TW202106714A - 藉由多肽鏈交換製造抗體衍生之多肽 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於雜二聚體多肽集合及其用途，例如用於藉由多肽鏈交換製造多特異性抗原結合物。

Description

藉由多肽鏈交換製造抗體衍生之多肽
本發明係關於雜二聚體多肽集合及其用途，例如用於藉由多肽鏈交換製造多特異性抗原結合物。
當需要藉由重組方法分別提供每種所得多特異性抗體時，自多種可能的抗原結合物提供抗原結合物在多特異性抗體中之最佳組合為一項挑戰。需要篩查複數個多特異性抗體之替代方法。
Labrijn, A. F.等人揭示藉由可控的Fab臂交換來有效製造穩定的雙特異性IgG1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150)。簡言之，使CH3域中具有點突變之兩個IgG樣域排列的單特異性前體分子接觸以進行多肽鏈交換，從而形成雙特異性產物分子，其亦為IgG樣域排列。因此，前體分子及產物分子具有相同大小，從而使產物分子與未反應之前體分子分離及分析產物分子具有挑戰性。
未公開之先前技術PCT/EP2018/078675及PCT/EP2018/079523揭示藉由多肽鏈交換自兩種不同的前體分子製造多特異性抗原結合物的方法。兩種前體分子均為不對稱域排列之雜二聚體多肽。兩種前體分子均包含根據「杵臼」技術(WO 96/027011，Ridgway, J.B.等人, Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及Merchant, A.M.等人, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681)修飾且包含以不對稱模式排列之進一步去穩定化突變的CH3域。在前體分子中之每一者中，僅一個CH3域包含此類去穩定化突變。在多肽鏈交換後，形成兩個產物分子，其中產物分子中之每一者包含來自前體分子中之每一者的多肽。前體分子及產物分子具有不同的域排列。PCT/EP2018/078675及PCT/EP2018/079523揭示待取代之前體分子的CH3/CH3介面中之胺基酸位置。
然而，仍需要藉由多肽鏈交換製造多特異性抗原結合物的其他方法。
本發明係關於一種雜二聚體前體多肽集合，其包含： -  第一雜二聚體前體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變， 其中該第一雜二聚體前體多肽包含第一抗原結合部分，其中該第一抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上，及 -  第二雜二聚體前體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變， 其中該第二雜二聚體前體多肽包含第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上； 其中 A)    i)在該第一雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈包含該第一抗原結合部分之至少一部分，而在該第二雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈包含該第二抗原結合部分之至少一部分，或ii)在該第一雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈包含該第一抗原結合部分之至少一部分，而在該第二雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈包含該第二抗原結合部分之至少一部分；且其中 B)     i)該第一雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域及該第二雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域，或 ii)該第一雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域及該第二雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域 包含以下胺基酸取代，其中編號係根據Kabat編號系統： -  具有臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： o 用疏水性胺基酸置換S354； o 用帶正電荷之胺基酸置換D356； o 用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； o 用帶正電荷之胺基酸置換D356，且用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； o 用疏水性胺基酸置換S364； o 用疏水性胺基酸置換A368； o 用帶負電荷之胺基酸置換E392； o 用疏水性胺基酸置換T394； o 用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換S400； o 用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換F405； o 用疏水性胺基酸置換V407；及 o 用帶負電荷之胺基酸置換K409；及 o 用帶負電荷之胺基酸置換K439； -  具有杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： o 用帶正電荷之胺基酸置換Q347，且用帶負電荷之胺基酸置換K360； o 用帶負電荷之胺基酸置換Y349； o 用疏水性胺基酸置換L351，且用疏水性胺基酸置換E357； o 用疏水性胺基酸置換S364； o 用疏水性胺基酸置換W366，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； o 用疏水性胺基酸置換L368； o 用帶負電荷之胺基酸置換K370； o 用帶負電荷之胺基酸置換K370，且用帶負電荷之胺基酸置換K439； o 用帶負電荷之胺基酸置換K392； o 用疏水性胺基酸置換T394； o 用疏水性胺基酸置換V397； o 用帶正電荷之胺基酸置換D399，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； o 用帶正電荷之胺基酸置換S400； o F405W； o Y407W；及 o 用帶負電荷之胺基酸置換K439。
本發明之一個實施例係關於本發明之雜二聚體多肽集合，其中i)第一雜二聚體前體多肽之包含杵突變的CH3域包含半胱胺酸突變，而第二雜二聚體前體多肽之包含臼突變的CH3域包含半胱胺酸突變，或ii)第一雜二聚體前體多肽之包含臼突變的CH3域包含半胱胺酸突變，而第二雜二聚體前體多肽之包含杵突變的CH3域包含半胱胺酸突變。
本發明之一個實施例係關於本發明之雜二聚體多肽集合，其中第一抗原結合部分及/或第二抗原結合部分為抗體片段。
本發明之另一態樣為用於製造雜二聚體多肽之方法，其包含以下步驟： a)     使根據本發明之第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽接觸，以形成第三雜二聚體多肽，該第三雜二聚體多肽包含來自第一雜二聚體前體多肽之至少一個多肽及來自第二雜二聚體多肽之至少一個多肽，及 b)     回收該第三雜二聚體多肽。
本發明之一個實施例係關於製造本發明之雜二聚體多肽的方法，其中第二雜二聚體前體多肽包含特異性結合至第二抗原之抗原結合部分，且其中第三雜二聚體多肽包含特異性結合至第一抗原之抗原結合部分及特異性結合至第二抗原之抗原結合部分。
本發明之另一態樣為藉由根據本發明之方法獲得的雜二聚體多肽。
本發明之另一態樣為用於鑑別多特異性雜二聚體多肽之方法，其包含以下步驟： a)     藉由對以下之各種組合： -  來自複數個第一雜二聚體前體多肽之第一雜二聚體前體多肽，其包含特異性結合至第一抗原之抗原結合部分，及 -  來自複數個第二雜二聚體前體多肽之第二雜二聚體前體多肽，其包含特異性結合至第二抗原之抗原結合部分， 進行製造本發明之雜二聚體多肽的方法來製造複數個多特異性雜二聚體多肽；及 b)     自步驟a)中製造之複數個多特異性雜二聚體多肽分別偵測各多特異性雜二聚體多肽之所需特徵，及 c)     選擇多特異性雜二聚體多肽。
本發明之另一態樣為根據本發明之雜二聚體前體多肽集合，其用作藥物。
藉由本文揭示之發明，提供能夠進行多肽鏈交換以形成產物多肽的前體多肽。由此，可產生多特異性抗原結合多肽。多特異性抗原結合多肽之製造可由於包含特異性結合至不同抗原之抗原結合部分的兩個前體多肽之組合，或由於多肽鏈交換導致特異性結合至抗原之抗體可變域的締合而活化抗原結合位點，或藉由前述兩者而發生。
本發明提供用於製造與前體多肽大小不同之產物多肽的方法，從而使得所需產物多肽與未反應之前體多肽容易分離。根據本發明之方法及多肽集合適用於藉由活體外多肽鏈交換及避免產物多肽之重組表現來提供產物多肽，例如雙特異性或多特異性抗體。由此，本發明之方法及多肽集合適用於篩選由複數個前體多肽形成之產物多肽，例如允許鑑別抗原結合部分之有利組合。本發明之方法及多肽集合可有利地用於提供用於治療或診斷用途之抗原結合多肽。
本發明之前體多肽集合的治療性應用允許在靶位點處製造所需產物多肽，從而減少產物多肽之脫靶效應。
1.  定義  除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語應具有由一般熟習此項技術者通常理解之含義。另外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。本揭示案之方法及技術一般根據此項技術中熟知的習知方法進行。一般而言，與本文所述之生物化學、酶學、分子及細胞生物學、微生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學及雜交結合使用之命名法及技術為此項技術中眾所周知及常用的。
除非上下文另外明確指出，否則術語「一(a/an)」及「該」通常包括複數指示物。
除非本文另外定義，否則術語「包含」應包括術語「由……組成」。
除非上下文另外明確指出，否則使用術語「……或……(either … or)」提供的兩個替代方案表示相互排斥的替代方案。
如本文所用，術語「抗原結合部分」係指特異性結合至靶抗原之部分。該術語包括能夠特異性結合至靶抗原之抗體以及其他天然(例如受體、配體)或合成(例如DARPin)分子。
術語「抗體」在最廣泛之意義上使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。
如本文所用，術語「結合位點」或「抗原結合位點」表示抗原實際上結合之抗原結合部分的一或多個區域。倘若抗原結合部分為抗體，則抗原結合位點包括抗體重鏈可變域(VH)及/或抗體輕鏈可變域(VL)或VH/VL對。特異性結合至靶抗原之衍生自抗體之抗原結合位點可衍生自a)特異性結合至抗原之已知抗體，或b)藉由重生免疫方法使用尤其抗原蛋白質或核酸或其片段或藉由噬菌體呈現方法獲得的新的抗體或抗體片段。
當衍生自抗體時，根據本發明之抗體的抗原結合位點可含有六個互補決定區(CDR)，其在不同程度上有助於結合位點對抗原之親和力。存在三個重鏈可變域CDR (CDRH1、CDRH2及CDRH3)及三個輕鏈可變域CDR (CDRL1、CDRL2及CDRL3)。CDR及構架區(FR)之範圍係藉由與胺基酸序列彙編資料庫進行比較來確定，其中彼等區域已根據序列之間的變異性來定義。亦包括在本發明範疇內的為由較少的CDR構成之功能性抗原結合位點(亦即，其中結合特異性係由三個、四個或五個CDR來決定)。舉例而言，少於一組完整的6個CDR可能足以實現結合。
如本文所用，術語「價」表示抗體分子中存在指定數目之結合位點。天然抗體例如具有兩個結合位點且為二價的。因此，術語「三價」表示抗體分子中存在三個結合位點。
「抗體片段」係指除完整抗體以外之分子，其包含完整抗體之一部分，該部分結合完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 ；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv、scFab)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
「特異性」係指抗原結合部分(例如抗體)對抗原之特定抗原決定基的選擇性識別。舉例而言，天然抗體為單特異性的。如本文所用，術語「單特異性抗體」表示具有一或多個結合位點之抗體，該一或多個結合位點中之每一者結合至相同抗原之相同抗原決定基。「多特異性抗體」結合兩個或更多個不同的抗原決定基(例如，兩個、三個、四個或更多個不同的抗原決定基)。該等抗原決定基可在相同或不同的抗原上。多特異性抗體之實例為結合兩個不同抗原決定基之「雙特異性抗體」。當抗體具有多於一種特異性時，所識別之抗原決定基可能與單一抗原或多於一種抗原相關。
抗原決定基為抗原結合部分(例如抗體)所結合之抗原區域。術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合至抗體或抗原結合部分之任何多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括分子之化學活性表面基團，諸如胺基酸、聚糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且在某些實施例中，可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。
如本文所用，術語「結合」及「特異性結合」係指抗體或抗原結合部分在活體外分析中，較佳在具有經純化之野生型抗原的電漿子共振分析(BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden)中與抗原之抗原決定基的結合。在某些實施例中，當抗體或抗原結合部分在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中優先識別其靶抗原時，稱其特異性結合抗原。
抗體與抗原結合之親和力係由術語ka (抗體/抗原複合物之抗體的締合速率常數)、kD (解離常數)及KD (kD /ka)定義。在一個實施例中，結合或/特異性結合意謂結合親和力(KD )為10- 8 mol/l或更小，在一個實施例中為10- 8 M至10- 13 mol/l。因此，抗原結合部分，尤其抗體結合位點，以10- 8 mol/l或更小的結合親和力(KD )，例如以10- 8 至10- 13 mol/l的結合親和力(KD )，在一個實施例中以10- 9 至10- 13 mol/l的結合親和力(KD )特異性結合至其特異性的每種抗原。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結合之域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為VH及VL)一般具有相似的結構，各域包含四個保守構架區(FR)及三個互補決定區(CDR)。(參見例如Kindt等人 Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁 (2007)。)單個VH或VL域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可使用VH或VL域自結合抗原之抗體分離結合特定抗原之抗體，以分別篩選互補的VL或VH域之文庫。參見例如Portolano等人, J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson等人, Nature 352:624-628 (1991)。
如本申請案中使用之術語「恆定域」或「恆定區」表示抗體除可變區以外之域的總和。恆定區不直接參與抗原之結合，但表現出各種效應功能。
視抗體重鏈恆定區之胺基酸序列而定，抗體分為以下「類別」：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中一些可進一步分為亞類，諸如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別抗體之重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及µ。可見於所有五種抗體類別之輕鏈恆定區(CL)稱為κ及λ。
如本文所用，「恆定域」較佳來自人類來源，其來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類之人類抗體的恆定重鏈區及/或恆定輕鏈κ或λ區。此類恆定域及區為目前先進技術中眾所周知的，且例如由Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)描述。
在野生型抗體中，「鉸鏈區」為IgG及IgA免疫球蛋白類別之重鏈中心部分的可撓性胺基酸序列段，其藉由二硫鍵，亦即「鏈間二硫鍵」連接兩條重鏈，因為該等二硫鍵在兩條重鏈之間形成。人類IgG1之鉸鏈區一般定義為自人類IgG1之約Glu216或約Cys226至約Pro230的序列段(Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985))。藉由使鉸鏈區中之半胱胺酸殘基缺失或藉由用其他胺基酸諸如絲胺酸取代鉸鏈區中之半胱胺酸殘基，避免鉸鏈區中二硫鍵的形成。
來自任何脊椎動物物種之抗體的「輕鏈」可基於其恆定域之胺基酸序列而分配至兩種稱為κ及λ之不同類型之一。野生型輕鏈通常含有兩個免疫球蛋白域，通常為一個對結合抗原重要的可變域(VL)及一個恆定域(CL)。
存在數種不同類型的「重鏈」，其定義抗體之類別或同型。野生型重鏈含有一系列免疫球蛋白域，通常具有一個對結合抗原重要的可變域(VH)及數個恆定域(CH1、CH2、CH3等)。
本文中之術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區，其含有恆定區之至少一部分。該術語包括天然序列Fc區及變異Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自重鏈之Cys226或Pro230延伸至羧基端。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。
人類IgG Fc區之「CH2域」通常自約位置231處之胺基酸殘基延伸至約位置340處之胺基酸殘基。多特異性抗體沒有CH2域。「沒有CH2域」意謂根據本發明之抗體不包含CH2域。
「CH3域」包含Fc區中之C端殘基至CH2域的序列段(亦即自IgG之約位置341處之胺基酸殘基至約位置447處之胺基酸殘基)。本文中之「CH3域」為變異CH3域，其中天然CH3域之胺基酸序列進行至少一個不同的胺基酸取代(亦即CH3域之胺基酸序列的修飾)，以促進多特異性抗體內彼此面對之兩個CH3域的雜二聚化。
通常，在此項技術中已知的雜二聚化方法中，一條重鏈之CH3域及另一條重鏈之CH3域均以互補的方式進行工程改造，以使得包含一個經工程改造之CH3域的重鏈可不再與相同結構之另一條重鏈均二聚化。因此，迫使包含一個經工程改造之CH3域的重鏈與包含以互補方式工程改造之CH3域的另一條重鏈雜二聚化。
此項技術中已知的一種雜二聚化方法為所謂的「杵臼」技術，其在例如WO 96/027011，Ridgway, J.B.等人, Protein Eng. 9 (1996) 617-621；Merchant, A.M.等人, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681；及WO 98/ 050431中提供若干實例進行詳細描述，該等文獻以引用的方式包括在本文中。在「杵臼」技術中，在抗體之三級結構中兩個CH3域之間形成的介面內，各CH3域上之特定胺基酸經工程改造以分別在CH3域中之一者中產生隆凸(「杵」)及在CH3域中之另一者中產生空腔(「臼」)。在多特異性抗體之三級結構中，在一個CH3域中引入之隆凸可定位於另一CH3域中引入之空腔中。
結合根據杵臼技術之取代，可將額外的鏈間二硫鍵引入CH3域中以進一步穩定雜二聚化之多肽(Merchant, A.M.等人, Nature Biotech. 16 (1998) 677-681)。此類鏈間二硫鍵係例如藉由將以下胺基酸取代引入CH3域中而形成：一個CH3域中之D399C及另一個CH3域中之K392C；一個CH3域中之Y349C及另一個CH3域中之S354C；一個CH3域中之Y349C及另一個CH3域中之E356C；一個CH3域中之Y349C及另一個CH3域中之E357C；一個CH3域中之L351C及另一個CH3域中之S354C；一個CH3域中之T394C及另一個CH3域中之V397C。如本文所用，「半胱胺酸突變」係指CH3域中之胺基酸經半胱胺酸取代的一個胺基酸取代，其能夠與第二CH3域中之胺基酸經半胱胺酸取代的另一個匹配的胺基酸取代形成鏈間二硫鍵。
除如前所述之「杵臼」技術以外，用於修飾CH3域以強制雜二聚化之其他技術為此項技術中已知的。此等技術，尤其WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954及WO 2013/096291中所述之技術在本文中考慮作為本發明提供之多肽之「杵臼技術」的替代方案。所有彼等技術均涉及藉由引入電荷相反或側鏈體積不同之胺基酸以互補方式工程改造CH3域，從而支持雜二聚化。
本發明之前體多肽僅在其CH3域中之一者中包含「使CH3/CH3介面去穩定化之」胺基酸取代，在本文中亦稱為「去穩定化突變」。對於此等末端，意謂僅在雜二聚體前體多肽中締合之CH3域中之一者排列的胺基酸取代。在該CH3域中，已知在CH3/CH3介面內相互作用，例如在與上述CH3-雜二聚化策略相關之先前技術中所揭示之一或多個胺基酸位置，經具有另一個位鏈特性之胺基酸置換。與雜二聚化策略相反，其中通常相關CH3域中之一對相互作用的胺基酸經取代(亦即雜二聚體中所涉及之一個CH3域中的一或多個胺基酸殘基；及雜二聚體中所涉及之另一個CH3域中的一或多個胺基酸殘基)，去穩定化突變僅排列在根據本發明之雜二聚體前體多肽中所涉及之CH3域中之一者中。使CH3/CH3介面去穩定化之例示性胺基酸取代在下面「去穩定化突變」部分中列出。本文具體揭示之所有例示性胺基酸取代經排列以使得經取代之胺基酸在一對該等CH3域內之CH3/CH3介面中相互作用。
如本文所用，術語「多肽鏈」係指包含經由肽鍵連接在一起之大量胺基酸的線性有機聚合物。一或多條多肽鏈形成「多肽」或「蛋白質」，其中兩個術語在本文中可互換使用。如在根據本發明之組中所提供之雜二聚體前體多肽包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈。因此，包含第一CH3域之第一多肽鏈與包含第二CH3域之第二多肽鏈「締合」以形成二聚體多肽。由於第一CH3域及第二CH3域包含根據杵臼技術之胺基酸取代，因此兩條多肽鏈形成「雜二聚體」，亦即由兩條不相同的多肽形成的二聚體。
雜二聚體多肽中包含之多肽鏈，亦即雜二聚體前體多肽及雜二聚體產物多肽，包含一或兩個多肽域。當在本文中指示多肽域之順序時，其在N端至C端方向上指示。
各雜二聚體前體多肽包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈。
倘若兩個雜二聚體前體多肽中存在之抗原結合部分為抗體衍生之抗原結合位點，例如抗體片段，則包含CH3域之多肽鏈在本文中亦稱為「重鏈多肽」。在此情況下，雜二聚體前體多肽亦可包含「輕鏈多肽」，其通常包含抗體可變域及抗體恆定域，例如VL及CL。
本發明提供包含至少兩個多肽之組。該組包含至少兩個雜二聚體「前體」多肽。當使前體多肽反應以彼此進行多肽鏈交換時，形成「產物」多肽。本發明亦提供藉由使至少兩個雜二聚體前體多肽接觸來製造雜二聚體多肽，亦即雜二聚體產物多肽的方法。接觸步驟可在允許多肽鏈交換之任何適當條件下進行，較佳在適當緩衝溶液中進行。當在本文中結合本發明提及時，「多肽鏈交換」意謂在兩個雜二聚體(前體)多肽之間交換包含CH3域之多肽鏈。當兩條最初締合之包含來自前體多肽之CH3域的多肽鏈解離，且解離之多肽鏈中之至少一者藉由與同樣解離之包含衍生自另一前體多肽之CH3域的多肽鏈締合形成新的雜二聚體時，發生多肽鏈交換。多肽鏈交換之機制亦指示於圖1、2及3中。
「經分離之」雜二聚體多肽，例如抗體，為已與其天然環境之組分分離的雜二聚體多肽。在一些實施例中，抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評定抗體純度之方法的綜述，參見例如Flatman等人, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
如本文所用，重鏈及輕鏈之所有恆定區及域的胺基酸位置係根據Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)中所述之Kabat編號系統進行編號。特定言之，對於可變域以及κ及λ同型之輕鏈恆定域CL，使用Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)之Kabat編號系統(參見第647-660頁)，對於恆定重鏈域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3)，使用Kabat EU索引編號系統(參見第661-723頁)。本文提供之胺基酸位置通常藉由指定
多肽鏈內之胺基酸「取代」或「置換」或「突變」(所有術語在本文中可互換使用)係藉由將適當的核苷酸變化引入抗體DNA或藉由核苷酸合成來製備。然而，此類修飾僅可在非常有限的範圍內進行。舉例而言，修飾不改變上述抗體特徵，諸如IgG同型及抗原結合，但可進一步提高重組生產之產量、蛋白質穩定性或有助於純化。在某些實施例中，提供具有一或多個保守胺基酸取代之抗體變異體。如本文所提及，「雙突變」意謂兩個指定胺基酸取代存在於各別多肽鏈中。
如本文所用，術語「胺基酸」表示具有位於羧基α位之胺基部分的有機分子。胺基酸之實例包括：精胺酸、甘胺酸、鳥胺酸、離胺酸、組胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、異白胺酸、白胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、脯胺酸。所採用之胺基酸在各情況下視情況為L型。術語「帶正電荷」或「帶負電荷」之胺基酸係指在pH 7.4下之胺基酸側鏈電荷。胺基酸可根據共同的側鏈特性分組： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Tyr、Phe； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性或帶負電荷：Asp、Glu； (4)鹼性或帶正電荷：His、Lys、Arg； (5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；表 - 具有特定特性之胺基酸
胺基酸 3 字母 1 字母 側鏈極性 側鏈電荷(pH 7.4)
丙胺酸 Ala A 非極性 中性
精胺酸 Arg R 鹼性極性 正
天冬醯胺 Asn N 極性 中性
天冬胺酸 Asp D 酸性極性 負
半胱胺酸 Cys C 非極性 中性
麩胺酸 Glu E 酸性極性 負
麩醯胺酸 Gln Q 極性 中性
甘胺酸 Gly G 非極性 中性
組胺酸 His H 鹼性極性 正 (10%) 中性 (90%)
異白胺酸 Ile I 非極性 中性
白胺酸 Leu L 非極性 中性
離胺酸 Lys K 鹼性極性 正
甲硫胺酸 Met M 非極性 中性
苯丙胺酸 Phe F 非極性 中性
脯胺酸 Pro P 非極性 中性
絲胺酸 Ser S 極性 中性
蘇胺酸 Thr T 極性 中性
色胺酸 Trp W 非極性 中性
酪胺酸 Tyr Y 極性 中性
纈胺酸 Val V 非極性 中性
如本文所用，「標籤部分」為出於各種目的(例如支持純化)基因接枝於多肽鏈上之肽序列。在一個實施例中，標籤部分為親和標籤。因此，包含該親和標籤之多肽可經由適當的親和技術，例如藉由親和層析純化。通常，標籤部分經由肽連接體與CH3域之C端融合。通常，肽連接體由可撓性胺基酸殘基如甘胺酸及絲胺酸構成。因此，用於將標籤部分融合至多肽之典型肽連接體為甘胺酸-絲胺酸連接子，亦即由甘胺酸及絲胺酸殘基之模式組成的肽連接體。
如本文所用，術語「經純化」係指多肽自天然環境或重組生產之來源中移出，或以其他方式分離，且至少60%、例如至少80%不含其他組分，例如與其天然締合之膜及微粒體。藉由標準技術，包括鹼性/SDS處理、CsCl帶、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中眾所周知的其他技術進行抗體純化(自宿主細胞培養物回收抗體)，以消除細胞組分或其他污染物，例如其他細胞核酸或蛋白質。參見Ausubel, F.等人, 編 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)。不同的方法在蛋白質純化方面沿用已久且得到廣泛的應用，諸如使用微生物蛋白質進行親和層析(例如使用親和介質純化κ或λ同型恆定輕鏈域，例如KappaSelect或LambdaSelect)、離子交換層析(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(胺基乙基樹脂)及混合模式交換)、親硫吸附(例如使用β-巰基乙醇及其他SH配體)、疏水性相互作用或芳族吸附層析(例如使用苯基-瓊脂糖、氮雜-親脂性樹脂或間胺基苯基
Figure 109113953-A0101-12-0030-1
酸)、金屬螯合劑親和層析(例如使用Ni(II)-及Cu(II)-親和材料)、尺寸排阻層析及電泳方法(諸如凝膠電泳、毛細管電泳) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。
包含標籤部分之多肽可經由「標籤特異性親和層析」來純化。用於標籤之適當純化方法為此項技術中已知的。因此，包含聚(his)標籤之多肽可例如經由金屬螯合劑親和層析，尤其鎳螯合劑親和層析來純化。
如本文所用，術語「肽連接體」表示具有胺基酸序列之肽，其較佳為合成來源的。在用於本發明之雜二聚體多肽內，肽連接體可用於將額外的多肽域，如抗體片段融合至單個多肽鏈之C端或N端。在一個實施例中，該等肽連接體為具有長度為至少5個胺基酸之胺基酸序列的肽，在另一個實施例中長度為5至100個胺基酸，在另一個實施例中為10至50個胺基酸。在一個實施例中，肽連接體為甘胺酸-絲胺酸連接子。在一個實施例中，肽連接體為由甘胺酸及絲胺酸胺基酸殘基組成之肽。在一個實施例中，該肽連接體為 (Gx S)n 或(Gx S)n Gm 其中G =甘胺酸，S =絲胺酸，且 x = 3，n= 3、4、5或6，m= 0、1、2或3；或 x = 4，n= 2、3、4或5，m= 0、1、2或3。
在一個實施例中，x = 4且n= 2或3，在另一個實施例中，x = 4，n= 2。在一個實施例中，該肽連接體為(G4 S)2 。
如本文所用，術語「價」表示抗原結合分子中存在指定數目之結合位點。天然抗體例如具有兩個結合位點且為二價的。因此，術語「三價」表示抗原結合分子中存在三個結合位點。
根據本發明之多肽係藉由重組方式產生。重組生產多肽(例如抗體)之方法為目前先進技術中廣泛已知的，且包含在原核及真核宿主細胞中進行蛋白質表現，隨後分離多肽且通常純化至醫藥學上可接受之純度。為了在宿主細胞中表現上述多肽，藉由標準方法將編碼各別多肽鏈之核酸插入表現載體中。在適當的原核或真核宿主細胞中進行表現，如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母或大腸桿菌細胞，且自細胞回收多肽(上清液或溶解後之細胞)。重組生產多肽(例如抗體)之一般方法為目前先進技術中眾所周知的，且描述於例如以下綜述文章中：Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202；Geisse, S.等人, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282；Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161；Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880。
由宿主細胞產生之多肽可自在C端包含CH3域之多肽鏈的C端轉譯後裂解一或多個，尤其一或兩個胺基酸。因此，由宿主細胞藉由表現編碼此類多肽鏈之特定核酸分子產生的多肽可包括全長多肽鏈，該全長多肽鏈包括全長CH3域，或其可包括全長多肽鏈之裂解變異體(在本文中亦稱為裂解之變異多肽鏈)。此可為重鏈之最後兩個C端胺基酸為甘胺酸(G446)及離胺酸(K447)之情況。
