TARIFNAME BISPESIFIK ANTIKORLARIN GELISTIRILMIS BIRLESMESI Teknik alan Mevcut tarif, bispesifik antikorlar gibi heteromultimerik proteinlerin birlestirilmesine yönelik bilesimler ve gelistirilmis yöntemler ile ilgilidir. Bulusun geçmisi kolu ve bir sabit domen (Fc) içerir. Baglanma kollarinda farkli bir spesifiklige sahip antikorlar, genellikle dogada bulunmazlar ve bu nedenle kimyasal isleme (örnegin kimyasal çapraz baglama Vb.), rekombinant DNA ve/Veya hücre-füzyon teknolojisi yardimi ile islenmeleri gerekir. Bispesifik antikorlar ayni anda iki farkli antijeni baglayabilmektedir. Bu özellik, konvansiyonel monoklonal antikorlarla mümkün olmayan terapötik stratejilerin gelistirilmesini saglar. Gelistirilmis olan temsili bispesifik antikor formatlarinin büyük panosu, bu moleküllere olan güçlü ilgiyi yansitmaktadir. Bkz. Berg J, Lotscher E, Steimer KS, ve dig., "Bispecific antibodies that mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus of any strain," Proc O., "Biospecific Antibodies: Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies," Pathobiology (2007) 74:3-14. Bir diger multispesifik moleküller sinifi, rekombinant füzyon proteinleridir. Immüno düzenleyici proteinlerin hücre disi domeninden.ve immünoglobülinin (Ig) sabit (Fc) domeninden olusan rekombinant füzyon proteinleri, insan terapötiklerinin büyüyen bir sinifini temsil eder. Immünoadezinlery bir antikorun.efektör domeni ile bir protein sekansinin baglanma bölgesini, istenen bir spesifiklik ile, birlestirir. Immünoadezinler, terapötik ajanlar olarak potansiyelleri açisindan kaydadeger olan iki önemli özellige sahiptir: hedef spesifikligi ve farmakokinetik stabilite (antikorlarinki ile karsilastirilabilir olan in Vivo yari ömür). Immünoadezinler, zararli etkilesimleri inhibe etmek veya engellemek için antagonist olarak ya da fizyolojik tepkileri taklit etmek veya güçlendirmek için agonist olarak kullanilabilmektedir. Bkz. Chamow SM, Zhang DZ, Tan XY, ve dig., CD3+ effectors to kill HIV-l-infected cells," J Hematother 1995; 4(5): 439-446. Diger multispesifik moleküller baska yerlerde tartisilmistir. Örnekler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla asagidakileri içerir: Fisher ve dig., Pathobiology (2007) 74:3-14 (review of various bispecific formats); Feige ve dig.'ne 9 Aralik 2003 tarihinde verilen U.S. Pat. No. 6,660,843 (peptibodies); 10 Ocak (multispecific antibodies); Wu ve dig.'ne13Kasin12009 tarihinde verilen U.S. Pat. No. ; U.S. digu, Biotechnol Appl Biochem. (2008) Jun;50(Pt 2):, 12: armed.antibodies); Bostronive dig., Science (2009) 323:. Diger formatlar teknikte uzman kisilerce bilinir. Klinik dereceli materyalin üretimi, genellikle antikorlar için ve özellikle yukarida tarif edileninultispesifikInoleküller için zordur. Yukarida belirtildigi gibi, karma baglanma kollari, baska bir ifadeyle birbiriyle özdes olmayan baglanma kollari, olan moleküllerin üretilmesi için birçok yol vardir. Ancak bu yöntemlerin her birinin dezavantajlari vardir. Ilgili türlerin yine de homodimerlerden ve diger istenmeyen yan ürünlerden saflastirilmasi gerekebileceginden dolayi kimyasal çapraz baglama emek-yogundur. Ayrica, kimyasal modifikasyon asamalari proteinlerin bütünlügünü degistirerek zayif stabiliteye yol açabilir. Bu nedenle, bu yöntem çogu zaman verimsizdir ve antikor aktivitesi kaybina yol açabilir. Hücre-füzyon teknolojisi (Örnegin, hibrit hibridomlar), 10 antikor kombinasyonunun olusturulmasina yol açarak rastgele olarak birlesen iki agir ve iki hafif zinciri eksprese eder. Istenen heteromultimerik antikorlar, bu sekilde üretilen antikorlarin sadece küçük bir kismidir. Istenen heteromultimerik proteinlerin saflastirilmasi, önemli ölçüde üretim verimlerini azaltir ve üretim maliyetlerini arttirir. Rekombinant DNA teknikleri, bir Fc domeni içermeyen, örnegin, tek zincirli FV, diyakorlar vb. gibi çesitli heteromultimerik formatlarin üretimi için kullanilmistir. Bu tip antikor molekülünün önemli bir dezavantaji, Fc domeninin eksikligi ve bu nedenle antikorun bir efektör fonksiyonunu (örnegin, kompleman aktivasyonu, Fc-reseptör baglanmasi Vb.) tetikleme kabiliyetidir. Bu nedenle, fonksiyonel bir Fc domeni içeren bir bispesifik antikor istenir. Rekombinant DNA teknikleri ayrica, "delik içine topuz" (knob into hole) bispesifik antikorlari üretmek için de kullanilmistir. Bkz. U.S. Patent Basvurusu . Bu stratejideki bir kisitlama, iki ana antikorun hafif zincirlerinin, ayni hücrede eksprese edildiginde istenmeyen ve/veya inaktif moleküllerin yanlis eslesmesini.ve olusumunu önlemek için özdes olmasi gerektigidir. Ayrica, tavlama ve saflastirma esnasindaki sinirlayici olaylardan biri redoks etkililigidir. Oksitlenmis heterodimer tipik olarak, bu adimdan sonra proteinin yalnizca %70-80'ini olusturur (BioAnalyzer ve MS-TOF). Antikorun kalan %20-30'u dimeriktir ve kovalent bir baglantidan yoksundur (SEC-LLS). Bu giderilebilir ancak toplam verimi de önemli ölçüde etkiler. bispesifik antikorlarin üretilmesine yönelik bir yöntem tarif eder, burada antikorun ayri ayri eksprese edilen dört zinciri, polipeptidlerin oksitlenmis glutatyon (GSSG) içeren bir çözelti içinde karistirilmasiyla birlestirilir ve tekrar katlanir. Bu nedenle, antikor üretiminde, özellikle heterodimerlerde, toplam› verimin arttirilmasina ihtiyaç vardir. Burada, bispesifik antikorlarin, heterodimerlerin ve benzerlerinin toplam.verimini arttirabilen yöntemler tarif edilir. Bulusun bu ve diger yönleri ve avantajlari, bulusun burada sunulan açiklamasindan anlasilacaktir. Bulusun özeti Mevcut teknikler kullanilarak iki veya.daha fazla.mentese içeren polipeptidden birlestirilen heteromultimerik proteinlerin, örnegin iki ya da daha fazla yarim antikordan (half-antibody) birlestirilen nmltispesifik antikorlarin üretimi, digerleri arasinda bir ürün karisiminin üretimi, verimin azalmasi ve efektör fonksiyonunun azalmasi/eliminasyonu dahil olmak üzere dezavantajlara sahiptir: Ayrica, agregasyon ve çöktürme, her bir mentese içeren polipeptidin preparasyonu esnasinda ve heteromultimerlerin birlestirilmesi veya tavlanmasi esnasinda ortaya çikar. Agregasyon ve çöktürme istenen heteromultimerin verimini büyük ölçüde azaltabilmektedir. Bu nedenle, heteromultimerik. proteinlerin daha verimli ve daha yüksek seviyelerde üretilmesi istenir. Burada, sinirlama olmaksizin asagidakilerden birinin veya daha fazlasinin kullanilmasi veya modüle edilmesi ile heteromultimerik proteinlerin, örnegin multispesifik antikorlarin, ekonomik üretimine yönelik verimli üretim prosesleri/yöntemleri açiklanir: bir stabilizör, bir çözündürücü, bir indirgeyici kosul, seçilmis pH ve seçilmis sicaklik, vb. Burada tarif edilen bulusa ait yöntemler, protein kaybini çöktürme ve/veya agregasyona indirgemis ve bispesifik antikorlarin uretimi gibi heteromultimerik protein üretiminin toplam verimini arttirmistir. Mevcut bulusun konusu, ekteki istemlerde ortaya konmustur. Bir yönde, bir bispesifik antikor üretme yöntemi sunulmakta olup söz konusu yöntem asagidakileri içerir: a. Birinci bir çözündürücü varliginda, pH 5-9'da birinci bir yarim antikor sunulmasi, burada birinci yarim antikor bir heteromultimerizasyon domeni içerir; b. Ikinci bir çözündürücü varliginda, pH 5-9'da ikinci bir yarim antikor sunulmasi, burada ikinci yarim antikor bir heteromultimerizasyon domeni içerir; c. Birinci ve ikinci yarim antikorlarin bir birlesme karisimi olusturmak› üzere indirgeyici bir kosulda karistirilmasi, burada indirgeyici, yarim antikorlarin toplam miktarina göre 50-4OOX molar fazlaliktaki karisima ilave edilir; burada indirgeyici, GSH'dir; ve d. Birinci ve ikinci yarim antikorlari içeren bir bispesifik antikoru olusturmak veya üretmek üzere birlesme karisiminin inkübe edilmesi, burada birinci yarim antikor, ikinci yarim antikor ile heteromultimerizasyon domeninde etkilesime girer. Bu yönün belirli uygulamalarinda, birinci ve/veya ikinci yarim antikorun saflastirilmasi asamasi, a asamasindan ve/veya b asamasindan önce gerçeklestirilir. Belirli özel uygulamalarda, birinci ve/veya ikinci yarim antikor, Protein A ile saflastirilir. Mevcut tarifin bir yönünde, bir heteromultimer üretmeye yönelik bir yöntem sunulmakta olup söz konusu yöntem, mentese içeren polipeptidlerin 4 ila 9 arasinda, tercihen 5-9, bir pH degerine sahip karisimini içeren bir antijen sunmayi, zayif bir indirgeyici ilave etmeyi ve bir heteromultimer üretmeye olanak veren kosullar altinda inkübe etmeyi içerir. Mevcut tarifin baska bir yönünde, bir heteromultimerik protein üretme yöntemi sunulmakta olup söz konusu yöntem asagidakileri a. Protein A ile saflastirilmis birinci bir mentese içeren polipeptidin elde edilmesi; b. Protein A ile saflastirilmis ikinci bir mentese içeren polipeptidin elde edilmesi; c. Her bir yarim antikorun pH'inin 4 ila 9 arasinda ayarlanmasi; d. Bir birlesme karisimi elde etmek üzere birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidin karistirilmasi; e. Birlesme karisimina zayif bir indirgeyicinin bir molar fazlaliginin ilave edilmesi; ve I. Birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidi içeren bir heteromultimerik protein olusturmak üzere birlesme karisiminin inkübe edilmesi. Mevcut tarifin baska bir yönünde, bir heteromultimerik protein üretme yöntemi sunulmakta olup söz konusu yöntem asagidakileri a. Protein A ile saflastirilmis birinci bir mentese içeren polipeptidin elde edilmesi; b. Protein A ile saflastirilmis ikinci bir mentese içeren polipeptidin elde edilmesi; c. Her bir Hentese içeren polipeptidin pH'inin L-Arjinin varliginda 4 ila 9 arasinda ayarlanmasi; d. Karma bir mentese içeren.polipeptid.havuzu elde etmek üzere birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidin karistirilmasi, e. Birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidi içeren bir heteromultimerik protein olusturmak üzere inkübe edilmesi. Bu yönun belirli uygulamalarinda, karma mentese içeren polipeptid havuzu, indirgeyici bir kosulda inkübe edilir. Belirli uygulamalarda, mentese içeren polipeptid bir yarim antikor, bir immünoadezin veya bunun bir fonksiyonel bir fragmanini içerir. Diger belirli uygulamalarda, Arjinin, 20 mM-lM, 20 mM ila 200 mM veya 50 mM-ZOO mM'lik.bir konsantrasyonda bulunur. Diger belirli uygulamalarda, PVP, d asamasina veya e asamasina ilave edilir. Belirli uygulamalarda, pH karistirmadan sonra ayarlanir. Mevcut basvuru sahipleri, beklenmedik bir sekilde, bir yarim antikor gibi mentese içeren bir polipeptidin bir ara pH tutmasinin (intermediate pH hold), mentese içeren polipeptidlerin sonraki birlesmesini arttiran konformasyon kaymasini kolaylastirabilecegini kesfetmistir. Belirli uygulamalarda, ara pH, 5 ila 9 arasinda ya da 5 ila 9, 5 ila 8, 7 ila 8, 7.5 ila 8.5 veya 7 ila 8.5 arasindadir. Mentese içeren polipeptidin pH ile indüklenmis çöktürmesini önlemek.veya.en aza indirmek amaciyla bir çözündürücü eklenebilmektedir. Belirli özel uygulamalarda, çözündürücü, ara pH tutmasindan önce ilave edilir. Belirli uygulamalarda, birinci çözündürücü ve ikinci Çözündürücünün her biri, arjinin, histidin ve sakaroz, tercihen arjinin ve/Veya histidinden olusan gruptan seçilir. Diger belirli uygulamalarda, arjinin bir arjinin tuzudur ve/Veya histidin bir histidin tuzudur. Diger belirli uygulamalarda, arjinin bir arjinin türevidir ve/veya histidin bir histidin türevidir. Diger belirli uygulamalarda, arjinin veya histidin, L-arjinin. veya L-histidindir. Diger' belirli uygulamalarda, arjinin veya histidin,arjinin HCI veya histidin HCl'dir. Diger belirli uygulamalarda, arjinin veya histidin, arjinin fosfat veya histidin fosfattir. Belirli uygulamalarda, birinci ve ikinci çözündürücüler farklidir; diger uygulamalarda ise, birinci ve ikinci çözündürücüler aynidir. Tercih edilen belirli uygulamalarda, henibirinci çözündürücü henide ikinci çözündürücü arjinin içerir. Yine diger uygulamalarda, arjinin, 20 mM ila lM, tercihen.20Im4ila.200nmîarasindaki.bir~konsantrasyondaßbulunur. Yine diger uygulamalarda, çözündürücü, sinirlama olmaksizin asetil-arjinin dahil olmak üzere bir arjinin türevi içerir. Diger uygulamalarda, hem birinci çözündürücü hem de ikinci çözündürücü, 20 mM ila lM, 20 mM ila lM'den az, 20 mM ila 500 bulunan histidin içerir. Tercih edilen belirli uygulamalarda, çözündürücü, 50 mM'lik bir konsantrasyonda ilave edilir. Diger belirli uygulamalarda, çözündürücü, 200 mM'lik bir konsantrasyonda ilave edilir. Belirli özel uygulamalarda, konsantrasyonda ilave edilir. Diger belirli özel uygulamalarda, birinci ve/veya ikinciinentese içerenjpolipeptidler, heniarjinin henide histidin varliginda sunulur. Diger uygulamalarda, arjinin ve histidinin her biri, 20 mM ila lM, 20 mM ila lM'den az, 20 bir konsantrasyonda bulunur. Diger belirli uygulamalarda, birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidler, pH'in, birinci nentese içeren polipeptid ve ikinci mentese içeren polipeptidde ayri ayri ayarlanmasinin ardindan karistirilir. Belirli uygulamalarda, bir çözündürücü, pH ayarlamasindan önce ilave edilir. Belirli uygulamalarda, birinci mentese içeren polipeptid ve ikinci.mentese içeren.polipeptid, karistirma öncesinde ayri ayri saflastirilir; diger uygulamalarda ise, birinci mentese içeren polipeptid ve ikinci nwntese içeren polipeptid, karistirma sonrasinda birlikte saflastirilir. Mentese içeren polipeptid, bir yarim antikor içerir. Belirli uygulamalarda, birlestirilmis heteromultimerik protein daha fazla saflastirmaya tabi tutulabilmektedir. Saflastirma için, sinirlama olmaksizin, protein A kromatografisi, protein G kromatografisi, hidrofobik etkilesim kromatografisi (HIC), immünoafinite kolonu üzerinde fraksiyonasyon, etanol çöktürmesi, silika veya DEAE gibi bir iyon degistirme reçinesi üzerinde ters faz kromatografisi, odaklama kromatografisi, SDS-PAGE, amonyum sülfat çöktürmesi ve örnegin Sephadex G-75 kullanarak jel filtrasyonu ile saflastirma ve diger benzer saflastirma yöntemleri ve bunlarin kombinasyonlari dahil olmak üzere herhangi bir uygun yöntem kullanilabilmektedir. Belirli uygulamalarda, bir yarim antikor olan mentese içeren polipeptid, Protein A veya Protein G kromatografisi ile saflastirilir. Baska bir uygulamada, birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidler, Protein A saflastirmasindan önce karistirilir ve Protein A araciligiyla birlikte saflastirilir. Diger uygulamalarda, pH, Protein A ile saflastirilmis polipeptidleri karistirmadan önce ayarlanir. Belirli uygulamalarda, bir çözündürücü, pH ayarlamasindan önce ilave Diger belirli uygulamalarda, mentese içeren polipeptid, HIC ile veya bir iyon degistirme kolonu ile saflastirilir. Uygun saflastirma yöntemlerini seçmek teknikte uzman bir kisinin kabiliyeti dahilindedir. Örnegin, mentese içeren polipeptid, bir Protein A kolonu ve ardindan iyon degistirme kolonu ile saflastirilabilmektedir; mentese içeren polipeptid ayni zamanda bir Protein A kolonu ve ardindan bir jel filtrasyonu kolonu ve/Veya HIC ile de saflastirilabilmektedir. Diger örneklerde, mentese içeren polipeptid, bir Protein A kolonu ile saflastirma öncesinde bir veya daha fazla iyon degistirme kolonu ile saflastirilabilmektedir. Belirli uygulamalarda, mentese içeren polipeptidlerin saflastirma asamalarindan herhangi biri esnasinda kullanilan yikama ve/Veya elüsyon tamponlari, arjinin ve/veya histidin içermez. Yine diger uygulamalarda, asidik pH'da Protein A matrisi veya diger kolon matrisinden elüt edilen yarim antikor, bir ara pH'a ayarlanir. Bu sonraki pH ayarlamasi (ayni zamanda bir ara pH tutmasi olarak.da ifade edilir), bir yarim antikor gibi mentese içeren polipeptidin çöktürülmesine neden olabilmekte ve böylece, birlestirilmis heteromultimerik proteinin veriminin düsmesine yol açabilmektedir. Bu nedenle, belirli uygulamalarda, asidik pH'da Protein A veya Protein G kolonundan elüt edilen yarim antikor, pH ayarlamasindan önce bir çözündürücü varliginda. sunulurx Bir` pH ayarlama. asamasinin gerekli olmamasi durumunda, belirli uygulamalarda, çöktürmeyi ve/veya agregasyonu önlemek veya azaltmak amaciyla saflastirilmis mentese içeren polipeptide tercihen bir çözündürücü ilave edilir. Ara.pH tutmasina ek olarak, mevcut basvuru sahipleri beklenmedik bir sekilde isitmanin, yarim antikorlar gibi mentese içeren polipeptidlerin konformasyon kaymasini ve/veya birlesmesini arttirabildigini kesfetmislerdir. Buna uygun olarak, belirli uygulamalarda, bulusa ait yöntemlerin a-d asamalarinin biri, daha fazlasi veya tümü, en az 30 dakika boyunca, 15°C ve 39°C, da 32°C ve 37°C, tercihen 35°C ve 37°C arasindaki bir sicaklikta isitilir. Belirli uygulamalarda, inkübasyon süresi, özellikle oda sicakliginda 72 saate kadardir. Bazi uygulamalarda, inkübasyon süresi, 35°C'de 3 saattir. Diger belirli uygulamalarda, sicaklik, tam olarak veya yaklasik olarak 30°C, °C veya 37°C'dir. Bununla birlikte isitma ayni zamanda agregasyonu ve/Veya çöktürmeyi arttirabilmektedir. Buna uygun olarak, belirli özel uygulamalarda, isitma Öncesinde bir Protein A veya Protein G kolonundan elüt edilen yarim antikora bir çözündürücü ilave Birinci ve/Veya ikinci mentese içeren polipeptid bir yarim antikor içerir. Belirli uygulamalarda, yarim antikor, bir IgG yarim antikorudur. Belirli özel uygulamalarda, IgG yarim antikoru, IgGl, IgG4 veya IgG2 izotipine sahiptir. Belirli faydali uygulamalarda, immünoglobülinin molekülünün sinyal peptidi, özellikle memeli hücrelerinde üretildiginde, yarim antikorun salgilanmasini kolaylastirmak için muhafaza edilir. Belirli uygulamalarda, bulusa ait yöntem, pH 5-9'da, yaklasik 50 mM'lik bir konsantrasyonda arjinin ve alternatif olarak veya ek olarak yaklasik 200 mM'lik bir konsantrasyonda histidin varliginda birinci bir ve ikinci bir yarim antikorun sunulmasini içerir. Belirli uygulamalarda, birinci ve/veya ikinci yarim antikorun her biri, farkli bir antijen veya ayni antijendeki farkli bir epitop için spesifik bir antijen baglayici domen içerir ve birlestirilmis tam antikor bir bispesifik antikordur. Diger belirli uygulamalarda, birinci ve ikinci yarim antikor ayni izotipe sahiptir; diger uygulamalarda ise, birinci ve ikinci yarim antikor farkli izotiplere sahiptir. Yarim antikor, bir\h,domeni, bir\h domeni, bir mentese domeni, bir CHz domeni ve/Veya bir CH3 domeni içerebilir. Yarim antikor ayrica.bir baglayici (tether) içeren tek Zincirli bir polipeptid olabilmektedir, burada söz konusu tek Zincirli polipeptid, bir N-terminalden C-terminal yönünde birbirlerine göre su sekilde konumlandirilmis domenler içerir: VL-baglayici-Vn-mentese-CHz-CH3. Diger belirli uygulamalarda, yarim antikor ayrica bir CL domeni ve bir CHi domeni içerir; ve diger uygulamalarda, yarim antikor bir baglayici içeren tek Zincirli bir polipeptid olabilmektedir, burada söz konusu tek Zincirli polipeptid, bir N-terminalden C-terminal yönünde birbirlerine göre su sekilde konumlandirilmis domenler içerir: Vrfhrbaglayici-VwfHh-mentese-CHz-CHy Baglayici, bir veya daha fazla Glisin (G) ve Serin (S) kalintisi içerebilir. Diger uygulamalarda, baglayici, GGS tekrarlarini içerir. Baglayici, örnegin, 15 ila 50 amino asit uzunlugu arasindadiru Öze1.bir uygulamada, baglayici, 20 ilaIKZamino.asit 31 veya 32 amino asit uzunlugu arasindadir. Belirli uygulamalarda, baglayici ayrilabilirdir (cleavable). Diger uygulamalarda, baglayici, proteinden ayrilabilir veya ayrilmayabilir. Tercih edilen belirli uygulamalarda, baglayici, ayni enzim tarafindan.baglayicinin.N- ve C-ucunda veya yakininda iki bölgede ayrilabilir. Bir uygulamada, baglayici, furin gibi proteazlar için ayrilma bölgesi içerir. Baska bir uygulamada, baglayici, X'in herhangi bir amino asit oldugu RXRXRR (SEQ ID No:1) ayrilma bölgesinde furin ile ayrilir. Bazi uygulamalarda, birinci mentese içeren.polipeptid.bir yariniantikordur've ikinci mentese içeren polipeptid tek zincirli yarim antikordur. Baska bir uygulamada, mevcut bulus, bir baglayici ve bir PC bilesen kompleksi içeren bir protein sunar, burada baglayici, proteinden ayrilabilir veya ayrilmayabilir. Mevcut bulusa göre, birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidler, bir heteromultimerizasyon domeni içerir. Heteromultimerizasyon domeni, bir delik içine topuz mutasyonu, lösin fermuarlari, elektrostatik ve benzerleri olabilir. Birinci mentese içeren polipeptid.bir topuz içerebilir ve ikinci mentese içeren polipeptid bir delik içerebilir. Belirli uygulamalarda, mentese içeren polipeptid bir yarim antikor içerir ve birinci yarim antikor bir topuz içerir ve ikinci yarim antikor bir delik içerir. Bazi uygulamalarda, yöntemler, pH ayarlamasindan önce 20 mM ila lM arasindaki nihai bir konsantrasyona Arjinin ilave edilmesini içerir. Bazi uygulamalarda, Arjinin, 50 mM - 600 mM arasindaki nihai bir konsantrasyona ilave edilir. Bazi uygulamalarda, Arjinin, 50 mM-lOO mNIarasindaki nihai bir konsantrasyona ilave Belirli uygulamalarda, yöntenn her birinentese içereripolipeptid Protein A havuzunun, birinci ve ikinci yarim antikorlari karistirmadan önce 5.LlaEBarasindaki bir pH'ta inkübe edilmesini Bazi uygulamalarda, burada tarif edilen yöntemler, karma yarim antikor veya karma mentese içeren polipeptid havuzunun, en az arasinda, daha tercihen 20°C - 25°C arasinda, daha tercihen 32°C - 37°C arasinda bir sicaklikta inkübe edilmesini içerir. Mentese içeren polipeptidler, örnegin, bir bakteri hücresi, bir maya hücresi, bir böcek hücresinde bakülovirüs veya bir memeli hücresi tarafindan üretilebilmektedir. Belirli uygulamalarda, mentese içeren polipeptid, bir bakteri hücresi, özellikle E. Coli tarafindan üretilir. Diger belirli özel uygulamalarda, mentese içeren polipeptid, bir memeli hücresi. Özellikle bir CHO hücresi tarafindan üretilir. Belirli özel uygulamalarda, mentese içeren polipeptid bir yarim antikor içerir. Mentese içeren polipeptidler, heterodimerizasyon domeni araciligiyla.bir dimer veyaImiltimer olusturmak üzere etkilesime girebilmektedir. Belirli uygulamalarda, heterodimerizasyon domenlerinin ara yüzeyindeki birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidler arasindaki etkilesim, bir oyuk-içine-çikinti (protuberance-into-cavity) etkilesimi, bir hidrofobik etkilesim ve/veya bir elektrostatik etkilesimdir. Diger belirli uygulamalarda, heteromultimerizasyon domeni, bir topuz (örnegin çikinti), bir delik (Örnegin oyuk), bir lösin fermuari, bir sarili sarmal veya elektrostatikküi:etkilesiniolusturabilenloir polar amino asit kalintisi veya bunlarin kombinasyonlarini içerir. Belirli uygulamalarda, birinci mentese içeren polipeptid bir topuz içerir ve ikinci mentese içeren polipeptid bir delik içerir. Diger belirli uygulamalarda, etkilesim, hem bir hidrofobik etkilesimi hem de bir elektrostatik etkilesimi içerir. Belirli örnek niteligindeki uygulamalarda, birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidlerin her birinin heteromultimerizasyon domeni, elektrostatik bir etkilesim olusturabilen bir topuz ya da bir delik ve bir amino asit kalintisi içerir. Teknikte uzman kisilerce anlasilacagi üzere, heterodimerizasyon domeni, örnegin, topuz ve delik (K&H) ve hidrofobik etkilesim, K&H ve lösin fermuari, Vb. gibi birden fazla.etkilesin1yolunu.içerebilmektedir. Belirli uygulamalarda, mentese içeren polipeptid ayrica bir baglayici içerir. Belirli özel uygulamalarda, mentese içeren polipeptid bir yarim antikor Belirli özel uygulamalarda, birlesme karisimi, pH'in 7 ila 9 arasinda ve sicakligin 15°C ila 39 °C arasinda olmasi gibi heteromultimerik proteinlerin birlesmesini kolaylastiran tercihen -300 ila -500 mV arasinda, en çok tercihen yaklasik -400mV'lik oksidasyon