 계열, cDVA 클로닝용의 λ gtII 등이 사용되고 있다. 최근에 와서, 이러한 발현 조절 시스템은 동물 세포를 이용하는 연구에도 사용되어 왔다[참조 문헌.Ulrich Deuschele et al., ProcNatl. Acad Sci USA Vol. 86. pp. 5400-5404, 1989; Micky C.-T. Hu et al., Mol. Cell. Biol, Vol. 10, pp. 6141-6151, 1990].
또한, 이러한 발현 조절 시스템은 유용 물질의 생산용으로 사용되어 왔다[참조 문헌, Mercedes Zazo et al,, Gene, Vol, 113, pp. 231-238, 1992]. 그러나, 이러한 시스템은 유전자의 발현을 유도하기 위하여 값비싼 유도 물질인 IPIG를 배양 배지에 첨가해야 한다는 단점이 있다. 특히, 이러한 시스템이 산업적 규모로 유용 물질을 생산하는데 사용될 경우 IPTG이 사용은 생산 원가를 증가시킨다.
따라서, 유전자 발현을 조절하기 위한 산업적으로 유용한 신규 방법이 시급히 요구된다. 따라서, 목적하는 유전자의 발현과 관련하여, IPTG와 같은 고가의 유도 물질을 사용하지 않는 유전자 발현 조절 시스템, 및 이러한 조절 시스템을 사용하는 유전자 발현 방법의 개발이 요구된다.
본 발명자는 에스케리키아 콜라이 락토스 오페론의 발현 조절 유전자에서 억제자 단백질에 대한 연구의 결과로서 신규의 락토스 억제자 단백질을 발견하였다. 본 억제자 단백질은 저온에서 오퍼레이터에 결합하여 전사를 억제하지만, 고온에서는 불활성화되어 오퍼레이터에 결합할 수 없고, 따라서 억제자 단백질은 온도-민감성 돌연변이 억제자 단백질이다. 본 발명은 전술한 신규의 억제자 단백질을 사용한다.
따라서, 본 발명은 야생형 락토스 억제자의 94,241,265 또는 300번 위치에서의 하나 이상의 아미노산이 야생형 락토스 억제자의 것 이외의 아미노산으로 치환된 락토스 억제자 단백질을 제공한다.
앞서 언급한 아미노산의 치환에는 94번 아미노산인 발린의 메티오닌으로의 돌연변이, 241번 아미노산인 알라닌의 트레오닌으로의 돌연변이, 265번 아미노산인 글라신의 아스파르트산으로의 돌연변이 및/또는 300번 아미노산인 세린의 아스파라긴, 페닐알라닌 또는 프롤린으로의 돌연변이가 포함된다. 돌연변이된 락토스 억제자 단백질의 아미노산 서열의 예를 서열 확인 번호 : 20에 나타냈다.
본 발명은 또한 전술한 온도-민감성 락토스 억제자 단백질을 암호화하는 유전자(락타제 억제자 단백질 유전자)도 제공한다. 본 유전자의 뉴클레오티드 서열의예를 서열 확인 번호 : 20에 나타냈다.
또한, 본 발명은 숙주 세포의 배양 온도를 변화시켜 락토스 억제자 단백질의 작용을 조절함으로써 목적 유전자의 발현을 조절함을 특징으로 하여, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자(목적 유전자)의 발현을 전술한 락토스 억제자 단백질 유전자 및 전술한 목적 유전자를 함유하는 숙주 세포내에서 조절하는 방법도 제공한다.
상기 방법에서, 락토스 억제자 단백질 유전자는 숙주의 염색체, 또는 플라스미와 같은 비염색체성 실체, 예를들면, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터내로 도입된다. 숙주 세포에는 예를 들면, 원핵 생물 예를 들면 에스케리키아 콜라이와 같은 박테리아, 및 진핵 생물 예를들면 진균류, 효모와 같은 하등 진핵 생물 및 포유류 세포, 곤충 세포 등과 같은 고등 진핵 생물이 포함된다. 본 발명의 방법에서, 목적 유전자의 발현은 실온, 예를 들면 30℃에서는 억제되고, 고온 예를 들면 35℃ 이상의 고온, 예를 들면 37℃ 이상의 고온에서 탈억제된다.
본 발명은 또한, 락토스 억제자 단백질 유전자 및 목적 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포의 배양 온도를 변화시켜 락토스 억제자 단백질의 작용을 조절함으로써 목적 유전자의 발현을 조절함을 특징으로 하는, 목적 단백질을 암호화하는 유전자(목적 유전자)의 발현 방법도 제공한다. 본 방법에서, 숙주 세포 및 배양 온도의 조절은 전술한 바와 같다.
락토스 억제자 단백질을 암호화하는 lacI 유전자를 함유하는 플라스미드 pMC9을 돌연변이제인 하이드록실아민으로 처리하여 lacI 유전자상에 돌연변이를 도입시킨다. 이와 같이 처리한 플라스미드를 사용하여 이. 콜라이 K12로부터 유도된 lacI 유전자 돌연변이체 MYW3110 균주를 형질전환시킨다. 형질전환된 세포를 암피실린 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-β-D-갈락토피라노시드(X-gal)를 함유하는 한천 평판상에 접종한 다음 38℃에서 밤새 배양한다.
배양후 청색 콜로니를 선별하여 동일한 두개의 평판상에 접종하고 하나의 평판은 30℃에서 배양하고, 다른 하나의 평판은 38℃에서 밤새 배양한다. 이러한 스크리닝 과정에 의하여, 30℃에서 백색 및 38℃에서 청색을 띠는 7개의 온도-민감성 돌연변이체가 수득된다. 이렇게하여 수득된 돌연변이가 플라스미드상의 lacI 유전자내에서 일어났음을 확인 하기 위하여, 플라스미드를 각각의 온도-민감성 돌연변이체로 부터 분리해내고 lacI 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정한다.