在本文中可互換使用之「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸的聚合物，包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中之受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。核苷酸序列可雜有非核苷酸組分。聚核苷酸可包含合成後進行之修飾，諸如與標記結合。其他類型之修飾包括例如「帽」；用類似物取代天然存在之核苷酸中之一或多者；核苷酸間修飾，諸如彼等具有不帶電鍵(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之修飾，彼等含有諸如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)之側接部分之修飾，彼等具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)之修飾，彼等含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)之修飾，彼等含有烷基化劑之修飾，彼等具有修飾鍵(例如α變旋異構核酸等)之修飾，以及未修飾形式之聚核苷酸。此外，通常存在於糖中之任何羥基可例如由膦酸酯基、磷酸酯基置換，由標準保護基保護，或經活化以製備與額外核苷酸之額外鍵聯，或可結合至固體或半固體支撐物。5'及3'端OH可經磷酸化或經1至20個碳原子之胺或有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知的核糖或去氧核糖之類似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基-、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)、哌喃醣、呋喃醣、景天庚酮糖、非環類似物及鹼基核苷類似物(諸如甲基核糖苷)。一或多個磷酸二酯鍵可經替代性鍵聯基團置換。此等替代性鍵聯基團包括但不限於其中磷酸酯基經P(O)S (硫代酸酯基」)、P(S)S (「二硫代酸酯基」)、(O)NR2 (「醯胺酯基」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2 (「甲縮醛」)置換，其中各R或R'獨立地為H或視情況含有醚(-O-)鍵之經取代或未經取代之烷基(1-20 C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳醛基。聚核苷酸中並非所有鍵均需要相同。前面的描述適用於本文所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
「經分離之」核酸係指已與其天然環境之組分分離的核酸分子。經分離之核酸包括通常含有該核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置。
「編碼雜二聚體多肽之經分離之核酸」係指編碼該雜二聚體多肽之一或多條多肽鏈(或其片段)的一或多個核酸分子，包括在單個載體或單獨載體中之此類核酸分子，及存在於宿主細胞中之一或多個位置的此類核酸分子。
如本文所用，術語「載體」係指能夠傳播與其連接之另一核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入已引入其之宿主細胞之基因組中的載體。該術語包括主要用於將DNA或RNA插入細胞(例如染色體整合)之載體、主要用於DNA或RNA複製之載體的複製及用於DNA或RNA轉錄及/或轉譯之表現載體。亦包括提供不止一種所述功能之載體。
「表現載體」為能夠指導與其可操作地連接之核酸之表現的載體。當表現載體引入適當宿主細胞中時，其可經轉錄且轉譯成多肽。當在根據本發明之方法中轉型宿主細胞時，使用「表現載體」；因此，如本文所述與宿主細胞轉型有關之術語「載體」意謂「表現載體」。「表現系統」通常係指由表現載體構成之適合的宿主細胞，該表現載體可用以產生所需表現產物。
如本文所用，「表現」係指核酸經轉錄成mRNA之過程及/或經轉錄之mRNA(亦稱為轉錄物)隨後轉譯成肽或多肽之過程。轉錄物及編碼之多肽單獨或共同稱為基因產物。若核酸衍生自基因組DNA，則在真核細胞中之表現可包括相應mRNA之剪接。
如本文所用，術語「轉型」係指將載體或核酸轉移至宿主細胞中之過程。若沒有強大細胞壁屏障之細胞用作宿主細胞，則例如藉由如Graham及Van der Eh, Virology 52 (1978) 546ff所述之磷酸鈣沈澱方法進行轉染。然而，亦可使用其他諸如藉由核注射或藉由原生質體融合將DNA引入細胞之方法。若使用原核細胞或含有實質細胞壁結構之細胞，則例如一種轉染方法為如Cohen, F.N等人, PNAS 69 (1972) 7110 et seq所述之使用氯化鈣的鈣處理。
如本申請案中所用，術語「宿主細胞」表示可經工程改造以製造本發明提供之多肽的任何種類的細胞系統。
如本文所用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養」可互換使用，且所有此類名稱均包括後代。因此，詞語「轉型體」及「轉型細胞」包括原生個體細胞及自其衍生之培養物，而與轉移次數無關。亦應理解，由於有意或無意突變，所有後代之DNA含量可能不完全相同。包括具有與最初轉型細胞中篩選之功能或生物活性相同的功能或生物活性的變異後代。若意欲使用不同名稱，將自上下文清楚地看出。
短暫表現係由例如Durocher, Y., 等人, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9描述。可變域之選殖係由Orlandi, R.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837；Carter, P.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及Norderhaug, L.等人, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87描述。較佳的短暫表現系統(HEK 293)係由Schlaeger, E.-J.及Christensen, K., 在Cytotechnology 30 (1999) 71-83中及由Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199描述。
術語「醫藥組合物」係指呈准許其中所含活性成分之生物活性有效之形式且不含有對該組合物將投與之個體具有不可接受之毒性的其他組分的製劑。本發明之醫藥組合物可藉由此項技術中已知的多種方法投與。如熟習此項技術者應瞭解，投藥途徑及/或模式將視所需結果而變化。為了藉由某些投藥途徑投與根據本發明之抗體，可能有必要用防止其不活化之材料包覆該抗體或與該抗體共同投與。舉例而言，雜二聚體多肽可在適當的載劑(例如脂質體)或稀釋劑中投與個體。醫藥學上可接受之稀釋劑包括生理鹽水及水性緩衝溶液。
醫藥組合物包含有效量之本發明提供之雜二聚體多肽。藥劑例如雜二聚體多肽之「有效量」係指在所需劑量及時間段內有效達成所需治療或預防結果之量。特定言之，「有效量」表示當向個體投與本發明之雜二聚體多肽時，(i)治療或預防特定疾病、病況或病症，(ii)減輕、改善或消除特定疾病、病況或病症之一或多種症狀，或(iii)預防或延遲本文所述之特定疾病、病況或病症之一或多種症狀發作之量。治療有效量將視所用雜二聚體多肽分子、所治療之疾病狀態、所治療疾病之嚴重程度、個體之年齡及相對健康狀況、投藥途徑及形式、主治醫學或獸醫學從業者之判斷及其他因素而變化。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外之對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括生理上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，及其類似物。在一個較佳實施例中，載劑適用於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投藥(例如藉由注射或輸注)。
根據本發明之醫藥組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。防止微生物之存在可藉由滅菌程序(見上文)及藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其類似物)來確保。亦可能需要在組合物中包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可藉由包括延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來實現可注射醫藥形式之延長吸收。
如本文所用，片語「非經腸投藥」及「非經腸投與」意謂除經腸及局部投藥以外的投藥模式，通常藉由注射，且包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
無論選擇何種投藥途徑，可以適合之水合形式使用之本發明化合物及/或本發明之醫藥組合物係藉由熟習此項技術者已知的習知方法成醫藥學上可接受之劑型。
本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量濃度可有所變化，以獲得在對患者無毒性之情況下有效地達成特定患者、組合物及投藥模式之所需治療反應的活性成分之量。所選劑量濃度將視多種藥物動力學因素而定，包括所採用之本發明之特定組合物的活性；投藥途徑；投藥時間；所採用之特定化合物的排泄率；治療持續時間；與所採用之特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料；所治療之患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況及先前病史；及醫學技術中熟知之類似因素。
組合物必須為無菌的，且流動性達到組合物可藉由注射器遞送的程度。除水之外，在一個實施例中，載劑為等張緩衝鹽水溶液。
舉例而言，可藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散液之情況下維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。在許多情況下，組合物中較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)及氯化鈉。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其文法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床介入且可出於防治目的或在臨床病理學之病程期間進行。理想的治療效果包括但不限於預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性結果、預防癌轉移、減緩疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明之抗體用於延遲疾病發展或減慢疾病進展。
「個體(individual/subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於家養動物(例如牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體(individual/subject)為人類。
2.  本發明實施例之詳細描述  本發明提供適用於例如藉由多肽鏈交換活體外製造產物多肽的前體多肽。各前體多肽包含一對CH3域，其排列於經由該等CH3域彼此締合之兩條單獨的多肽鏈上。該等CH3域包含數個胺基酸取代。因此，包含前體多肽中之CH3域的兩條多肽鏈形成雜二聚體。本發明提供之前體多肽的CH3域包含至少兩種模式之突變，其具有不同的功能。第一種模式之突變為支持該兩條包含CH3域之多肽鏈之雜二聚化的突變，亦即杵臼突變。因此，前體多肽之一個CH3域包含杵突變且前體多肽之另一個CH3域包含臼突變。第二種模式之突變為僅在前體多肽之雜二聚體中所涉及之一個CH3域中提供的一或多個突變，其中該突變使包含CH3域之兩個多肽的相互作用不穩定。因此，各前體多肽包含一個具有去穩定化突變之CH3域，其經選擇及排列以使其在前體多肽之間的多肽鏈交換後支持產物多肽的正確組裝。
前體多肽  在一個態樣中，本發明提供一種雜二聚體前體多肽集合，其包含： a)     第一雜二聚體前體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變， 其中該第一雜二聚體前體多肽包含第一抗原結合部分，其中該第一抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上，及 b)     第二雜二聚體前體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變， 其中該第二雜二聚體前體多肽包含第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上， 其中 A)    i)在該第一雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈包含該第一抗原結合部分之至少一部分，而在該第二雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈包含該第二抗原結合部分之至少一部分，或ii)在該第一雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈包含該第一抗原結合部分之至少一部分，而在該第二雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈包含該第二抗原結合部分之至少一部分；且其中 B)     i)該第一雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域及該第二雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域，或 ii)該第一雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域及該第二雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域 包含使CH3/CH3介面不穩定之胺基酸取代，其中該胺基酸取代經排列以使得經取代之胺基酸在一對該等CH3域內之CH3/CH3介面中相互作用。
在一個態樣中，本發明提供一種雜二聚體前體多肽集合，其包含： a)     第一雜二聚體前體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變， 其中該第一雜二聚體前體多肽包含第一抗原結合部分，其中該第一抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上，及 b)     第二雜二聚體前體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變， 其中該第二雜二聚體前體多肽包含第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上， 其中 A)    i)在該第一雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈包含該第一抗原結合部分之至少一部分，而在該第二雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈包含該第二抗原結合部分之至少一部分，或ii)在該第一雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈包含該第一抗原結合部分之至少一部分，而在該第二雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈包含該第二抗原結合部分之至少一部分；且其中 B)     i)該第一雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域及該第二雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域，或 ii)該第一雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域及該第二雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域 包含以下胺基酸取代(其在本文中亦稱為「去穩定化突變」)，其中編號係根據Kabat編號系統： -  具有臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： o 用疏水性胺基酸置換S354； o 用帶正電荷之胺基酸置換D356； o 用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； o 用帶正電荷之胺基酸置換D356，且用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； o 用疏水性胺基酸置換S364； o 用疏水性胺基酸置換A368； o 用帶負電荷之胺基酸置換E392； o 用疏水性胺基酸置換T394； o 用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換S400； o 用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換F405； o 用疏水性胺基酸置換V407；及 o 用帶負電荷之胺基酸置換K409；及 o 用帶負電荷之胺基酸置換K439； -  具有杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： o 用帶正電荷之胺基酸置換Q347，且用帶負電荷之胺基酸置換K360； o 用帶負電荷之胺基酸置換Y349； o 用疏水性胺基酸置換L351，且用疏水性胺基酸置換E357； o 用疏水性胺基酸置換S364； o 用疏水性胺基酸置換W366，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； o 用疏水性胺基酸置換L368； o 用帶負電荷之胺基酸置換K370； o 用帶負電荷之胺基酸置換K370，且用帶負電荷之胺基酸置換K439； o 用帶負電荷之胺基酸置換K392； o 用疏水性胺基酸置換T394； o 用疏水性胺基酸置換V397； o 用帶正電荷之胺基酸置換D399，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； o 用帶正電荷之胺基酸置換S400； o F405W； o Y407W；及 o 用帶負電荷之胺基酸置換K439。
在另一態樣中，本發明提供第一雜二聚體前體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變，其中該第一雜二聚體前體多肽包含第一抗原結合部分，其中該第一抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上；且其中CH3域中之一者(而非另一CH3域)包含以下胺基酸取代(亦即去穩定化突變)，其中編號係根據Kabat編號系統： -  具有臼突變之CH3域包含至少一個胺基酸取代，亦即去穩定化突變，其選自以下之群：用疏水性胺基酸置換S354；用帶正電荷之胺基酸置換D356；用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357；用帶正電荷之胺基酸置換D356，且用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357；用疏水性胺基酸置換S364；用疏水性胺基酸置換A368；用帶負電荷之胺基酸置換E392；用疏水性胺基酸置換T394；用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換S400；用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換F405；用疏水性胺基酸置換V407；及用帶負電荷之胺基酸置換K409；及用帶負電荷之胺基酸置換K439；或 -  具有杵突變之CH3域包含至少一個胺基酸取代，亦即去穩定化突變，其選自以下之群：用帶正電荷之胺基酸置換Q347，且用帶負電荷之胺基酸置換K360；用帶負電荷之胺基酸置換Y349；用疏水性胺基酸置換L351，且用疏水性胺基酸置換E357；用疏水性胺基酸置換S364；用疏水性胺基酸置換W366，且用帶負電荷之胺基酸置換K409；用疏水性胺基酸置換L368；用帶負電荷之胺基酸置換K370；用帶負電荷之胺基酸置換K370，且用帶負電荷之胺基酸置換K439；用帶負電荷之胺基酸置換K392；用疏水性胺基酸置換T394；用疏水性胺基酸置換V397；用帶正電荷之胺基酸置換D399，且用帶負電荷之胺基酸置換K409；用帶正電荷之胺基酸置換S400；F405W；Y407W；及用帶負電荷之胺基酸置換K439。
在另一態樣中，本發明提供第二雜二聚體前體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變，其中該第二雜二聚體前體多肽包含第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上；且其中CH3域中之一者(而非另一CH3域)包含以下胺基酸取代(亦即去穩定化突變)，其中編號係根據Kabat編號系統： -  具有臼突變之CH3域包含至少一個胺基酸取代，亦即去穩定化突變，其選自以下之群：用疏水性胺基酸置換S354；用帶正電荷之胺基酸置換D356；用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357；用帶正電荷之胺基酸置換D356，且用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357；用疏水性胺基酸置換S364；用疏水性胺基酸置換A368；用帶負電荷之胺基酸置換E392；用疏水性胺基酸置換T394；用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換S400；用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換F405；用疏水性胺基酸置換V407；及用帶負電荷之胺基酸置換K409；及用帶負電荷之胺基酸置換K439；或 -  具有杵突變之CH3域包含至少一個胺基酸取代，亦即去穩定化突變，其選自以下之群：用帶正電荷之胺基酸置換Q347，且用帶負電荷之胺基酸置換K360；用帶負電荷之胺基酸置換Y349；用疏水性胺基酸置換L351，且用疏水性胺基酸置換E357；用疏水性胺基酸置換S364；用疏水性胺基酸置換W366，且用帶負電荷之胺基酸置換K409；用疏水性胺基酸置換L368；用帶負電荷之胺基酸置換K370；用帶負電荷之胺基酸置換K370，且用帶負電荷之胺基酸置換K439；用帶負電荷之胺基酸置換K392；用疏水性胺基酸置換T394；用疏水性胺基酸置換V397；用帶正電荷之胺基酸置換D399，且用帶負電荷之胺基酸置換K409；用帶正電荷之胺基酸置換S400；F405W；Y407W；及用帶負電荷之胺基酸置換K439。
在另一態樣中，本發明提供根據本發明之第一雜二聚體前體多肽與根據本發明之第二雜二聚體多肽組合用於形成雜二聚體產物多肽之用途。在一個實施例中，根據本發明之第一雜二聚體前體多肽係用於與根據本發明之第二雜二聚體多肽組合，藉由多肽鏈交換而形成雜二聚體產物多肽。
在另一態樣中，本發明提供根據本發明之第二雜二聚體前體多肽與根據本發明之第一雜二聚體多肽組合用於形成雜二聚體產物多肽之用途。在一個實施例中，根據本發明之第二雜二聚體前體多肽係用於與根據本發明之第一雜二聚體多肽組合，藉由多肽鏈交換而形成雜二聚體產物多肽。
在本發明之另一態樣中，提供根據本發明之第一雜二聚體前體多肽在根據本發明之雜二聚體前體多肽集合中之用途。在本發明之另一態樣中，提供根據本發明之第二雜二聚體前體多肽在根據本發明之雜二聚體前體多肽集合中之用途。
本發明之另一態樣為根據本發明之第一雜二聚體前體多肽在製造根據本發明雜二聚體多肽之方法中之用途。本發明之另一態樣為根據本發明之第二雜二聚體前體多肽在製造根據本發明雜二聚體多肽之方法中之用途。
本發明之另一態樣為根據本發明之第一雜二聚體前體多肽在鑑別根據本發明多特異性雜二聚體多肽之方法中之用途。本發明之另一態樣為根據本發明之第二雜二聚體前體多肽在鑑別根據本發明多特異性雜二聚體多肽之方法中之用途。
本發明之另一態樣為根據本發明之雜二聚體前體多肽集合在製造根據本發明雜二聚體多肽之方法中之用途。本發明之另一態樣為根據本發明之雜二聚體前體多肽集合在鑑別根據本發明多特異性雜二聚體多肽之方法中之用途。
在一個實施例中，以下適用於第一及第二雜二聚體前體多肽： -  倘若具有杵突變之CH3域包含突變E357K，則具有臼突變之CH3域不包含突變K370E；及 -  倘若具有杵突變之CH3域包含突變D356K，則具有臼突變之CH3域不包含突變K439E。
換言之，根據本發明之一個實施例，以下適用於本發明提供之前體多肽： -  倘若具有杵突變之CH3域包含胺基酸取代E357K，則具有臼突變之CH3域在位置370處包含K；及 -  倘若具有杵突變之CH3域包含胺基酸取代D356K，則具有臼突變之CH3域在位置439處包含K。
在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽包含至少兩條(在一個實施例中正好兩條)包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者包含特異性結合至抗原之(第一)抗原結合部分的至少一部分；且其中該兩條包含CH3域之多肽鏈中之另一者不包含特異性結合至抗原之抗原結合部分。在一個實施例中，第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條(在一個實施例中正好兩條)包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者包含特異性結合至抗原之(第一)抗原結合部分的至少一部分；且其中該兩條包含CH3域之多肽鏈中之另一者不包含特異性結合至抗原之抗原結合部分。在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽包含至少兩條(在一個實施例中正好兩條)包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者包含特異性結合至抗原之(第一)抗原結合部分的至少一部分；且其中該兩條包含CH3域之多肽鏈中之另一者不包含特異性結合至抗原之抗原結合部分；第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條(在一個實施例中正好兩條)包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者包含特異性結合至抗原之(第一)抗原結合部分的至少一部分；且其中該兩條包含CH3域之多肽鏈中之另一者不包含特異性結合至抗原之抗原結合部分。換言之，根據本發明之此實施例，一或多個功能性抗原結合部分僅排列在兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上，而在另一條包含CH3域之多肽鏈上未排列功能性抗原結合部分。此多肽鏈在本文中亦稱為「虛設多肽」。在一個實施例中，虛設多肽僅與另一條包含CH3域之多肽鏈締合，亦即在雜二聚體中，但不與另一條(例如第三)多肽鏈締合。虛設多肽可包含抗原結合部分之部分，例如抗體可變域，其不參與雜二聚體前體多肽內之功能性抗原結合位點。此排列之一個優點為，例如包含CH3域之虛設多肽與包含CH3域之多肽鏈的組合，該多肽鏈參與形成一或多個功能性抗原結合位點，在多肽鏈交換後形成之產物多肽具有與雜二聚體前體分子不同的大小，其允許自未反應之前體多肽改良產物多肽。
如所指出，在雜二聚體前體多肽中之每一者中，包含CH3域之多肽鏈中之一者包含具有杵突變之CH3域，而另一條包含CH3域之多肽鏈包含具有臼突變之CH3域。在多肽鏈交換後，來自第一前體多肽之包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈與來自第二前體多肽之包含具有臼之CH3域的多肽鏈形成雜二聚體(亦即第一雜二聚體產物多肽)，且來自第一前體多肽之包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈與來自第二前體多肽之包含具有杵之CH3域的多肽鏈形成雜二聚體(亦即第二雜二聚體產物多肽)。
如所指出，包含於第一雜二聚體前體多肽中之一個CH3域包含一或多個如上文所指出之去穩定化突變，而包含於該第一雜二聚體前體多肽中之另一個CH3域不包含去穩定化突變；且包含於第二雜二聚體多肽中之一個CH3域包含一或多個如上文所指出之去穩定化突變，而包含於該第二雜二聚體前體多肽中之另一個CH3域不包含去穩定化突變。前體多肽中所存在之去穩定化突變經排列以使其在多肽鏈交換之後仍存在於同一產物多肽中。因此，在前體多肽中之一者中，一或多個去穩定化突變排列在包含杵突變之CH3域中，而在另一前體多肽中，一或多個去穩定化突變排列在包含臼突變之CH3域中。
在一個實施例中，在第一雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈包含第一抗原結合部分的至少一部分，且在第二雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈包含第二抗原結合部分的至少一部分。
在一個實施例中，在第一雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈包含第一抗原結合部分的至少一部分，且在第二雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈包含第二抗原結合部分的至少一部分。
在一個實施例中，雜二聚體前體多肽包含正好兩條包含CH3域之多肽鏈。
在一個實施例中，包含去穩定化突變之CH3域包含一個、兩個或三個去穩定化突變。在一個實施例中，包含去穩定化突變之CH3域包含一或兩個去穩定化突變。
本發明包括雜二聚體前體多肽，其中在具有杵突變之CH3域中，杵突變經去穩定化突變置換。舉例而言，去穩定化突變可排列在具有杵突變之CH3域中的位置366處，其為例如T366W。因此，此雜二聚體前體多肽在CH3域中之位置366處包含去穩定化突變，亦即疏水性胺基酸，而非色胺酸(W)。然而，具有此類取代之雜二聚體前體多肽視為由本發明所涵蓋。
另外，本發明包括雜二聚體前體多肽，其中在具有臼突變之CH3域中，一或多個突變經去穩定化突變置換。舉例而言，去穩定化突變可排列在具有臼突變之CH3域中的位置368處，其為例如T366S L368A Y407V。因此，此雜二聚體前體多肽在CH3域中之位置368處包含去穩定化突變，亦即另一種疏水性胺基酸，而非丙胺酸(A)。在另一個實例中，去穩定化突變可排列在具有臼突變之CH3域中的位置407處，其為例如T366S L368A Y407V。因此，此雜二聚體前體多肽在CH3域中之位置407處包含去穩定化突變，亦即另一種疏水性胺基酸，而非纈胺酸(V)。然而，具有此類一或多個取代之此類雜二聚體前體多肽視為由本發明所涵蓋。
在本發明之一個實施例中，在第一雜二聚體多肽之包含CH3域的兩條多肽鏈之間沒有形成鏈間二硫鍵。在本發明之一個實施例中，在第二雜二聚體多肽之包含CH3域的兩條多肽鏈之間沒有形成鏈間二硫鍵。在本發明之一個實施例中，在第一雜二聚體多肽及第二雜二聚體多肽之包含CH3域的兩條多肽鏈之間沒有形成鏈間二硫鍵。在包含CH3域的兩條多肽鏈之間沒有鏈間二硫鍵的雜二聚體前體多肽能夠在不存在還原劑的情況下進行多肽鏈交換。因此，在包含CH3域之多肽鏈之間不存在鏈間二硫鍵的雜二聚體前體多肽特別適合不可能或不希望有還原劑存在之應用上；例如療法中之應用。
A) CH3域中之胺基酸取代  本發明提供之前體多肽在其CH3域中包含胺基酸取代。
杵臼突變  在一個實施例中，包含於第一雜二聚體前體多肽中之杵突變與包含於第二雜二聚體前體多肽中之杵突變相同。
在一個實施例中，杵突變為T366W。在一個實施例中，臼突變為T366S L368A Y407V。
去穩定化突變  如上文所指出，各前體多肽僅一個CH3域包含一或多個去穩定化突變。
根據本發明，i)第一雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域及第二雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域，或ii)第一雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域及第二雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域包含一或多個去穩定化突變。第一及第二雜二聚體前體多肽內之一或多個去穩定化突變經選擇以使其在藉由前體多肽之間的多肽鏈交換形成之產物多肽的CH3/CH3介面中相互作用。
倘若雜二聚體前體多肽之包含杵突變的CH3域包含去穩定化突變，則該雜二聚體前體多肽之包含臼突變的CH3域不包含去穩定化突變。當CH3域「不包含去穩定化突變」時，其在同一類別之野生型免疫球蛋白CH3域中與包含於相應CH3域中之去穩定化突變位置處的胺基酸殘基相互作用的位置處包含野生型胺基酸殘基。
