DE69636996T2

DE69636996T2 - Methoden und zusammensetzungen für die sekretion von heterologen polypeptiden

Info

Publication number: DE69636996T2
Application number: DE69636996T
Authority: DE
Inventors: Laura C. Burlingame SIMMONS; Daniel G. Pacifica YANSURA
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1995-03-01
Filing date: 1996-02-27
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2016-02-28
Also published as: RU2208639C2; FI120357B; JP3375970B2; AU701476B2; US5840523A; FI973559A0; BR9607464A; NZ303619A; FI973559A; NO973985L; ZA961688B; IL117314A0; NO324920B1; DK0815246T3; CA2213813C; EP0815246A1; AU4998496A; ES2285711T3; ATE358181T1; MX9706607A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Signalsequenzen zur Sekretion von heterologen Polypeptiden aus Bakterien.
BESCHREIBUNG DES HINTERGRUNDS UND VERWANDTER GEBIETE
Die Sekretion von heterologen Polypeptiden in den periplasmatischen Raum von E. coli und anderen Prokaryoten oder in ihr Kulturmedium ist einer Reihe von Parametern unterworfen. Typischerweise werden Vektoren zur Sekretion eines Polypeptids von Interesse gentechnisch hergestellt, um DNA, die für eine sekretorische Signalsequenz kodiert, 5' zur DNA, die für das Polypeptid von Interesse kodiert, zu positionieren. Zwei große wiederkehrende Probleme quälen die Sekretion solcher Polypeptide. Erstens wird die Signalsequenz oft unvollständig verarbeitet oder entfernt, und zweitens ist die Menge des sekretierten Polypeptids oft gering oder nicht detektierbar. Versuche, diese Probleme zu überwinden, fallen in drei große Bereiche: Probieren mehrerer verschiedener Signalsequenzen, Mutieren der Aminosäuresequenz der Signalsequenz und Änderung des sekretorischen Wegs innerhalb des Wirtsbakteriums.
Für den ersten Ansatz zum Überwinden von Sekretionsproblemen sind eine Reihe von Signalsequenzen verfügbar. Watson (Nucleic Acids Research 12, 5145-5164 (1984)) offenbart eine Sammlung von Signalsequenzen. US 4.963.495 offenbart die Expression und Sekretion von reifem eukaryotischem Protein im periplasmatischen Raum eines Wirtsorganismus unter Einsatz einer prokaryotischen Sekretionssignalsequenz-DNA, die an ihrem 3'-Ende an das 5'-Ende der DNA gebunden ist, die für ein reifes Protein kodiert. Insbesondere ist DNA, die für E.-coli-Enterotoxinsignale kodiert, insbesondere STII, bevorzugt. Chang et al. (Gene 55, 189-196 (1987)) offenbaren die Verwendung der STII-Signalsequenz zur Sekretion von hGH in E. coli. Gray et al. (Gene 39, 247-245 (1985)) offenbaren die Verwendung der natürlichen Signalsequenz von menschlichem Wachstumshormon und die Verwendung des alkalischen Phosphatasepromotors von E. coli und der Signalsequenz für die Sekretion von menschlichem Wachstumshormon in E. coli. Wong et al. (Gene 68, 193-203 (1988)) offenbaren die Sekretion von insulinähnlichem Wachstumsfaktor 1 (IGF-1), der an LamB- und OmpF-Sekretionsleadersequenzen fusioniert ist, in E. coli und die Verstärkung der Verarbeitungseffizienz dieser Signalsequenzen in Gegenwart einer prIA4-Mutation. Fujimoto et al. (J. Biotech 8, 77-86 (1988)) offenbaren die Verwendung von vier verschiedenen E.-coli-Enterotoxin-Signalsequenzen, STI, STII, LT-A und LT-B, zur Sekretion des menschlichen Epidermiswachstumsfaktors (hEGF) in E. coli. Denefle et al. (Gene 85, 499-510 (1989)) offenbaren die Verwendung von OmpA- und phoA-Signalpeptiden zur Sekretion des reifen menschlichen Interleukins 1β.
Mutagenese der Signalsequenz ist im Allgemeinen nicht besonders hilfreich gewesen, um Sekretionsprobleme zu überwinden. Zum Beispiel offenbaren Morioka-Fujimoto et al. (J. Biol. Chem. 266, 1728-1732 (1991)) Aminosäureänderungen in der LTA-Signalsequenz, welche die Menge von menschlichem Epidermiswachstumsfaktor erhöhen, der in E. coli sekretiert wurde. Goldstein et al. (J. Bact. 172, 1225-1231 (1990)) offenbaren Aminosäuresubstitution in der hydrophoben Region von OmpA, die durch Sekretion von Nuclease A, aber nicht von TEM-β-Lactamase ausgeführt wird. Matteucci et al. (Biotech. 4, 51-55 (1986)) offenbaren Mutationen in der Signalsequenz von menschlichem Wachstumshormon, die die Sekretion von hGH erhöhen. Lehnhardt et al. (J. Biol. Chem. 262, 1716-1719 (1987)) offenbaren die Wirkung von Deletionsmutationen im OmpA-Signalpeptid auf die Sekretion von Nuclease A und TEM-β-Lactamase.
Letztendlich haben Versuche, heterologe Sekretion in E. coli durch Modulation des Wirtsmechanismus zu verbessern, bisher eingeschränkte Verbesserung bei der Überwindung von Sekretionsproblemen gezeigt. Zum Beispiel offenbaren van Dijl et al. (Mol. Gen. Genet. 227, 40-48 (1991)) die Wirkungen der Überproduktion von E.-coli-Signalpeptidase I (SPase I) auf die Verarbeitung von Vorläufern. Klein et al. (Protein Engineering 5, 511-517 (1992)) offenbaren, dass die Mutagenese der LamB-Signalsequenz wenig Wirkung auf die Sekretion von Rinder-Somatotropin zeigte und dass die Sekretionseigenschaften von Rindersomatotropin eher vom reifen Protein bestimmt zu sein scheinen als durch Veränderungen in der Signalsequenz. Perez-Perez et al. (Bio/Technology 12, 179-180 (1994)) offenbaren, dass die Bereitstellung eines E.-coli-Wirts mit zusätzlichen Kopien von prlA4 (secY-Allel) und SecE-Genen, die für die Hauptkomponenten des „Translokators", d.h. die molekulare Vorrichtung, die Proteine physisch über die Membran bewegt, kodieren, das Verhältnis von reifen zu Vorläufer-hlL-6 von 1,2 auf 10,8 steigerte. US 5.232.840 offenbart neue Ribosomenbindungsstellen, die zur Verstärkung der Proteinproduktion in Bakterien durch verstärkte und/oder wirksamere Translation nützlich sind. US 5.082.783 offenbart verbesserte Sekretion von heterologen Proteinen durch Wirte, wie z.B. Hefe, durch die Verwendung von Promotoren in der größten Vermittlungsstärke mit heterologen DNA-Sekretionssignalsequenzen. Die europäische Patentanmeldung Nr. 84308928.5, die am 19. Dezember 1984 eingereicht wurde, offenbart Promotor-Ribosomenbindungsstellen-Expressionselemente von allgemeiner Nützlichkeit für einen hohen Grad an heterologer Genexpression.
