BR112014008684A2

BR112014008684A2 - métodos de produção de proteína heteromultimérica e composições

Info

Publication number: BR112014008684A2
Application number: BR112014008684A
Authority: BR
Inventors: Williams Ambrose; Lim Amy; Giese Glen; Persson Josefine; Scheer Justin
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2011-10-11
Filing date: 2012-10-11
Publication date: 2019-10-15
Also published as: KR102492792B1; HRP20240230T1; CN107266577B; KR20140082783A; JP2014534198A; US10626189B2; CN107266577A; HK1200844A1; KR102219217B1; US20140336361A1; KR102106002B1; US20180162955A1; ES2971444T3; EP2766397B1; EP3418306A1; RU2014118743A; HUE065876T2; HK1202878A1; US20200317820A1; KR20200046129A

Abstract

métodos de produção de proteína heteromul timérica ecomposições [00,1] são descritos no presente métodos de produção eficiente de uma proteína heteromultimérica, tal como um anticorpo biespecífico. proteínas heteromultiméricas podem ser capazes de ligar-se especificamente a mais de uma molécula alvo ou diferentes epítopos sobre uma única molécula alvo. os · métodos modulam parâmetros para aprimorar a montagem das proteínas heteromultiméricas em rendimento e eficiência mais alta que o possível de outra forma. também são descritas composições que compreendem um polipeptídeo que contém articulação, tal como um meio anticorpo.

Description

“MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA HETEROMULTIMÉRICA E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ANTICORPO BIESPECÍFICO” [001] A presente invenção refere-se e reivindica o benefício de prioridade dos Pedidos de Patente Provisórios Norte-Americanos com números de série 61/545863, depositado em 11 de outubro de 2011, 61/546503, depositado em 12 de outubro de 2011, 61/560704, depositado em 16 de novembro de 2011, e 61/676837, depositado em 27 de julho de 2012. O relatório descritivo de cada um dos Pedidos Provisórios mencionados acima é integralmente incorporado ao presente como referência.

Campo da Invenção [002] O presente relatório descritivo refere-se a composições e métodos aprimorados de montagem de proteínas heteromultiméricas tais como anticorpos biespecíficos.

Antecedentes da Invenção [003] Anticorpos monoclonais do tipo IgG contêm dois braços de ligação de antígenos idênticos e um domínio constante (Fc). Anticorpos com especificidade diferente nos seus braços de ligação normalmente não ocorrem na natureza e, portanto, necessitam ser elaborados com o auxílio de engenharia química (tal como reticula química etc.), DNA recombinante e/ou tecnologia de fusão celular.

[004] Anticorpos biespecíficos podem ligar simultaneamente dois antígenos diferentes. Esta propriedade permite o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que não são possíveis com anticorpos monoclonais convencionais. O grande quadro de formatos de anticorpos biespecíficos imaginativos que foi desenvolvido reflete o forte interesse por essas moléculas. Vide Berg, J., Lotscher, E., Steimer, K. S. et al, Bispecific Antibodies that Mediate Killing of Cells Infected with Human Immunodeficiency Virus of Any Strain, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991) 88 (11): 4723-4727 e Fischer, N. e

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Leger, 0., Biospecific Antibodies: Molecules that Enable Novel Therapeutic Strategies, Pathobiology (2007) 74: 3-14.

[005] Outra classe de moléculas multiespecíficas são proteínas de fusão recombinantes. Proteínas de fusão recombinantes que consistem do domínio extracelular de proteínas imunorreguladoras e o domínio constante (Fc) de imunoglobulina (Ig) representam uma classe crescente de produtos terapêuticos humanos. Imunoadesinas combinam a região de ligação de uma sequência de proteínas, com especificidade desejada, com o domínio efetor de um anticorpo. Imunoadesinas possuem duas propriedades importantes que são significativas para o seu potencial como agentes terapêuticos: a especificidade alvo e a estabilidade farmacocinética (meia vida in vivo que é comparável com a de anticorpos). Imunoadesinas podem ser utilizadas como antagonistas para inibir ou bloquear interações prejudiciais ou como agonistas para imitar ou amplificar reações fisiológicas. Vide Chamow, S. M., Zhang, D. Z, Tan, X. Y. et al, A Humanized, Bispecific Immunoadhesin-Antibody that Retargets CD3+ Effectors to Kill HIV-1 Infected Cells, J. Hematother. 1995; 4 (5): 439-446.

[006] Outras moléculas multiespecíficas foram discutidas em outras publicações. Exemplos incluem, mas sem limitações: Fisher et al, Pathobiology (2007) 74: 3-14 (análise de diversos formatos biespecíficos); Patente Norte-Americana n° 6.660.843, emitida em nove de dezembro de 2003 para Feige et al (corpos de peptídeos); Patente Norte-Americana Publicada n° 2002-004587, publicada em dez de janeiro de 2002 (anticorpos multiespecíficos); Patente Norte-Americana n° 7.612.181, emitida em três de novembro de 2009 para Wu et al (formato de domínio variável duplo); Patente Norte-Americana n° 6.534.628, Nord, K. et al, Prot. Eng. (1995) 8: 601-608, Nord, K. et al, Nat. Biotech. (1997) 15: 772-777 e Grõnwall et al, Biotechnol. Appl. Biochem. (2008), junho; 50 (Pt 2): 97-112 (corpos de afinidade); Martens et al, Clin. Cancer Res. (2006), 12: 6144-6152 e Jin et al, Cancer Res. (2008)

3/118 (11): 4360-4368 (anticorpos com um braço); Bostrom et al, Science (2009) 323: 1610-1614 (Fab de dupla ação, também conhecido como anticorpos de valência misturada). Outros formatos são conhecidos dos técnicos no assunto.

[007] A fabricação de material em grau clínico permanece um desafio para anticorpos de forma geral e especialmente para as moléculas multiespecíficas descritas acima. Conforme indicado acima, existem muitos processos de produção de moléculas com braços de ligação misturados, ou seja, braços de ligação que não são idênticos entre si. Cada um desses métodos possui, entretanto, as suas desvantagens.

[008] A reticula química requer trabalho intensivo, pois a substância relevante pode ainda necessitar ser purificada a partir de homodímeros e outros subprodutos indesejáveis. Além disso, as etapas de modificação química podem alterar a integridade das proteínas, de forma a gerar baixa estabilidade. Desta forma, este método frequentemente é ineficiente e pode gerar perda de atividade de anticorpos.

[009] Tecnologia de fusão celular (tal como hibridomas híbridos) expressam duas cadeias leves e duas pesadas que se montam aleatoriamente, levando à geração de dez combinações de anticorpos. Os anticorpos heteromultiméricos desejados são apenas uma pequena fração dos anticorpos produzidos desta forma. A purificação das proteínas heteromultiméricas desejadas reduz dramaticamente os rendimentos de produção e aumenta os custos de fabricação.

[010] Métodos de DNA recombinante vêm sendo utilizados para gerar diversos formatos heteomultiméricos, tais como Fv de fita simples, diacorpos etc., que não compreendem um domínio Fc. Uma desvantagem importante deste tipo de molécula de anticorpo é a falta do domínio Fc e, portanto, a capacidade do anticorpo de acionar uma função efetora (tal como ativação de complementos, ligação de receptor Fc etc.). Desta forma, é

4/118 desejado um anticorpo biespecífico que compreende um domínio Fc funcional.

[011] Métodos de DNA recombinante também vêm sendo utilizados para gerar anticorpos biespecíficos de “botão em orifício”. Vide o Pedido de Patente Norte-Americano n^Q 20030078385 (Arathoon et al Genentech). Uma restrição desta estratégia é o fato de que as cadeias leves dos dois anticorpos parentais necessitam ser idênticas para evitar desemparelhamento e a formação de moléculas inativas e/ou indesejadas quando expressas na mesma célula.

[012] Além disso, um dos eventos limitadores durante a combinação e a purificação é a eficiência de redox. Heterodímero oxidado tipicamente compõe apenas 70-80% da proteína após esta etapa (BioAnalyzer e MS-TOF). Os 20-30% restantes de anticorpo são diméricos e não possuem ligação covalente (SEC-LLS). Isso pode ser removido, mas apresenta impacto significativo sobre os rendimentos gerais. Desta forma, permanece a necessidade de aumentar o rendimento geral da produção de anticorpos, especialmente heterodímeros. São descritos no presente métodos que podem aumentar o rendimento geral de anticorpos biespecíficos, heterodímeros e similares. Estes e outros aspectos e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir do relatório descritivo da invenção fornecido no presente.

Descrição Resumida da Invenção [013] A produção de proteínas heteromultiméricas montadas a partir de dois ou mais polipeptídeos que contêm articulações, tais como anticorpos multiespecíficos de dois ou mais meio-anticorpos, utilizando métodos atuais, apresenta desvantagens, que incluem a fabricação de uma mistura de produtos, redução do rendimento e redução/eliminação da função efetora, entre outras. Além disso, agregação e precipitação frequentemente ocorrem durante a preparação de cada polipeptídeo que contém articulação e durante a montagem ou combinação dos heteromultímeros. A agregação e a

5/118 precipitação podem reduzir muito o rendimento do heteromultímero desejado. É desejável, portanto, produzir proteínas heteromultiméricas mais eficientemente e em níveis mais altos.

[014] São descritos no presente métodos/processos de produção eficientes para a produção econômica de proteínas heteromultiméricas, tais como anticorpos multiespecíficos, utilizando ou modulando um ou mais dos seguintes, incluindo, sem limitações: um estabilizante, um solubilizante, uma condição de redução, pH selecionado, temperatura selecionada etc. Os métodos de acordo com a presente invenção aqui descritos reduziram a perda de proteína na preparação e/ou agregação e aumentaram o rendimento geral da produção de proteínas heteromultiméricas, como a produção de anticorpos biespecíficos.

[015] Em um aspecto, é fornecido um método de produção de proteína heteromultimérica, em que o mencionado método compreende:

a. fornecimento de um primeiro polipeptídeo que contém articulação sob pH 4-9, preferencialmente 5-9, na presença de um primeiro solubilizante, em que o primeiro polipeptídeo que contém articulação compreende um domínio de heteromultimerização;

b. fornecimento de um segundo polipeptídeo que contém articulação sob pH 4-9, preferencialmente 5-9, na presença de um segundo solubilizante, em que o segundo polipeptídeo que contém articulação compreende um domínio de heteromultimerização;

c. mistura dos primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação em condição redutora para formar uma mistura de montagem (assembly mixture)·, e

d. incubação da mistura de montagem para formar ou produzir uma proteína heteromultimérica que compreende os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação, em que o primeiro polipeptídeo

6/118 que contém articulação interage com o segundo polipeptídeo que contém articulação no domínio de heteromultimerização.

[016] Em certas realizações deste aspecto, a etapa a e/ou a etapa b é precedida pela etapa de purificação do primeiro e/ou do segundo polipeptídeo que contém articulação. Em certas realizações específicas, o primeiro e/ou o segundo polipeptídeo que contém articulação é purificado por Proteína A.

[017] Em outro aspecto, é fornecido um método de formação ou produção de anticorpos biespecíficos, em que o mencionado método compreende:

a. fornecimento de um primeiro meio-anticorpo sob pH 4-9, preferencialmente 5-9, na presença de um primeiro solubilizante, em que o primeiro meio-anticorpo compreende um domínio de heteromultimerização;

b. fornecimento de um segundo meio-anticorpo sob pH 4-9, preferencialmente 5-9, na presença de um segundo solubilizante, em que o segundo meio-anticorpo compreende um domínio de heteromultimerização;

c. mistura dos primeiro e segundo meio-anticorpos em condição redutora para formar uma mistura de montagem; e

d. incubação da mistura de montagem para formar ou produzir um anticorpo biespecífico que compreende os primeiro e segundo meio-anticorpos, em que o primeiro meio-anticorpo interage com o segundo meio-anticorpo no domínio de heteromultimerização.

[018] Em certas realizações deste aspecto, a etapa a e/ou a etapa b é precedida pela etapa de purificação do primeiro e/ou do segundo meio-anticorpo. Em certas realizações específicas, o primeiro e/ou o segundo meio-anticorpo é purificado por Proteína A.

[019] Em um aspecto adicional, é fornecido um método de produção de heteromultímeros, em que o mencionado método compreende o

7/118 fornecimento de uma mistura que contém arginina de polipeptídeos que contêm articulação, em que a mencionada mistura possui pH de 4 a 9, preferencialmente 5-9, adição de um redutor fraco e incubação sob condições de produção de heteromultímeros.

[020] Em ainda outro aspecto, é fornecido um método de produção de proteína heteromultimérica, em que o mencionado método compreende:

a. obtenção de um primeiro polipeptídeo que contém articulação purificado por proteína A;

b. obtenção de um segundo polipeptídeo que contém articulação purificado por proteína A;

c. ajuste do pH de cada meio-anticorpo em 4 a 9;

d. mistura dos primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação para obter uma mistura de montagem;

e. adição de excesso molar de um redutor fraco à mistura de montagem; e

f. incubação da mistura de montagem para formar uma proteína heteromultimérica que compreende os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação.

[021] Em outro aspecto, é fornecido um método de produção de proteína heteromultimérica, em que o mencionado método compreende:

c. ajuste do pH de cada polipeptídeo que contém articulação em 4 até 9 na presença de L-arginina;

d. mistura dos primeiro e segundo polipeptídeos que contêm

8/118 articulação para obter um conjunto de polipeptídeo que contém articulação misturado; e

e. incubação para formar uma proteína heteromultimérica que compreende os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação.

[022] Em certas realizações deste aspecto, o conjunto de polipeptídeo que contém articulação misturado é incubado em condição redutora. Em certas realizações, o polipeptídeo que contém articulação compreende um meio-anticorpo, imunoadesina ou seu fragmento funcional. Em algumas outras realizações, a arginina está presente em uma concentração de 20 mM a 1 M, 20 mM a 200 mM ou 50 mM a 200 mM. Em algumas outras realizações, PVP é adicionado à etapa d ou à etapa e. Em certas realizações, o pH é ajustado após a mistura.

[023] Os depositantes do presente descobriram inesperadamente que a manutenção de pH intermediário de um polipeptídeo que contém articulação tal como meio-anticorpo pode promover a alteração de conformação que melhorou a montagem subsequente dos polipeptídeos que contêm articulação. Em certas realizações, o pH intermediário é de pH 4 a 9, preferencialmente 5 a 9 ou pelo menos pH 5, pelo menos pH 5,5, pelo menos pH 5,7, pH maior que 5, pH maior que 5,5, pH maior que 5,7, de 5 a 9, 5 a 8, 5,5 a 8, 5,5 a 9, 5,7 a 8, 5,7 a 9, 6 a 8, 6 a 9, 7 a 8, 7,5 a 8,5 ou 7 a 8,5. Podese adicionar um solubilizante para evitar ou minimizar a precipitação induzida por pH do polipeptídeo que contém articulação. Em certas realizações específicas, o solubilizante é adicionado antes da manutenção do pH intermediário. Em certas realizações, o primeiro solubilizante e o segundo solubilizante são selecionados a partir do grupo que consiste de arginina, histidina e sacarose, preferencialmente arginina e/ou histidina. Em algumas outras realizações, a arginina é um sal de arginina e/ou histidina é um sal de histidina. Em algumas outras realizações, a arginina é um derivado de arginina

9/118 e/ou histidina é um derivado de histidina. Em algumas outras realizações, a arginina ou histidina é L-arginina ou L-histidina. Em algumas outras realizações, a arginina ou histidina é arginina HCI ou histidina HCI. Em algumas outras realizações, a arginina ou histidina é fosfato de arginina ou fosfato de histidina. Em certas realizações, os primeiro e segundo solubilizantes são diferentes; enquanto, em outras realizações, os primeiro e segundo solubilizantes são idênticos. Em certas realizações preferidas, o primeiro solubilizante e o segundo solubilizante compreendem arginina. Em ainda outras realizações, a arginina está presente em uma concentração de 20 mM a 1 mM, 20 mM a menos de 1 mM, 20 mM a 100 mM, 20 mM a 200 mM, 20 mM a 300 mM, 20 mM a 400 mM, 50 mM a 100 mM, 50 mM a 150 mM, 50 mM a 200 mM, 50 mM a 250 mM ou 50 mM a 300 mM, preferencialmente de 20 mM a 200 mM. Em ainda outras realizações, o solubilizante compreende um derivado de arginina que inclui, sem limitações, acetilarginina. Em outras realizações, o primeiro solubilizante e o segundo solubilizante compreendem histidina presente em uma concentração de 20 mM a 1 M, 20 mM a menos de 1 M, 20 mM a menos de 500 mM, 20 mM a 100 mM, 20 mM a 200 mM, 20 mM a 300 mM, 20 mM a 400 mM, 50 mM a 100 mM, 50 mM a 150 mM, 50 mM a 200 mM, 50 mM a 250 mM, 50 mM a 300 mM, 50 mM a 400 mM, 50 mM a 500 mM ou 50 mM a 600 mM. Em certas realizações preferidas, o solubilizante é adicionado em uma concentração de 50 mM. Em certas realizações preferidas, o solubilizante é adicionado em uma concentração de 200 mM. Em certas realizações específicas, adiciona-se arginina ou histidina em uma concentração de 20 mM, 50 mM, 100 mM ou 200 mM. Em algumas outras realizações específicas, os primeiro e/ou segundo polipeptídeos que contêm articulação são fornecidos na presença de arginina e histidina. Em outras realizações, a arginina e a histidina estão presentes em uma concentração de 20 mM a 1 mM, 20 mM a menos de 1 mM, 20 mM a 100 mM, 20 mM a 200 mM, 20 mM a 300

10/118 mM, 20 mM a 400 mM, 50 mM a 100 mM, 50 mM a 150 mM, 50 mM a 200 mM, 50 mM a 250 mM ou 50 mM a 300 mM, preferencialmente de 50 mM a 200 mM, cada uma.