在本發明之一個實施例中，具有臼突變之CH3域包含至少一個胺基酸取代，亦即去穩定化突變，其選自以下之群：用疏水性胺基酸置換S354；用帶正電荷之胺基酸置換D356；用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357；用帶正電荷之胺基酸置換D356，且用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357；用疏水性胺基酸置換S364；用疏水性胺基酸置換A368；用帶負電荷之胺基酸置換E392；用疏水性胺基酸置換T394；用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換S400；用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換F405；用疏水性胺基酸置換V407；及用帶負電荷之胺基酸置換K409；及用帶負電荷之胺基酸置換K439；且具有杵突變之CH3域包含至少一個胺基酸取代，亦即去穩定化突變，其選自以下之群：用帶正電荷之胺基酸置換Q347，且用帶負電荷之胺基酸置換K360；用帶負電荷之胺基酸置換Y349；用疏水性胺基酸置換L351，且用疏水性胺基酸置換E357；用疏水性胺基酸置換S364；用疏水性胺基酸置換W366，且用帶負電荷之胺基酸置換K409；用疏水性胺基酸置換L368；用帶負電荷之胺基酸置換K370；用帶負電荷之胺基酸置換K370，且用帶負電荷之胺基酸置換K439；用帶負電荷之胺基酸置換K392；用疏水性胺基酸置換T394；用疏水性胺基酸置換V397；用帶正電荷之胺基酸置換D399，且用帶負電荷之胺基酸置換K409；用帶正電荷之胺基酸置換S400；F405W；Y407W；及用帶負電荷之胺基酸置換K439。
在一個實施例中，疏水性胺基酸係選自正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Tyr及Phe。在一個實施例中，疏水性胺基酸係選自Ala、Val、Leu、Ile及Tyr。在一個實施例中，疏水性胺基酸為Val、Leu或Ile。在一個實施例中，疏水性胺基酸為Leu或Ile。在一個實施例中，疏水性胺基酸為Leu。在一個實施例中，疏水性胺基酸為Tyr。在一個實施例中，疏水性胺基酸為Phe。
在一個實施例中，帶正電荷之胺基酸為His、Lys或Arg。在一個實施例中，帶正電荷之胺基酸為Lys或Arg。在一個實施例中，帶正電荷之胺基酸為Lys。
在一個實施例中，帶負電荷之胺基酸為Asp或Glu。在一個實施例中，帶負電荷之胺基酸為Asp。在一個實施例中，帶負電荷之胺基酸為Glu。
發現在CH3域中之指定胺基酸位置處用具有各別側鏈特性之胺基酸進行胺基酸取代支持由兩個前體多肽進行多肽鏈交換及形成產物多肽。
在本發明之一個實施例中，具有臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：S354V、S354I、S354L、D356K、D356R、E357K、E357R、E357F、S364L、S364I、A368F、K392D、K392E、T394L、T394I、V407Y、K409E、K409D、K439D、K439E及雙突變D399A S400K、D399A S400R、D399A F405W；而具有杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：Y349E、Y349D、S364V、S364I、S364L、L368F、K370E、K370D、K392E、K392D、T394L、T394I、V397Y、S400K、S400R、F405W、Y407W、K349E、K439D及雙突變Q347K K360E、Q347R K360E、Q347K K360D、Q347R K360D、L351F E357F、W366I K409E、W366L K409E、W366K K409D、W366L K409D、D399K K409E、D399R K409E、D399K K409D及D399K K409E。
在本發明之一個實施例中，具有臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：S354V、D356K、E357K、E357F、S364L、A368F、K392E、T394I、V407Y、K409E、K439E及雙突變D399A S400K；而具有杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：Y349E、S364V、L368F、K370E、K392D、T394I、V397Y、S400K、F405W、Y407W、K349E及雙突變Q347K K360E、L351F E357F、W366I K409E及D399K K409E。
在本發明之一個實施例中，具有臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：D356K、D356R、E357K、E357R、E357F、S364L、S364I、V407Y、K409E、K409D及雙突變D399A S400K、D399A S400R；而具有杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：Y349E、Y349D、K370E、K370D、K392E、K392D、T394L、T394I、V397Y、F405W、Y407W、K349E、K439D及雙突變Q347K K360E、Q347R K360E、Q347K K360D、Q347R K360D、W366I K409E、W366L K409E、W366K K409D、W366L K409D、D399K K409E、D399R K409E、D399K K409D及D399K K409E。
在本發明之一個實施例中，具有臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：D356K、E357K、E357F、S364L、V407Y、K409E及雙突變D399A S400K；而具有杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：Y349E、K370E、K392D、T394I、V397Y、F405W、Y407W、K349E及雙突變Q347K K360E、W366I K409E及D399K K409E。
在本發明之一個實施例中，包含去穩定化突變之具有臼突變之CH3域及具有杵突變之CH3域包含選自下表中指示之群的胺基酸取代中之一者：
包含臼突變之CH3 域 包含杵突變之CH3 域
D356K K370E K439E
D356K E357K Y349E
D356K E357K W366I K409E
D356K E357K K370E K439E
D356K E357K K392D
D356K E357K T394I
D356K E357K D399K K409E
D356K E357K F405W
D356K E357K Y407W
E357K Y349E
E357K W366I K409E
E357K K370E K439E
E357K T394I
E357K D399K K409E
E357K F405W
E357K Y407W
E357F Q347K K360E
E357F Y349E
E357F W366I K409E
E357F K370E K439E
E357F T394I
E357F D399K K409E
E357F Y407W
S364L Y349E
S364L K392D
S364L F405W
S364L W366I K409E
S364L K370E K439E
S364L T394I
S364L D399K K409E
S364L Y407W
A368F T394I
D399A S400K W366I K409E
D399A S400K T394I
V407Y Q347K K360E
V407Y Y349E
V407Y W366I K409E
V407Y T394I
V407Y D399K K409E
V407Y F405W
V407Y Y407W
V407Y K392D
K409E Y349E
K409E W366I K409E
K409E K392D
K409E T394I
K409E D399K K409E
K409E F405W
K409E Y407W
為了清楚起見，此表應理解為包含臼突變之CH3域包含如上表第一行中所指示之去穩定化突變，包含杵突變之CH3域包含上表右行中所列之去穩定化突變，在同一列中指示。
在本發明之一個實施例中，包含去穩定化突變之具有臼突變之CH3域及具有杵突變之CH3域包含選自下表中指示之群的胺基酸取代中之一者：
包含臼突變之CH3 域 包含杵突變之CH3 域
V407Y K370E
V407Y K370E K439E
V407Y V397Y
S364L K439E
S364L W366I K409E
S364L K370E K439E
S364L D399K K409E
S364L T394I
S364L W366I K409E
S364L K370E K439E
S364L D399K K409E
S364L T394I
在本發明之一個實施例中，包含去穩定化突變之具有臼突變之CH3域及具有杵突變之CH3域包含選自下表中指示之群的胺基酸取代中之一者：
包含臼突變之CH3 域 包含杵突變之CH3 域
T394I E357F Y349E Y407W
S364L E357F Y349E Y407W
E357K T394I Y349E K439E
E357K T394I Y349E W366I K409E
D356K V407Y W366I K409E F405W
S364L E357F W366I K409E K439E
T394I E357F W366I K409E K439E
S364L D356K W366I K409E K439E
D356K V407Y T394I F405W
S364L D356K T394I F405W
在本發明之一個實施例中，包含去穩定化突變之具有臼突變之CH3域及具有杵突變之CH3域包含選自下表中指示之群的胺基酸取代中之一者：
包含臼突變之CH3 域 包含杵突變之CH3 域
E357F S364L K370E K439E
E357F S364L Y349E W366I K409D
E357F S364L Y349E K439E
D356K V407Y K370E K439E
E357F S364L Y407W
D356K V407Y Y349E W366I K409D
E357F S364L Y349E Y407W
D356K V407Y Y349E K439E
E357F S364L W366I F405W K409D
E357F S364L D399K K409E
D356K V407Y W366I K409D K439E
S364I Y349E K439E
D356K V407Y D399K K409E
D356K V407Y W366I K409D
D356K V407Y T394I F405W
V407Y D399K K409E
E357K T394I D399K K409E
E357K T394I W366I K409D
為了清楚起見，此表應理解為包含臼突變之CH3域包含如上表第一行中所指示之去穩定化突變，包含杵突變之CH3域包含上表右行中所列之去穩定化突變，在同一列中指示。具有此去穩定化突變組合之前體分子表現出特別有益的多肽鏈交換。
在本發明之一個實施例中，包含去穩定化突變之具有臼突變之CH3域及具有杵突變之CH3域包含選自下表中指示之群的胺基酸取代中之一者：
包含臼突變之CH3 域 包含杵突變之CH3 域
E357F S364L Y349D
S364A Y349D
E357F S364L Y407W
E357F S364L Y349E
S364A Y349E
E357F S364L W336I F405W K409D
S364A W336I F405W K409D
E357F S364L D399K K409E
S364A D399K K409E
S364I Y349D
S364I Y407W
S364I Y349E
S364I W336I F405W K409D
S364L Y349D
S364I D399K K409E
S364L Y407W
K409E Y349D
S364L Y349E
S364L W336I F405W K409D
K409E Y407W
K409E Y349E
S364L D399K K409E
K409E W336I F405W K409D
K409E D399K K409E
為了清楚起見，此表應理解為包含臼突變之CH3域包含如上表第一行中所指示之去穩定化突變，包含杵突變之CH3域包含上表右行中所列之去穩定化突變，在同一列中指示。具有此去穩定化突變組合之前體分子表現出特別有益的多肽鏈交換，同時可以高產率生產。
半胱胺酸突變  在本發明之一個實施例中，雜二聚體前體多肽之CH3域包含第三種模式之突變，亦即由半胱胺酸取代CH3/CH3介面中之不同胺基酸，以允許在相互作用的位置具有半胱胺酸取代之兩個CH3域之間形成鏈間二硫鍵。
因此，在本發明之一個實施例中，i)第一雜二聚體前體多肽之包含杵突變的CH3域包含半胱胺酸突變，而第二雜二聚體前體多肽之包含臼突變的CH3域包含半胱胺酸突變，或ii)第一雜二聚體前體多肽之包含臼突變的CH3域包含半胱胺酸突變，而第二雜二聚體前體多肽之包含杵突變的CH3域包含半胱胺酸突變。換言之，在一個實施例中，i)在第一雜二聚體多肽內，包含杵突變之CH3域包含半胱胺酸突變，而包含臼突變之CH3域不包含半胱胺酸突變，且在第二雜二聚體多肽內，包含杵突變之CH3域不包含半胱胺酸突變，而包含臼突變之CH3域包含半胱胺酸突變，或ii)在第一雜二聚體多肽內，包含杵突變之CH3域不包含半胱胺酸突變，而包含臼突變之CH3域包含半胱胺酸突變，且在第二雜二聚體多肽內，包含杵突變之CH3域包含半胱胺酸突變，而包含臼突變之CH3域不包含半胱胺酸突變。
在一個實施例中，i)第一雜二聚體前體多肽之包含杵突變的CH3域包含第一半胱胺酸突變，而第二雜二聚體前體多肽之包含臼突變的CH3域包含第二半胱胺酸突變，或ii)第一雜二聚體前體多肽之包含臼突變的CH3域包含第一半胱胺酸突變，而第二雜二聚體前體多肽之包含杵突變的CH3域包含第二半胱胺酸突變，其中第一及第二半胱胺酸突變係選自以下對：
第一半胱胺酸突變 第二半胱胺酸突變
D399C K392C
Y349C S354C
Y349C E356C
Y349C E357C
L351C S354C
T394C V397C
在一個實施例中，第一半胱胺酸突變為Y349C，第二半胱胺酸突變為S354C。
在本發明之一個實施例中，i)第一雜二聚體前體多肽之包含杵突變的CH3域包含取代S354C，而第二雜二聚體前體多肽之包含臼突變的CH3域包含取代Y349C，或ii)第一雜二聚體前體多肽之包含臼突變的CH3域包含取代Y349C，而第二雜二聚體前體多肽之包含杵突變的CH3域包含取代S354C。
在本發明之一個實施例中，在第一雜二聚體前體多肽內，包含杵突變之CH3域包含取代S354C，而包含臼突變之CH3域在位置349處包含Y；且其中在第二雜二聚體前體多肽內，包含臼突變之CH3域包含取代Y349C，而包含杵突變之CH3域在位置354處包含S。
在本發明之一個實施例中，i)第一雜二聚體前體多肽之包含杵突變的CH3域包含取代T366W S354C，而第二雜二聚體前體多肽之包含臼突變的CH3域包含取代T366S L368A Y407V Y349C，或ii)第一雜二聚體前體多肽之包含臼突變的CH3域包含取代T366S L368A Y407V Y349C，而第二雜二聚體前體多肽之包含杵突變的CH3域包含取代T366W S354C。
在本發明之一個實施例中，在第一雜二聚體前體多肽內，包含杵突變之CH3域包含取代T366W S354C，而包含臼突變之CH3域在位置349處包含Y且包含取代T366S L368A Y407V；且其中在第二雜二聚體前體多肽內，包含臼突變之CH3域包含取代T366S L368A Y407V Y349C，而包含杵突變之CH3域在位置354處包含S且包含取代T366W。
在本發明之一個實施例中，雜二聚體前體多肽之CH3域不包含鏈間二硫鍵。
B)抗原結合部分  在本發明之一個實施例中，抗原結合部分為特異性結合至抗原之多肽。在一個實施例中，抗原結合部分係選自能夠特異性結合至抗原之抗體、受體、配體及DARPin。
在本發明之一個實施例中，包含於根據本發明之(前體)多肽中之抗原結合部分為抗體片段。
在本發明之一個實施例中，抗原結合部分包含一對VH域及VL域，其形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點。
在本發明之一個實施例中，包含於根據本發明之(前體)多肽中之抗體片段為選自Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、雙功能抗體、scFv及scFab之群的抗體片段。在一個實施例中，包含於根據本發明之(前體)多肽中之抗體片段為Fv或Fab。
在本發明之一個實施例中，抗原結合部分為Fab片段。
在本發明之一個實施例中，第一抗原結合部分為第一Fab片段，第二抗原結合部分為第二Fab片段。在本發明之一個實施例中，第一Fab片段、第二Fab片段或第一及第二Fab片段兩者係藉由域交叉而改變，使得： a)     僅CH1及CL域相互置換； b)     僅VH及VL域相互置換；或 c)     CH1及CL域相互置換，且VH及VL域相互置換。
在本發明之一個實施例中，抗原結合部分為Fv片段。在本發明之一個實施例中，第一抗原結合部分為第一Fv片段，第二抗原結合部分為第二Fv片段。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽之抗原結合部分及第二雜二聚體前體多肽之抗原結合部分結合至相同的抗原。在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽之抗原結合部分及第二雜二聚體前體多肽之抗原結合部分為相同的抗原結合部分。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽之抗原結合部分及第二雜二聚體前體多肽之抗原結合部分結合至不同的抗原。在此情況下，在兩個雜二聚體前體多肽之間進行多肽鏈交換後，形成多特異性產物多肽，其包含源自第一雜二聚體前體多肽之抗原結合部分及源自第二雜二聚體前體多肽之抗原結合部分。
雜二聚體前體多肽中可存在其他抗原結合部分，其可與雜二聚體前體多肽中包含之多肽鏈的N端或C端融合，以提供更高價的產物多肽。
此類其他抗原結合部分經由適當的肽連接體與多肽鏈融合。在一個實施例中，肽連接體為甘胺酸絲胺酸連接子。
在本發明之一個實施例中，在雜二聚體前體多肽中，包含CH3域之多肽鏈中僅一者包含抗原結合部分的至少一部分。在本發明之一個實施例中，在雜二聚體前體多肽中，包含CH3域之多肽鏈中之一者為特異性結合至靶抗原之抗原結合位點。在本發明之一個實施例中，在雜二聚體前體多肽中，包含CH3域之多肽鏈中之一者包含自N端至C端方向的鉸鏈區、抗體可變域及CH3域，且該多肽鏈不為特異性結合至靶抗原之抗原結合位點之一部分。在本發明之一個實施例中，在雜二聚體前體多肽中，包含CH3域之多肽鏈中之一者包含自N端至C端方向的鉸鏈區、抗體可變域、CH2域及CH3域，且該多肽鏈不為特異性結合至靶抗原之抗原結合位點之一部分。
C)前體多肽之域排列  根據本發明之前體多肽適合於製造各種形式及具有各種域排列的產物多肽。視雜二聚體前體分子中提供之域的選擇及抗原結合部分的數目而定，可製造具有不同抗原結合特徵(例如特異性、價數)及不同效應功能的產物多肽。
在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽包含正好兩條包含CH3域之多肽鏈。因此，沒有CH3域之其他多肽鏈可包含於第一及第二雜二聚體前體多肽中。
包含抗體片段之前體多肽  在本發明之一個實施例中，抗原結合部分包含一對VH域及VL域，其形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；及 a)     第一雜二聚體前體多肽包含： -  包含CH3域及第一抗體可變域之第一重鏈多肽， -  包含CH3域之第二重鏈多肽，其中該第一重鏈多肽及該第二重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  包含第二抗體可變域之輕鏈多肽，其中該第一及第二抗體可變域一起形成特異性結合至靶抗原之第一抗原結合位點；且其中 b)     第二雜二聚體前體多肽包含： -  包含CH3域及第三抗體可變域之第三重鏈多肽， -  包含CH3域之第四重鏈多肽，其中該第三重鏈多肽及該第四重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  包含第四抗體可變域之輕鏈多肽，其中該第三及第四抗體可變域一起形成特異性結合至靶抗原之第二抗原結合位點；且其中 c)     i)該第一重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域；或ii)該第一重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域。
在本發明之一個實施例中，抗原結合部分包含一對VH域及VL域，其形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；及 a)     第一雜二聚體前體多肽包含： -  第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VH域及恆定抗體域CH1、CH2及CH3， -  第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之恆定抗體域CH2及CH3域，其中該第一重鏈多肽及該第二重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VL域及CL域，其中該第一VH域及該第一VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 b)     第二雜二聚體前體多肽包含： -  第三重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VH域及恆定抗體域CH1、CH2及CH3， -  第四重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之恆定抗體域CH2及CH3域，其中該第三重鏈多肽及該第四重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VL域及CL域，其中該第二VH域及該第二VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 i)該第一重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域；或ii)該第一重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域。
在本發明之一個實施例中，抗原結合部分包含一對VH域及VL域，其形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；及 a)     第一雜二聚體前體多肽包含： -  第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之CH2域、CH3域、肽連接體、第一VH域及CH1域， -  第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之恆定抗體域CH2及CH3域，其中該第一重鏈多肽及該第二重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VL域及CL域，其中該第一VH域及該第一VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 b)     第二雜二聚體前體多肽包含： -  第三重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之CH2域、CH3域、肽連接體、第一VH域及CH1域， -  第四重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之恆定抗體域CH2及CH3域，其中該第三重鏈多肽及該第四重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VL域及CL域，其中該第二VH域及該第二VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 i)該第一重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域；或ii)該第一重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域。
在本發明之一個實施例中，抗原結合部分包含一對VH域及VL域，其形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；及 a)     第一雜二聚體前體多肽包含： -  第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VH域及恆定抗體域CH1、CH2、CH3、肽連接體、第一VH域及CH1域， -  第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之恆定抗體域CH2及CH3域，其中該第一重鏈多肽及該第二重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VL域及CL域，其中該第一VH域及該第一VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 b)     第二雜二聚體前體多肽包含： -  第三重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VH域及恆定抗體域CH1、CH2及CH3、肽連接體、第一VH域及CH1域， -  第四重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之恆定抗體域CH2及CH3域，其中該第三重鏈多肽及該第四重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VL域及CL域，其中該第二VH域及該第二VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 i)該第一重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域；或ii)該第一重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域。
包含CH2域之前體多肽  在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條包含CH2域及CH3域之多肽鏈。包含CH2域及CH3域之雜二聚體前體多肽表現出有利的特性，諸如在循環中之長半衰期及介導Fc介導之效應功能。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條多肽鏈，其包含自N端至C端方向之CH2域及CH3域。
在本發明之一個實施例中，i)第一雜二聚體前體多肽包含一條包含VL域、CH2域及CH3域之多肽鏈，且其中第二雜二聚體前體多肽包含一條包含VH域、CH2域及CH3域之多肽鏈，其中該VL域及該VH域在與一對VH域及VL域締合時，特異性結合至抗原；或ii)第一雜二聚體前體多肽包含一條包含VH域、CH2域及CH3域之多肽鏈，且其中第二雜二聚體前體多肽包含一條包含VL域、CH2域及CH3域之多肽鏈，其中該VL域及該VH域在與一對VH域及VL域締合時，特異性結合至抗原。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽沒有CH2域。沒有CH2域之雜二聚體前體多肽可表現出有利的特性，諸如自循環中快速清除。
包含可活化抗原結合位點之前體多肽  在一個實施例中，各前體多肽包含抗原結合部分之一部分，其中該抗原結合部分在前體多肽中為非功能性的，且其中在藉由前體多肽之間的多肽鏈交換形成的產物多肽中，該抗原結合部分為功能性的且特異性結合至靶抗原。此類前體多肽之例示性結構在圖2及圖3中示出。
在本發明之一個實施例中，該抗原結合部分為包含一對抗體可變域之抗原結合位點。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽包含一條包含VL域及CH3域之多肽鏈，且其中第二雜二聚體前體多肽包含一條包含VH域及CH3域之多肽鏈，其中該VL域及該VH域在與一對VH域及VL域締合時，特異性結合至抗原。
在一個實施例中，可活化抗原結合位點，例如一對抗體可變域，係藉由鏈間二硫鍵穩定。在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽包含鉸鏈區，其中該鉸鏈區不包含鏈間二硫鍵，且其中可活化抗原結合位點係藉由鏈間二硫鍵穩定。
在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽包含一條包含VL域及CH3域之多肽鏈及一條包含VH域及CH3域之多肽鏈，其中該等CH3域彼此締合，且其中該VH域及該VL域彼此締合，且其中在該VH域與該VL域之間藉由在選自以下對之胺基酸位置處引入之半胱胺酸殘基形成二硫鍵：VH位置44及VL位置100，VH位置105及VL位置43，以及VH位置101及VL位置100；在一個實施例中，VH位置44及VL位置100。
在一個實施例中，第二雜二聚體前體多肽包含一條包含VL域及CH3域之多肽鏈及一條包含VH域及CH3域之多肽鏈，其中該等CH3域彼此締合，且其中該VH域及該VL域彼此締合，且其中在該VH域與該VL域之間藉由在選自以下對之胺基酸位置處引入之半胱胺酸殘基形成二硫鍵：VH位置44及VL位置100，VH位置105及VL位置43，以及VH位置101及VL位置100；在一個實施例中，VH位置44及VL位置100。
在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽包含一條包含VL域及CH3域之多肽鏈及一條包含VH域及CH3域之多肽鏈，其中該等CH3域彼此締合，且其中該VH域及該VL域彼此締合，且其中在該VH域與該VL域之間藉由在選自以下對之胺基酸位置處引入之半胱胺酸殘基形成二硫鍵：VH位置44及VL位置100，VH位置105及VL位置43，以及VH位置101及VL位置100；且第二雜二聚體前體多肽包含一條包含VL域及CH3域之多肽鏈及一條包含VH域及CH3域之多肽鏈，其中該等CH3域彼此締合，且其中該VH域及該VL域彼此締合，且其中在該VH域與該VL域之間藉由在選自以下對之胺基酸位置處引入之半胱胺酸殘基形成二硫鍵：VH位置44及VL位置100，VH位置105及VL位置43，以及VH位置101及VL位置100；其中該第一雜二聚體前體多肽之VH域中半胱胺酸之胺基酸取代處於與該第二雜二聚體前體多肽之VH域中的相同位置，且其中該第一雜二聚體前體多肽之VL域中半胱胺酸之胺基酸取代處於與該第二雜二聚體前體多肽之VL域中的相同位置。
在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽包含一條包含VL域及CH3域之多肽鏈及一條包含VH域及CH3域之多肽鏈，其中該等CH3域彼此締合，且其中該VH域及該VL域彼此締合，且其中在該VH域與該VL域之間藉由在選自以下對之胺基酸位置處引入之半胱胺酸殘基形成二硫鍵：VH位置44及VL位置100，VH位置105及VL位置43，以及VH位置101及VL位置100；且該第二雜二聚體前體多肽包含一條包含VL域及CH3域之多肽鏈及一條包含VH域及CH3域之多肽鏈，其中該等CH3域彼此締合，且其中該VH域及該VL域彼此締合，且其中在該VH域與該VL域之間藉由在選自以下對之胺基酸位置處引入之半胱胺酸殘基形成二硫鍵：VH位置44及VL位置100，VH位置105及VL位置43，以及VH位置101及VL位置100；其中該第一雜二聚體前體多肽之VH域中半胱胺酸之胺基酸取代處於與該第二雜二聚體前體多肽之VH域中的相同位置，且其中該第一雜二聚體前體多肽之VL域中半胱胺酸之胺基酸取代處於與該第二雜二聚體前體多肽之VL域中的相同位置。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽包含一條多肽鏈，其包含自N端至C端方向之VL域及CH3域，且其中第二雜二聚體前體多肽包含一條多肽鏈，其包含自N端至C端方向之VH域及CH3域，其中該VL域及該VH域在與一對VH域及VL域締合時，特異性結合至抗原。
在本發明之一個實施例中， a)     第一雜二聚體前體多肽包含： -  第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VH域、CH1域、選自VH域及VL域之第二抗體可變域以及CH3域， -  第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之能夠與該第一重鏈多肽之第二抗體可變域締合的抗體可變域及CH3域，其中該第一重鏈多肽及該第二重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VL域及CL域，其中該第一VH域及該第一VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 b)     第二雜二聚體前體多肽包含： -  第三重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VH域、CH1域、選自VH域及VL域之第三抗體可變域以及CH3域， -  第四重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之能夠與該第三重鏈多肽之第三抗體可變域締合的抗體可變域及CH3域，其中該第三重鏈多肽及該第四重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VL域及CL域，其中該第二VH域及該第二VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 c)     i)該第一重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域；或ii)該第一重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域；且其中 d)     該第一重鏈多肽及該第三重鏈多肽之可變域能夠形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點。