그 결과, 락토스 억제자 단백질의 300번 세린 잔기는 아스파라긴 잔기로, 241번 알라닌 잔기는 트레오닌 잔기로, 265번 글라이신 잔기는 아스파르트산 잔기 로, 및 94번 발린 잔기는 메티오닌 잔기로 전환되었음이 밝혀졌다. 이들 위치에서의 돌연변이는 온도-민감성 돌연변이로서 이제껏 보고된 서열에는 포함되지 않으며, 전술한 돌연변이된 서열은 본 발명에 의하여 최초로 분리되고 등정된 신규한 것이다.
이어서, 온도-민감성 돌연변이를 지닌 이들 분리된 락토스 억제자 유전자를 시험하여 이들 돌연변이된 유전자가 유전자 발현의 조절에 사용될 수 있는지 여부를 측정한다. 우선, 전술한 돌연변이를 지닌 돌연변이치 lacI 유전자를, 신규의 플라스미드 pY01, pY02 및 pY016을 작제하기 위하여, 콜리신 E1-유래 플라스미드와혼화성을 갖는 플라스미드, 예를 들면, pMW119 내로 삽입시킨다. 이어서, 발현시키고자 하는 단백질의 예로서는 사람의 칼씨시토닌 전구체 펩타이드의 융합 단백질이 언급될 수 있다. 전술한 융합 단백질을 생성하는 균주로부터 분리된 플라스미드 pG97S4DhCT(GRRR)를, 형질전환체를 수득하기 위하여, 각각 플라스미드 pY01, pY02 및 pY016을 함유하는 이. 콜라이 MYW3110/pY01, MYW3110/pY02 및MYW3110/pY016 내로 형질전환에 의해 도입한다.
플라스미드 pG97S4Dh[GRRR]과 실질적으로 동일한 플라스미드 pG97S4DhCT[G]를 함유하는 에스케리키아 콜라이 W3110은 에스케리키아 콜라이 SBM323으로 명명되었으며, 부다페스트 조약하에 1991년 8월 8일자로 국제 기탁 기관 [National Institute of Bioscience and Human Techuology Agency of Industrial Science and Technology(이전 명칭 : Fermentation Research Institute Agency of Industrial Scieuce and Technology), 1-3, Higashi 1-chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken, 305 JAPAN]에 기탁 번호 제FERM BP-3503호로 기탁되어 있음을 주지하라. 플라스미드 pG97S4DhCT[GRRR]과 pG97S4DhCT[G] 간의 차이점은 단지, pG97S4DhCT[G]가 목적 단백질이 C-말단에 글라이신을 갖는 융합 단백질을 암호화하는 반면에, pG97S4DhCT[GRRR]은 목적 단백질이 전술한 글라이신 뒤에 3개의 추가의 아르기닌잔기를 갖는 융합 단백질을 암호화한다는 점이다.
이렇게 하여 수득한 형질전환체를 30℃에서 배양한 다음 37℃에서 추가 배양하여 단백질(특히 융합 단백질)의 생성에 대하여 시험한다. 시험한 결과 30℃에서는 단백질 생성이 유도되지 않은 반면에, 37℃에서는 단백질 생성이 유도되었음이밝혀졌으며, 따라서 온도-민감성 돌연변이를 지닌 억제자 단백질 및 이를 암호화하는 유전자를 사용하여 유전자의 발현을 조절할 수 있음이 증명되었다.
전술한 돌연변이의 위치는 온도의 변화에 고도로 불안정한, 락토스 억제자 단백질의 고차원 구조상의 위치인 것으로 생각된다. 다시 말해서, 돌연변이의 위치는 락토스 억제자 단백질의 고차원 구조를 유지하는데 중요한 것으로 생각된다. 따라서, 기타의 아미노산 잔기를 돌연변이가 발생한 위치에 삽입시킴으로써 락토스 억제자 단백질의 추가적인 온도-민감성 돌연변이체가 수득될 수 있을 것으로 예상된다.
즉, 락토스 억제자 단백질의 300번 아미노산에 대한 코돈이 18종의 아미노산 중 하나에 대한 코돈으로 치환된 돌연변이체 lacI 유전자가 시험관내 돌연변이 유발에 의하여 수득되며, 돌연변이체 lacI 유전자의 온도-민감성을 시험한다. 시험 결과, 300번 아미노산의 코돈을 기타의 아미노산, 특히 페닐알라닌 또는 프롤린에 대한 코돈으로 치환시킨 돌연변이체 유전자는 온도-민감성의 표현형을 나타냈다.
본 발명의 분리된 억제자 단백질의 온도-민감성 돌연변이 부위, 즉 락토스 억제자 단백질의 94번, 241번, 265번 및 300번 위치에서의 아미노산 잔기들은 단백질의 고차원 구조를 유지하는데 중요함이 확인되었다. 따라서, 온도-민감성 돌연변이는 전술한 위치에서의 아미노산 잔기를 기타의 아미노산 잔기로 치환시킴으로써 유도해낼 수 있다. 이하의 실시예에서, 단백질의 생성이 실질적으로 시험되며 온도-민감성 돌연변이를 수반하는 본 발명에 따른 억제자 유전자를 사용하여 목적하는 유전자의 발현을 조절할 수 있음을 나타냈다.
본 발명에 관계하는 락토스 억제자 단백질의 아미노산 서열 및 그에 따른 뉴클레오타이드 서열을 서열 확인 번호 : 20에 나타냈다. 이들 아미노산 서열들 가운데, 94번 Xaa가 val이고, 241번 Xaa가 Ala이며, 265번 Xaa가 Gly이고, 300번 Xaa 가 Ser인 아미노산 서열은 야생형 락토스 억제자 단백질의 아미노산 서열이다. 본 발명의 한 양태로서, 94번 Xaa는 Met이고, 다른 양태로서 241번 Xaa는 Thr이며; 또 다른 양태로서 265번 Xaa는 Asp이며; 다른 또 하나의 양태로서 300번 Xaa는 Asn, Phe 또는 Pro이다.