[024] Em certas realizações, os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação são misturados antes da manutenção de pH intermediário (ou seja, ajuste de pH). Em algumas outras realizações, os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação são misturados após o ajuste do pH no primeiro polipeptídeo que contém articulação e no segundo polipeptídeo que contém articulação separadamente. Em certas realizações, adiciona-se um solubilizante antes do ajuste do pH.

[025] Em certas realizações, o primeiro polipeptídeo que contém articulação e o segundo polipeptídeo que contém articulação são purificados separadamente antes da mistura; enquanto, em outras realizações, o primeiro polipeptídeo que contém articulação e o segundo polipeptídeo que contém articulação são copurificados após a mistura. Em certas realizações específicas, o polipeptídeo que contém articulação compreende um meioanticorpo. Em certas realizações, a proteína heteromultimérica montada pode ser submetida a purificação adicional.

[026] Qualquer método apropriado pode ser utilizado para purificação, incluindo, sem limitações, purificação por meio de cromatografia de proteína A, cromatografia de proteína G, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), fracionamento sobre coluna de imunoafinidade, precipitação de etanol, cromatografia de fase reversa sobre silica ou sobre uma resina de troca de íons tal como DEAE, cromatoconcentração, SDS-PAGE, precipitação de sulfato de amônio e filtragem de gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75 e outros métodos de purificação similares, bem como suas combinações.

[027] Em certas realizações, o polipeptídeo que contém articulação tal como meio-anticorpo é purificado por meio de cromatografia de

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Proteína A ou Proteína G. Em outra realização, os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação são misturados antes da purificação com proteína A e copurificados sobre proteína A. Em certas realizações, o pH é ajustado após a mistura dos polipeptídeos purificados por Proteína A. Em outras realizações, o pH é ajustado antes da mistura dos polipeptídeos purificados por Proteína A. Em certas realizações, adiciona-se um solubilizante antes do ajuste do pH.

[028] Em algumas outras realizações, o polipeptídeo que contém articulação é purificado por meio de HIC ou uma coluna de troca de íons. Encontra-se dentro da capacidade dos técnicos no assunto a seleção de métodos de purificação apropriados. O polipeptídeo que contém articulação pode ser purificado, por exemplo, por uma coluna de Proteína A seguida por uma coluna de troca de íons; o polipeptídeo que contém articulação pode também ser purificado por uma coluna de Proteína A seguida por uma coluna de filtragem de gel e/ou HIC. Em outros exemplos, o polipeptídeo que contém articulação pode ser purificado por uma ou mais colunas de troca de íons antes da purificação por uma coluna de Proteína A. Em certas realizações, os tampões de lavagem e/ou eluição utilizados durante qualuer uma das etapas de purificação dos polipeptídeos que contêm articulação não contêm arginina e/ou histidina.

[029] Em ainda outras realizações, o meio-anticorpo eluído da matriz de Proteína A ou outra matriz de coluna sob pH ácido é ajustado em pH intermediário. Esse ajuste de pH subsequente (também denominado manutenção de pH intermediário) pode causar precipitação do polipeptídeo que contém articulação tal como meio-anticorpo e, portanto, gerar redução do rendimento da proteína heteromultimérica montada. Desta forma, em certas realizações, o meio-anticorpo eluído da coluna de Proteína A ou Proteína G sob pH ácido é fornecido na presença de um solubilizante antes do ajuste de

12/118 pH. Caso não seja necessária uma etapa de ajuste de pH, em certas realizações, é preferencialmente adicionado um solubilizante ao polipeptídeo que contém articulação purificado para evitar ou reduzir a precipitação e/ou agregação.

[030] Além da manutenção de pH intermediário, os depositantes do presente descobriram inesperadamente que o aquecimento pode aumentar a alteração de conformação e/ou montagem dos polipeptídeos que contêm articulação tais como meio-anticorpos. Consequentemente, em certas realizações, uma, mais ou todas as etapas a-d dos métodos de acordo com a presente invenção são aquecidas sob temperatura de 15 ^QC a 39 ^QC, 15 ^QC a 42 °-C, 18 ^QC a 37 °-C, 20 ^SC a 42 °-C, 20 ^SC a 25 °-C, 25 ^SC a 42 °-C, 25 ^SC a 35 °-C, 25 ^SC a 39 °-C, 30 ^SC a 35 °-C, 32 ^SC a 35 ^SC ou 32 ^SC a 37 °-C, preferencialmente 35 ^QC a 37 ^QC, por pelo menos trinta minutos. Em certas realizações, o tempo de incubação é de até 72 horas, especialmente à temperatura ambiente. Em algumas realizações, o tempo de incubação é de três horas a 35 ^QC. Em algumas outras realizações, a temperatura é de ou cerca de 30 ^QC, 35 ^QC ou 37 ^QC.

[031] O aquecimento, entretanto, pode também aumentar a agregação e/ou a precipitação. Consequentemente, em certas realizações específicas, adiciona-se um solubilizante ao meio-anticorpo que sofreu eluição de uma coluna de Proteína A ou Proteína G antes do aquecimento.

[032] Em certas realizações, o polipeptídeo que contém articulação compreende um meio-anticorpo, imunoadesina ou seu fragmento funcional. Em certas realizações específicas, o polipeptídeo que contém articulação compreende um componente Fc.

[033] Em certas realizações específicas, os primeiro e/ou segundo polipeptídeos que contêm articulação compreendem um meioanticorpo. Em certas realizações, o meio-anticorpo é um meio-anticorpo IgG.

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Em certas realizações específicas, o meio-anticorpo IgG é do isotipo lgG1, lgG4 ou lgG2. Em certas realizações vantajosas, o peptídeo de sinal da molécula de imunoglobulina é retido para facilitar a secreção do meioanticorpo, especialmente quando produzido em células de mamíferos. Em certas realizações, o método de acordo com a presente invenção compreende o fornecimento de primeiro e segundo meio-anticorpos sob pH 5-9 na presença de arginina em uma concentração de cerca de 50 mM e, alternativa ou adicionalmente, histidina em uma concentração de cerca de 200 mM. Em certas realizações, os primeiro e/ou segundo meio-anticorpos compreendem um domínio de ligação de antígenos específico para um antígeno diferente cada um ou um epítopo diferente sobre o mesmo antígeno e o anticorpo completo montado é um anticorpo biespecífico. Em algumas outras realizações, os primeiro e segundo meio-anticorpos são do mesmo isotipo, enquanto, em outras realizações, os primeiro e segundo meio-anticorpos são de isotipos diferentes.

[034] O meio-anticorpo pode compreender um domínio V_L, domínio V_H, domínio de articulação, domínio CH₂ e/ou domínio CH₃. O meioanticorpo pode também ser um polipeptídeo de fita simples que compreende adicionalmente um téter e o mencionado polipeptídeo de fita simples compreende domínios posicionados entre si em direção N-terminal para Cterminal conforme segue: V_L -téter-V_H-articulação-CH₂-CH₃. Em algumas outras realizações, o meio-anticorpo compreende adicionalmente um domínio Cl e um domínio CH-,; e, em realizações adicionais, o meio-anticorpo pode ser um polipeptídeo de fita simples que compreende adicionalmente um téter e o mencionado polipeptídeo de fita simples compreende domínios posicionados entre si em direção N-terminal para C-terminal conforme segue: V_L-CL-téter-V_HCHi-articulação-CH₂-CH₃.

[035] O téter pode compreender um ou mais resíduos de Glicina

14/118 (G) e Serina (S). Em outras realizações, o téter compreende repetições GGS. O téter, por exemplo, possui de 15 a 50 aminoácidos de comprimento. Em uma realização específica, o téter possui de 20 a 32 aminoácidos de comprimento, tais como 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 aminoácidos de comprimento. Em certas realizações, o téter é divisível. Em outras realizações, o téter pode ou não ser divisível da proteína. Em certas realizações preferidas, o téter é divisível em dois locais no terminal N e C do téter ou perto dele pela mesma enzima. Em uma realização, o téter compreende o local de divisão para proteases, tais como furina. Em uma realização adicional, o téter é dividido por furina no local de divisão RXRXRR (SEQ ID N^Q 1), em que X é qualquer aminoácido. Em algumas realizações, o primeiro polipeptídeo que contém articulação é um meio-anticorpo e o segundo polipeptídeo que contém articulação é meio-anticorpo de fita simples.

[036] Em outra realização, a presente invenção fornece uma proteína que compreende um téter e um complexo de componentes Fc, em que o téter pode ou não ser divisível da proteína.

[037] Em realizações adicionais, os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação compreendem um domínio de heteromultimerização. O domínio de heteromultimerização pode ser uma mutação de botão em orifício, fechos de leucina, eletrostático e similares. O primeiro polipeptídeo que contém articulação pode compreender um botão (knob) e o segundo polipeptídeo que contém articulação pode compreender um orifício. Em certas realizações, o polipeptídeo que contém articulação compreende um meio-anticorpo, o primeiro meio-anticorpo compreende um botão e o segundo meio-anticorpo compreende um orifício.

[038] Em algumas realizações, o método compreende a adição de arginina até concentração final de 20 mM a 1 M antes do ajuste do pH. Em algumas realizações, a arginina é adicionada até concentração final de 50 mM

15/118 a 600 mM. Em algumas realizações, a arginina é adicionada até concentração final de 50 mM a 100 mM.

[039] Em certas realizações, o método inclui a incubação de cada conjunto de Proteína A e polipeptídeo que contém articulação sob pH de 5 a 8 antes da mistura dos primeiro e segundo meio-anticorpos. Em outras realizações, os conjuntos de Proteína A são misturados e, em seguida, o pH é ajustado em 5 a 8.

[040] Em algumas realizações, os métodos descritos no presente compreendem a incubação do conjunto de polipeptídeo que contém articulação misturado ou meio-anticorpo misturado sob temperatura de 15 ^QC a 39 ^QC, preferencialmente de 18 ^QC a 37 ^QC, de maior preferência de 20 ^QC a 25 ^QC e, de maior preferência, de 32 ^QC a 37 ^QC por pelo menos trinta minutos.

[041] Os polipeptídeos que contêm articulação podem ser produzidos, por exemplo, por uma célula bacteriana, uma célula de levedura, um bacilovírus em uma célula de inseto ou uma célula de mamífero. Em certas realizações, o polipeptídeo que contém articulação é produzido por uma célula bacteriana, particularmente E. coli. Em algumas outras realizações específicas, o polipeptídeo que contém articulação é produzido por uma célula de mamífero, particularmente célula de CHO. Em certas realizações específicas, o polipeptídeo que contém articulação compreende um meio-anticorpo.

[042] Os polipeptídeos que contêm articulação podem interagir para formar um dímero ou multímero por meio do domínio de heterodimerização. Em certas realizações, a interação entre os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação na interface dos domínios de heterodimerização é uma interação de protuberância em cavidade, interação hidrofóbica e/ou interação eletrostática. Em algumas outras realizações, o domínio de heteromultimerização compreende um ou mais dentre um botão (tal como protuberância), orifício (tal como cavidade), fecho de leucina, bobina

16/118 enrolada ou resíduo de aminoácido polar capaz de formar uma interação eletrostática ou suas combinações. Em certas realizações, o primeiro polipeptídeo que contém articulação compreende um botão e o segundo polipeptídeo que contém articulação compreende um orifício. Em algumas outras realizações, a interação envolve uma interação hidrofóbica e uma interação eletrostática. Em certos exemplos de realização, o domínio de heteromultimerização de cada um dentre os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação compreende um botão ou orifício e um resíduo de aminoácido capaz de formar uma interação eletrostática. Os técnicos no assunto compreendem que o domínio de heterodimerização pode compreender mais de uma forma de interação, tais como interação hidrofóbica e de botão e orifício, botão e orifício e fecho de leucina etc. Em certas realizações, o polipeptídeo que contém articulação compreende adicionalmente um téter. Em certas realizações específicas, o polipeptídeo que contém articulação compreende um meio-anticorpo.

[043] Em certas realizações específicas, a mistura de montagem está presente em condição redutora, preferencialmente condição redutora fraca, que possui potencial de oxidação de -50 a -600 mV, -100 a -600 mV, 200 a -600 mV, -100 a -500 mV, -150 a -300 mV, de maior preferência de -300 a -500 mV, de preferência superior cerca de -400 mV, sob condições que promovam a montagem das proteínas heteromultiméricas tal como quando o pH for de 7 a 9 e a temperatura for de 15 ^QC a 39 ^QC. Em certas realizações, é adicionado um redutor à etapa c ou etapa d para preparar uma condição redutora desejada durante a montagem. Em algumas outras realizações, o redutor é selecionado a partir do grupo que consiste de ditiotreitol (DDTT), ír/s(2-carboxietil)fosfina (TCEP), ácido tioglicólico, ácido ascórbico, ácido tiol acético, glutationa (GSH), betamercaptoetilamina, cisteína/cistina, glutationa (GSH), cisteamina/cistamina, glicilcisteína e betamercaptoetanol,

17/118 preferencialmente GSH. Em certas realizações preferidas, o redutor, preferencialmente um redutor fraco, é selecionado a partir do grupo que consiste de glutationa (GSH), betamercaptoetilamina, cisteína/cistina, glutationa (GSH)/dissulfeto de glutationa (GSSG), cisteamina/cistamina, glicilcisteína e betamercaptoetanol, preferencialmente GSH. Em certas realizações, o redutor não é DTT.

[044] Em algumas outras realizações, o redutor é adicionado à mistura de reação em excesso molar de 2-600X, 2-200X, 2-300X, 2-400X, 2500X, 2-20X, 2-8X, 20-50X, 50-600X, 50-200X ou 100-300X, preferencialmente 50-400X, de maior preferência 100-300X e, de preferência superior, 200X com relação à quantidade total dos polipeptídeos que contêm articulação. Em certas realizações, a mistura de montagem possui pH de 7 a 9, preferencialmente pH 8,5. Em certas realizações específicas, o polipeptídeo que contém articulação é um meio-anticorpo.

[045] Em algumas realizações, o redutor é adicionado aos primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação antes da mistura. Preferencialmente, a adição é de menos de uma hora, de maior preferência menos de quinze minutos e, de preferência superior, menos de cinco minutos antes da mistura.

[046] Em certas realizações, o método compreende ainda a adição de um estabilizante à reação em uma ou mais das etapas, incluindo, sem limitações, a etapa de manutenção de pH intermediário e a etapa de montagem na presença ou ausência de aquecimento. Pode-se, por exemplo, adicionar um estabilizante ao polipeptídeo que contém articulação para evitar ou reduzir a agregação. Em outros exemplos, pode-se adicionar um estabilizante à mistura de montagem para evitar ou reduzir a agregação durante a montagem de uma proteína heteromultimérica. Em certas realizações específicas, o polipeptídeo que contém articulação compreende um meio

18/118 anticorpo.

[047] Em certas realizações específicas, o estabilizante é selecionado a partir do grupo que consiste de arginina, histidina e polivinilpirrolidona (PVP). Em certas realizações, a arginina ou histidina é um sal de arginina ou um sal de histidina. Em algumas outras realizações, a arginina ou histidina é um derivado de arginina ou histidina. Em algumas outras realizações, a arginina ou histidina é arginina HCI ou histidina HCI. Em certas realizações, a arginina não é fosfato de arginina.