在一個實施例中，第一重鏈多肽包含自N端至C端方向之第一VH域、CH1域、選自VH域及VL域之第二抗體可變域、肽連接體及CH3域，第二重鏈多肽包含自N端至C端方向之能夠與該第一重鏈多肽之第二抗體可變域締合的抗體可變域、肽連接體及CH3域，其中該第一重鏈多肽及該第二重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；第三重鏈多肽包含自N端至C端方向之第二VH域、CH1域、選自VH域及VL域之第三抗體可變域、肽連接體及CH3域，第四重鏈多肽包含自N端至C端方向之能夠與該第三重鏈多肽之第三抗體可變域締合的抗體可變域、肽連接體及CH3域，其中該第三重鏈多肽及該第四重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變。在一個實施例中，包含於第一、第二、第三及第四重鏈多肽中之肽連接體為相同的。
在一個實施例中，在第一雜二聚體前體多肽內，包含於第一重鏈多肽中之第二抗體可變域衍生自特異性結合至第一靶抗原之抗體，且包含於第二重鏈多肽中之抗體可變域特異性結合至第二靶抗原。兩個可變域均能夠彼此締合。因此，重鏈多肽中之一者包含VH域，而另一重鏈多肽包含VL域。VH域及VL域能夠彼此締合。然而，形成非功能性抗原結合位點。因此，在本發明之上下文內，術語「能夠彼此締合之可變域」意謂提供一對VH及VL域。在此實施例中，在第二雜二聚體前體多肽內，包含於第三重鏈多肽中之第三抗體可變域衍生自特異性結合至第一靶抗原之抗體(亦即能夠與包含於第一雜二聚體前體多肽之第一重鏈多肽中之第二可變域形成功能性VH/VL對)，且包含於第四重鏈多肽中之抗體可變域特異性結合至另一(例如第二)靶抗原。包含於第一重鏈多肽及第三重鏈多肽中之可變域能夠彼此締合，亦即可變域中之一者為VH域且可變域中之另一者為VL域；且包含於第一重鏈多肽及第三重鏈多肽中之可變域能夠形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點，亦即兩個可變域均衍生自特異性結合至靶抗原之相同抗體。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條包含自N端至C端方向之CH2域及CH3域的多肽鏈，其中該第一雜二聚體前體多肽包含一條包含自N端至C端方向之VL域、CH2域及CH3域的多肽鏈，且其中該第二雜二聚體前體多肽包含一條包含自N端至C端方向之VH域、CH2域及CH3域的多肽鏈，其中該VL域及該VH域能夠形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點。
在本發明之一個實施例中， a)     第一雜二聚體前體多肽包含： -  第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VH域、CH1域、選自VH域及VL域之第二抗體可變域、CH2域及CH3域， -  第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之能夠與該第一重鏈多肽之第二抗體可變域締合的抗體可變域、CH2域及CH3域，其中該第一重鏈多肽及該第二重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VL域及CL域，其中該第一VH域及該第一VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 b)     第二雜二聚體前體多肽包含： -  第三重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VH域、CH1域、選自VH域及VL域之第三抗體可變域、CH2域及CH3域， -  第四重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之能夠與該第三重鏈多肽之第三抗體可變域締合的抗體可變域、CH2域及CH3域，其中該第三重鏈多肽及該第四重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VL域及CL域，其中該第二VH域及該第二VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 c)     i)該第一重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域；或ii)該第一重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域；且其中 d)     該第一重鏈多肽及該第三重鏈多肽之可變域能夠形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點。
在一個實施例中，第一重鏈多肽包含自N端至C端方向之第一VH域、CH1域、選自VH域及VL域之第二抗體可變域、肽連接體、CH2域及CH3域，第二重鏈多肽包含自N端至C端方向之能夠與該第一重鏈多肽之第二抗體可變域締合的抗體可變域、肽連接體、CH2域及CH3域，其中該第一重鏈多肽及該第二重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；第三重鏈多肽包含自N端至C端方向之第二VH域、CH1域、選自VH域及VL域之第三抗體可變域、肽連接體、CH2域及CH3域，第四重鏈多肽包含自N端至C端方向之能夠與該第三重鏈多肽之第三抗體可變域締合的抗體可變域、肽連接體、CH2域及CH3域，其中該第三重鏈多肽及該第四重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變。在一個實施例中，包含於第一、第二、第三及第四重鏈多肽中之肽連接體為相同的。
包含鉸鏈區之前體多肽  在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條多肽鏈，該等多肽鏈包含自N端至C端方向之鉸鏈區及CH3域。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條多肽鏈，該等多肽鏈包含自N端至C端方向之鉸鏈區、CH2域及CH3域。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽在鉸鏈區中包含鏈間二硫鍵。具有包含至少一個鏈間二硫鍵之鉸鏈區的雜二聚體前體多肽在還原劑存在下進行多肽鏈交換。因此，彼等雜二聚體前體多肽適合於可能存在還原劑之應用，例如用於活體外製造產物多肽或用於篩選目的。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽在鉸鏈區中不包含鏈間二硫鍵。具有無鏈間二硫鍵之鉸鏈區的雜二聚體前體多肽能夠在不存在還原劑之情況下進行多肽鏈交換。因此，具有無鏈間二硫鍵之鉸鏈區的雜二聚體前體多肽特別適用於不可能或不希望存在還原劑之應用。因此，彼等雜二聚體前體多肽宜用於療法中。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽包含天然鉸鏈區，其不形成鏈間二硫鍵。一個實例為衍生自IgG4同型抗體之鉸鏈區肽。
代替無鏈間二硫鍵之鉸鏈區，雜二聚體前體多肽可包含肽連接體，其將抗原結合部分(之一部分)與恆定抗體結構域(亦即CH2或CH3)連接。在本發明之一個實施例中，在包含前體多肽之CH3域的兩條多肽鏈中所包含之肽連接體之間沒有形成鏈間二硫鍵。在本發明之一個實施例中，包含CH3域之兩條多肽鏈中所包含之肽連接體彼此相同。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條多肽鏈，該等多肽鏈包含自N端至C端方向之肽連接體及CH3域。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條多肽鏈，該等多肽鏈包含自N端至C端方向之肽連接體、CH2域及CH3域。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽包含具有第一肽連接體、抗體可變域、視情況存在之CH2域及CH3域的第一多肽鏈，及具有第一肽連接體、能夠與第一多肽鏈之抗體可變域締合的抗體可變域、視情況存在之CH2域及CH3域的第二多肽鏈；第二雜二聚體前體多肽包含具有第一肽連接體、抗體可變域、視情況存在之CH2域及CH3域的第一多肽鏈，及具有第一肽連接體、能夠與第一多肽鏈之抗體可變域締合的抗體可變域、視情況存在之CH2域及CH3域的第二多肽鏈。
在本發明之一個實施例中，肽連接體為至少15個胺基酸之肽。在本發明之另一個實施例中，肽連接體為15-70個胺基酸之肽。在本發明之另一個實施例中，肽連接體為20-50個胺基酸之肽。在本發明之另一個實施例中，肽連接體為10-50個胺基酸之肽。視例如待由可活化結合位點結合之抗原類型而定，較短(或甚至較長)肽連接體亦可適用於根據本發明之雜二聚體前體多肽。
在本發明之另一個實施例中，第一及第二肽連接體之長度約為天然鉸鏈區之長度(對於IgG1同型之天然抗體分子為約15個胺基酸，且對於IgG3同型為約62個胺基酸)。因此，在一個實施例中，其中第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽屬於IgG1同型，肽連接體為10-20個胺基酸之肽，在一個較佳實施例中為12-17個胺基酸。在另一個實施例中，其中第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽屬於IgG3同型，肽連接體為55-70個胺基酸之肽，在一個較佳實施例中為60-65個胺基酸。
在本發明之一個實施例中，肽連接體為甘胺酸-絲胺酸連接子。在本發明之一個實施例中，肽連接體為由甘胺酸及絲胺酸殘基組成之肽。在本發明之一個實施例中，甘胺酸-絲胺酸連接子具有以下結構： (GxS)n或(GxS)nGm 其中G = 甘胺酸，S = 絲胺酸，x = 3或4，n = 2、3、4、5或6，且m = 0、1、2或3。
在一個實施例中，在上文所定義之甘胺酸-絲胺酸連接子中，x ＝ 3，n ＝ 3、4、5或6，且m ＝ 0、1、2或3；或x ＝ 4，n ＝ 2、3、4或5，且m ＝ 0、1、2或3。在一個較佳實施例中，x ＝ 4且n ＝ 2或3，且m ＝ 0。在另一個較佳實施例中，x ＝ 4且n ＝ 2。在一個實施例中，該肽連接體為(G4 S)4 或(G4 S)6 。
在本發明之一個實施例中，i)第一雜二聚體前體多肽包含一條具有VL域、肽連接體及CH3域之多肽鏈，且其中第二雜二聚體前體多肽包含一條具有VH域、肽連接體及CH3域之多肽鏈，其中該VL域及該VH域在與一對VH域及VL域締合時，特異性結合至抗原；或ii)第一雜二聚體前體多肽包含一條具有VH域、肽連接體及CH3域之多肽鏈，且其中第二雜二聚體前體多肽包含一條具有VL域、肽連接體及CH3域之多肽鏈，其中該VL域及該VH域在與一對VH域及VL域締合時，特異性結合至抗原。
在本發明之一個實施例中，i)第一雜二聚體前體多肽包含一條具有VL域、肽連接體、CH2域及CH3域之多肽鏈，且其中第二雜二聚體前體多肽包含一條具有VH域、肽連接體、CH2域及CH3域之多肽鏈，其中該VL域及該VH域在與一對VH域及VL域締合時，特異性結合至抗原；或ii)第一雜二聚體前體多肽包含一條具有VH域、肽連接體、CH2域及CH3域之多肽鏈，且其中第二雜二聚體前體多肽包含一條具有VL域、肽連接體、CH2域及CH3域之多肽鏈，其中該VL域及該VH域在與一對VH域及VL域締合時，特異性結合至抗原。
D)抗體同型及價數  在本發明之一個實施例中，前體多肽包含一或多個免疫球蛋白類別之免疫球蛋白恆定區。免疫球蛋白類別包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE同型，以及在IgG及IgA之情況下，包括其亞型。在本發明之一個實施例中，前體多肽具有IgG型抗體之恆定域結構。
在本發明之一個實施例中，前體多肽中所包含之CH3域屬於哺乳動物IgG類別。在本發明之一個實施例中，前體多肽中所包含之CH3域屬於哺乳動物IgG1亞類。在本發明之一個實施例中，前體多肽中所包含之CH3域屬於哺乳動物IgG4亞類。
在本發明之一個實施例中，前體多肽中所包含之CH3域屬於人類IgG類別。在本發明之一個實施例中，前體多肽中所包含之CH3域屬於人類IgG1亞類。在本發明之一個實施例中，前體多肽中所包含之CH3域屬於人類IgG4亞類。
在一個實施例中，根據本發明之前體多肽的恆定域屬於人類IgG類別。在一個實施例中，根據本發明之前體多肽的恆定域屬於人類IgG1亞類。在一個實施例中，根據本發明之前體多肽的恆定域屬於人類IgG4亞類。
在一個實施例中，前體多肽不含CH4域。
在本發明之一個實施例中，根據本發明之前體多肽的恆定域屬於相同的免疫球蛋白亞類。在本發明之一個實施例中，根據本發明之前體多肽的可變域及恆定域屬於相同的免疫球蛋白亞類。
在本發明之一個實施例中，前體多肽為經分離之前體多肽。在本發明之一個實施例中，產物多肽為經分離之產物多肽。
在一個實施例中，包含包括CH3域之多肽鏈的雜二聚體前體多肽或雜二聚體產物多肽包括全長CH3域或CH3域，其中一或兩個C端胺基酸殘基，亦即G446及/或K447不存在。
在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽為單特異性的。在一個實施例中，第二雜二聚體前體多肽為單特異性的。在一個實施例中，雜二聚體產物多肽為雙特異性的。
在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽為單特異性的且包含第二抗原結合位點之一部分；第二雜二聚體前體多肽為單特異性的且包含第二抗原結合位點之另一部分。在該實施例中，雜二聚體產物多肽為三特異性的。
在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽為雙特異性的。在一個實施例中，第二雜二聚體前體多肽為單特異性的。在一個實施例中，雜二聚體產物多肽為三特異性的。
在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽為雙特異性的。在一個實施例中，第二雜二聚體前體多肽為雙特異性的。在一個實施例中，雜二聚體產物多肽為四特異性的。
在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽為單價的。在一個實施例中，第二雜二聚體前體多肽為單價的。
在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽為二價的。在一個實施例中，第二雜二聚體前體多肽為二價的。
在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽為三價的。在一個實施例中，第二雜二聚體前體多肽為三價的。
在一個實施例中，雜二聚體產物多肽為二價的。在一個實施例中，雜二聚體產物多肽為三價的。在一個實施例中，雜二聚體產物多肽為四價的。
E)前體多肽之其他組分  在本發明之一個實施例中， i)在第一雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈，及在第二雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈；或 ii)在第一雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈，及在第二雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈 包含標籤部分。在一個實施例中，標籤部分與CH3域之C端融合。在一個實施例中，標籤部分為親和標籤。在一個實施例中，標籤部分為聚(his)標籤、C標籤或Strep標籤。在一個實施例中，標籤部分為聚(his)標籤或C標籤。
F)製造產物多肽之方法  在一個態樣中，本發明提供一種製造雜二聚體產物多肽之方法，該方法包含以下步驟： a)     使根據本發明之第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽接觸，以形成第三雜二聚體多肽，該第三雜二聚體多肽包含至少一條包含來自該第一雜二聚體前體多肽之CH3域的多肽鏈及至少一條包含來自該第二雜二聚體多肽之CH3域的多肽鏈，及 b)     回收該第三雜二聚體多肽。
在一個實施例中，使根據本發明之第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽接觸以形成第三雜二聚體多肽，該第三雜二聚體多肽包含至少一條包含來自第一雜二聚體前體多肽之CH3域的多肽鏈及至少一條包含來自第二雜二聚體多肽之CH3域的多肽鏈，及第四雜二聚體多肽，該第四雜二聚體多肽包含另一個包含來自第一雜二聚體前體多肽之CH3域的多肽及另一個包含來自第二雜二聚體前體多肽之CH3域的多肽。在一個實施例中，該方法包括回收第四雜二聚體產物多肽之步驟。
在本發明之一個實施例中，該方法包括形成第三雜二聚體產物多肽及第四雜二聚體產物多肽，其中該等產物多肽中之一者不包含特異性結合至抗原之抗原結合位點。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽包含特異性結合至第一抗原之抗原結合部分，其中第二雜二聚體前體多肽包含特異性結合至第二抗原之抗原結合部分，且其中第三雜二聚體多肽包含特異性結合至第一抗原之抗原結合部分及特異性結合至第二抗原之抗原結合部分。
在一個實施例中，接觸步驟在液體溶液中進行。在一個實施例中，接觸步驟在緩衝溶液中進行。
在一個實施例中，回收步驟係藉由層析進行。
鉸鏈二硫鍵之還原  在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽包含具有鏈間二硫鍵之鉸鏈區，且第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽在還原劑存在下接觸。倘若前體多肽包含具有鏈間二硫鍵之鉸鏈區，則僅在藉由還原劑還原鏈間二硫鍵之後才發生多肽鏈交換。
在本發明之一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽鉸鏈區不包含鏈間二硫鍵。在此情況下，多肽鏈交換可在不存在還原劑之情況下發生。因此，在一個實施例中，第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽鉸鏈區不包含鏈間二硫鍵，且第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽在不存在還原劑之情況下接觸。
純化  在一個實施例中，i)在第一雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈，及在第二雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈；或ii)在第一雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈，及在第二雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈，包含如上文所定義之標籤部分，且該方法包含經由標籤特異性親和層析回收第三雜二聚體多肽之步驟。在一個替代性實施例中，該方法包含經由標籤特異性親和層析回收第四雜二聚體多肽之步驟。
在一個實施例中，標籤部分為聚(his)標籤，且該方法包括經由金屬螯合劑親和層析純化多肽之步驟。在一個實施例中，標籤部分為聚(his)標籤，且該方法包括經由鎳螯合劑親和層析純化多肽之步驟。
在一個實施例中，標籤部分為C標籤，且該方法包括經由C標籤親和層析純化多肽之步驟。
在本發明之一個實施例中，在包含第一及第二雜二聚體多肽之CH3域的兩條多肽鏈之間沒有形成鏈間二硫鍵，且在不存在還原劑之情況下進行接觸。
F)雜二聚體產物多肽  本發明之一個態樣為藉由製造本發明之雜二聚體產物多肽的方法獲得之雜二聚體產物多肽。
本發明之一個態樣為雜二聚體多肽，在一個實施例中為雜二聚體產物多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；其中該雜二聚體多肽包含第一抗原結合部分，其中該第一抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上；且其中該雜二聚體多肽包含第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之另一者上；且 其中具有臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： -  用疏水性胺基酸置換S354； -  用帶正電荷之胺基酸置換D356； -  用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； -  用帶正電荷之胺基酸置換D356，且用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； -  用疏水性胺基酸置換S364； -  用疏水性胺基酸置換A368； -  用帶負電荷之胺基酸置換E392； -  用疏水性胺基酸置換T394； -  用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換S400； -  用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換F405； -  用疏水性胺基酸置換V407；及 -  用帶負電荷之胺基酸置換K409；及 -  用帶負電荷之胺基酸置換K439；且其中 具有杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： -  用帶正電荷之胺基酸置換Q347，且用帶負電荷之胺基酸置換K360； -  用帶負電荷之胺基酸置換Y349； -  用疏水性胺基酸置換L351，且用疏水性胺基酸置換E357； -  用疏水性胺基酸置換S364； -  用疏水性胺基酸置換W366，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； -  用疏水性胺基酸置換L368； -  用帶負電荷之胺基酸置換K370； -  用帶負電荷之胺基酸置換K370，且用帶負電荷之胺基酸置換K439； -  用帶負電荷之胺基酸置換K392； -  用疏水性胺基酸置換T394； -  用疏水性胺基酸置換V397； -  用帶正電荷之胺基酸置換D399，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； -  用帶正電荷之胺基酸置換S400； -  F405W； -  Y407W；及 -  用帶負電荷之胺基酸置換K439。
根據本發明之雜二聚體(產物)多肽包含兩條包含CH3域之多肽鏈，其中兩個CH3域均包含上文所定義之去穩定化突變。以上列出之本發明之雜二聚體前體多肽中之去穩定化突變的所有實施例均適用於雜二聚體產物多肽，不同之處在於雜二聚體產物多肽在兩個CH3域中均包含去穩定化突變。
製造雜二聚體產物多肽之方法的另一種產物，因此為本發明之另一態樣，為雜二聚體產物多肽，其較佳藉由本發明之方法獲得，包含兩條包含CH3域之多肽鏈，其中兩個CH3域均不包含去穩定化突變。
在本發明之一個實施例中，雜二聚體產物多肽包含兩條包含CH3域之多肽鏈，其中兩個CH3域均包含上文所定義之半胱胺酸突變。在本發明之一個實施例中，雜二聚體產物多肽包含兩條包含CH3域之多肽鏈，其中兩個CH3域均不包含如上文所定義之半胱胺酸突變。
G)用於製造多特異性多肽之方法  在一個態樣中，本發明提供一種用於鑑別多特異性雜二聚體多肽之方法，其包含以下步驟： a)     藉由對以下之各種組合： -  來自複數個第一雜二聚體前體多肽之第一雜二聚體前體多肽，其包含特異性結合至第一抗原之抗原結合部分，及 -  來自複數個第二雜二聚體前體多肽之第二雜二聚體前體多肽，其包含特異性結合至第二抗原之抗原結合部分， 進行製造根據本發明之雜二聚體產物多肽的方法來製造複數個多特異性雜二聚體多肽；及 b)     自步驟a)中製造之複數個多特異性雜二聚體多肽分別偵測各多特異性雜二聚體多肽之所需特徵，及 c)     選擇多特異性雜二聚體多肽。
在本發明之一個實施例中，多特異性雜二聚體多肽特異性結合至第一抗原且特異性結合至第二抗原。
在一個實施例中，多特異性雜二聚體多肽係基於步驟b)中所偵測之所需特徵來選擇。
在一個實施例中，步驟b)中所偵測之所需特徵為多特異性雜二聚體多肽與第一抗原結合之親和力。在一個實施例中，步驟b)中所偵測之所需特徵為多特異性雜二聚體多肽與第二抗原結合之親和力。在一個實施例中，步驟b)中所偵測之所需特徵為多特異性雜二聚體多肽之熱穩定性。
本發明之另一態樣為藉由用於鑑別本發明之多特異性雜二聚體多肽之方法獲得的多特異性雜二聚體多肽。
H)重組方法  根據本發明之前體多肽係藉由重組方法製備。因此，本發明亦關於一種用於製備根據本發明之雜二聚體前體多肽的方法，其包含在適合於表現前體多肽之條件下培養包含編碼雜二聚體前體多肽之核酸的宿主細胞。
在一個態樣中，提供一種製造本發明之雜二聚體前體多肽的方法，其中該方法包含在適合於表現雜二聚體前體多肽之條件下，培養如上文所提供之包含編碼雜二聚體前體多肽之核酸的宿主細胞，且視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收雜二聚體前體多肽。
在一個實施例中，該方法包含以下步驟：用包含編碼雜二聚體前體多肽之核酸的表現載體轉型宿主細胞，在允許合成該雜二聚體前體多肽之條件下培養該宿主細胞，及自該宿主細胞培養物回收該雜二聚體前體多肽。
為了重組產生雜二聚體前體多肽，將如上所述之編碼雜二聚體前體多肽之核酸分離且插入一或多個載體中，以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此類核酸可使用習知程序(例如，藉由使用能夠特異性結合至編碼雜二聚體前體多肽之多肽鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離及定序，或藉由重組方法產生或藉由化學合成獲得。
適合用於選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，雜二聚體前體多肽可在細菌中產生。關於多肽在細菌中之表現，參見例如US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523。(亦參見Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology,第248卷, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2003), 第245-254頁，其描述抗體片段在大腸桿菌中之表現。) 表現後，雜二聚體前體多肽可以可溶級分自細菌細胞糊分離，且可進一步純化。
除原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為編碼本發明之雜二聚體前體多肽之載體的適合之選殖或表現宿主，包括糖基化途徑已經「人類化」之真菌及酵母菌株，從而產生具有部分或完全人類糖基化型態之多肽。參見Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及Li, H.等人, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215。
適用於表現(糖基化)雜二聚體前體多肽之宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出許多桿狀病毒株，其可與昆蟲細胞結合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞。
植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978及US 6,417,429 (描述用於在轉殖基因植物中產生抗體的PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為有用的。有用的哺乳動物宿主細胞株之其他實例為由SV40 (COS-7)轉型之猴腎CV1細胞株；人類胚腎細胞株(如例如在Graham, F.L.等人, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74中所述之293或293T細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell) (如例如在Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252中所述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；水牛鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞(如例如在Mather, J.P.等人, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68中所述)；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub, G.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適合於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見例如Yazaki, P.及Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, 第248卷, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2004), 第255-268頁。
在一個態樣中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之核酸，其編碼本發明之雜二聚體前體多肽。在一個態樣中，本發明提供一種表現載體，其包含根據本發明之核酸。在另一態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包含本發明之核酸。
I)治療應用  本發明之雜二聚體前體多肽集合可用於療法中。因此，本發明之一個態樣為根據本發明之雜二聚體前體多肽集合，其用作藥物。本發明之另一態樣為一種醫藥組合物，其包含本發明之雜二聚體前體多肽集合及醫藥學上可接受之載劑。本發明之另一態樣為一種治療患有疾病之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之本發明之第一及第二雜二聚體前體多肽或本發明之醫藥組合物。
在一個實施例中，用於療法中之雜二聚體前體多肽包含如上文所定義之鉸鏈區，其中第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽在鉸鏈區中不包含鏈間二硫鍵。在鉸鏈區中不存在鏈間二硫鍵之情況下，多肽鏈交換在不存在還原劑之情況下發生，且因此可自發地發生；例如當兩個雜二聚體前體多肽均結合至靶抗原或靶細胞時。
在一個實施例中，用於療法中之雜二聚體前體多肽包含如上文所定義之可活化抗原結合位點。
因此，在一個實施例中，用於療法中之雜二聚體前體多肽包含鉸鏈區，其不包含鏈間二硫鍵；及如上文所定義之可活化抗原結合位點。