전술한 바와 같이, 94, 241, 265 및 300번 위치중 하나가 돌연변이된 락토스 억제자 단백질 뿐만 아니라 두 위치, 즉 94 및 241위치, 94 및 256위치, 또는 94및 300위치가 돌연변이된 락토스 억제자 단백질; 세 위치, 즉 94, 241 및 265위치, 94, 241 및 300위치, 또는 241, 265 및 300위치가 돌연변이된 락토스 억제자 단백질; 및 네개의 모든 위치, 즉 94, 241, 265 및 300위치가 돌연변이된 락토스 억제자 단백질도 온도-민감성이고 본 발명의 범위내에 있음이 합리적으로 고려된다.
300번 아미노산인 세린이 아스파라긴, 페닐알라닌, 또는 프롤린으로 치환될 수 있다는 사실로부터 알수 있는 바와 같이, 특정 위치에서의 천연 아미노산을 대체하는 아미노산은 1종의 아미노산에 국한되지는 않는다. 즉, 비록 265번 천연 아미노산 글라이신이 아스파르트산으로; 241번 천연 아미노산 알라닌이 트레오닌으로; 및 94번 천연 아미노산 발린이 메티오닌으로 치환될 수 있지만, 전술한 위치에서의 천연 아미노산을 대체하는 아미노산이 전술한 것들에 국한되지는 않는다.
즉, 300번 위치에서의 치환에 대하여 기술한 바와 같이 동일한 과정에 따라,265, 241 및 94번 위치를 대체하는 아미노산이 결정될 수 있다. 특히, 위치 특이적 돌연변이는 전술한 위치에서의 천연 아미노산을 치환시키기 위하여 수행되며, 부위-돌연변이된 억제자 단백질을 암호화하는 DNA가 합성된다. 이어서, 300번 위치 돌연변이에 대하여 기술한 바와 같이 동일한 과정에 따라, 전술한 위치에 자리 잡은 아미노산을 락토스 억제자를 온도-민감성이 되게 하는 아미노산으로 치환시킬 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 각종 락토스 억제자 단백질을 암호화하는 유전자의 발명에 관한 것이다. 이들 유전자는 게놈성 코돈의 축퇴성에 기인하여 다양한 뉴크레오티드 서열을 갖는다. 이들 유전자는 아미노산 서열에 기초하여 디자인된 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성될 수 있다. 이와는 달리, 이들 유전자는 목적하는 아미노산 이외의 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산을 암호화하는 DNA의 코돈을 위치-특이적 돌연변이 시킴으로써 수득될 수 있다. 하나 이상의 돌연변이를 지닌 락토스 억제자 단백질을 암호화하는 DNA가 화학적으로 합성될 수 있거나, 위치-특이적 돌연변이에 의하여 수득될 수 있다.
본 발명은 또한 본 온도-민감성 락토스 억제자 단백질을 사용하여 목적 단백질을 암호화하는 유전자(목적 유전자)의 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 본 방법은 온도-민감성 락토스 억제자 유전자 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자 (목적 유전자)에 결합된 락토스 오퍼레이터 유전자 영역을 동일 세포내에 포함시키고 배양 온도를 조절함으로써 수행될 수 있다. 억제자 유전자 및 목적 유전자는 동일 유전자상에 또는 상이한 유전자상에 존재할 수 있다.
예를 들면, 억제자 유전자 및 목적 유전자는 동일한 비염색체성 유전자상에 존재할 수 있다. 여기에서, 비염색체성 유전자는 자가-복제성 플라스미드, 파아지, 바이러스 등을 의미한다.
본 발명의 온도-민감성 락토스 억제자 단백질은 30℃ 이하의 배양 온도, 예를 들면 20 내지 30℃에서는 락토스 오퍼레이터에 결합된 목적 유전자의 발현을 억제하는 반면에, 35℃ 이상의 배양 온도, 예를 들면 37℃ 이상에서는 락토스 오퍼레이터에 결합된 목적 유전자의 발현을 억제하지 않는다. 따라서, 목적 유전자는 숙주 세포를 30℃ 이하의 온도에서 생장시킨 다음, 온도를 35℃ 이상, 예를 들면 37℃ 이상으로 증가시킴으로써 발현될 수 있다.
본 발명에 사용된 숙주 세포는 유전자 재조합 기술에 의한 목적 유전자의 발현에 통상적으로 사용된 여타의 세포들일 수 있다. 예를 들면, 원핵 세포 예를 들면 에스케리키아 콜라이 같은 박테리아, 바실러스 브레비스(Bacillus brevis) 같은 바실러스, 및 하등 진핵 세포, 예를 들면 사카로마이세스(Saccharomyces) 같은 효모, 예들면 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae), 알콜-동화 효모, 예를 들면 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리몰파(Hansenula polymorpha), 캔디다 보이디니(Candida boidinii) 및 추가의 사상균, 예를 들면 아스퍼질러스(Aspsrgillus)가 사용될 수 있다.
또한, 고등 진핵 세포, 예를 들면 COS 세포, CHO 세포 (차이니스 햄스터 난소 세포), BHK 세포(베이비 햄스터 신장 세포)와 같은 동물 세포, 및 SF9 세포 등과 같은 곤충 세포도 사용될 수 있다.