[048] Em algumas outras realizações, o método compreende adicionalmente a etapa de incubação da mistura de montagem na presença de PVP. Em realizações relacionadas, o PVP é adicionado em até 40% (p/v). Em algumas outras realizações, o PVP está presente na mistura de montagem em uma concentração de 2% a 6% (p/v), 10% a 20%, 2% a 10%, 1%, 1,3%, 1,7%, 2%, 2,3%, 2,7%, 3%, 3,3%, 3,7% ou 4%, preferencialmente de 0,1% a 10%, de maior preferência de 2% a 6% e, de preferência superior, de 4%. Em certas realizações, o PVP é de não mais de 100 kD, não mais de 30 kD e, preferencialmente, 10 kD. Em algumas outras realizações, o PVP está presente em menos de 10% (p/v) ou menos de 5% (p/v).

[049] Em algumas realizações, o estabilizante é arginina presente em uma concentração de 20 mM a 1 mM, 20 mM a menos de 1 mM, 20 mM a 100 mM, 20 mM a 200 mM, 20 mM a 300 mM, 20 mM a 400 mM, 20 mM a 50 mM, 50 mM a 100 mM, 50 mM a 150 mM, 50 mM a 200 mM, 50 mM a 250 mM ou 50 mM a 300 mM. Em outras realizações, o estabilizante é histidina presente em uma concentração de 20 mM a 1 mM, 20 mM a menos de 1 mM, 20 mM a 100 mM, 20 mM a 200 mM, 20 mM a 300 mM, 20 mM a 400 mM, 20 mM a 50 mM, 50 mM a 100 mM, 50 mM a 150 mM, 50 mM a 200 mM, 50 mM a 250 mM ou 50 mM a 300 mM. Em certas realizações preferidas, a arginina ou histidina é adicionada em uma concentração de 50 mM ou 200 mM. Em

19/118 algumas outras realizações, a arginina e/ou histidina são adicionadas em uma concentração de 20 mM a 200 mM, 20 mM a 100 mM, 50 mM a 200 mM ou 50 mM a 100 mM. Em algumas outras realizações, o polipeptídeo que contém articulação compreende um meio-anticorpo.

[050] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula hospedeira que expressa um polipeptídeo que contém articulação. Em certas realizações, o polipeptídeo que contém articulação compreende um meio-anticorpo.

[051] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método de produção de anticorpos biespecíficos, que compreende as etapas de (a) cultivo de uma primeira célula hospedeira elaborada para expressar um primeiro meio-anticorpo específico para um primeiro antígeno ou primeiro epítopo de um antígeno; (b) cultivo de uma segunda célula hospedeira elaborada para expressar um segundo meio-anticorpo específico para um segundo antígeno ou segundo epítopo do mesmo antígeno; (c) obtenção do primeiro meio-anticorpo a partir do cultivo da etapa a sob pH 4 a 9, preferencialmente 5 a 9, na presença de um primeiro solubilizante; (d) obtenção do segundo meio-anticorpo a partir do cultivo da etapa b sob pH 4 a 9, preferencialmente 5 a 9, na presença de um segundo solubilizante; (e) mistura dos primeiro e segundo meio-anticorpos em condição redutora para formar uma mistura de montagem; e (f) incubação da mistura de montagem para formar um anticorpo biespecífico que compreende os primeiro e segundo meio-anticorpos.

[052] Em algumas realizações, a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cultivadas em cultivos separados e o primeiro meio-anticorpo e o segundo meio-anticorpo são purificados separadamente dos cultivos das primeira e segunda células hospedeiras antes da mistura. Em certas realizações, as primeira e segunda células hospedeiras são cultivadas

20/118 em cultivos separados, os cultivos são combinados, as células são peletizadas, opcionalmente homogeneizadas e/ou lisadas e os primeiro e segundo meioanticorpos são copurificados por meio de quaisquer métodos apropriados. Em certas realizações, os primeiro e segundo meio-anticorpos são copurificados por meio de purificação com proteína A. Em realizações adicionais, as primeira e segunda células hospedeiras são cocultivadas em um cultivo misturado e os primeiro e segundo meio-anticorpos são copurificados.

[053] A célula hospedeira pode, por exemplo, ser uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma célula vegetal, uma célula de inseto ou célula de mamífero. Em algumas realizações específicas, o polipeptídeo que contém articulação ou meio-anticorpo é produzido por uma célula de mamífero, tal como célula de CHO. Em algumas outras realizações, a célula hospedeira é uma célula de bactéria, particularmente E. coli.

[054] Em certas realizações adicionais, os métodos de acordo com a presente invenção compreendem adicionalmente a etapa de recuperação da proteína heteromultimérica ou anticorpo biespecífico formado na etapa d. A proteína heteromultimérica montada pode ser adicionalmente purificada por meio de métodos descritos ao longo de todo o pedido ou métodos apropriados conhecidos na técnica.

[055] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece composições que compreendem um polipeptídeo que contém articulação e um solubilizante, em que o pH da composição é de pH 4 a pH 9, preferencialmente pH 5-9. Em certas realizações, o pH da composição é de pelo menos pH 5, pelo menos pH 5,5, pelo menos pH 5,7, pH maior que 5, pH maior que 5,5 pH maior que 5,7, de 5 a 9, 5 a 8, 5,5 a 8, 5,5 a 9, 5,7 a 8, 5,7 a 9, 6 a 8, 6 a 9, 7 a 8, 7,5 a 8,5 ou 7 a 8,5. Em certas realizações, o solubilizante é selecionado a partir do grupo que consiste de arginina, histidina e sacarose, preferencialmente arginina e/ou histidina. Em algumas outras realizações, a

21/118 arginina é um sal de arginina e/ou histidina é urn sal de histidina. Em algumas outras realizações, a arginina é um derivado de arginina e/ou histidina é um derivado de histidina. Em algumas outras realizações, a arginina ou histidina é L-arginina ou L-histidina. Em algumas outras realizações, a arginina ou histidina é arginina HCI ou histidina HCI.

[056] Em algumas realizações específicas, o solubilizante é arginina ou histidina. Em algumas outras realizações, a arginina ou histidina está presente em uma concentração de 20 mM, 50 mM, 200 mM, 400 mM, 20 mM a 1 M, 20 mM a menos de 1 M, 20 mM a 200 mM, 20 mM a 400 mM, 20 mM a 100 mM, 50 mM a 100 mM, 50 mM a 200 mM, 50 mM a 300 mM ou 50 mM a 400 mM. Em algumas realizações específicas, a composição compreende arginina e histidina, cada qual presente em uma concentração de 20 mM, 50 mM, 200 mM, 400 mM, 20 mM a 1 M, 20 mM a menos de 1 M, 20 mM a 20 mM, 20 mM a 400 mM, 20 mM a 100 mM, 50 mM a 100 mM, 50 mM a 200 mM, 50 mM a 300 mM ou 50 mM a 400 mM. Em algumas outras realizações, a composição não compreende guanidina HCI ou ureia. Em certas realizações, a composição compreende, alternativa ou adicionalmente, um estabilizante.

[057] Em certas realizações específicas, o polipeptídeo que contém articulação compreende um meio-anticorpo. Em algumas outras realizações específicas, a composição compreende apenas um tipo de polipeptídeo que contém articulação ou meio-anticorpo. Em certas realizações, a composição compreende apenas um tipo de meio-anticorpo que é um meioanticorpo de botão. Em algumas outras realizações, a composição compreende apenas um tipo de meio-anticorpo que é um meio-anticorpo de orifício.

[058] Em algumas realizações específicas, a composição compreende adicionalmente um segundo polipeptídeo que contém articulação, em que o primeiro polipeptídeo que contém articulação compreende um botão

22/118 e o segundo polipeptídeo que contém articulação compreende um orifício. Em certas realizações, o polipeptídeo que contém articulação compreende um meio-anticorpo. Em certas realizações específicas, o polipeptídeo que contém articulação é um meio-anticorpo. Em algumas outras realizações, o meioanticorpo IgG é do isotipo IgG 1, lgG2 ou lgG4.

[059] Todas as realizações descritas no presente podem ser combinadas, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Além disso, toda e qualquer realização descrita acima aplica-se a todo e qualquer aspecto da presente invenção, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[060] Outros objetos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir. Dever-se-á compreender, entretanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem realizações preferidas da presente invenção, são fornecidos apenas como forma de ilustração, pois diversas mudanças e modificações dentro do escopo e do espírito da presente invenção tornar-se-ão evidentes para os técnicos no assunto a partir da presente descrição detalhada.

Breve Descrição das Figuras [061] A Figura 1A ilustra um meio-anticorpo totalmente oxidado. Não é exibido o “botão”, “orifício” ou outros domínios de heterodimerização. O meio-anticorpo ilustrado nesta figura é um isotipo IgG 1. Os técnicos no assunto apreciarão que os outros isotipos de imunoglobulina podem ser idealizados como meio-anticorpos com as ligações inter e intracadeias correspondentes. Em um anticorpo intacto, as cisteínas de articulação formarão ligações de dissulfeto intercadeias.

[062] A Figura 1B ilustra um anticorpo biespecífico de comprimento total com um domínio de heteromultimerização. Não são

23/118 ilustradas as ligações de dissulfeto intercadeias pesadas na região de articulação. O domínio de heteromultimerização exibido é o formato de botão em orifício.

[063] A Figura 1C é uma representação em desenho de um anticorpo biespecífico que compreende um domínio de heteromultimerização (botão em orifício), um téter divisível por furina e uma ligação de dissulfeto adicional opcional (S354). Também são exibidas as ligações de dissulfeto intercadeias pesadas na região de articulação. Os locais de divisão de furina são indicados pelos triângulos. Embora o téter divisível por furina seja exibido sobre o meio-anticorpo que compreende o botão, ele também pode ser utilizado sobre o meio-anticorpo de orifício ou sobre os dois meio-anticorpos, de botão e de orifício.

[064] As Figuras 2A e B exibem cromatogramas de exclusão de tamanho compostos que demonstram os efeitos de pH sobre a alteração de conformação de meio-anticorpos. A Figura 2A demonstra que pH elevado induziu a alteração de conformação de meio-anticorpo de orifício que resulta em maior raio hidrodinâmico. Essa alteração de conformação aumentou a heterodimerização durante a montagem. A Figura 2B demonstra que pH elevado promoveu a formação de homodímero de meio-anticorpo de botão não covalente. Essa alteração de conformação favoreceu a formação biespecífica durante a montagem. . Faz-se referência ao Exemplo 2.

[065] As Figuras 3A e 3B ilustram os resultados que demonstram que um solubilizante tal como arginina (Figuras 3A e B) e cloridrato de histidina (Fig. 3B) reduziu a precipitação induzida por pH intermediário de meioanticorpos de botão.

[066] As Figuras 4A e B exibem cromatogramas compostos que demonstram o efeito de um redutor tal como glutationa sobre a agregação e montagem de anticorpos biespecíficos. Glutationa é adicionada em excesso

24/118 molar de 2 a 200X. Faz-se referência ao Exemplo 3.

[067] A Figura 5A é um gráfico que ilustra o efeito de temperatura sobre a velocidade de formação de anticorpos biespecíficos lgG1 (montagem). A Figura 5B demonstra que temperatura mais alta promoveu a montagem de anticorpo lgG1 biespecífico de botão em orifício na presença de excesso molar de 200x de glutationa com ou sem manutenção de pH, conforme analisado por meio de cromatografia de fase reversa. A Figura 5B também ilustra que a otimização da manutenção de pH dos conjuntos de meio-anticorpos para dirigir alterações de conformação antes da montagem aumentou a velocidade e a eficiência da montagem. Faz-se referência ao Exemplo 4.

[068] A Figura 6A ilustra o efeito de um estabilizante tal como PVP sobre a estabilização do anticorpo biespecífico formado e a redução da formação de agregados.

[069] A Figura 6B demonstra que PVP e histidina sob temperatura elevada promoveram a montagem de anticorpo lgG4 biespecífico de botão em orifício conforme analisado por meio de cromatografia de fase reversa. Curva inferior: montagem à temperatura ambiente com razão de 300x Glutationa: Ab, pH = 8,5, cerca de 400 mM de arginina; curva superior: montagem aquecida com razão de 200x Glutationa: Ab, pH = 8,0, 4% de PVP, 50 mM de arginina, 100 mM de histidina a 35 ^QC.

[070] A Figura 6C demonstra que PVP reduziu a agregação de anticorpo biespecífico de botão em orifício lgG4 durante montagem aquecida a 37 ^QC e pH 8 por seis horas. Faz-se referência ao Exemplo 5.

[071] A Figura 7 ilustra que histidina reduziu a agregação induzida por calor de meio-anticorpos de orifício lgG4 a 37 ^QC e pH 8 por três horas.

Descrição Detalhada da Invenção [072] A presente invenção será agora descrita em detalhes

25/118 unicamente como forma de referência, utilizando as definições e exemplos a seguir. Todas as patentes e publicações, incluindo todas as sequências descritas nessas patentes e publicações indicadas no presente são expressamente incorporadas como referência.

[073] A menos que definido em contrário no presente, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente possuem o mesmo significado comumente compreendido pelos técnicos comuns no assunto a que pertence a presente invenção. Singleton et al, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, segunda edição, John Wiley and Sons, Nova Iorque (1994) e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, Nova Iorque (1991) fornecem aos técnicos no asssunto um dicionário geral de muitos dos termos utilizados na presente invenção. Embora possam ser utilizados quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos no presente na prática ou teste de acordo com a presente invenção, são descritos os métodos e materiais preferidos. As faixas numéricas incluem os números que definem a faixa. A menos que indicado em contrário, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita em orientação 5’ para 3’; as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita em orientação amino para carboxila, respectivamente. Os praticantes são orientados particularmente a consultar Sambrook et al, 1989, e Ausubel, F. M. et al, 1993, para definições e termos da técnica. Deve-se compreender que a presente invenção não é limitada à metodologia específica, protocolos e reagentes descritos, pois estes podem variar.

[074] As faixas numéricas incluem os números que definem a faixa.

[075] A menos que indicado em contrário, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita em orientação 5’ para 3’; e as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita em

26/118 orientação amino para carboxila, respectivamente.

[076] Da forma utilizada no presente, as formas no singular “um”, “uma” e “o/a” incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Referência a “uma célula hospedeira”, por exemplo, indica uma ou mais células hospedeiras.

[077] Os títulos fornecidos no presente não são limitações dos diversos aspectos ou realizações da presente invenção que podem ser obtidos por meio de referência ao relatório descritivo como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por meio de referência ao relatório descritivo como um todo.

[078] Todas as realizações descritas no presente podem ser combinadas, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Além disso, toda e qualquer realização descrita acima aplica-se a todo e qualquer aspecto da presente invenção, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[079] I. Definições:

A presente invenção fornece métodos de produção de proteínas heteromultiméricas que compreendem um primeiro polipeptídeo que contém articulação e um segundo polipeptídeo que contém articulação. A expressão “polipeptídeo que contém articulação”, da forma utilizada no presente, designa um polipeptídeo que contém pelo menos uma região de articulação. Em certas realizações, a região de articulação conecta diversos domínios, tais como um domínio de ligação e um domínio efetor, e fornece alguma flexibilidade estrutural ao polipeptídeo para dimerização ou multimerização. Como exemplo, o domínio de ligação pode ser um domínio de ligação de antígenos de um anticorpo ou um domínio de ligação de ligantes de um receptor e o domínio efetor pode ser um componente Fc de um anticorpo. Em certas realizações, o

27/118 primeiro polipeptídeo que contém articulação é diferente do segundo polipeptídeo que contém articulação e o dímero ou multímero resultante é um heterodímero ou heteromultímero. Em certas realizações específicas, o primeiro polipeptídeo que contém articulação e o segundo polipeptídeo que contém articulação ligam-se a dois epítopos diferentes sobre a mesma proteína alvo. Em algumas outras realizações, o primeiro polipeptídeo que contém articulação possui especificidade de ligação de alvo diferente do segundo polipeptídeo que contém articulação e o heterodímero ou heteromultímero resultante liga-se a duas ou mais proteínas alvo diferentes. Em certas realizações, o polipeptídeo que contém articulação compreende um domínio de heterodimerização de ocorrência natural ou elaborado. Em certas realizações específicas, o polipeptídeo que contém articulação compreende um ou mais resíduos de cisteína na região de articulação capazes de formar uma ou mais ligações de dissulfeto com outro polipeptídeo que contém articulação.