3.  本發明之具體實施例  在下文中列出本發明之具體實施例。 1.   一種雜二聚體前體多肽集合，其包含： a)     第一雜二聚體前體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變， 其中該第一雜二聚體前體多肽包含第一抗原結合部分，其中該第一抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上，及 b)     第二雜二聚體前體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變， 其中該第二雜二聚體前體多肽包含第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上； 其中 A)    i)在該第一雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈包含該第一抗原結合部分之至少一部分，而在該第二雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈包含該第二抗原結合部分之至少一部分，或ii)在該第一雜二聚體前體多肽內，包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈包含該第一抗原結合部分之至少一部分，而在該第二雜二聚體前體多肽內，包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈包含該第二抗原結合部分之至少一部分；且其中 B)     i)該第一雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域及該第二雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域，或 ii)該第一雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域及該第二雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域 包含以下胺基酸取代，其中編號係根據Kabat編號系統： -  具有該臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： o 用疏水性胺基酸置換S354； o 用帶正電荷之胺基酸置換D356； o 用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； o 用帶正電荷之胺基酸置換D356，且用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； o 用疏水性胺基酸置換S364； o 用疏水性胺基酸置換A368； o 用帶負電荷之胺基酸置換E392； o 用疏水性胺基酸置換T394； o 用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換S400； o 用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換F405； o 用疏水性胺基酸置換V407；及 o 用帶負電荷之胺基酸置換K409；及 o 用帶負電荷之胺基酸置換K439； -  具有該杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： o 用帶正電荷之胺基酸置換Q347，且用帶負電荷之胺基酸置換K360； o 用帶負電荷之胺基酸置換Y349； o 用疏水性胺基酸置換L351，且用疏水性胺基酸置換E357； o 用疏水性胺基酸置換S364； o 用疏水性胺基酸置換W366，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； o 用疏水性胺基酸置換L368； o 用帶負電荷之胺基酸置換K370； o 用帶負電荷之胺基酸置換K370，且用帶負電荷之胺基酸置換K439； o 用帶負電荷之胺基酸置換K392； o 用疏水性胺基酸置換T394； o 用疏水性胺基酸置換V397； o 用帶正電荷之胺基酸置換D399，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； o 用帶正電荷之胺基酸置換S400； o F405W； o Y407W；及 o 用帶負電荷之胺基酸置換K439。 2.   如實施例1之雜二聚體多肽集合，其中B)中指示之CH3域包含以下胺基酸取代： -  具有該臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：S354V、S354I、S354L、D356K、D356R、E357K、E357R、E357F、S364L、S364I、A368F、K392D、K392E、T394L、T394I、V407Y、K409E、K409D、K439D、K439E及雙突變D399A S400K、D399A S400R、D399A F405W；及 -  具有該杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：Y349E、Y349D、S364V、S364I、S364L、L368F、K370E、K370D、K392E、K392D、T394L、T394I、V397Y、S400K、S400R、F405W、Y407W、K349E、K439D及雙突變Q347K K360E、Q347R K360E、Q347K K360D、Q347R K360D、L351F E357F、W366I K409E、W366L K409E、W366K K409D、W366L K409D、D399K K409E、D399R K409E、D399K K409D及D399K K409E。 3.   如實施例1或2之雜二聚體多肽集合，其中B)中指示之CH3域包含以下胺基酸取代： -  具有該臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：S354V、D356K、E357K、E357F、S364L、A368F、K392E、T394I、V407Y、K409E、K439E及雙突變D399A S400K；及 -  具有該杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：Y349E、S364V、L368F、K370E、K392D、T394I、V397Y、S400K、F405W、Y407W、K349E及雙突變Q347K K360E、L351F E357F、W366I K409E及D399K K409E。 4.   如實施例1至3中一項之雜二聚體多肽集合，其中B)中指示之CH3域包含以下胺基酸取代： -  具有該臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：D356K、D356R、E357K、E357R、E357F、S364L、S364I、V407Y、K409E、K409D及雙突變D399A S400K、D399A S400R；及 -  具有該杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：Y349E、Y349D、K370E、K370D、K392E、K392D、T394L、T394I、V397Y、F405W、Y407W、K349E、K439D及雙突變Q347K K360E、Q347R K360E、Q347K K360D、Q347R K360D、W366I K409E、W366L K409E、W366K K409D、W366L K409D、D399K K409E、D399R K409E、D399K K409D及D399K K409E。 5.   如實施例1至4中一項之雜二聚體多肽集合，其中B)中指示之CH3域包含以下胺基酸取代： -  具有該臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：D356K、E357K、E357F、S364L、V407Y、K409E及雙突變D399A S400K；及 -  具有該杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：Y349E、K370E、K392D、T394I、V397Y、F405W、Y407W、K349E及雙突變Q347K K360E、W366I K409E及D399K K409E。 6.   如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中B)中指示之包含杵突變之CH3域及包含臼突變之CH3域包含選自下表中指示之群的胺基酸取代中之一者：
包含臼突變之CH3 域 包含杵突變之CH3 域
D356K K370E K439E
D356K E357K Y349E
D356K E357K W366I K409E
D356K E357K K370E K439E
D356K E357K K392D
D356K E357K T394I
D356K E357K D399K K409E
D356K E357K F405W
D356K E357K Y407W
E357K Y349E
E357K W366I K409E
E357K K370E K439E
E357K T394I
E357K D399K K409E
E357K F405W
E357K Y407W
E357F Q347K K360E
E357F Y349E
E357F W366I K409E
E357F K370E K439E
E357F T394I
E357F D399K K409E
E357F Y407W
S364L Y349E
S364L K392D
S364L F405W
S364L W366I K409E
S364L K370E K439E
S364L T394I
S364L D399K K409E
S364L Y407W
A368F T394I
D399A S400K W366I K409E
D399A S400K T394I
V407Y Q347K K360E
V407Y Y349E
V407Y W366I K409E
V407Y T394I
V407Y D399K K409E
V407Y F405W
V407Y Y407W
V407Y K392D
K409E Y349E
K409E W366I K409E
K409E K392D
K409E T394I
K409E D399K K409E
K409E F405W
K409E Y407W
7.   如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中B)中指示之包含杵突變之CH3域及包含臼突變之CH3域包含選自下表中指示之群的胺基酸取代中之一者：
臼 杵
V407Y K370E
V407Y K370E K439E
V407Y V397Y
S364L K439E
S364L W366I K409E
S364L K370E K439E
S364L D399K K409E
S364L T394I
S364L W366I K409E
S364L K370E K439E
S364L D399K K409E
S364L T394I
8.   如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中倘若B)中指示之具有杵突變之CH3域包含突變E357K，則B)中指示之具有臼突變之CH3域不包含突變K370E。 9.   如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中倘若B)中指示之具有杵突變之CH3域包含突變D356K，則B)中指示之具有臼突變之CH3域不包含突變K439E。 10.  如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中i)該第一雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域包含半胱胺酸突變，而該第二雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域包含半胱胺酸突變，或ii)該第一雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域包含半胱胺酸突變，而該第二雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域包含半胱胺酸突變。 11.  如實施例10之雜二聚體多肽集合，其中i)該第一雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域包含取代S354C，而該第二雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域包含取代Y349C，或ii)該第一雜二聚體前體多肽之包含臼突變之CH3域包含取代Y349C，而該第二雜二聚體前體多肽之包含杵突變之CH3域包含取代S354C。 12.  如實施例10或11之雜二聚體多肽集合，其中在該第一雜二聚體前體多肽內，包含該杵突變之CH3域包含取代S354C，而包含該臼突變之CH3域在位置349處包含Y；且其中在該第二雜二聚體前體多肽內，包含該臼突變之CH3域包含取代Y349C，而包含該杵突變之CH3域在位置354處包含S。 13.  如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中該第一抗原結合部分及/或該第二抗原結合部分包含一對VH域及VL域，其形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點。 14.  如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中該第一抗原結合部分及/或該第二抗原結合部分為抗體片段。 15.  如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中 a)   該第一雜二聚體前體多肽包含： -  包含CH3域及第一抗體可變域之第一重鏈多肽， -  包含CH3域之第二重鏈多肽，其中該第一重鏈多肽及該第二重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  包含第二抗體可變域之輕鏈多肽，其中該第一及第二抗體可變域一起形成特異性結合至靶抗原之第一抗原結合位點；且其中 b)     該第二雜二聚體前體多肽包含： -  包含CH3域及第三抗體可變域之第三重鏈多肽， -  包含CH3域之第四重鏈多肽，其中該第三重鏈多肽及該第四重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  包含第四抗體可變域之輕鏈多肽，其中該第三及第四抗體可變域一起形成特異性結合至靶抗原之第二抗原結合位點；且其中 c)     i)該第一重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域；或ii)該第一重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域。 16.  如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中該第一雜二聚體前體多肽及該第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條多肽鏈，其包含CH2域及該CH3域。 17.  如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中該第一雜二聚體前體多肽及該第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條多肽鏈，其包含自N端至C端方向之CH2域及該CH3域。 18.  如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中該第一雜二聚體前體多肽及該第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條多肽鏈，其包含自N端至C端方向之鉸鏈區、CH2域及該CH3域。 19.  如實施例15至18中一項之雜二聚體多肽集合，其中 a)     該第一雜二聚體前體多肽包含： -  第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VH域及恆定抗體域CH1、CH2及CH3， -  第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之恆定抗體域CH2及CH3域，其中該第一重鏈多肽及該第二重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VL域及CL域，其中該第一VH域及該第一VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 b)     該第二雜二聚體前體多肽包含： -  第三重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VH域及恆定抗體域CH1、CH2及CH3， -  第四重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之恆定抗體域CH2及CH3域，其中該第三重鏈多肽及該第四重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VL域及CL域，其中該第二VH域及該第二VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 i)該第一重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域；或ii)該第一重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域。 20.  如實施例19之雜二聚體多肽集合，其中該第一雜二聚體前體多肽及該第二雜二聚體前體多肽在該鉸鏈區中包含鏈間二硫鍵。 21.  如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中該抗原結合位點為抗體片段。 22.  如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中 i)在該第一雜二聚體前體多肽內，該包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈，及在該第二雜二聚體前體多肽內，該包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈；或 ii)在該第一雜二聚體前體多肽內，該包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈，及在該第二雜二聚體前體多肽內，該包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈 包含標籤部分。 23.  如實施例22之雜二聚體多肽集合，其中該標籤部分與該等CH3域之C端融合。 24.  如實施例22或23之雜二聚體多肽集合，其中該標籤部分為組胺酸標籤或C標籤。 25.  如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中該第一雜二聚體前體多肽包含一條包含VL域及該CH3域之多肽鏈，且其中該第二雜二聚體前體多肽包含一條包含VH域及該CH3域之多肽鏈，其中該VL域及該VH域在與一對VH域及VL域締合時，特異性結合至抗原。 26.  如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中 a)     該第一雜二聚體前體多肽包含： -  第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VH域、CH1域、選自VH域及VL域之第二抗體可變域以及CH3域， -  第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之能夠與該第一重鏈多肽之第二抗體可變域締合的抗體可變域及CH3域，其中該第一重鏈多肽及該第二重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VL域及CL域，其中該第一VH域及該第一VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 b)     該第二雜二聚體前體多肽包含： -  第三重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VH域、CH1域、選自VH域及VL域之第三抗體可變域以及CH3域， -  第四重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之能夠與該第三重鏈多肽之第三抗體可變域締合的抗體可變域及CH3域，其中該第三重鏈多肽及該第四重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VL域及CL域，其中該第二VH域及該第二VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 c)     i)該第一重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域；或ii)該第一重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域；且其中 d)     該第一重鏈多肽及該第三重鏈多肽之可變域能夠形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點。 27.  如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合， 其中該第一雜二聚體前體多肽及該第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條多肽鏈，其包含自N端至C端方向之CH2域及該CH3域， 其中該第一雜二聚體前體多肽包含一條包含自N端至C端方向之VL域、CH2域及該CH3域的多肽鏈，且其中該第二雜二聚體前體多肽包含一條包含自N端至C端方向之VH域、CH2域及該CH3域的多肽鏈，其中該VL域及該VH域能夠形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點。 28.  如前述實施例中一項之雜二聚體多肽集合，其中 a)     該第一雜二聚體前體多肽包含： -  第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VH域、CH1域、選自VH域及VL域之第二抗體可變域、CH2域及CH3域， -  第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之能夠與該第一重鏈多肽之第二抗體可變域締合的抗體可變域、CH2域及CH3域，其中該第一重鏈多肽及該第二重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第一VL域及CL域，其中該第一VH域及該第一VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 b)     該第二雜二聚體前體多肽包含： -  第三重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VH域、CH1域、選自VH域及VL域之第三抗體可變域、CH2域及CH3域， -  第四重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之能夠與該第三重鏈多肽之第三抗體可變域締合的抗體可變域、CH2域及CH3域，其中該第三重鏈多肽及該第四重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 -  輕鏈多肽，其包含自N端至C端方向之第二VL域及CL域，其中該第二VH域及該第二VL域彼此締合且形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點；且其中 c)     i)該第一重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域；或ii)該第一重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域；且其中 d)     該第一重鏈多肽及該第三重鏈多肽之可變域能夠形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點。 29.  如前述實施例中一項之雜二聚體前體多肽集合，其中該第一雜二聚體前體多肽之抗原結合部分及該第二雜二聚體前體多肽之抗原結合部分結合至相同的抗原。 30.  如前述實施例中一項之雜二聚體前體多肽集合，其中該第一雜二聚體前體多肽之抗原結合部分及該第二雜二聚體前體多肽之抗原結合部分結合至不同的抗原。 31.  一種雜二聚體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；其中該雜二聚體多肽包含第一抗原結合部分，其中該第一抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上；且其中該雜二聚體多肽包含第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之另一者上；且 其中具有該臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： -  用疏水性胺基酸置換S354； -  用帶正電荷之胺基酸置換D356； -  用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； -  用帶正電荷之胺基酸置換D356，且用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； -  用疏水性胺基酸置換S364； -  用疏水性胺基酸置換A368； -  用帶負電荷之胺基酸置換E392； -  用疏水性胺基酸置換T394； -  用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換S400； -  用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換F405； -  用疏水性胺基酸置換V407；及 -  用帶負電荷之胺基酸置換K409；及 -  用帶負電荷之胺基酸置換K439；且其中 具有該杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： -  用帶正電荷之胺基酸置換Q347，且用帶負電荷之胺基酸置換K360； -  用帶負電荷之胺基酸置換Y349； -  用疏水性胺基酸置換L351，且用疏水性胺基酸置換E357； -  用疏水性胺基酸置換S364； -  用疏水性胺基酸置換W366，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； -  用疏水性胺基酸置換L368； -  用帶負電荷之胺基酸置換K370； -  用帶負電荷之胺基酸置換K370，且用帶負電荷之胺基酸置換K439； -  用帶負電荷之胺基酸置換K392； -  用疏水性胺基酸置換T394； -  用疏水性胺基酸置換V397； -  用帶正電荷之胺基酸置換D399，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； -  用帶正電荷之胺基酸置換S400； -  F405W； -  Y407W；及 -  用帶負電荷之胺基酸置換K439。 32.  一種用於製造雜二聚體多肽之方法，其包含以下步驟： a)     使如實施例1至30中一項所定義之第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽接觸，以形成第三雜二聚體多肽，該第三雜二聚體多肽包含至少一條包含來自該第一雜二聚體前體多肽之CH3域的多肽鏈及至少一條包含來自該第二雜二聚體多肽之CH3域的多肽鏈，及 b)     回收該第三雜二聚體多肽。 33.  如實施例32之方法，其中該第一雜二聚體前體多肽包含特異性結合至第一抗原之抗原結合部分，其中該第二雜二聚體前體多肽包含特異性結合至第二抗原之抗原結合部分，且其中該第三雜二聚體多肽包含該特異性結合至第一抗原之抗原結合部分及該特異性結合至第二抗原之抗原結合部分。 34.  如實施例32或33中一項之方法，其中 i)在該第一雜二聚體前體多肽內，該包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈，及在該第二雜二聚體前體多肽內，該包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈；或 ii)在該第一雜二聚體前體多肽內，該包含具有臼突變之CH3域的多肽鏈，及在該第二雜二聚體前體多肽內，該包含具有杵突變之CH3域的多肽鏈 包含標籤部分，且其中該方法包含經由標籤特異性親和層析回收該第三雜二聚體多肽之步驟。 35.  如實施例32至34中一項之方法，其中該第一雜二聚體前體多肽及該第二雜二聚體前體多肽在該鉸鏈區中包含鏈間二硫鍵，且該第一雜二聚體前體多肽及該第二雜二聚體前體多肽在還原劑存在下接觸。 36.  一種雜二聚體多肽，其係藉由如實施例32至35中任一項之方法獲得。 37.  一種用於鑑別多特異性雜二聚體多肽之方法，其包含以下步驟： a)     藉由對以下之各種組合： -  來自複數個第一雜二聚體前體多肽之第一雜二聚體前體多肽，其包含特異性結合至第一抗原之抗原結合部分，及 -  來自複數個第二雜二聚體前體多肽之第二雜二聚體前體多肽，其包含特異性結合至第二抗原之抗原結合部分， 進行如實施例32至35中一項之方法來製造複數個多特異性雜二聚體多肽；及 b)     自步驟a)中製造之複數個多特異性雜二聚體多肽分別偵測各多特異性雜二聚體多肽之所需特徵，及 c)     選擇多特異性雜二聚體多肽。 38.  如實施例37之方法，其中該所需特徵係選自親和力及熱穩定性。 39.  一種多特異性雜二聚體多肽，其係藉由如實施例37至38中任一項之方法獲得。 40.  如實施例1至30中任一項之雜二聚體前體多肽集合，其用作藥物。 41.  如實施例26至30中任一項之雜二聚體前體多肽集合，其用作藥物。 42.  如實施例26至30中任一項之雜二聚體前體多肽集合，其用作藥物，其中該等雜二聚體前體多肽包含鉸鏈區，其中該鉸鏈區不包含鏈間二硫鍵。 43.  一種醫藥組合物，其包含根據實施例1至30中一項之雜二聚體前體多肽集合及醫藥學上可接受之載劑。 44.  一種第一雜二聚體前體多肽，其係如實施例1至30中任一項所定義。 45.  一種第二雜二聚體前體多肽，其係如實施例1至30中任一項所定義。 46.  一種如實施例44或45中一項之雜二聚體前體多肽在如實施例32至36中一項之方法中的用途。
胺基酸序列之描述
SEQ ID NO:1 抗生物胞素醯胺VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:2 抗生物胞素醯胺VH GVKLDETGGGLVQPGGAMKLSCVTSGFTFGHYWMNWVRQSPEKGLEWVAQFRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDTGIYYCTGASYGMEYLGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:3 抗生物胞素醯胺輕鏈多肽 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:4 具有杵之抗生物胞素醯胺重鏈多肽 GVKLDETGGGLVQPGGAMKLSCVTSGFTFGHYWMNWVRQSPEKGLEWVAQFRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDTGIYYCTGASYGMEYLGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:5 具有臼及標籤之重鏈鉸鏈-CH2-CH3多肽 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSHHHHHHHH
SEQ ID NO:6 抗螢光素VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLSWYQQKPGKVPKLLIYSAKTLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHFWSSIYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:7 抗螢光素VH GVKLDETGGGLVQPGGAMKLSCVTSGFTFGHYWMNWVRQSPEKGLEWVAQFRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDTGIYYCTGASYGMEYLGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:8 抗螢光素輕鏈多肽 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLSWYQQKPGKVPKLLIYSAKTLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHFWSSIYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:9 具有臼之抗螢光素重鏈多肽 GVKLDETGGGLVQPGGAMKLSCVTSGFTFGHYWMNWVRQSPEKGLEWVAQFRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDTGIYYCTGASYGMEYLGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:10 具有杵及標籤之重鏈鉸鏈-CH2-CH3多肽 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSHHHHHHHH
SEQ ID NO:11 抗LeY輕鏈多肽 DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQIIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:12 具有杵及VH抗CD3之抗LeY重鏈多肽 DVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISNDDSSAAYSDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSRLKSEDTAIYYCARGLAWGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGNTKYNEKFKGRATLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARDSYSNYYFDYWGQGTLVTVSSGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:13 具有臼及VL及標籤之重鏈多肽 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIKNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYSSTLLSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSITLPPTFGGGTKVEIKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSHHHHHHHH
SEQ ID NO:14 具有臼及VL抗CD3之抗LeY重鏈多肽 DVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISNDDSSAAYSDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSRLKSEDTAIYYCARGLAWGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGQGTKVEIKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:15 具有杵及VH及標籤之重鏈多肽 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSIAGTAIHWVRQAPGKGLEWVASISPGGGSTAYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSGGSGASAMDYWGQGTLVTVSSGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSHHHHHHHH
SEQ ID NO:16 具有杵及VL抗CD3之抗LeY重鏈多肽 DVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISNDDSSAAYSDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSRLKSEDTAIYYCARGLAWGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGQGTKVEIKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:17 具有臼及VH及標籤之重鏈多肽 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSIAGTAIHWVRQAPGKGLEWVASISPGGGSTAYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSGGSGASAMDYWGQGTLVTVSSGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSHHHHHHHH
SEQ ID NO:18 具有臼及VH抗CD3之抗LeY重鏈多肽 DVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISNDDSSAAYSDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSRLKSEDTAIYYCARGLAWGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGNTKYNEKFKGRATLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARDSYSNYYFDYWGQGTLVTVSSGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:19 具有杵及VL及標籤之重鏈多肽 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIKNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYSSTLLSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSITLPPTFGGGTKVEIKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSHHHHHHHH
SEQ ID NO:20 具有杵及VH抗CD3及CH2之抗LeY重鏈多肽 DVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISNDDSSAAYSDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSRLKSEDTAIYYCARGLAWGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSGGSGGEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGNTKYNEKFKGRATLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARDSYSNYYFDYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGGGSGGSGGGEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:21 具有臼及VL及CH2及標籤之重鏈多肽 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLSWYQQKPGKVPKLLIYSAKTLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHFWSSIYTFGQGTKLEIKSSGGGGSGGGGSGGSGGGEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSHHHHHHHH
SEQ ID NO:22 具有臼及VL抗CD3及CH2之抗LeY重鏈多肽 DVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISNDDSSAAYSDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSRLKSEDTAIYYCARGLAWGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSGGSGGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGQGTKVEIKSSGGGGSGGGGSGGSGGGEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:23 具有杵及VH及CH2域及標籤之重鏈多肽 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWIRQAPGKGLEWVSSINIGATYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGSPYEYDKAYYSMAYWGQGTTVTVSSASGGGGSGGGGSGGSGGGEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSHHHHHHHH
SEQ ID NO:24 具有杵及VL抗CD3及CH2之抗LeY重鏈多肽 DVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISNDDSSAAYSDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSRLKSEDTAIYYCARGLAWGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSGGSGGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGQGTKVEIKSSGGGGSGGGGSGGSGGGEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:25 具有臼及VH及CH2及標籤之重鏈多肽 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWIRQAPGKGLEWVSSINIGATYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGSPYEYDKAYYSMAYWGQGTTVTVSSASGGGGSGGGGSGGSGGGEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSHHHHHHHH
SEQ ID NO:26 具有臼及VH抗CD3及CH2之抗LeY重鏈多肽 DVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISNDDSSAAYSDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSRLKSEDTAIYYCARGLAWGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSGGSGGEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGNTKYNEKFKGRATLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARDSYSNYYFDYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGGGSGGSGGGEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:27 具有杵及VL及CH2及標籤之重鏈多肽 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLSWYQQKPGKVPKLLIYSAKTLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHFWSSIYTFGQGTKLEIKSSGGGGSGGGGSGGSGGGEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSHHHHHHHH
SEQ ID NO: 28 具有臼之抗生物胞素醯胺重鏈多肽 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGFNNKDTFFQWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGFTKYAQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDTYGAAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 29 具有杵之抗螢光素重鏈多肽 GVKLDETGGGLVQPGGAMKLSCVTSGFTFGHYWMNWVRQSPEKGLEWVAQFRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDTGIYYCTGASYGMEYLGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
實例  提供以下實例以幫助理解本發明，其真實範疇闡述於隨附申請專利範圍中。應理解，可在不偏離本發明精神之情況下對所闡述之程序進行修改。
實例1：  製造包含完整Fc域之單特異性前體多肽  為了評定由單特異性前體多肽形成雙特異性抗生物胞素醯胺/抗螢光素抗體，製造具有如圖1所指示之第一及第二雜二聚體前體多肽所描繪之域排列的單特異性前體多肽。
第一雜二聚體前體多肽(亦稱為「抗bio前體」)包含特異性結合至生物胞素醯胺(「bio」，一種生物素衍生物)之Fab片段，其具有SEQ ID NO:01之VL域及SEQ ID NO:02之VH域(描述於Dengl S等人, Hapten-directed spontaneous disulfide shuffling: a universal technology for sitedirected covalent coupling of payloads to antibodies. FASEB J 2015;29:1763-1779)。第一前體多肽包含SEQ ID NO:03之輕鏈多肽(亦稱為「bio LC」)、SEQ ID NO:04之第一重鏈多肽(亦稱為「bio HC」)及基於SEQ ID NO:05 (其代表無去穩定化突變之基礎胺基酸序列)且具有如下所示之去穩定化突變及組胺酸標籤之第二重鏈多肽。第二重鏈多肽(亦稱為「虛設臼」多肽)包含自N端至C端方向之鉸鏈區、CH2域及CH3域。
第二雜二聚體前體多肽(亦稱為「抗fluo前體」)包含特異性結合至螢光素(「fluo」)之Fab片段，其具有SEQ ID NO:06之VL域及SEQ ID NO:07之VH域。第二前體多肽包含SEQ ID NO:08之輕鏈多肽(亦稱為「fluo LC」)、SEQ ID NO:09之第一重鏈多肽(亦稱為「fluo HC」)及基於SEQ ID NO:10 (其代表無去穩定化突變之基礎胺基酸序列)且具有如下所示之去穩定化突變及組胺酸標籤之第二重鏈多肽。第二重鏈多肽(亦稱為「虛設杵」多肽)包含自N端至C端方向之鉸鏈區、CH2域及CH3域。
所示多肽鏈之CH3域包含以下突變： 表1：前體多肽之CH3域中的胺基酸取代
突變 bio HC 虛設臼 fluo HC 虛設杵
杵/臼 T366W T366S, L368A, Y407W T366S, L368A, Y407W T366W
去穩定化突變 無 有 無 有
半胱胺酸突變 S354C 無 Y349C 無
製造包含具有SEQ ID NO:05之胺基酸序列之虛設臼多肽的抗bio前體，其中進行以下胺基酸取代中之一者：E357K、D356K、C349Y、C349A、C349W、E357F、A368F、F405W、V407Y、D399A F405W、L441Y、K409E、T394I、D356K E357K、L351Y、Q347K、S354V、K370E、S364L、K392E、K439E或D399A S400K。
製造包含具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之虛設杵多肽的抗fluo前體，其中進行以下胺基酸取代中之一者：K370E、K439E、C354S、C354S N297Q、S354E、S364L、Y407W、F405W、W366I K409E、K370E K439E、D399K K409E、Y349E、S364V、L368F、K392D、T394I、Q347K K360E、E357F、S400K或L351F E357F。
如下製造前體多肽之表現質體 ： 為了表現如本文所報導之抗bio前體及抗fluo前體，使用包含以下功能元件之轉錄單元： -  包括內含子A之人類細胞巨大病毒(P-CMV)之即刻早期強化子及啟動子， -  人類重鏈免疫球蛋白5'非轉譯區(5'UTR)， -  小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列， -  編碼各別前體多肽之核酸，及 -  牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
-  除包括待表現之所需基因之表現單元/卡匣以外，基本/標準哺乳動物表現質體含有 -  來自載體pUC18之複製起點，其允許此質體在大腸桿菌中複製，及 -  在大腸桿菌中賦予安比西林抗性之β-內醯胺酶基因。
重組生產前體多肽 在適應懸浮之Expi293FTM 細胞(A14527；Life TechnologiesTM )中，在Expi293FTM 表現培養基(A1435101；Life TechnologiesTM )中，用轉染劑混合物ExpiFectamineTM 293轉染套組(A14524；Life TechnologiesTM )進行如本文所報導之抗bio前體及抗fluo前體的短暫表現。
細胞解凍後，在125 ml搖瓶中，經過稀釋至少四次(體積30 ml)進行傳代(在37℃、7% CO2 、85%濕度、135 rpm下培育/震盪)。細胞於250 ml體積中擴增至3×105 個細胞/毫升。三天後，細胞分裂且以250 ml體積中1.3*106 個細胞/毫升之密度新接種在1公升搖瓶中。24小時後以約2.2-2.8×106 個細胞/毫升之細胞密度進行轉染。
轉染前，用預熱(水浴；37℃)的Opti-MEM (Gibco)將30 µg質體DNA稀釋至1.5 ml的最終體積。將溶液輕輕混合且在室溫下培育不超過5分鐘。隨後向DNA-OptiMEM溶液中添加1.5 ml ExpiFectamineTM 試劑於Opti-MEM中之預培育溶液。將所得溶液輕輕混合且在室溫下培育20-30分鐘。將全部體積之混合物添加至具有30 ml Expi293FTM 培養物之100 ml搖瓶、50 ml falcon管或48孔深孔盤之深孔中。
將經轉染細胞在37℃、7% CO2 、85%濕度下培育7天，且在搖瓶中於110 rpm下震盪，在falcon管中於205 rpm下震盪。
轉染後16-24小時，將20 µl ExpiFectamineTM 強化子1及200 µl ExpiFectamineTM 強化子2添加至30 ml細胞培養物中。
藉由在4℃下以4,000 rpm離心20分鐘收穫上清液。此後，將無細胞上清液經由0.22 µm瓶頂過濾器過濾且儲存於冷凍箱(-20℃)中。
藉由使用MabSelectSure-SepharoseTM (GE Healthcare, Sweden)之親和層析，自細胞培養物上清液純化抗體。
簡言之，在經PBS緩衝液(10 mM Na2 HPO4 、1 mM KH2 PO4 、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡之MabSelectSuRe樹脂上捕捉無菌過濾的細胞培養物上清液，用平衡緩衝液洗滌且用25 mM檸檬酸鈉(pH 3.0)溶離。合併各別前體多肽之溶離份，且用2 M Tris (pH 9.0)中和。
或者，藉由使用ani-Ckappa樹脂(KappaSelect, GE Healthcare, Sweden)之親和層析自細胞培養物上清液純化前體多肽。
簡言之，在經PBS緩衝液(10 mM Na2 HPO4 、1 mM KH2 PO4 、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡之KappaSelect樹脂上捕捉無菌過濾的細胞培養物上清液，用平衡緩衝液洗滌且用25 mM檸檬酸鈉(pH 3.0)溶離。合併前體多肽之溶離份，且用2 M Tris (pH 9.0)中和。
藉由質譜分析確認前體多肽之身分。對於各單獨的樣品，酶促(使用N-糖苷酶F)移除保守Fc N-糖基化，使蛋白質變性(鹽酸胍)且使二硫鍵還原(使用DTT或TCEP)。藉由液相層析(藉由尺寸排阻或逆相層析)將樣品脫鹽，且藉由質譜分析(Bruker Maxis Q-ToF)進行分析。藉由精確的質量量測且與理論上預期之分子質量進行比較來確認各分子之身分。
使用200 mM K2 HPO4 /KH2 PO4 、250 mM KCl，pH 7.0運行緩衝液，在1 mg/ml之流動速率下，經由BioSuite高解析度SEC管柱(250Å, Waters, USA)進行分析型尺寸排阻層析。在反應建立之前，評定所有個別前體多肽之單體含量。 表2：具有在CH3域中具有指示之去穩定化突變之虛設臼鏈的抗bio前體多肽的單體含量(LMW…大分子量副產物；單體=所需雜二聚體前體多肽；HMW…高分子量副產物)
去穩定化突變 % SEC LMW % SEC 單體 % SEC HMW
E357K 12 88 0
D356K 23.5 73.3 3.3
C349Y 22.8 77.2 0
C349A 13.4 86.6 0
C349W 16.5 83.5 0
E357F 11.7 88.3 0
A368F 9.7 77.8 12.5
F405W 9 76.6 14.4
V407Y 13.4 68.7 17.9
D399A F405W 9.6 75.1 15.2
L441Y 12.3 72.9 14.8
K409E 8.1 73.5 18.3
T394I 19 62 19
D356K E357K 10.6 71.2 18.2
L351Y 8.5 74.4 17.1
Q347K 4.2 76.2 19.6
S354V 4.9 81.8 13.3
K370E 7 75.7 17.3
S364L 12.2 68.3 19.5
K392E 3.3 86.6 10.1
K439E 4.6 84.7 10.7
D399A S400K 12.4 78.2 9.4
表3：具有在CH3域中具有指示之去穩定化突變之虛設杵鏈的抗fluo前體多肽的單體含量(LMW...大分子量副產物；單體=所需雜二聚體前體多肽；HMW...高分子量副產物)
去穩定化突變 % SEC LMW % SEC 單體 % SEC HMW
K370E 6.6 90.5 2.9
K439E 2.6 95 2.4
C354S 7.9 84 8.1
C354S N297Q 7.2 76.6 16.2
S354E 7.9 83.3 8.8
S364L 7.8 83.4 8.8
Y407W 12.8 73.3 14
F405W 11.7 75.3 13
W366I K409D 16.7 77.5 5.8
K370E K439E 8.6 86 5.4
D399K K409E 3.6 94 2.4
Y349E 0 96.3 3.7
S364V 0 97.1 2.9
L368F 0.7 95.9 3.3
K392D 2.9 94.5 2.6
T394I 1.1 91.3 7.5
Q347K K360E 1.8 85.5 2.7
E357F 2.7 93 4.3
S400K 0 88.1 11.9
L351F E357F 3.9 83.8 12.4
實例2：  藉由ELISA直接偵測雙特異性產物多肽形成來分析多肽鏈交換效率  為了評定不同的去穩定化突變對多肽鏈交換之影響，使用實例1中製造之前體多肽建立460個交換反應。預期產物多肽之結構描繪於圖1中。藉由ELISA評定雙特異性抗生物胞素醯胺/抗螢光素產物多肽之存在。
為了開始交換反應，在384孔REMP®培養盤(Brooks, #1800030)上將抗bio前體多肽及抗fluo前體多肽以等莫耳量(標準化為%單體SEC值，以確保單個反應中完整分子之量相同)混合，蛋白質濃度為2 µM，總體積為48 µl 1×PBS + 0.05% Tween 20 + 0.25 mM TCEP。值得注意的是，添加還原劑TCEP會減少鉸鏈二硫鍵，從而支持多肽鏈之解離。離心後，將培養盤密封且在37℃下培育一小時。經由ELISA分析所得反應混合物。
隨後使用生物素 - 螢光素 橋式 ELISA 定量雙特異性抗體 ： 因此，白色Nunc® MaxiSorp™ 384孔培養盤用1 µg/ml白蛋白-螢光素異硫氰酸鹽結合物(Sigma, #A9771)塗佈且在4℃下培育隔夜。用90 µl PBST緩衝液(PBST、再蒸餾水、10×PBS + 0.05% Tween 20)洗滌3次之後，每孔添加90 µl阻斷緩衝液(1×PBS、2%明膠、0.1% Tween-20)且在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌3次後，將25 µl各反應混合物之1:4稀釋液添加至各孔中。在室溫下培育一小時後，將培養盤再用90 µl PBST緩衝液洗滌3次。添加每孔25 µl含生物素-Cy5結合物之0.5% BSA、0.025% Tween-20、1×PBS直至0.1 µg/ml之最終濃度，且將培養盤在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌6次後，向各孔中添加25 µl 1×PBS。在Tecan Safire 2讀取器上量測發射波長為670 nm (在649 nm下激發)的Cy5螢光。
預先形成的抗螢光素/抗生物胞素醯胺雙特異性參考抗體(SEQ ID NO:03之bio輕鏈、SEQ ID NO:04之bio重鏈、SEQ ID NO:08之fluo輕鏈及SEQ ID NO:09之fluo重鏈)用作反應結果之100%對照。
如上文所指示，藉由分析型尺寸排阻層析分析預先形成的雙特異性參考抗體： 表4：雙特異性參考抗體之單體含量
% SEC LMW % SEC 單體 % SEC HMW
抗螢光素/抗生物胞素醯胺雙特異性參考抗體 5.8 94 0.2
橋式ELISA設置中來自參考抗體之吸光度信號取自23個反應的平均值。此平均值用作100%橋式信號，用於所有多肽鏈交換反應之標準化。橋式ELISA中參考抗體之分析變異性為100 +/- 15.2 %。超過100%之多肽鏈交換反應可能位於此變異性內。另外，反應混合物中可能出現的潛在聚集物可能導致橋式信號增加。
結果指示於表5中。用下劃線標出來自被認為支持多肽鏈交換之CH3突變對的相對吸光度值。
表5：藉由多肽鏈反應自在虛設鏈之CH3域中包含指示之去穩定化突變的抗bio及抗fluo前體多肽形成雙特異性產物多肽。行指示抗bio前體之虛設臼多肽中的去穩定化突變；列指示抗fluo前體之虛設杵多肽中的去穩定化突變。指示經由橋式ELISA所偵測之相對吸光度。
突變 E357K D356K C349Y C349A C349W E357F A368F F405W V407Y D399A F405W L441Y
K370E 58 16 5 6 8 38 14 3 20 15 9
K439E 52 37 5 8 10 35 21 4 21 16 9
C354S 15 13 4 5 7 12 12 3 9 11 5
C354S N297Q 28 16 5 7 7 20 16 5 18 15 8
S354E 37 18 4 7 9 17 16 3 15 16 7
S364L 21 13 4 5 7 11 13 3 16 8 6
Y407W 135 33 6 7 13 63 23 4 90 24 8
F405W 93 34 9 9 13 38 25 4 64 21 11
W366I K409D 130 36 8 10 13 61 45 4 101 43 8
K370E K439E 138 68 6 8 12 74 17 3 52 17 9
D399K K409E 144 34 6 8 10 62 32 4 87 29 9
Y349E 175 38 7 9 15 109 36 7 73 26 14
S364V 13 7 4 5 6 15 17 4 13 10 7
L368F 34 17 5 8 11 45 39 5 31 19 13
K392D 44 13 4 7 9 54 27 4 60 41 12
T394I 82 29 10 16 16 81 64 9 100 22 21
Q347K K360E 43 23 8 16 21 66 39 8 60 39 20
E357F 11 7 5 7 7 13 16 6 10 9 7
S400K 25 20 8 11 13 32 25 7 25 18 12
L351F E357F 24 12 6 9 8 22 11 7 17 12 9
突變 K409E T394I D356K E357K L351Y Q347K S354V K370E S364L K392E K439E D399A S400K
K370E 32 22 37 8 4 18 2 25 14 14 27
K439E 25 29 43 11 5 21 2 28 17 15 25
C354S 14 16 12 7 4 13 2 12 14 9 13
C354S N297Q 17 19 20 6 4 17 2 13 16 11 17
S354E 15 15 16 7 4 17 2 17 16 10 16
S364L 13 14 16 7 4 11 2 11 10 12 11
Y407W 96 46 93 10 4 34 2 82 32 18 44
F405W 62 25 60 13 5 24 2 54 33 18 33
W366I K409D 89 44 93 11 5 23 2 80 28 18 74
K370E K439E 40 28 75 11 4 24 2 67 18 16 25
D399K K409E 95 55 84 8 4 23 2 91 31 15 54
Y349E 90 50 88 11 4 48 3 80 25 13 29
S364V 15 16 15 6 4 14 2 15 7 8 7
L368F 54 35 41 11 6 34 2 37 20 13 13
K392D 77 45 81 10 4 30 2 64 26 11 55
T394I 114 51 106 20 9 41 4 79 45 30 61
Q347K K360E 51 45 48 18 8 38 4 43 39 23 38
E357F 11 11 11 7 6 9 4 11 8 9 9
S400K 22 36 25 11 7 24 5 32 38 19 24
L351F E357F 18 15 27 10 6 18 4 36 16 18 15
實例3：  藉由雙特異性產物形成之生物化學定量分析多肽鏈交換效率  抗bio及抗fluo前體之子集反應形成86個雙特異性產物多肽。對於該反應，將等莫耳量的如實例1中所述之前體多肽合併。將新鮮製備之TCEP (60 eq.含0.5 mM TCEP之1 × PBS pH 7.4，0.05% Tween20)作為還原劑添加至反應混合物中，且將混合物在37℃下，在300 rpm下溫和震盪培育1小時。
雙特異性產物多肽以流經的方式自經50 mM Na2 HPO4 、300 mM NaCl，pH 8.0及1 ml/min之流量平衡之cOmplete His-Tag管柱(Roche Diagnostics GmbH)分離。剩餘的未反應的前體多肽及由虛設鏈雜二聚體組成之產物多肽經由其組胺酸標籤保留，且出於分析目的用50 mM Na2 HPO4 、300 mM NaCl、250 mM咪唑在pH 8.0下溶離。樣品經由Amicon Ultra離心管(Millipore)濃縮至0.2-1.5 mg/ml之蛋白質濃度，且藉由BioSuite高解析度SEC管柱(250Å，5 µm，Waters, USA)，使用200 mM K2 HPO4 /KH2 PO4 、250 mM KCl，pH 7.0運行緩衝液在0.5 ml/min之流動速率下進行尺寸排阻層析(SE-HPLC)來分析確定雙特異性產物形成之純度。使用CE-SDS (LabChip GXII (Perkin Elmer)在非還原(二硫橋鍵重新形成)及還原條件(蛋白質鏈之正確數量及存在)下測定雙特異性產物多肽的品質。CE-SDS之樣品製備如下：將5 µl，c = 0.1-1 mg/ml與35 µl樣品緩衝液或樣品變性溶液在96孔PCR盤中組合，且在70℃下培育10分鐘，同時溫和震盪。關於還原條件，將還原劑(NuPage)在HT蛋白質表現樣品緩衝液(例如100 µl還原劑 + 900 µl樣品緩衝液)中稀釋10倍。隨後，將70 µl純水添加至樣品中，且將樣品板置於LAbChip系統中進行分析。
86個鏈交換反應之結果顯示於表6中。具有特別高的產物產率之CH3突變對的結果以加下劃線及粗體指示。顯示的是在多肽鏈交換及純化步驟後雙特異性產物多肽之總產量，單位為mg。產物產率(%)係以校正至最大預期產物質量之重組產物的相對量來計算。對於此計算，如藉由分析型尺寸排阻層析所分析，前體多肽之量已校正為單體含量，因為預計僅單體有效重組。另外，考慮到最大預期產物質量受不太豐富的前體多肽的限制。
表6：在自虛設鏈之CH3域中包含指示之去穩定化突變的抗bio及抗fluo前體多肽的多肽鏈交換後且在純化後，雙特異性產物多肽之產率。
虛設臼CH3 中之 去穩定化突變 虛設杵CH3 中之 去穩定化突變 產物產量[mg] 產物產率[%]
E357K K370E 0.42 55.17
E357K K370E 0.49 67.12
E357K K439E 0.26 36.35
D356K K370E 0.21 33.62