비록 이하의 실시예에서는 락토스 프로모터가 사용되지만, 여타의 적절한 프로모터도 본 발명에 사용될 수 있다. 즉, 본 억제자 유전자는 여타의 프로모터 영역 유전자 및 프로모터 영역 유전자의 하부에 위치한 락토스 오퍼레이터 영역 유전자를 함유하는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터(예를 들면, 플라스미드, 파아지 등)를 사용하여 목적 유전자의 발현을 조절하는 시스템에 적용될 수 있다. 락토스 프로모터외의 적절한 프로모터 영역에는 tac, trc, lacUV5 등이 포함되며 이로써 제한되지는 않는다.
유전자 재조합에 의해 생성될 수 있는 어떠한 단백질 및 펩타이드도 본 발명의 방법에 의해 생성될 수 있다. 이들 단백질 또는 펩타이드에는 예를 들면, 인슐린, 성장 호르몬, 이뇨성 펩타이드(특히, C형 나트륨이뇨성 펩타이드, CNP), 칼씨토닌, 부갑상선 호르몬(PTH1-34, PTH1-84 등)과 같은 생물학적 활성 펩타이드, 세포-분화 성장 인자, 세포 성장 억제 인자 및 또한 생리학적으로 중요한 효소와 같은 생물학적 활성 단백질이 포함된다.
본 발명에 따른 온도-민감성 락토스 억제자 단백질 유전자는 이를 플라스미드와 같은 비염색체성 실체 또는 숙주의 염색체에 삽입시켜 목적 유전자의 발현을 조절함으로써 사용될 수 있다. 이하에서 기술한 실시예에서는 플라스미드를 사용한다.
본 발명은 온도-민감성 돌연변이체 락토스 억제자 유전자가 IPTG와 같은 고가의 유도 물질을 사용함이 없이 목적하는 펩타이드나 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 제공하기 때문에 산업적인 면에서 매우 중요하다.
실시예
본 발명은 하기의 실시예에서 더욱 상세히 설명되며 이로써 제한되지는 않는다.
실시예 1
이.콜라이 W3110으로부터 유래된 락토스 억제자 돌연변이체 균주의 작제
본 발명의 목적은 lacI 유전자의 온도-민감성 돌연변이체를 분리하고 목적 유전자의 발현을 조절하기 위한 이들의 적용에 있다. 온도-민감성 돌연변이를 지닌 락토스 억제자 유전자(lacI 유전자)를 분리해내기 위해서는 먼저 다음과 같이 lacI-숙주 균주를 작제한다. 락토스 억제자가 돌연변이된 경우, β -갈락토시다제가 본질적으로 발현(본질적 표현형; constitutive phenotype)됨이 공지되어 있으며, 이러한 돌연변이체를 분리하는 방법으로서 페닐-β -D-갈락토시드를 사용하는 스크리닝 방법이 공지되어 있다[참조 문헌 : J. H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Laboratory Manual pp. 131-134, Cold Spring Harbor Laboratory, 1992].
상기의 방법에 따라서 모계 에스케리키아 콜라이 W3110 (ATCC 14948로 입수 가능) 세포를 탄소원으로서 페닐-β -D-갈락토 시드를 함유하는 한천 평판상에 플레이팅한 다음 37℃에서 2일간 배양한다. 배양후 콜로니를 분리하여 β -갈락토시다제의 본질적 발현을 나타내는 락토스 억제자 돌연변이체를 선택하여 이. 콜라이MYW3110으로 명명한다.
실시예 2
온도-민감성 돌연변이를 지닌 락토스 억제자 유전자의 분리
플라스미드 pMC9는 pBR322의 유도체이고 에스케리키아 콜라이 Y1089 중에 존재한다[참조 문헌 : Huynh, T. V et al., (1985) DNA Cloning Vol 1, IRL Press Limited, Oxford, England, pp. 49-78; Invitrogen으로부터 입수가능(catalog NO 789-02)].
100mM NaCl, 2mM EDTA 및 1M 하이드록실아민을 함유하는 1ml의 50mM 포스페이트 완충액(pH 7.0)에 10μ g의 pMC9을 가하고 65℃에서 30분간 반응시킨다. 반응 혼합물을 5ℓ 의 TE(10mM Tris HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 대하여 투석시키고, 통상적인 과정에 따라서 에탄을 침전시킨 다음, 생성된 침전물을 20μ l의 TE에 용해시킨다. 4μ l의 용액을 사용하여 통상적인 칼슘 클로라이드법에 따라서 이. 콜라이 MYW3110을 형질전환시킨다.
40μ g/ml 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-β-D-갈락토퍼라노시드(X-gal) 및 50u g/ml 암피실린으로 보충한 L-한천 평판 (탈이온수 1ℓ 중 폴리펩톤 10g, NaCl 5g, 효모 추출물 5g 및 한천 15g) 상에 형질전환체를 플레이팅한 다음 38℃에서 밤새 배양한다. 형질전환체 가운데 상기 배지상에서 청색을 띠는 콜로니를 선별하여 전술한 조성의 두 한천 평판상에 접종하여 하나의 한천 평판은 30℃에서 밤새, 다른 하나의 한천 평판은 38℃에서 밤새 배양한다.
이와 같이 수행한 결과, 30℃에서 백색, 및 38℃에서 청색을 띠는 7개의 형질전환체가 수득된다. 온도-민감성 돌연변이가 lacI 유전자상에 존재함을 확인하기위하여, 통상적인 알카리성 변성법에 따라 각 형질전환체로부터 플라스미드를 분리해내고 이를 사용하여 에스케리키아 콜라이 MYW3110을 재차 형질전환시켜 형질전환체가 동일한 표현형을 나타냄을 확인한다. 플라스미드를 pMC9-1, pMC9-2, pMC9-6, pMC9-16, pMC9-17, pMC9-22 및 pMC9-24로 명명한다.