[080] Um polipeptídeo que contém articulação inclui, sem limitações, um meio-anticorpo, uma imunoadesina e seu fragmento funcional. A expressão “fragmento funcional”, da forma utilizada no presente, designa um fragmento, ou seja, menos que o comprimento total do polipeptídeo que contém articulação, que ainda mantém a função desejada; ele retém, por exemplo, a atividade alvo ou de ligação de antígenos, a atividade efetora de Fc e/ou a capacidade de dimerização/multimerização. Em certas realizações específicas, cada um dentre o primeiro polipeptídeo que contém articulação e o segundo polipeptídeo que contém articulação é um meio-anticorpo com especificidade de ligação de antígenos diferente e o dímero ou multímero resultante é um anticorpo biespecífico ou multiespecífico. Em certas realizações, a proteína heteromultimérica resultante compreende um meioanticorpo e uma imunoadesina.

[081] A expressão “anticorpo multiespecífico” é utilizada no

28/118 sentido mais amplo e cobre especificamente um anticorpo que possui especificidade poliepitópica. Esses anticorpos multiespecíficos incluem, mas sem limitações, um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada (V_H) e um domínio variável de cadeia leve (V_L), em que a unidade V_HV_Lpossui especificidade poliepitópica, anticorpos que possuem dois ou mais domínios V_L e V_H em que cada unidade V_HV_L liga-se a um epítopo diferente, anticorpos que possuem dois ou mais domínios variáveis isolados em que cada domínio variável isolado liga-se a um epítopo diferente, anticorpos com comprimento total, fragmentos de anticorpos tais como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacorpos, diacorpos e triacorpos específicos e fragmentos de anticorpos que foram ligados de forma covalente ou não covalente. “Especificidade poliepitópica” designa a capacidade de ligar-se especificamente a dois ou mais epítopos diferentes sobre o(s) mesmo(s) alvo(s) ou diferente(s). “Monoespecífico” designa a capacidade de ligar apenas um epítopo. Segundo uma realização, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo IgG que se liga a cada epítopo com afinidade de 5 pM a 0,001 pM, 3 pM a 0,001 pM, 1 pM a 0,001 pM, 0,5 pM a 0,001 pM ou 0,1 pM a 0,001 pM.

[082] Uma unidade básica de anticorpo de quatro cadeias de ocorrência natural é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas (um anticorpo IgM consiste de cinco das unidades heterotetraméricas básicas, juntamente com um polipeptídeo adicional denominado cadeia J, contendo, portanto, dez locais de ligação de antígenos, enquanto os anticorpos IgA secretados podem polimerizar-se para formar conjuntos polivalentes que compreendem duas a cinco das unidades de quatro cadeias básicas junto com a cadeia J). No caso de IgGs, a unidade de quatro cadeias é geralmente de cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas entre si por uma ou mais

29/118 uniões de dissulfeto, dependendo do isotipo de cadeia H. Cada cadeia H e L também contém pontes de dissulfeto intracadeias em espaços regulares. Cada cadeia H contém, no terminal N, um domínio variável (V_H) seguido por três domínios constantes (Ch) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios Ch para os isótipos μ e ε. Cada cadeia L contém, no terminal N, um domínio variável (V_L) seguido por um domínio constante (Cl) no terminal C. O V_L é alinhado ao V_H e o Cl é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada (Ch1). Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formem uma superfície intermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. O emparelhamento de V_H e V_L entre si forma um local de ligação de antígenos isolado. Para estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, vide, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8^ãedição, Daniel P. Stites, Abba I., Terr e Tristam, G. Parslow (Eds.), Appleton & Lange, Norwalk CT, 1994, pág. 71 e Capítulo 6.

[083] A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser classificada em um dentre dois tipos claramente distintos, denominados capa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que contêm cadeias pesadas denominadas α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As classes γ e α são adicionalmente divididas em subclasses com base em diferenças relativamente menores de função e sequência CH; seres humanos, por exemplo, expressam as subclasses a seguir: lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2.

[084] O termo “variável” designa o fato de que certos segmentos dos domínios variáveis diferem extensamente de sequência entre os anticorpos. O domínio V media a ligação de antígenos e define a especificidade

30/118 de um anticorpo específico para o seu antígeno específico. A variabilidade não é distribuída regularmente, entretanto, ao longo da série de 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Ao contrário, as regiões V consistem de estiramentos relativamente invariáveis denominados regiões de estrutura (FRs) de quinze a trinta aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade, denominadas “regiões hipervariáveis”, que contêm de nove a doze aminoácidos de comprimento cada uma. Cada um dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada compreende quatro FRs, que adotam em grande parte configuração de folha beta, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam circuitos que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha beta. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação de antígenos de anticorpos (vide Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tais como a participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).

[085] A expressão “região hipervariável”, “HVR” ou “HV”, da forma utilizada no presente, indica as regiões de um domínio variável de anticorpo que são de sequência hipervariável e/ou formam circuitos definidos estruturalmente. Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). Em anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade das seis HVRs e acredita-se que H3 desempenhe particularmente um papel exclusivo no fornecimento de especificidade fina a anticorpos. Vide, por exemplo, Xu et al, Immunity 13: 37-45 (2000); Johnson e Wu, em Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa

31/118

NJ, 2003). De fato, anticorpos de camelídeos de ocorrência natural que consistem de uma única cadeia pesada são funcionais e estáveis na ausência de cadeia leve. Vide, por exemplo, Hamers-Casterman et al, Nature 363: 446448 (1993); Sheriff et al, Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996).

[086] Diversas delineações de HVR encontram-se em uso e são englobadas no presente. As Regiões de Determinação de Complementaridade (CDRs) de Kabat baseiam-se na variabilidade de sequências e são as mais comumente utilizadas (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). Chothia refere-se, per sua vez, ao local dos circuitos estruturais (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). As HVRs de AbM representam compromisso entre as HVRs de Kabat e os circuitos estruturais de Chothia e são utilizadas pelo software de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular. As HVRs de “contato” baseiam-se em análise das estruturas de cristal complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma destas HVRs são indicados abaixo.

Circ	Kabat	AbM	Chothia	Contato
L1	L24-L34	L24-L34	L26-L32	L30-L36
L2	L50-L56	L50-L56	L50-L52	L46-L55
L3	L89-L97	L89-L97	L91-L96	L89-L96
H1	H31-H35B	H26-H35B	H26-H32	H30-H35B
(numeração de Kabat)
H1	H31-H35	H26-H35	H26-H32	H30-H35
(numeração de Chothia)
H2	H50-H65	H50-H58	H53-H55	H47-H58
H3	H95-H102	H95-H102	H96-H101	H93-H101

[087] As HVRs podem compreender “HVRs estendidas”

32/118 conforme segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) no VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) no VH. Os resíduos de domínios variáveis são numerados de acordo com Kabat et al, acima, para cada uma dessas definições.

[088] “Regiões de estrutura” (FR) são os resíduos de domínios variáveis diferentes dos resíduos de CDR. Cada domínio variável contém tipicamente quatro FRs identificadas como FR1, FR2, FR3 e FR4. Caso as CDRs sejam definidas de acordo com Kabat, os resíduos de FR de cadeia leve são posicionados perto dos resíduos 1 a 23 (LCFR1), 35 a 49 (LCFR2), 57 a 88 (LCFR3) e 98 a 107 (LCFR4) e os resíduos de FR de cadeia pesada são posicionados perto dos resíduos 1 a 30 (HCFR1), 36 a 49 (HCFR2), 66 a 94 (HCFR3) e 103 a 113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada. Caso as CDRs compreendam resíduos de aminoácidos de circuitos hipervariáveis, os resíduos de FR de cadeia leve são posicionados perto dos resíduos 1 a 25 (LCFR1), 33 a 49 (LCFR2), 53 a 90 (LCFR3) e 97 a 107 (LCFR4) na cadeia leve e os resíduos de FR de cadeia pesada são posicionados perto dos resíduos 1 a 25 (HCFR1), 33 a 52 (HCFR2), 56 a 95 (HCFR3) e 102 a 113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada. Em alguns casos, quando a CDR compreender aminoácidos de uma CDR conforme definido por Kabat e os de um circuito hipervariável, os resíduos de FR serão ajustados proporcionalmente. Quando CDRH1 incluir os aminoácidos H26 a H35, por exemplo, os resíduos de FR1 de cadeia pesada encontram-se nas posições 1 a 25 e os resíduos de FR2 encontram-se nas posições 36 a 49.

[089] “Estrutura de consenso humano” é uma estrutura que representa os resíduos de aminoácidos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências de estrutura VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de sequências VL ou VH de imunoglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo

33/118 de sequências é um subgrupo como em Kabat et al. Em uma realização, para o VL, o subgrupo é subgrupo capa I como em Kabat. Em uma realização, para o VH, o subgrupo é subgrupo III como em Kabat.

[090] Um exemplo de anticorpo “intacto” é aquele que compreende um local de ligação de antígenos, bem como um Cl e pelo menos domínios contantes de cadeia pesada, Ch1, Ch2 e Ch3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequências nativas humanas) ou suas variantes de sequências de aminoácidos.

[091] “Fragmentos de anticorpos” compreendem uma parte de um anticorpo intacto, preferencialmente a região variável ou de ligação de antígenos do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab’, F(ab’)₂ e Fv; diacorpos (Db); diacorpos em conjunto (taDb), anticorpos lineares (por exemplo, Patente Norte-Americana n° 5.641.870, Exemplo 2; Zapata et al, Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995)); anticorpos com um braço, anticorpos com domínio variável único, minicorpos, moléculas de anticorpos de fita simples; e anticorpos multiespecíficos formados com fragmentos de anticorpos (incluindo, por exemplo, mas sem limitações, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3 e (scFV)4-Fc).

[092] A expressão “meio-anticorpo”, da forma utilizada no presente, designa uma cadeia pesada de imunoglobulina associada a uma cadeia leve de imunoglobulina. Um exemplo de meio-anticorpo é ilustrado na Figura 1A. Os técnicos no assunto apreciarão facilmente que um meioanticorpo pode englobar um de seus fragmentos e pode também ter um domínio de ligação de antígenos que consiste de um único domínio variável originário, por exemplo, de um camelídeo.

[093] Os inventores do presente descobriram inesperadamente que a otimização ou ajuste de pH de meio-anticorpos eluídos a partir de uma

34/118 coluna de Proteína A ou outra matriz sob baixo pH induziu alteração de conformação de polipeptídeos que contêm articulação tais como meioanticorpos. A otimização de pH em pH intermediário, às vezes denominada manutenção de pH ou manutenção de pH intermediário ao longo do presente relatório descritivo, pode causar precipitação ou agregação dos meioanticorpos. Desta forma, em certas realizações, o método de produção de uma proteína heteromultimérica compreende a etapa de fornecimento de um primeiro ou segundo polipeptídeo que contém articulação sob pH 5-9 na presença de um primeiro ou segundo solubilizante, respectivamente.

[094] Um solubilizante, da forma utilizada no presente, é definido como um reagente que evita ou reduz a precipitação de um polipeptídeo que contém articulação, tal como um meio-anticorpo. Um solubilizante apropriado inclui, sem limitações, arginina e histidina ou um de seus sais ou derivados e sacarose. Em algumas realizações, o solubilizante é arginina e/ou histidina. Em certas realizações, o solubilizante evita ou reduz a precipitação induzida por manutenção de pH intermediário e/ou aquecimento. Em certas realizações específicas, é adicionado um solubilizante antes da manutenção de pH intermediário (ou seja, antes do ajuste ao pH intermediário) e/ou aquecimento. Em certas realizações, a arginina ou histidina é um sal de arginina ou um sal de histidina. Em algumas outras realizações, a arginina ou histidina é um derivado de arginina ou derivado de histidina. Redução da precipitação pode gerar aumento de rendimento do produto final montado desejado.

[095] Imidazol e guanidina vêm sendo utilizados para solubilizar proteínas para preparação e purificação geral de proteínas. Descobriu-se inesperadamente, entretanto, que imidazol e guanidina isolados, fora do contexto de histidina ou arginina, respectivamente, foram insuficientes para aumentar o rendimento geral de proteína heteromultimérica montada conforme descrito no presente, tal como um anticorpo biespecífico. Em certas

35/118 realizações, imidazol e guanosina podem desnaturar as proteínas.

[096] De forma similar, detergentes tais como guanidina HCI e ureia são comumente utilizados para reduzir a agregação/precipitação em geral, mas podem desnaturar completamente a proteína. Desta forma, em certas realizações, o solubilizante evita ou reduz a precipitação sem desnaturar a proteína de interesse. Desta forma, em certas realizações específicas, o solubilizante não é guanidina HCI, guanidina, imidazol ou ureia. Em algumas outras realizações, as composições de acordo com a presente invenção não compreendem guanidina HCI ou ureia. Em algumas outras realizações, o solubilizante não é Tween nem PEG.

[097] Além disso, pode-se adicionar um estabilizante, por exemplo, durante manutenção de pH intermediário de cada meio-anticorpo ou durante a montagem na mistura dos polipeptídeos que contêm articulação ou meio-anticorpos ou logo em seguida. Pode-se adicionar um estabilizante à reação de um ou mais ou todas as etapas dos métodos de acordo com a presente invenção para evitar ou reduzir a agregação dos polipeptídeos que contêm articulação ou meio-anticorpos antes, durante e/ou depois da montagem.

[098] Podem ser detectados agregados como substâncias com alto peso molecular e, no contexto de meio-anticorpos, substâncias com alto peso molecular de mais de 150 kDa. Agregados podem ser detectados e quantificados, por exemplo, por meio de cromatografia de exclusão de tamanhos ou outros métodos apropriados. Em algumas outras realizações, os agregados detectados por meio de cromatografia de exclusão de tamanhos podem passar através de um filtro estéril de 0,2 pm. Proteínas precipitadas, por outro lado, podem ser compostas de proteínas desnaturadas ou proteínas agregadas que podem formar complexos muito grandes. Diversos reagentes foram testados e determinados como sendo ineficazes ou inadequados para

36/118 uso como estabilizantes, tais como imidazol, ácido 3-(A/-morfolino) propanossulfônico (MOPS), ácido 2-(A/-morfolino)etanossulfônico (MES), ciclodextrina, CuSO₄ e NaOAc. Desta forma, em certas realizações, o estabilizante não inclui sais inorgânicos nem metais de transição. Estabilizantes apropriados incluem, sem limitações, PVP, histidina e arginina. Redução da agregação pode gerar aumento de rendimento do produto final montado desejado.

[099] PVP é um polímero não carregado hidrossolúvel com um grupo pirrolidona. Em certas realizações, outros polímeros polares não carregados, outros reagentes ou compostos, especial mente compostos com estrutura e propriedades similares aos estabilizantes apropriados descritos no presente podem ser estabilizantes apropriados para uso na presente invenção. Encontra-se dentro da capacidade dos técnicos no assunto a determinação de um estabilizante apropriado por meio de análise do efeito do composto sobre os níveis de agregação por métodos conhecidos na técnica, incluindo os métodos fornecidos no presente.

[0100] Um reagente pode ser caracterizado como solubilizante e estabilizante. Arginina, por exemplo, pode ser utilizada como solubilizante para reduzir a precipitação de meio-anticorpos durante manutenção de pH intermediário e/ou aquecimento, bem como um estabilizante para reduzir a agregação durante a etapa de montagem. De forma similar, histidina pode ser utilizada como solubilizante para reduzir a precipitação, bem como um estabilizante para reduzir a agregação de meio-anticorpos durante a manutenção de pH intermediário e/ou aquecimento. Sem desejar limitações a nenhum mecanismo específico, em certas realizações, um solubilizante e um estabilizante podem funcionar evitando a interação de emplastros hidrofóbicos sobre as superfícies de proteínas que podem gerar agregação. Em outras realizações, um solubilizante e um estabilizante podem funcionar formando

37/118 clatratos para evitar a interação indesejada de proteínas.

[0101] A expressão “meio-anticorpo de fita simples”, da forma utilizada no presente, designa urn polipeptideo de fita simples que compreende um domínio VL, opcionalmente um domínio CL, um téter, um domínio VH, opcionalmente um domínio CH1, um domínio de articulação, um domínio CH2 e um domínio CH3, em que os mencionados domínios são posicionados entre si em direção N-terminal para C-terminal conforme segue: VL-téter-VHarticulação-CH2-CH3 ou VL-CL-téter-VH-CH1-articulação-CH2-CH3.

[0102] A expressão “anticorpos de domínio isolado” (sdAbs) ou “anticorpos de domínio variável isolado (SVD)” designa geralmente anticorpos nos quais um único domínio variável (VH ou VL) pode conferir ligação de antígenos. Em outras palavras, o domínio variável isolado não necessita interagir com outro domínio variável a fim de reconhecer o antígeno alvo. Exemplos de anticorpos de domínio isolado incluem os derivados de camelídeos (lhamas e camelos) e peixes cartilaginosos (tais como tubarõeslixa) e os derivados de métodos recombinantes de anticorpos de camundongos e humanos (Nature (1989) 341: 544-546; Dev. Comp. Immunol. (2006) 30: 4356; Trend Biochem. Sci. (2001) 26: 230-235; Trends Biotechnol. (2003): 21: 484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; Febs Lett. (1994) 339: 285-290; WO 00/29004; WO 02/051870).