D356K K439E 0.10 16.32
D356K C354S N297Q 0.15 25.45
D356K K370E K439E 0.19 45.49
D356K L368F 0.14 24.35
D356K T394I 0.11 19.05
D356K Q347K K360E 0.13 22.47
D356K V397Y 0.08 19.68
D356K S400K 0.13 41.63
C349Y K370E 0.01 5.49
C349Y C354S N297Q 0.00 0.56
C349Y S364L 0.00 0.12
C349Y K370E K439E 0.00 0.86
C349Y D399K K409E 0.00 0.31
C349Y L368F 0.00 1.63
C349Y T394I 0.01 2.79
C349Y V397Y 0.00 0.41
A368F K370E 0.14 27.51
A368F K439E 0.17 32.89
A368F C354S N297Q 0.13 25.08
A368F S364L 0.06 11.67
A368F K370E K439E 0.08 18.25
A368F D399K K409E 0.14 27.25
A368F L368F 0.13 23.76
A368F K392D 0.10 18.84
A368F T394I 0.13 24.85
A368F Q347K K360E 0.13 25.56
A368F E357F 0.06 10.45
A368F V397Y 0.12 26.88
A368F S400K 0.07 13.14
V407Y K370E 0.30 89.70
V407Y C354S N297Q 0.11 33.47
V407Y S364L 0.10 30.56
V407Y K370E K439E 0.28 82.55
V407Y Q347K K360E 0.17 49.93
V407Y V397Y 0.31 90.59
D399A F405W K370E 0.24 32.37
D399A F405W K439E 0.24 33.33
D399A F405W C354S N297Q 0.13 20.27
D399A F405W S364L 0.09 14.54
D399A F405W K370E K439E 0.16 36.75
D399A F405W Q347K K360E 0.28 43.69
D399A F405W E357F 0.05 7.29
D399A F405W V397Y 0.13 29.49
D399A F405W S400K 0.12 21.48
T394I C354S N297Q 0.09 14.63
T394I S364L 0.08 12.90
T394I W366I K409D 0.16 32.81
T394I D399K K409E 0.25 48.24
T394I L368F 0.16 25.63
T394I K392D 0.16 25.41
T394I T394I 0.14 22.56
T394I E357F 0.04 7.17
T394I S400K 0.09 14.98
S354V K370E 0.12 19.63
S354V K439E 0.15 23.60
S354V C354S N297Q 0.04 6.80
S354V W366I K409D 0.01 1.90
S354V K370E K439E 0.05 10.61
S354V D399K K409E 0.11 22.31
S354V T394I 0.06 9.34
S354V Q347K K360E 0.04 6.71
S354V V397Y 0.07 16.24
S354V S400K 0.05 8.31
S364L K439E 0.43 86.59
S364L C354S N297Q 0.15 30.85
S364L W366I K409D 0.35 70.95
S364L K370E K439E 0.41 92.99
S364L D399K K409E 0.37 75.71
S364L L368F 0.22 43.66
S364L K392D 0.25 49.62
S364L T394I 0.29 58.08
S364L Q347K K360E 0.22 43.51
S364L S400K 0.12 23.78
K439E C354S N297 0.13 38.34
K439E W366I K409D 0.14 41.17
K439E D399K K409E 0.15 42.63
K439E L368F 0.12 35.36
K439E T394I 0.12 33.48
D399A S400K K370E 0.03 4.38
D399A S400K K439E 0.05 8.15
D399A S400K K370E K439E 0.09 19.41
D399A S400K Q347K K360E 0.05 7.58
D399A S400K V397Y 0.06 14.16
實例4：  製造用於在多肽鏈交換後生成可活化結合位點之單特異性前體多肽  為了評定由單特異性前體多肽形成雙特異性抗LeY/抗CD3抗體，製造具有如圖2及圖3所指示之第一及第二雜二聚體前體多肽所描繪之域排列的單特異性前體多肽。
不含 CH2 域之前體多肽 在第一組實驗中，提供具有如圖2中所描繪之域排列的雜二聚體前體多肽。該等前體多肽不含CH2域，且包含排列於CH3域之N末端的抗體可變域。
在第一種替代方案中，提供以下前體多肽： -  第一雜二聚體前體多肽(亦稱為「抗LeY-CD3(VH)-杵前體」)包含特異性結合至LeY之Fab片段。抗LeY-CD3(VH)-杵前體包含SEQ ID NO: 11之輕鏈多肽(亦稱為「LeY LC」)、包含衍生自特異性結合至CD3之抗體之VH域(「CD3(VH)」)的SEQ ID NO: 12之第一重鏈多肽(亦稱為「LeY-CD3(VH)-杵HC」)及基於SEQ ID NO: 13(其代表無去穩定化突變之基礎胺基酸序列)且具有如下所示之去穩定化突變及組胺酸標籤之第二重鏈多肽。第二重鏈多肽(亦稱為「虛設-VL-臼」多肽)包含自N端至C端方向之鉸鏈區、衍生自特異性結合至地高辛(「dig」)之抗體的VL域及CH3域。 -  第二雜二聚體前體多肽(亦稱為「抗LeY-CD3(VL)-臼前體」)包含特異性結合至LeY之Fab片段。抗LeY-CD3(VL)-臼前體包含SEQ ID NO: 11之輕鏈多肽，亦即LeY LC；包含衍生自特異性結合至CD3之抗體之VL域(「CD3(VL)」)的SEQ ID NO: 14之第一重鏈多肽(亦稱為「LeY-CD3(VL)-臼HC」；及基於SEQ ID NO: 15 (其代表無去穩定化突變之基礎胺基酸序列)且具有如下所示之去穩定化突變及組胺酸標籤之第二重鏈多肽。第二重鏈多肽(亦稱為「虛設-VH-杵」多肽)包含自N端至C端方向之鉸鏈區、衍生自非結合抗體之VH域及CH3域。
在第二種替代方案中，提供以下前體多肽： -  第一雜二聚體前體多肽(亦稱為「抗LeY-CD3(VL)-杵前體」)包含特異性結合至LeY之Fab片段。抗LeY-CD3(VL)-杵前體包含SEQ ID NO: 11之輕鏈多肽，亦即LeY LC；包含CD3(VL)域之SEQ ID NO: 16之第一重鏈多肽(亦稱為「LeY-CD3(VL)-杵HC」)；及基於SEQ ID NO: 17 (其代表無去穩定化突變之基礎胺基酸序列)且具有如下所示之去穩定化突變及組胺酸標籤之第二重鏈多肽。第二重鏈多肽(亦稱為「虛設-VH-臼」多肽)包含自N端至C端方向之鉸鏈區、衍生自非結合抗體之VH域及CH3域。 -  第二雜二聚體前體多肽(亦稱為「抗LeY-CD3(VH)-臼前體」)包含特異性結合至LeY之Fab片段。抗LeY-CD3(VH)-臼前體包含SEQ ID NO: 11之輕鏈多肽，亦即LeY LC；包含CD3(VH)域之SEQ ID NO: 18之第一重鏈多肽(亦稱為「LeY-CD3(VH)-臼HC」)；及基於SEQ ID NO: 19 (其代表無去穩定化突變之基礎胺基酸序列)且具有如下所示之去穩定化突變及組胺酸標籤之第二重鏈多肽。第二重鏈多肽(亦稱為「虛設-VL-杵」多肽)包含自N端至C端方向之鉸鏈區、衍生自抗dig抗體之VL域及CH3域。
所示多肽鏈包含以下突變： 表7：前體多肽之CH3域中的胺基酸取代
突變 LeY-CD3(VH)- 杵 HC 虛設-VL- 臼 LeY-CD3(VL)- 臼 HC 虛設-VH- 杵
杵/臼 T366W T366S, L368A, Y407W T366S, L368A, Y407W T366W
去穩定化突變 無 有 無 有
半胱胺酸突變 無 無 無 無
突變 LeY-CD3(VL)- 杵 HC 虛設 -VH- 臼 LeY-CD3(VH)- 臼 HC 虛設 -VL- 杵
杵/臼 T366W T366S, L368A, Y407W T366S, L368A, Y407W T366W
去穩定化突變 無 有 無 有
半胱胺酸突變 無 無 無 無
具有 Fc 域之前體多肽 在第二組實驗中，提供具有如圖3中所描繪之域排列的雜二聚體前體多肽。前體多肽包含完整Fc域，且包含排列於CH2域之N末端的抗體可變域。
在第一種替代方案中，提供以下前體多肽： -  第一雜二聚體前體多肽(亦稱為「抗LeY-CD3(VH)-Fc(杵)前體」)包含特異性結合至LeY之Fab片段。抗LeY-CD3(VH)-Fc(杵)前體包含SEQ ID NO: 11之輕鏈多肽，亦即LeY LC；包含CD3(VH)域之SEQ ID NO: 20之第一重鏈多肽(亦稱為「LeY-CD3(VH)-Fc(杵) HC」)；及基於SEQ ID NO: 21 (其代表無去穩定化突變之基礎胺基酸序列)且具有如下所示之去穩定化突變及組胺酸標籤之第二重鏈多肽。第二重鏈多肽(亦稱為「虛設-VL-Fc(臼)」多肽)包含自N端至C端方向之鉸鏈區、衍生自特異性結合至地高辛(「dig」)之抗體的VL域、CH2域及CH3域。 -  第二雜二聚體前體多肽(亦稱為「抗LeY-CD3(VL)-Fc(臼)前體」)包含特異性結合至LeY之Fab片段。抗LeY-CD3(VL)-Fc(臼)前體包含LeY LC；包含CD3(VL)域之SEQ ID NO: 22之第一重鏈多肽(亦稱為「LeY-CD3(VL)-Fc(臼) HC」)；及基於SEQ ID NO: 23 (其代表無去穩定化突變之基礎胺基酸序列)且具有如下所示之去穩定化突變及組胺酸標籤之第二重鏈多肽。第二重鏈多肽(亦稱為「虛設-VH-Fc(杵)」多肽)包含自N端至C端方向之鉸鏈區、衍生自抗dig抗體之VH域、CH2域及CH3域。
在第二種替代方案中，提供以下前體多肽： -  第一雜二聚體前體多肽(亦稱為「抗LeY-CD3(VL)-Fc(杵)前體」)包含特異性結合至LeY之Fab片段。抗LeY-CD3(VL)-Fc(杵)前體包含LeY LC；包含CD3(VL)域之SEQ ID NO:24之第一重鏈多肽(亦稱為「LeY-CD3(VL)-Fc(杵) HC」)；及基於SEQ ID NO: 25 (其代表無去穩定化突變之基礎胺基酸序列)且具有如下所示之去穩定化突變及組胺酸標籤之第二重鏈多肽。第二重鏈多肽(亦稱為「虛設-VH-Fc(臼)」多肽)包含自N端至C端方向之鉸鏈區、衍生自抗dig抗體之VH域、CH2域及CH3域。 -  第二雜二聚體前體多肽(亦稱為「抗LeY-CD3(VH)-Fc(臼)前體」)包含特異性結合至LeY之Fab片段。抗LeY-CD3(VH)-Fc(臼)前體包含LeY LC；包含CD3(VH)域之SEQ ID NO:26之第一重鏈多肽(亦稱為「LeY-CD3(VH)-Fc(臼) HC」)；及基於SEQ ID NO:27 (其代表無去穩定化突變之基礎胺基酸序列)且具有如下所示之去穩定化突變及組胺酸標籤之第二重鏈多肽。第二重鏈多肽(亦稱為「虛設-VL-Fc(杵)」多肽)包含自N端至C端方向之鉸鏈區、衍生自抗dig抗體之VH域、CH2域及CH3域。
所示多肽鏈包含以下突變： 表8：前體多肽之CH3域中的胺基酸取代
突變 LeY-CD3(VH)-Fc( 杵 ) HC 虛設-VL-Fc( 臼) LeY-CD3(VL)-Fc( 臼 ) HC 虛設-VH-Fc( 杵)
杵/臼 T366W T366S, L368A, Y407W T366S, L368A, Y407W T366W
去穩定化突變 無 有 無 有
半胱胺酸突變 S354C 無 Y349C 無
突變 LeY-CD3(VL)-Fc( 杵 ) HC 虛設 -VH-Fc( 臼 ) LeY-CD3(VH)-Fc( 臼 ) HC 虛設 -VL-Fc( 杵 )
杵/臼 T366W T366S, L368A, Y407W T366S, L368A, Y407W T366W
去穩定化突變 無 有 無 有
半胱胺酸突變 S354C 無 Y349C 無
製造如上文所指示之包含SEQ ID NO: 13之虛設VL-臼多肽及SEQ ID NO: 17之虛設VH-臼多肽的雜二聚體前體多肽，其具有如上文所指示之各別虛設多肽之胺基酸序列，其中進行以下胺基酸取代中之一者：E357K、A368F、D399A F405W、S364L、Y407W或S354V。
製造如上文所指示之包含SEQ ID NO: 15之虛設VH-杵多肽及SEQ ID NO: 19之虛設VL-杵多肽的雜二聚體前體多肽，其具有如上文所指示之各別虛設多肽之胺基酸序列，其中進行以下胺基酸取代中之一者：K370E、無去穩定化突變、W366I K409D、V397Y或K392D。
製造如上文所指示之包含SEQ ID NO: 21之虛設VL-Fc(臼)多肽及SEQ ID NO: 25之虛設-VH-Fc(臼)多肽的雜二聚體前體多肽，其具有如上文所指示之各別虛設多肽之胺基酸序列，其中製備以下胺基酸取代中之一者：E357K、A368F、D399A F405W、S364L、D356K或S354V。
製造如上文所指示之包含SEQ ID NO: 23之虛設-VH-Fc(杵)多肽及SEQ ID NO:27之虛設-VL-Fc(杵)多肽的雜二聚體前體多肽，其具有如上文所指示之各別虛設多肽之胺基酸序列，其中進行以下胺基酸取代中之一者：K370E、無去穩定化突變、W366I K409D、V397Y、K392D或K370E K439E。
重組生產前體多肽 藉由目前先進技術將各前體多肽之三條多肽鏈的質體共轉染至哺乳動物細胞(例如HEK293或Expi293FTM )中來完成表現。
為了表現上文所示之前體多肽，使用包含以下功能元件之轉錄單元： -  包括內含子A之人類細胞巨大病毒(P-CMV)之即刻早期強化子及啟動子， -  人類重鏈免疫球蛋白5'非轉譯區(5'UTR)， -  小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列， -  編碼各別前體多肽之核酸，及 -  具有聚腺苷酸化信號序列之3'非轉譯區。
除包括待表現之所需基因之表現單元/卡匣以外，基本/標準哺乳動物表現質體含有 -  複製起點，其允許此質體在大腸桿菌中複製，及 -  在大腸桿菌中賦予安比西林抗性之β-內醯胺酶基因。
編碼包含前體多肽鏈之表現卡匣係藉由PCR及/或基因合成製造，且藉由已知重組方法及技術連接相應的核酸區段，例如使用各別質體中之獨特限制位點進行組裝。藉由DNA定序驗證次選殖核酸序列。對於短暫轉染，藉由自轉型之大腸桿菌培養物(HiSpeed Plasmid Maxi Kit, Qiagen)製備質體來製備大量質體。
如Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.及Yamada, K.M. (編), John Wiley & Sons, Inc.中所描述使用標準細胞培養技術。
根據製造商的說明書，藉由使用HEK293-F系統(Invitrogen)或Expi293FTM 系統(Live Technologies)短暫轉染各別質體來製造前體多肽衍生物。簡言之，將在搖瓶或攪拌醱酵罐中在無血清FreeStyle™ 293表現培養基(Invitrogen)或Expi293FTM 表現培養基(Life Technologies)中懸浮生長之HEK293-F細胞(Invitrogen)或Expi293FTM 細胞(Live Technologies)用各別表現質體及293fectin™、fectin (Invitrogen)或PEIpro (Polyplus)或試劑混合物ExpiFectamineTM 293轉染套組(Life Technologies)轉染。對於1-2 L搖瓶(Corning)，將HEK293-F細胞或Expi293FTM 細胞以1-1.3*106 個細胞/毫升之密度接種於250-600 mL中，且在120 rpm、8% CO2 下培育。次日，用適當的表現質體轉染細胞。HEK293-F細胞以約1.5*106 個細胞/毫升之細胞密度用約42 mL A) 20 mL Opti-MEM (Invitrogen)與300 µg總質體DNA (0.5 µg/mL)及B) 20 ml Opti-MEM + 1.2 mL 293 fectin或fectin (2 µL/mL)或750 µl PEIpro (1.25 µL/mL)之混合物轉染。Expi293FTM 細胞以約2.2-2.8×106 個細胞/毫升之細胞密度轉染。轉染前，用預熱(水浴；37℃)的Opti-MEM (Gibco)將30 µg質體DNA稀釋至1.5 ml的最終體積。將溶液輕輕混合且在室溫下培育不超過5分鐘。隨後向DNA-OptiMEM溶液中添加1.5 ml ExpiFectamineTM 試劑於Opti-MEM中之預培育溶液。將所得溶液輕輕混合且在室溫下培育20-30分鐘。將全部體積之混合物添加至具有30 ml Expi293FTM 培養物之100 ml搖瓶中。將培養物在37℃、7% CO2 、85%濕度、110 rpm下培育7天。對於Expi293FTM 培養物，在轉染後15-24小時，將20 µl ExpiFectamineTM 強化子1及200 µl ExpiFectamineTM 強化子2添加至30 ml細胞培養物中。在醱酵過程中，根據葡萄糖消耗來添加葡萄糖溶液。正確組裝之分裂細胞介素分子類似於標準IgG分泌於培養物上清液中。在5-10天之後收集含有分裂細胞介素分子之上清液，且將分裂細胞介素分子自上清液直接純化或將上清液在-20℃下冷凍並儲存。
具有完整Fc區(CH2-CH3)之前體多肽與蛋白質A結合。此等前體藉由蛋白質A層析隨後藉由SEC純化。
前體多肽不含CH2域，但含有κ輕鏈。因此，此等前體藉由應用標準κ輕鏈親和層析來純化。藉由使用KappaSelect (GE Healthcare, Sweden)之親和層析及Superdex 200尺寸排阻(GE Healthcare, Sweden)層析或離子交換層析自細胞培養物上清液純化前體多肽。
簡言之，在經PBS緩衝液(10 mM Na2 HPO4 、1 mM KH2 PO4 、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡之KappaSelect樹脂上捕捉無菌過濾的細胞培養物上清液，用平衡緩衝液洗滌且用50 mM檸檬酸鈉、150 mM NaCl在pH 3.0下溶離。合併前體多肽之溶離份，且用2 M Tris (pH 9.0)中和。前體多肽庫藉由尺寸排阻層析或離子交換層析進一步純化。對於尺寸排阻層析，用20 mM組胺酸、140 mM NaCl，pH 6.0平衡Superdex™ 200 pg HiLoad™ 16/600 (GE Healthcare, Sweden)管柱。對於離子交換層析，將自KappaSelect純化獲得之蛋白質樣品1:10稀釋於20 mM組胺酸pH 6.0中，且負載於用緩衝液A (20 mM組胺酸，pH 6.0)平衡之HiTrap™ SP HP離子交換(GE Healthcare, Sweden)管柱上。應用0-100%緩衝液B (20 mM組胺酸、1 M NaCl，pH 6.0)之梯度溶離不同的蛋白質物種。
在純化後藉由SDS-PAGE分析純度及完整性。將蛋白質溶液(13 µl)與5 µl 4× NuPAGE LDS樣品緩衝液(Invitrogen)及2 µl 10× NuPAGE樣品還原劑(Invitrogen)混合且加熱至95℃持續5分鐘。將樣品負載於NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上，且根據製造商說明書使用Novex Mini-Cell (Invitrogen)及NuPAGE MES SDS運行緩衝液(Life Technologies)運行。使用InstantBlue™庫馬斯蛋白質染色劑對凝膠進行染色。此外，使用分析型尺寸排阻層析分析蛋白質之完整性及均一性。
(CE-)SDS-PAGE表明所有預期的多肽鏈存在於製備物中；分析型尺寸排阻證實製備物之純度＞90%。關於評定抗體純度之方法之綜述，參見例如Flatman, S.等人, J. Chrom. B 848 (2007) 79-87。
實例5：  經由T細胞活化分析測定多肽鏈交換  為了評定不同的去穩定化突變對多肽鏈交換之影響，使用實例4中製造之前體多肽建立交換反應。不含CH2域之前體多肽之預期產物多肽的結構描繪於圖2中，且包含完整Fc域之前體多肽之預期產物多肽的結構描繪於圖3中。多肽鏈交換導致形成特異性結合至CD3之抗原結合位點。藉由基於細胞之分析評定雙特異性抗LeY/抗CD3產物多肽之存在。
在由表現LeY之MCF7細胞及Jurkat報導體細胞株(Promega J1621)構成之基於細胞之報導分析系統中，根據以下原理評估不同的CH3介面突變對此鏈交換反應功效之影響：第一及第二雜二聚體多肽與MCF7細胞之結合及多肽鏈交換導致形成特異性結合至CD3之抗原結合位點。表現CD3之Jurkat細胞藉由特異性結合至CD3之抗原結合位點結合，從而導致Jurkat細胞表現螢光素酶。添加BioGlo受質後偵測到發光。
簡言之，基於細胞之分析如下在384孔盤中進行。將具有10% FCS之RPMI1640用作分析培養基。將6×104 個Jurkat效應細胞與2×104 個MCF7細胞混合，總體積為10 µl。前體多肽以200 nM及2 nM單獨或組合應用，最終體積為30 µl。將細胞在細胞培養條件下培育20小時。向各孔中添加24 µl Bioglo，培育5分鐘。在Infinite® 200 PRO讀取器(TECAN)中量測發光。
表9：藉由多肽鏈反應自如上文實例4中所定義之不含CH2域之前體多肽形成雙特異性產物多肽，該等前體多肽在虛設鏈之CH3域中包含指示之去穩定化突變。顯示在200 nM前體多肽濃度下之交換反應的結果。發光效率評定如下：＜10% … 「-」，10-29% …「+」，30-50% … 「++」，＞50% …「+++」)
虛設-VL- 杵
虛設-VH- 臼 突變 K370E 無突變 W366I K409D V397Y K392D
E357K +++ + +++ ++ ++
A368F - - + - -
D3 99A F405W ++ - ++ ++ ++
S364L +++ + +++ ++ ++
Y407W +++ ++ +++ ++ ++
S354V + - + - -
虛設-VH- 杵
虛設-VL- 臼 突變 K370E 無突變 W366I K409D V397Y K392D
E357K ++ + +++ +++ ++
A368F - - + + -
D3 99A F405W + + ++ ++ ++
S364L ++ ++ +++ +++ ++
Y407W ++ ++ +++ +++ ++
S354V + + ++ ++ +
表10：藉由多肽鏈反應自如上文實例4中所定義之不含CH2域之前體多肽形成雙特異性產物多肽，該等前體多肽在虛設鏈之CH3域中包含指示之去穩定化突變。顯示在2 nM前體多肽濃度下之交換反應的結果。發光效率評定如下：＜2% … 「-」，2-4% …「+」，5-10% … 「++」，＞10% …「+++」)
虛設-VL- 杵
虛設-VH- 臼 突變 K370E 無突變 W366I K409D V397Y K392D
E357K + - ++ - -
A368F - - - - -
D3 99A F405W - - + - -
S364L + - ++ - -
Y407W + - ++ - -
S354V - - - - -
虛設-VH- 杵
虛設-VL- 臼 突變 K370E 無突變 W366I K409D V397Y K392D
E357K - - +++ ++ -
A368F - - - - -
D3 99A F405W - - + + -
S364L - - ++ ++ -
Y407W - - +++ +++ -
S354V - - - - -
表11：藉由多肽鏈反應自如上文實例4中所定義之具有Fc域之前體多肽形成雙特異性產物多肽，該等前體多肽在虛設鏈之CH3域中包含指示之去穩定化突變。顯示在2 nM前體多肽濃度下之交換反應的結果。發光效率評定如下：＜10% … 「-」，10-19% …「+」，20-50% … 「++」，＞50% …「+++」)
虛設-VH-Fc( 杵)
虛設-VL-Fc( 臼) 突變 K370E 無突變 W366I K409D V397Y K392D K370E K439E
E357K +++ + +++ +++ +++ +++
A368F ++ - ++ ++ ++ ++
D3 99A F405W + - ++ + + +
S364L +++ + +++ +++ +++ +++
D356K + - + + + +
S354V + - + + + +
實例6：  製造其他包含完整Fc域之單特異性前體多肽  為了評定由單特異性前體多肽形成雙特異性抗生物胞素醯胺/抗螢光素抗體，製造具有如圖1所指示之第一及第二雜二聚體前體多肽所描繪之域排列的單特異性前體多肽。注意，在此實驗中，杵突變及臼突變排列於相對的鏈上。
第一雜二聚體前體多肽(亦稱為「抗fluo前體」)包含特異性結合至螢光素(「fluo」，一種生物素衍生物)之Fab片段，其具有SEQ ID NO:06之VL域及SEQ ID NO:07之VH域。第一前體多肽包含SEQ ID NO:08之輕鏈多肽(亦稱為「fluo LC」)、SEQ ID NO:29之第一重鏈多肽(亦稱為「fluo HC」)及基於SEQ ID NO:05 (其代表無去穩定化突變之基礎胺基酸序列)且具有如下所示之去穩定化突變及C標籤的第二重鏈多肽。第二重鏈多肽(亦稱為「虛設臼」多肽)包含自N端至C端方向之鉸鏈區、CH2域及CH3域。
第二雜二聚體前體多肽(亦稱為「抗bio前體」)包含特異性結合至生物胞素醯胺(「bio」)之Fab片段，其具有SEQ ID NO:01之VL域及SEQ ID NO:02之VH域。第二前體多肽包含SEQ ID NO:03之輕鏈多肽(亦稱為「bio LC」)、SEQ ID NO:28之第一重鏈多肽(亦稱為「bio HC」)及基於SEQ ID NO: 10 (其代表無去穩定化突變之基礎胺基酸序列)且具有如下所示之去穩定化突變及C標籤的第二重鏈多肽。第二重鏈多肽(亦稱為「虛設杵」多肽)包含自N端至C端方向之鉸鏈區、CH2域及CH3域。
根據如實例1所揭示之方法製造第一及第二雜二聚體前體多肽。
所示多肽鏈之CH3域包含以下突變： 表12：具有在CH3域中具有指示之去穩定化突變之虛設臼鏈的抗fluo前體多肽的純化產率及單體含量(純化產率[mg/ml] = 每公升表現體積之純化抗體量，藉由%單體峰值校正；單體 = 所需雜二聚體前體多肽)
去穩定化突變 純化產率[mg/L] % SEC 單體
E357F 45.6 96.6
V407Y 30.1 95.7
D356K 39.5 90.7
K409E 78.3 99.1
D356K-E357K 42.1 95.9
S364L 65.9 95.8
S364A 75.0 81.5
S364I 61.9 90.8
S364Q 34.3 98.5
E357F-T394I 43.2 98.9
E357F-S364L 56.1 81.2
D356K-V407Y 28.7 84.7
D356K-S364L 43.4 92.0
E357K-T394I 40.6 98.0
表13：具有在CH3域中具有指示之去穩定化突變之虛設杵鏈的抗bio前體多肽的純化產率及單體含量(純化產率[mg/ml] = 每公升表現體積之純化抗體量，藉由%單體峰值校正；單體 = 所需雜二聚體前體多肽)
去穩定化突變 純化產率[mg/L] % SEC 單體
Y407W 104.1 95.3
W366I-K409D 40.2 91.0
D399K-K409E 88.0 91.3
K370E-K439E 45.7 98.9
Y349E 153.5 94.8
T394I 49.7 98.5
Y349D 96.2 98.2
Y349F 76.8 91.4
Y349H 75.5 89.9
Y349E-Y407W 75.8 94.6
W366I-F405W-K409D 106.8 93.7
T394I-F405W 54.5 90.8
W366I-K409D-K439E 37.9 93.4
Y349E-K439E 72.0 98.0
實例7：  實例6之前體多肽的多肽鏈交換效率分析  為了評定不同的去穩定化突變對多肽鏈交換之影響，在實例6中製造之前體多肽之間進行交換反應。根據實例2中所述之方法論進行實驗。預期產物多肽之結構描繪於圖1中。
表14：藉由多肽鏈交換反應自在虛設鏈之CH3域中包含指示之去穩定化突變的抗bio及抗fluo前體多肽形成雙特異性產物多肽。行指示抗fluo前體之虛設臼多肽中的去穩定化突變；列指示抗bio前體之虛設杵多肽中的去穩定化突變。值經由產物產率[%]表示交換效率。實驗獲得之產率與雙特異性抗體之最大可能產率有關。雙特異性抗體之最大可能產率係藉由各反應中兩種相應輸入形式之最低%單體峰SEC進行校正，因為預計僅單體有效重組。
突變 E357F V407Y D356K K409E D356K E357K S364L S364A
Y407W 63.5 79.5 43.1 74.6 73.8 74.7 55.3
W366I K409D 65.9    85.4 40.2 88.7 79.8 86.8 50.4
D399K K409E 78.5 92.8 45.1 73.6 77.3 81.7 73.0
K370E K439E 73.9 70.6 68.1 55.8 82.2 69.3 71.4
Y349E 75.4 75.4 52.3 72.6 79.3 85.0 68.9
T394I 51.9 70.8 39.1 57.6 61.3 58.3 43.7
Y349D 71.4 77.0 51.0 67.2 79.0 76.9 66.9
Y349F 56.8 59.8 43.2 43.9 56.1 56.3 49.1
Y349H 64.5 70.3 47.1 57.1 77.0 63.3 56.2
Y349E Y407W 72.2 82.0 49.6 79.9 84.8 84.0 67.1
W366I F405W K409D 81.4 76.2 43.0 73.6 78.4 77.5 69.7
T394I F405W 68.7 84.3 48.9 67.6 68.0 73.5 53.5
W366I K409D K439E 74.3 89.2 54.7 75.7 77.0 77.7 60.3
Y349E K439E 75.2 84.1 63.0 68.7 70.4 71.4 70.0
Y349E W366I K409D 79.8 80.7 46.1 74.7 75.8 82.2 63.1
突變 S364I S364Q E357F T394I E357F S364L D356K V407Y D356K S364L E357K T394I
Y407W 81.4 70.2 87.4 90.6 79.3 78.4 66.3
W366I K409D 79.6 77.5 81.0 86.6 96.4 85.2 94.9
D399K K409E 77.0 80.7 82.0 94.5 95.1 79.2 91.9
K370E K439E 87.9 71.7 72.6 90.6 95.6 87.9 76.8
Y349E 79.3 73.0 83.0 84.7 85.0 82.1 70.6
T394I 64.8 52.8 74.8 77.6 78.2 69.0 57.5
Y349D 86.8 77.8 72.3 88.7 89.6 88.7 75.9
Y349F 58.0 51.3 61.5 73.3 60.8 56.7 63.5
Y349H 76.9 65.9 73.7 77.2 75.3 77.1 80.6
Y349E Y407W 86.3 79.2 86.8 99.4 84.8 86.6 82.7
W366I F405W K409D 78.2 76.2 79.8 100 81.4 79.1 81.9
T394I F405W 84.2 66.6 77.8 87.9 96.7 71.2 79.3
W366I K409D K439E 73.3 72.8 78.0 89.4 96.2 78.3 81.4
Y349E K439E 91.5 69.1 78.3 95.4 97.7 76.6 72.8
Y349E W366I K409D 84.7 76.0 83.8 98.4 90.1 76.6 75.8
實例8：  製造其他包含完整Fc域之單特異性前體多肽，其中該等前體多肽之CH3域包含杵臼突變，但不包含半胱胺酸突變  為了評定由單特異性前體多肽形成雙特異性抗生物胞素醯胺/抗螢光素抗體，製造具有如圖1所指示之第一及第二雜二聚體前體多肽所描繪之域排列的單特異性前體多肽。注意，在此實驗中，杵突變及臼突變排列於相對的鏈上。
如實例6中所述之第一及第二雜二聚體前體多肽係根據其中所揭示之結構及方法來製造。
此外，與實例1不同，bio HC係基於SEQ ID NO: 28，但在位置354處具有絲胺酸殘基，而fluo HC係基於SEQ ID NO: 29，但在位置349處具有酪胺酸殘基。因此，CH3域之突變概述如下： 表15：前體多肽之CH3域中的胺基酸取代