Die vorliegende Erfindung offenbart das unerwartete Ergebnis, dass geänderte Translationsinitiationsregionen mit reduzierter Translationsstärke im Wesentlichen eine vollständige Verarbeitung und hohe Sekretionsausmaße eines Polypeptids von Interesse im Vergleich zu Wildtypsignalsequenzen bereitstellte und dass viele Säugetierpolypeptide einen engen Bereich von Translationsausmaßen erfordern, um maximale Sekretion zu erreichen. Eine Reihe von Vektoren mit Varianten von Translationsinitiationsregionen stellen eine Reihe von Translationsstärken zur Optimierung der Sekretion eines Polypeptids von Interesse bereit.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Sekretion eines heterologen Polypeptids von Interesse in einer Zelle, das den Einsatz einer Translationsinitiationsregionsvariante umfasst, die operabel an die Nucleinsäure gebunden ist, die für das heterologe Polypeptid kodiert, um das heterologe Polypeptid zu sekretieren, worin die Menge des sekretierten Polypeptids, wenn die Nucleinsäure operabel an die Variante gebunden ist, größer ist als die Menge des sekretierten Polypeptids, wenn die Nuc leinsäure operabel an eine Wildtyptranslationsinitiationsregion gebunden ist, und worin die Variante eine Variante von STII ist, welche die Aminosäuresequenz der Translationsinitiationsregion nicht ändert und aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Nucleinsäure bereit, die für eine Translationsinitiationsregionvariante kodiert, worin die Variante eine Variante von STIII ist, die aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist:
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt eine Nucleinsäure bereit wie oben beschrieben, worin die Translationsinitiationsregionvariante operabel an eine Nucleinsäure gebunden ist, die für ein Polypeptid kodiert.
Weitere Aspekte stellen Expressionsvektoren bereit, die diese Nucleinsäuren umfassen, die operabel an weitere Elemente zur Expression für ein Gen von Interesse gebunden sind, und Wirtszellen, die diese Nucleinsäuren umfassen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Sequenz des phoA-Promotors, von trp und den STII-Shine-Dalgarno-Regionen und der STII-Signalsequenz.
2 ist ein Diagramm, das relevante Eigenschaften des Plasmids pLS33 zeigt.
3 ist ein Diagramm, das die Herstellung der Bibliothek pSTIIBK zeigt.
4 ist eine Graphik, die einen Vergleich des Expressionsausmaßes von IGF-1, gemessen durch die Menge von IGF-1, das in Kulturüberständen detektiert wird, für pLS33, pSTIIBK Nr. 131 und pSTIIC darstellt. Versuche 1 bis 8 stehen für Messungen, die zu 8 verschiedenen Terminen gemessen wurden.
5 ist ein Diagramm, das die Herstellung von Plasmid pSTIIC zeigt.
6 ist ein Diagramm, das die Herstellung von Plasmid pSTIILys zeigt.
7 ist ein Diagramm, das die Herstellung von Plasmid ppho21 zeigt.
8 ist ein Diagramm, das die Herstellung von Plasmid ppho31 zeigt.
9 ist ein Diagramm, das die Herstellung von Plasmid ppho41 zeigt.
10 ist ein Diagramm, das die Herstellung von Plasmid ppho51 zeigt.
11 ist ein Diagramm, das relevante Eigenschaften von Bibliothek pSTIICBK zeigt.
12 ist ein Diagramm, dass die Herstellung von Bibliothek pSTBKphoA zeigt.
13 ist eine Graphik, die phoA-Aktivität in Isolaten der pSTBKphoA-Bibliothek zeigt.
14 zeigt die Nucleotidsequenzen der angeführten STII-Signalsequenzvarianten.
15 ist ein Diagramm, das die Herstellung von Plasmid pNT3PST116 zeigt.
16 ist ein Diagramm, das die Herstellung von Plasmid pST116pho zeigt.
17 ist ein Diagramm, das relevante Eigenschaftten von „Kategorie A"-Plasmiden zeigt, die in den Beispielen verwendet werden.
18 ist ein Diagramm, das relevante Eigenschaften von „Kategorie B"-Plasmiden zeigt, die in den Beispielen verwendet werden.
19 ist eine Fotografie eines mit Coomassie-Blau gefärbten Polypeptidgels, das die Sekretion von reifen extrazellulären ICAM-1-Domänen 1 und 2 in E. coli unter Kontrolle von STII-Signalsequenzvarianten zeigt. Die TIR der relativen Stärke 9 wurde durch die ppho31-STII-Variante bereitgestellt, die TIR der relativen Stärke 3 wurde durch die pphp41-STII-Variante bereitgestellt. Vorläufer- und reife Formen des Polypeptids sind in der Fig. angegeben.
20 ist eine Fotografie eines mit Coomassie-Blau gefärbten Polypeptidgels, das die Sekretion von reifem NT3 in E. coli unter der Kontrolle von STII-Signalsequenzvarianten zeigt. Die TIR der relativen Stärke 9 wurde von der ppho31-STII-Variante bereitgestellt; die TIR der relativen Stärke 7 wurde von der ppho21-STII-Variante bereitgestellt; die TIR der relativen Stärke 3 wurde von der ppho41-STII-Variante bereitgestellt; die TIR der relativen Stärke 1 wurde von der ppho51-STII-Variante bereitgestellt. Die reife Form des Polypeptids ist in der Figur angegeben.
21 ist eine Fotografie eines mit Coomassie-Blau gefärbten Polypeptidgels, das die Sekretion reifer RANTES in E. coli unter Kontrolle von STII-Signalsequenzvarianten zeigt. Bei Lesen der Figur von links nach rechts wurden die TIRs der relativen Stärke 9 durch ppho31- und pSTBKphoA-Nr.116-STII-Varianten bereitgestellt; die TIR der relativen Stärke 7 wurde von der ppho21-STII-Variante bereitgestellt; die TIR der relativen Stärke 4 wurde durch die pSTBKphoA-Nr.81-STII-Variante bereitgestellt; die TIR der relativen Stärke 3 wurde von der ppho41-STII-Variante bereitgestellt; die TIR der relativen Stärke 2 wurde von der pSTBKphoA-Nr.107-STII-Variante bereitgestellt; die TIRs der relativen Stärke 1 wurden von der pSTBKphoA-Nr.86- und der ppho51-STII-Variante bereitgestellt. Die reife Form des Polypeptids ist in der Figur angegeben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
A. DEFINITIONEN
Die „Translationsinitiationsregion" oder TIR bezeichnet wie hierin verwendet eine RNA-Region (oder ihre kodierende DNA), welche die Stelle und Wirksamkeit der Initiation der Translation eines Gens von Interesse bestimmt (siehe z.B. McCarthy et al., Trends in Genetics 6, 78-85 (1990)). Eine TIR für ein bestimmtes Gen kann sich über die Ribosomenbindungsstelle (Rbs) hinaus erstrecken, um Sequenzen 5' und 3' zur Rbs zu umfassen. Die Rbs ist so definiert, dass sie mindestens die Shine-Dalgarno-Region und das Startcodon umfasst, plus die Basen dazwischen, kann aber die Ausdehnung der mRNA umfassen, die vor Ribonucleaseverdau durch gebundene Ribosomen geschützt ist. Daher kann eine TIR einen nicht-translatierten Leader oder das Ende eines Stromauf-Cistrons umfassen und daher ein Translationsstopcodon.