[0103] A expressão “anticorpos lineares” geralmente designa os anticorpos descritos em Zapata et al, Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995). Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em conjunto (V_h-Ch1-V_h-Ch1) que, junto com os polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação de antígenos. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

[0104] A expressão tecnologia de “botão em orifício” ou “KnH”, da forma mencionada no presente, designa a tecnologia que dirige o

38/118 emparelhamento de dois polipeptídeos juntos in vitro ou in vivo por meio da introdução de uma protuberância (botão) em um polipeptídeo e uma cavidade (orifício) no outro polipeptídeo em uma interface na qual interagem. KnHs, por exemplo, foram introduzidos nas interfaces de ligação Fc:Fc, interfaces CL:CH1 ou interfaces VH/VL de anticorpos (por exemplo, US 2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431 e Zhu et al (1997), Protein Science 6: 781-788). Isso é especialmente útil para dirigir o emparelhamento de duas cadeias pesadas diferentes juntas durante a fabricação de anticorpos multiespecíficos. Anticorpos multiespecíficos que possuem KnH nas suas regiões Fc podem compreender adicionalmente, por exemplo, domínios variáveis isolados ligados a cada região Fc ou compreender adicionalmente domínios variáveis de cadeia pesada diferentes que se emparelham com domínios variáveis de cadeia leve similares ou diferentes. Tecnologia KnH pode também ser utilizada para emparelhar dois domínios extracelulares receptores diferentes juntos ou quaisquer outras sequências de polipeptídeos que compreendem sequências de reconhecimento de alvo diferentes (incluindo, por exemplo, corpos de afinidade, corpos de peptídeo e outras fusões Fc).

[0105] A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígenos idênticos, denominados fragmentos “Fab”, e um fragmento “Fc” residual, cuja designação reflete a capacidade de cristalização rápida. O fragmento de Fab consiste de uma cadeia L inteira, juntamente com o domínio de região variável da cadeia H (V_H) e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (Ch1). O tratamento com pepsina de um anticorpo gera um único fragmento F(ab’)₂ grande, que corresponde aproximadamente a dois fragmentos de Fab ligados por dissulfeto que possuem atividade de ligação de antígenos divalentes e ainda são capazes de reticular antígenos. Os fragmentos de Fab’ diferem dos fragmentos de Fab por conterem alguns resíduos adicionais no terminal carbóxi do domínio Ch1,

39/118 incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab’-SH é a designação do presente para Fab’ em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes apresenta(m) um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpos F(ab’)₂ foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos de Fab’ que contêm cisteínas de articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

[0106] O fragmento de Fc compreende as partes carbóxiterminais das duas cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras de anticorpos são determinadas por sequências na região Fc; esta região também é a parte reconhecida por receptores de Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células.

[0107] “Fv” consiste de um dímero de um domínio de região variável de cadeia leve e um de cadeia pesada em associação firme e não covalente. Da dobra desses dois domínios, emanam seis laços hipervariáveis (três laços da cadeia H e L cada) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação de antígenos e conferem especificidade de ligação de antígenos ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável isolado (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um antígeno) possui a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora frequentemente em afinidade menor que o local de ligação completo.

[0108] “Fv de fita simples”, também abreviado como “sFv” ou “scFv”, são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios de anticorpos V_H e V_L conectados a uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, o polipeptídeo de sFv compreende adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre os domínios V_H e V_L, o que permite que o sFv forme a estrutura desejada para ligação de antígenos. Para análise de sFv, vide Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315

40/118 (1994); Malmborg et al, J. Immunol. Methods 183: 7-13, 1995.

[0109] O termo “diacorpos” designa fragmentos de anticorpos pequenos preparados por meio da construção de fragmentos de sFv (vide parágrafo anterior) com ligantes curtos (cerca de cinco a dez resíduos) entre os domínios V_H e V_L, de forma a atingir-se o emparelhamento intercadeias mas não intracadeias dos domínios V, o que resulta em um fragmento bivalente, ou seja, um fragmento que contém dois locais de ligação de antígenos. Os diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos de sFv “cruzados”, em que os domínios V_H e V_L dos dois anticorpos estão presentes sobre diferentes cadeias de polipeptídeos. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404.097, WO 93/11161 e Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 90: 6444-6448 (1993).

[0110] A expressão “anticorpo com um braço” ou “anticorpos com um braço” designa um anticorpo que compreende (1) um domínio variável ligado por uma ligação de peptídeo a um polipeptídeo que compreende um domínio CH2, um domínio CH3 ou um domínio CH2-CH3 e (2) um segundo domínio CH2, CH3 ou CH2-CH3, em que um domínio variável não é unido por uma ligação de peptídeo a um polipeptídeo que compreende o segundo domínio CH2, CH3 ou CH2-CH3. Em uma realização, o anticorpo com um braço compreende três polipeptídeos: (1) um primeiro polipeptídeo que compreende um domínio variável (tal como VH), CH1, CH2 e CH3; (2) um segundo polipeptídeo que compreende um domínio variável (tal como VL) e um domínio CL; e (3) um terceiro polipeptídeo que compreende um domínio CH2 e CH3. Em uma realização, o terceiro polipeptídeo não compreende um domínio variável. Em outra realização, o anticorpo com um braço possui uma região de articulação parcial que contém os dois resíduos de cisteína que formam ligações de dissulfeto que ligam as cadeias pesadas constantes. Em uma realização, os domínios variáveis do anticorpo com um braço formam uma

41/118 região de ligação de antígenos. Em outra realização, um domínio variável do anticorpo com um braço é um domínio variável isolado, em que cada domínio variável isolado é uma região de ligação de antígenos.

[0111] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser anticorpos “quiméricos”, nos quais uma parte da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes de anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (vide Patente Norte-Americana n° 4.816.567; e Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 81: 6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse no presente incluem anticorpos primatizados que compreendem sequências de ligação de antígenos de domínio variável derivadas de primatas não humanos (por exemplo, Macaco do Velho Mundo, Chimpanzé etc.) e sequências de região constante humanas.

[0112] As formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada do anticorpo não humano. Em sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que apresente a capacidade, afinidade e especificidade de anticorpo desejada. Em alguns casos, os resíduos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são

42/118 encontrados no anticorpo receptor nem no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

[0113] “Complexo” ou “em complexo”, da forma utilizada no presente, designa a associação de duas ou mais moléculas que interagem entre si por meio de ligações e/ou forças (tais como forças de van der Waals, hidrofóbicas e hidrofílicas) que não são ligações de peptídeos. Em uma realização, o complexo é heteromultimérico. Dever-se-á compreender que a expressão “complexo de proteínas” ou “complexo de polipeptídeos”, da forma utilizada no presente, inclui complexos que contêm uma entidade não de proteína conjugada a uma proteína no complexo de proteínas (incluindo, por exemplo, mas sem limitações, moléculas químicas tais como uma toxina ou agente de detecção).

[0114] O termo “heteromultímero” ou “heteromultimérico”, da forma utilizada no presente, descreve dois ou mais polipeptídeos que interagem entre si por uma ligação covalente não peptídica (tal como ligação de dissulfeto) e/ou interação não covalente (tal como ligações de hidrogênio, ligações iônicas, forças de Van der Waals e interações hidrofóbicas), em que pelo menos duas das moléculas possuem sequências diferentes entre si.

43/118 [0115] Da forma utilizada no presente, “domínio de heteromultimerização” designa alterações ou adições a uma molécula biológica, de forma a promover a formação de heteromultímeros e obstruir a formação de homomultímeros. Qualquer domínio de heterodimerização que possui forte preferência pela formação de heterodímeros sobre homodímeros encontra-se dentro do escopo da presente invenção. Exemplos ilustrativos incluem, mas sem limitações, por exemplo, o Pedido de Patente NorteAmericano 20030078385 (Arathoon et al - Genentech; descreve botão em orifícios); WO 2007147901 (Kjaergaard et al - Novo Nordisk; descreve interações iônicas); WO 2009089004 (Kannan et al - Amgen; descreve efeitos de direcionamento eletrostático); WO 2010/034605 (Christensen et al Genentech; descreve bobinas enroladas). Vide também, por exemplo, Pack, P. e Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992), que descreve fecho de leucina, ou Pack et al, Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993), que descreve o motivo de hélice-volta-hélice. As expressões “domínio de heteromultimerização” e “domínio de heterodimerização” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Em certas realizações, o polipeptídeo que contém articulação compreende um ou mais domínios de heterodimerização.

[0116] Da forma utilizada no presente, o termo “imunoadesina” designa moléculas que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (“adesina”) com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada, em que a sequência de aminoácidos é diferente do local de ligação e reconhecimento de antígenos de um anticorpo (ou seja, é “heteróloga” em comparação com uma região constante de um anticorpo) e uma sequência de domínio constante de imunoglobulina (tal como uma sequência CH2 e/ou CH3 de IgG). Exemplos de sequências de adesina incluem sequências de

44/118 aminoácidos contíguas que compreendem uma porção de receptor ou ligante que se liga a uma proteína de interesse. Sequências de adesina podem também ser sequências que se ligam a uma proteína de interesse, mas não são sequências de ligantes ou receptores (tais como sequências de adesina em corpos de peptídeos). Essas sequências de polipeptídeos podem ser selecionadas ou identificadas por meio de diversos métodos, que incluem métodos de exibição de fagos e métodos de ordenamento de alto rendimento. A sequência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos lgG-1, IgG2, lgG-3 ou lgG-4, IgA (incluindo lgA-1 e lgA-2), IgE, IgD ou IgM.

[0117] Um anticorpo de acordo com a presente invenção “que liga” um antígeno de interesse é aquele que liga o antígeno com afinidade suficiente, de tal forma que o anticorpo seja útil como agente terapêutico e/ou de diagnóstico para dirigir-se a uma proteína, célula ou tecido que expressa o antígeno e não apresenta reação cruzada significativa com outras proteínas. Nessas realizações, a extensão da ligação do anticorpo a uma proteína “não alvo” será de menos de cerca de 10% da ligação do anticorpo à sua proteína alvo específica, conforme determinado por meio de análise de ordenamento de células ativado por fluorescência (FACS), radioimunoprecipitação (RIA) ou ELISA. Com relação à ligação de um anticorpo a uma molécula alvo, a expressão ligação específica, liga-se especificamente a ou é específica para um polipeptídeo específico ou epítopo sobre um polipeptídeo alvo específico indica ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica (uma interação não específica, por exemplo, pode ligar-se a caseína ou albumina de soro bovino). A ligação específica pode ser medida, por exemplo, por meio da determinação da ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula controle. A ligação específica pode ser determinada, por exemplo, por meio de competição com uma

45/118 molécula controle que é similar ao alvo, tal como excesso de alvo não marcado. Neste caso, indica-se ligação específica caso a ligação do alvo marcado a uma sonda seja competitivamente inibida por alvo não marcado em excesso. A expressão “ligação específica”, “liga-se especificamente a” ou “é específico para” um polipeptídeo específico ou um epítopo sobre um polipeptídeo alvo específico, da forma utilizada no presente, pode ser exibida, por exemplo, por uma molécula que possui Kd para o alvo de pelo menos cerca de 200 nM, alternativamente pelo menos cerca de 150 nM, alternativamente pelo menos cerca de 100 nM, alternativamente pelo menos cerca de 60 nM, alternativamente pelo menos cerca de 50 nM, alternativamente pelo menos cerca de 40 nM, alternativamente pelo menos cerca de 30 nM, alternativamente pelo menos cerca de 20 nM, alternativamente pelo menos cerca de 10 nM, alternativamente pelo menos cerca de 8 nM, alternativamente pelo menos cerca de 6 nM, alternativamente pelo menos cerca de 4 nM, alternativamente pelo menos cerca de 2 nM, alternativamente pelo menos cerca de 1 nM ou mais. Em uma realização, a expressão “ligação específica” indica ligação em que uma molécula liga-se a um polipeptídeo específico ou epítopo sobre um polipeptídeo específico sem ligação substancial a nenhum outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.

[0118] “Afinidade de ligação” geralmente designa a resistência da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (tal como um anticorpo) e seu parceiro de ligação (tal como um antígeno). A menos que indicado em contrário, da forma utilizada no presente, “afinidade de ligação” designa afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (tal como anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para o seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). Kd pode ser, por exemplo, cerca de 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM,

46/118 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM ou mais. A afinidade pode ser medida por meio de métodos comuns conhecidos na técnica, que incluem os descritos no presente. Anticorpos com baixa afinidade geralmente ligam antígeno lentamente e tendem a dissociar-se rapidamente, enquanto anticorpos com alta afinidade geralmente ligam antígeno mais rapidamente e tendem a permanecer ligados por mais tempo. Uma série de métodos de medição da afinidade de ligação é conhecida na técnica e qualquer um deles pode ser utilizado para os propósitos da presente invenção.

[0119] Em uma realização, “Kd” ou “valor Kd” de acordo com a presente invenção é medido utilizando testes de ressonância de plasma de superfície empregando BIAcore® 2000 ou BIAcore® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 ^QC com lascas de antígeno CM5 imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de Netil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 pg/ml (cerca de 0,2 μΜ) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingir cerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (por exemplo, 0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 ^QC sob velocidade de fluxo de cerca de 25 μΙ/min. Taxas de associação (k_on) θ taxas de dissociação (k_otf) são calculadas utilizando um modelo de ligação Langmuir um a um simples (Software de Avaliação BIAcore versão 3.2) por meio de configuração simultânea do sensograma de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como razão koff/k_on. Vide, por exemplo, Chen et al, J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). Caso a taxa

47/118 de associação exceda 10⁶ M'¹ s'¹ por meio do teste de ressonância de plasma de superfície acima, a taxa de associação pode ser determinada em seguida utilizando um método de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 ^QC de 20 nM de anticorpo antiantígeno (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em um espectrômetro, tal como espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou espectrofotômetro SLM-AMINCO® série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta vermelha agitada.

[0120] “Taxa ligada”, “taxa de associação” ou “k_on” de acordo com a presente invenção pode também ser determinada com o mesmo método de ressonância de plasma de superfície descrito acima utilizando BIAcore® 2000 ou BIAcore® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 ^QC com lascas de antígeno CM5 imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, até 5 pg/ml (cerca de 0,2 μΜ) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingir cerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (por exemplo, 0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 ^QC sob velocidade de fluxo de cerca de 25 μΙ/min. Taxas de associação (k_on) e taxas de dissociação (k_Off) são calculadas utilizando um modelo de ligação Langmuir um a um simples (Software de Avaliação BIAcore versão 3.2) por meio de configuração simultânea do

48/118 sensograma de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como razão koff/k_on. Vide, por exemplo, Chen et al, J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). Caso a taxa de associação exceda 10⁶ M'¹ s'¹por meio do teste de ressonância de plasma de superfície acima, a taxa de associação pode ser determinada em seguida utilizando um método de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 ^QC de 20 nM de anticorpo antiantígeno (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em espectrômetro, tal como espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou espectrofotômetro SLM-Aminco® série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada.

[0121] “Biologicamente ativo”, “atividade biológica” e “características biológicas”, com relação a um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, tal como seu anticorpo, fragmento ou derivado, indica que ele possui a capacidade de ligar-se a uma molécula biológica, exceto quando especificado de outra forma.

[0122] “Corpo de peptídeo” ou “corpos de peptídeo” designa uma fusão de peptídeos gerados aleatoriamente com um domínio Fc. Vide a Patente Norte-Americana n° 6.660.843, emitida em nove de dezembro de 2003 para Feige et al (integralmente incorporada como referência). Eles incluem um ou mais peptídeos ligados ao terminal N, terminal C, cadeias laterais de aminoácidos ou mais de um desses locais. Tecnologia de corpos de peptídeo permite o projeto de agentes terapêuticos que incorporam peptídeos que se dirigem a um ou mais ligantes ou receptores, peptídeos que abrigam tumores, peptídeos que transportam membranas e similares. Comprovou-se que a tecnologia de corpos de peptídeos é útil no projeto de uma série dessas moléculas, incluindo peptídeos lineares e restritos por dissulfeto, “multímeros

49/118 de peptídeos em conjunto” (ou seja, mais de um peptídeo sobre uma fita simples de um domínio Fc). Vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 6.660.843; Pedido de Patente Norte-Americano n° 2003/0195156, publicado em 16 de outubro de 2003 (correspondente a WO 02/092620, publicado em 21 de novembro de 2002); Pedido de Patente Norte-Americano n° 2003/0176352, publicado em 18 de setembro de 2003 (correspondente a WO 03/031589, publicado em 17 de abril de 2003); Número de Série Norte-Americano 09/422.838, depositado em 22 de outubro de 1999 (correspondente a WO 00/24770, publicado em 4 de maio de 2000); Pedido de Patente NorteAmericano n^Q 2003/0229023, publicado em 11 de dezembro de 2003; WO 03/057134, publicado em 17 de julho de 2003; Pedido de Patente NorteAmericano n^Q 2003/0236193, publicado em 25 de dezembro de 2003 (correspondente a PCT/US04/010989, depositado em 8 de abril de 2004); Número de Série Norte-Americano 10/666.480, depositado em 18 de setembro de 2003 (correspondente a WO 04/026329, publicado em 1^Q de abril de 2004), cada um dos quais integralmente incorporado ao presente como referência.