실시예 3
돌연변이 위치의 결정
전술한 플라스미드 pMC9-1, pMC9-2, pMC9-6, pMC9-16, pMC9-17, pMC9-22 및 pMC9-24의 lacI 유전자상의 돌연변이 위치를 결정하기 위하여, 하기의 실험을 수행한다. 플라스미드를 초원심분리법으로 정제하고, T7 서열화 TM 키트(Pharmacia 제조)를 사용하여 화학적으로 합성한 프라이머로 서열 분석한다. 20량체 프라이머는 하기와 같다:
서열 분석에 사용된 프라이머
lacI 유전자의 해독 개시 코돈 GTG의 첫 "G"를 1번 뉴클레오타이드로 취할 때, 프라이머 1은 183 내지 200번 뉴클레오타이드에 상응하고, 프라이머 2는 448 내지 465번 뉴클레오타이드에 상응하며, 프라이머 3은 720 내지 741번 뉴클레오타이드에 상응하며, 프라이며 4는 224 내지 241번 뉴클레오타이드에 상응하며, 프라이머 5는 483 내지 501번 뉴클레오타이드에 상응하며, 프라이머 6은 757 내지 774번 뉴클레오타이드에 상응하며, 프라이머 7은 해독 개시 코돈의 상부 -72 내지 -56번 뉴클레오티드에 상응한다. 상부 프라이머로서는 프라이머 1 내지 3 및 7이 사용되고 하부 프라이머로는 프라이머 4 내지 6이 사용된다. 분리된 유전자의 DNA 서열 및 유전자에 의하여 암호화된 아미노산 서열을 서열 확인 번호 : 20에 나타냈다.
본 발명자에 의하여 분리된 돌연변이된 lacI 유전자와 문헌에 기술된 야생형lacI 유전자[참조 문헌 : J H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetilcs, Handbook Section 16, Cold Spring Harbor Laboratory 1992]와의 비교 결과를 표 1에 나타냈다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pMC9-1, pMC9-17 및 pMC9-24에서, 300번 아미노산인 세린을 암호화하는 코돈 AGC는 아스파라긴을 암호화하는 코돈 AAC로 돌연변이 되었고, 플라스미드 pMC9-16 및 pMC9-22에서, 241번 아미노산인 알라닌을 암호화하는 코돈 GCG는 트레오닌을 암호화하는 코돈 ACG로 돌연변이되었으며; 플라스미드 pMC9-2에서, 265번 아미노산인 글리신을 암호화하는 코돈 GGT는 아스파르트산을 암호화하는 코돈 GAT로 돌연변이 되었으며; 플라스미드 pMC9-6에서, 94번 아미노산인 발린을 암호화하는 코돈 GTG는 메티오닌을 암호화하는 코돈 ATG로 돌연변이 되었다.
표 1
온도-민감성 lacI 유전자상의 돌연변이 위치
락토즈 억제자의 다양한 돌연변이체가 문헌[참조: J. H. Miller et al., J. M. Biol. (1990) Vol, 212, pp. 295-318]에 의하여 보고되어 있다. 본 발명의온도-민감성을 제공하는 돌연변이의 위치는 밀러 등의 것들과는 상이하며 본 발명에 따른 돌연변이체 락토스 억제자는 신규의 것이다.
락토즈 억제자는 상이한 작용을 갖는 2개의 작용 영역을 갖고 있음이 공지되어 있다. 즉, 오퍼레이터 DNA에 결합하는 단백질의 N-말단의 59개 아미노산 잔기, 및 올리고머 형성 및 IPTG와 같은 유도 물질에의 결합 모두에 요구되는 단백질의 나머지 "코어" 영역이다. 본 발명의 억제자 유진자에 있어서, 돌연변이는 락토스 억제자 단백질의 94, 241, 265 및 300번 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈상에 존재한다. 이들 돌연변이를 포함하는 영역은 "코어" 영역에 상응한다. 따라서, 고온에서는 이들 돌연변이는 유도 물질의 결합에 의하여 형성된 구조를 가장함으로써, 높은 확률로 4량체 형성 불능이 일어나거나 억제자 단백질의 구조적인 변화를 초래할 것이다.
이어서, 온도-민감성 돌연변이와 관련하여 바람직한 특성을 지닌 플라스미드pMC9-1, pMC9-2 및 pMC9-16을 추가 시험한다.
실시예 4
온도-민감성 돌연변이체 락토스 억제자와 배양 온도간의 상관 관계
전술한 실시예 3에서, 저온을 대표하는 30℃ 및 고온을 대표하는 38℃에서 락토스 억제자의 온도-민감성 돌연변이의 특성을 연구한다. 발현이 유도되지 않는 하한 및 발현이 유도되는 상한 임계 온도를 측정하기 위해서는 형질전환체에 대한 바람직한 배양 조건을 측정하는 것이 더욱 중요할 것으로 사려된다. 따라서, 형질 전환체를 30℃에서 배양하여 제조한 접종 배양액을 35℃, 37℃, 40℃, 42℃ 또는45℃에서 시험 배양 배지에 추가 배양하며, 숙주 염색체에 의해 발현된 β -갈락토시다제 활성을 지시자로 이용하여 전술한 임계 온도를 측정한다.
즉, 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pMC9-1, 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pMC9-2 및 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pMC9-16 을 50μ g/ml의 암피실린을 함유하는 3ml의 L-배지에 개별적으로 접종하고, 30℃에서 밤새 배양한다. 배양액의 OD 660 값을 측정하고, 배양액의 OD 660 값이 0.5인 배양액 다량을 50μ g/ml의 암피실린을 함유하는 2ml의 L-배지에 30, 35, 37, 40, 42 또는 45℃에서 3시간 동안 접종한다.