Eine „Sekretionssignalsequenz" oder „Signalsequenz" bezieht sich wie hierin verwendet auf eine Sequenz, die am Aminoterminus eines Polypeptids vorhanden ist, die seine Translokation über eine Membran lenkt. Typischerweise wird ein Vorläuferpolypeptid durch Spaltung der Signalsequenz verarbeitet, um ein reifes Polypeptid zu erzeugen.
Der Begriff „Translationsstärke" bezieht sich wie hierin verwendet auf ein Maß eines sekretierten Polypeptids in einem Kontrollsystem, worin eine oder mehrere Varianten einer TIR zur Steuerung der Sekretion eines Polypeptids verwendet wird/werden, für welches ein Reportergen kodiert, und die Ergebnisse werden mit der Wildtyp-TIR oder einigen anderen Kontrollen unter denselben Kultur- und Testbedingungen verglichen. Zum Beispiel wird die Translationsstärke in diesen Versuchen durch die Verwendung von alkalischer Phosphatase als Reportergen gemessen, die unter Kontrolle des phOA-Promotors auf Grundniveau exprimiert wird, worin die Sekretion des phoA-Polypeptids durch Varianten der STII-Signalsequenz gelenkt wird. Die Menge der reifen alkalischen Phosphatase, die im Wirt vorhanden ist, ist ein Maß der Menge des sekretierten Polypeptids und kann im Verhältnis zu einer negativen Kontrolle quantifiziert werden. Ohne auf irgendeine Theorie beschränkt zu sein, kann die „Translationsstärke" wie hierin verwendet z.B. ein Maß der mRNA-Stabilität, Wirksamkeit der Ribosomenbindung an die Ribosomenbindungsstelle und einen Translokationsmodus über die Membran umfassen.
„Polypeptid" bezieht wie hierin verwendet im Allgemeinen auf Peptide und Polypeptide, die zumindest zwei Aminosäuren aufweisen.
B. ALLGEMEINE VERFAHREN
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass die Translationsstärke ein kritischer Faktor zur Bestimmung ist, ob viele heterologe Polypeptide in signifikanten Mengen sekretiert werden. Daher können für eine bestimmte TIR eine Reihe von Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenzvarianten mit einer Reihe von Translationsstärken geschaffen werden, wodurch ein geeignetes Mittel bereitgestellt wird, durch welches dieser Faktor zur optimalen Sekretion vieler verschiedener Polypeptide angepasst werden kann. Die Verwendung eines Reportergens, das unter der Kontrolle dieser Varianten exprimiert wird, wie z.B. phoA, stellt ein Verfahren zur Quantifizierung der relativen Translationsstärken verschiedener Translationsinitiationsregionen bereit. Die Varianten- oder Mutanten-TIRs können vor dem Hintergrund eines Plasmidvektors bereitgestellt werden, wodurch eine Reihe von Plasmiden bereitgestellt wird, in welche ein Gen von Interesse eingeführt werden kann, und seine Expression gemessen wird, um einen optimalen Bereich von Translationsstärken zur maximalen Expression des reifen Polypeptids herzustellen.
Daher können z.B. Signalsequenzen aus einem beliebigen prokaryotischen oder eukaryotischen Organismus verwendet werden. Vorzugsweise ist die Signalsequenz STII, OmpA, phoE, LamB, MBP oder phoA.
Mutagenese der TIR wird mithilfe herkömmlicher Verfahren ausgeführt, die zu Codonänderungen führen, welche die Aminosäuresequenz verändern können, obwohl stumme Veränderungen der Nucleotidsequenz bevorzugt sind. Änderungen in der TIR können zum Beispiel Änderungen der Zahl oder der Abstände von Shine-Dalgarno-Sequenzen umfassen, gemeinsam mit Änderungen in der Signalsequenz. Eine bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Signalsequenzmutanten ist die Herstellung einer „Codonbank" am Beginn einer kodierenden Sequenz, welche die Aminosäuresequenz der Signalsequenz nicht verändert (d.h. die Veränderungen sind stumm). Dies kann durch die Änderung der dritten Nucleotidposition jedes Codons erreicht werden, zusätzlich haben einige Aminosäuren, wie z.B. Leucin, Serin und Arginin, multiple erste und zweite Positionen, welche die Herstellung dieser Bank komplexer machen. Dieses Mutageneseverfahren ist im Detail in Yansura et al. (METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4, 151-158 (1992)) beschrieben. Grundsätzlich wird ein DNA-Fragment, das für die Signalsequenz und den Anfang des reifen Polypeptids kodiert, so synthetisiert, dass die dritte (und möglicherweise erste und zweite oben beschriebene) Position jedes der ersten 6 bis 12 Codons verändert wird. Die zusätzlichen Nucleotide stromab dieser Codons stellen eine Stelle zur Bindung eines komplementären Primers bereit, der zur Herstellung des unteren Strangs verwendet wird. Die Behandlung des oberen Kodierstrang- und unteren Strangprimers mit DNA-Polymerase I (Klenow) resultiert in einer Reihe von Duplex-DNA-Fragmenten, die randomisierte Codons enthalten. Die Primer sind so entworfen, dass sie nützliche Klonierungsstellen umfassen, die dann dazu verwendet werden können, die DNA-Fragmente in einen geeigneten Vektor einzuführen, wodurch eine Amplifikation der Codonbank ermöglicht wird. Alternative Verfahren umfassen z.B. den Ersatz der vollständigen rbs durch zufällige Nucleotide (Wilson et al., Bio-Techniques 17, 944-952 (1994)) und die Verwendung von Phagendisplaybibliotheken (siehe z.B. Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4457-4461 (1992), Garrard et al.., Gene 128, 103-109 (1993)).