[0123] “Corpo de afinidade” ou “corpos de afinidade” designa o uso de uma proteína ligada por ligação de peptídeo a uma região Fc, em que a proteína é utilizada como armação para fornecer uma superfície de ligação para uma molécula alvo. A proteína frequentemente é uma proteína de ocorrência natural tal como proteína A de estafilococo ou domínio B de ligação de IgG, ou a proteína Z dela derivada (vide Nilsson et al (1987), Prot. Eng. 1, 107-133 e a Patente Norte-Americana n^Q 5.143.844) ou um de seus fragmentos ou derivados. Corpos de afinidade podem ser criados, por exemplo, a partir de variantes de proteínas Z que possuem afinidade de ligação alterada para molécula(s) alvo, em que um segmento da proteína Z sofreu mutação por meio de mutagênese aleatória para criar uma biblioteca de variantes capazes de ligar uma molécula alvo. Exemplos de corpos de afinidade incluem a Patente

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Norte-Americana n^Q 6.534.628, Nord, K. et al, Prot. Eng. 8: 601-608 (1995) e Nord, K. et al, Nat. Biotech. 15: 772-777 (1997), Biotechnol. Appl. Biochem., junho de 2008; 50 (Parte 2):97-112.

[0124] Heteromultimero “isolado” ou complexo indica um heteromultímero ou complexo que tenha sido separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente de cultivo celular natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interferiríam com utilizações em diagnóstico ou terapêuticas para o heteromultímero e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutes proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o heteromultímero será purificado (1) até mais de 95% em peso de proteína, conforme determinado por meio do método de Lowry, e, de maior preferência, mais de 99% em peso; (2) até grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos de sequência de aminoácidos interna ou N-terminal, utilizando um sequenciador de xícara de centrifugação; ou (3) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, manchas de prata.

[0125] Os heteromultímeros de acordo com a presente invenção são geralmente purificados até homogeneidade substancial. As expressões “substancialmente homogêneo”, “forma substancialmente homogênea” e “homogeneidade substancial” são utilizadas para indicar que o produto é substancialmente isento de subprodutos originados de combinações de polipeptídeos indesejadas (tais como homomultímeros).

[0126] Expressa em termos de pureza, homogeneidade substancial indica que a quantidade de subprodutos não excede 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 4%, 3%, 2% ou 1% em peso ou é de menos de 1% em peso. Em uma realização, o subproduto é de menos de 5%.

[0127] “Molécula biológica” designa um ácido nucleico, proteína,

51/118 carboidrato, lipídio e suas combinações. Em uma realização, a molécula biológica existe na natureza.

[0128] “Isolado”, quando utilizado para descrever os vários anticorpos descritos no presente, indica um anticorpo que tenha sido identificado e separado e/ou recuperado de uma célula ou cultivo celular do qual foi expresso. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que tipicamente interferiríam com utilizações em diagnóstico ou terapêuticas para o polipeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutes proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até grau suficiente para obter pelo menos quinze resíduos de sequência de aminoácidos interna ou N-terminal utilizando um sequenciador de xícara de centrifugação; ou (2) até a homogeneidade por meio de SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução, utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. Anticorpo isolado inclui anticorpos in situ em células recombinantes, já que pelo menos um componente do ambiente natural de polipeptídeo não estará presente. Normalmente, entretanto, o polipeptídeo isolado será preparado por meio de pelo menos uma etapa de purificação.

[0129] Por “ligado” ou “ligações”, da forma utilizada no presente, indica-se uma ligação de peptídeo direta entre uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos ou uma ligação que envolve uma terceira sequência de aminácidos que é ligada por peptídeo às primeira e segunda sequências de aminoácidos e entre elas. Um peptídeo ligante, por exemplo, ligado à extremidade C-terminal de uma sequência de aminoácidos e à extremidade Nterminal da outra sequência de aminoácidos.

[0130] Por “ligante”, da forma utilizada no presente, indica-se uma sequência de aminnoácidos com dois ou mais aminoácidos de comprimento. O ligante pode consistir de aminoácidos não polares ou polares

52/118 neutros. Um ligante pode ter, por exemplo, 2 a 100 aminoácidos de comprimento, tal como de 2 a 50 aminoácidos de comprimento, por exemplo 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos de comprimento. Um ligante pode ser “divisível”, por exemplo, por meio de autodivisão ou divisão química ou enzimática. Locais de divisão em sequências de aminácidos e enzimas e substâncias que dividem nesses locais são bem conhecidos na técnica e também descritos no presente.

[0131] Por “téter”, da forma utilizada no presente, indica-se um ligante de aminoácido que liga duas outras sequências de aminoácidos. Um téter conforme descrito no presente pode ligar o terminal N de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina ao terminal C de um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina. Em realizações específicas, o téter possui cerca de 15 a 50 aminoácidos de comprimento, tais como 20 a 26 aminoácidos de comprimento (por exemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 aminoácidos de comprimento). Um téter pode ser “divisível”, por exemplo, por meio de autodivisão, divisão química ou enzimática utilizando métodos e reagentes padrão na técnica. Em certas realizações específicas, o téter ocmpreende repetições Gly-Gly-Ser.

[0132] A divisão enzimática de um “ligante” ou “téter” pode envolver o uso de uma endopeptidase, tal como Lys-C, Asp-N, Arg-C, V8, GluC, quimiotripsina, tripsina, pepsina, papaína, trombina, Genenase, fator Xa, TEV (protease de cisteína de vírus de corrosão de fumo), enteroquinase, HRV C3 (protease C3 de rinovírus humano), Quininogenase, bem como convertases pró-proteína similares a subtilisina (tais como Furina (PC1), PC2 ou PC3) ou convertase dibásica de N-arginina. Divisão química pode envolver o uso, por exemplo, de hidroxilamina, N-clorossuccinimida, N-bromossuccinimida ou brometo de cianogênio.

[0133] “Local de divisão de endopeptidase Lys-C”, da forma

53/118 utilizada no presente, é um resíduo de Usina em uma sequência de aminoácidos que pode ser dividido no lado C-terminal por endopeptidase LysC. Endopeptidase Lys-C divide-se no lado C-terminal de um resíduo de lisina. Em certas realizações, o meio-anticorpo compreende adicionalmente uma mutação K222A na região de articulação para remover o local de divisão de endopeptidase Lys-C endógeno para preservar a estrutura do meio-anticorpo ou do anticorpo biespecífico montado mediante divisão do téter por endopeptidase Lys-C.

[0134] “Região de articulação” é geralmente definida como estendendo-se de Glu216 a Pro230 de lgG1 humano (Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985)). As regiões de articulação de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de lgG1 por meio da colocação dos primeiro e último resíduos de cisteína, formando ligações S-S intercadeias pesadas nas mesmas posições.

[0135] A “região de articulação inferior” de uma região Fc é normalmente definida como o estiramento de resíduos imediatamente Cterminais até a região de articulação, ou seja, os resíduos 233 a 239 da região Fc. Antes da presente invenção, a ligação de FcyR geralmente foi atribuída a resíduos de aminoácidos na região de articulação inferior de uma região Fc de IgG.

[0136] O “domínio CH2” de uma região Fc IgG humana normalmente estende-se a partir de cerca dos resíduos 231 até cerca de 340 de IgG. O domínio CH2 é exclusivo pelo fato de que não é emparelhado de perto com outro domínio. Por outro lado, duas cadeias de carboidrato ramificadas N-ligadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula IgG nativa intacta. Especulou-se que o carboidrato pode fornecer um substituto para o emparelhamento entre domínios e ajudar a estabilizar o domínio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985).

54/118 [0137] O “domínio CH3” compreende o estiramento de resíduos C-terminais até um domínio CH2 em uma região Fc (ou seja, de cerca do resíduo de aminoácido 341 até cerca do resíduo de aminoácido 447 de um IgG).

[0138] A expressão “região Fc” é utilizada no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora as fronteiras da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humano é normalmente definida como estendendo-se a partir de um resíduo de aminoácido na posição Cys226 ou de Pro230, até o seu terminal carboxila. A lisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo ou por meio de elaboração recombinante do ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada do anticorpo. Consequentemente, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpos com todos os resíduos K447 removidos, populações de anticorpos sem resíduos K447 removidos e populações de anticorpos que possuem uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447.

[0139] Uma “região Fc funcional” possui uma “função efetora” de uma região Fc de sequência nativa. Exemplos de “funções efetoras” incluem ligação de C1q, CDC, ligação de receptor Fc, ADCC, fagocitose, regulagem para baixo de receptores da superfície celular (tais como receptor de células B; BCR) etc. Essas funções efetoras geralmente necessitam que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (tal como um domínio variável de anticorpo) e podem ser determinadas utilizando vários testes conforme descrito, por exemplo, nas definições do presente.

[0140] Uma “região Fc de sequência nativa” compreende uma

55/118 sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Regiões Fc humanas de sequência nativa incluem uma região Fc de lgG1 humano de sequência nativa (alotipos A e não A); região Fc de lgG2 humano de sequência nativa; região Fc de lgG3 humano de sequência nativa; e região Fc de lgG4 humano de sequência nativa, bem como suas variantes de ocorrência natural.

[0141] “Região Fc variante” compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, preferencialmente uma ou mais substituições de aminoácidos. Preferencialmente, a região Fc variante contém pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo parental, tal como cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos e, preferencialmente, cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante do presente possuirá preferencialmente pelo menos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental e, de maior preferência, pelo menos cerca de 90% de homologia com ele, de maior preferência pelo menos cerca de 95% de homologia.

[0142] “Complexo de Fc”, da forma utilizada no presente, designa dois domínios CH2 de uma região Fc que interagem entre si e/ou dois domínios CH3 de uma região Fc que interagem entre si, em que os domínios CH2 e/ou os domínios CH3 interagem por meio de ligações e/ou forças (tais como forças de van der Waals, hidrofóbicas e hidrofílicas) que não são ligações de peptídeos.

[0143] “Componente Fc”, da forma utilizada no presente, designa uma região de articulação, um domínio CH2 ou um domínio CH3 de uma região

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Fc.

[0144] “Componente CH Fc” ou “FcCH”, da forma utilizada no presente, designa um polipeptídeo que compreende um domínio CH2, domínio CH3 ou domínios CH2 e CH3 de uma região Fc.

[0145] As “funções efetoras” de anticorpos designam as atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc com variação de sequência de aminoácidos) de um anticorpo e variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: citotoxicidade dependente de complemento e ligação de C1q; ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulagem para baixo de receptores da superfície celular (tais como receptores de células B); e ativação de células B.

[0146] Na presente invenção, “condição redutora” é definida com base no potencial redox em uma reação (por exemplo, em uma mistura de montagem) para indicar que o potencial redox da reação é negativo (-). O potencial redox da reação sob condições redutoras é preferencialmente de cerca de -50 a -600 mV, -100 a -600 mV, -200 a -600 mV, -100 a -500 mV, -150 a -300 mV, de maior preferência cerca de -300 a -500 mV e, de preferência superior, cerca de -400 mV.

[0147] Qualquer método apropriado pode ser utilizado para preparar uma condição redutora desejada. Pode ser preparada uma condição redutora desejada, por exemplo, por meio da adição de um redutor/agente redutor à reação (tal como uma mistura de montagem de acordo com a presente invenção). Redutores apropriados incluem, sem limitações, ditiotreitol (DTT), ír/s(2-carboxietil)fosfina (TCEP), ácido tioglicólico, ácido ascórbico, ácido tiol acético, glutationa (GSH), betamercaptoetilamina, cisteína/cistina, GSH/dissulfeto de glutationa (GSSG), cisteamina/cistamina, glicilcisteína e

57/118 betamercaptoetanol, preferencialmente GSH. Em certas realizações específicas, o redutor é um redutor fraco que inclui, sem limitações, GSH, betamercaptoetilamina, cisteína/cistina, GSH/GSSG, cisteamina/cistamina, glicilcisteína e betamercaptoetanol, preferencialmente GSH. Em certas realizações preferidas, o redutor é GSH. Encontra-se dentro da capacidade dos técnicos comuns no assunto a seleção de redutores apropriados sob concentrações adequadas e condições experimentais apropriadas para atingir, em uma reação, a condição redutora desejada. 10 mM de glutationa L-reduzida em uma solução com concentração de proteína de anticorpo biespecífica de 10 g/l a 20 ^QC, por exemplo, resultará em potencial redox inicial de cerca de -400 mV. Os técnicos no assunto podem utilizar quaisquer métodos apropriados para medir o potencial redox em uma dada reação.

[0148] A condição redutora da reação pode ser estimada e medida utilizando qualquer método apropriado conhecido na técnica. A condição redutora pode ser medida, por exemplo, utilizando um indicador de resazurina (descoloração de azul para incolor em condições redutoras). Para medição mais precisa, pode ser utilizado um medidor de potencial redox (tal como eletrodo ORP fabricado pela BROADLEY JAMES®).

[0149] Alternativamente, pode ser preparada uma condição redutora por meio da remoção de gases dissolvidos, especialmente oxigênio dissolvido, sob pressão reduzida de cerca de 10 mmHg ou menos, preferencialmente cerca de 5 mmHg ou menos, de maior preferência cerca de 3 mmHg ou menos, por cerca de um a sessenta minutos, preferencialmente por cerca de cinco a quarenta minutos.

[0150] Na presente invenção, prefere-se que sejam mantidas condições redutoras imediatamente após a mistura dos primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação (tais como meio-anticorpos) ao longo de toda a etapa de montagem. Em certas realizações, a reação ou a mistura de

58/118 montagem é mantida em condições de redução, preferencialmente por cerca de 50% ou mais, de maior preferência por cerca de 70% ou mais, de preferência ainda maior por cerca de 90% ou mais do tempo de reação. Prefere-se particularmente que o potencial redox do meio de reação seja mantido em cerca de -200 a -600 mV, de maior preferência de -300 a -500 mV, de preferência superior cerca de -400 mV, por cerca de 50% ou mais, de maior preferência por cerca de 70% ou mais, de preferência ainda maior por cerca de 90% ou mais do tempo de reação.

[0151] Em certas realizações específicas, a condição redutora é uma condição redutora fraca. A expressão “redutor fraco” ou “condição redutora fraca”, da forma utilizada no presente, designa um agente redutor ou condição de redução preparada pelo agente de redução que possui potencial de oxidação negativo a 25 ^QC. O potencial de oxidação do redutor é preferencialmente de -50 a -600 mV, -100 a -600 mV, -200 a -600 mV, -100 a 500 mV, -150 a -300 mV, de maior preferência cerca de -300 a -500 mV, de preferência superior cerca de -400 mV, em que opHéde7a9ea temperatura é de 15 ^QC a 39 ^QC. Os técnicos no assunto serão capazes de selecionar redutores apropriados para preparar uma condição de redução desejada. Os técnicos no assunto reconhecerão que um redutor forte, ou seja, que possui potencial de oxidação mais negativo que os redutores mencionados acima para a mesma concentração, pH e temperatura, pode ser utilizado em uma concentração mais baixa. Em uma realização preferida, as proteínas serão capazes de formar ligações de dissulfeto na presença do redutor quando incubadas sob as condições indicadas acima. Exemplos de redutor fraco incluem, sem limitações, glutationa, betamercaptoetilamina, cistina/cisteína, GSH/GSSG, cisteamina/cistamina, gliciclcisteína e betamercaptoetanol. Em certas realizações, potencial de oxidação similar à razão molar 200X de GSH: anticorpo pode ser utilizado como ponto de referência para condição

59/118 fracamente redutora na qual pode-se esperar montagem eficiente utilizando outros redutores.