potansiyeline sahip indirgeyici bir kosulda, tercihen zayifloir indirgeyici kosulda.bulunur. Bulusun bir yönüne göre, birlesme esnasinda istenen bir indirgeyici kosulu hazirlamak üzere c asamasina bir indirgeyici ilave edilir. Indirgeyici bir glutatyondur (GSH). Diger belirli uygulamalarda, indirgeyici, mentese içeren polipeptidlerin toplam miktarina göre 50-200X veya 50-4OOX, tercihen lOO-3OOX, ve daha tercihen 200X'lik molar fazlalikta birlesme karisimina ilave edilir. Belirli uygulamalarda, birlesme karisimi, 7 ila 9 arasinda, tercihen 8.5'lik bir pH'a sahiptir. Mentese içeren polipeptid, bir yarim antikordur. Bazi uygulamalarda, karistirma öncesinde birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidlere indirgeyici ilave edilir. Karistirma öncesinde, ilave, tercihen 1 saatten az, daha tercihen 15 dakikadan az, en çok tercihen ise 5 dakikadan azdir. Belirli uygulamalarda, yönteni ayrica, sinirlama olmaksizin isitma varliginda veya yoklugunda ara pH tutma asamasi veya birlesme asamasi dahil olmak üzere bir veya daha fazla asamada tepkimeye bir stabilizör ilave edilmesini içerir. Örnegin, agregasyonu önlemek ya da azaltmak amaciyla mentese içeren polipeptide bir stabilizör ilave edilebilmektedir. Diger örneklerde, bir heteromultimerik.proteinin.birlesmesi esnasinda agregasyonu önlemek veya azaltmak amaciyla birlesme karisimina bir stabilizör ilave edilebilmektedir. Belirli özel uygulamalarda, mentese içeren polipeptid bir yarim antikor Belirli özel uygulamalarda, stabilizör, arjinin, histidin ve Polivinilpirrolidon (PVP)'dan olusan gruptan seçilir. Belirli uygulamalarda, arjinin veya histidin, arjinin tuzu veya histidin tuzudur. Diger belirli uygulamalarda, arjinin veya histidin, bir arjinin türevi veya histidin türevidir. Diger belirli uygulamalarda, arjinin veya histidin,arjinin HCI veya histidin HCI'dir. Belirli uygulamalarda, arjinin, arjinin fosfat degildir. Diger belirli uygulamalarda, yöntem ayrica, PVP varliginda birlesme karisiminin inkübe edilmesi asamasini içerir. Ilgili uygulamalarda, PVP, %40'a kadar (w/V) ilave edilir. Diger belirli uygulamalarda, PVP, %2-%6 (w/V), %lO-%20, %2-%10, %1, konsantrasyondaki birlesme karisiminda bulunur. Belirli uygulamalarda, PVP, 100 KD'den fazla, 30 KB'den fazla degildir ve tercihen 10 KD'dir. Diger belirli uygulamalarda, PVP, %10'dan daha az (w/V) veya %5'ten daha az (w/V) bulunur. Bazi uygulamalarda, stabilizör, 20 mM ila lM, 20 mM ila lM'den bir konsantrasyonda bulunan arjinindir. Diger uygulamalarda, bulunan histidindir. Tercih edilen belirli uygulamalarda, arjinin veya histidin, 50 mM veya 200 mM'lik bir konsantrasyonda ilave edilir. Diger belirli uygulamalarda, arjinin ve/veya veya 50 mM ila 100 mM'lik bir konsantrasyonda ilave edilir. Mentese içeren polipeptid, bir yarim antikor içerir. Mevcut tarifin yine bir baska yönünde, bulus, mentese içeren bir polipeptidi eksprese eden bir konak hücre sunar. Belirli uygulamalarda, mentese içeren polipeptid bir yarim antikor Baska bir yönde, mevcut tarif, bir bispesifik antikor üretmeye yönelik, (a) birinci bir antijen veya bir antijenin birinci bir epitopu için spesifik olan birinci bir yarim antikoru eksprese etmek üzere islenmis birinci bir konak hücreyi kültürleme; (b) ikinci bir antijen veya ayni antijenin ikinci bir epitopu için spesifik olan ikinci bir yarim antikoru eksprese etmek üzere islenmis ikinci bir konak hücreyi kültürleme; (c) birinci bir çözündürücü varliginda, 4-9, tercihen 5-9 arasindaki bir pH'ta a asamasindaki kültürden birinci yarim antikoru elde etme; (d) ikinci bir çözündürücü varliginda, 4-9, tercihen 5-9 arasindaki bir pH'ta b asamasindaki kültürden ikinci yarim antikoru elde etme; (e) bir birlesme karisimi elde etmek üzere indirgeyici bir kosulda birinci ve ikinci yarim antikorlari karistirma; ve (f) birinci ve ikinci yarim antikorlari içeren bir bispesifik antikor olusturmak üzere birlesme karisimini inkübe etme asamalarini içeren bir yöntem sunar. Bazi uygulamalarda, birinci konak hücre ve ikinci konak hücre ayri kültürlerde kültürlenir ve birinci yarim antikor ve ikinci yarim antikor, karistirma öncesinde birinci ve ikinci konak hücrelerin kültürlerinden ayri ayri saflastirilir. Belirli uygulamalarda, birinci ve ikinci konak.hücreler ayri kültürlerde kültürlenir, kültürler birlestirilir, hücreler pellet haline getirilir, istege bagli olarak homojenlestirilir ve/Veya lize edilir ve birinci ve ikinci yarim antikorlar uygun herhangi bir yöntem araciligiyla birlikte saflastirilir. Belirli uygulamalarda, birinci ve ikinci yarim antikorlar, Protein A saflastirmasi araciligiyla birlikte saflastirilir. Baska uygulamalarda, birinci ve ikinci konak› hücreler karma bir kültürde birlikte kültürlenir ve birinci ve ikinci yarim antikorlar birlikte saflastirilir. Konak hücre, örnegin, bir bakteri hücresi, bir maya hücresi, bir bitki hücresi, bir~ böcek, hücresi veya bir memeli hücresi olabilmektedir. Belirli özel uygulamalarda, mentese içeren polipeptid veya yarim antikor, bir CHO hücresi gibi bir memeli hücresi tarafindan üretilir. Diger belirli uygulamalarda, konak hücre bir bakteri hücresi, özellikle E. coli'dir. Belirli ek uygulamalarda, bulusa ait yöntemler ayrica, (d) asamasinda olusmus heteromultimerik proteinin veya bispesifik antikorun geri kazanilmasi asamasini içerir. Birlestirilmis heteromultimerik protein, uygulama boyunca tarif edilen yöntemlerle veya teknikte bilinen uygun yöntemlerle de saflastirilabilmektedir. Baska bir yönde, mevcut tarif, mentese içeren bir polipeptid ve bir çözündürücü içeren bilesimler sunar, burada bilesimin pH'i, pH 4 - pH 9 arasinda, tercihen pH 5-9 arasindadir. Belirli uygulamalarda, bilesimin pH'i, en az pH 5, en az pH 5.5, en az pH 5.7, pH 5'ten fazla, pH 5.5'ten fazla, pH 5.7'den fazla, 5 Belirli uygulamalarda, çözündürücü, arjinin, histidin ve sakaroz, tercihen arjinin ve/Veya histidinden olusan gruptan seçilir. Diger belirli uygulamalarda, arjinin bir arjinin tuzudur ve/Veya histidin bir histidin tuzudur. Diger belirli uygulamalarda, arjinin bir arjinin türevidir ve/veya histidin bir histidin türevidir. Diger belirli uygulamalarda, arjinin veya histidin, L-arjinin veya L-histidindir. Diger belirli uygulamalarda, arjinin veya histidin,arjinin HCI veya histidin HCI'dir. Diger ozel uygulamalarda, çözündürücü, arjinin veya histidindir. Diger belirli uygulamalarda, arjinin ve mM veya.50 mM ila 400 mM'lik.bir konsantrasyonda bulunur. Belirli konsantrasyonda bulunan arjinin ve histidin içerir. Diger belirli uygulamalarda, bilesim, guanidin HCI veya üre içermez. Belirli uygulamalarda, bilesinn alternatif olarak veya.ek olarak bir stabilizör içerir. Belirli özel uygulamalarda, mentese içeren polipeptid bir yarim antikor içerir. Diger belirli özel uygulamalarda, bilesim, sadece bir tip mentese içeren polipeptid veya yarim antikor içerir. Belirli uygulamalarda, bilesinn bir topuz yariniantikoru olan sadece bir tip yarim antikor içerir. Diger belirli uygulamalarda, bilesinn bir delik yariniantikoru olan sadece bir tip yarim antikor içerir. Belirli özel uygulamalarda, bilesim ayrica ikinci bir mentese içeren polipeptid içerir, burada birinci mentese içeren polipeptid bir topuz içerir ve ikinci mentese içeren polipeptid bir delik içerir. Belirli uygulamalarda, mentese içeren polipepticibir`yariniantikor içerir. Belirli özel uygulamalarda, mentese içeren polipeptid bir yarim antikordur. Diger belirli uygulamalarda, yarim antikor, IgGl, IgG2 veya IgG4 izotipine sahiptir. Burada açiklanan tüm uygulamalar, baglam aksini açikça belirtmedikçe birlestirilebilmektedir. Ayrica, baglam aksini açikça belirtmedikçe, yukarida tarif edilen her bir uygulama, bulusun her bir yönü için geçerlidir. Mevcut bulusun diper amaçlari, özellikleri ve faydalari, asagidaki ayrintili açiklama sayesinde daha anlasilir hale gelecektir. Sekillerin kisa açiklamasi Sekil 1A , tamamen oksitlenmis bir yarim antikoru gösterir. domenleri gösterilmez. Bu sekilde gösterilen yarim antikor, bir izotiplerinin, karsilik gelen zincirler arasi ve zincir içi baglar ile yarim antikorlar olarak düsünülebilecegini takdir edecektir. Bütün bir antikorda, mentese sisteinleri zincirler arasi disülfit baglari olusturacaktir. Sekil 1B,.bir heteromultimerizasyon.domenine sahip taniuzunlukta bir bispesifik antikoru gösterir. Mentese bölgesindeki agir zincirler arasi disülfit baglari gösterilmez. Gösterilen heteromultimerizasyon domeni, delik içine topuz formatidir. Sekil lC, bir heteromultimerizasyon domeni (delik içine topuz), bir furin ayrilabilir baglayici ve istege bagli bir ekstra disülfit bagi (8354) içeren bir bispesifik antikorun bir resim taslagi gösterimidir. Mentese bölgesindeki agir zincirler arasi disülfit baglari da gösterilmistir. Furin ayrilma bölgeleri üçgenler ile gösterilmistir. Furin ayrilabilir baglayici topuz içeren yarim antikorda gösterilmesine ragmen delik yarim antikorunda ya da hem topuz hem de delik yarim antikorlarinda da kullanilabilmektedir. Sekiller 2A-B, pH'in yarim antikorlarin konformasyon kaymasi üzerindeki etkilerini gösteren kompozit boyut dislamali kromatogramlarini gösterir. Sekil 2A, yükseltilmis pH ile indüklenmis delik yarim antikor konformasyon kaymasinin daha genis hidrodinamik yariçap ile sonuçlandigini gösterir. Böyle bir konformasyon kaymasi, birlesme esnasinda heterodimerizasyonu arttirmistir. Sekil 2B, yükseltilmis pH'in, kovalent olmayan topuz yarim antikor homodimer olusumunu kolaylastirdigini gösterir. Böyle bir konformasyon kaymasi, birlesme esnasinda bispesifik olusumu kolaylastirmistir. Örnek Z'ye referans yapilmistir. Sekil 3A-3B, arj inin (Sekiller 3A ve B) veya histidin hidroklorür (Sekil 3B) gibi bir çözündürücünün, topuz yarim antikorlarinin ara pH ile indüklenmis çöktürmesini azalttigini gösteren sonuçlari gösterir. Sekil 4A-B, glutatyon gibi bir indirgeyicinin agregasyon ve bispesifik antikor birlesmesi üzerindeki etkisini gösteren kompozit kromatogramlari gösterir. Glutatyon, 2-200X molar fazlalikta ilave edilir. Örnek 3'e referans yapilmistir. Sekil 5A, sicakligin IgGl bispesifik antikor olusumu (birlesimi) hizi üzerindeki etkisini gösteren bir grafiktir. Sekil SB, arttirilmis sicakligin, ters faz kromatografisi ile analiz edildigi gibi, pH tutmasi ile veya olmaksizin 200X glutatyon molar fazlalik varliginda delik-içine-topuz bispesifik IgGl antikorunun birlesmesini kolaylastirdigini gösterir. Sekil 5B ayni zamanda, birlesme öncesinde konformasyon kaymalarini yönlendirmek üzere yarim antikor havuzlarinin pH tutmasinin optimizasyonunun, birlesme hizini ve etkililigini gelistirdigini gösterir. Örnek 4'e referans yapilmistir. Sekil 6A, olusturulmus bispesifik antikoru stabilize etmede ve agregat olusumundaki azalmada.PVP gibi.bir stabilizörün etkisini gösterir. Sekil GB, yükseltilmis sicaklikta PVP ve histidinin, ters faz kromatografisi ile analiz edildigi gibi, delik-içine-topuz bispesifik lgG4 antikorunun birlesmesini kolaylastirdigini gösterir. Alt egri: 300X GlutatyonzAb orani, pH = 8.5, ~400mM Arjinin ile oda sicakligi birlesmesi; üst egri: 35°C'de 200X Glutatyon:Ab orani, pH = 8.0, %4 PVP, 50mM Arjinin, lOO mM Histidin ile isitilmis birlesme. Sekil GC, PVP'nin, 6 saat boyunca 37°C ve pH 8'de isitilmis birlesme esnasinda IgG4 delik-içine-topuz bispesifik antikorunun agregasyonunu azalttigini gösterir. Örnek 5'e referans yapilmistir. Sekil 7, histidinin, 3 saat boyunca 37°C ve pH 8'de IgG4 delik yarim antikorlarinin isi ile indüklenmis agregasyonunu azalttigini gösterir. Ayrintili açiklama Bulus, yalnizca asagidaki tanimlarin ve örneklerin kullanilmasi ile referans araciligiyla ayrintili olarak tarif edilecektir. Istemler, korumanin arastirildigi konuyu tanimlar, istemlerde tanimlananin ötesine geçen herhangi bir ifade sadece bilgi için Burada aksi belirtilmedikçe, burada kullanilan bütün teknik ve bilimsel terimler, bir bulusun ait oldugu alanda siradan tecrübe sahibi olan bir kimsenin genel olarak anladigi sey ile ayni anlama sahiptir. Singleton, ve digç, DICTKWARYCW MICNNHOLdnîAND DkmEmnAR BHHDGY, 2. Baski, John Wiley ve Sons, New York (1994), ve .Hale & Pdarhann THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harperî Perennial, NY (1991), mevcut. bulusta kullanilan. terimlerin çogunun oldugu genel bir sözlüge sahip uzmanlardan birini sunar. Burada tarif edilenlere benzer veya bunlarla esdeger herhangi bir yöntem ve materyal, mevcut bulusun uygulanmasinda veya test edilmesinde kullanilabilmesine ragmen tercih edilen yöntemler ve materyaller tarif edilir. Sayisal araliklar, araligi tanimlayan sayilari kapsar. Aksi belirtilmedikçe, nükleik asitler, 5' ila 3' yönünde soldan saga yazilir ve amino asit sekanslari, sirasiyla, amino ila karboksi yönünde soldan saga yazilir. Uygulayicilar özellikle, teknigin tanimlari ve terimleri için Sambrook ve dig., 1989, ve Ausubel FM ve dig., 1993'e yönlendirilir. Degiskenlik gösterebileceginden, mevcut bulusun tarif edilen belirli metodoloji, protokoller ve reaktiflerle sinirli olmadigi anlasilmalidir. Sayisal araliklar, araligi tanimlayan sayilari kapsar. Aksi belirtilmedikçe, nükleik asitler, 5' ila 3' yönünde soldan saga yazilir ve amino asit sekanslari, sirasiyla, amino ila karboksi yönünde soldan saga yazilir. Burada kullanildigi sekliyle, "bir" ve "bu" ifadelerinin tekil biçimleri, baglam. aksini açikça belirtmedigi sürece çogul göndermelerini de kapsar. Örnegin, "bir konak hücre" referansi bir veya daha fazla konak hücresi anlamina gelir. Burada sunulan basliklar, bir bütün olarak tarifnameye referansla bulusun çesitli yönlerinin veya uygulamalarinin sinirlamalari degildir. Buna uygun olarak, hemen asagida tanimlanan terimler, bir bütün olarak tarifnameye referansla bütün yönleriyle tanimlanmistir. Burada açiklanan tüm uygulamalar, baglam aksini açikça belirtmedikçe birlestirilebilmektedir. Ayrica, baglam aksini açikça belirtmedikçe, asagida tarif edilen her bir uygulama, bulusun her bir yönü için geçerlidir. 1. Tanimlar Mevcut.bulus, birinci.bir1nentese içeren bir polipeptid ve ikinci bir mentese içeren polipeptid ihtiva eden bir heteromultimerik protein üretmeye yönelik yöntemler sunar. Burada kullanildigi sekliyle "mentese içeren polipeptid" terimi, en az bir mentese bölgesi içeren bir polipeptidi ifade eder. Belirli uygulamalarda, mentese bölgesi, örnegin, bir baglayici domen ve bir efektör domen gibi birden çok domeni baglar ve dimerizasyon veya multimerizasyon için polipeptide bazi yapisal esneklikler saglar. Bir örnek olarak, baglayici domen, bir antikorun bir antijen baglayici domeni veya bir reseptörün bir ligant baglayici domeni olabilmektedir ve efektör domen, bir antikorun bir PC bileseni olabilmektedir. Belirli uygulamalarda, birinci mentese içeren polipeptid, ikinci mentese içeren polipeptidden farklidir ve ortaya çikan dimer veya multimer, bir heterodimer veya heteromultimerdir. Belirli özel uygulamalarda, birinci mentese içeren bir polipeptid ve ikinci mentese içeren polipeptid, ayni hedef proteindeki iki farkli epitopa baglanir. Diger belirli uygulamalarda, birinci mentese içeren polipeptid, ikinci mentese içeren polipeptidinkinden farkli bir hedef baglama.spesifikligine sahiptir ve ortaya çikan.heterodimer veya heteromultimer, iki veya daha fazla farkli hedef proteine baglanir. Belirli uygulamalarda, mentese içeren bir polipeptid, dogal olarak olusan veya islenmis bir heterodimerizasyon domeni içerir. Belirli özel uygulamalarda, mentese içeren polipeptid, mentese bölgesinde baska bir mentese içeren polipeptid ile bir veya daha fazla disülfit bagi olusturabilen bir veya daha fazla sistein kalintisi içerir. Mentese içeren bir polipeptid, sinirlama olmaksizin bir yarim antikor, bir immünoadezin ve bunlarin fonksiyonel fragmanini içerir. Burada kullanildigi sekliyle "fonksiyonel fragman" terimi, istenen fonksiyonu hala muhafaza eden, örnegin, hedef veya antijen baglanma aktivitesini, Fc efektör aktivitesini ve/veya dimerizasyon/multimerizasyon kabiliyetini muhafaza eden, mentese içeren polipeptidin, tam uzunlugundan daha kisa olan, bir fragmanini ifade eder. Belirli özel uygulamalarda, birinci mentese içeren polipeptid ve ikinci mentese içeren polipeptidin her biri, farkli antijen baglayici spesifiklige sahip bir yarim antikordur ve ortaya çikan dimer veya multimer, bispesifik veya multispesifik bir antikordur. Belirli uygulamalarda, ortaya çikan heteromultimerik protein, bir yarim antikor ve bir immünoadezin içerir. kullanilir ve spesifik olarak poliepitopik spesifiklige sahip bir antikoru kapsar. Bu tür multispesifik antikorlar arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, bir agir zincir degisken domeni (V3) ve bir hafif zincir degisken domeni (VL) içeren ve VMAJ biriminin poliepitopik spesifiklige sahip oldugu bir antikor, iki veya daha fazla Vi've vg domenine sahip olan ve her bir Vßhjbiriminin farkli bir epitopa baglandigi antikorlar, iki veya daha fazla tek degiskenli domene sahip olan ve her bir tek degiskenli domenin farkli bir epitopa baglandigi antikorlar, tam uzunluklu antikorlar, Fab, FV, dSFV, scFV, diyakorlar, bispesifik diyakorlar ve triyakorlar gibi antikor fragmanlari, kovalent olarak veya kovalent olmayan biçimde baglanmis olan antikor fragmanlari bulunur. "Poliepitopik spesifiklik" ifadesi, ayni veya farkli hedefte/hedeflerde iki veya daha fazla farkli epitopa spesifikiolarakloaglanma kabiliyetini ifade eder. kabiliyetini ifade eder. Bir uygulamaya göre, multispesifik bir afinite ile baglanan bir IgG antikorudur. Dogal olarak olusan temel 4 Zincirli bir antikor birimi, iki özdes hafif (L) zincir ve iki özdes agir (H) zincirden olusan bir heterotetramerik glikoproteindir (bir IgM antikoru, J zinciri adi verilen ilave bir polipeptid ile birlikte, temel heterotetramer birimlerinin 5'inden olusur ve dolayisiyla 10 adet antijen baglanma bölgesi içerir, bununla birlikte, salgilanan IgA.antikorlari ise, polimerize olarak, J zinciri ile birlikte temel 4 Zincirli birimlerin 2-5'ini içeren çok degerlikli kümeler olusturabilmektedir). IgG'lerde, 4 Zincirli birim genellikle yaklasik 150.000 daltondur. Her bir L zinciri, bir kovalent disülfit bagi ile bir H zincirine baglidir, bununla birlikte iki H zinciri ise, H zincir izotipine bagli olarak bir veya daha fazla disülfit bagi ile birbirine baglidir. Her bir H ve L zinciri ayni zamanda düzenli aralikli zincir içi disülfit köprülerine sahiptir. Her bir H zincirinin, N-ucunda bir degisken domen (VH)\K2bunu takiben, d've\rzincirleriniriher biri için üç sabit domen (CH) ve u ve e izotipleri için dört.CH domeni bulunur. Her bir L zincirinin, N-ucunda bir degisken domen (VL) ve bunu takiben C-ucunda bir sabit domen (cm bulunur. VL,\m ile hizalanmistir ve(hjise, agir zincirin ilk sabit domeni (CHl) ile hizalanmistir. Belirli amino asit kalintilarinin, hafif zincir ve agir zincir degisken domenleri arasinda bir ara yüzey olusturdugu düsünülür. Bir VH ve VL eslesmesi birlikte tek bir antijen baglanma bölgesi olusturur. Farkli antikor siniflarinin yapilari ve özellikleri için, bkz. örn. Basic and Clinical G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, sayfa 71 ve Bölüm 6. Herhangi bir omurgali türünden elde edilen L zinciri, sabit domenlerinin amino asit sekanslarina dayali olarak, kappa ve lambda olarak adlandirilan açikça farkli iki türden birine ayrilabilmektedir. Agir zincirlerinin (Cm sabit.domeninin amino asit sekansina bagli olarak, immünoglobülinler farkli siniflara veya izotiplere ayrilabilmektedir. Bes immünoglobülin sinifi bulunmakta olup bunlar: sirasiyla, atanmis d, 5, 8, V ve u agir zincirlerine sahip IgA, lgD, IgE, IgG ve lgM. V ve d siniflari ayrica, CH sekansindaki ve fonksiyonundaki nispeten küçük farklara dayali olarak daha fazla alt siniflara ayrilmaktadir, örnegin, insanlar, asagidaki alt siniflari ifade eder: IgGl, antikorlar arasinda sekans bakimindan büyük farklar gösterdigini ifade eder. Vidomeni, antijen.baglanmasina aracilik eder ve belirli bir antikorun belirli antijeni için olan spesifikligini tanimlar. Bununla birlikte, degiskenlik, degisken domenlerin 110 amino asitlik bir kismi boyunca esit dagilinigöstermez. Bunun yerine, Vloölgeleri, her biri 9-12 amino asit uzunlugunda olan "asiri degisken bölgeler" olarak adlandirilan asiri degisken kisa bölgelerle ayrilan 15-30 amino asitlik çerçeve bölgeleri (FRs) adi verilen nispeten degismeyen uzanimlardan olusur. Natif agir ve hafif zincirlerin degisken domenlerinin her biri, beta-tabaka yapisini baglayan ve bazi durumlarda beta-tabaka yapisinin bir kismini olusturan kivrimlar olusturan üç asiri degisken bölge ile baglanan bir beta-tabaka konfigürasyonunu büyük ölçüde benimseyen dört FR içerir. Her zincirde asiri degisken bölgeler FR'ler ile birbirlerine yakin tutulur ve, diger zincirden asiri degisken bölgelerle, antikorlarin antijen.baglannß.bölgesinin.olusmasina katkida bulunurlar (bkz. Kabat ve dig, Sequences of Proteins of National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Sabit bölgeler bir antikorun bir antijene dogrudan baglanmasinda rol almaz; ancak, antikorun, antikora bagimli hücresel sitotoksisiteye (ADCC) katilimi gibi çesitli efektör fonksiyonlar gösterir. Burada kullanildigi sekliyle "asiri degisken bölge", "HVR" veya asiri degisken olan ve/veya yapisal olarak tanimli kivrimlar olusturan bölgelerini ifade eder. Genellikle, antikorlar alti HVR içerir; bunlarin üçü VH'de (Hl, H2, H3) ve üçü VL'de (L1, L2, L3) bulunur. Natif antikorlarda, H3 ve L3, alti HVR'nin çesitliligini gösterir ve özellikle H3'ün antikorlara kaliteli spesifiklik kazandirmada essiz bir rol oynadigina inanilir. in MEthods in Molecular`Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Aslinda, bir agir zincirden olusan dogal olarak meydana gelen devegil antikorlari, hafif zincir yoklugunda fonksiyonel ve stabildir. Bkz., örn., Bir takim HVR çizimleri kullanimdadir ve bu metnin kapsami dahilindedir. Kabat Tamamlayicilik Belirleme Bölgeleri (CDR'ler), sekans degiskenligine dayanir ve en yaygin olarak kullanilanlardir (Kabat ve digi, Sequences of` Proteins of National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia, bunun yerine, yapisal kivrimlarin konumuna atifta bulunur Kabat HVR'leri ve Chothia yapisal kivrimlari arasinda bir uyusmayi temsil eder ve Oxford Molecular'in AbM antikor modelleme yaziliminda kullanilir. "Temas" HVR'ler, mevcut kompleks kristal yapilarin bir analizine dayanir. Bu HVR'lerin her birinden olan kalintilar asagida belirtilmistir. Kabat AbM Chothia Temas L24-L3 L24-L3 L50-L5 L50-L5 L89-L9 L89-L9 Numaralandirmasi (Chothia Numaralandirmasi HVR'ler asagidaki gibi "genisletilmis HVR" ler içerebilir: VL tanimlarin her biri için yukaridaki, Kabat ve dig.'ne göre numaralandirilir. domen kalintilaridir. Her bir degisken domen tipik olarak FRl, FR2, FR3 ve FR4 olarak tanimlanan dört FR'ye sahiptir. Eger CDR'ler Kabat'a göre tanimlanirsa, hafif zincir FR kalintilari, yaklasik olarak ve kalintilarinda bulunur ve agir zincir FR kalintilari, agir zincir kalintilarinda yaklasik olarak 1-30 kalintilarinda bulunur. Eger CDR'ler asiri degisken kivrimlardan kaynaklanan amino asit kalintilari içermekte ise, hafif zincir FR kalintilari, hafif zincirde yaklasik olarak kalintilarinda bulunur ve agir zincir FR kalintilari, agir zincir kalintilarindar yaklasikr olarak , kalintilarinda bulunur. Bazi durumlarda, CDR'nin hem Kabat tarafindan tanimlandigi gibi bir CDR'ye ait hem de bir asiri degisken kivrima.ait amino asitleri içermesi halinde, FR kalintilari buna göre ayarlanacaktir. Örnegin, CDRHl, H26-H35 