Typischerweise werden die TIR-Varianten in einem Plasmidvektor mit geeigneten Elementen zur Expression eines Gens von Interesse exprimiert. Zum Beispiel enthält ein typisches Konstrukt einen Promotor 5' zur Signalsequenz, eine Restriktionsenzymerkennungsstelle 3' zur Signalsequenz zur Insertion eines Gens von Interesse oder eines Reportergens und einen selektierbaren Marker, wie z.B. einen Arzneimittelresistenzmarker, zur Selektion und/oder Aufrechterhaltung von Bakterien, die mit den resultierenden Plasmiden transformiert werden.
Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen β-Lactamase und Lactase-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 617-624 (1978), und Goeddel et al., Nature 281, 544-548 (1979)), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8 (18), 4057-4074 (1980), und EP 36.776 ) und Hybridpromotoren wie z.B. den tac-Promotor (de-Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)).
Geeignete Promoting-Sequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (24), 12073-80 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149-67 (1968), und Holland, Biochemistry 17, 4900-4907 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind, die den zusätzlichen Vorteil von Transkription aufweisen, die durch Wachstumsbedingungen kontrolliert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase-2, Isocytochrom-23, Säurephosphatase, degradative Enzyme, die mit Stickstoffmetabolismus in Verbindung stehen, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in Hefeexpression sind in Hitzeman et al., EP 73.657A , beschrieben. Hefeenhancer werden ebenfalls vorteilhaft mit Hefepromotoren verwendet.
Es kann jedes beliebige Reportergen verwendet werden, das auf bestimmte Art und Weise quantifiziert werden kann. Daher kann z.B. die Produktion alkalischer Phosphatase als Maß des sekretierten Ausmaßes des phoA-Genprodukts quantifiziert werden. Andere Beispiele umfassen z.B. die β-Lactamasegene.
Vorzugsweise wird eine Reihe von Vektoren mit einer Reihe von Translationsstärken erzeugt, in welche DNA, die für ein Polypeptid von Interesse kodiert, insertiert werden kann. Diese eingeschränkte Reihe stellt einen Vergleich von sekretierten Ausmaßen von Polypeptiden bereit. Das sekretierte Ausmaß von Polypeptiden kann bestimmt werden, z.B. durch einen Funktionstest auf das Polypeptid von Interesse, wenn verfügbar, mit Radioimmuntests (RIA), enzymgebundenen Immuntests (ELISA) oder durch PAGE und Visualisierung des korrekten Molekulargewichts des Polypeptids von Interesse. Vektoren, die so hergestellt werden, können verwendet werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren. Vorzugsweise ist der Wirt ein prokaryotischer Wirt. Noch bevorzugter ist der Wirt E. coli.
Weitere Details der Erfindung sind in den folgenden Beispielen zu finden, die den Schutzumfang der Erfindung weiter definieren. Alle hierin zitierten Referenzen sind durch Verweis ausdrücklich vollständig aufgenommen.
BEISPIELE
I. PLASMIDKONSTRUKTE
A. GRUNDLEGENDE PLASMIDHERSTELLUNG
Alle in dieser Patentanmeldung beschriebenen Plasmide wurden aus dem Grundgerüst von pBR322 hergestellt (Sutcliffe, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 43, 77-90 (1978)). Während das Gen von Interesse, das exprimiert wird, in jedem Fall variiert, wurden die Transkriptions- und Translationssequnezen, die für die Expression jedes Gens erforderlich sind, durch den phoA-Promotor und die trp-Shine-Dalgarno-Sequenz bereitgestellt (Chang et al., Gene 55, 189-196 (1987)). Zusätzlich dazu war auch in den angeführten Fällen eine zweite Shine-Dalgarno-Sequenz, die STII-Shine-Dalgarno-Sequenz, ebenfalls vorhanden (Picken et al., Infect. Immun. 42(1), 269-275 (1983)). Die Sekretion des Polypeptids wurde durch die STII-Signalsequenz oder Varianten davon gesteuert (Picken et al., Infect. Immun. 42(1), 269-275 (1983)). Der phoA-Promotor, trp und die STII-Shine-Dalgarno-Sequenzen und die Sequenz der Wildtyp-STII-Signalsequenz sind in 1 dargestellt.
B. HERSTELLUNG VON pLS33
Das Plasmid pLS33 wurde von phGH1 abgeleitet (Chang et al., Gene 55, 189-196 (1987)), das für die Expression von des(1,3)-IGF-I hergestellt wurde. Im Plasmid pLS33 ersetzte das Gen, das für diese Version des insulinähnlichen Wachstumsfaktors I kodierte (das von der Originalsequenz (Elmblad et al., Third European Congress on Biotechnology III, Weinheim, Verlag Chemie, 287-292 (1984)) durch die Entfernung der ersten drei Aminosäuren am N-Terminus geändert wurde), das Gen, das für das menschliche Wachstumshormon kodierte. Die Konstruktion von pLS33 hielt Sequenzen für den phoA-Promotor, trp und STII-Shine-Dalgarnoregionen und die Wildtyp-STII-Signalsequenz aufrecht, die für phGH1 beschrieben wurden. Jedoch wurde das 3'-Ende, das dem Terminationscodon für des(1,3)-IGF-I folgte, von jenem geändert, das für phGH1 beschrieben wurde. Im Fall von pLS33 wurde gleich stromab des Terminationscodons eine HindIII-Restriktionsstelle gentechnologisch hergestellt, gefolgt von einem Methionin-Startcodon des Tetracyclinresistenzgens von PBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 43, 77-90 (1978)). Ein Diagramm des Plasmids pLS33 ist in 2 zu sehen.
C. HERSTELLUNG VON pSTIIBK
Eine Plasmidbibliothek, die eine variable Codonbank der STII-Signalsequenz enthielt (pSTIIBK), wurde hergestellt, um auf verbesserte Nucleotidsequenzen dieses Signals zu screenen. Das Vektorfragment zur Herstellung von pSTIIBK wurde durch Isolieren des größten Fragments hergestellt, wenn pLS33 mit XbaI und BstEII verdaut wurde. Dieses Vektorfragment enthält die Sequenzen, die für den phoA-Promotor, die trp-Shine-Dalgarno-Sequenz und Aminosäuren 16-67 von des(1,3)-IGF-I kodieren. Die kodierende Region für Aminosäuren 3-15 von des(1,3)-IGF-I wurde durch Isolieren des DraIII-BstEII-Fragments (etwa 45 bp) von einem anderen IGF-I-Expressionsplasmid, pLS33LamB, bereitgestellt. Die Variationen in der Nucleotidsequenz für das STII-Signal stammten von den zwei Strängen der unten angeführten synthetischen DNA:
Diese zwei Stränge der synthetischen DNA wurden anelliert und mit DNA-Polymerase-I (Klenow-Fragment) behandelt, um Duplex-DNA von etwa 101 bp zu bilden. Diese Duplex-DNA wurde dann mit XbaI und DraIII verdaut, um das Fragment von etwa 82 bp zu erzeugen, das für die STII-Signalsequenz mit variablen Codons und den ersten beiden Aminosäuren von des(1,3)-IGF-I kodiert. Diese Fragmente wurden dann wie in 3 dargestellt zusammenligiert, um die Bibliothek pSTIIBK herzustellen.