문헌의 방법[참조 문헌 : Miller; Experiment in Molecular Genectics, pp. 352-355, Cold Spring Harbor laboratory 1972]에 따라 기질로서 ONPG(0-니트로페닐-β -D-갈락토시드)를 사용하여 발현된 β -갈락토시다제 활성을 측정한다. 결과를 제1도에 나타냈다. 제1도에서 알 수 있는 바와 같이, 에스케리키아 콜라이MYW3110/pMC9-1, 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pMC9-2 및 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pMC9-16은 30℃에서는 β -갈락토시다제 활성을 실질적으로 나타내지 않았으며 이는 β -갈락토시다제 유전자의 발현이 억제되었음을 나타내는 반면에, 35 내지 37℃의 온도에서는 β -갈락토시다제의 발현이 일어났다.
유전자의 발현이 유도되는 임계 온도, 즉 락토스 억제자가 비-작용성이 되는 온도는 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pMC9-1 및 에스케리키아 콜라이MYW3110/pMC9-2의 경우는 35℃이고, 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pMC9-16의 경우는 37℃이다. 전술한 모든 에스케리키아 콜라이 균주는 40℃에서 lacI 유전자의 최대 발현을 유도하였다. 따라서 본 온도-민감성 돌연변이체 락토스 억제자 유전자는 숙주 세포의 성장에 최적 온도인 것으로 사려되고 숙주 세포의 실험 배양이나 대규모 배양을 위해 사용되는 37℃에서, 목적 유전자의 발현용으로 만족스럽게 사용될 수 있다.
실시예 5
유용한 융합 단백질의 생산을 위한, 온도-민감성 돌연변이체 락토스 억제자 유전자를 사용한 유전자 발현의 조절
전술한 실시예 4는 온도-민감성 돌연변이체 락토스 억제자 유전자를 사용한, 숙주 염색체상의 β -갈락토시다제 유전자의 발현 조절에 관한 것이다. 본 실시예 5는 본 발명의 다른 목적, 즉, 온도-민감성 돌연변이체 락토스 억제자를 사용하는, 형질전환체에 대한 배양 온도를 조절함에 의한 목적 유전자의 발현 방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명자들은 발현 조절 유전자 영역으로서 락토스 오페론의 프로모터/오퍼레이터 영역 및 발현 조절 유전자 영역의 하부에 위치한 융합 단백질 암호화 유전자를 함유하는 발현 플라스미드에 의해 목적 단백질의 예로서 β -갈락토시다제 유도체 및 사람 칼씨토닌 전구체 펩타이드로 이루어진 융합 단백질의 발현을 조절하기 위하여 본 온도-민감성 돌연변이체 락토스 억제자 유전자를 사용하고자 시도하였다.
우선, 플라스미드 pMC9-1을 EcoRI으로 절단하여 1.7kb의 온도-민감성 돌연변이체 락토스 억제자 유전자 영역을 분리해낸 다음 이를 pY01(제2도)을 작제하기 위하여 pMW119(pSC101로부터 유래된 복제 원점을 갖는 낮은 카피물수의 플라스미드)의 EcoRI 부위에 삽입시킨다. 전술한 바와 동일한 과정에 따라, 플라스미드 pMC9, pMC9-2, 및 pMC9-16을 사용하여 pYOW, pY02 및 pY016을 작제한다.
락토스 프로모터/오퍼레이터(lacP0)의 하부에 위치한 에스케리키아 콜라이β -갈락토시다제 유도체 및 사람 칼씨토닌 전구체 펩타이드로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드 pG97S4DhCT[GRRR]을 사용하여 상기에서 작제한 플라스미드 pMC9, pMC9-2 또는 pMC9-16을 함유하는 에스케리키아 콜라이 세포를 형질전환시켜 암피실린 및 테트라사이클린 내성인 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR] , pYOW; 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR]. PY01; 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pYO2; 및 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pY16을 수득한다.
이들 균주를 50μ g/ml 암피실린 및 10μ g/ml 테트라사이클린으로 보충한 L-배지상, 30℃에서 밤새 배양하여 접종 배양액을 제조하고, 이를 전술한 바와 동일한 조성의 두 배지에, 배지에 대하여 5%의 양으로 접종한다. 배지중 하나는 30℃에서 15시간 동안 배양하고 다른 하나의 배지는 37℃에서 15시간 동안 배양한다. 야생형 락토스 억제자 유전자를 지닌 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pG974DhCT[GRRR], pYOW는 IPTG를 최종 농도 5mM IPTG가 되게 첨가함으로써 유도된다. 배양후, 배양 배지를 원심 분리하고, 배양된 세포에서 생성된 융합 단백질을 SDS-16% PAGE(나트륨 도데실 설페이트 16% 플리아크릴 아미드 겔 전기 영동)로 측정하여 상이한 온도에서 융합 단백질의 발현을 비교한다. 결과를 제3도에 나타냈다.
제3도에서 알 수 있는 바와 같이, 야생형 락토스 억제자 유전자를 지닌 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pYOW는 IPTG가 첨가될 경우에만 융합 단백질을 생성한다. 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pY101; 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pY03; 및 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pG97S4DhCT[GRRR], pY016은 이들이 30℃에서 배양될 때는 융합 단백질을 발현하지 않았으나, 이들이 37℃에서 배양될 때는 야생형 락토스 억제자를 갖는 균주가 IPYG로 유도될때 발현한 양에 비교될만한 양으로 융합 단백질을 발현하였다.
따라서, 본 발명의 온도-민감성 돌연변이체 락토스 억제자 유전자 발현 조절 유전자 영역으로서 락토스 오페론의 프로모터/오퍼레이터 영역, 및 발현 조절 영역의 하부에 위치한 β -갈락토시다제 유도체 및 사람 칼씨토닌 전구체 펩타이드로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 발현 플라스미드에 의하여 융합 단백질의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 온도-민감성 돌연변이체 락토스 억제자 유전자는 락토스 오퍼레이터 유전자 영역 및 락토스 억제자 유전자의 조합을 포함하는 발현 시스템에서의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다.