amino asitlerini içerdiginde, agir zincir FRl kalintilari 1-25 konumlarinda ve FR2 kalintilari 36-49 konumlarinda bulunur. Bir "insan konsensus çerçevesi", insan immünoglobülin VL veya VH çerçeve sekanslarinin bir seçiminde en sik rastlanilan amino asit kalintilarini temsil eden bir çerçevedir. Genellikle, insan immünoglobülin VL veya VH sekanslarinin seçimi, degisken domen sekanslarinin bir alt grubu içinden yapilir- Genellikle, sekans alt grubu Kabat'taki gibi bir alt gruptur. Bir uygulamada, VL için alt grup, Kabat'ta oldugu gibi kappa I alt grubudur. Bir uygulamada, VH için alt grup, Kabat'ta oldugu gibi alt grup Bir "bütün" antikor örnegi, bir antijen baglannß.bölgesinin yani sira bir Crve en azindan agir zincir sabit domenleri olarak CH1, CH2 ve CH3'ü içeren bir antikordur. Sabit domenler, natif sekans sabit domenleri (örnegin, insan natif sekans sabit domenleri) ya da bunlarin amino asit sekansi varyantlari olabilmektedir. tercihen bütün antikorun antijen baglanma ya da degisken bölgesini içerir. Antikor fragmanlarinin örnekleri arasinda Fab, Fab', F(ab')2 ve FV fragmanlari; diyakorlar (Db); tandem diyakorlar (taDb), dogrusal antikorlar (örnegin U.S. Patent No. (l995)); tek kollu antikorlar, tek degisken domenli antikorlar, minikorlar, tek Zincirli antikor molekülleri; ve antikor fragmanlarindan olusturulmus multispesifik antikorlar (örnegin, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CHB, (scFV)4-Fc). Burada kullanildigi sekliyle "yarim antikor" terimi, bir immünoglobülin hafif zinciri ile baglantili bir immünoglobülin agir zincirini ifade eder. Örnek niteligindeki bir yarim antikor, Sekil 1A'da gösterilmistir. Teknikte uzman bir kisi, bir yarim antikorun bunun bir fragmanini kapsayabilecegini ve ayrica tek bir degisken domenden olusan, örnegin bir devegilden kaynaklanan, bir antijen baglayici domene sahip olabilecegini kolaylikla takdir edecektir. Mevcut bulus sahipleri beklenmedik bir sekilde, düsük pH'daki bir Protein A kolonu veya diger matristen elüt edilen yarim antikorlarin pH optimizasyonunun veya ayarlamasinin, yarim antikorlar gibi mentese içeren polipeptidlerin konformasyon kaymasini indükledigini kesfetmislerdir. Bir ara pH'a dogru yapilan pH optimizasyonu, mevcut tarif boyunca bazen pH tutmasi veya ara pH tutmasi olarak da ifade edilir, yarim antikor çöktürmesine veya agregasyonuna neden olabilir. Dolayisiyla, belirli uygulamalarda, bir heteromultimerik protein üretme yöntemi, sirasiyla, birinci bir veya ikinci bir çözündürücünün varliginda pH 5-9'da birinci bir veya ikinci mentese içeren bir polipeptid sunma asamasini içerir. Burada kullanildigi sekliyle bir çözündürücü, bir yarim antikor gibi mentese içeren bir polipeptid çöktürmesini önleyen veya azaltan bir reaktif olarak tanimlanir. Uygun çözündurücü, sinirlama.olmaksizin.arjinin ve histidin.ya da.bir tuz veya bunun türevini ve sakaroz içerir. Belirli uygulamalarda, çözündürücü, arjinin ve/veya histidindir. Belirli uygulamalarda, çözündürücü, ara pH tutmasi ve/veya isitma ile indüklenmis çöktürmeyi önler veya azaltir. Belirli özel uygulamalarda, ara pH tutmasi öncesinde (baska bir ifadeyle, ara pH'a ayarlamadan önce) ve/veya isitma Öncesinde bir çözündürücü ilave edilir. Belirli uygulamalarda, arjinin veya histidin, arjinin tuzu veya histidin tuzudur. Diger belirli uygulamalarda, arjinin veya histidin, bir arjinin türevi veya histidin türevidir. Çöktürmenin azaltilmasi, istenen birlestirilmis nihai ürünün veriminin artmasina neden olabilmektedir. Imidazol ve guanidin, genel protein preparasyonu ve saflastirmasi için proteini çözündürmek amaciyla kullanilmistir. Bununla birlikte, beklenmedik bir sekilde, imidazol ve guanidinin tek basina, histidin veya arjinin baglaminda olmaksizin, sirasiyla, burada tarif edilen sekilde bispesifik antikor gibi birlestirilmis heteromultimerik proteinin toplam verimini arttirmada yetersiz olduklari kesfedilmistir. Belirli uygulamalarda, imidazol ve guanozin, proteinleri denatüre edebilmektedir. Benzer sekilde, guanidin HCI ve üre gibi deterjanlar, genel olarak agregasyonu/çöktürmeyi azaltmak için yaygin olarak kullanilir ancak bunlar proteini tamamen denatüre edebilmektedirler. Bu nedenle, belirli uygulamalarda, çözündürücü, ilgili proteini denatüre etmeden çöktürmeyi önler veya azaltir. Bu nedenle, belirli özel uygulamalarda, Çözündürücü, guanidin HCI, guanidin, imidazol'veya üre degildir. Ve diger belirli uygulamalarda, mevcut bulusa ait bilesimler, guanidin HCI veya üre içermez. Diger belirli uygulamalarda, çözündürücü, Tween veya PEG degildir. Ayrica, örnegin, her bir yariniantikorun.ara.pH tutmasi esnasinda veya mentese içeren polipeptidleri ya da yarim antikorlari karistirma sirasindaki veya hemen sonrasindaki birlesme esnasinda bir stabilizör ilave edilebilmektedir. Birlesme öncesinde, esnasinda ve/veya sonrasinda, mentese içeren bir polipeptidlerin veya yarim antikorlarin agregasyonunu önlemek veya azaltmak amaciyla mevcut bulusa ait yöntemlerin asamalarinin biri veya daha fazlasi veya tümündeki tepkimeye bir stabilizör ilave edilebilmektedir. Agregatlar, yüksek moleküler agirlikli türler olarak ve yarim antikorlar baglaminda, 150 kDa'dan daha fazla bir moleküler agirliga sahip yüksek moleküler agirlikli türler olarak belirlenebilmektedir. Agregatlar, örnegin, boyut dislamali kromatografi veya diger uygun yöntemler ile belirlenebilmekte ve miktarlari ölçülebilmektedir. Diger belirli uygulamalarda, boyut dislamali kromatografi ile belirlenen agregatlar, 0,2 um'lik› bir steril filtreden geçebilmektedir. Diger yandan çöktürülmüs proteinler, denatüre proteinlerden veya çok büyük kompleksler olusturabilen agrega edilmis proteinlerden olusabilmektedir. Bazi reaktifler test edilmis ve stabilizör, örnegin, imidazol, 3-(N-morfolino)propansülfonik asit (MOPS), 2-(N-morfolino)etansülfonik asit (MES), siklodekstrin, CuSO4ve NaOAc olarak kullanilmaya uygun olmadiklari ve etkisiz olduklari belirlenmistir. Bu nedenle, belirli uygulamalarda, stabilizör inorganik tuz veya geçis metali içermez. Uygun stabilizörler, sinirlama olmaksizin PVP, histidin ve arjinin içerir. Agregasyonun azaltilmasi, istenen birlestirilmis nihai ürünün veriminin artmasina neden olabilmektedir. PVP, bir pirolidon grubu ile suda Çözünebilen yüksüz bir polimerdir. Belirli uygulamalarda, diger yüksüz polar polimerler, diger reaktifler veya bilesikler, özellikle burada tarif edilen uygun stabilizörler ile benzer yapi ve özelliklere sahip bilesikler, mevcut bulusta kullanmaya yönelik uygun stabilizörler olabilir. Burada sunulan yöntemler dahil olmak üzere teknikte bilinen yöntemler ile bilesigin agregasyon seviyeleri üzerindeki etkisini analiz ederek uygun bir stabilizörü belirlemek teknikte uzman bir kisinin kabiliyeti dahilindedir. Bir reaktif, hem bir çözündürücü hem de bir stabilizör olarak karakterize edilebilir. Örnegin, arjinin, ara.pH tutmasi ve/veya isitma esnasinda yarim.antikorlarin çöktürmesini azaltmak için bir çözündürücü olarak ve bununla birlikte birlesme asamasi esnasinda agregasyonu azaltmak için bir stabilizör olarak kullanilabilmektedir. Benzer sekilde, histidin, ara pH tutmasi ve/Veya isitma esnasinda, çöktürmeyi azaltmak için bir çözündürücü olarak ve bununla birlikte yarim antikorlarin agregasyonunu azaltmak için bir stabilizör olarak kullanilabilmektedir. Herhangi bir belirli mekanizma ile sinirli kalmaksizin, belirli uygulamalarda, bir çözündürücü ve bir stabilizörün her ikisi de, agregasyona neden olan proteinlerin yüzeylerindeki hidrofobik eklerin etkilesimini önleyerek çalisabilmektedir. Diger uygulamalarda, bir çözundürücü ve bir stabilizörün her ikisi de, proteinlerin istenmeyen etkilesimini önlemek amaciyla klatratlar olusturarak fonksiyonlarini yerine getirebilmektedir. Burada kullanildigi sekliyle "tek Zincirli yarim. antikor" terimi, bir VH domeni, istege bagli olarak bir CL domeni, bir baglayici, bir VH domeni, istege bagli olarak bir CHl domeni, bir mentese domeni, bir CH2 domeni ve bir CH3 domeni içeren tek Zincirli bir polipeptidi ifade etmekte olup burada söz konusu domenler, bir N-terminalden C-terminal yönünde birbirlerine göre su sekilde konumlandirilir: VL-baglayici-VH-mentese-CHZ-CH3 veya VL-CL-baglayici-VH-CHI-mentese-CHZ-CH3. (SVD) antikorlar" ifadesi genellikle, içerisinde tek bir degisken domenin (VH veya VL) antijene baglanma saglayabildigi antikorlari ifade eder. Baska bir deyisle, tek degisken domenin hedef antijeni tanimak için baska bir degisken domen ile etkilesime girmesi gerekmez. Tek domenli antikorlarin örnekleri arasinda devegillerden (lamalar ve develer) ve kikirdakli baliklardan (örnegin hemsire köpekbaliklari) türetilenler ve insan ve fare antikorlarindan rekombinant yöntemlerle 02/051870). antikorlari ifade eder. Özetle, bu antikorlar, tamamlayici hafif zincir polipeptidlerle birlikte, bir çift antijen baglanma bölgesi olusturan bir çift tandem Fd segmentini (VA-Cgl-VH-Cgl) içerir. Dogrusal antikorlar bispesifik veya monospesifik olabilmektedir. Burada sözü geçen "delik-içine-topuz" veya "KnH" teknolojisi terimi, etkilesime girdikleri bir ara yüzeyde bir çikintinin (topuz) bir polipeptidin içine ve bir oyugun (delik) diger polipeptidin içine dahil edilmesi ile iki polipeptidin birlikte in vitro veya in Vivo olarak eslestirilmesini yönlendiren teknolojiyi ifade eder. Örnegin, KnH'ler, antikorlarin FczFc baglanma ara yüzeylerine, CL:CH1 ara yüzeylerine veya VH/VL ara yüzeylerine dahil edilmistir (örnegin USZOO7/0178552, WO 6:781-788). Bu, multispesifik antikorlarin üretimi esnasinda iki farkli agir zincirin birlikte eslestirilmesinin yönlendirilmesinde özellikle faydalidir. Örnegin, Fc bölgelerinde KnH'ye sahip olan multispesifik antikorlar ayrica her bir PC bölgesine bagli tek degisken domenleri içerebilmekte veya benzer ya da farkli hafif zincir degisken domenleri ile eslesen farkli agir zincir degisken domenlerini içerebilmektedir. KnH teknolojisi ayrica, farkli hedef tanima sekanslarini (örnegin afikorlar, peptikorlar ve Pc füzyonlarini) içeren iki farkli reseptör hücre disi domenlerini birlikte veya herhangi bir baska polipeptid sekanslarini eslestirmek için kullanilabilmektedir. Antikorlarin papaini parçalamasi sonucunda "Fab" fragmanlari olarak adlandirilan iki özdes antijen baglayici fragman ve kolayca kristallesebilme özelligini gösteren.bir isiniolarak bir kalinti "Fc" fragmani üretilir. Fab fragmani, H zincirinin degisken bölge domeni (VH) ile birlikte tüm.bir L zincirinden ve bir agir zincirin (CHl) ilk sabit domeninden olusur. Bir antikorun pepsin ile isleme tabi tutulmasi sonucunda, çift degerlikli antijen baglanma aktivitesine sahip iki disülfit bagli Fab fragmanina kabaca karsilik gelen ve hala antijeni çapraz baglama kabiliyetine sahip olan tek bir büyük F(ab')2 fragmani elde edilir. Fab' fragmanlari, antikor mentese bölgesinden bir veya birden fazla sistein içeren CH1 domeninin karboksi ucundaki birkaç ek kalintiya sahip olma bakimindan Fab fragmanlarindan farklilik gösterir- Fab'-SH burada, içerisinde sabit domenlerin sistein kalintisinin/kalintilarinin bir serbest tiyol grubu tasidigi Fab' için verilen isimdir. F(ab')2 antikor fragmanlari baslangiçta aralarinda mentese sisteinler bulunan Fab' fragmani çiftleri olarak üretilmistir. Antikor fragmanlarinin diger kimyasal kenetlenmeleri de bilinir. Fc fragmani, disülfitler~ ile bir arada tutulan her iki H zincirinin karboksi terminal kisimlarini içerir. Antikorlarin efektör fonksiyonlari, Fc bölgesindeki sekanslara göre belirlenmekte olup; bu bölge ayni zamanda belirli hücre tipleri üzerinde bulunan Fc reseptörleri (FcR) tarafindan taninan parçadir. hafif Zincirli degisken bölge domeninin dimerinden olusur. Bu iki domenin katlanmasi sonucunda, antijen baglanmasi bakimindan amino asit kalintilarina katkida bulunan ve antikora antijen baglanma spesifikligi kazandiran alti adet asiri degisken kivrim (H ve L zincirinden 3'er kivrim) olusur. Bununla birlikte, tek bir degisken domen (veya sadece bir antijen için spesifik üç CDR içeren bir Fv'nin yarisi) bile, tüm baglanma bölgesine göre çogunlukla daha düsük afinite ile olsa da, antijeni tanima ve Ayni zamanda "sFV" ya da "scFV" olarak da kisaltilan "tek Zincirli FV" terimi, tek bir polipeptid zincirine baglanan`nge VLantikor domenlerini içeren antikor fragmanlaridir. Tercihen, st polipeptidi ayrica, VH ve VL domenleri arasinda, sFV'nin antijen baglanmasi için istenen yapiyi olusturmasina olanak taniyan bir polipeptid baglantilayici içerir. sFV ile ilgili bir inceleme için, bkz. Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, cilt 113, Rosenburg ve Moore eds., Springer-Verlag, saglanirken zincir içi eslesmesi saglanmayacak sekilde ve sonuçta, baska bir ifadeyle iki antijen.baglanma.bölgesine sahip fragman gibi iki degerli bir fragman elde edilecek sekilde, VE ve VL domenleri arasinda kisa baglantilayicilar (yaklasik 5-10 kalinti) ile st fragmanlarinin olusturulmasiyla (bkz. önceki paragraf) hazirlanan küçük antikor fragmanlarini ifade etmektedir. Bispesifik diyakorlar, iki "çapraz geçisli" sFV fragmaninin heterodimerleri olup içerisinde iki antikorun VHve VL domenleri farkli polipeptid zincirleri üzerinde bulunur. Diyakorlarin daha ayrintili açiklamasi için bkz., örnegin, EP 404,097; WO 93/lll6l; ve Hollinger ve dig., Proc. Natl. Acad. CHZ domeni, bir CH3 domeni veya bir CHZ-CH3 domeni içeren bir polipeptide bir peptid.bagi ile birlestirilen degisken bir domen ve (2) bir degisken domenin ikinci CH2, CH3 veya CH2-CH3 domenini içeren bir polipeptide bir peptid bagi ile birlestirilmedigi ikinci.bir CH2, CH3 veya.CH2-CH3 domeni içeren.bir antikoru.ifade eder. Bir uygulamada, tek kollu antikor, 3 polipeptid içerir; bunlar, (1) bir degisken domen (örnegin VH), CHl, CH2 ve CH3 içeren birinci bir polipeptid, (2) bir degisken domen (örnegin VL) ve bir CL domeni içeren ikinci bir polipeptid ve (3) bir CHZ ve CH3 domeni içeren üçüncü bir polipeptiddir. Bir uygulamada, üçüncü polipeptid, bir degisken domen içermez. Baska bir uygulamada, tek kollu antikor, sabit agir zincirleri baglayan disülfit baglarini olusturan iki sistein kalintisi içeren kismi bir~ mentese bölgesine sahiptir. Bir uygulamada, tek kollu antikorun degisken domenleri bir antijen baglayici bölge olusturur. Baska bir uygulamada, tek kollu antikorun bir degisken domeni, tek bir degisken domeni olup burada her bir tek degisken domen, bir antijen baglayici domendir. Bulusa ait antikorlar, agir ve/veya hafif zincirin bir kisminin belirli bir antikor sinifi veya alt sinifina ait veya belirli bir türden türetilmis antikorlardaki karsilik gelen sekanslarla özdes veya bu sekanslarin homologu oldugu "kimerik" antikorlar olabilmektedir, bununla birlikte zincirin(lerin) geri kalani ise, istenen biyolojik aktiviteyi sergilemek kosuluyla, bir baska antikor sinifina veya alt sinifina ait veya bir baska türden türetilmis antikorlardaki karsilik gelen sekanslarin yani siraknitür antikorlarin fragmanlari ile özdes veyalaunlarin homologudur (U.S. Patent No. 4,816,567; ve Morrison ve dig., kimerik antikorlar, insan olmayan bir primattan (örnegin Eski Dünya Maymunu, Ape Vb.) türetilmis degisken domen antijen baglanma sekanslarini ve insan sabit bölge sekanslarini içeren primatize antikorlari içerir. Insan olmayan antikorlarin (örnegin kemirgen) "hümanize edilmis" formlari, insan olmayan antikordan türetilen sekanstan minimal düzeyde içeren kimerik antikorlardir. Çogu zaman, hümanize edilmis antikorlar, insan immünoglobülinleri (alici antikor) olup içerisinde aliciniiibir asiri degisken bölgesinden kalintilari, fare, siçan, tavsan gibi insan olmayan bir türün (verici antikor) ya da istenen antikor spesifikligine, afinitesine ve kapasitesine sahip olan insan olmayan primatin bir asiri degisken bölgesinden elde edilen kalintilarla degistirilir. Bazi durumlarda, insan immünoglobulinin çerçeve bölgesi (FR) kalintilari, karsilik gelen insan olmayan kalintilarla degistirilir. Ayrica, hümanize edilmis antikorlar, alici antikorunda.ya da verici antikorunda bulunmayan kalintilar içerebilmektedir. Buinodifikasyonlar antikor performansini daha da iyilestirmek için yapilir. Genellikle, hümanize edilmis antikor, en az bir ve tipik olarak iki degisken domenin büyük ölçüde tamamini içerecek olup bunlarin içinden asiri degisken kivrimlarin tamami ya da büyük ölçüde tamami, insan olmayan bir immünoglobülininkilere karsilik gelir ve FR'lerin tamami ya da büyük ölçüde tamami bir insan immünoglobülin sekansinindir. Hümanize edilmis antikor, ayrica istege bagli olarak, immunoglobülin sabit bölgesinin (Fc), tipik olarak bir insan immünoglobulinin, en az bir kismini içerir. Daha fazla ayrinti Burada kullanildigi sekliyle "kompleks" veya "komplekslesmis", peptid baglari olmayan.baglar ve/veya kuvvetler (Örnegin van der Waals, hidrofobik, hidrofilik kuvvetler) araciligiyla birbiriyle etkilesime giren iki veya daha fazla molekülün birlesmesini ifade eder. Bir uygulamada, kompleks heteromultimeriktir. Burada kullanildigi sekliyle "protein kompleksi" veya "polipeptid kompleksi" teriminin, (örnegin, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, bir toksin veya.bir belirleme ajani dahil olmak üzere) protein kompleksinde bir proteine konjüge edilmis protein olmayan bir varliga sahip olan kompleksleri içerdigi anlasilmalidir. Burada kullanildigi sekliyle "heteromultimer" veya (örnegin disülfit bagi) ve/veya kovalent olmayan bir etkilesim (örnegin hidrojen baglari, iyonik baglar, Van der Waals kuvvetleri ve hidrofobik etkilesimler) ile birbirleri ile etkilesen iki veya daha fazla polipeptidi açiklamakta olup burada moleküllerin en az ikisi birbirinden farkli sekanslara sahiptir. Burada kullanildigi sekliyle "heteromultimerizasyon domeni", heteromultimer olusumu kolaylastirmak ve homomultimer olusumu engellemek üzere biyolojik bir moleküle yapilan degisiklikleri veya ilaveleri ifade eder. Homodimerler üzerinde heterodimerlerin olusturulmasi için güçlü bir öncelige sahip olan herhangi bir heterodimerizasyon domeni mevcut bulusun kapsami dahilindedir. Açiklayici örnekler arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, örnegin, US Patent Basvurusu - Amgen: elektrostatik yönlendirme etkilerini tarif eder); WO tarif eder) bulunur. Ayrica, örnegin lösin fermuari tarif eden sarmal-dönüs-sarmal desenini tarif eden Pack ve dig., ifadeleri burada birbirinin yerine kullanilir. Belirli uygulamalarda, mentese içeren polipeptid, bir veya daha fazla heterodimerizasyon domeni içerir. Burada kullanildigi sekliyle, "immünoadezin" terimi, heterolog bir proteinin (bir "adezin") baglanma spesifikligini, immünoglobülin sabit domenlerinin efektör fonksiyonlariyla birlestiren molekülleri isaret eder. Yapisal olarak immünoadezinler, istenen bir baglanma spesifikligine sahip olan bir amino asit sekansinin ve bir immünoglobülin sabit domen sekansinin (örnegin bir IgG'nin CHZ ve/veya CH3 sekansi) bir füzyonunu içermekte olup bahsedilen amino asit sekansi, bir antikorun antijen tanima ve baglanma bölgesinden farklidir (baska bir ifadeyle bir antikorun sabit bir bölgesine kiyasla bir proteine baglanan bir reseptörün ya da bir ligandin bir kismini içeren bitisik amino asit sekanslarini içerir. Adezin sekanslari ayni zamanda ilgili bir proteini baglayan ancak reseptör veya ligant sekanslari olmayan (örnegin peptikorlardaki adezin sekanslari) sekanslar olabilmektedir. Bu tür polipeptid sekanslari, faj görüntüleme teknikleri ve yüksek çiktili siralama yöntemleri dahil olmak üzere çesitli yöntemlerle seçilebilmekte veya belirlenebilmektedir. Immünoadezindeki immünoglobülin sabit domen sekansi, herhangi bir immünoglobülinden, örnegin IgG-l, IgG-2, IgG-3 veya IgG-4 alt tipleri, IgA (örnegin IgA-l ve IgA-Z), IgE, IgD veya IgM'den elde edilebilmektedir. Mevcut bulusun ilgili bir antijeni "baglayan" bir antikoru, antikorun antijeni ekprese eden bir protein ya da bir hücre ya da dokuyu hedef almak için tanilayici ve/veya terapötik bir ajan olarak kullanisli olacagi sekilde yeterli afinite ile antijeni baglayan ve diger proteinlerle önemli ölçüde çapraz tepkimeye girmeyen bir antikordur. Bu tür uygulamalarda, antikorun "hedef olmayan" bir proteine baglanma kapsami, fluoresan aktif hücre ayirma (FACS) analizi ya da radyoimmünopresipitasyon (RIA) ya da ELISA ile belirlendigi sekilde, antikorun belirli hedef proteinine baglanma boyutunun yaklasik %lO'undan daha az olacaktir. Bir antikorun bir hedef moleküle baglanmasi ile ilgili olarak, belirli bir polipeptid veya belirli bir polipeptid hedefi üzerindeki.bir epitop için "spesifiklaaglanma" veya"spesifikolarakbaglanmak"veya"içinspesifik"terimleri, spesifik olmayan bir etkilesimden ölçülebilir düzeyde farkli olan baglanma anlamina gelir (Örnegin, spesifik olmayan bir etkilesim, sigir serunialbümini.veya kazeine baglanma.olabilir). Spesifik baglanma, örnegin, bir molekülün baglanmasinin, bir kontrol molekülünün baglanmasina kiyasla belirlenmesiyle ölçülebilmektedir. Örnegin, spesifik baglanma, hedefe benzer bir kontrol molekülü, örnegin isaretlenmemis bir hedefin fazla miktari ile rekabet yoluyla belirlenebilmektedir. Bu durumda, isaretlenmis hedefin bir proba baglanmasi, isaretlenmemis hedef fazlasi tarafindan rekabetçi olarak inhibe edilirse, spesifik baglanma gösterilmis olur. Burada kullanildigi sekliyle belirli bir polipeptid veya belirli bir polipeptid hedefi üzerindeki.bir epitop için "spesifik baglanma" veya "spesifik olarak baglanir" veya "için spesifik" terimleri, örnegin, hedef için Kd degeri en az yaklasik 200 nM, alternatif olarak en az yaklasik 150 nM, alternatif olarak en az yaklasik 100 nM, alternatif olarak en az yaklasik 60 nM, alternatif olarak en az yaklasik 50 nM, alternatif olarak en az yaklasik 40 nM, alternatif olarak en az yaklasik 30 nM, alternatif olarak en az yaklasik 20 nM, alternatif olarak en az yaklasik 10 nM, alternatif olarak en az yaklasik.8 nM, alternatif olarak en az yaklasik 6 nM, alternatif olarak en az yaklasik 4 nM, alternatif olarak en az yaklasik 2 nM, alternatif olarak en az yaklasik 1 nM veya üzerinde olan bir molekül için kullanilabilmektedir. Bir uygulamada, "spesifik baglanma" terimi, bir molekülün, herhangi bir baska polipeptide veya polipeptid epitopuna büyük ölçüde baglanmadan, belirli bir polipeptide veya belirli bir polipeptid üzerindeki bir epitopa baglandigi baglanmayi ifade eder. (örnegin bir antikor) tek bir baglanma.bölgesi ve bunun.baglanma ortagi (örnegin bir antijen) arasindaki kovalent olmayan etkilesimlerin toplam gücünü ifade eder. Aksi belirtilmedigi sürece, burada kullanildigi sekliyle, "baglanma afinitesi", bir baglanma çiftinin (örnegin antikor ve antijen) taraflari arasindaki lzl etkilesimi yansitan intrinsik baglanma afinitesini ifade eder. Bir X molekülünün Y ortagi için afinitesi, genel olarak ayrisma sabiti ile (Kd) temsil edilebilmektedir. Örnegin, Kd degeri yaklasik 200 nM, 150 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM veya daha güçlüdür. Afinite, burada tarif edilenler de dahil olmak üzere, teknikte yaygin olarak bilinen yöntemlerle Ölçülebilmektedir. Düsük afiniteli antikorlar genellikle antijene yavas baglanir ve kolayca ayrismaya egilim gösterirken, yüksek afiniteli antikorlar ise genellikle antijene daha hizli baglanir ve daha uzun süre bagli kalma egilimi gösterirler. Baglanma afinitesini ölçmek için teknikte çesitli metotlar bilinmektedir ve bunlardan herhangi biri, mevcut bulusun amaçlari için kullanilabilir. Bir uygulamada, mevcut bulusa göre "Kd" veya "Kd degeri", ~lO yanit biriminde (RU) immobilize