D. SELEKTION VON pSTIIBK Nr. 131
Die Plasmidbibliothek, die eine variable Codonbank der STII-Signalsequenz enthält (pSTIIBK), wurde auf verbessertes Wachstum der Transformanten und erhöhte Sekretion des IGF-1 gescreent. Grundsätzlich wurden Plasmide zu Wirtsstamm 27C7 (siehe unten) transformiert und auf erhöhte Fähigkeit untersucht, in einem phosphatarmen Medium (siehe Chang et al., siehe oben) plus Carbenicillin (5 μg/ml) zu wachsen, basierend auf OD₆₀₀-Messungen der Zelldichte. Kandidatenkolonien wurden wie folgt auf erhöhtes Ausmaß der IGF-1-Sekretion gemessen. Die Kolonien wurden zu 3-5ml LB plus Carbenicillin (50 μg/ml) inokuliert und bei 37°C unter Schütteln etwa 5-15 Stunden lang gezüchtet. Die Kulturen wurden 1:100 in 1-3 ml Medium mit wenig Phosphat plus Carbenicillin (50 μg/ml) verdünnt und 24 Stunden lang unter Schütteln bei 37°C induziert. Die induzierten Kulturen wurden in Mikrozentrifugenröhrchen 5 Minuten lang zentrifugiert. Überstände wurden in IGF-RIA-Verdünnungsmittel verdünnt und bei –20°C aufbewahrt, bis sie getestet wurden. Die Menge von IGF-1, das in das Medium sekretiert wurde, wurde mit einem Radioimmuntest gemessen.
Das Expressionsausmaß von IGF-1, das durch die Menge von IGF-1 gemessen wird, die in den Kulturüberständen detektiert wird, wurde für pLS33, pSTIIBK Nr. 131 und pSTIIC in 4 verglichen. Die Variante Nr. 131 verbesserte die IGF-I-Expression gegenüber der „Original"- oder Wildtyp-STII-Signalsequenz durchwegs. pSTIIC zeigte eine leichte Verbesserung der Expression gegenüber der Wildtypsequenz. pSTIIBK NR. 131 unterschied sich von Wildtyp-STII in 12 Codons und in der Deletion der Shine-Dalgarno-Sequenz. pSTIIC wurde wie nachstehend beschrieben als Kontrollplasmid hergestellt, das nur eine Shine-Dalgarno-Sequenz und drei Codonänderungen nahe dem äußersten 3'-Ende des Signals besitzt.
E. HERSTELLUNG VON pSTIIC
Bei pSTIIC wurde die STII-Shine-Dalgarno-Sequenz vom Plasmid pLS33 entfernt. Zusätzlich wurde durch Einführung stummer Mutationen nahe dem 3'-Ende des STII-Signals eine MluI-Stelle in pSTIIC gentechnologisch hergestellt. Die identischen Fragmente, die für die Herstellung von pSTIIBK beschrieben worden sind (der Vektor aus pLS33 und das DraIII-BstEII-Fragment mit etwa 45 bp aus pLS33LamB), wurden zur Herstellung des Plasmids verwendet. Jedoch unterschied sich die synthetische DNA von der oben für die Herstellung von pSTIIBK beschriebenen. Zur Herstellung von pSTIIC war die synthetische DNA, die für die STII-Signalsequenz und die ersten beiden Aminosäuren von des(1,3)-IGF-I kodierte, wie folgt:
Diese Fragmente wurden wie in 5 veranschaulicht zusammenligiert, um das Plasmid pSTIIC herzustellen.
F. HERSTELLUNG VON pSTIILys
Das Plasmid pSTIILys enthielt eine STII-Signalsequenz, die sich von der Signalsequenz von pSTIIC nur durch eine Nucleotidänderung an der Position des zweiten Codons unterschied. Diese Signalsequenz wurde aus synthetischer DNA hergestellt und in einen pBR322-basierten Vektor zur Expression des Polypeptids RANTES platziert (Schall et al., J. Immunol. 141 (3), 1018-1025 (1988)). Das XbaI-MluI-Vektorfragment für diese Herstellung wurde aus dem Plasmid pBK131Ran isoliert (ein Derivat des Plasmids pSTIIBK Nr. 131 mit dem Gen, das für RANTES kodiert, welches das Gen, das für des(1,3)-IGF-I kodiert, ersetzt). Dieser Vektor enthielt den phoA-Promotor, trp-Shine-Dalgarno-Sequenz, die letzten drei Aminosäuren der STIIC-Signalsequenz und das Gen, das für das Polypeptid RANTES kodiert. Wie in 6 dargestellt wurde dieses Fragment dann mit den folgenden Strängen synthetischer DNA ligiert, um das Plasmid pSTIILys (Seq.-ID Nr. 3) herzustellen.
G. HERSTELLUNG VON PLASMIDEN ALKALISCHER PHOSPHATASE
Um einen quantitativen TIR-Wert für jede der beschriebenen STII-Signalsequenzen zu bestimmen, wurde das Gen alkalischer Phosphatase von E. coli als Reportergen verwendet. Bei jeder dieser Konstruktionen wurde das phoA-Gen stromab des phoA-Promotors, der trp-Shine-Dalgarno-Sequenz und einer Version der STII-Signalsequenz positioniert. Die Plasmide ppho21, ppho31, ppho41 und ppho51 enthielten die Signalsequenzen, die von pSTIIC, pLS33, pSTIIBK Nr. 131 bzw. pSTIILys stammten. Im Fall von ppho31 umfasste die Konstruktion auch die STII-Shine-Dalgarno-Region.
H. HERSTELLUNG VON ppho21
Das Vektorfragment zur Herstellung von ppho21 wurde durch Verdau von pBR322 mit EcoRI und BamHI und durch Isolation des größten Fragments hergestellt. Der phoA-Promotor, die trp-Shine-Dalgarno-Sequenz und die STII-Signalsequenz (Aminosäuren 1-20) wurden durch Isolieren des etwa 484 bp großen Fragments von pCN131Tsc nach Verdau mit EcoRI und MluI bereitgestellt. Ein identisches Fragment von etwa 484 bp hätte ebenfalls aus pSTIIC hergestellt werden können, einem Plasmid, das zuvor beschrieben worden ist. Das phoA-Genfragment (etwa 1430 bp), das für die Aminosäuren 24-450 der alkalischen Phosphatase kodiert, wurde aus dem Plasmid pB0525 nach Verdau mit BSp1286 und BamHI erzeugt (Inouye et al., J. Bacteriol. 146 (2), 668-675 (1981)). Dieses Bsp1268-BamHI-Fragment enthält auch etwa 142 bp von SV40-DNA (Fiers et al., Nature 273, 113-120 (1978)) nach dem Terminationscodon von alkalischer Phosphatase. Synthetische DNA wurde dazu verwendet, die STII-Signalsequenz mit dem phoA-Gen zu verbinden. Die Sequenz dieser DNA, die für die letzten drei Aminosäuren der STII-Signalsequenz und Aminosäuren 1-23 alkalischer Phosphatase kodiert, war wie folgt:
Um die Herstellung dieses Plasmids zu erleichtern, wurde die synthetische DNA auf das EcoRI-MluI-Frgament von pCN1313TSc präligiert. Diese Präligation erzeugte ein neues Fragment von etwa 575 bp. Wie in 7 dargestellt wurde das Fragment, das aus der Präligation erzeugt wurde, dann gemeinsam mit den anderen Fragmenten zusammenligiert, von denen beschrieben wurde, dass sie ppho21 herstellen.