突變 bio HC 虛設 杵 fluo HC 虛設臼
杵/臼 T366S, L368A, Y407W T366W T366W T366S, L368A, Y407W
去穩定化突變 無 有 無 有
半胱胺酸突變 無 無    無 無
所示多肽鏈之CH3域包含以下突變： 表16：具有在CH3域中具有指示之去穩定化突變之虛設杵鏈的抗bio前體多肽的純化產率及單體含量(純化產率[mg/ml] = 每公升表現體積之純化抗體量，藉由%單體峰值校正；單體 = 所需雜二聚體前體多肽)
去穩定化突變 純化產率 [mg/L] % SEC 單體
E357F 29.6 98.0
V407Y 16.8 97.4
D356K 22.9 91.2
K409E 27.0 96.7
D356K-E357K 68.4 99.0
S364L 23.4 94.9
S364A 38.3 95.1
S364I 69.5 97.9
S364Q 36.4 95.3
E357F-T394I 15.8 98.8
E357F-S364L 16.9 94.5
D356K-V407Y 16.7 93.7
D356K-S364L 30.2 98.2
E357K-T394I 27.9 96.4
表17：具有在CH3域中具有指示之去穩定化突變之虛設臼鏈的抗fluo前體多肽的純化產率及單體含量(純化產率[mg/ml] = 每公升表現體積之純化抗體量，藉由%單體峰值校正；單體 = 所需雜二聚體前體多肽)
去穩定化突變 純化產率[mg/L] % SEC 單體
Y407W 60.6 94.3
W366I-K409D 59.7 98.3
K370E-K439E 59.0 98.3
D399K-K409E 40.4 85.5
Y349E 39.8 99.7
T394I 8.6 95.7
Y349D 71.1 96.6
Y349F 30.2 98.2
Y349H 33.9 95.1
Y349E-Y407W 50.6 99.0
W366I-F405W-K409D 87.4 98.3
T394I-F405W 63.8 96.6
W366I-K409D-K439E 60.2 97.7
Y349E-W366I-K409D 58.1 98.4
Y349E-K439E 71.2 97.0
實例9：  實例8之前體多肽的多肽鏈交換效率分析  為了評定不同的去穩定化突變對多肽鏈交換之影響，在實例8中製造之前體多肽之間進行交換反應。根據實例2中所述之方法論進行實驗。
表18：藉由多肽鏈交換反應自在虛設鏈之CH3域中包含指示之去穩定化突變的抗bio及抗fluo前體多肽形成雙特異性產物多肽。行指示抗fluo前體之虛設臼多肽中的去穩定化突變；列指示抗bio前體之虛設杵多肽中的去穩定化突變。值經由產物產率[%]表示交換效率。實驗獲得之產率與雙特異性抗體之最大可能產率有關。雙特異性抗體之最大可能產率係藉由各反應中兩種相應輸入形式之最低%單體峰SEC進行校正，因為預計僅單體有效重組。
突變 E357F V407Y D356K K409E D356K E357K S364L S364A
Y407W 51.5 67.2 26.4 56.3 72.9 66.5 23.6
W366I K409D 58.5 80.3 31.3 72.5 82.5 80.3 8.8
D399K K409E 97.4 100.1 48.5 90.8 91.6 86.2 24.2
K370E K439E 58.6 71.5 54.3 47.0 78.4 82.9 25.4
Y349E 67.3 77.2 38.1 50.0 80.0 77.8 24.7
T394I 41.2 78.8 26.8 50.6 60.5 53.9 15.7
Y349D 63.3 76.3 38.6 52.1 78.7 80.2 32.6
Y349F 29.5 55.5 25.6 23.9 39.4 36.1 10.6
Y349H 45.0 52.1 25.9 40.0 62.6 54.3 10.8
Y349E Y407W 71.4 81.8 44.1 72.8 75.2 83.8 21.6
W366I F405W K409D 86.4 84.8 43.4 79.2 80.3 83.2 23.9
T394I F405W 69.4 77.6 35.9 69.9 69.6 85.7 24.5
W366I K409D K439E 67.8 86.7 59.0 73.7 80.3 78.0 16.3
Y349E K439E 52.6 60.3 39.2 50.1 48.4 62.5 24.1
Y349E W366I K409D 74.0 75.2 41.7 73.0 75.2 81.4 20.2
突變 S364I S364Q E357F T394I E357F S364L D356K V407Y D356K S364L E357K T394I
Y407W 27.8 60.2 82.7 64.8 69.6 72.9 81.6
W366I K409D 65.6 67.1 76.0 62.2 88.1 84.6 89.6
D399K K409E 50.9 92.7 88.0 78.3 99.7 86.6 83.0
K370E K439E 68.4 64.8 76.4 71.3 85.8 83.2 69.3
Y349E 65.2 71.3 81.9 66.6 80.6 74.7 65.7
T394I 51.7 43.2 68.0 55.9 70.7 64.2 69.7
Y349D 77.2 62.8 82.7 69.7 78.5 77.7 64.1
Y349F 28.5 29.2 47.8 42.7 52.8 39.8 54.7
Y349H 33.8 50.0 69.0 50.8 56.1 55.6 72.0
Y349E Y407W 78.0 77.0 75.7 76.0 89.8 80.9 88.7
W366I F405W K409D 64.2 72.3 72.9 73.5 79.0 78.1 77.6
T394I F405W 77.9 74.5 72.3 68.4 92.3 85.8 76.7
W366I K409D K439E 69.5 76.9 74.8 69.5 89.6 76.2 83.0
Y349E K439E 14.7 60.3 55.3 55.3 65.5 64.1 64.8
Y349E W366I K409D 80.0 82.1 74.3 80.2 83.9 71.0 77.3
結果表明，對於雜二聚體前體多肽而言，多肽鏈交換為可偵測的，其中杵臼突變未由額外半胱胺酸突變穩定。
實例10：  製造其他包含完整Fc域之單特異性前體多肽，前體多肽之CH3域具有不同的突變  為了評定由單特異性前體多肽形成雙特異性抗生物胞素醯胺/抗螢光素抗體，製造具有如圖1所指示之第一及第二雜二聚體前體多肽所描繪之域排列的單特異性前體多肽。注意，在此實驗中，杵突變及臼突變排列於相對的鏈上。
如實例6中所述之第一及第二雜二聚體前體多肽係根據其中所揭示之結構及方法來製造，但具有以下差異： 與實例6不同，製造三種特異性結合至螢光素之前體多肽，其中fluo HC係基於SEQ ID NO: 29，且虛設臼多肽係基於SEQ ID NO: 05且具有以下CH3突變：
前體多肽#01
突變 fluo HC 虛設臼
杵/臼 T366W T366S, L368A, Y407W
去穩定化突變 無 E357K
半胱胺酸突變 S354C 無
前體多肽#02
突變 fluo HC 虛設臼
杵/臼 T366W T366S, L368A, Y407W
去穩定化突變 無 E357K
半胱胺酸突變 無 Y349C
前體多肽#03
突變 fluo HC 虛設臼
杵/臼 T366W T366S, L368A, Y407W
去穩定化突變 無 E357K
半胱胺酸突變 S354C Y349C
-  與實例1不同，製造三種特異性結合至生物胞素醯胺之前體多肽，其中bio HC係基於SEQ ID NO: 28，且虛設杵多肽係基於SEQ ID NO: 10且具有以下CH3突變：
前體多肽#04
突變 bio HC 虛設 杵
杵/臼 T366S, L368A, Y407W T366W
去穩定化突變 無 K370E
半胱胺酸突變 Y349C 無
前體多肽#05
突變 bio HC 虛設 杵
杵/臼 T366S, L368A, Y407W T366W
去穩定化突變 無 K370E
半胱胺酸突變 無 S354C
前體多肽#06
突變 bio HC 虛設 杵
杵/臼 T366S, L368A, Y407W T366W
去穩定化突變 無 K370E
半胱胺酸突變 Y349C S354C
表19：指示之前體多肽的純化產率及單體含量(純化產率[mg/ml] = 每公升表現體積之純化抗體量，藉由%單體峰值校正；單體 = 所需雜二聚體前體多肽)
虛設突變 純化產率[mg/L] % SEC 單體
#01 70.0 97.4
#02 17.1 92.1
#03 67.4 99.6
#04 114.3 96.1
#05 44.7 96.1
#06 142.6 98.8
實例11：  實例10之前體多肽的多肽鏈交換效率分析  為了評定不同的去穩定化突變對多肽鏈交換之影響，在實例10中製造之前體多肽之間進行交換反應。根據實例2中所述之方法論進行實驗。
表18：藉由多肽鏈交換反應自指示之抗bio及抗fluo前體多肽形成雙特異性產物多肽。值經由產物產率[%]表示交換效率。實驗獲得之產率與雙特異性抗體之最大可能產率有關。雙特異性抗體之最大可能產率係藉由各反應中兩種相應輸入形式之最低%單體峰SEC進行校正，因為預計僅單體有效重組。
# 前體多肽 #01 #02 #03
#04 59.6 67.4 ＜10
#05 39.5 43.8 ＜10
#06 ＜10 10.5 ＜10
結果表明，多肽鏈的出現與在虛設鏈多肽上或在包含抗原結合部分之多肽鏈上的排列半胱胺酸突變無關。
圖1：雜二聚體前體多肽及在多肽鏈交換後形成之相應產物多肽的例示性結構。第一雜二聚體前體多肽包含三條多肽鏈：1. 第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之抗體域VH、CH1、鉸鏈、CH2及CH3。CH3域包含杵突變及半胱胺酸突變，且不包含去穩定化突變。2. 第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之抗體域鉸鏈、CH2及CH3。標籤部分與CH3域之C端融合。CH3域包含臼突變及去穩定化突變。3. 輕鏈多肽，其包含N端至C端方向之抗體域VL及CL。VH域及VL域形成特異性結合至第一抗原之抗原結合位點。第一雜二聚體前體多肽之重鏈多肽經由其CH3域彼此締合。鉸鏈區包含鏈間二硫鍵。第二雜二聚體前體多肽包含三條多肽鏈：1. 第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之抗體域VH、CH1、鉸鏈、CH2及CH3。CH3域包含臼突變及半胱胺酸突變，且不包含去穩定化突變。2. 第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之抗體域鉸鏈、CH2及CH3。標籤部分與CH3域之C端融合。CH3域包含杵突變及去穩定化突變。3. 輕鏈多肽，其包含N端至C端方向之抗體域VL及CL。VH域及VL域形成特異性結合至第二抗原之抗原結合位點。第二雜二聚體前體多肽之重鏈多肽經由其CH3域彼此締合。鉸鏈區包含鏈間二硫鍵。在還原劑存在下，鉸鏈區中之鏈間二硫鍵經還原，從而使由第一及第二重鏈多肽形成之雜二聚體去穩定化且支持多肽鏈交換。因此，形成雜二聚體產物多肽。第一產物多肽包含兩個抗原結合位點，亦即來自第一雜二聚體前體多肽之抗原結合位點及來自第二雜二聚體前體多肽之抗原結合位點。第一產物多肽包含來自第一及第二雜二聚體前體多肽之第一重鏈多肽，其經由其CH3域締合。第一產物多肽中包含之兩個重鏈多肽均包含不包含去穩定化突變之CH3域。兩個CH3域均包含半胱胺酸突變，其相互作用且支持雜二聚體產物多肽之形成。在此實例中不包含抗原結合位點之第二產物多肽包含來自第一雜二聚體前體多肽之第二重鏈多肽及來自第二雜二聚體前體多肽之第二重鏈多肽。兩個重鏈多肽均經由其CH3域締合。兩個CH3域均包含去穩定化突變，其相互作用且支持雜二聚體產物多肽之形成。此產物多肽包含允許經由標籤特異性層析純化之標籤部分。
圖2：雜二聚體前體多肽及在多肽鏈交換後形成之相應產物多肽的例示性結構，其中多肽鏈交換導致抗原結合位點之活化。第一雜二聚體前體多肽包含三條多肽鏈：1. 第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之抗體域VH、CH1、肽連接體、衍生自第一抗體之VH域及CH3。CH3域包含杵突變，且不包含去穩定化突變。2. 第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之以下抗體域：衍生自第二抗體之VL域及CH3。CH3域包含臼突變及去穩定化突變。3. 輕鏈多肽，其包含N端至C端方向之抗體域VL及CL。來自第一重鏈多肽之N端VH域及來自輕鏈多肽之VL域形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點。第一雜二聚體前體多肽之重鏈多肽經由其CH3域彼此締合。在第一及第二重鏈多肽之間沒有形成鏈間二硫鍵。在衍生自第一抗體之VH域與來自第二重鏈多肽之VL域之間形成一對VH域及VL域。兩個可變域彼此締合，但不形成特異性結合至抗原之抗原結合位點。第二雜二聚體前體多肽包含三條多肽鏈：1. 第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之抗體域VH、CH1、肽連接體、衍生自第一抗體之VL域及CH3。CH3域包含臼突變，且不包含去穩定化突變。2. 第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之以下抗體域：衍生自第三抗體之VH域及CH3。CH3域包含杵突變及去穩定化突變。3. 輕鏈多肽，其包含N端至C端方向之抗體域VL及CL。第一重鏈多肽之N端VH域及輕鏈多肽之VL域形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點。第二雜二聚體前體多肽之重鏈多肽經由其CH3域彼此締合。在第一及第二重鏈多肽之間沒有形成鏈間二硫鍵。在衍生自第一抗體之VL域與來自第二重鏈多肽之VH域之間形成一對VH域及VL域。兩個可變域彼此締合，但不形成特異性結合至抗原之抗原結合位點。在多肽鏈交換後，形成雜二聚體產物多肽。第一產物多肽包含來自前體多肽之兩個抗原結合位點，亦即來自第一雜二聚體前體多肽之抗原結合位點及來自第二雜二聚體前體多肽之抗原結合位點。第一產物多肽包含來自第一及第二雜二聚體前體多肽之第一重鏈多肽，其經由其CH3域締合。第一產物多肽中包含之兩個重鏈多肽均包含不包含去穩定化突變之CH3域。藉由使來自第一及第二雜二聚體前體多肽之第一重鏈多肽締合，形成一對衍生自第一抗體之VH域及衍生自第一抗體之VL域，其形成特異性結合至第一抗原之抗原結合位點。此抗原結合位點不存在於任何前體多肽，且僅在多肽鏈交換後形成(活化)。第二產物多肽包含來自第一雜二聚體前體多肽之第二重鏈多肽及來自第二雜二聚體前體多肽之第二重鏈多肽。兩個重鏈多肽均經由其CH3域締合。兩個CH3域均包含去穩定化突變，其相互作用且支持雜二聚體產物多肽之形成。藉由使來自第一及第二雜二聚體前體多肽之第二重鏈多肽締合，形成新的一對VH域及VL域。兩個可變域在第二產物多肽中締合。
圖3：雜二聚體前體多肽及在多肽鏈交換後形成之相應產物多肽的例示性結構，其中多肽鏈交換導致抗原結合位點之活化。第一雜二聚體前體多肽包含三條多肽鏈：1. 第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之抗體域VH、CH1、肽連接體、衍生自第一抗體之VH域、CH2及CH3。CH3域包含杵突變，且不包含去穩定化突變。2. 第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之以下抗體域：衍生自第二抗體之VL域、CH2及CH3。CH3域包含臼突變及去穩定化突變。3. 輕鏈多肽，其包含N端至C端方向之抗體域VL及CL。來自第一重鏈多肽之N端VH域及來自輕鏈多肽之VL域形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點。第一雜二聚體前體多肽之重鏈多肽經由其CH3域彼此締合。在第一及第二重鏈多肽之間沒有形成鏈間二硫鍵。在衍生自第一抗體之VH域與來自第二重鏈多肽之VL域之間形成一對VH域及VL域。兩個可變域彼此締合，但不形成特異性結合至抗原之抗原結合位點。第二雜二聚體前體多肽包含三條多肽鏈：1. 第一重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之抗體域VH、CH1、肽連接體、衍生自第一抗體之VL域、CH2及CH3。CH3域包含臼突變，且不包含去穩定化突變。2. 第二重鏈多肽，其包含自N端至C端方向之以下抗體域：衍生自第三抗體之VH域、CH2及CH3。CH3域包含杵突變及去穩定化突變。3. 輕鏈多肽，其包含N端至C端方向之抗體域VL及CL。第一重鏈多肽之N端VH域及輕鏈多肽之VL域形成特異性結合至靶抗原之抗原結合位點。第二雜二聚體前體多肽之重鏈多肽經由其CH3域彼此締合。在第一及第二重鏈多肽之間沒有形成鏈間二硫鍵。在衍生自第一抗體之VL域與來自第二重鏈多肽之VH域之間形成一對VH域及VL域。兩個可變域彼此締合，但不形成特異性結合至抗原之抗原結合位點。在多肽鏈交換後，形成雜二聚體產物多肽。第一產物多肽包含來自前體多肽之兩個抗原結合位點，亦即來自第一雜二聚體前體多肽之抗原結合位點及來自第二雜二聚體前體多肽之抗原結合位點。第一產物多肽包含來自第一及第二雜二聚體前體多肽之第一重鏈多肽，其經由其CH3域締合。第一產物多肽中包含之兩個重鏈多肽均包含不包含去穩定化突變之CH3域。藉由使來自第一及第二雜二聚體前體多肽之第一重鏈多肽締合，形成一對衍生自第一抗體之VH域及衍生自第一抗體之VL域，其形成特異性結合至第一抗原之抗原結合位點。此抗原結合位點不存在於任何前體多肽，且僅在多肽鏈交換後形成(活化)。第二產物多肽包含來自第一雜二聚體前體多肽之第二重鏈多肽及來自第二雜二聚體前體多肽之第二重鏈多肽。兩個重鏈多肽均經由其CH3域締合。兩個CH3域均包含去穩定化突變，其相互作用且支持雜二聚體產物多肽之形成。藉由使來自第一及第二雜二聚體前體多肽之第二重鏈多肽締合，形成新的一對VH域及VL域。兩個可變域在第二產物多肽中締合。
圖4：第一雜二聚體前體多肽之例示性域排列。杵臼突變、去穩定化突變及半胱胺酸突變之描繪與圖1至3中相同。前體多肽可包含一或多個抗原結合位點，其可排列在C端或N端。雖然圖像指示包含Fab片段之前體多肽，但應理解，前體多肽可包含其他適當的抗原結合部分。鉸鏈區二硫鍵之描繪為例示性的，視所需應用而定，鉸鏈區二硫鍵可能存在或可能不存在。在本發明之前體多肽中，半胱胺酸突變之描繪為例示性的而非強制性的。A)包含N端Fab片段及CH2域之前體多肽。B)包含C端及N端Fab片段及CH2域之前體多肽。C)包含C端Fab片段及CH2域之前體多肽。D)包含N端Fab片段及VH域之具有可活化結合位點的前體多肽。E)包含C端及N端Fab片段及VH域之具有可活化結合位點的前體多肽。F)包含C端Fab片段及VH域之具有可活化結合位點的前體多肽。G)具有可活化結合位點之前體多肽，其包含具有N端Fab片段及VH域之CH2域。H)具有可活化結合位點之前體多肽，其包含具有N端及C端Fab片段及VH域之CH2域。I)具有可活化結合位點之前體多肽，其包含具有C端Fab片段及VH域之CH2域。J)具有C端可活化結合位點之前體多肽，其包含具有N端Fab片段及VH域之CH2域。K)包含N端Fab片段及VL域之具有可活化結合位點的前體多肽。
圖5：第二雜二聚體前體多肽之例示性域排列。杵臼突變、去穩定化突變及半胱胺酸突變之描繪與圖1至3中相同。前體多肽可包含一或多個抗原結合位點，其可排列在C端或N端。雖然圖像指示包含Fab片段之前體多肽，但應理解，前體多肽可包含其他適當的抗原結合部分。鉸鏈區二硫鍵之描繪為例示性的，視所需應用而定，鉸鏈區二硫鍵可能存在或可能不存在。在本發明之前體多肽中，半胱胺酸突變之描繪為例示性的而非強制性的。A)包含N端Fab片段及CH2域之前體多肽。B)包含C端及N端Fab片段及CH2域之前體多肽。C)包含C端Fab片段及CH2域之前體多肽。D)包含N端Fab片段及VL域之具有可活化結合位點的前體多肽。E)包含C端及N端Fab片段及VL域之具有可活化結合位點的前體多肽。F)包含C端Fab片段及VL域之具有可活化結合位點的前體多肽。G)具有可活化結合位點之前體多肽，其包含具有N端Fab片段及VL域之CH2域。H)具有可活化結合位點之前體多肽，其包含具有N端及C端Fab片段及VL域之CH2域。I)具有可活化結合位點之前體多肽，其包含具有C端Fab片段及VL域之CH2域。J)具有C端可活化結合位點之前體多肽，其包含具有N端Fab片段及VL域之CH2域。K)包含N端Fab片段及VH域之具有可活化結合位點的前體多肽。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
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Claims (20)

  1. 一種雜二聚體前體多肽集合，其包含： a)     第一雜二聚體前體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變， 其中該第一雜二聚體前體多肽包含第一抗原結合部分，其中該第一抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上，及 b)     第二雜二聚體前體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變， 其中該第二雜二聚體前體多肽包含第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上； 其中 A) i)在該第一雜二聚體前體多肽內，包含具有該杵突變之CH3域的多肽鏈包含該第一抗原結合部分之至少一部分，而在該第二雜二聚體前體多肽內，包含具有該臼突變之CH3域的多肽鏈包含該第二抗原結合部分之至少一部分，或ii)在該第一雜二聚體前體多肽內，包含具有該臼突變之CH3域的多肽鏈包含該第一抗原結合部分之至少一部分，而在該第二雜二聚體前體多肽內，包含具有該杵突變之CH3域的多肽鏈包含該第二抗原結合部分之至少一部分；且其中 B) i)該第一雜二聚體前體多肽之包含該杵突變之CH3域及該第二雜二聚體前體多肽之包含該臼突變之CH3域，或 ii)該第一雜二聚體前體多肽之包含該臼突變之CH3域及該第二雜二聚體前體多肽之包含該杵突變之CH3域 包含以下胺基酸取代，其中編號係根據Kabat編號系統： 具有該臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： 用疏水性胺基酸置換S354； 用帶正電荷之胺基酸置換D356； 用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； 用帶正電荷之胺基酸置換D356，且用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； 用疏水性胺基酸置換S364； 用疏水性胺基酸置換A368； 用帶負電荷之胺基酸置換E392； 用疏水性胺基酸置換T394； 用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換S400； 用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換F405； 用疏水性胺基酸置換V407；及 用帶負電荷之胺基酸置換K409；及 用帶負電荷之胺基酸置換K439； 具有該杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： 用帶正電荷之胺基酸置換Q347，且用帶負電荷之胺基酸置換K360； 用帶負電荷之胺基酸置換Y349； 用疏水性胺基酸置換L351，且用疏水性胺基酸置換E357； 用疏水性胺基酸置換S364； 用疏水性胺基酸置換W366，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； 用疏水性胺基酸置換L368； 用帶負電荷之胺基酸置換K370； 用帶負電荷之胺基酸置換K370，且用帶負電荷之胺基酸置換K439； 用帶負電荷之胺基酸置換K392； 用疏水性胺基酸置換T394； 用疏水性胺基酸置換V397； 用帶正電荷之胺基酸置換D399，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； 用帶正電荷之胺基酸置換S400； F405W； Y407W；及 用帶負電荷之胺基酸置換K439。
  2. 如請求項1之雜二聚體前體多肽集合，其中b)中指示之CH3域包含以下胺基酸取代： 具有該臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：S354V、D356K、E357K、E357F、S364L、A368F、K392E、T394I、V407Y、K409E、K439E及雙突變D399A S400K；及 具有該杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：Y349E、S364V、L368F、K370E、K392D、T394I、V397Y、S400K、F405W、Y407W、K349E及雙突變Q347K K360E、L351F E357F、W366I K409E及D399K K409E。
  3. 如請求項1或2之雜二聚體前體多肽集合，其中b)中指示之CH3域包含以下胺基酸取代： 具有該臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：D356K、E357K、E357F、S364L、V407Y、K409E及雙突變D399A S400K；及 具有該杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代：Y349E、K370E、K392D、T394I、V397Y、F405W、Y407W、K349E及雙突變Q347K K360E、W366I K409E及D399K K409E。
  4. 如請求項1或2之雜二聚體前體多肽集合，其中若b)中指示之具有該杵突變之CH3域包含突變E357K，則b)中指示之具有該臼突變之CH3域不包含突變K370E；且其中若b)中指示之具有該杵突變之CH3域包含突變D356K，則b)中指示之具有該臼突變之CH3域不包含突變K439E。
  5. 如請求項1或2之雜二聚體前體多肽集合，其中i)該第一雜二聚體前體多肽之包含該杵突變之CH3域包含半胱胺酸突變，而該第二雜二聚體前體多肽之包含該臼突變之CH3域包含半胱胺酸突變，或ii)該第一雜二聚體前體多肽之包含該臼突變之CH3域包含半胱胺酸突變，而該第二雜二聚體前體多肽之包含該杵突變之CH3域包含半胱胺酸突變。
  6. 如請求項5之雜二聚體前體多肽集合，其中在該第一雜二聚體前體多肽內，包含該杵突變之CH3域包含取代S354C，而包含該臼突變之CH3域在位置349處包含Y；且其中在該第二雜二聚體前體多肽內，包含該臼突變之CH3域包含取代Y349C，而包含該杵突變之CH3域在位置354處包含S。
  7. 如請求項1或2之雜二聚體前體多肽集合，其中該第一抗原結合部分及/或該第二抗原結合部分為抗體片段。
  8. 如請求項1或2之雜二聚體前體多肽集合，其中 a)  該第一雜二聚體前體多肽包含： 包含CH3域及第一抗體可變域之第一重鏈多肽， 包含CH3域之第二重鏈多肽，其中該第一重鏈多肽及該第二重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 包含第二抗體可變域之輕鏈多肽，其中該第一及第二抗體可變域一起形成特異性結合至靶抗原之第一抗原結合位點；且其中 b) 該第二雜二聚體前體多肽包含： 包含CH3域及第三抗體可變域之第三重鏈多肽， 包含CH3域之第四重鏈多肽，其中該第三重鏈多肽及該第四重鏈多肽經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；及 包含第四抗體可變域之輕鏈多肽，其中該第三及第四抗體可變域一起形成特異性結合至靶抗原之第二抗原結合位點；且其中 c)  i)該第一重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域；或ii)該第一重鏈多肽包含具有臼突變之CH3域，且該第三重鏈多肽包含具有杵突變之CH3域。
  9. 如請求項1或2之雜二聚體前體多肽集合，其中該第一雜二聚體前體多肽及該第二雜二聚體前體多肽包含至少兩條多肽鏈，其包含自N端至C端方向之鉸鏈區、CH2域及該CH3域。
  10. 如請求項9之雜二聚體前體多肽集合，其中該第一雜二聚體前體多肽及該第二雜二聚體前體多肽在該鉸鏈區中包含鏈間二硫鍵。
  11. 如請求項1或2之雜二聚體前體多肽集合，其中該第一雜二聚體前體多肽包含一條包含VL域及該CH3域之多肽鏈，且其中該第二雜二聚體前體多肽包含一條包含VH域及該CH3域之多肽鏈，其中該VL域及該VH域在與一對VH域及VL域締合時，特異性結合至抗原。
  12. 一種雜二聚體多肽，其包含至少兩條包含CH3域之多肽鏈，其中該兩條包含CH3域之多肽鏈經由該等CH3域彼此締合且形成雜二聚體，其中該等CH3域中之一者包含杵突變且另一CH3域包含臼突變；其中該雜二聚體多肽包含第一抗原結合部分，其中該第一抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之一者上；且其中該雜二聚體多肽包含第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分之至少一部分排列於該兩條包含CH3域之多肽鏈中之另一者上；且 其中具有該臼突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： 用疏水性胺基酸置換S354； 用帶正電荷之胺基酸置換D356； 用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； 用帶正電荷之胺基酸置換D356，且用帶正電荷之胺基酸或疏水性胺基酸置換E357； 用疏水性胺基酸置換S364； 用疏水性胺基酸置換A368； 用帶負電荷之胺基酸置換E392； 用疏水性胺基酸置換T394； 用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換S400； 用疏水性胺基酸置換D399且用帶正電荷之胺基酸置換F405； 用疏水性胺基酸置換V407；及 用帶負電荷之胺基酸置換K409；及 用帶負電荷之胺基酸置換K439；且其中 具有該杵突變之CH3域包含選自以下之群的至少一個胺基酸取代： 用帶正電荷之胺基酸置換Q347，且用帶負電荷之胺基酸置換K360； 用帶負電荷之胺基酸置換Y349； 用疏水性胺基酸置換L351，且用疏水性胺基酸置換E357； 用疏水性胺基酸置換S364； 用疏水性胺基酸置換W366，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； 用疏水性胺基酸置換L368； 用帶負電荷之胺基酸置換K370； 用帶負電荷之胺基酸置換K370，且用帶負電荷之胺基酸置換K439； 用帶負電荷之胺基酸置換K392； 用疏水性胺基酸置換T394； 用疏水性胺基酸置換V397； 用帶正電荷之胺基酸置換D399，且用帶負電荷之胺基酸置換K409； 用帶正電荷之胺基酸置換S400； F405W； Y407W；及 用帶負電荷之胺基酸置換K439。
  13. 一種用於製造雜二聚體多肽之方法，其包含以下步驟： a)     使如請求項1至12中任一項所定義之第一雜二聚體前體多肽及第二雜二聚體前體多肽接觸，以形成第三雜二聚體多肽，該第三雜二聚體多肽包含至少一條包含來自該第一雜二聚體前體多肽之CH3域的多肽鏈及至少一條包含來自該第二雜二聚體多肽之CH3域的多肽鏈，及 b)     回收該第三雜二聚體多肽。
  14. 如請求項13之方法，其中 i)在該第一雜二聚體前體多肽內，包含具有該杵突變之CH3域的多肽鏈，及在該第二雜二聚體前體多肽內，包含具有該臼突變之CH3域的多肽鏈；或 ii)在該第一雜二聚體前體多肽內，包含具有該臼突變之CH3域的多肽鏈，及在該第二雜二聚體前體多肽內，包含具有該杵突變之CH3域的多肽鏈 包含標籤部分，且其中該方法包含經由標籤特異性親和層析回收該第三雜二聚體多肽之步驟。
  15. 一種雜二聚體多肽，其係藉由如請求項13或14之方法獲得。
  16. 一種鑑別多特異性雜二聚體多肽之方法，其包含以下步驟： a)     由以下之各種組合： 來自複數個第一雜二聚體前體多肽之第一雜二聚體前體多肽，其包含特異性結合至第一抗原之抗原結合部分，及 來自複數個第二雜二聚體前體多肽之第二雜二聚體前體多肽，其包含特異性結合至第二抗原之抗原結合部分， 進行如請求項13或14之方法，製造複數個多特異性雜二聚體多肽；及 b)     自步驟a)中製造之複數個多特異性雜二聚體多肽分別偵測各多特異性雜二聚體多肽之所需特徵，及 c)     選擇多特異性雜二聚體多肽。
  17. 如請求項16之方法，其中該所需特徵係選自親和力及熱穩定性。
  18. 一種多特異性雜二聚體多肽，其係藉由如請求項16或17之方法獲得。
  19. 一種第一雜二聚體前體多肽，其係如請求項1至12中任一項所定義。
  20. 一種第二雜二聚體前體多肽，其係如請求項1至12中任一項所定義。
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