[0152] “Mistura de montagem” é uma solução que compreende um primeiro polipeptídeo que contém articulação e um segundo polipeptídeo que contém articulação. Em certas realizações, a mistura de montagem está presente em condição redutora. Em algumas realizações, a mistura de montagem está presente em condição redutora fraca. Em algumas outras realizações, a mistura de montagem compreende adicionalmente um redutor fraco. O potencial de oxidação da mistura de montagem é de -50 a -600 mV, 100 a -600 mV, -200 a -600 mV, -100 a -500 mV, -150 a -300 mV, de maior preferência de cerca de -300 a -500 mV, de preferência superior cerca de -400 mV, em que opHéde7a9ea temperatura é de 15 ^QC a 39 ^QC.

[0153] Os reagentes disponíveis comercialmente indicados nos Exemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante, a menos que indicado em contrário. A fonte dessas células identificadas nos exemplos a seguir e em todo o relatório descritivo por números de acesso ATCC é a Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos, Manassas VA. A menos que indicado em contrário, a presente invenção utiliza procedimentos padrão de tecnologia de DNA recombinante, tais como os descritos acima e nos livrostexto a seguir: Sambrook et al, acima; Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates e Wiley Interscience, Nova Iorque, 1989); Innis et al, PCP Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc., Nova Iorque, 1990); Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al, Current Protocols in Immunology, 1991.

[0154] Ao longo de todo o presente relatório descritivo e das reivindicações, a palavra “compreende” ou variações tais como “compreendem”

60/118 ou “que compreende”, serão compreendidas como indicando a inclusão de um número inteiro ou grupo de números inteiros indicado, mas não a exclusão de nenhum outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

[0155] II. Construção de proteínas heteromultiméricas:

Tipicamente, as proteínas heteromultiméricas descritas no presente compreenderão uma parte significativa de uma região Fc de anticorpo. Em outros aspectos, entretanto, a cadeia pesada compreende apenas uma parte dos domínios Ch1 , Ch2 e/ou Ch3.

[0156] Domínios de heteromultimerização:

As proteínas heteromultiméricas compreendem um domínio de heteromultimerização. Para gerar uma população substancialmene homogênea de moléculas heterodiméricas, o domínio de heterodimerização deve ter forte preferência pela formação de heterodímeros sobre homodímeros. Embora as proteínas heteromultiméricas exemplificadas no presente utilizem a tecnologia de botões em orifícios para facilitar a heteromultimerização, os técnicos no assunto apreciarão outros domínios de heteromultimerização úteis na presente invenção.

[0157] Botões em orifícios:

O uso de botões em orifícios como método de produção de anticorpos multiespecíficos é bem conhecido na técnica. Vide a Patente NorteAmericana n^Q 5.731.168 concedida em 24 de março de 1998 e atribuída à Genentech, PCT publicado n^Q WO 2009089004 publicado em 16 de julho de 2009 e atribuído à Amgen e a Patente Norte-Americana publicada n^Q20090182127 publicada em 16 de julho de 2009 e atribuída à Novo Nordisk A/S. Vide também Marvin e Zhu, Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26 (6): 649-658 e Kontermann (2005), Acta Pharmacol. Sin., 26: 1-9. É fornecida uma breve discussão no presente.

[0158] “Protuberância” designa pelo menos uma cadeia lateral de

61/118 aminoácido que se projeta a partir da interface de um primeiro polipeptídeo e, portanto, pode ser posicionada em cavidade compensatória na interface adjacente (ou seja, a interface de um segundo polipeptídeo), de forma a estabilizar o heteromultímero e, desta forma, favorecer a formação de heteromultímeros sobre a formação de homomultímeros, por exemplo. A protuberância pode existir na interface original ou pode ser introduzida sinteticamente (alterando, por exemplo, ácido nucleico que codifica a interface). Normalmente, ácido nucleico que codifica a interface do primeiro polipeptídeo é alterado para codificar a protuberância. Para atingir isso, o ácido nucleico que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido “original” na interface do primeiro polipeptídeo é substituído por ácido nucleico que codifica pelo menos um resíduo “importado” que possui volume de cadeia lateral maior que o resíduo de aminoácido original. Apreciar-se-á que pode haver mais de um resíduo original e importado correspondente. O limite superior para a quantidade de resíduos originais que são substituídos é a quantidade total de resíduos na interface do primeiro polipeptídeo. Os volumes de cadeia lateral dos vários resíduos amino são exibidos na tabela a seguir.

Tabela 1 [0159] Propriedades de resíduos de aminoácidos:

Aminoácido	Abreviação de uma letra	Massa^a (daltons)	Volume^b(Angstrom³)	Extensão acessível⁰(Angstrom²)
Alanina (Ala)	A	71,08	88,6	115
Arginina (Arg)	R	156,20	173,4	225
Asparagina (Asn)	N	114,11	117,7	160
Ácido aspártico (Asp)	D	115,09	111,1	150
Cisteína (Cys)	C	103,14	108,5	135

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Aminoácido	Abreviação de uma letra	Massa^a (daltons)	Volume^b(Angstrom³)	Extensão acessível⁰(Angstrom²)
Glutamina (Gin)	Q	128,14	143,9	180
Ácido glutâmico (Glu)	E	129,12	138,4	190
Glicina (Gly)	G	57,06	60,1	75
Histidina (His)	H	137,15	153,2	195
Isoleucina (lie)	I	113,17	166,7	175
Leucina (Leu)	L	113,17	166,7	170
Lisina (Lys)	K	128,18	168,6	200
Metionina (Met)	M	131,21	162,9	185
Fenilalinina (Phe)	F	147,18	189,9	210
Prolina (Pro)	P	97,12	122,7	145
Serina (Ser)	S	87,08	89,0	115
Treonina (Thr)	T	101,11	116,1	140
Triptofano (Trp)	w	186,21	227,8	255
Tirosina (Tyr)	Y	163,18	193,6	230
Valina (Vai)	V	99,14	140,0	155

^a Peso molecular do aminoácido menos o da água. Valores de

Handbook of Chemistry and Physics, 43^ã ed., Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961.

^b Valores de A. A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24: 107123, 1972.

^c Valores de C. Chothia, J. Mol. Biol. 105: 1-14, 1975. A extensão acessível é definida nas Figuras 6 a 20 dessa referência.

[0160] Os resíduos de importação preferidos para a formação de protuberância são geralmente resíduos de aminoácidos de ocorrência natural e

63/118 são preferencialmente selecionados a partir de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W). São de preferência superior triptofano e tirosina. Em uma realização, o resíduo original para a formação da protuberância possui pequeno volume de cadeia lateral, tal como alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina ou valina. Exemplos de substituições de aminoácidos no domínio CH3 para formar a protuberância incluem, sem limitações, a substituição T366W.

[0161] “Cavidade” designa pelo menos uma cadeia lateral de aminoácido que sofre recesso da interface de um segundo polipeptídeo e, portanto, acomoda uma protuberância correspondente sobre a interface adjacente de um primeiro polipeptídeo. A cavidade pode existir na interface original ou pode ser introduzida sinteticamente (alterando, por exemplo, ácido nucleico que codifica a interface). Normalmente, ácido nucleico que codifica a interface do segundo polipeptídeo é alterado para codificar a cavidade. Para atingir isso, o ácido nucleico que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido “original” na interface do segundo polipeptídeo é substituído por DNA que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido “importado” que possui volume de cadeia lateral menor que o resíduo de aminoácido original. Apreciar-se-á que pode haver mais de um resíduo original e importado correspondente. O limite superior para a quantidade de resíduos originais que são substituídos é a quantidade total de resíduos na interface do segundo polipeptídeo. Os volumes de cadeia lateral dos vários resíduos amino são exibidos na Tabela 1 acima. Os resíduos importados preferidos para formação de cavidade normalmente são resíduos de aminoácidos de ocorrência natural e são preferencialmente selecionados a partir de alanina (A), serina (S), treonina (T) e valina (V). São de preferência superior serina, alanina ou treonina. Em uma realização, o resíduo original para a formação da cavidade possui grande volume de cadeia lateral, tal como tirosina, arginina, fenilalanina ou triptofano.

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Exemplos de substituições de aminoácidos no domínio CH3 para gerar a cavidade incluem, sem limitações, as substituições T366S, L368A, Y407A, Y407T e Y407V. Em certas realizações, o meio-anticorpo de botão compreende substituição T366W e o meio-anticorpo de orifício compreende as substituições T366S/L368A/Y407V.

[0162] Resíduo de aminoácido “original” é aquele que é substituído por resíduo “importado” que pode possuir volume de cadeia lateral menor ou maior que o resíduo original. O resíduo de aminoácido importado pode ser um resíduo de aminoácido de ocorrência natural ou não de ocorrência natural, mas é preferencialmente o primeiro. Resíduos de aminoácidos “de ocorrência natural” são os resíduos codificados pelo código genético e relacionados na Tabela 1 acima. Resíduo de aminoácido “não de ocorrência natural” designa um resíduo que não é codificado pelo código genético, mas que é capaz de ligar covalentemente resíduo(s) de aminoácido(s) adjacente(s) na cadeia de polipeptídeo. Exemplos de resíduos de aminoácidos não de ocorrência natural são norleucina, ornitina, norvalina, homosserina e outros análogos de resíduos de aminoácidos, tais como os descritos em Ellman et al, Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991), por exemplo. Para gerar esses resíduos de aminoácidos não de ocorrência natural, podem ser utilizados os procedimentos de Noren et al, Science 244: 182 (1989) e Ellman et al, acima. Resumidamente, estes procedimentos envolvem a ativação química de um tRNA supressor com um resíduo de aminoácido não de ocorrência natural seguido por transcrição e tradução do RNA in vitro. O método de acordo com a presente invenção envolve a substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido original, mas mais de um resíduo original pode ser substituído. Normalmente, não mais que o total de resíduos na interface do primeiro ou segundo polipeptídeo compreenderá resíduos de aminoácidos originais que são substituídos. Tipicamente, os resíduos originais para substituição são “enterrados”. Por

65/118 “enterrado”, indica-se que o resíduo é essencialmente inacessível ao solvente. Geralmente, o resíduo importado não é cisteína, para evitar possível oxidação ou desemparelhamento de ligações de dissulfeto.

[0163] A protuberância é “posicionável” na cavidade, o que significa que a localização espacial da protuberância e da cavidade sobre a interface de um primeiro polipeptídeo e segundo polipeptídeo, respectivamente, e os tamanhos da protuberância e da cavidade são tais que a protuberância pode ser localizada na cavidade sem perturbar significativamente a associação normal dos primeiro e segundo polipeptídeos na interface. Como protuberâncias tais como Tyr, Phe e Trp tipicamente não se estendem perpendicularmente a partir do eixo da interface e possuem conformações preferidas, o alinhamento de uma protuberância com cavidade correspondente depende da modelagem do par de protuberância e cavidade com base em estrutura tridimensional, tal como a obtida por meio de cristalografia de raio X ou ressonância magnética nuclear (NMR). Isso pode ser atingido utilizando métodos amplamente aceitos na técnica.

[0164] Por “ácido nucleico original ou modelo”, indica-se o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse que pode ser “alterado” (ou seja, geneticamente elaborado ou que sofreu mutação) para codificar protuberância ou cavidade. O ácido nucleico original ou inicial pode ser um ácido nucleico de ocorrência natural ou pode compreender um ácido nucleico que tenha sido submetido a alteração anterior (por exemplo, um fragmento de anticorpo humanizado). Por “alteração” do ácido nucleico, indica-se que o ácido nucleico original sofre mutação por meio de inserção, exclusão ou substituição de pelo menos um códon que codifica um resíduo de aminoácido de interesse. Normalmente, um códon que codifica um resíduo original é substituído por um códon que codifica um resíduo importado. Os métodos de modificação genética de DNA desta forma foram analisados em Mutagenesis: a Practical Approach,

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M. J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, Reino Unido (1991)) e incluem, por exemplo, mutagênese dirigida a local, mutagênese de conjunto e mutagênese de reação em cadeia de polimerase (PCR). Por mutação de ácido nucleico original/modelo, um polipeptídeo original/modelo codificado pelo ácido nucleico original/modelo é, portanto, consequentemente, alterado.

[0165] A protuberância ou cavidade pode ser “introduzida” na interface de um primeiro ou segundo polipeptídeo por meios sintéticos, tal como por métodos recombinantes, síntese de peptídeos in vitro, em que estes métodos destinam-se a introduzir resíduos de aminoácidos não de ocorrência natural descritos anteriormente, por meio de acoplamento enzimático ou químico de peptídeos ou alguma combinação destes métodos. Consequentemente, a protuberância ou cavidade que é “introduzida” é de ocorrência não natural” ou “não nativa”, o que significa que não existe na natureza nem no polipeptídeo original (tal como um anticorpo monoclonal humanizado).

[0166] Geralmente, o resíduo de aminoácido importado para a formação da protuberância possui uma quantidade relativamente pequena de “rotâmeros” (tal como cerca de 3 a 6). “Rotâmero” é uma conformação energeticamente favorável de uma cadeia lateral de aminoácido. A quantidade de rotâmeros dos diversos resíduos de aminoácidos é analisada em Ponders e Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987).

[0167] III. Vetores, células hospedeiras e métodos recombinantes:

Para a produção recombinante de uma proteína heteromultimérica (tal como um anticorpo biespecífico) de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico que o codifica é isolado e inserido em um vetor reproduzível para clonagem adicional (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA codificador do anticorpo é facilmente isolado e sequenciado

67/118 utilizando procedimentos convencionais (por meio, por exemplo, do uso de sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de unir-se especificamente a genes codificadores das cadeias pesada e leve do anticorpo). Diversos vetores são disponíveis. O vetor selecionado depende em parte da célula hospedeira a ser utilizada. Geralmente, células hospedeiras preferidas são de origem procariótica ou eucariótica (geralmente de mamíferos, mas também incluindo fungos (tais como leveduras), insetos, plantas e células nucleadas de outros organismos multicelulares). Apreciar-se-á que regiões constantes de qualquer isotipo podem ser utilizadas com este propósito, incluindo regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, e que essas regiões constantes podem ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ou animal. Em certas realizações, a região constante é de IgG, particularmente IgG 1, lgG2 ou lgG4.

[0168] Uma célula hospedeira é elaborada de tal forma que expresse um polipeptídeo que contém articulação e compreende um domínio de heterodimerização em que a célula hospedeira não expressa um polipeptídeo que contém articulação e compreende um segundo domínio de heterodimerização.

a. Geração de proteínas heteromultiméricas utilizando células hospedeiras procarióticas:

i. Construção de vetores:

As sequências de polinucleotídeos que codificam componentes de polipeptídeos das proteínas heteromultiméricas (tais como anticorpos) de acordo com a presente invenção podem ser obtidas utilizando métodos recombinantes padrão. As sequências de polinucleotídeos desejadas podem ser isoladas e sequenciadas, por exemplo, a partir de células produtoras de anticorpos, tais como células de hibridoma. Alternativamente, polinucleotídeos podem ser sintetizados utilizando um sintetizador de nucleotídeos ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas, as sequências que codificam os polipeptídeos são inseridas em um vetor recombinante capaz de reproduzir e expressar polinucleotídeos heterólogos em hospedeiros

68/118 procarióticos. Muitos vetores que são disponíveis e conhecidos na técnica podem ser utilizados para o propósito da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho dos ácidos nucleicos a serem inseridos no vetor e da célula hospedeira específica a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes, dependendo da sua função (amplificação ou expressão de polinucleotídeo heterólogo, ou ambos) e sua compatibilidade com a célula hospedeira específica na qual reside. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas sem limitações: origem de reprodução, gene marcador de seleção, promotor, local de ligação de ribossomos (RBS), sequência de sinais, inserto de ácido nucleico heterólogo e sequência de término de transcrição.

[0169] Geralmente, os vetores de plasmídeos que contêm sequências de controle e réplica que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são utilizados com relação a esses hospedeiros. O vetor normalmente conduz um local de reprodução, bem como sequências de marcação que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. E. coli, por exemplo, é tipicamente transformado utilizando pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli. pBR322 contém genes que codificam resistência à ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) e, portanto, fornece meios fáceis de identificação de células transformadas. pBR322, seus derivados ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófago podem também conter ou ser modificados para que contenham promotores que podem ser utilizados pelo organismo microbiano para a expressão de proteínas endógenas. Exemplos de derivados de pBR322 utilizados para a expressão de anticorpos específicos são descritos em detalhes em Carter et al, Patente Norte-Americana n° 5.648.237.

[0170] Além disso, vetores de fagos que contêm sequências de controle e de réplica que são compatíveis com o micro-organismo hospedeiro podem ser utilizados como vetores de transformação com relação a esses

69/118 hospedeiros. Bacteriófagos tais como ÀGEM.TM.-11, por exemplo, podem ser utilizados na fabricação de vetores recombinantes que podem ser utilizados para transformar células hospedeiras suscetíveis tais como E. coli LE392.