I. HERSTELLUNG VON ppho31
Das Vektorfragment zur Herstellung dieses Plasmids war der identische Vektor, der für ppho21 beschrieben wurde. Der phoA-Promotor, die trp-Shine-Dalgarno-Sequenz, STII-Shine-Dalgarno-Sequenz und STII-Signalsequenz (Aminosäuren 1-20) wurden aus pJAL55 erzeugt. Das notwendige Fragment (etwa 496 bp) aus pJAL55 wurde nach Verdau mit EcoRI und MluI isoliert. Dieses EcoRI-MluI-Fragment unterschied sich von derselben Region von pLS33 nur durch eine gentechnologisch hergestellte MluI-Stelle, die bei Aminosäure 20 der STII-Signalsequenz begann (wie für pSTIIC beschrieben). Die letzten drei Aminosäuren der STII-Signalsequenz und die Sequenz, die für das phoA-Gen kodierte, wurden durch Verdau des Plasmids ppho21 mit MluI und BamHI und durch Isolation des etwa 1505 bp großen Fragments bereitgestellt. Diese Fragmente wurden wie in 8 dargestellt zusammenligiert, um ppho31 zu ergeben.
J. HERSTELLUNG VON ppho41
Das Vektorfragment zur Herstellung dieses Plasmids war der identische Vektor, der für ppho21 beschrieben wurde. Der phoA-Promotor, die trp-Shine-Dalgarno-Sequenz und STII-Signalsequenz mit pSTIIBK-Nr.131-Codons (Aminosäuren 1-20) wurden durch Isolieren des etwa 484 bp großen EcoRI-MluI-Fragments von pNGF131 bereitgestellt. Aus pSTIIBK Nr. 131 hätte ebenfalls ein identisches Fragment erzeugt werden können. Die letzten drei Aminosäuren der STII-Signalsequenz und die Sequenz, die für das phoA-Gen kodiert, wurden durch Verdau des Plasmids ppho21 mit MluI und BamHI und durch Isolation des etwa 1505 bp großen Fragments bereitgestellt. Wie in 9 dargestellt wurden diese drei Fragmente dann zusammenligiert, um ppho41 herzustellen.
K. HERSTELLUNG VON ppho51
Das Vektorfragment zur Herstellung von ppho51 wurden durch Verdau des Plasmids pLS18 mit XbaI-BamHI und durch Isolation des größten Fragments erzeugt. Das Plasmid PLS18 ist ein Derivat von phGHI (Chang et al., Gene 55, 189-196 (1987)), und ein identischer Vektor wäre erzeugt worden, wenn phGH1 anstelle von pLS18 verwendet worden wäre. Dieser XbaI-BamHI-Vektor enthält den phoA-Promotor und die trp-Shine-Dalgarno-Sequenz. Die STII-Signalsequenz (Aminosäuren 1-20) mit pSTIILys-Codons wurde durch Isolation des etwa 67 bp großen Fragments, das erzeugt wurde, als pSTIILys mit XbaI und MluI verdaut wurde, bereitgestellt. Die letzten drei Aminosäuren der STII-Signalsequenz und die Sequenz, die für das phoA-Gen kodiert, wurden durch Verdau des Plasmids ppho21 mit MluI und BamHI und Isolation des etwa 1505 bp großen Fragments bereitgestellt. Ein Diagramm zur Herstellung von ppho51 ist in 10 dargestellt.
L. HERSTELLUNG von pSTIICBK
Es wurde eine zweite variable Codonbibliothek der STII-Signalsequenz, pSTIICBK, hergestellt. Diese zweite Codonbibliothek wurde nur hergestellt, um auf die Codons zu fokussieren, welche dem Met-Initiationscodon der STII-Signalsequenz am nächsten sind. Wie in 11 dargestellt war pSTIICBK ein pBR322-basiertes Plasmid, welches das Gen enthielt, das für das Polypeptid RANTES kodierte (Schall et al., J. Immunol. 141 (3), 1018-1025 (1988)), und zwar unter der Kontrolle des phoA-Promotors und der trp-Shine-Dalgarno-Sequenz. In diesem Plasmid wird die Sekretion von RANTES durch eine STII-Signalsequenzcodonbibliothek, die von den folgenden zwei Strängen synthetischer DNA stammt, gesteuert:
Diese beiden Stränge synthetischer DNA wurden anelliert und mit DNA-Polymerase-I (Klenow-Fragment) behandelt, um Duplex-DNA von etwa 86 bp zu bilden. Diese Duplex-DNA wurde dann mit XbaI und MluI verdaut, um ein Fragment von etwa 67 bp zu erzeugen, das für die ersten 20 Aminosäuren der STII-Signalsequenz mit variablen Codons an den Positionen 2-6 kodierte.
M. HERSTELLUNG VON pSTBKphoA
Zur Steigerung der Zahl von STII-Signalsequenzen, die mit unterschiedlichen relativen TIR-Stärken erhältlich sind, war ein passendes Verfahren zum Screenen der Codonbibliothek von pSTIICBK erforderlich. Das Plasmid pSTBKphoA wurde als Lösung für dieses Problem entwickelt. Im Plasmid pSTBKphoA wurde die STII-Codonbibliothek von pSTIICBK stromauf des phoA-Gens und stromab des phoA-Promotors und der trp-Shine-Dalgarno-Sequenz eingeführt. phoA-Aktivität stellte daher ein Mittel bereit, durch welches zwischen verschiedenen Versionen der STII-Signalsequenzen unterschieden wurde.
Das Vektorfragment für diese Konstruktion wurde durch Isolation des größten Fragments geschaffen, als p131TGF mit XbaI und BamHI verdaut wurde. Aus phGH1 hätte ebenfalls ein identischer Vektor erzeugt werden können (Chang et al., Gene 55, 189-196 (1987)). Dieser Vektor enthielt den phoA-Promotor und die trp-Shine-Dalgarno-Sequenz. Die Codonbibliothek der STII-Signalsequenz wurde durch Isolieren des etwa 67 bp großen Fragments, das aus pSTIICBK nach Verdau mit XbaI und MluI erzeugt wurde, bereitgestellt. Die letzten drei Aminosäuren der STII-Signalsequenz und die Sequenz, die für das phoA-Gen kodiert, wurden durch Verdau von ppho21 mit MluI und BamHI und durch Isolation des etwa 1505 bp großen Genfragments bereitgestellt. Wie in 12 dargestellt wurden die Fragmente dann zusammenligiert, um pSTBKphoA herzustellen.