실시예 6
온도-민감성에 대한 돌연변위 부위에서의 아미노산 치환의 효과
본 발명자에 의해 락토스 억제자의 온도-민감성 돌연변이 위치로 동정된 아미노산 위치 94, 241, 265 및 300은 억제자 단백질의 구조를 유지시키는데 중요한 것으로 생각된다. 억제자 단백질의 돌연변이 부위에서의 아미노산 잔기가 실시예 3에서 동정된 것들 이외의 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이 단백질이 아미노산의 종류에 따라 온도-민감성을 보임이 합당하게 고려된다.
따라서, 300번 위치가 18종의 상이한 아미노산 중 하나로 치환된, 돌연변이체 락토스 억제자 단백질을 암호화하는 18개의 유전자가 작제되고 특징화되었다. 즉, 위치-지정 돌연변이를 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)에 의하여 락토스 억제자 유전자내로 도입시킨다. 우선, 아미노산을 변화시킴이 없이 lacI 유전자의 903번 뉴클레오티드 "G"를 "C"로 변화시킴으로써 SalI 제한 부위가 lacI 유전자에 도입된 플라스미드 pMC9-SalI을 작제한다.
5'쪽에 SalI 절단 부위를 제공하도록 고안된 프라이머 8 및 9를 화학적으로 합성한다. 프라이머 9를 프라이머 10과 함께 주형 DNA로서 pMC9-1을 사용하는 pCR에 사용하여 DNA 단편 A를 제조하고; 프라이머 8을 프라이머 11과 함께 주형 DNA로 pMC9-1을 사용하는 pCR에 사용하여 DNA 단편 B를 제조한다.
1μ 몰 프라이며, 1μ g 주형 DVA, 50mM KCl, 10mM 트리스-HCI, pH 8.3,1.5mM MgCl2, 0.01% 젤라틴, 200μ M dNTP (dATF, dGTP, dCTP 및 dTTP의 혼합물)를 함유하는 50μ l의 반응 혼합물증에서 PCR을 수행하고 여기에 2.5단위의 Tag DNA 폴리 머라제를 94℃에서 1분간, 72℃에서 2분간 및 55℃에서 2분간 30 사이클로 가한다. 생성된 DAN 단편 A를 제한 효소 MluⅠ 및 Sall으로 절단하고, 생성된 DNA 단편 B를 제한 효소 SalI 및 HindIII로 절단한다.
이와 같이 하여 수득된 DNA 단편과, MluI 및 HindIII로 pMC9를 절단하여 제조한 4.7kb DNA 단편을 혼합하고, T4 DNA 리가제를 사용하여 이들을 연결한다. 반응 혼합물을 사용하여 에스케리키아 콜라이 MYW3110을 형질전환시킨 다음 이를 50 μ g/ml 암피실린을 함유하는 L-한천 평판상에 플레이팅하고, 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pMC9-SalI(제4도)을 작제하기 위하여 형질전환체를 30℃에서 밤새 배양한다.
이어서, 300번 아미노산 위치에 돌연변이를 도입하기 위하여, 프라이머 12내지 19를 합성하여 프라이머 10과 함께 한조를 이뤄 주형 DNA로서 pMC9을 사용하는PCR을 수행하는데 사용한다.
PCR에 의해 제조된 각각의 DNA 단편을 0.15kb의 단편을 분리해내기 위하여 BssHII 및 SalI으로 절단하고, 이어서 이를 pMC9-SalI의 1. 0kb SalI-BamHI 단편및 4. 9kb BamHI-BssHII 단편과 혼합한 다음, 이들은 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시킨다. 반응 혼합물을 사용하여 에스케리키아 콜라이 MYW3110을 형질전환시킨 다음 이어서, 50μ g/ml 암피실린을 함유하는 L-한천 평판상에 플레이팅하고 30℃에서 밤새 배양한다. 이렇게 하여 수득된 형질전환체로부터 플라스미드 pMC9-300A 내지 pMC9-300Y(제5도 참조)를 분리해내고, 실시예 3에서 기술한 바와 동일한 과정에 따라 서열을 분석한 다음, 의도했던 아미노산을 암호화하는 정확한 코돈이 의도했던 돌연변이 부위에 도입되었는지를 확인한다.
이렇게 하여 수득된 형질전환체를 X-gal 및 암피실린을 함유하는 한천 평판상에 플레이팅하고, 30℃ 및 37℃에서 밤새 배양한 후에 발생된 콜로니의 색채를 관찰한다. 그 결과, 300번 아미노산으로서 각각 페닐알라닌 및 프롤린에 대한 코돈으로 바뀐 돌연변이체 lacI 유전자를 갖는 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pMC9-300F 및 에스케리키아 콜라이 MYW3110/pMC9-300P의 콜로니는 30℃ 배양의 경우 백색이었고 37℃ 배양의 경우 청색이었다.
따라서, 실시예 3에서 돌연변이된 아미노산으로 동정된 아스파라긴외의 아미노산, 즉 페닐알라닌 및 프롤린이 온도-민감성 돌연변이를 제공함이 확인되었고, 이 부위에서의 아미노산 치환이 새로운 온도-민감성 돌연변이를 제공함이 증명되었다.
그러므로, 300번 위치 뿐만 아니라 94, 241 및 265 위치중 하나 이상에서의 아미노산을 실시예 3에서 등정된 것들 이외의 아미노산으로 치환해도 온도-민감성 락토스 억제자가 제공되며, 따라서, 이와 같은 돌연변이체 락토스 억제자도 본 발명에 포함된다. 또한, 전술한 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 유전자, 이러한 유전자를 사용한 유전자 발현 조절 방법, 및 이러한 방법을 사용한 목적 유전자의 발현 방법도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 온도-민감성 돌연변이체 억제자 유전자는 IPTG 등의 값비싼 유도 물질을 사용함이 없이 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 제공하며, 따라서 목적 유전자의 연구 조사 및 클로닝, 및 산업적인 면에서 목적 단백질의 대량 생산용으로 유용하다.