antijen CMS çipleri ile birlikte °C'de bir BIAcorem-ZOOO veya bir BIAcorem-EOOO (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) kullanilarak yapilan yüzey plazmon rezonans deneyleri kullanilarak ölçülür. Özetle, karboksimetillenmis dekstran biyosensör çipleri (CMS, BIAcore, Inc.), tedarikçinin talimatlarina uygun olarak N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimit hidroklorür (EDC) ve N-hidroksisüksinimit (NHS) ile aktiflestirilir. Yaklasik 10 yanit birimi (RU) kadar baglanmis protein elde etmek amaciyla antijen, lOmM sodyum asetat, pH 4.8 ile 5 pg/ml'ye (~O,2uM) seyreltilir ve ardindan 5 ul/dakikalik bir akis hizi ile enjeksiyon yapilir. Antijen enjeksiyonunun ardindan, lM etanolamin enjekte edilerek, tepkimeye girmemis olan gruplar bloke edilir. Kinetik ölçümler için, Fab'nin iki kat seri seyreltmeleri (Örnegin 0,78rm4ilat500rmß, yaklasik25 pl/dk'lik bir akis hizi ile 25°C'de % ile PBS'ye enjekte edilir. Birlesme hizlari (kmû ve ayrisma hizlari (küf), basit bir bire bir Langmuir baglanma modeli (BIACORE Degerlendirme Yazilimi versiyon 3.2) kullanilarak birlesme ve ayrisma sensogramlarinin es zamanli olarak ayarlanmasi yoluyla hesaplanir. Denge ayrisma sabiti (Kd) koff/kon orani biçiminde hesaplanir. Bkz., örnegin, Chen ve dig., J. Mol. Biol. plazmon rezonans testinde lO6 M"1 8'1 degerini asmasi halinde, ileri (yön) hiz degeri, bir karistirma küvetiyle akis durdurma ekipmanli bir spektrofotometre (Aviv Instruments) veya 8000 serisi bir SLM-Aminco spektrofotometresi (ThermoSpectroniC) gibi bir spektrometrede ölçüldügü üzere, artan antijen konsantrasyonu varliginda, PBS içinde, pH 7.2'de 20 nM anti-antijen antikorunun (Fab biçimi) 25°C sicaklikta fluoresan emisyon siddeti artisini veya azalmasini ölçen bir fluoresan söndürme teknigi ile belirlenebilir (uyarilma : 295 nm; emisyon = 340 nm, 16 nm bant-geçisi). Mevcut bulusa göre "ileri (yön) hizi" veya "birlesmenin hizi" veya "birlesme hizi" veya "kmßh ~10 tepki biriminde (RU) immobilize antijen CMS çipleriyle 25°C'de bir BIAcorem-ZOOO veya BlAcorem- kullanilarak yukarida tarif edilen ayni yüzey plazmon rezonans teknigiyle de belirlenebilmektedir. Özetle, karboksimetillenmis dekstran biyosensör çipleri (CMS, BIAcore, Inc.), tedarikçinin talimatlarina uygun olarak N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimit hidroklorür (EDC) ve N-hidroksisüksinimit (NHS) ile aktiflestirilir. Yaklasik 10 yanit birimi (RU) kadar baglanmis protein elde etmek amaciyla antijen, 10 mM sodyum asetat, pH 4.8 ile 5 ug/ml'ye (yaklasik seyreltilir ve ardindan Siil/dakikalijçbir*akis hizinda enjeksiyon yapilir. Antijen enjeksiyonunun ardindan, lM etanolamin enjekte edilerek, tepkimeye girmemis olan gruplar bloke edilir. Kinetik ölçümler için, Fab'nin iki kat seri seyreltmeleri (örnegin 0,78rw4ila.500rw®, yaklasik25 ul/dk'lik bir akis hizi ile 25°C'de % ile PBS'ye enjekte edilir. Birlesme hizlari (Km) ve ayrisma hizlari (koü)i basit bir bire bir Langmuir baglanma modeli (BIACORE Degerlendirme Yazilimi versiyon 3.2) kullanilarak birlesme ve ayrisma sensogramlarinin es zamanli olarak ayarlanmasi yoluyla hesaplanir. Denge ayrisma sabiti (Kd) koü/km orani biçiminde hesaplanir. Bkz., örnegin, Chen ve dig., J. Mol. Biol. yüzey plazmon rezonans testinde 106 M_1 5-1 degerini asmasi halinde, ileri (yön) hiz degeri tercihen, bir karistirma küvetiyle akis durdurma ekipmanli bir spektrofotometre (Aviv (ThermoSpectronic) gibi bir spektrometrede ölçüldügü üzere, artan antijen konsantrasyonu varliginda, PBS içinde, pH 7.2'de nM anti-antijen antikorunun (Fab biçimi) 25°C sicaklikta fluoresan emisyon siddeti artisini veya azalmasini ölçen bir fluoresan söndürme teknigi ile belirlenir (uyarilma = 295 nm; emisyon = 340 nm, 16 nm bant-geçisi). Bir antikor, fragman veya bunun türevi gibi mevcut bulusa ait bir polipeptid ile ilgili olarak kullanilan "biyolojik olarak aktif" ve "biyolojik aktivite" ve "biyolojik özellikler" ifadeleri, aksi belirtilmedigi sürece, bir biyolojik moleküle baglanma kabiliyetine sahip olma anlamina gelir. peptidleriribir FC domeni ile füzyonunu ifade eder. Bkz. 9 Aralik Bunlar, N-ucu, C-ucu, amino asit yan zincirleri veya bu bölgelerin birden fazlasina bagli bir veya daha fazla peptidi içerir. Peptikor teknolojisi, bir veya daha fazla ligandi veya reseptörleri, tümör barindiran peptidleri, membran nakledici peptidleri ve benzerlerini hedefleyen peptidleri içeren terapötik ajanlarin tasarlanmasini mümkün kilar. Peptikor teknolojisi, dogrusal ve disülfitle sinirlanmis peptidler, domeninin tek bir zinciri üzerindeki birden fazla peptid) dahil olmak üzere bu tür moleküllerin bir dizi tasariminda faydali oldugunu kanitlamistir. Bkz., örnegin, U.S. Pat. No. 6,660,843; 16 Ekim 2003 tarihinde yayinlanmis U.S. Pat. Basv. No. karsilik gelir); 18 Eylül 2003 tarihinde yayinlanmis U.S. Pat. tarihinde yayinlanmis WO 04/026329). baglanmis bir proteinin kullanilmasini ifade eder, burada protein, bir hedefinolekül içiribir baglanma yüzeyi saglamak için bir iskele olarak kullanilir. Protein genellikle, stafilokokal protein A veya lgG baglayici B domeni veya bunlardan türetilen Z proteini gibi dogal olarak olusan bir protein (bkz. Nilsson ya da bunun bir fragmani veya türevidir. Örnegin, afikorlar, hedeflenen› molekül(1er) için degismis baglanma› afinitesine sahip olanîiproteinleri varyantlarindan olusturulabilmektedir, burada bir Z proteininin bir segmenti, bir hedef nwlekülü baglayabilen varyantlardan olusan bir kütüphane olusturmak üzere rastgele mutajenez ile mutasyona ugratilmistir. Afikor örnekleri arasinda U.S. Pat. No. 6,534,628, Nord K ve dig, Prot 2):97-112. ortamindan ayrilmis ve/Veya geri kazanilmis bir heteromultimer veya kompleks anlamina gelir. Dogal ortamini kirletici bilesenler, antikorun tanilayici ya da terapötik kullanimlarina müdahale edecek olan malzemelerdir ve bunlar, enzimleri, hormonlari ve diger proteinli yackiproteinsiz çözüneninaddeleri içerebilir. Tercih edilen uygulamalarda, heteromultimer, (l) Lowry yöntemi ile belirlenen sekilde proteinin agirlikça N-terminal ya da dahili amino asit sekansinin en az 15 kalintisini elde etmeye yetecek kadar bir düzeye, ya da (3) Coomassie mavisi ya da tercihen gümüs boya kullanilarak indirgeyici ya da indirgeyici olmayan kosullar altinda SBS-PAGE ile homojen olana kadar saflastirilir. Mevcut bulusa ait heteromultimerler genellikle büyük ölçüde homojenlige saflastirilir. "Büyük ölçüde homojen", "büyük ölçüde homojen formu" ve "büyük ölçüde homojenlik" ifadeleri, ürünün, istenmeyen polipeptid kombinasyonlarindan (örnegin homomultimerler) kaynaklanan yan ürünlerden.büyük ölçüde yoksun oldugunu belirtmek için kullanilir. Saflik açisindan eksprese edilen, büyük ölçüde homojenlik, yan ürün miktarinin, agirlikça %10, %9, %8, %7, %6, %4, %3, %2 veya gelir. Bir uygulamada, yan ürün %S'in altindadir. karbonhidrat, bir lipit ve bunlarin kombinasyonlarini ifade eder. Bir uygulamada, biyolojik molekül dogada bulunur. Burada açiklanan çesitli antikorlari tarif etmek için kullanildiginda, "izole" ifadesi, eksprese edildigi bir hücre veya hücre kültüründe tanimlanan ve bu hücre veya hücre kültüründen ayrilan ve/Veya geri kazanilan bir antikor anlamina gelir. Dogal ortamini kirletici bilesenler tipik olarak, polipeptidin tanilayici ya da terapötik kullanimlarina müdahale edecek olan malzemelerdir ve bunlar, enzimleri, hormonlari ve diger proteinli ya da proteinsiz çözünen maddeleri içerebilmektedir. Tercih edilen uygulamalarda, antikor, (1) bir döner kap sekanslayici kullanilarakeniaz 15 adet.N-terminal'veya dahili amino asit sekansi kalintisi elde etmek üzere yeterli bir dereceye kadar veya (2) SBS-PAGE ile Coomassie mavisi veya tercihen gümüs boya kullanilarak indirgeyici olmayan veya indirgeyici kosullar altinda homojenlik elde edilene kadar saflastirilacaktir. Izole antikor, rekombinant hücreler içindeki in situ antikorlari içerir, çünkü polipeptid dogal ortaminin, en› az bir bileseni mevcut olmayacaktir. Bununla birlikte, normalde, izole polipeptid en az bir saflastirma asamasi ile hazirlanacaktir. Burada kullanilan "bagli/baglantili" veya "baglar/baglantilar" ile, birinci bir ve ikinci amino asit sekansi arasinda bir dogrudan peptit bagi baglantisi ya da birinci ve ikinci amino asit arasinda olan ve bunlara baglanan üçüncü bir amino asit sekansini içeren bir baglanti kastedilir. Örnegin, bir amino asit sekansinin C-terminal ucuna ve diger amino asit sekansinin N-terminal ucuna baglanan bir baglantilayi peptid. Burada kullanilan "baglantilayici" ile, iki veya daha fazla amino asit uzunlugundaki bir amino asit sekansi kastedilir. Baglantilayici, nötr polar veya polar olmayan amino asitlerden olusabilmektedir. Bir baglantilayici, örnegin, 2 ila 100 amino asit uzunlugunda, örnegin 2 ila 50 amino asit uzunlugunda, uzunlugundadir. Bir baglantilayici, örnegin, otomatik ayrilma veya enzimatik ya da kimyasal ayrilma ile "ayrilabilir" olabilmektedir. Amino asit sekanslarindaki ayrilma bölgeleri ve bu bölgelerde ayrilan enzimler ve kimyasallar, teknikte iyi bilinir ve ayrica burada tarif edilmistir. Burada kullanildigi sekliyle bir "baglayici", diger iki amino asit sekansini birlestiren bir amino asit baglantilayici anlamina gelir. Burada tarif edilen sekilde bir baglayici, bir immünoglobülin agir zincir degisken domeninin N-ucunu, bir immünoglobülin hafif zincir sabit alaninin C-terminaline baglayabilir. Özel uygulamalarda, bir baglayici, 15 ila 50 amino asit uzunlugu, örnegin, 20 ila 26 amino asit uzunlugu (örnegin Bir baglayici, örnegin, otomatik ayrilma veya teknikte standart olan yöntemler ve reaktifler kullanilarak enzimatik. ya da kimyasal ayrilma ile "ayrilabilir" olabilir. Belirli özel uygulamalarda, baglayici, Gly-Gly-Ser tekrarlarini içerir. Bir "baglantilayicinin" veya bir "baglayicinin" enzimatik ayrilmasi, örnegin, Lys-C, Asp-N, Arg-C, V8, Glu-C, kimotripsin, tripsin, pepsin, papain, trombin, Genenaz, Faktör Xa, TEV (tütün etch virüsü sistein proteazi), Enterokinaz, HRV C3 (insan rinovirüsü C3 proteazi), Kininojenaz gibi bir endopeptidazin ve bununla birlikte subtilizin benzeri proprotein konvertazlari (örnegin Furin (PCl), PC2 veya PCS) veya N-arjinin dibazik konvertazin kullanimini içerebilir. Kimyasal ayrilma, örnegin, hidroksilamin, N-klorosüksinimid, N-bromosüksinimid veya siyanojen bromürün kullanimini içerebilir. Burada kullanildigi sekliyle bir "Lys-C endopeptidaz ayrilma bölgesi", bir amino asit sekansinda, Lys-C endopeptidaz ile C-terminal tarafinda ayrilabilen bir Lizin kalintisidir. Lys-C endopeptidaz, bir Lizin kalintisinin C-terminal tarafinda ayrilir. Belirli uygulamalarda, yarim antikor ayrica, Lys-C endopeptidaz ile baglayicinin ayrilmasi uzerine yarim antikorun veya birlestirilmis bispesifik antikorun yapisini korumak amaciyla endojen Lys-C endopeptidaz ayrilma bölgesini çikarmak üzere mentese bölgesinde bir K222A mutasyonu içerir. uzanmasi olarak tanimlanir (Burton, Molec. Immunol.22:l6l-206 (1985)). Diger IgG izotiplerinin mentese bölgeleri, ayni konumlarda agir zincirler arasi S-S baglari olusturan birinci ve sonuncu sistein kalintilarinin yerlestirilmesi araciligiyla Bir Fc bölgesinin "alt mentese bölgesi" normal olarak, kalintilarin hemen C-terminalden mentese bölgesine, baska bir ifadeyle Fc bölgesinin 233 ila 239 arasindaki kalintilarinin uzanmasi olarak tanimlanir. Mevcut bulusun öncesinde, FcyR baglanmasi genellikle, bir IgG› Fc bölgesinin alt mentese bölgesinde amino asit kalintilarina atfedilmistir. Bir insan IgG FC bölgesinin "CH2 domeni" genellikle, IgG'nin yaklasik 231 ila yaklasik 340 kalintisi arasinda uzanir. CH2 domeni, baska bir domenle yakindan eslesmemesi bakimindan benzersizdir. Daha dogrusu, iki N-baglantili dalli karbonhidrat zincirleri, bütün bir dogal IgG leekülünün iki CH2 domeni arasinda.yer alir. Karbonhidratin, domen-domen.eslemesi için bir ornatim saglayabildigi ve CH2 domeninin stabilize edilmesine yardimci olabilecegi düsünülmüstür. Burton, Molec. CH2 domenine (baska bir ifadeyle bir IgG'nin yaklasik amino asit kalintisi 341'den yaklasik amino asit kalintisi 447'ye) uzanmasini içerir. Buradaki "FC bölgesi" terimi, natif sekans Fc bölgeleri ve varyant FC bölgeleri de dahil olmak üzere, bir immünoglobülin agir zincirinin bir C-terminal bölgesini tanimlamak için kullanilir. Bir immünoglobülin agir zincirinin FC bölgesinin sinirlari degisebilmesine ragmen insan IgG agir zincir FC bölgesi genellikle Cy5226 konumundaki bir amino asit kalintisindan, veya Pro230'dan, karboksil ucuna uzanmasi olarak tanimlanir. FC bölgesinin C-terminal lizini (AB numaralandirma sistemine göre kalinti 447), örnegin, antikorun üretimi veya saflastirilmasi esnasinda veya antikorun bir agir zincirini kodlayan nükleik asidin rekombinant sekilde islenmesi ile çikartilabilir. Buna uygun olarak, bütün antikorlarin bir bilesimi, tüm K447 kalintilari çikarilmis antikor popülasyonlarini, K447 kalintisi çikarilmamis antikor popülasyonlarini ve K447 kalintisi ile veya olmaksizin antikorlarin bir karisimina sahip antikor popülasyonlari içerebilir. Bir "fonksiyonel FC bölgesi", bir natif sekans FC bölgesinin bir fonksiyonlari" Clg baglanmasini; CDC; FC reseptör baglanmasini; ADCC; fagositoz; hücre yüzey reseptörlerinin (örnegin B hücresi reseptörü; BCR) asagi regülasyonunu içerir. Bu gibi efektör fonksiyonlari genel olarak FC bölgesinin bir baglayici domen (Örnegin bir antikor degisken domeni) ile birlestirilmesini gerektirir ve, örnegin, buradaki tanimlarda açiklandigi sekilde çesitli testler kullanilarak degerlendirilebilmektedir. Bir "natif sekans FC bölgesi", dogada bulunan bir FC bölgesinin amino asit sekansina özdes olan bir amino asit sekansini içerir. Natif sekans insan FC bölgeleri, natif bir sekans insan IgGl FC bölgesini (A olmayan ve A allotipleri); natif sekans insan IgGZ FC bölgesini; natif sekans insan IgG3 FC bölgesini; ve natif sekans insan IgG4 FC bölgesi ile birlikte bunlarin dogal olarak olusan varyantlarini içerir. Bir "varyant FC bölgesi", en az bir amino asit tadilati, tercihen bir veya.daha fazla.amino asit ikame(ler)si'vasitasiyla.bir dogal dizi FC bölgesininkinden farkli olan bir amino asit dizisini içermektedir. Tercihen, varyant Fc bölgesi, bir natif sekans Fc bölgesine veya bir ana polipeptidin Fc bölgesine kiyasla en az bir amino asit.ornatimina, örneginküitnatif sekansEkibölgesinde veya ana polipeptidin Fc bölgesinde yaklasik bir ila on amino asit ornatimina ve tercihen yaklasik bir ila yaklasik.bes amino asit ornatimina sahiptir. Buradaki varyant Fc bölgesi tercihen, natif bir sekans Fc bölgesi ve/veya bir ana polipeptidin bir PC bölgesi ile en az yaklasik %80 homolojiye ve bunlarla en çok tercihen en az yaklasik %90 homolojiye, bunlarla daha tercihen en az yaklasik %95 homolojiye sahip olacaktir. Burada kullanildigi sekliyle "Fc kompleksi", bir FC bölgesinin birbiriyle etkilesime giren iki CH2 domenini ve/Veya bir PC bölgesinin birbiriyle etkilesime giren iki CH3 domenini ifade etmekte olup burada CH2 domenleri ve/veya CH3 domenleri peptid baglari olmayan baglar ve veya kuvvetler (örnegin van der Waals, hidrofobik, hidrofilik kuvvetler) araciligiyla etkilesir. Burada kullanildigi sekliyle "Fc bileseni", bir PC bölgesinin bir mentese bölgesini, bir CH2 domenini veya bir CH3 domenini ifade eder. Burada kullanildigi sekliyle "Fc CH bileseni "veya" FcCH ", bir PC bölgesinin bir CH2 domenini, bir CH3 domenini veya CH2 ve CH3 domenlerini içeren bir polipeptidi ifade eder. Antikor "efektör fonksiyonlari", bir antikorun Fc bölgesine (bir natif sekans Fc bölgesi ya da amino asit sekansi varyant Fc bölgesi) atfedilebilen biyolojik aktiviteleri ifade eder ve antikor izotipine göre degisir. Antikor efektör fonksiyonlarinin örnekleri arasinda: Clq baglanmasi ve tamamlayiciya bagli sitotoksisite; Fc reseptör` baglanmasi; antikora.bagimli hücre aracili sitotoksisite (ADCC): fagositoz; hücre yüzeyi reseptörlerinin (örneginlâhücresi reseptörü) asagi regülasyonu; ve B hücresi aktivasyonu bulunur. Mevcut bulusta, "indirgeyici bir kosul", tepkimenin redoks potansiyelinin negatif (-) oldugu anlamina gelen bir tepkimedeki (örnegin bir birlesme karisimindaki) redoks potansiyeline dayali olarak tanimlanir. Indirgeyici kosullari altindaki tepkimenin redoks potansiyeli tercihen yaklasik.-5O ila -600 mV, -300 mV arasindadir, daha tercihen yaklasik -300 ila -500 mV arasindadir, en çok tercihen ise yaklasik -400mV'dir. Istenen indirgeyici bir kosul hazirlamak için uygun herhangi.bir yöntem kullanilabilmektedir. Örnegin, istenen indirgeyici bir kosul, (bulusa ait bir birlesme karisimi gibi) tepkimeye bir indirgeyici/indirgeyici ajan ilave edilmesiyle hazirlanabilmektedir. Uygun indirgeyiciler arasinda sinirlama olmaksizin› ditiyotreitol (DTT), tris (2-karboksietil)fosfin (TCEP), tioglikolik asit, askorbik asit, tiyol asetik asit, glutatyon (GSH), Beta-MerkaptoEtilAmin, sistein/sistin, GSH/glutatyon disülfit (GSSG), sisteamin/sistamin, glisilsistein ve beta-merkaptoetanol, tercihen GSH bulunur. Belirli özel uygulamalarda, indirgeyici, sinirlama olmaksizin GSH, Beta-MerkaptoEtilAmin, sistein/sistin, GSH/GSSG, sisteamin/sistamin, glisilsistein ve beta-merkaptoetanol, tercihen GSH dahil olmak üzere zayif bir indirgeyicidir. Tercih edilen belirli uygulamalarda, indirgeyici bir GSH'dir. Bir tepkimede istenen indirgeyici kosulu elde etmek üzere uygun konsantrasyonlarda ve uygun deneysel kosullar altunda uygun indirgeyicileri seçmek teknikte siradan uzmanliga sahip bir kisinin kabiliyeti dahilindedir. Örnegin, 20°C'de lO bispesifik antikor protein konsantrasyonuna sahip bir çözeltide lOnWlL-indirgenmis glutatyon, yaklasik -400mV'lik bir baslangiç redoks potansiyeline neden olacaktir. Teknikte uzman bir kisi, belirli bir tepkimede redoks potansiyelini ölçmek için uygun herhangi bir metodu kullanabilmektedir. Tepkimenin indirgeyici kosulu, teknikte bilinen herhangi bir uygun yöntem kullanilarak tahmin edilebilmekte ve ölçülebilmektedir. Örnegin, indirgeyici kosul, bir rezazürin indikatörü (indirgeyici kosullarda maviden renksize renksizlesme) kullanilarak ölçülebilmektedir. Daha kesin bir ölçüm için, bir redoks potansiyel metresi (örnegin BROADLEY JAMES® tarafindan yapilan ORP Elektrot) kullanilabilmektedir. Alternatif olarak, indirgeyici bir kosul, çözünmüs gazlarin, özellikle çözünmüs oksijenin, yaklasik 10 mmHg veya daha düsük, tercihen yaklasik SinmHg veya daha düsük, daha tercihen yaklasik 3 mmHg veya daha düsük indirgenmis basinç altinda, yaklasik 1 ila 60 dakika, tercihen yaklasik 5 ila 40 dakika boyunca çikarilmasi ile hazirlanabilmektedir. Mevcut bulusta, indirgeyici kosullarin, birlesme asamasi boyunca (yariniantikorlar gibi) birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidlerin karistirilmasindan hemen sonra muhafaza edilmesi tercih edilir. Belirli uygulamalarda, tepkime veya birlesme karisimi, tepkime süresinin tercihen yaklasik %50 veya daha fazlasi, daha tercihen yaklasik %70 veya daha fazlasi, daha da tercihen yaklasik %90 veya daha fazlasi boyunca indirgeyici kosullarda muhafaza edilir. Tepkime ortaminin redoks-potansiyelinin, tepkime süresinin yaklasik %50 veya daha fazlasi, daha tercihen yaklasik %70 veya daha fazlasi, daha da tercihen yaklasik %90 veya daha fazlasi boyunca yaklasik -200 ila -600 mV arasinda, daha tercihen -300 ila -500 mV arasinda, en çok tercihen ise yaklasik -400mV'de muhafaza edilmesi özellikle tercih edilir. Belirli özel uygulamalarda, indirgeyici kosul, zayif bir indirgeyici kosuldur. Burada kullanildigi sekliyle "zayif indirgeyici" veya "zayif indirgeyici kosul" terimi, 25°C'de negatif bir oksidasyon potansiyeline sahip indirgeyici ajan ile hazirlanan bir indirgeyici ajani veya indirgeyici bir kosulu ifade eder. Indirgeyicinin oksidasyon potansiyeli, pH degeri 7 ila 9 arasinda oldugunda ve sicaklik 15°C ila 39°C arasinda tercihen yaklasik -300 ila -500 mV arasinda, en çok tercihen ise -400mV'dir. Teknikte uzman bir kisi, istenen bir indirgeyici kosulu hazirlamak için uygun indirgeyicileri seçebilecektir. Teknikte uzman bir arastirmaci, güçlü bir indirgeyicinin, baska bir ifadeyle ayni konsantrasyon, pH ve sicaklikta yukarida belirtilen indirgeyicilerden daha fazla negatif bir oksidasyon potansiyeline sahip bir indirgeyicinin, daha düsük bir konsantrasyonda kullanilabildigini fark edecektir. Tercih edilen bir uygulamada, proteinler, yukarida belirtilen kosullar altinda inkübe edildiginde indirgeyici varliginda disülfit baglari olusturabilecektir. Zayif bir indirgeyici örnekleri arasinda sinirlama olmaksizin glutatyon, Beta-MerkaptoEtilAmin, sistin/sistein, GSH/GSSG, sisteamin/sistamin, glisilsistein ve beta-merkaptoetanol bulunur. Belirli uygulamalarda, GSH:Antikorun 200X'lik molar oranina benzer bir oksidasyon potansiyeli, diger indirgeyicilerin kullanildigi verimli birlesmenin beklenebilecegi zayif bir indirgeyici kosul için bir referans Bir "birlesme karisimi", birinci bir mentese içeren polipeptid, ikinci bir mentese içeren polipeptid içeren bir çözeltidir. Belirli uygulamalarda, birlesme karisimi, indirgeyici bir kosulda bulunur. Bazi uygulamalarda, birlesme karisimi, zayif bir indirgeyici kosulda bulunur. Diger belirli uygulamalarda, birlesme karisimi, zayif bir indirgeyici de içerir. Birlesme karisiminin oksidasyon potansiyeli, pH degeri 7 ila 9 arasinda oldugunda ve sicaklik 15°C ila 39°C arasinda oldugunda, -50 ila mV arasinda, en çok tercihen ise -400mV'dir. Örneklerde belirtilen piyasada mevcut reaktifler, aksi belirtilmedigi sürece, üreticinin talimatlarina uygun olarak kullanilmistir. Asagidaki örneklerde ve mevcut tarifname boyunca, ATCC erisim numaralari araciligiyla tanimlanan bu hücrelerin kaynagi, American.Type Culture Collection, Manassas, VA'dir. Aksi belirtilmedigi sürece, mevcut bulusta standart rekombinant DNA teknolojisi prosedürleri, örnegin yukarida ve asagidaki ders kitaplarinda tarif edilen prosedürler kullanilmistir: Sambrook ve dig., yukarida; Ausubel ve dig., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and.Wiley Interscience, NY, 1989); Innis ve dig., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan ve dig., Current Protocols in Immunology, 1991. Mevcut tarifname ve istemlerde, "içerme" ifadesi ve bunun ya da tam sayi gruplarinin dahil edildigini belirttigini, ancak herhangi bir baska tam sayi ya da tam sayi grubunun dahil edilmedigini belirtmedigi anlasilacaktir. Tipik olarak, burada tarif edilen heteromultimerik proteinler bir antikor Fc bölgesinin önemli bir kismini içerecektir. Ancak, diger yönlerde, agir zincir CHl, CHZ, ve/veya CH3 domenlerinin yalnizca bir kismini içerir. Heteromultimerizasyon Domenleri Heteromultimerik proteinler bir heteromultimerizasyon domeni içerir. Büyük ölçüde homojen bir heterodimerik molekül popülasyonuineydana getirmek için, heterodimerizasyon domeninin homodimerler üzerinde heterodimerlerin olusturulmasina yönelik güçlü bir öncelige sahip Olmasi gerekir. Burada örneklenen heteromultimerik proteinler, heteromultimerizasyonu kolaylastirmak için delikler içine topuzlar teknolojisine kullanmalarina ragmen teknikte uzman kisiler mevcut bulusta yararli olan diger heteromultimerizasyon domenlerini de takdir edecektir. Delikler içine Topuzlar Delikler içine topuzlarin multispesifik antikorlarin üretilmesine yönelik bir yönteniolarak kullanilmasi teknikte iyi bilinir. Bkz. 24 Mart 1998 tarihinde kabul edilerive Genentech'in ve 16 Temmuz 2009 tarihinde yayinlanan ve Novo Nordisk A/S'nin Kontermann (2005) Acta Pharacol. Sin., 26:1-9. Burada kisa bir