N. SELEKTION VON pSTBKphoA Nr. 81, 86, 107, 116
Die Plasmide pSTBKphoA Nr. 81, 86, 107, 116 wurden aus der Codonbibliothek von pSTBKphoA basierend auf ihrer Grundniveau-phoA-Aktivität (13) ausgewählt. Wie in 14 angeführt hatte jede eine andere Nucleotidsequenz, die für die STII-Signalsequenz kodierte.
O. HERSTELLUNG VON pST116pho
Diese Version der STII-Signalsequenz, ST116, kombinierte die doppelte Shine-Dalgarno-Sequenz, die von Chang et al. (Gene 55, 189-196 (1987)) beschrieben wurde, mit den Codons der ausgewählten STII-Sequenz pSTBKphoA Nr. 116. Diese Signalsequenz wurde anfänglich in einem Plasmid hergestellt, das zur Sekretion der Pro-Region von NT3 (pNT3PST116) hergestellt worden war, und dann in ein Plasmid transferiert, welches das phoA-Gen enthielt, um ein relatives TIR-Maß zu erhalten (pST116pho).
P. HERSTELLUNG VON pNT3PST116
Der Vektor für diese Konstruktion wurde durch Verdau des Plasmids pLS18 mit XbaI und BamHI und Isolation des größten Fragments erzeugt. Das Plasmid pLS18 war ein Derivat von phGH1 (Chang et al., Gene 55, 189-196 (1987)), und es hätte ein identischer Vektor aus phGH1 erzeugt werden können. Dieser XbaI-BamHI-Vektor enthielt den phoA-Promotor und die trp-Shine-Dalgarno-Sequenz. Ein Fragment (etwa 682 bp), das die letzten drei Aminosäuren der STII-Signalsequenz und die kodierenden Region für Aminosäuren 19-138 von proNT3 enthielt (Jones et al., Proc. Natl. Acad. Sci 87, 8060-8064 (1990)), wurde aus dem Plasmid pNT3P nach Verdau mit MluI und BamHI erzeugt. Das Plasmid pNT3P war ein pBR322-basiertes Plasmid, das den phoA-Promotor, die STIIBK-Nr.131-Version der STII-Signalsequenz und die kodierende Region für Aminosäuren 19-138 von proNT3 enthielt. Die Stränge der synthetischen DNA, die unten angeführt sind, stellten die Sequenz für die STII-Shine-Dalgarno-Sequenz und die ersten 20 Aminosäuren der STII-Signalsequenz bereit:
Diese Fragmente wurden dann wie in 15 dargestellt zusammenligiert, um pNT3PST116 herzustellen.
Q. HERSTELLUNG von pST116pho
Der Vektor zur Herstellung dieses Plasmids war identisch mit dem Vektor, der für die Herstellung von pNT3PST116 beschrieben worden ist. Die STII-Shine-Dalgarno-Sequenz und die ersten 20 Aminosäuren der STII-Signalsequenz (pSTBKphoA-Nr.116-Codons) wurden durch Isolation des etwa 79 bp großen Fragments von pNT3PST116 nach Verdau mit XbaI und MluI hergestellt. Die letzten drei Aminosäuren der STII-Signalsequenz und die Sequenz, die für das phoA-Gen kodiert, wurden aus pSTBKphoA Nr. 116 nach Verdau mit MluI und BamHI isoliert (etwa 1505 bp großes Fragment). Wie in 16 dargestellt resultierte die Ligation dieser drei Fragmente in der Herstellung von pST116pho.
II. ALKALISCHER PHOSPHATASE-TEST
In diesen Versuchen wurden die geänderten TIR-Konstrukte, die das phoA-Reportergen verwendeten, mittels einer Modifikation des Verfahrens von Amemuura et al. (J. Bacteriol. 152, 692-701 (1982)) auf relative Translationsstärken getestet. Grundsätzlich wurde das Verfahren wie folgt verwendet. Plasmide, die geänderte Sequenzen trugen, ob in der TIR, der Shine-Dalgarno-Region, der Nucleotidsequenz zwischen der Shine-Dalgarno-Region und dem Startcodon der Signalsequenz oder Signalsequenz selbst, ob Aminosäuresequenzvarianten oder Nucleotidsequenzvarianten, wurden zur Transformation des E.-coli-Stamms 27C7 (ATCC 55.244) verwendet, obwohl ein beliebiger phoA^–-Stamm von E. coli verwendet werden konnte. Transformantenkolonien wurden zu Luria-Bertani-Medium (LB) plus Carbenicillin (50 μg/ml, Sigma, Inc.) inokuliert. Die Kulturen wurden bei 37°C unter Schütteln 4-8 Stunden lang wachsen gelassen. Das Äquivalent von 1 OD₆₀₀ jeder Kultur wurde zentrifugiert, dann in 1 ml eines strengen AP-Mediums (0,4 % Glucose, 20 mM NH₄Cl, 1,6 mM MgSO₄, 50 mM KCl, 20 mM NaCl, 120 mM Triethanolamin, pH 7,4) plus Carbenicillin (50 μg/ml) resuspendiert. Die Gemische wurden dann sofort über Nacht bei –20°C platziert. Nach dem Auftauen wurde 1 Tropfen Toluol zu 1 μl der aufgetauten Kultur zugefügt. Nach dem Verwirbeln wurden die Gemische in 16 × 125 mm große Teströhrchen transferiert und auf einem Rad bei 37°C 1 Stunde lang belüftet. 40 μl jeder mit Toluol behandelten Kultur wurden dann zu 1 ml 1 M Tris-HCl pH 8 plus 1 mM PNPP (Dinatrium-4-nitophenylphosphathexahydrat) hinzugefügt und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang stehen gelassen. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 100 ml 1 M Natriumphosphat pH 6,5 gestoppt. Die OD₄₁₀ wurde innerhalb von 30 Minuten gemessen. Die Enzymaktivität wurde als Mikromol von p-Nitrophenol berechnet, das pro Minute pro OD₆₀₀-Äquivalent der Zellen freigesetzt wird.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: Bestimmung der relativen Stärke von TIR Verwendung von phoA als Reportergen

¹Mikromol von p-Nitrophenol/min/OD₆₀₀-Zellen
²dieselbe STII-Variante wie pSTIILys
³dieselbe STII-Variante wie pSTIIBK Nr. 131
⁴dieselbe STII-Variante wie STIIC
⁵Wildtyp-STII + MluI-Stelle, letztes Codon GCC

III. SEKRETION DER HETEROLOGEN POLYPEPTID-BEISPIELE
Die Plasmide, die in diesen Beispielen verwendet werden, sind alle in ihrem Entwurf wie oben beschrieben sehr ähnlich. Statt einer detaillierten Beschreibung jeder Konstruktion sind die Expressionsplasmide hierin allgemeiner beschrieben. Obwohl ein anderes Polypeptid von Interesse in jedem Beispiel exprimiert wurde, war die einzige signifikante Variation zwischen diesen Konstruktionen die Nucleotidsequenz nach dem 3'-Ende jeder kodierenden Region. Daher wurden diese Plasmide für deskriptive Zwecke basierend auf ihrer 3'-Sequenz lose in die folgenden zwei Kategorien gruppiert:
Kategorie A: Innerhalb von etwa 25 bp 3' zum Terminationskodon jedes Gens von Interesse begann die Sequenz, die für den Transkriptionsterminator kodiert, der von Scholtissek und Grosse (Nucleic Acids Res. 15 (7), 3185 (1987)) beschrieben worden ist, gefolgt vom Tetracyclinresistenzgen von pBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 43, 77-90 (1978)). Beispiele in dieser Kategorie umfassten Plasmide, die zur Sekretion reifer NGF entworfen worden sind (Ullrich et al., Nature 303, 821-825 (1983)), reifen TGF-β1 (Derynck et al., Nature 316, 701-705 (1985)) und Domänen 1 und 2 von ICAM-1 (Staunton et al., Cell 52, 925-933 (1988)). Eine schematische Repräsentation dieser Plasmide ist in 17 angegeben.