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분자유형 :
특성 : 락토스 억제자 단백질의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 뉴클레오 타이드 서열, 94번 Xaa는 Val 또는 Met이고, 241번 Xaa는 Ala 또는 Thr이며, 265번 Xaa는 Gly 또는 Asp이며, 300번 Xaa는 Ser, Asn, Phe 또는 Pro이다.
서열
제1도는 β -갈락토시다제 생성에 미치는 배양 온도의 영향을 보여주는 그래프이다.
제2도는 플라스미드 pMC9-1 및 pMW119로부터의 플라스미드 pY01 작제 공정도이다.
제3도는 단백질 생성에 미치는 배양 온도 및 유도 물질의 영향을 보여주는 나트륨 도데실 설페이트 겔 전기영동도이다.
제4도는 플라스미드 pMC9-SalI의 작제 공정도이다.
제5도는 제300번 위치에 위치-지정 돌연변이를 함유하는 각종 플라스미드의 작제 공정도이다.

Claims (24)

  1. 이.콜라이(E.coli) 야생형 락토스 억제자의 94, 241, 265 또는 300번 위치에 있는 하나 이상의 아미노산이 야생형 락토스 억제자의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환된 온도-민감성 도연변이형 락토스 억제자 단백질로, 단, 상기 241번 또는 300번 위치의 아미노산 하나만이 야생형 락토스 억제자의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환된 온도-민감성 돌연변이형 락토스 억제자를 제외한, 온도-민감성 돌연변이형 락토스 억제자 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 94번 아미노산이 메티오닌인 돌연변이형 락토스 억제자 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 241번 아미노산이 트레오닌인 돌연변이형 락토스 억제자 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 265번 아미노산이 아스파르트산인 돌연변이형 락토스 억제자 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 300번 아미노산이 아스파라긴, 페닐알라닌 또는 프롤린인 돌연변이형 락토스 억제자 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 서열 번호 20에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 돌연변이형 락토스 억제자 단백질.
  7. 이.콜라이(E. coli) 야생형 락토스 억제자의 94, 241, 265 또는 300번 위치에 있는 하나 이상의 아미노산이 야생형 락토스 억제자의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환된 온도-민감성 돌연변이형 락토스 억제자 단백질로, 단, 상기 241번 또는 300번 위치의 아미노산 하나만이 야생형 락토스 억제자의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환된 온도-민감성 돌연변이형 락토스 억제자를 제외한 돌연변이형 락토스 억제자 단백질을 암호화하는 유전자.
  8. 제7항에 있어서, 94번 아미노산이 메티오닌인 유전자.
  9. 제7항에 있어서, 241번 아미노산이 트레오닌인 유전자.
  10. 제7항에 있어서, 265번 아미노산이 아스파르트산인 유전자.
  11. 제7항에 있어서, 300번 아미노산이 아스파라긴, 페닐알라닌 또는 프롤린인 유전자.
  12. 제7항에 있어서, 서열 번호 20에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 락토스 억제자 단백질을 암호화하는 유전자.
  13. 숙주 세포의 배양 온도를 변화시켜, 이. 콜라이(E. coli)야생형락토스 억제자의 94, 241, 265 또는 300번 위치에 있는 하나 이상의 아미노산이 야생형 락토스 억제자의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환된 온도-민감성 돌연변이형 락토스 억제자 단백질의 작용을 조절함으로써 목적 유전자의 발현을 조절하는 것을 포함하는, 상기 온도-민감성 돌연변이형 락토스 억제자 단백질을 암호화하는 유전자 및 목적 유전자를 함유하는 숙주 세포내에서, 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자의 발현을 조절하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 락토스 억제자 단백질 유전자가 목적 유전자를 함유하는 플라스미드 또는 목적 유전자를 함유하는 숙주 염색체 내로 삽입된 방법.
  15. 제13항에 있어서, 락토스 억제자 단백질 유전자가 목적 유전자를 함유하는 클로닝 벡터 또는 목적 유전자를 함유하는 발현 벡터내로 삽입된 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 포유류 세포, 원핵 세포, 진균류, 효모 또는 곤충 세포인 방법.
  17. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 35℃ 이상에서 유전자를 발현시키는 돌연변이형 락토스 억제자 단백질을 암호화하는 유전자가 사용된 방법.
  18. 제17항에 있어서, 37℃ 이상에서 유전자를 발현시키는 돌연변이형 락토스 억제자를 암호화하는 유전자가 사용된 방법.
  19. 이. 콜라이(E. coli) 야생형 락토스 억제자의 94, 241, 265 또는 300번 위치에 있는 하나 이상의 아미노산이 야생형 락토스 억제자의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환된 온도-민감성 돌연변이형 락토스 억제자 단백질 유전자 및 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포의 배양 온도를 변화시켜 돌연변이형 락토스 억제자 단백질의 작용을 조절함으로써 상기 목적 유전자의 발현을 조절하는 것을 포함하는, 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 발현시키는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 숙주 세포가 포유류 세포, 원핵 세포, 진균류, 효모 또는 곤충 세포인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 35℃ 이상에서 유전자를 발현시키는 돌연변이형 락토스 억제자 단백질을 암호화하는 유전자가 사용된 방법.
  22. 제21항에 있어서, 37℃ 이상에서 유전자를 발현시키는 돌연변이형 락토스 억제자를 암호화하는 유전자가 사용된 방법.
  23. 제19항에 있어서, 락토스 억제자 단백질 유전자가, 목적 유전자를 함유하는 플라스미드 또는 목적 유전자를 함유하는 숙주 염색체내로 삽입된 방법.
  24. 제19항에 있어서, 락토스 억제자 단백질 유전자가 목적 유전자를 함유하는 발현 벡터로 삽입된 방법.
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