irdeleme sunulur. Bir "çikinti", birinci bir polipeptidin ara yüzeyinden disari çikan ve bu nedenle heteromultimeri stabilize etmek ve böylece, örnegin, homomultimer olusumu üzerinde heteromultimer olusumunu kolaylastirmak amaciyla bitisik ara yüzeydeki (baska bir ifadeyle ikinci bir polipeptidin ara yüzeyindeki) karsilayici bir oyukta konumlandirilabilen eneazküiramino asit yan zincirini ifade eder. Çikinti, orijinal ara yüzeyde mevcut olabilir veya sentetik olarak (örnegin ara yüzeyi kodlayan nükleik asidin degistirilmesi ile) dahil edilebilir. Normal olarak, birinci polipeptidin ara yüzeyini kodlayan nükleik asit, çikintiyi kodlamak için degistirilir. Bunu gerçeklestirmek için, birinci polipeptidin ara yüzeyinde en az bir "orijinal" amino asit kalintisini kodlayan nükleik asit, orijinal amino asit kalintisindan daha büyük bir yan zincir hacmine sahip olan en az bir "ithal" amino asit kalintisini kodlayan nükleik asit ile yer degistirilir. Takdir edilecegi üzere, birden fazla orijinal ve karsilik gelen ithal kalinti olabilmektedirx Yer degistirilen orijinal kalintilarin sayisi için üst sinir, birinci polipeptidin ara yüzeyindeki toplam kalinti sayisidir. Çesitli amino kalintilarinin yan zincir hacimleri, asagidaki tabloda gösterilmistir. TABLO l Amino Asit Kalintilarinin Özellikleri n . Erisilebilir Tek Harfli KUTLEa HACIMb Amino Asit v` Yüzey AlaniC Kisaltma (dalton) (Angstromû (Angstromâ Glisin (Gly) G 57,06 60,1 75 a Molekül agirligi amino asit eksi su. Handbook of Chemistry and Physics, 43. baski, Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961 adli belgeden elde edilen degerler. edilen degerler. Erisilebilir yüzey alani, bu referansa ait Sekiller 6-20'de tanimlanmistir. Bir çikinti olusumu için tercih edilen ithal kalintilari genellikle dogal olarak olusan amino asit kalintilaridir ve tercihen arjinin (R), fenilalanin (F), tirozin (Y) ve triptofan (W) arasindan seçilir. Triptofan ve tirozin en çok tercih edilenlerdir. Bir uygulamada, alanin, asparajin, aspartik asit, glisin, serin, treonin veya valin gibi çikinti olusumu için olan orijinal kalinti, küçük. bir yan zincir hacmine sahiptir. Çikintinin, olusturulmasina için olan. CH3 domenindeki örnek niteligindeki amino asit ornatimlari sinirlama olmaksizin T366W ornatimini içerir. Bir "oyuk", ikinci bir polipeptidin ara yüzeyinden girinti olusturan ve bu nedenle birinci bir polipeptidin bitisik ara yüzeyi üzerinde karsilik gelen bir çikintiyi barindiran en az bir amino asit yan zincirini ifade eder. Oyuk, orijinal ara yüzeydeinevcut olabilir veya sentetik olarak (örnegin ara yüzeyi kodlayan nükleik asidin degistirilmesi ile) dahil edilebilir. Normal olarak, ikinci.polipeptidin ara yüzeyini kodlayan.nük1eik asit, oyugu kodlamak için degistirilir. Bunu gerçeklestirmek için, ikinci polipeptidin ara yüzeyinde en az bir "orijinal" amino asit kalintisini kodlayan nükleik asit, orijinal amino asit kalintisindan daha küçük bir yan zincir hacmine sahip olan en az bir "ithal" amino asit kalintisini kodlayan DNA ile yer degistirilir. Takdir edilecegi üzere, birden fazla orijinal ve karsilik gelen ithal kalinti olabilmektedir. Yer degistirilen orijinal kalintilarin sayisi için üst sinir, ikinci polipeptidin ara yüzeyindeki toplam kalinti sayisidir. Çesitli amino kalintilarinin yan zincir` hacimleri, yukaridaki Tablo 1'de gösterilmistir. Bir oyuk olusumu için tercih edilen ithal kalintilari genellikle dogal olarak olusan amino asit kalintilaridir ve tercihen alanin (A), serin (S), treonin (T) ve valin (V) arasindan seçilir. Alanin veya treonin en çok tercih edilenlerdir. Bir uygulamada, tirozin, arjinin, fenilalanin veya triptofan gibi oyuk olusumu için olan orijinal kalinti, büyük bir yan zincir hacmine sahiptir. Oyugun olusturulmasina için olan CH3 domenindeki örnek niteligindeki amino asit Y407V ornatimlarini içerir. Belirli uygulamalarda, topuz yarim antikoru T366W ornatimini ve delik yarim antikoru T366S/L368A/Y407V ornatimlarini içerir. Bir "orijinal" amino asit kalintisi, orijinal kalintidan daha küçük veya daha büyük bir yan zincir hacmine sahip olabilen bir asit kalintisi, dogal olarak olusan veya dogal olarak olusmayan bir amino asit kalintisi olabilmekte olup ilk tarafindan kodlanan ve yukaridaki Tablo 1'de listelenen kalintilardir. "Dogal olarak olusmayan" amino asit kalintisi ile, genetik kod tarafindan kodlanmayan, ancak polipeptid zincirindeki bitisik amino asit kalintisini/kalintilarini kovalent olarak baglayabilen bir kalinti kastedilir. Dogal olarak olusmayan amino asit kalintilarinin örnekleri arasinda norlösin, ornitin, norvalin, homoserin ve, örnegin, Ellman ve edilenler gibi diger amino asit kalintisi analoglari bulunur. Bu tür dogal olarak olusmayan amino asit kalintilarini meydana ve Ellman ve digx prosedürleri kullanilabilmektedirn Özetle, bu, bir baskilayici tRNA'nin dogal olarak olusmayan bir amino asit kalintisi ile kimyasal olarak aktive edilmesini, ardindan RNA'nin in vitrO'transkripsiyorive translasyonunu içerir. Mevcut bulusa ait yöntem, en az bir orijinal amino asit kalintisinin yer degistirmesini içerir, ancak birden fazla orijinal kalinti da yer degistirilebilmektedir. Normal olarak, birinci veya ikinci polipeptidin ara yüzeyindeki toplam kalintilardan daha fazlasi, yer, degistirilen orijinal amino asit kalintilarini içermeyecektir. Tipik olarak, yer degistirme için olan orijinal kaintilar "gömülüdür"- "Gömülü" ile, kalintinin esas olarak çözücüye erisemeyecegi kastedilir. Genel olarak, ithal kalinti, disülfit baglarinin muhtemel oksidasyonunu veya yanlis eslesmesini Önlemek için sistein degildir Çikinti, oyukta "konumlandirilabilirdir", bu da, birinci bir polipeptidin ve ikinci polipeptidin sirasiyla ara yüzeyinde çikinti ve oyugun uzamsal konumunun ve çikinti ve oyugun boyutlarinin, birinci ve ikinci polipeptidlerin ara yüzeyde normal birlesmesini önemli ölçüde bozmadan çikintinin oyugun içine yerlestirilebilecegi sekilde oldugu anlamina gelir. Tyr, Phe ve Trp gibi çikintilar tipik olarak ara yüzeyin ekseninden dik olarak uzanmadigindan ve tercih edilen konformasyonlara sahip olmadiklarindan, bir çikintinin karsilik gelen bir oyuk ile hizalanmasi, X-isini kristalografisi veya nükleer manyetik rezonans (NMR) ile elde edilen gibi üç boyutlu.bir yapiya dayanan çikinti/oyuk çiftinin modellenmesine dayanir. Bu, teknikte yaygin olarak kabul edilmis teknikler kullanilarak gerçeklestirilebilmektedir. kodlamak için "degistirilebilen" (baska bir ifadeyle genetik olarak islenmis veya mutasyona ugratilmis) ilgili bir polipeptidi kodlayan nükleik asit kastedilir. Orijinal veya baslangiç nükleik asit, dogal olarak olusan bir nükleik asit olabilir veya önceden degisime tabi tutulmus bir nükleik asit (Örnegin hümanize edilmis bir antikor fragmani) içerebilir. Nükleik asidi "degistirme" ile, orijinal nükleik asidin, ilgili bir amino asit kalintisini kodlayan en az bir kodonun eklenmesi, silinmesi veya yerinin degistirilmesi yoluyla mutasyona ugradigi kastedilir. Normal olarak, orijinal bir kalintiyi kodlayan bir kodon, ithal bir kalintiyi kodlayan bir kodon ile yer degistirilir. Bir DNA'yi bu sekilde genetik.olarak.modifiye etmeye yönelik teknikler, Mutagenesis: a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991) adli belgede incelenmistir ve bu teknikler, Örnegin, alan-hedefli mutajenez, kaset Hmtajenezi ve polimeraz zincir tepkimesi (PCR) mutajenezini içerir. Bir orijinal/sablon nükleik asidi mutasyona ugratarak orijinal/sablon nükleik asit ile kodlanan bir orijinal/sablon polipeptidi buna.bagli olarak degistirilir. Çikinti veya oyuk, birinci bir veya ikinci polipeptidin ara yüzeyine sentetik yollarla, örnegin rekombinant teknikler, in vitro peptid sentezi, daha önce tarif edilmis olan dogal olarak olusmayan amino asit kalintilarinin dahil edilmesi için kullanilan teknikler ile, peptidlerin enzimatik veya kimyasal eslesmesi veya bu tekniklerin bazi kombinasyonlari ile "dahil edilebilmektedir". Buna uygun olarak, "dahil edilen" çikinti veya oyuk, "dogal olarak olusmamistir" veya "natif degildir", bu da dogada ya da orijinal polipeptidde (örnegin hümanize edilmis bir nmnoklonal antikorda) mevcut olmadigi anlamina Genel olarak, çikintiyi olusturmaya yönelik olan ithal amino asit kalintisi nispeten az sayida "rotamere" sahiptir (örnegin yaklasik 3-6). Bir "rotamer", bir amino asit yan zincirinin enerjik olarak uygun bir konformasyonudur. Çesitli amino asit kalintilarinin rotamer sayisi, Ponders ve Richards, J. MOl. Mevcut bulusa ait bir heteromultimerik proteinin (örnegin bir bispesifik antikor) rekombinant üretimi için, bunu kodlayan nükleik asit izole edilir ve daha fazla klonlama (DNA'nin amplifikasyonu) veya ekspresyonu için kopyalanabilir bir vektör içine yerlestirilir. Antikoru kodlayan DNA kolaylikla izole edilir ve konvansiyonel prosedürler kullanilarak (Örnegin antikorun agir ve hafif Zincirlerini kodlayan genlere spesifik olarak baglanabilen oligonükleotit problar kullanilarak) sekanslanir. Birçok vektör mevcuttur. Vektör seçimi kismen, kullanilacak konak hücreye baglidir. Genellikle, tercih edilen konak hücreler, prokaryotik ya da ökaryotik kökenlidir (genellikle memelidir, fakat ayni zamanda mantarlar (Örnegin maya), böcek, bitki ve diger çok hücreli organizma kaynakli çekirdekli hücreleri de içerir). Takdir edilecegi üzere, IgG, bir izotipin sabit bölgeleri bu amaçla kullanilabilmekte ve bu tür sabit bölgeler herhangi bir insan ya da hayvan türünden elde edilebilmektedir. Belirli uygulamalarda, sabit bölge, lgG, özellikle IgGl, IgG2 veya IgG4 kaynaklidir. Bir konak› hücre, bir heterodimerizasyon domeni içeren bir mentese içeren polipeptidi eksprese edecek sekilde islenmekte olup burada konak hücre, ikinci bir heterodimerizasyon domeni içeren bir mentese içeren polipeptidi eksprese etmez. a. Prokaryotik konak hücreleri kullanarak heteromultimerik protein üretimi: 1. VEktör yapilandirmasi Mevcut bulusa ait heteromultimerik proteinlerin (örnegin bir antikorun) polipeptid bilesenlerini kodlayan polinükleotid sekanslari, standart rekombinant teknikleri kullanilarak elde edilebilmektedir. Istenen polinükleotid sekanslari, örnegin, hibridom hücreleri gibi antikor üreten hücrelerden izole edilebilir ve sekanslanabilir. Alternatif olarak, polinükleotidler, nükleotid sentezleyici ya da PCR teknikleri kullanilarak sentezlenebilmektedir. Elde edildikten sonra polipeptidleri kodlayan sekanslar, prokaryotik konaklarda heterolog polinükleotidleri kopyalayabilen ve eksprese edebilen bir rekombinant vektörün içine yerlestirilir. Teknikte mevcut olanxmebilinenbirçokvektörnßvcutbulusunamacinauygunolarak kullanilabilmektedir. Uygun bir vektörün seçimi temel olarak, vektörün içine yerlestirilecek olan nükleik asitlerin boyutuna ve vektörle dönüstürülecek olan belirli konak hücreye bagli olacaktir. Her bir vektör, fonksiyonuna (heterolog polinükleotidin amplifikasyonu veya ekspresyonu ya da her ikisi birden) ve içinde bulundugu belirli konak hücreyle uyumluluguna bagli olarak çesitli bilesenler içerir. Vektör bilesenleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, genellikle: bir replikasyon kökeni, bir seçim isaretçi geni, bir promotör, bir ribozom baglanma bölgesi (RBS), bir sinyal sekansi, heterolog nükleik asit eki (inserti) ve bir transkripsiyon sonlandirma sekansi Genellikle, konak hücreyle uyumlu türlerden türetilen replikon ve kontrol sekanslari içeren plazmit vektörler, bu konaklarla baglantili olarak kullanilir. Vektör genellikle bir replikasyon bölgesi tasir ve ayni zamanda dönüstürülen hücrelerde fenotipik seçinisaglama özelligine sahip olan isaretleme sekanslari tasir. Örnegin, E. coli tipik olarak, E. coli türünden türetilen bir plazmit olan pBR322 kullanilarak dönüstürülür. pBR322, ampisilin (Amp) ve tetrasiklin (Tet) direnci kodlayan genler içerir ve böylece dönüstürülen hücrelerin tanimlanmasi için kolay araçlar saglar. pBR322, bunun türevleri ya da diger mikrobiyal plazmitler ya da bakteriyofaj da yine endojenöz proteinlerin ekspresyonu için mikrobiyal organizma tarafindan kullanilabilecek olan promotörleri içerebilir ya da bunlari içerecek sekilde modifiye edilebilir. Belirli antikorlarin ekspresyonu için kullanilan pBR322 türevlerinin Örnekleri, Carter ve dig., U.S. Patent. No. 5,648,237 sayili belgede Ayrica, konak mikroorganizma ile uyumlu replikon ve kontrol sekanslari içeren, faj vektörleri, bu konaklarla. baglantili olarak dönüstürücü vektörler biçiminde kullanilabilmektedir. Örnegin, AGEM.TM.-ll gibi bir bakteriyofaj, E. coli LE392 gibi duyarli konak hücrelerin dönüstürülmesinde kullanilabilecek olan bir rekombinant vektörün yapiminda kullanilabilir. Mevcut bulusa.ait ekspresyon vektörü, polipeptid.bilesenlerinin her birini kodlayan iki ya da daha fazla promotör-sistron çifti içerebilir. Bir promotör, ekspresyonunu modüle eden bir sistronun öncesinde (5') bulunan, translasyona ugramamis düzenleyici bir sekanstir. Prokaryotik promotörler tipik olarak uyarilabilir ve konstitütif siniflar olmak üzere iki sinifa ayrilir. Indüklenebilir bir promotör, kültür kosullarindaki degisimlere, örnegin bir besinin varligina veya yokluguna ya da sicakliktaki bir degisime yanit olarak kontrolü altindaki sistronun transkripsiyon seviyelerinin arttirilmasini baslatan bir promotördür. Çesitli potansiyel konak hücreler tarafindan taninan Çok sayida promotör iyi bilinir. Seçilen promotör, örnegin, hafif ya daiagir zinciri kodlayan sistron DNA'sina, kisitlama enzind parçalamasi araciligiyla kaynak DNA'dan promotörün Çikartilmasi ve izole promotör sekansinin bulusa ait vektörün içine yerlestirilmesi ile uygulanabilir sekilde baglanabilmektedir. Hem natif promotör sekansi hem. de birçok heterolog promotör, hedef genlerin amplifikasyonunu ve/Veya ekspresyonunu yönlendirmek için kullanilabilir. Bazi uygulamalarda, natif hedef polipeptid promotörüne kiyasla genellikle daha fazla transkripsiyona ve daha yüksek verimli eksprese edilmis hedef gene olanak tanimalarindan dolayi heterolog promotörler kullanilir. Prokaryotik konaklarla birlikte kullanima uygun promotörler arasinda PhoA promotör, ß-galaktamaz ve laktoz promotör sistemleri, bir triptofan (trp) promotör sistemi ve tac ya da trc promotörü gibi hibrit promotörler bulunur. Ancak, bakterilerde fonksiyonel olan diger promotörler de (örnegin diger` bilinen. bakteriyel ya da faj promotörler) uygundur. Bunlarin nükleotid sekanslari yayinlanmis olup böylece teknikte uzman bir kisinin bunlari, herhangi bir gerekli kisitlama bölgesini desteklemek için baglantilayicilar ya da adaptörler kullanarak heteromultimerik proteinin genlerini, örnegin hedef hafif ve agir zincirleri, kodlayan sistronlara uygulanabilir sekilde baglayabilmesine olanak taninir (Siebenlist ve dig., (1980) Cell 20: 269). Mevcut bulusun bir yönünde, rekombinant vektördeki her bir sistron, eksprese edilen polipeptidlerin bir membran üzerinden translokasyonunu yönlendiren bir salgilama sinyal sekans bileseni içerir. Genellikle, bu sinyal sekansi vektörün bir bileseni olabilir ya da vektör içine yerlestirilen hedef polipeptid DNA'nin bir parçasi olabilir. Mevcut bulusun amacina uygun olarak seçilen sinyal sekansi, konak hücre tarafindan taninan ve islenen (baska bir ifadeyle, bir sinyal peptidaz ile ayrilan) bir sinyal sekansi olmalidir. Heterolog polipeptidlere natif olan sinyal sekanslarini tanimayan ve islemeyen prokaryotik konak hücrelerde, sinyal sekansi, örnegin alkalin fosfataz, penisilinaz, Ipp ya da isiya dayanikli enterotoksin içinden seçilen bir prokaryotik sinyal sekansi ile ornatilir. Mevcut bulusun bir uygulamasinda, ekspresyon sisteminin her bir sistronunda kullanilan sinyal sekanslari, STII sinyal sekanslari ya da bunlarin varyantlaridir. Baska bir yönde, mevcut.bulusa göre immünoglobülinlerin üretimi, konak hücrenin sitoplazmasinda meydana gelebilir ve bu nedenle her bir sistronun içinde salgilama sinyal sekanslarinin bulunmasini gerektirmez. Bu bakimdan, immünoglobülin hafif ve agir zincirleri, sitoplazma içinde fonksiyonel immünoglobülinleri olusturmak üzere eksprese edilir, katlanir ve birlestirilir. Belirli konak suslar (örnegin E. coli trXB_ suslari), disülfit bagi olusumu için avantajli sitoplazma kosullari saglar ve böylece eksprese edilen protein alt birimlerinin uygun sekilde katlanmasina ve birlesmesine olanak Mevcut bulusa ait heteromultimerik proteinleri (örnegin antikorlari) eksprese etmek için uygun olan prokaryotik konak hücreler arasinda Arkeobakteriler ve Öbakteriler, örnegin Gram-negatif ya da Gram-pozitif organizmalar bulunur. Faydali bakteri örnekleri arasinda Escherichia (örnegin E. coli), Basil (örnegin B. subtilis), Enterobakteri, Psödomonas türü (örnegin P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla ya da Paracoccus bulunur. Bir uygulamada, gram-negatif hücreler kullanilir. Bir uygulamada, E. coli hücreleri mevcut bulus için konak olarak kullanilir. E. coli suslarinin örnekleri arasinda, W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 laC lq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP4l kanRgenotipine sahip 33D3 susu dahil olmak üzere (U.S. Pat. No. Biology, cilt 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, ve bunun türevleri bulunur. Diger suslar ve bunlarin türevleri, örnegin E. coli , E. coli E, E. coliÄ1776 (ATCC de ayrica uygundur. Bir uygulamada, E. coli AIpp, özel bir* sekilde kullanilir. Bu örnekler sinirlandirici degil, örnekleyicidir. Yukarida bahsedilen, tanimlanan genotiplere sahip bakterilerin türevlerini olusturmaya yönelik yöntemler teknikte bilinir ve tarif edilir. Genellikle, replikonun bir bakterinin hücrelerinde kopyalanabilirligi dikkate alinarak uygun bakterilerin seçilmesi gerekir. Örnegin, replikonu saglamak için pBR322, pBR325, pACYCl77 ya da pKN4lO gibi iyi bilinen plazmitler olarak kullanildiginda, E. coli, Serratia ya da Salmonella türleri uygun sekilde konak olarak kullanilabilir. Tipik olarak, konak hücre minimal miktarda proteolitik enzim salgilamalidir ve hücre kültürüne ilave proteaz inhibitörleri avantajli bir sekilde dahil edilebilir. Konak hücreler, yukarida tarif edilen ekspresyon vektörleri ile dönüstürülür ve promotörleri indüklemek, dönüstürücüleri seçmek ya da istenen sekanslari kodlayan genleri amplifiye etmek için uygun sekilde modifiye edilmis olan konvansiyonel besleyici ortamda kültürlenir. Transformasyon, DNA'nin prokaryotik konaga dahil edilmesi ve böylece DNA'nin, ya kromozom disi bir öge ya da kromozomal bütünleyici olarak kopyalanabilir olmasi anlamina gelir. Kullanilan konak hücreye bagli olarak, transformasyon, bu tür hücrelere uygun standart teknikler kullanilarak yapilir. Kalsiyum klorürün kullanildigi kalsiyum tedavisi genellikle, belirgin hücre duvari bariyerleri içeren bakteriyel hücreler için kullanilir. Baska bir transformasyon yönteminde polietilen glikol/DMSO kullanilir. Yaygin olarak kullanilan bir baska teknik de elektroporasyondur. Mevcut bulusun polipeptidlerinin üretilmesinde kullanilan prokaryotik hücreler teknikte bilinen ve seçilen konak hücrelerin kültürü için uygun olan ortamlarda yetistirilir. Uygun ortaniörnekleri arasinda Luria sivi besi yeri (LB) ve bunun yaninda gereken besin takviyeleri bulunur. Bazi uygulamalarda, ortam ayrica, ekspresyon vektörünü içeren prokaryotik hücrelerin büyümesine seçici olarak olanak tanimak için, ekspresyon vektörünün yapilandirmasina dayali bir seçim ajani içerir. Örnegin, ampisiline dirençli gen eksprese eden hücrelerin büyümesini saglamak için ortama ampisilin ilave Karbon, azot.ve inorganik.fosfat kaynaklarinin yani sira gerekli herhangi bir takviye maddesi de uygun konsantrasyonlarda, tek basina ya da bir baska takviye ya da bir kompleks azot kaynagi gibi ortamla karisim halinde sunularak dahil edilebilir. Istege bagli olarak, kültür ortami, glutatyon, sistein, sistamin, tiyoglikolat, ditiyoeritritol ve ditiyotreitolden olusan grup içinden seçileribir`ya.da daha.fazla.indirgeyici ajan içerebilir. Prokaryotik konak hücreler uygun sicakliklarda kültürlenir. Örnegin E. coli büyümesi için, tercih edilen sicaklik, yaklasik °C ila yaklasik 39°C, daha tercihen yaklasik 25°C ila yaklasik 37°C arasinda, daha da tercihen yaklasik 30°C'dir. Ortamin pH düzeyi, temelde konak organizmaya dayali olarak yaklasik 5 ila yaklasik 9 arasindaki herhangi bir pH olabilir. E. coli için, pH düzeyi tercihen yaklasik 6.8 ila yaklasik 7.4 arasinda ve daha tercihen yaklasik 7.0 düzeyindedir. Mevcut bulusa ait ekspresyon vektöründe indüklenebilir bir promotörün kullanilmasi halinde_protein ekspresyonu, promotörün aktivasyonu için uygun olan kosullar altinda indüklenir. Mevcut bulusun.bir yönünde, polipeptidlerin transkripsiyonunun kontrol edilmesi için PhoA promotörleri kullanilir. Buna uygun olarak, dönüstürülmüs konak hücreler, indükleme için bir fosfat sinirlayici ortaminda kültürlenir. Tercihen, fosfat sinirlayici ortam, C.R.A.P. ortamidir (bkz., Örn., Simmons ve dig., J. yapisina bagli olarak, teknikte bilinen sekilde çesitli baska indükleyiciler de kullanilabilir. Bir uygulamada, birinci ve ikinci mentese içeren konak hücreler ayri ayri kültürlenir ve bu bulusa ait eksprese edilen polipeptidler, ayri ayri konak hücrelerin periplazmasina salgilanir ve buradan geri kazanilir. Ikinci bir uygulamada, birinci ve ikinci Hentese içeren konak hücreler ayri ayri kültürlenir ve mentese içeren polipeptidlerin izolasyonundan önce, iki konak hücre kültürü birlikte karistirilir ve hücreler pellet haline getirilir. Üçüncü bir uygulamada, birinci ve ikinci mentese içeren konak hücreler ayri ayri kültürlenir, santrifüje edilir ve ayri olarak yeniden süspanse edilir ve sonrasinda mentese içeren polipeptidlerin izolasyonundan önce birlikte karistirilir. Dördüncü uygulamada, birinci ve ikinci mentese içeren konak hücreler, ayni kültür kabinda birlikte kültürlenir. Protein geri kazanimi tipik olarak mikroorganizmanin hücre membraninin genellikle ozmotik sok, sonikasyon ya da liz gibi yollarla parçalanmasini içerir. Hücreler parçalandiktan sonra, hücre kalintisi ya da tam hücreler santrifügasyon ya da filtrasyon yoluyla uzaklastirilabilir. Proteinler, örnegin afinite reçine kromatografisiyle daha fazla saflastirilabilir. Alternatif olarak, proteinler kültür ortamina aktarilabilmekte veya salgilanabilmekte ve burada izole edilebilmektedir. Bir egzojen sekans etiketi (veya epitop etiketi) ile eksprese edilen rekombinant proteinler, saflastirma asamasini kolaylastirabilmektedir. Bir egzojen sekans etiketi (sinirlama olmaksizin His etiketi ve GST etiketi) içeren proteinlerin klonlanma ve saflastirilma teknigi teknikte iyi bilinir. Hücreler kültürden uzaklastirilabilir ve kültür üst fazi filtrelenip konsantre edilerek, üretilen proteinlerin daha fazla saflastirilmasi saglanir. Eksprese edilen polipeptidler, poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE) ve Western blot testi gibi yaygin olarak bilinen yöntemler kullanilarak daha fazla izole edilebilmekte ve tanimlanabilmektedir. Izole polipeptidler, heteromultimerik proteinleri üretmek için kullanilacaktir. Mevcut bulusun bir yönünde, heteromultimerik protein (örnegin antikor) üretimi, bir fermentasyon prosesi ile büyük ölçekli olarak gerçeklestirilir. Rekombinant proteinlerin üretimi için çesitli büyük ölçekli kesikli beslemeli fermantasyon prosedürleri bulunur. Büyük ölçekli fermentasyonlar en az 1000 litrelik kapasiteye sahiptir. Bu fermentörlerde oksijen ve besinlerin, özellikle glikozun (tercih edilen karbon/enerji kaynagi) dagitimi için karistirici pervaneler kullanilir. Küçük ölçekli