Kategorie B: Beispiele in dieser Kategorie umfassten Plasmide, die für die Sekretion reifer VEGF entworfen sind (Leung et al., Science 246, 1306-1309 (1989)), reife NT3 (Jones et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 8060-8064 (1990)), RANTES (Schall et al., J. Immunol. 141 (3), 1018-1025 (1988)) und phoA. Das Terminationscodon in jedem dieser Plasmide wird in der 3'-Richtung von einem Segment nicht-translatierter DNA gefolgt (VEGF: etwa 43 bp, reife NT3: etwa 134 bp, RANTES: etwa 7 bp; phoA: etwa 142 bp). Nach dieser nichttranslatierten 3'-Region wurde die Sequenz von pBR322 entweder durch Beginnen mit der HindIII-Stelle (wie in reifem NT3-Sekretionsplasmid) oder der BamHI-Stelle (phoA-, VEGF-, RANTES-Sekretionsplasmide) reinitiiert. Eine schematische Darstellung der Plasmide, die in dieser Kategorie enthalten sind, ist in 18 veranschaulicht.
Diese Plasmide wurden zur Transformierung des Wirts E.-coli-Stamm 27C7 verwendet. Transformantenkolonien wurden zu 3-5 ml LB + Carbenicillin (50 μg/ml) inokuliert. Die Kulturen wurden bei 37°C unter Schütteln 3-8 Stunden lang wachsen gelassen. Die Kulturen wurden dann 1:100 in 3 ml phosphatarmes Medium (Chang et al., siehe oben) verdünnt und etwa 20 Stunden lang unter Schütteln bei 37°C induziert. Für jede gewachsene Kultur wurde eine 0,5-OD₆₀₀-Aliquote in einem Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert.
Jedes 0,5-OD₆₀₀-Pellet wurde dann wie folgt für Gelanalyse hergestellt. Jedes Pellet wurde in 50 μl TE (10 mM Tris pH 7,6, 1 mM EDTA) resuspendiert. Nach Zugabe von 10 μl 10 % SDS, 5 μl Reduktionsmittel (1 M Dithiothreit oder 1 M β-Mercaptoethanol) wurden die Proben 2 Minuten lang auf etwa 90°C erwärmt und dann verwirbelt. Die Proben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt, danach wurden 500 μl Aceton hinzugefügt. Die Proben wurden verwirbelt und bei Raumtemperatur etwa 15 Minuten lang stehen gelassen. Die Proben wurden 5 Minuten lang zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen und die Pellets in 20 μl Wasser, 5 μl Reduktionsmittel, 25 μl NOVEX 2 X Probenpuffer resuspendiert. Die Proben wurden 3-5 Minuten lang auf etwa 90°C erwärmt, dann verwirbelt. Nach 5-minütiger Zentrifugation wurden die Überstände auf saubere Röhrchen transferiert und die Pellets verworfen. 5-10 μl jeder Probe wurden auf 10 Well, 1,0 mm angefertigtes NOVEX-Gel (San Diego, Kalifornien) geladen und 1,5-2 h bei 120 Volt einer Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden mit Coomassieblau gefärbt, um das Polypeptid sichtbar zu machen (19-21).
Zur Bereitstellung weiterer Quantifizierung der Ergebnisse wurden einige Gele mittels Densitometrie analysiert. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten angeführt. Sowohl die Polypeptidgele als auch die Densitometrieergebnisse geben an, dass die getesteten heterologen Polypeptide durchwegs wirksamer sekretiert wurden, wenn eine STII-Variante mit reduzierter Translationsstärke verwendet worden war, um die Sekretion dieses Polypeptids zu steuern. Tabelle 2: Beispiele für verbesserte Polypeptidsekretion durch TIR-Modifikation: Densitometerscans von Polypeptidgelen

pSTBKphoA-Nr.86-Signalsequenz

Claims

Verfahren zum Sekretieren eines heterologen Polypeptids von Interesse in einer Zelle, umfassend den Einsatz einer Translationsinitiationsregionsvariante, die operabel an eine für das heterologe Polypeptid kodierende Nucleinsäure gebunden ist, um das heterologe Polypeptid zu sekretieren, worin die Menge an sekretiertem Polypeptid, wenn die Nucleinsäure operabel an die Variante gebunden ist, größer ist als die Menge an sekretiertem Polypeptid, wenn die Nucleinsäure operabel an eine Translationsinitiationsregion vom Wildtyp gebunden ist, und worin die Variante eine Variante von STII ist, welche die Aminosäuresequenz der Translationsinitiationsregion nicht verändert, und aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist:
Nucleinsäure, die für eine Translationsinitiationsregionsvariante kodiert, worin die Variante eine Variante von STII ist, die aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist:
Nucleinsäure nach Anspruch 2, worin die Translationsinitiationsregionsvariante operabel an eine für ein Polypeptid kodierende Nucleinsäure gebunden ist.
Expressionsvektor, der eine Nucleinsäure nach Anspruch 2 oder Anspruch 3 operabel an weitere Elemente gebunden umfasst, zur Expression eines Gens von Interesse.
Wirtszelle, eine Nucleinsäure nach Anspruch 2 oder Anspruch 3 umfassend.