fermentasyon ifadesi genel olarak, volümetrik kapasitesi yaklasik olarak 100 litrenin üzerinde olmayan bir fermentör içinde yapilan fermentasyonu ifade eder ve yaklasik 1 litre ila yaklasik 100 litre arasinda degisebilmektedir. Bir fermentasyon prosesinde, protein ekspresyonunun indüklenmesi tipik olarak, hücreler uygun kosullar altinda istenen bir yogunluga, örnegin yaklasik 180-220 arasinda bir ODsm, yetistirildikten. sonra baslatilmakta. olup bu asamada hücreler erken duragan fazda bulunur. Kullanilan vektör yapilanmasina bagli olarak, teknikte bilinen ve yukarida tarif edilen sekilde çesitli indükleyiciler kullanilabilir. Hücreler indükleme öncesinde daha kisa sürelerde yetistirilebilir. Hücreler genellikle yaklasik 12-50 saat indüklenmekte olup bununla birlikte daha uzun ya da daha kisa indükleme süreleri de kullanilabilir. Mevcut bulusun polipeptidlerinin üretim verimini ve kalitesini arttirmak amaciyla çesitli fermentasyon kosullari modifiye edilebilmektedir. Örnegin, salgilanan heteromultimerik proteinlerin (örnegin antikorlar) uygun sekilde birlesme ve katlanmasini gelistirmek üzere, Dsb proteinleri (DsbA, DsbB, DsbC, Dsz ve/veya DsbG) ya da FkpA (saperon aktiviteli bir peptidilprolil cis,trans-izomeraz) gibi saperon proteinleri asiri eksprese eden ilave vektörler, konak prokaryotik hücrelerin birlikte dönüstürülmesini saglamak üzere kullanilabilmektedir. Saperon proteinlerin, bakteriyel konak hücrelerde üretilen heterolog proteinlerin uygun sekilde katlanmasini ve çözünürlüklerini kolaylastirdigi Georgiou ve dig., U.S. Patent No. 6,083,715; Georgiou ve dig., Eksprese edilen heterolog proteinlerin (özellikle proteolitik olarak duyarli olanlarin) proteolizini en aza indirmek için, proteolitik enzimleri eksik olan belirli konak suslar mevcut bulus için kullanilabilmektedir. Örnegin, konak hücre suslari, bilineribakteriyel proteazlari, örnegin Proteaz III, OmpT, DegP, Tsp, Proteaz I, Proteaz Mi, Proteaz V, Proteaz VI ve bunlarin kombinasyonlarini kodlayan genlerde genetik mutasyonu/mutasyonlari saglamak üzereinodifiye edilebilir. Bazi E. coli proteaz eksikligi bulunan suslar mevcuttur ve, örnegin, Georgiou ve dig., U.S. Patent No. 5,264,365; Georgiou ve dig., U.S. Patent No. 5,508,192; Hara ve dig., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996) adli belgelerde tarif edilmistir. Bir uygulamada, proteolitik enzimleri eksik olan ve bir ya da daha fazla saperon proteini asiri eksprese eden plazmitlerle birlikte dönüstürülmüs olan E. coii suslari, mevcut bulusa ait ekspresyon sisteminde konak hücreler olarak kullanilir. Ikinci bir uygulamada, E. coli susu, disinembraniribir lipoproteini için yetersizdir (Alpp). iii. Heteromultimerik protein saflastirmasi Bir uygulamada, burada üretilen heteromultimerik protein, daha fazla test ve kullanim için büyük ölçüde homojen olan preparatlari elde etmek için ayrica saflastirilir. Teknikte bilinen standart protein saflastirma yöntemleri kullanilabilmektedir. Asagidaki prosedürler, uygun saflastirma prosedürleri için örnek niteligindedirt immünoafinite ya da iyon degistirme kolonlari üzerinde fraksiyonasyon, etanol çöktürmesi, ters faz HPLC, silika ya da DEAE gibi bir iyon degistirme reçinesi üzerinde kromatografi, odaklama kromatografisi, SBS-PAGE, amonyum sülfat çöktürmesi ve örnegin Sephadex G-75 kullanilarak jel filtreleme. Bir yönde, bir kati faz üzerinde immobilize edilen Protein A, örnegin, mevcut bulusa ait yarim antikor veya tam uzunluklu antikor ürünlerinin immünoafinite saflastirilmasinda kullanilir. Protein A, Staphylococcus aureus'tan 41 kD'lik bir hücre duvari proteini olup antikorlarin Fc bölgesine yüksek bir afiniteyle baglanir. Lindmark ve dig. (1983) JJ Immunol. Meth. 62:1-13. Protein A'nin immobilize edildigi kati faz tercihen bir caniya da silika yüzey içeren bir kolon, daha tercihen kontrollü bir gözenekli cam kolon ya da bir silisik asit kolonudur. Bazi uygulamalarda, kolon, kirleticilerin spesifik olmayan yapismasini önlemek amaciyla gliserol gibi bir reaktif ile kaplanmistir. Saflastirmanin birinci asamasinda, yukarida tarif edilen sekilde hücre kültüründen türetilen preparasyon, Protein A immobilize kati faz üzerine uygulanarak, ilgili antikorun Protein A'ya spesifik baglanmasina olanak taninir. Kati faz daha sonra yikanarak, kati faza spesifik olmayan sekilde baglanan kirleticiler uzaklastirilir. Heteromultimerik protein (örnegin antikor), elüsyon ile kati fazdan geri kazanilir. b. Ökaryotik konak hücreleri kullanarak heteromultimerik proteinler üretimi: Vektör bilesenleri genellikle, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla sunlarin birini veya daha fazlasini içerir: bir sinyal sekansi, bir replikasyon kökeni, bir veya daha fazla isaretleyici gen, bir güçlendirici eleman, bir promotör ve bir transkripsiyon sonlandirma sekansi. i. Sinyal sekansi bileseni Ökaryotik bir konak hücrede kullanima yönelik olan bir vektör ayrica, olgun protein ya da ilgili polipeptidin N-ucunda spesifikküi:ayrilnm.bölgesine sahip baska bir polipeptid de içerebilir. Seçilen heterolog sinyal sekansi tercihen konakçi hücre tarafindan taninan ve islenen (baska bir ifadeyle bir sinyal peptidaz tarafindan ayrilan) bir sinyal sekansidir. Memeli hücre ekspresyonunda, memeli sinyal sekanslari ve ayni zamanda viral salgilayici liderler, örnegin herpes simpleks gD sinyali bulunur. Bu tür öncül bölge için DNA, okuma çerçevesinde, istenen heteromultimerik protein(ler)i (Örnegin antikorlari) kodlayan DNA'ya baglanir. ii. Replikasyon kökeni Genellikle, memeli ekspresyon vektörleri için bir replikasyon kökeni bilesenine ihtiyaç duyulmaz. Örnegin, SV4O kökeni tipik olarak, yalnizca erken promotörü içerdiginden dolayi kullanilabilir. iii. Seçim geni bileseni Ekspresyon ve klonlama vektörleri, ayni zamanda seçilebilir isaretleyici olarak da adlandirilan bir seçim geni içerebilir. Tipik seçinigenleri, (a) antibiyotiklere ya da diger toksinlere, Örnegin ampisilin, neomisin, metotreksat ya da tetrasikline direnç kazandiran, (b) ilgili oldugu yerlerde oksotrofik yetmezlikleri tamamlayan ya da (c) kompleks ortaminda mevcut olmayan kritik besin maddelerini saglayan proteinleri kodlar. Bir seçim. semasi örneginde, bir konak hücrenin. büyümesini durdurmak için bir ilaç kullanilir. Bir heterolog gen ile basarili bir sekilde dönüstürülen hücreler, ilaç direnci saglayan bir protein üretir ve böylece seçim rejiminden sag kalarak çikar. Bu tür` baskin seçim örneklerinde neomisin, mikofenolik asit ve higromisin ilaçlari kullanilir. Memeli hücreleri için uygun seçilebilir isaretleyicilerin bir baska örnegi, DHFR, timidin kinaz, metalotiyonein-I ve II, tercihen primat metalotiyonein genleri, adenozin deaminaz, ornitin dekarboksilaz vb. gibi antikor nükleik asidinin oyugunu alabilme yetenegine sahip olan hücrelerin tanimlanmasina olanak taniyanlardir. Örnegin, DHFR seçim geniyle dönüstürülen hücreler ilk olarak, transformanlarin (dönüstürücülerin) tamaminin, DHFR'nin bir rekabetçi antagonisti olan metotreksati (Mtx) içeren bir kültür ortami içinde kültürlenmesiyle tanimlanir. Yabani tip DHFR uygulandiginda.uygun bir konak hücre, DHFR aktivitesinden yoksun Çin hamsteri yumurtalik (CHO) hücre hattidir (örnegin ATCC Alternatif olarak, bir antikor, yabani tip DHFR proteini ve aminoglikozit 3'-fosfotransferaz (APH) gibi bir baska seçilebilir isaretleyiciyi kodlayan DNA sekanslari ile dönüstürülen ya da birlikte dönüstürülen konak hücreler (özellikle, endojenöz DHFR içeren yabani tip konaklar), seçilebilir isaretleyici için örnegin kanamisin, neomisin ya da G418 gibi bir aminoglikozidik antibiyotik gibi bir seçim ajani içeren bir ortamda hücre büyümesi ile seçilebilmektedir. Bkz., örnegin, U.S. Patent No. 4,965,199. iv. Promotör bilesen Ekspresyon ve klonlama vektörleri genellikle, konak organizma tarafindan taninan ve istenen mentese içeren polipeptid(ler) (örnegin antikor) nükleik asidine uygulanabilir sekilde baglanan bir promotör içerir. Ökaryotlar için promotör sekanslar bilinir. Neredeyse tüm ökaryotik genler, transkripsiyonun baslatildigi bölgenin yaklasik olarak 25 ila 30 baz öncesinde konumlandirilmis olanZüîbakimindan zenginküiîbölgeye sahiptir. Birçok genin transkripsiyonunun baslangicindan 70 ila 80 baz öncesinde bulunan bir baska sekans ise, N'nin herhangi bir nükleotid olabildigi CNCAAT bölgesidir. Birçok ökaryotik genin 3' ucunda bir AATAAA sekansi bulunmakta olup bu sekans, poli A kuyrugunun, kodlayici sekansin 3' ucuna eklenmesine yönelik sinyal olabilir. Bu sekanslarin tamami, ökaryotik ekspresyon vektörlerinin içine uygun sekilde yerlestirilir. Memeli konak hücrelerinde vektörlerden istenen mentese içeren polipeptid(ler) (örneginyarim antikor) transkripsiyonu, örnegin, poliom virüsü, kus çiçegi hastaligi (fowlpox) Virüsü, adenovirüs (örnegin Adenovirüs 2), sigir papilom.virüsü, aVian sarkom. Virüsü, sitomegalovirüs, bir retrovirüs, hepatit-B virüsü ve Simian Virüs 40 (SV40) gibi virüslerin genomlarindan, heterolog memeli promotörlerden, örnegin aktin promotör ya da bir immünoglobülin promotör, veya isi soku promotörlerinden elde edilen promotörler ile kontrol edilmekte olup bu tür promotörlerin konak hücre sistemleriyle uyumlu olmalari kosulu SV40 virüsünün.erkerive geçzpromotörleri, ayni zamanda SV40 viral replikasyon kökenini de içeren bir SV4O kisitlama fragmani biçiminde uygun sekilde elde edilir. Insan sitomegalovirüsünün hemen erken promotörü, uygun sekilde bir Hindlll E kisitlama fragmani olarak elde edilir. Memeli konaklarda DNA.ekspresyonuna yönelik olarak sigir papilom virüsünün bir vektör olarak kullanildigi bir sisteniU.S. Patent No. 4,419,446 sayili belgede açiklaniri Bu sistemin bir modifikasyonu, U.S. Patent No. 4,601,978 sayili belgede tarif edilir. Herpes simpleks Virüsünden bir timidin kinaz promotörünün kontrolü altinda fare hücrelerinde insan ß-interferon cDNA'sinin ekspresyonu ile ilgili olarak ayrica bkz. Reyes ve dig., Nature 297z598-601 (1982). Alternatif olarak, Rous Sarkom Virüsü uzun terminal tekrari promotör olarak kullanilabilmektedir. v. Güçlendirici eleman bileseni Istenen mentese içeren polipeptid(ler)i (örnegin antikoru) kodlayan DNA'nin yüksek ökaryotlar ile transkripsiyonu, vektöre bir güçlendirici sekansin dahil edilmesi ile arttirilabilmektedir. Memeli genlerinden (örnegin globin, elastaz, albumin, d-fetoprotein ve insülin genleri) birçok güçlendirici sekans bilinir. Ayrica, bir ökaryotik hücre virüsünden bir güçlendirici kullanilabilir. Örnekler arasinda, replikasyon kökeninin geç tarafinda (bp 100-270) SV40 güçlendirici, sitomegalovirüs erken promotör güçlendirici, replikasyon kökeninin. geç tarafinda. polyoni güçlendirici ve adenovirüs güçlendiriciler bulunur. Ökaryotik promotörlerin aktivasyonunu güçlendirmeye yönelik elemanlarla ilgili bir Güçlendirici, güçlendirmenin gerçeklestirilmesi kosulu ile, antikor polipeptidini kodlayan sekansin 5' ya da 3' konumunda vektörün içine birlestirilebilir; ancak genellikle promotörden vi. Transkripsiyon sonlandirma bileseni Ökaryotik konak hücrelerde kullanilan ekspresyon vektörleri tipik olarak ayrica, transkripsiyonun sonlandirilmasi için ve mRNA'nin stabilize edilmesi için gerekli sekanslari da içerecektir. Bu tür sekanslar, ökaryotik veya Viral DNA'lar ya da cDNA'larin yaygin olarak 5' ve bazen de 3' translasyona ugramayan bölgelerinde bulunur. Bu bölgeler, bir antikoru kodlayan mRNA'nin translasyona ugramayan kisminda poliadenillenmis fragmanlar biçiminde transkribe edilen nükleotid segmentleri içerir. Kullanisli transkripsiyon sonlandirma bilesenlerinden birisi, sigir büyüme hormonu poliadenilasyon bölgesidir. Bkz. W094/11026 sayili belge ve bu belgede açiklanan ekspresyon vektörü. vii. Konak hücrelerin seçimi ve transfbrmasyonu Buradaki vektörlerde DNA'nin klonlanmasi veya eksprese edilmesi için uygun olan konak hücreler arasinda omurgali konak hücreleri dahil olmak üzere burada tarif edilen yüksek ökaryot hücreler bulunur. Omurgali hücrelerinin kültürde (doku kültürü) propagasyonu rutin bir prosedür haline gelmistir. Kullanisli memeli konak hücre hatlarinin örnekleri arasinda, SV4O tarafindan dönüstürülen maymun böbrek.CV1 hatti (CCS-7, ATCC CRL 1651); insan embriyonik böbrek hatti (süspansiyon kültüründe büyüme için alt klonlanmis 293 ya da 293 hücreleri, Graham ve dig., JL Gen Virol. 36:59 (1977)); bebek.hamster böbrek hücreleri (BHK, ATCC CCL 10); Çin hamsteri yumurtalik hücreleri/-DHFR fare sertoli hücreleri (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (; Afrika yesil maymunu böbrek hücreleri (VERO-76, ATCC CRL-1587); insan servikal karsinom hücreleri (HELA, ATCC CCL 2); köpek böbrek hücreleri (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo siçan karaciger hücreleri (BRL 3A, ATCC CRL 1442); insan akciger hücreleri (W138, ATCC CCL 75); insan karaciger hücreleri (Hep G2, HB 8065); fare meme tümörü (MMT ; TRI hücreleri (Mather ve dig., hücreleri; ve bir insan hepatom hatti (Hep G2) bulunur. Konak hücreler, istenen mentese içeren polipeptid(ler) (örnegin antikor) üretimi için yukarida tarif edilen ekspresyon ya da klonlama vektörleri ile dönüstürülür ve promotörleri indüklemek, dönüstürücüleri seçmek ya da istenen sekanslari kodlayan genleri amplifiye etmek için uygun sekilde modifiye edilmis olan konvansiyonel besleyici ortamda kültürlenir. viii. Konak hücrelerin kültürlenmesi Mevcut bulusa ait istenen bir mentese içeren polipeptid(ler) (Örnegin antikor) üretiminde kullanilan konak hücreler çesitli ortamlarda kültürlenebilir. Ham's FlO (Sigma), Minimal Esansiyel Ortam ((MEM-Minimal Essential Medium), (Sigma), RPMI-l ve Dulbecco Modifiye Eagle Ortami ((DMEM-Dulbecco's Modified Eagle's Medium), Sigma) gibi piyasadaki mevcut ortamlar, konak hücrelerinin kültürlenmesi için uygundur. Ayrica, Ham ve dig., Méth. Enz. 58:44 (1979), belgelerde tarif edilen ortamlardan herhangi biri de konak hücreler için kültür ortami olarak kullanilabilir. Bu ortamlardan herhangi birisi, hormonlar ve/veya diger büyüme faktörleri (örnegin insülin, transferin ya da epidermal büyüme faktörü), tuzlar (örnegin sodyum klorür, kalsiyum, magnezyum ve fosfat), tamponlar, (örnegin HEPES), nükleotidler (örnegin adenozin ve timidin), antibiyotikler (örnegin GENTAMYCINTM ilaci), eser elementler (genellikle mikromolar düzeydeki nihai konsantrasyonlarda bulunan inorganik bilesikler olarak tanimlanir) ve glukoz ya da buna esdeger bir enerji kaynagi ile gereken sekilde takviye edilebilir; Diger gerekli takviyeler de, teknikte uzman kisilerce bilinen uygun konsantrasyonlarda dahil edilebilir. Sicaklik, pH ve benzeri gibi kültür kosullari, ekspresyon için seçilen konak hücrede önceden kullanilan kosullardir ve teknikte siradan uzmanliga sahip kisiler tarafindan anlasilacaktir. ix. Heteromultimerik proteinlerin saflastirilmasi Rekombinant teknikler kullanilirken, mentese içeren polipeptidler hücre içinde üretilebilmekteaya.da ortama.dogrudan salgilanabilmektedir. Mentese içeren polipeptidin hücre içinde üretilmesi durumunda, birinci asama olarak, konak hücreler veya lize edilmis fragmanlar biçimindeki parçacikli artiklar, örnegin santrifüjleme veya ultrafiltreleme yoluyla uzaklastirilir. Mentese içeren polipeptid ortama salgilandiginda, bu tür ekspresyon sistemlerinin üst fazlari genellikle ilk olarak piyasada mevcut olan bir polipeptid konsantrasyon filtresi, örnegin bir Amicon veya Millipore Pellicon ultrafiltreleme birimi kullanilarak konsantre edilir. PMSF gibi bir proteaz inhibitörü, proteolizi inhibe etmek üzere yukaridaki adimlardan herhangi birine dahil edilebilir ve advantisyöz kirleticilerin büyümesinin önlemesi için antibiyotikler dahil edilebilir. Hücrelerden hazirlanan heteromultimer bilesimi, örnegin, iyon degistirme, hidrofobik etkilesim kromatografisi, hidroksilapatit kromatografisi, jel elektroforezi, diyaliz ve afinite kromatografisi kullanilarak saflastirilabilmekte olup tercih edilen saflastirma teknigi afinite kromatografisidir. Yukarida belirtilen tekniklerin kombinasyonlari da tasarlanir. Protein A'nin bir afinite ligandi olarak uygunlugu, antikor içinde bulunan herhangi bir immünoglobülin Fc domeninin izotipine ve türüne baglidir. Protein A, insan yl, y2 ya da y4 agir zincirlerine dayali antikorlarin saflastirilmasinda kullanilabilmektedir (Lindmark ve dig., JJ Immunol. Meth. Afinite ligandinin baglandigi matris çogunlukla agarozdur; ancak diger matrisler de mevcuttur. Denetimli gözenekli cam ya da poli(stirendivinil)benzen gibi mekanik olarak stabil matrisler, agarozla elde edilebilecek olandan daha hizli akis hizina ve daha kisa isleme sürelerine olanak tanir. Antikor bir CH3 domeni içerdiginde, Bakerbond ABXTM reçinesi (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) saflastirma için kullanislidir. Protein saflastirma için, geri kazanilacak olan antikora bagli olarak baska teknikler deinevcut olup bunlarin arasinda örnegiribir iyon degistirme kolonu üzerinde fraksiyonasyon, etanol çöktürmesi, Ters Faz HPLC, silika üzerinde kromatografi, heparin SEPHAROSETM üzerinde kromatografi, bir anyon ya da katyon degistirme reçinesi (örnegin bir poliaspartik asit kolonu) üzerinde kromatografi, odaklama kromatografisi, SBS-PAGE ve amonyum sülfat çöktürmesi bulunur. Herhangi bir ön saflastirma asamasi/asamalari izlenerek, ilgili antikoru ve kirleticileri içeren karisim, yaklasik 2,5 ila 4,5 arasindaki bir pH degerinde, tercihen düsük tuz konsantrasyonlarinda (örnegin yaklasik O-O,25 M tuz) gerçeklestirilen bir elüsyon tamponu kullanilarak düsük pH hidrofobik etkilesim kromatografisine tabi tutulabilir. Heteromultimerik proteinlerin üretilmesi (yukaridaki özel yöntemlerden herhangi birine) alternatif olarak.veya ek olarak, bir polipeptid karisimini içeren bir çözeltinin diyaliz edilmesini içerir. x. Bakülovirüs kullanarak antikor üretimi Rekombinant bakülovirüs, bir antikor veya antikor fragmanini ve BaculoGoldTM Virüsü DNA'sini kodlayan bir plazmidin (Pharmingen), örnegin lipofektin (piyasada GIBCO-BRL'den temin edilebilir) kullanilarak bir Spodoptera frugiperda hücresi (örnegin Sf9 hücreleri; ATCC CRL l71l) veya bir Drosophila melanogaster 82 hücresi gibi bir~ böcek hücresine birlikte transfekte edilmesiyle üretilebilir. Özel bir örnekte, bir antikor sekansi, bir bakülovirüs ekspresyon vektörü içinde bulunan bir epitop etiketinin yukarisina kaynastirilir. Bu epitop etiketleri poli-His etiketlerini içerir. pVL gibi piyasada mevcut olan plazmidlerden elde edilen plazmidler dahil olmak üzere çesitli plazmidler kullanilabilir. Özetle, bir antikoru veya bunun bir fragmanini kodlayan sekans, 5' ve 3' bölgelerine tamamlayici olan primerlere sahip PCR ile amplifiye edilebilir. 5' primeri, komsu (seçilmis) kisitlama enzim bölgelerini içerebilir. Ürün daha sonra seçilen kisitlama enzimleri ile sindirilebilir ve ekspresyon vektörüne alt klonlanabilir. Ekspresyon vektörü ile transfeksiyon sonrasinda, konak hücreler (örnegin Sf9 hücreleri), 28°C'de 4-5 gün boyunca inkübe edilir ve birakilan virüs hasat edilir ve daha fazla amplifikasyon için kullanilir. Viral enfeksiyon ve protein ekspresyonu, örnegin, O'Reilley ve dig. (Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual. Oxford: Oxford.University Press (1994)) tarafindan tarif edilen sekilde gerçeklestirilebilir. Eksprese edilmis poli-His etiketli antikor, daha sonra, örnegin, asagidaki gibi Ni2+-kelat afinite kromatografisi ile saflastirilabilmektedir. Ekstraktlar, Rupert ve dig. (Nature virüsle enfekte edilmis Sf9 hücrelerinden.hazirlanabilmektedir. Özetle, Sf9 hücreleri yikanir, sonikasyon tamponu (25 mL HEPES 0,4 M KCl) içinde yeniden süspanse edilir ve buz üzerinde 20 saniye süreyle iki kez sonikasyon islemine tabi tutulur. Sonikatlar santrifüj yoluyla temizlenir ve üst faz yükleme 50 kat seyreltilir ve 0,45 um'lik bir filtre aracaligiyla filtrelenir. Bir Ni2+-NTA agaroz kolonu (piyasada Qiagen'den temin edilebilir), 5 mL'lik bir yatak hacmi ile hazirlanir, 25 mL su ile yikanir ve 25 mL yükleme tamponu ile dengelenir. Filtrelenmis hücre ekstrakti, dakikada 0,5 mL'de kolon üzerine yüklenir. Kolon, yükleme tamponu ile A280 referans degerine yikanir, bu noktada fraksiyon koleksiyonu baslatilir. Daha sonra, spesifik olmayan bir sekilde baglanmis proteini elüt eden kolon, ikincil bir yikama tamponu (50 mM fosfat; 300 mM NaCl; ulastiktan sonra kolon, ikincil yikama tamponunda 0 ila 500 mM Imidazol gradiyent ile gelistirilir. Bir mL fraksiyonlar toplanir` ve SDS-PAGE ve gümüs boya veya alkalen fosfataza (Qiagen) konjüge edilmis Ni2+-NTA'ya sahip Western blot ile analiz edilir. Elüt edilmis HislO-etiketli antikoru içeren fraksiyonlar` havuzlanir` ve yükleme tamponuna karsi diyaliz Alternatif olarak, antikorun saflastirilmasi, Örnegin Protein A veya protein G kolon kromatografisi dahil olmak üzere bilinen kromatografi teknikleri kullanilarak gerçeklestirilebilmektedir. Bir uygulamada, ilgili antikor, bir kaotropik ajan veya yumusak deterjan içeren bir çözelti içine elüsyon yoluyla kolonun kati fazindan geri kazanilabilir. Örnek niteligindeki kaotropik ajanlar ve yumusak deterjanlar arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, hepsi piyasadan temin edilebilen Guanidin-HCI, üre, lityum perklorat, Arjinin, Histidin, SDS (sodyum dodesil sülfat), Tween, Triton ve NP-4O Mevcut bulusa ait bir heteromultimerik protein tarafindan hedeflenebilen moleküllerin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, çözünebilir serum proteinleri ve bunlarin reseptörleri ve diger membrana bagli proteinler (örnegin adezinler) bulunur. Bkz. WOZOll/l33886. Baska bir uygulamada, mevcut bulusa ait heteromultimerik protein, bir, iki veya daha fazla sitokini, sitokin ile iliskili proteinleri ve asagidakilerden olusan gruptan seçilen sitokin reseptörlerini baglayabilmektedir: BMPI, BMP2, BMP3B (GDFIO), BMP4, BMP6, BMP8, CSFI (M-CSF), CSFZ (GM-GSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGFI (aFGF), FGFZ (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGFS, FGFG (EPSELON), FELI (ZETA), ILlA, ILlB, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, TGFB3, LTA (TNF-b), LTB, TNF (TNF-a), TNFSF4 (OX4O ligandi), TNFSFS (CD4O ligandi), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 ligandi), TNFSF8 (CD3O ligand)i, TNFSF9 (, TNFSFll (TRANCE), TNFSFlZ (APO3L), TNFSF13 (Nisan), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILIRl, lLl R2, lLl RLl, lLlRLZ, ILZRA, ILZRB, AIFI, HGF, LEP (leptin), PTN ve THPO. Baska bir uygulamada, bir hedef molekül, bir kemokin, kemokin reseptörü veya asagidakilerden olusan gruptan seçilen kemokin ile iliskili bir proteindir: CCLI (I-, CCL3 (MIP-Ia), CCL4 (MIP-Ib), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-Z), CCLH (eotaksin), CCLl3 (MCP-4), CCLlS (MIP-Id), CCLl6 (HCG-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCLl9 (MDP-3b), CCLZO (MIP-3a), CCLZl (SLC / exodus-Z), CCL22 (MDC / STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2 / eotaksin-Z), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaksin-3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCLZ (GROZ), CXCL3 (GRO3), CXCLS (ENA-78), CXCL6 (GCP-Z), CXCL9 (MIG), CXCLlO (IP 10), CXCLll (I-TAC), CXCL12 (SDFI), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (lenfotaktin), XCLZ (SCM-Ib), BLRI (MDR15), CCBPZ (D6//JAB61),CCR1(CKRI,/HM,CCR3(CKR3 / CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBRS / Chele3), CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6), CCR7 (CKR7 / EBII), CCR8 (CMKBR8 / TERI / CKR-LI), CCR9 (GPR-, XCRI (GPR5,/CCXCRI), CMKLRI, CMKORI (RDCI), CX3CR1 (V28), CXCRA, GPRZ (CCRIO), GPR3l, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPRl6), TCPIO, CKLFSFZ, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSFS, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C, EPO, FY (DARC), GDFS, HDFIA, DL8, PRL, RGs3, RGSl3, SDFZ, SLITZ, TLR2, TLR4, TREMI, TREMZ ve VHL. Baska bir uygulamada, mevcut bulusa ait heteromultimerik proteinler, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla hedefi baglayabilmektedir: ABCFI; ACVRI; ACVRIB; ACVRZ; ACVRZB; ACVRLI; ADORAZA; Agrekan; AGRZ; AICDA; AIFI; AIGI; AKAPI; AKAPZ; AMH; AMHRZ; ANGPTI; ANGPTZ; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOCI; AR; AZGPI (çinko-a- glikoprotein): B7.l; B; BAGI; BAH; BCLZ; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMPI; BMPZ; BMP3B (GDFIO); BMP4; BMP6; BMP8; BMPRIA; BMPRIB; BMPRZ; BPAGI (plektin): BRCAI; ClgorflO (IL27w); C3; C4A; C5; CSRl; CANTI; CASPl; CASP4; CAVI; CCBPZ (D6 / JAB61); (MCP-1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL2l (MTP-2); SLC; exodus-Z; CCL22 (MDC,/STC-I); CCL23 (MPIF-l); CCL24 (MPIF-Z//eotaksin-2); CCL25 (TECK); CCL26 (eotaksin-3); CCL27 (CTACK / ILC); CCL28; CCL3 (MTP-Ia); CCL4 (MDP-Ib); CCLS (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mCp-2); CCNAI; CCNAZ; CCNDI; CCNEI; CCNEZ; CCRI (CKRI / HM145); CCR2 (mCp-IRB / RA); CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCRS (CMKBR5 / Chele3); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBII); CCR8 (CMKBR8 / TERI / CKR-LI); CCR9 (GPR-9-6); CCRLI (VSHKI): CCRLZ (L-CCR); CD164; CD19; CDIC; CDZO; CDZOO; CD22; CD81; CD83; CD86; CDHI (E-kaderin): CDHlO; CDHlZ; CDH13; CDHl8; CDK6; CDK7; CDK9; CDKNIA (p21Wapl/Cipl); CDKNIB (p27Kipl); CDKNIC; CDKNZA (P161NK4a); CDKNZB; CDKNZC; CDKN3; CEBPB; CERI; CHGA; CHGB; Kitinaz; CHSTlO; CKLFSFZ; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSFS; CKLFSFG; CKLFSF7; CKLFSFS; CLDN3; CLDN7 (klodin-7); CLN3; CLU (klusterin); CMKLRI; CMKORI (RDCI); CNRI; COL18A1; COLIAI; (GCSF): CTLA4; CTNNBI (b-katenin); CTSB (katepsin B); CX3CL1 (SCYDI): CXSCRl (V28); CXCLI (GROI); CXCLlO (IP-10); CXCLII (I-TAC / IP-9); CXCLlZ (SDFI); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCLZ (GR02); CXCL3 (GRO3); CXCLS (ENA-78 / LIX); CXCL6 (GOP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / BonZO); CYBS; CYCI; CYSLTRI; DABZIP; DES; DKFZp451 JOl 18; DNCLI; DPP4; E2Fl; ECGFI; EDGI; EFNAI; EFNA3; EFNBZ; EGF; EGFR; ELACZ; ENG; ENOl; ENOZ; ENO3; EPHB4; EPO; ERBBZ (Her-2); EREG; ERK8; ESRI; ESRZ; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCERIA; FCERZ; FCGR3A; FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FELI (EPSILON); FILI (ZETA); FLJ; FLTI; FOS; FOSLI (ERA-I): FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEBI; GAGECI; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFIl; GGTl; GM-CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCRIO); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSGSO): GRCCIO (CIO); GRP; GSN (Gelsolin); GSTPI; HAVCRZ; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDÄC9; HGF; HIFIA; HDPI; histamin ve histamin reseptörleri; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOXI; HUMCYTZA; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNAI; IFNAZ; IFNA4; EL7R; EL8; ILSRA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA; integrin); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b 4 integrin); JAGI; JAKI; JAK3; JUN; K6HF; KAII; KDR; KITLG; KLFS (GCîBox.BP); KLF6; KLKIO; KLKlZ; (Keratin 19); KRTZA; KHTHB6 (saça özgü tip H keratin); LAMAS; LEP (leptin); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG veya Omgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIBI; midkin; MEF; MIP-Z; MK167; (Ki-67); MMPZ; MMP9; MS; MTSSI; MUCI (musin); MYC; MYD88; NCKZ; nörokan; NFKBI; NFKBZ; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NMEI (NM23A); NOXS; NPPB; NROBI; NROB2; NRIDI; NRl DZ; NRl HZ; NRl NR6Al; NRPI; NRPZ; NTSE; NTN4; ODZI; OPRDI; P2RX7; PAP; PARTI; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAMI; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; fosfakan; PIASZ; PIKBCG; PLAU (uPA): PLG; PLXDCI; PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROKZ; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGSZ (COX-2); PTN; RACZ (p21 Rac2); RARB; RGSI; RGSl3; RGS3; RNFIIO (ZNF144); ROBOZ; SlOOAZ; SCGBl D2 (lipofilin B); SCGBZAi (mammaglobin2); SCGB2A2 (mammaglobin 1); SCYEI (endotelyal Monosit-aktive edici sitokin); SDF2; SERPINAI; SERPINA3; SERPl NB5 (maspin): SERPINEI (PAI-I); SERPDMFl; SHBG; ST6GAL1; STABI; STAT6; STEAP; STEAPZ; TB4R2; TBX21; TCPIO; TDGFI; TEK; TGFA; TGFBI; TGFBIII; TGFBZ; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBRZ; TGFBR3; THIL; THBSI (trombospondin-l); THBSZ; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; doku faktörü; TLRIO; TLRZ; TLR3; TLR4; TLRS; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAEPZ (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSFIA; TNFRSFIB; TNFRSFZl; TNFRSFS; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSFB; TNFRSF9; TNFSFIO (TRAIL): TNFSFI l (TRANCE); TNFSFlZ (APO3L); TNFSF13 (Nisan): TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSFlS (VEGI); TNFSFl8; TNFSF4 (OX40 ligandi); TNFSFS (CD4O ligandi); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 ligandi); TNFSF8 (CD3O ligandi); TNFSF9 (; TOLLIP; Toll benzeri reseptörler; TOPZA (topoizomeraz Ea): TP53; TPMI; TPM2; TRADD; TRAFI; TRAFZ; TRAF3; TRAF4; TRAFS; TRAF6; TREMI; TREMZ; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; versikan; VHL C5; VLA-4; XCLI (lenfotaktin); XCLZ (SCM-Ib); XCRI(GPR5//CCXCRI); YYI ve ZFPM2. Mevcut bulusun.kapsami dahilindeki antikorlar için tercih edilen moleküler hedef moleküller arasinda CD3, CD4, CD8, CD16, CDl9, CD20, CD34, CD64, CDZOO gibi.CE)proteinleri; EGE'reseptörü, HERZ, HER3 veya HER4 reseptörü gibi ErbB reseptör ailesinin üyeleri; LFA-l, Mad, p150.95, VLA-4, ICAM-l, VCAM, alfa4/beta7 integrin, ve alfaV/beta3 integrin ve bunlarin alfa veya.beta alt üniteleri gibi (örnegin anti-CDlla, anti-CD18 veya anti-CDllb antikorlari) hücre adezyon molekülleri; VEGF-A, VEHF-C gibi büyüme faktörleri; doku faktörü (TF); alfa interferon (alfaIFN); bir interlökin; kan grubu antijenleri; flk2/flt3 reseptörü; obezite (OB) reseptörü; mpl reseptörü; CTLA-4; RANKL, RANK, RSV F proteini; protein C ve benzerleri bulunur. Bir uygulamada, mevcut bulusa ait heteromultimerik proteinler, düsük yogunluklu lipoprotein reseptörü ile iliskili protein (LRP)-l veya LRP-8 veya transferrin reseptörünü ve 1) beta sekretaz (BACEl veya BACEZ), 2) alfa-sekretaz, 3) gama-sekretaz, 4) tau-sekretaz, 5) amiloid öncü proteini (APP), 6) ölüm reseptörü 6 (DR6), 7) amiloid beta peptid, 8) alfa- sinüklein, 9) Parkin, lO) Huntingtin, ll) p75 NTRxnalZ) kaspaz-6'dan olusan gruptan seçilen en az bir hedefi baglar. Bir uygulamada, mevcut bulusa ait heteromultimerik proteinler, asagidakilerden olusan gruptan seçilen en az iki hedef moleküle baglanir: IL-l alfa ve IL-l beta, IL-12 ve IL-18; IL-l3 ve IL-9; ve TGF-3; IL-l3 ve LHR agonisti; IL-12 ve TWEAK, IL-13 ve CL25; CD4O ve CD20; CD-8 ve IL-6; CD20 ve BR3, TNFalfa ve TGF-beta, TNFalfa ve IL-l beta; TNFalfa ve IL-2, TNF alfa ve IL-3, TNFalfa ve IL-4, TNFalfa.ve IL-S, TNFalfa.ve IL6, TNFalfa.ve IL8, TNFalfa ve IL-9, TNFalfa ve IL-lO, TNFalfa ve IL-ll, TNFalfa ve IL-12, TNFalfa ve IL-l3, TNFalfa ve IL-l4, TNFalfa ve IL-15, TNFalfa ve IL-l6, TNFalfa ve IL-l7, TNFalfa ve IL-18, TNFalfa ve IL-19, TNFalfa ve IL-20, TNFalfa ve IL-23, TNFalfa ve IFNalfa, TNFalfa ve CD4, TNFalfa ve VEGF, TNFalfa ve MIF, TNFalfa ve ICAM-l, TNFalfa ve PGE4, TNFalfa ve PEGZ, TNFalfa ve RANK ligandi, TNFalfa ve Te38; TNFalfa ve BAFF; TNFalfa ve CD22; TNFalfa ve CTLA-4; TNFalfa ve GP130; TNFa ve IL-12p40; VEGF ve HERZ, VEGF-A ve HERZ, VEGF-A ve PDGF, HERl ve HERZ, VEGF-A ve VEGF-C, VEGF-C ve VEGF-D, HERZ ve DR5,VEGF ve IL-8, VEGF ve MET, VEGFR ve MET reseptörü, VEGFR.Ve EGFR, HER2 ve CD64, HER2 ve CD3, HER2 ve CDl6, ve TNFRl ve IL-18R, EpCAM ve CD3, MAPG ve CD28, EGFR ve CD64, CSPGS ve RGM A; CTLA-4 ve BTNOZ; IGFl ve IGFZ; IGFl/Z ve ErbZB; MAG ve RGM A; NgR ve RGM A; NogoA ve RGM A; OMGp ve RGM A; PDL-I ve CTLA-4; ve RGM A ve RGM B. Istege bagli olarak diger moleküllere konjüge edilmis çözünebilir antijenler veya bunlarin fragmanlari, antikorlari üretmeye yönelik immünojenler olarak kullanilabilmektedir. Reseptörler gibi transmembran molekülleri için bunlarin fragmanlari (örnegin bir reseptörün hücre disi domeni), immünojen olarak kullanilabilmektedir. Alternatif olarak, transmembran molekülü eksprese eden hücreler, immünojen olarak kullanilabilmektedir. Bu tür* hücreler, dogal bir kaynaktan (örnegin kanser hücre hatlari) türetilebilmektedir ya da bu hücreler, transmembran molekülü eksprese etmek üzere rekombinant teknikler ile dönüstürülmüs hücreler olabilir. Antikorlarin hazirlanmasi için faydali olan diger antijenler ve bunlarin formlari, teknikteki kisilerce anlasilacaktir. V. Uygulamalar Mevcut bulus, asagida tarif edilen ilave uygulamalari sunar. Birinci bir uygulamada, bir heteromultimerik protein üretmeye yönelik bir yöntem sunulmakta olup söz konusu yöntem asagidakileri içerir: Protein A ile saflastirilmis birinci bir mentese içeren polipeptidin elde edilmesi; Protein A ile saflastirilmis ikinci bir mentese içeren polipeptidin elde edilmesi; Her bir yarim antikorun pH'inin 4 ila 9 arasinda ayarlanmasi; Karma bir mentese içeren polipeptid havuzu elde etmek üzere birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidin karistirilmasi; Zayif bir indirgeyicinin bir molar fazlaliginin karma mentese içeren polipeptid havuzuna ilave edilmesi; ve birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidi içeren bir heteromultimerik.protein olusturmak.üzere zayif indirgeyici ile karma mentese içeren polipeptid havuzunun inkübe edilmesi. Ikinci bir uygulamada ve birinci uygulamaya göre, birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidler, bir yarim antikor, immünoadezin KK& bunlarin fragmanlarindan seçilebilmektedir. Üçüncü bir uygulamada. ve birinci uygulamaya göre, birinci mentese içeren polipeptid, bir yarim antikordur. Dördüncü bir uygulamada ve birinci uygulamaya göre, ikinci mentese içeren polipeptid, bir Fc bilesenidir. Besinci bir uygulamada ve üçüncü uygulamaya göre, yarim antikor, bir VL domeni, bir CL domeni, bir VH domeni, bir CHl domeni, bir mentese domeni, bir CH2 domeni ve bir CH3 domeni içerir. Altinci bir uygulamada ve besinci uygulamaya göre, yarim antikor, tek bir polipeptid zinciridir ve ayrica.bir baglayici içermekte olupiburada söz konusu bir N-terminalden C-terminal yönünde birbirlerine göre su sekilde konumlandirilir: VL-CL-baglayici-VH-CHl-mentese-CHZ-CH3. Yedinci.bir uygulamada ve birinci uygulamaya göre, birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidler, Protein A saflastirmasindan önce karistirilir ve Protein A araciligiyla birlikte saflastirilir. Sekizinci bir uygulamada.ve birinci uygulamaya göre, birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidler, bir heteromultimerizasyon domeni içerir. Dokuzuncu bir uygulamada ve sekizinci uygulamaya göre, heteromultimerizasyon domeni, bir delik içine topuz mutasyonu, lösin fermuarlari, elektrostatik vb.'den seçilir. Onuncu bir uygulamada ve dokuzuncu uygulamaya göre, birinci mentese içeren polipeptid.bir topuz içerir ve ikinci mentese içeren polipeptid bir delik.içeriru On birinci bir uygulamadaxmebirinci uygulamaya göre, pH karistirmadan sonra ayarlanir. On ikinci bir'uygulamada ve birinci veya on birinci uygulamaya göre, yöntem ayrica, pH ayarlamasi öncesinde 20mM ila lM'lik bir nihai konsantrasyona L-Arjinin ilave edilmesini içerir. On üçüncü bir uygulamada ve birinci uygulamaya göre, yöntem ayrica, karma havuzun en az 30 dakika boyunca 15°C ila 39°C arasindaki bir sicaklikta inkübe edilmesini içerir. On dördüncü bir uygulamada ve birinci uygulamaya göre, birlesme karisimi, -200 ila -600 mV arasinda, daha tercihen -300 ila -500 mV arasinda, en çok tercihen ise yaklasik -400mV'lik bir oksidasyon potansiyeline sahiptir. On besinci bir uygulamada ve birinci uygulamaya göre, zayif indirgeyici, GSH, Beta-MerkaptoEtilAmin, sistein/sistin, GSH/GSSG, sisteamin/sistamin, glisilsistein ve beta-merkaptoetanol arasindan seçilir. On altinci bir uygulamada.ve birinci uygulamaya göre, zayif indirgeyici, 50-600 molar fazlalikta ilave edilir. On yedinci bir uygulamada ve birinci uygulamaya göre, zayif indirgeyici, karisma öncesinde ilave edilir. On sekizinci bir uygulamada ve on yedinci uygulamaya göre, ilave, karisma öncesinde bir saatten daha az bir sürede yapilir. On dokuzuncu bir uygulamada ve birinci uygulamaya göre, birlesme karisimini inkübe etme asamasi, Polivinilpirrolidon (PVP) varliginda 15°C ila 39°C arasindaki bir sicaklikta yapilir. Yirminci bir uygulamada ve on dokuzuncu uygulamaya göre, histidin, PVP öncesinde, PVP ile es zamanli olarak veya PVP sonrasinda ilave edilir. 21. bir uygulamada ve on dokuzuncu uygulamaya göre, PVP, %40'a kadar (w/v) ilave 22. bir uygulamada, mevcut.bulus bir bispesifik antikor üretmeye yönelik bir yöntem.sunmakta olup söz konusu yönteniasagidakileri a. Protein A ile saflastirilmis birinci bir yarim antikorun elde edilmesi; b. Protein A ile saflastirilmis ikinci bir yarim antikorun elde edilmesi; c. Her bir yarim antikora L-Arjinin çözeltisinin ilave edilmesi; d. Her bir yarim antikorun pH'inin 4 ila 9 arasinda ayarlanmasi; e. Karma bir yarim antikor havuzu elde etmek üzere birinci ve ikinci yarim antikor havuzlarinin karistirilmasi; f. Karma yarim antikor havuzuna zayif bir indirgeyicinin bir molar fazlaliginin ilave edilmesi; g. Karma yarim antikor havuzunun PVP varliginda 15°C ila 39°C arasindaki bir sicaklikta inkübe edilmesi, böylece, birinci ve ikinci yarim antikoru içeren bir bispesifik antikor üretilir. 23. bir uygulamada, mevcut bulus bir heteromultimer üretmeye yönelik bir yöntenisunmakta olup söz konusu yöntem asagidakileri içerir: (a) en az iki farkliinentese içereripolipeptid.karisimini ihtiva eden bir L-Arjinin sunulmasi, burada söz konusu karisim 7 ila 9 arasinda bir pH'a sahiptir, (b) zayif indirgeyicinin bir molar fazlaliginin ilave edilmesi ve (0) bir heteromultimerin üretildigi kosullar altinda karisimin inkübe edilmesi. 24. bir uygulamada ve 22. uygulamaya.göre, birinci yariniantikor, (a) Bir VL domeni ve bir CL domeni içeren tam uzunluklu bir Hafif zincir; (b) Bir baglayici, (c) Bir VH domeni, CHl domeni, bir mentese, bir CH2 domeni ve bir CH3 domeni içeren tam uzunluklu bir Agir zincir içeren tek zincirli bir polipeptid olup söz konusu polipeptid bir N-terminalden C-terminal yönünde birbirlerine göre su sekilde konumlandirilmis olan hafif ve agir zincirlerin domenlerini içerir: VL-CL-CL7VH baglayici-VH-CHl-mentese-CHZ-CH3. 25. bir uygulamada ve 24. uygulamaya göre, tek Zincirli polipeptid ayrica bir heteromultimerizasyon domeni içerir. 26. bir uygulamada ve 25. uygulamaya göre, heteromultimerizasyon domeni, bir delik (örnegin oyuk) ya da topuzdur (örnegin çikinti). 27. bir uygulamada ve 26. uygulamaya göre, birinci yarim antikor bir topuz içerdiginde ikinci yarim antikor bir delik içerir. 28. bir uygulamada ve 26. uygulamaya göre, birinci yarim antikor bir delik içerdiginde ikinci yarim antikor bir topuz içerir. 29. bir uygulamada ve 24. uygulamaya göre, baglayici, GGS tekrarlarini içerir. 30. bir uygulamada ve 24. uygulamaya göre, baglayici, -50 amino asittir. 31. bir uygulamada, mevcut bulus bir heteromultimerik protein üretmeye yönelik bir yöntem sunmakta olup söz konusu yöntem asagidakileri içerir: (a) Protein A ile saflastirilmis birinci bir mentese içeren polipeptidin elde edilmesi; (b) Protein A ile saflastirilmis ikinci bir mentese içeren polipeptidin elde edilmesi; (c) LHer bir mentese içeren polipeptidin pH'inin L-Arjinin varliginda 4 ila 9 arasinda ayarlanmasi; (d) Karma bir yarim antikor havuzu elde etmek üzere birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidin karistirilmasi ve birinci ve ikinci mentese içeren polipeptidi içeren bir heteromultimerik protein olusturmak üzere inkübe edilmesi. 32. bir uygulamada ve 31. uygulamaya göre, yarim antikorlardan en az biri, asagidakileri içeren tek Zincirli bir polipeptiddir: (a) Bir VL domeni ve bir CL domeni içeren tam uzunluklu.bir Hafif zincir; (b) Bir baglayici; (c) Bir VH domeni, CHl domeni, bir mentese, bir CH2 domeni ve bir CH3 domeni içeren tam uzunluklu bir Agir zincir. 33. bir uygulamada ve birinci uygulamaya göre, birinci mentese içeren polipeptid, hafif ve agir zincirlerin domenlerini içeren söz konusu polipeptid bir N-terminalden C-terminal yönünde birbirlerine göre su sekilde konumlandirilmis olan hafif ve agir zincirlerin domenlerini içerir: VL-CL-VH-CHl-mentese-CHZ-CH3. 34. bir uygulamada ve 33. uygulamaya.göre, tek polipeptid.zinciri ayrica bir baglayici içermekte olup burada söz konusu domenler bir N-terminalden C-terminal yönünde birbirlerine göre su sekilde konumlandirilir: VL-CL-baglayici-VH-CHl-mentese-CHZ-CH3. . bir uygulamada, mevcut bulus bir heteromultimer üretmeye yönelik bir yöntem sunmakta olup söz konusu yöntem, mentese içeren polipeptidlerin 4 ila 9 arasinda bir pH degerine sahip bir karisimini içeren bir L-arjinin sunmayi, zayif bir indirgeyici ilave etmeyi ve bir heteromultimer üretmeye olanak veren kosullar altinda inkübe etmeyi içerir. 36. bir uygulamada, mevcut bulus, bir yarim antikor eksprese etmek üzere islenmis bir konak hücre sunmakta olup söz konusu yarim antikor, bir baglayici, bir VL domeni, bir CL domeni, bir VH domeni, bir CHl domeni, bir mentese domeni, bir CH2 domeni ve bir CH3 domeni içeren tek Zincirli bir polipeptiddir ve burada söz konusu domenler bir N-terminalden C-terminal yönünde birbirlerine göre su sekilde konumlandirilir: VL-CL-baglayici-VH-CHl-mentese-CHZ-CH3. 37. bir uygulamada ve 36. uygulamaya göre, tek polipeptid zinciri ayrica bir heterodimerizasyon domeni içerir. 38. bir uygulamada ve 36. veya 37. uygulamaya göre, konak hücre, prokaryotik hücreler, ökaryotik hücreler, memeli hücreleri veya bitki hücrelerinden seçilir. 39. bir uygulamada ve 38. uygulamaya göre, konak hücre bir prokaryotik hücredir. 40. bir uygulamada ve 39. uygulamaya göre, prokaryotik hücre bir E. Coli hücresidir. 41. bir uygulamada ve 40. uygulamaya göre, E.coli hücresi, Ipp açisindan yetersizdir. 42. bir uygulamada ve 38. uygulamaya göre, konak hücrelairinemeli hücresidiru 43. bir uygulamada\K34l. uygulamaya göre, memeli hücresi bir CHO hücresidir. 44. bir uygulamada ve 36. veya 37. uygulamaya göre, konak hücre, tek Zincirli yarim antikoru kodlayan bir vektör içerir. 45. bir uygulamada ve 36. veya 37. uygulamaya göre, yarim antikor ayrica bir heterodimerizasyon domeni içerir. 46. bir uygulamada ve 45. uygulamaya göre, heterodimerizasyon domeni, bir topuz, bir delik, homodimer olusumu için elektrostatik olarak elverisli olmayan ancak heterodimer olusumu için elektrostatik olarak elverisli olan ara yüzeydeki bir veya daha fazla yüklü amino asit, molekül içi iyonik etkilesimleri güçlendirmek için degistirilmis bir veya daha fazla amino asit, bir sarili sarmal ve bir lösin fermuar arasindan seçilir. 47. bir uygulamada, mevcut bulus, birinci bir tek Zincirli yarim antikoru eksprese etmek üzere islenmis birinci bir konak hücreyi ve bir PC bilesenini eksprese etmek üzere islenmis ikinci bir konak hücreyi içeren bir konak hücre karisimini sunar. 48. bir uygulamada ve 36. uygulamaya göre, bir konak hücre tarafindan üretilen yarim antikor bir heterodimerizasyon domeni içerir. Asagidaki deneysel açiklamalarda, su kisaltmalar geçerlidir: eq (esdeger); M (Molar); pM (mikromolar); N (Normal); mol (mol): mmol (milimol); pmol (mikromol); nmol (nanomol); g (gram); mg (miligram); kg (kilogram); ug (mikrogram); L (litre); ml (mililitre); pl (mikrolitre); cm (santimetre): mm (milimetre): um (mikrometre); nm (nanometre); °C. (Santigrat derece): 5 (saat); dk (dakika); sn (saniye); ms (milisaniye). Örnekler Mevcut bulus, herhangi bir sekilde mevcut bulusun kapsamini sinirlama amaci tasimayan asagidaki örneklerde daha ayrintili olarak tarif edilir. Ekteki Sekiller, mevcut bulusun açiklamasinin ve tarifinin ayrilmaz parçalari olarak düsünülmelidir. Örnek 1: Ekspresyon & Saflastirma Bu örnek, yarim antikorlarin ekspresyonunu ve saflastirilmasini gösterir. E. coli'de yarim antikorlarin örnek niteligindeki yapilandirma ve ekspresyon yöntemleri, örnegin, U.S. 20ll/OZ87009 sayili birlikte beklemede olan basvuruda bulunabilmektedir. Kültür ve ekspresyon kosullarini modifiye etme ve ayarlama teknikte uzmanliga sahip bir kisinin kabiliyeti dahilindedir. E. coli hücrelerinde yarim antikorlarin ekspresyonu Ekspresyon plazmitlerinin yapilandirmasi Agir ve hafif zincir DNA.kodlama.sekanslari, sekanslaririher biri için ayri promotör elemanlari içeren ekspresyon plazmidi ve ekspresyon plazmidini içeren bakteriyel hücrelerin seçimi için antibiyotik direncine klonlanmistir. Vektör yapilari ayrica, antikor polipeptidlerinin bakteri hücresinin periplazmik alanina aktarilmasi için isiya dayanikli enterotoksin II (STII) salgilama sinyalini de kodlar (Picken ve dig., 1983, Infect. 42:264-268). Her bir zincirin transkripsiyonu, phoA promotörü ile kontrol edilir (Kikuchi ve dig., 1981, Nucleic Acids Res., 9:5671-5678) ve translasyonel kontrol, ölçülen göreceli translasyonel dayanikliligin, translasyon baslatma bölgesinde (TIR) sessiz kodon degisikliklerini içeren daha önce tarif edilmis STII sinyal sekansi varyantlari tarafindan saglanir Her bir yarim antikor, U.S. Pat. No. 7,642,228 sayili belgede tarif edilen sekilde agir zincirin içine islenmis bir topuz (çikinti) ya da bir delik (oyuk) bulundurmustur. Özetle, ilk olarak bir CH3 topuz mutanti üretilmistir. Daha sonra bir CH3 delik mutanti kütüphanesi, ortak CH3 domeni üzerindeki topuza yakin olan 366, 368 ve 407 kalintilarinin rastgele dagitilmasi ile olusturulmustur. Asagidaki örneklerde, topuz mutasyonu ve Y407V mutasyonlarini bulundurmustur. Diger immünoglobülin izotiplerindeki esdeger mutasyonlar, teknikte uzman bir kisi tarafindan yapilabilmektedir. Ayrica, teknikte uzman bir kisi, bispesifikler için kullanilan iki yarim antikorun ayni izotip olmasinin tercih edildigini kolaylikla takdir edecektir. Ekspresyon ve saflastirma Topuz ya da delik mutasyonlarini içeren yarim antikorlar, örnegin E.coli gibi bakteriyel bir konak hücrede agir ve hafif zincir yapilarini eksprese ederek ayri kültürlerde üretilmistir . Ekspresyon plazmitleri, : ilvG+.DELTA.prc spr43Hl .DELTA.degP .DELTA.manA lacl.sup.q .DELTA.ompT) E. Coli konak suslarina dahil edilmistir ve transformantlar LB plakalari içeren karbenisilinde seçilmistir. Daha.sonra transformantlar, karbenisilin içeren bir LBloaslatici kültürünü inoküle etmek için kullanilmistir* ve bu 30°C'de çalkalanarak gece boyunca yetistirilmistir. Baslatici kültür, karbenisilin içeren bir fosfat sinirlayici ortam C.R.A.P'ye seyreltilmistir ve kültür 30°C'de çalkalanarak 24 saat boyunca yetistirilmistir. Kültürler santrifüje edilmistir` ve hücre peletleri antikor saflastirmasi baslangicina kadar dondurulmustur. Peletler çözülmüs ve her 5 gramlik hücre peleti için 100 mL'lik.bir haciniila agirlik orani ile hidroklorik.asit, l25 mM NaCl ve 5 mM EDTA (TEB ya da Tris Ekstraksiyon Tamponu) ile pH degeri 7.5'e ayarlanmis 25 mM Tris-baz içeren. bir ekstraksiyon tamponunda yeniden süspanse edilmis ve yeniden süspanse edilmis karisima bir Microfluidics Corporation modeli llOF mikro-akiskanlastirici (Newton,Mass.) araciligiyla üç kez nüfuz edilmesi ile mikroakiskanlar kullanarak hücrelerin parçalanmasi ile ekstrakte edilmistir. Daha sonra bakteri hücresi ekstrakti 15.000Xg'de 20 dakika boyunca santrifügasyon yoluyla arindirilmistir ve üst faz toplanmis ve saflastirma öncesinde bir 0,22 mikron asetat filtresi ile filtrelenmistir. Her bir yarim antikor, Protein A afinite kromatografisi ile ayri ayri saflastirilmistir. Topuz yarim antikorundan arindirilmis hücre ekstraktlari, 2 mL/dk'da GE Healthcare'den (Pistcataway, N.J.) olan]3ir].ml HiTraçMABSELECI'SUREmdkolonuna yüklenmistir. Yüklemenin ardindan kolon, 40 mM sodyum sitrat, pH 6.0, 125 mM sodyum klorür ve 5 mM EDTA'lik 10 kolon hacmi (CV) ve ardindan katyon degistirme kolonu ile yakalamayi kolaylastirmak için pH 6.0'da 20 mM sodyum sitratlik 5 kolon hacmi ile yikanmistir. Afinitesi yakalanmis yariniantikorlar, 0,2 mM asetik asitlik (pH 2-3) 10 kolon hacmi (CV) ile elüt edilmistir. CHO hücrelerinde yarim antikorlarin ekspresyonu Ekspresyon plazmitlerinin yapilandirmasi. Agir zincir ve hafif zincir cDNA'lari, Sitomegalovirüs hemen erken gen promotörü ve güçlendiricisi (CMV) kontrolü altinda tutulmustur. Her bir CMV transkripsiyonel baslangiç bölgesini, nihai transkriptlerden çikarilmis intronlari tanimlayan birlesme verici ve alici sekanslari takip eder (Lucas ve dig., High-level production of recombinant.proteins in CHO cells using a dicistronic DHFR intron expression vector. Nucl. Acid Res. hatti gelisimi için seçim isaretleyicisi olarak kullanilmistir (Sanders ve dig., Amplification and cloning of the Chinese hamster glutamine synthetase gene. The EMBO J (1984) 3:65-71) ve SV4O erken promotör` ve güçlendiricisi kontrolü altinda tutulmustur. Hücre kültürü. CHO hücreleri, çalkalama siselerinde 37°C ve %5 CIh'de bir propriyete DMEM/FlZ-tabanli ortamda kültürlenmistir. Hücreler, her üç ila dört günde 3xlO5/mL'lik bir tohumlama yogunlugu ile geçirilmistir. Stabil transfeksiyon. CHO hücreleri, üreticinin tavsiyesine (Invitrogen, Carlsbad, CA) uygun olarak lipofektamin 2000 CD kullanilarak transfekte edilmistir. Transfekte edilmis hücreler, santrifüje edilmis ve çesitli konsantrasyonlardaki metionin sülfoksimin (MSX) ile DMEM/F-lZ-tabanli seçici (glutamin içermeyen) ortama tohumlanmistir. Tohumlamadan yaklasik üç hafta sonra, tek koloniler 96 kuyucuklu plakalara toplanmistir. Toplanan koloniler, ELISA analizi için üst fazin alinmasi ile antikor üretimi için degerlendirilmistir. Üst klonlar, ölçeklenmis ve antikor titrelerine, uygun metabolizmaya (esas olarak laktat tüketimi) ve kabul edilebilir ürün kalitesi özelliklerine göre degerlendirilmistir. Ekspresyon: Her bir yarim antikor, CHO hücrelerinde eksprese edilmistir. ZL kültürleri yetistirilmis ve hasat edilmistir. Yarim antikorlarin saflastirilmasi. Her bir yarim antikor, bir MABSELECT SURETM kolonu üzerinde yakalanmistir. Kolon daha sonra asagidaki tamponlarin 4 kolon hacmi (CV) ile yikanmistir: 50 mM TRIS pH 8.0, 150 mM NaCI'den olusan bir dengeleme tamponu ve 0,4M Potasyum Fosfat pH 7.0'dan olusan bir yikama tamponu. Her bir kol, pH 2.9'da 0,15 M Sodyum Asetat içine elüt edilmistir. Yarim antikorlarin yukarida tarif edilen ekspresyon ve saflastirma yöntemleri genel olarak farkli izotiplerin IgG'sine uygulanabilir. Örnek 2: Çözündürücü & pH tutmasi Asagidaki örnek, bir ara pH'taki yarim antikorlarin inkübasyonunun, konformasyon kaymasini nasil etkiledigini ve birlesme etkililigini nasil arttirdigini ve arjinin ve histidin gibi bir çözündürücü ilave edilmesinin, yarim antikorlarin ara pH ile indüklenmis çöktürmesini nasil azalttigini ayrintili olarak anlatir. Yarim antikor protein A havuzlari, normal olarak bir antikorun çözücüye maruz birakilmayan yüzeyinde bulunan hidrofobik.ekleri içermesi muhtemel olan CH2 ve CH3 domenlerinin maruz kalmis iç yüzeyi nedeniyle dogal olarak stabil degildir. Bu nedenle, pH 4'ten daha büyük bir degere ayarlandiginda, yarim antikor protein A havuzlari çökelme egilimi gösterir. Mevcut bulus sahipleri, mevcut olan minimum bir L-Arjinin konsantrasyonu (belirli örneklerde ZSOmM) ile yarim antikorun stabilize edildigini ve pH ayarlamasi sonrasinda çözelti içinde kaldigini kesfetmislerdir. Arjinin gibi bir çözündürücünün ilave edilmesi, yarim antikoru Çözelti içinde muhafaza etmis, pH ayarlamasi sonrasinda bulanikligi azaltmis ve bispesifik birlesme verimini arttirmistir. Bkz. Sekil 3. Arjinin ayrica bispesifik yarim antikorlari da korumus ve donma esnasinda agregasyon olusturmaktan bispesifigi saflastirilmistir. Histidinde de benzer çöktürme-azaltici etki görülmüstür. Bu örnegin baslangiç materyali olarak Örnek l'deki Protein A kolonlarindan elde edilen geri kazanilmis protein kullanilmistir. Protein A ile saflastirilmis proteine 50-600 mM'lik nihai bir konsantrasyona L-Arjinin (lM, pH 9) ilave edilmistir. Çözelti daha sonra gerektigi gibi 1,5M Tris Baz, pH ll kullanilarak daha yüksek bir pH'a titre edilmistir. Protein A kolonundan asidik elüsyon sontasinda ara pH degerine yükselme asamasi, ara pH tutmasi olarak adlandirilir. CH3 domenindeki topuz ve delik mutasyonlarina bagli olarak bispesifik antikorlar, standart antikorlara kiyasla farkli derecelerde esneklige sahiptir. Bu essiz esnekligin ve CH2 ve CH3 domenlerinin maruz kalmis iç yüzeylerinin bir sonucu olarak, yarim antikorlarin pH ayarlamasi sonrasinda konformasyonel kaymalara ugradigi görülmüstür. Bkz. Sekil 2. Bu deneyde, pH 4'ten daha büyük bir degere ayarlandiginda, topuzlar monomerden kovalent olmayan.baglantili homodimere olan bir kaymaya maruz kalmislardir. Bkz. Sekil 2B. Delikler,Boyut Dislamali Kromatografi alikonma süresine dayali olarak daha küçük bir hidrodinamik yariçaptan daha büyük bir hidrodinamik yariçapa dogru bir konformasyon kaymasina maruz kalmistir. Kayma, pH 5'te1neydana.gelmistir`vegüi2'7kaymanin'tamamlanmasina Antikorlarin agregasyonunu ve oligomerik durumunu belirlemeye yönelik boyut dislamali kromatografi (SEC), HPLC kromatografisi ile gerçeklestirilmistir. Özetle, Protein A ile saflastirilmis antikorlar, bir Agilent HPLC 1200 sistemi üzerindeki bir Tosoh TSKjel SWZOOO kolonuna uygulanmistir. Protein (E. coli'de üretilen IgGl yarim antikoru), 0,5 mL/dk'lik bir akis hizinda 0,2M K3PO4 0,25M KCI pH 6.2 ile elüt edilmistir. Elüt edilmis protein, UV absorbansi ve pik alanlarin entegrasyonu ile ölçülmüstür. Bkz. Sekiller 2 A & B. Bu kayma, yarim antikorun daha yüksek esnekliginden, özellikle de CH3 domenindeki mutasyonlara sahip olan topuz ve delik yarim antikorlarindan dolayi, pH degisimiyle indüklenen bir katlanma ara ürününü temsil edebilir. Bununla birlikte, ara pH tutmasi, yarim antikorlarin çöktürmesine neden olabilir. Sekil 3A'da gösterildigi gibi, arjinin varligi, Protein A ile saflastirilmis IgGl topuz yarim antikorlarinin pH ile indüklenen bulanikligini azaltmistir. Bu deneyde, E. 0011 tarafindan üretilen IgGl yariniantikoru Protein A havuzlarindaki pH'i titre etmek için lM arjinin kullanilmistir. Nihai arjinin konsantrasyonu, pH 5.5'e kadar titre edildiginde yaklasik 50 mM, pH 7.5'de yaklasik 200 mM ve pH 8.5'de yaklasik . Arjinin varligi ayni zamanda delik-içine-topuz bispesifik antikorunun birlesme verimini %15 arttirmistir (veriler gösterilmemistir). Benzer sekilde, histidin çöktürme nedeniyle pH ile indüklenen bulanikligi azaltabilmistir. Bir "topuz" IgGl yarim antikoru, bir MABSELECT SÜRETM kolonu üzerinde E. coli homojenattan saflastirilmistir ve 12 g/L'lik bir yarim antikor konsantrasyonuna sahip bir Protein A havuzu ile sonuçlanmistir. Arjinin-Hidroklorür veya Histidin-Hidroklorürün dörtte bir hacmi, "Yok" kontrolü için ilave edilmis esdeger bir saflastirilmis su hacmi ile, 200 mM'lik nihai bir ilave konsantrasyonuna ilave edilmistir. Numune pH'i, konsantre Sodyumr Hidroksit'in› (%50 w/V NaOH çözeltisi veya 19,1 N) damlatilarak ilave edilmesiyle arttirilmis ve veri noktalari kaydedilmistiri Ph, bir Orion Ross 8l-O3Inikroprobu kullanilarak ölçülmüstür. Çözeltinin bulanikligi, bir Hach 2100 laboratuvar bulaniklik ölçer kullanilarak ölçülmüstür. Sekil 3B'deki veriler, arjinin (, E. coli'den izole edilen IgGl'de pH ile indüklenen çöktürmeyi azalttigini göstermistir. Özetle, ara pH, yarim antikor konformasyon kaymasini bispesifik birlesmenin lehine olacak sekilde azaltmistir ve ara pH bekletme asamasina ilave edilen bir çözündürücü, pH ile indüklenen çöktürmeyi azaltmistir. Örnek 3: Indirgeme Asagidaki örnek, bir indirgeyici kosulun kullaniminin, istenen heteromultimerin, örnegin bir bispesifik antikorun, daha fazla olusumuna neden olacak sekilde agregasyonu nasil azalttigini ayrintili olarak.açiklar. Örnegin, bir birlesme karisimina ilave edilen glutatyon, delik-içine-topuz bispesifik birlesmesi için avantajli olan zayif bir indirgeyici kosul yaratir. BMEA (Beta-MerkaptoEtilAmin) gibi benzer bir siniftaki diger indirgeyiciler benzer bir etkiye sahip olabilir. Agregasyon, bispesifik olusturmak üzere topuz ve delik yarim antikorlarinin birlesmesi esnasinda meydana gelebilmektedir. Artan glutatyon seviyeleri, birlesme esnasinda agregasyon miktarini en aza indirir. Aksine, yüksek konsantrasyonlardaki DTT gibi güçlü indirgeyiciler bazen agregasyonu arttirabilir. Spesifik mekanizmalar ile sinirli kalmaksizin, disülfit baglarini kalici olarak indirgemek yerine glutatyon, uygun disülfit olusumu için katalizör görevi gören disülfitleri karistirir. Glutatyon birlesmeleri ile, güçlü bir indirgeyici kullanildiginda tekrar oksidasyon için gerekli oldugu gibi, ilgili bispesifik üründeki mentese bölgesi disülfitlerini olusturmak amaciyla bir tampon degisinü gerekmez. Glutatyon gibi zayif bir indirgeyici kullanildiginda kimyasal re-oksidanin ilave edilmesi gerekli degildir. Glutatyon konsantrasyonlari, molarite açisindan veya birlesme karisimi içindeki mevcut mentese içeren polipeptidlerin veya yarim antikorlarin miktarina göre molar oran açisindan eksprese edilebilmektedir. Birlesme karisimindaki protein konsantrasyonu için indirgeyici kontrollerin bir hedef molar oraninin kullanilmasi; bu, degisken protein konsantrasyonlarinin bir sonucu olarak asiri indirgemeyi veya az indirgemeyi önler. Bu örnekte, 2 ila 200X molar fazlalikta karma yarim antikorlara glutatyon ilave edilmistir. Numuneler oda sicakliginda 46 saat boyunca inkübe edilmistir. RP-HPLC'de (ters fazli yüksek performansli sivi kromatografisi) tüm numuneler, 1,0 mg/ml'lik bir maksimum konsantrasyona %0,1 Trifloroasetik Asit ile seyreltilmistir. Protein konsantrasyonu 280 nm'de fotometrik ölçümlerle belirlenmistir. Numune analizi öncesinde %0,l Trifloroasetik› Asitli dört numune enjekte edilmistir. Bu, kolonun tamamen dengelenmis olmasini saglamistir. Protein A ile saflastirilmis E coli ile üretilen IgGl yarim antikorlari, bir Agilent HPLC 1200 sistemi üzerindeki bir Poros R2/2O 2.1 mmD x 20mmL'ye uygulanmistir. Protein, 0,5 mL/dk'lik bir akis hizinda dakika içinde %0,09 Trifloroasetik Asit %80 Asetonitrile (Tampon B) %38 - 49'luk Tampon A dogrusal bir gradiyent ile elüt edilmistir. Elüt edilmis protein, UV absorbansi.ve pik alanlarin entegrasyonu ile ölçülmüstür. Sekil 4A'da gösterildigi gibi, bispesifik olusum seviyesi, artmis glutatyon:Ab molar orani ile artmistir. Bkz. Sekil 4A. Antikorlarin agregasyonunu ve oligomerik durumunu belirlemeye yönelik boyut dislamali kromatografi (SEC) gerçeklestirilmistir. Özetle, Protein A ile saflastirilmis E coli ile üretilen IgGl yarim antikorlari, bir Agilent HPLC 1200 sistemi üzerindeki bir Tosoh TSKjel SWZOOO kolonuna uygulanmistir. Protein, 0,5 mL/dk'lik bir akis hizinda 0,2M K3PO4 0,25NIKCI pH 6.2 ile elüt edilmistir. Elüt edilmis protein, UV absorbansi ve pik alanlarin entegrasyonu ile ölçülmüstür. Gözlenen 150kD'lik pikin, bispesifik antikorun olusumuna bagli oldugu dogrulanmistir. Bkz. Sekil 4B. Görülebilecegi üzere, istenmeyen monomerlerden (baska bir ifadeyle yarim antikorlar, topuz veya delik) ve homodimerlerden heteromultimere, baska bir ifadeyle bir bispesifik antikor, dogru.piklerde bir kayma vardir (Sekil 4AKK2B). Özetle, veriler, glutatyon ila yarim antikorlar molar oraninin artmasinin agregasyonu indirgedigini ve bispesifik olusumunu gelistirdigini gösterir (Sekil 43). Örnek 4: Sicaklik Bu örnek, sicakligin, yarim antikorlarin stabilitesi ve heteromultimer birlesimi üzerindeki etkisini gösterir. Yarim antikorlarin çözeltisinin sicakligi, birlesme hizi üzerinde önemli bir etkiye sahip olmustur. Daha yüksek sicaklikta E. coli ile üretilen IgGl yarim antikorlarinin gelistirilmis birlesmesinin bir örnegi, Sekil 5A'da gösterilmistir. Sicakligin bispesifik birlesme üzerindeki etkisini gösteren baska bir örnek, Sekil 5B'de gösterilmistir. Bu deneyde, E. coli'de iki IgGl yarim antikoru üretilmistir` ve bu yarim antikorlar Örnek 1'de tarif edilen sekilde Protein A ile saflastirilmistir. Yariniantikorlar birlestirilmistir ve isitma ve/veya ara pH tutmasi ile veya olmaksizin farkli kosullar altinda bispesifik birlesmeyi test etmek için dört alikuota ayrilmistir. Sekil 5B'de gösterildigi gibi, degisen kosullar altinda bir glutatyonun 200 molar fazlaligi, bispesifik IgGl antikor olusum hizini arttirmistir. Kontrol kosullari (oda sicakligi, yaklasik °C, yarim antikor pH 4'te tutulmustur, ara pH tutmasi olmamistir), daha yavas bir hizda olsa bile bispesifik birlesmeye olanak saglamistir. Protein A ile saflastirilmis yarim.antikorlari 16 saat boyunca oda sicakliginda bir ara pH'da (topuz yarim antikoru için pH 5; delik yarim antikoru için pH 7) tutma, daha yüksek.bir sicakliga ulasmadan bispesifik antikor olusum hizini arttirmistir (birlesme karisimi Sekil 5B'deki asamasi olmadan sicakligi 37°C'ye yükseltmek, kontrol üzerindeki bispesifik antikor birlesme hizini arttirmistir ve bir pH tutma asamasi ve oda sicakliginda yapilan birlesmeye göre nispeten daha hizli olmustur. Bununla birlikte, en hizli birlesme hizi, Protein A ile saflastirilmis yarim antikorlar, bir ara pH'da tutuldugunda (yukaridaki gibi), daha sonra, yüksek bir sicaklikta (baska bir ifadeyle 37°C) pH 8.5'de birlestirildiginde görülmüstür. Bu kosul altinda, bispesifik birlesmenin yaklasik %80'i, sadece yaklasik 6 saatte gerçeklestirilmistir (Sekil SB). Özetle, toplam birlesme hizi isitma ile arttirilmistir ve pH tutmasi ve isitma, birlesme uzerinde sinerjik bir etkiye sahip olmustur. antikorunda da görülmüstür. Sekil GB'ye ait sonuçlar, PVP ve histidin varliginda, E. coli kültürü tarafindan üretilen isitilmis IgG4 yarim antikorlarinin, E. coli ile üretilen IgGl yarim antikorlarinin birlesmesine benzer birlesme sonuçlarina ulastigini gösterir. Bispesifik miktari, yukarida tarif edildigi gibi ters fazli HPLC kullanilarak analiz edilmistir. Birlikte ele alindiginda, veriler, isitmanin bispesifik olusumu kolaylastirdigini göstermistir. Örnek 5: Stabilizörler Asagidaki örnek, stabilizörlerin, birlesme ve/veya ara pH tutmasi esnasinda isitma ve/veya yüksek pH'in bir sonucu olarak agregasyonu nasil azaltabilecegini ayrintili olarak anlatir. Polivinilpirrolidon (PVP), bir pirolidon grubu ile suda çözünebilen yüksüz bir polimerdir. PVP, isitilmis birlesme esnasinda agregasyonu azaltmistir. Spesifik mekanizmalar ile sinirli kalmaksizin, PVP, bispesifigin katlanan bir ara ürününü stabilize etmek veya yariniantikorlari, bispesifigin hidrofobik ekleri ile etkilesime girerek, agregasyondan korumak için harekete geçebilmektedir. PVP'nin agregat olusumu üzerindeki etkisi, Örnek 3'te tarif edilen kosullar altinda SEC kullanilarak analiz edilmistir. PVP'nin ilave edilmesi, birlestirilmis havuzda bulunan yüksek moleküler agirlikli türleri (HMWS), PVP ilavesi olmaksizin Bkz. Sekil 6A" Tüninumuneler, 200 mM arjinin varliginda isitilan Daha sonra, IgG4 bispesifik antikor birlesmesi test edilmistir. Sekil 6B'de gösterildigi gibi, PVP ve histidin varliginda isitilmis birlesme, E. coli ile üretilen IgG4 bispesifik birlesmesini, Sekil 5A'da gösterilen E. coli ile üretilen gelistirmistir. Arjinin, hem isitilmis numunede hem de oda sicakligi numunesinde bir çözündürücü ve bir pH titranti olarak bulunmustur. PVP'ye ek olarak, bu asama esnasinda yariniantikoru stabilize etmek için isitilmis ara pH tutmasi asamasi öncesinde baska bir stabilizatör Histidin ilave edilmistir. Sonuçlar, PVP ve histidinin, IgG4 bispesifik birlesmesini IgGl bispesifik birlesmesine benzer seviyelere gelistirdigini gösterir (Sekil 6B'yi 5B ile karsilastirin). Sekil 6C, bir IgG4 bispesifik antikorunun isitilmis birlesmesi esnasinda PVP'nin HMWS olusumunu en aza indirdigi baska bir örnegi sunar. Yarim antikor Protein A havuzlarini isitma, bir ara pH'da inkübasyon sonrasinda yarim antikorlarin konformasyon kaymalarini hizlandirmistir. Ancak isitma, özellikle E.coli'de üretilen IgG4 yarim antikorlarindan IgG4 topuz ve delik bispesifik antikorlarinin birlesmesi için agregasyona neden olabilmektedir. Bu nedenle, lgG4 yarim antikorlari, birlesme esnasinda isitildiginda ilave çözündürücü ve/Veya stabilizatörler ilave edilmistir. E. coli IgG4 delik yarim antikorunun konformasyon kaymasi, oda sicakliginda 48 saatlik inkübasyon sonrasinda tespit edilmistir. IgG4 delik yarim antikorlari 37°C'de inkübe edildiginde, konformasyon kaymasi yaklasik üç saatte tespit edilmistir (veriler gösterilmemistir). Ancak isitma, SEC tarafindan belirlenen sekilde agregasyonda artisa neden olmustur. Bkz. Sekil 7, sol panel. Bu deneyde, histidin, yarim antikorlarin agregasyonunu azaltma üzerindeki etkisini test etmek için isitilmis ara pH tutmasi asamasi esnasinda ilave edilmistir. Sekil 7'de gösterildigi gibi, isitma esnasinda histidin varligi, yarim antikorlarin konformasyon kaymasini etkilemeden, agregasyon seviyesini, %ll yüksek moleküler agirlikli türlerden (HMWS, histidin yok) %6 HMWS'ye (200 mM histidin) indirmistir. Bu nedenle sonuçlar, bir stabilizörün, henibispesifik:antikorlariribirlesmesi hentde yariniantikorlarin ara.pH tutmasi esnasinda agregat olusumunu azalttigini gösterir. Örnek 6 - Birlesme Bu örnek, iki örnek niteligindeki immünoglobülin izotipi, baska bir ifadeyle IgGl ve IgG4 için protokoller sunar. Yarim antikorlar, iki farkli konakr hücreden birinde, baska bir ifadeyle E. coli ya da CHO, üretilmistir. Burada tarif edilen yöntemlerin, ayni veya farkli kaynaklarda üretilen diger antikor izotiplerine uygulanabilecegi anlasilmalidir. Protokolleri teknikteki bilgilere ve mevcut uygulamada açiklanan Ögretilere dayali olarak rutin deneylerle modifiye etme teknikte uzman bir kisinin kabiliyeti dahilindedir. Ayrica, birinci bir konak hücrede (örnegin CHO) üretilen bir yarim antikoru içeren bir antikor olusumunun, ikinci bir konak hücrede (örnegin E. coli) üretilen tamamlayici bir yariniantikor ile birlestirilebilecegi anlasilmalidir (veriler gösterilmemistir). Bu nedenle, örnegin, CHO'da üretilen bir topuz yarini antikoru, E. coli'de üretilen. bir delik yarim antikoru ile birlestirilebilir veya tam tersi olabilir. Bu örnekte tarif edilen birlesme prosedürlerinin dördü, 4 saat sonra platolanan ve birlesme esnasinda %lO'dan daha az agregat ve minimal agregasyon üreten birlesmeler ile sonuçlanmistir. A. E.coli'den IgGl: Yarim antikorlarin konformasyon degisimi: Protein A havuzlari 7'den daha az bir pH'da olsaydi, her iki yarim antikor havuzunun pH'i, lM Arjinin (pH 9) kullanilarak pH 7'ye ayarlanirdi ve her iki havuz da 3 saat boyunca 37°C'de inkübe edilirdi. Alternatif olarak, havuzlar oda sicakliginda 48 saat boyunca inkübe edilmistir. Havuzlar 48 saat veya daha fazla süre boyunca.pH 7'de ise, bu asamayi geçin. Çözeltiyi pH 7'ye getirmek için ilave edilen Arjinin miktari ölçülmüstür. (Hala sicak) Havuzlar birlestirilmis ve pH, lM Arjinin (pH 9) kullanilarak pH 8.5'e ayarlanmistir. Bu asamada ilave edilen Arjinin miktari ölçülmüstür. Arjininin nihai konsantrasyonu 0,5 M olana kadar ZM Arjinin (pH 8.5) ilave edilmistir. GSHzAb orani 200X olana kadar (örnegin: yarim antikorun her bir mg'si için 0,5 M Arjininde (nihai ilave edilmistir. Glutatyon yarim antikor çözeltisi, yarim. antikorlarin bir bispesifik antikora birlesmesini saglamak için 4 saat boyunca 37°C'de inkübe edilmistir. B. CHO'dan IgGl: Yukarida E. coli için tarif edilen sekilde birlestirilmistir. PH'in, ara.pH tutmasi için.pH 7'ye veya yukarisina yükseltilmesi gerekmeyebilir. Glutatyon eklendikten sonraki birlesme süresi 2 saat sonra tamamlanabilir. C. CHO'dan IgG4: Yukaridaki ile ayni kosullar altinda birlestirilmistir (CHO'dan D. E.coli'den IgG4: Yukaridaki protokolleri kullanarak E. coli'den IgG4 birlestirmesi, yüksek, baska bir ifadeyle ~% 35, agregat seviyeleri ile sonuçlanmistir. Bu, birlesme kosullarinin modifiye edilmesini gerektirmistir: 0,2 M histidin ve 50 mM Arjinin içeren bir Protein A havuz bilesiminin kabul edilebilir sonuçlar` verdigi saptanmistir (veriler gösterilmemistir). Böylece, nihai sonuç elde etmenin çesitli yollari arastirilmis ve kabul edilebilir sonuçlar elde etmek için belirlenmistir. Birinci yöntemde, 0.2 M His & 50 mM Arg içerecek sekilde Protein A.saflastirmasi esnasinda degistirilmis elüsyon.(pHiM ve yikama tamponlari (pH 7) kullanilmistir. Bu, 0,2M His ve 50 mM Arg, pH 4 içeren nihai Protein A havuzu ile sonuçlanmistir; bu, daha sonra 1,5 M Tris bazi (pH 11) kullanilarak pH 8'e titre edilmistir. Ikinci bir alternatif yöntemde, (0,8 M'lik bir çözünürlüge sahip) 0,8M'lik Histidin HCI çözeltisi kullanilmistir. Histidin HCl'nin üçte birlik bir hacmi, 0,2 M His'lik nihai bir konsantrasyona ulasmak için Protein A havuzuna/havuzlarina ilave edilmistir. Daha sonra l/40'lik bir ZM Arg hacmi ilave edilmistir. Üçüncü bir alternatif yöntem, Protein A havuzlarini 0,2 M His olmustur. Son bir alternatif yöntem, Histidinin dogrudan Protein A havuzuna/havuzlarina (31,03 g/L) ilave edilmesi ve daha sonra l/40'lik 2M Arg hacminin ilave edilmesi olmustur. 0,2 M Histidin ve 50 mM Arg içindeki %20 w/v'lik bir Spectrum PVP K-15 çözeltisinin bir çeyrek hacmi, Protein A havuzuna/havuzlarina ilave edilmistir. PVP'nin ayrica düsük glutatyon kosullari altinda IgGl için birlesme esnasinda agregasyonu en aza indirdigi de not edilmistir. Yarim antikorlarin konformasyon degisimi: Protein A havuzunun/havuzlarinin pH'lari, 0,2 M Histidin ve 50 mM Arg ve ayarlanmistir ve 3 saat boyunca 37°C'de inkübe edilmistir. Alternatif olarak, havuz(lar) oda sicakliginda 48 saat boyunca inkübe edilmistir. GSHzAb orani 200X olana kadar (örnegin: yarim antikorun her bir mg'si için 0,2 M Histidin, %4 PVP, 50mM Arjininde, nihai pH 8.0, 200 mM indirgenmis glutatyon (GSH) ilave edilmistir. Yarim antikor havuzlari birlestirilmemis olsaydi, bu noktada birlestirilirlerdi. Havuzlanmis yarim antikorlar, bispesifik antikorun olusumunu saglamak üzere 4 saat boyunca 37°C'de inkübe edilmistir. Bu noktada, yüzde bispesifik antikor platolanmistir. Bispesifik antikor miktari platolandiktan sonra, çözelti düsük sicaklikta saklanabilmekte veya sonraki kromatografi asamalarinda islenmek üzere daha düsük bir pH degerine ayarlanabilmektedir. Burada açiklanan yöntemler, bispesifik antikorlar gibi terapötik proteinlerin üretiminde kullanilir. <110 <120 <130 <150 <151 <150 <151 <150 <151 <150 <151 <160 <170 <210 <211 <212 <213 <220 <223 <220 <221 <222 <223 <220 SEKANS LISTESI GENENTECH, INC. ET AL. BISPESIFIK ANTIKORLARIN GELISTIRILMIS BIRLESMESI P4764R1-WO 61/676837 27.07.2012 61/560704 16.11.2011 61/546503 12.10.2011 61/545863 11.10.2011 Patentln versiyon 3.5 Yapay Sekans Sentetik sekans MISC_FEATURE (2)..(2) X, herhangi bir amino asit kalintisidir <221 MISC_FEATURE <222 (4)..(4) <223 X, herhangi bir amino asit kalintisidir <400 1 TR