[0171] O vetor de expressão de acordo com a presente invenção pode compreender dois ou mais pares de promotor e cistron, que codificam cada um dos componentes de polipeptídeos. Promotor é uma sequência reguladora não traduzida localizada acima no fluxo (5’) para um cistron que modula a sua expressão. Promotores procarióticos enquadram-se tipicamente em duas classes, indutível e constitutivo. O promotor indutível é um promotor que inicia níveis mais altos de transcrição do cistron sob o seu controle em resposta a alterações das condições de cultivo, tais como a presença ou ausência de nutrientes ou mudança de temperatura.

[0172] É bem conhecida uma grande quantidade de promotores reconhecidos por uma série de células hospedeiras potenciais. O promotor selecionado pode ser ligado operativamente a DNA de cistron que codifica, por exemplo, a cadeia leve ou pesada por meio de remoção do promotor do DNA fonte por meio de digestão de enzimas de restrição e inserção da sequência promotora isolada no vetor de acordo com a presente invenção. Tanto a sequência promotora nativa quanto muitos promotores heterólogos podem ser utilizados para dirigir a amplificação e/ou a expressão dos genes alvo. Em algumas realizações, são utilizados promotores heterólogos, pois eles geralmente permitem maior transcrição e rendimentos mais altos do gene alvo expresso em comparação com o promotor de polipeptídeo alvo nativo.

[0173] Os promotores apropriados para uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor PhoA, os sistemas promotores de lactose e βgalactamase, sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, tais como o promotor tac ou trc. Entretanto, outros promotores que são funcionais em bactérias (tais como outros promotores de fagos ou bacterianos

70/118 conhecidos) também são apropriados. Suas sequências de nucleotídeos foram publicadas, de forma a permitir que os técnicos no assunto as liguem operativamente a cistrons que codificam os genes da proteína heteromultimérica, tais como as cadeias leve e pesada alvo (Siebenlist et al (1980), Cell, 20: 269) utilizando ligantes ou adaptadores para fornecer qualquer local de restrição necessário.

[0174] Em um aspecto da presente invenção, cada cistron dentro do vetor recombinante compreende um componente de sequência de sinal de secreção que dirige a translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. De forma geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor ou pode ser uma parte do DNA de polipeptídeo alvo que é inserida no vetor. A sequência de sinal selecionada para o propósito da presente invenção deverá ser reconhecida e processada (ou seja, dividida por peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam as sequências de sinal nativas para os polipeptídeos heterólogos, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariótico selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina II estáveis ao calor (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA e MBP. Em uma realização da presente invenção, as sequências de sinais utilizadas nos dois cistrons do sistema de expressão são sequências de sinais de STII ou suas variantes.

[0175] Em outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo com a presente invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira e, portanto, não necessita da presença de sequências de sinal de secreção em cada cistron. Neste particular, cadeias leve e pesada de imunoglobulina são expressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais dentro do citoplasma. Certas linhagens hospedeiras (tais como as linhagens E. coli trxB') fornecem condições de citoplasma que

71/118 são favoráveis para a formação de ligações de dissulfeto, de forma a permitir dobra e montagem adequadas das subunidades de proteínas expressas. Vide Proba e Pluckthun, Gene, 159: 203 (1995).

[0176] Células hospedeiras procarióticas apropriadas para a expressão de proteínas heteromultiméricas (tais como anticorpos) de acordo com a presente invenção incluem arcaebactérias e eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (tal como E. coli), Bacilli (tal como B. subtilis), enterobactérias, espécies de Pseudomonas (tais como P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebisella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla ou Paracoccus. Em uma realização, são utilizadas células gram-negativas. Em uma realização, células de E. coli são utilizadas como hospedeiros para a presente invenção. Exemplos de linhagens de E. coli incluem linhagem W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington DC, Sociedade Norte-Americana de Microbiologia, 1987), págs. 1190-1219; Depósito ATCC n^Q 27.325) e seus derivados, incluindo linhagem 33D3 que possui genótipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA (nmpc-fepE) degP41 kan^R (Patente Norte-Americana n^Q 5.639.635). Outras linhagens e seus derivados, tais como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E. colix 1776 (ATCC 31.537) e E. coli RV308 (ATCC 31.608) também são apropriadas. Em uma realização, E. coli ΔΙρρ encontra uso específico. Estes exemplos são ilustrativos e não limitadores. Métodos de construção de derivados de quaisquer das bactérias mencionadas acima que possuem genótipos definidos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Bass et al, Proteins, 8: 309-314 (1990). Geralmente é necessário selecionar a bactéria apropriada considerando a capacidade de reprodução da réplica nas células de bactéria. Espécies de E. coli, Serratia ou Salmonella, por exemplo, podem ser utilizadas adequadamente como hospedeiro ao empregar-se

72/118 plasmídeos bem conhecidos, tais como pBR322, pBR325, pACYC177 ou pKN410 para fornecer a réplica. Tipicamente, a célula hospedeira deverá secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas e inibidores de protease adicionais podem ser desejável mente incorporados ao cultivo celular.

[0177] ii. Produção de polipeptídeos:

Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão descritos acima e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção de transformadores ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas.

[0178] Transformação indica a introdução de DNA no hospedeiro procariótico, de tal forma que o DNA seja reproduzível, seja na forma de elemento extracromossômico ou por integrante cromossômico. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando técnicas padrão apropriadas para essas células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio é geralmente utilizado para células bacterianas que contêm barreiras de parede celular substanciais. Outro método de transformação emprega polietileno glicol/DMSO. Ainda outro método comumente utilizado é a eletroporação.

[0179] As células procarióticas utilizadas para produzir os polipeptídeos de acordo com a presente invenção são cultivadas em meios conhecidos na técnica e apropriados para cultivo das células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meios apropriados incluem caldo Luria (LB) mais os suplementos nutrientes necessários. Em algumas realizações, os meios também contêm um agente de seleção, selecionado com base na construção do vetor de expressão, para permitir seletivamente o crescimento de células procarióticas que contenham o vetor de expressão. Ampicilina é adicionada aos meios, por exemplo, para crescimento de células que expressem o gene

73/118 resistente à ampicilina.

[0180] Quaisquer suplementos necessários além de fontes de carbono, nitrogênio e fosfato inorgânico podem também ser incluídos em concentrações apropriadas introduzidas isoladamente ou na forma de mistura com outro suplemento ou meio, tal como uma fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente, o meio de cultivo pode conter um ou mais agentes redutores selecionados a partir do grupo que consiste de glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.

[0181] As células hospedeiras procarióticas são cultivadas sob temperaturas apropriadas. Para crescimento de E. coli, por exemplo, a temperatura preferida varia de cerca de 20 °C a cerca de 39 °C, de maior preferência cerca de 25 °C a cerca de 37 °C, de preferência ainda maior cerca de 30 °C. O pH do meio pode ser qualquer pH que varie de cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para E. coli, o pH é preferencialmente de cerca de 6,8 a cerca de 7,4 e, de maior preferência, cerca de 7,0.

[0182] Caso seja utilizado promotor indutível no vetor de expressão de acordo com a presente invenção, a expressão de proteínas é induzida sob condições apropriadas para a ativação do promotor. Em um aspecto da presente invenção, promotores de PhoA são utillizados para o controle da transcrição dos polipeptídeos. Consequentemente, as células hospedeiras transformadas são cultivadas em meio limitador de fosfato para indução. Preferencialmente, o meio limitador de fosfato é o meio C. R. A. P. (vide, por exemplo, Simmons et al, J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). Uma série de outros indutores pode ser utilizada, de acordo com a construção de vetor empregada, como é conhecido na técnica.

[0183] Em uma realização, as primeira e segunda células hospedeiras que contêm articulação são cultivadas separadamente e os

74/118 polipeptídeos expressos de acordo com a presente invenção são secretados e recuperados do periplasma das células hospedeiras separadamente. Em uma segunda realização, as primeira e segunda células hospedeiras que contêm articulação são cultivadas separadamente e, antes do isolamento dos polipeptídeos que contêm articulação, os dois cultivos de células hospedeiras são misturados entre si e as células são peletizadas. Em uma terceira realização, as primeira e segunda células hospedeiras que contêm articulação são cultivadas separadamente, centrifugadas, novamente suspensas separadamente e misturadas em seguida antes do isolamento dos polipeptídeos que contêm articulação. Em uma quarta realização, as primeira e segunda células hospedeiras que contêm articulação são cultivadas juntas no mesmo recipiente de cultivo. A recuperação de proteína envolve tipicamente o rompimento da membrana celular do micro-organismo, geralmente por meios tais como choque osmótico, sonicação ou lise. Após o rompimento das células, fragmentos celulares ou células inteiras podem ser removidas por meio de centrifugação ou filtragem. As proteínas podem ser adicionalmente purificadas, por exemplo, por meio de cromatografia de resina de afinidade. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas ou secretadas para o meio de cultivo e nele isoladas. Proteínas recombinantes expressas com uma marca de sequência exógena (ou marca de epítopo) podem facilitar a etapa de purificação. O método de clonagem e purificação de proteínas que contêm uma marca de sequência exógena (incluindo, sem limitações, a marca His e a marca GST) é bem conhecido na técnica. As células podem ser removidas do cultivo e o sobrenadante de cultivo é filtrado e concentrado para purificação adicional das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressos podem ser adicionalmente isolados e identificados utilizando métodos comumente conhecidos, tais como eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) e teste Western Blot. Os polipeptídeos isolados serão utilizados para produzir as

75/118 proteínas heteromultiméricas.

[0184] Em um aspecto da presente invenção, a produção de proteínas heteromultiméricas (tais como anticorpos) é conduzida em grande quantidade por meio de um processo de fermentação. Vários procedimentos de fermentação de alimentação de bateladas em larga escala são disponíveis para a produção de proteínas recombinantes. As fermentações em larga escala possuem capacidade de pelo menos mil litros, preferencialmente cerca de 1000 a 100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores utilizam impulsionadores agitadores para distribuir oxigênio e nutrientes, especialmente glicose (a fonte de carbono e energia preferida). Fermentação em pequena escala refere-se geralmente a fermentação em um fermentador que possui capacidade volumétrica de não mais de cerca de cem litros e pode variar de cerca de um litro a cerca de cem litros.

[0185] Em um processo de fermentação, a indução da expressão de proteína é tipicamente iniciada após o cultivo das células sob condições apropriadas até densidade desejada, tal como OD550 de cerca de 180 a 220, estágio em que as células encontram-se na fase estacionária inicial. Uma série de indutores pode ser utilizada, de acordo com a construção de vetor empregada, como é conhecido na técnica e descrito acima. As células podem ser cultivadas por períodos mais curtos antes da indução. As células são normalmente induzidas por cerca de doze a cinquenta horas, embora possa ser utilizado tempo de indução mais longo ou mais curto.

[0186] Para aumentar 0 rendimento de produção e a qualidade dos polipeptídeos de acordo com a presente invenção, várias condições de fermentação podem ser modificadas. Para melhorar a montagem adequada e a dobra das proteínas heteromultiméricas secretadas (tais como anticorpos), por exemplo, vetores adicionais que sobre-expressam proteínas chaperone, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e/ou DsbG) ou FkpA

76/118 (peptidilprolil cis, trans-isomerase com atividade de chaperone), podem ser utilizados para cotransformar as células procarióticas hospedeiras. Demonstrou-se que as proteínas de chaperone facilitam a dobra e solubilidade adequadas de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et al (1999), J. Bio. Chem. 274: 19601-19605; Georgiou et al, Patente Norte-Americana n° 6.083.715; Georgiou et al, Patente NorteAmericana n° 6.027.888; Bothmann e Pluckthun (2000), J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000), J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al (2001), Mol. Microbiol. 39: 199-210.

[0187] Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas (especialmente as que são proteoliticamente sensíveis), certas linhagens hospedeiras com deficiência de enzimas proteolíticas podem ser utilizadas para a presente invenção. Linhagens de células hospedeiras podem ser modificadas, por exemplo, para efetuar mutação(ões) genética(s) nos genes que codificam proteases bacterianas conhecidas, tais como Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e suas combinações. Algumas linhagens com deficiência de protease de E. coli são disponíveis e descritas, por exemplo, em Joly et al (1998), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 95: 2773-2777; Georgiou et al, Patente Norte-Americana n° 5.264.365; Georgiou et al, Patente Norte-Americana n° 5.508.192; Hara et al, Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996).

[0188] Em uma realização, linhagens de E. coli com deficiência de enzimas proteolíticas e transformadas com plasmídeos que sobreexpressam uma ou mais proteínas chaperone são utilizadas como células hospedeiras no sistema de expressão de acordo com a presente invenção. Em uma segunda realização, a linhagem de E. coli possui deficiência de uma lipoproteína da membrana externa (ΔΙρρ).

[0189] ill. Purificação de proteínas heteromultiméricas:

77/118 [0190] Em uma realização, a proteína heteromultimérica produzida no presente é adicionalmente purificada para obter preparações que são substancialmente homogêneas para testes e usos adicionais. Podem ser empregados métodos de purificação de proteínas padrão conhecidos na técnica. Os procedimentos a seguir são exemplos de procedimentos de purificação apropriados: fracionamento sobre imunoafinidade ou colunas de troca de íons; precipitação em etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia sobre silica ou sobre resina de troca de íons, tal como DEAE; cromatoconcentração; SDS-PAGE, precipitação de sulfato de amônio e filtragem de gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75.

[0191] Em um aspecto, Proteína A imobilizada sobre fase sólida é utilizada para purificação de imunoafinidade, por exemplo, dos produtos de anticorpos de comprimento total ou meio-anticorpo de acordo com a presente invenção. Proteína A é uma proteína de parede celular de 41 kD de Staphylococcus aureus que se liga com alta afinidade à região Fc de anticorpos. Lindmark et al (1983), J. Immunol. Meth. 62: 1-13. A fase sólida à qual a Proteína A é imobilizada é preferencialmente uma coluna que compreende uma superfície de vidro ou silica, de maior preferência uma coluna de vidro com poros controlados ou coluna de ácido silícico. Em algumas aplicações, a coluna foi revestida com um reagente, tal como glicerol, para tentar evitar a aderência não específica de contaminantes.

[0192] Como primeira etapa da purificação, a preparação derivada do cultivo celular conforme descrito acima é aplicada sobre a fase sólida imobilizada com Proteína A para permitir a ligação específica do anticorpo de interesse à Proteína A. A fase sólida é lavada em seguida para remover contaminantes ligados de forma não específica à fase sólida. A proteína heteromultimérica (tal como anticorpo) é recuperada da fase sólida por meio de eluição.

78/118 [0193] b. Geração de proteínas heteromultiméricas utilizando células hospedeiras eucarióticas:

Os componentes do vetor geralmente incluem, mas sem limitações, um ou mais dos seguintes: sequência de sinal, origem de reprodução, um ou mais genes marcadores, elemento amplificador, promotor e sequência de término de transcrição.

[0194] i. Componente de sequência de sinal:

Um vetor para uso em células hospedeiras eucarióticsa pode também conter uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo que possui local de divisão específico no terminal N da proteína madura ou polipeptídeo de interesse. A sequência de sinal heterólogo preferencialmente selecionada é reconhecida e processada (ou seja, dividida por peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Em expressão de células de mamíferos, sequências de sinal de mamíferos, bem como líderes de secreção viral, tais como o sinal simplex gD da herpes, são disponíveis. O DNA para essa região precursora é ligado na estrutura de leitura a DNA que codifica a(s) proteína(s) heteromultimérica(s) desejada(s) (tais como anticorpos).

[0195] ii. Origem de reprodução:

Geralmente, um componente de origem de reprodução não é necessário para vetores de expressão de mamíferos. A origem SV40, por exemplo, pode ser tipicamente utilizada, mas somente porque contém o promotor inicial.

[0196] iii. Componente de gene de seleção:

Os vetores de clonagem e de expressão podem conter um gene de seleção, também denominado marcador selecionável. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina; (b) complementam deficiências auxotróficas, quando relevantes; ou (c) fornecem

79/118 nutrientes fundamentais não disponíveis a partir de meios complexos.

[0197] Um exemplo de esquema de seleção utiliza uma droga para interromper o crescimento de células hospedeiras. As células que são transformadas com sucesso com genes heterólogos produzem proteínas que conferem resistência a drogas e, desta forma, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos dessa seleção dominante utilizam as drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

[0198] Outro exemplo de marcadores selecionáveis apropriados para células de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células competentes para absorver o ácido nucleico de anticorpo, tais como DHFR, timidino quinase, metalotioneína I e II, preferencialmente genes de metalotioneína de primatas, adenosino deaminase, ornitino decarboxilase etc.

[0199] Células transformadas com o gene de seleção de DHFR, por exemplo, são identificadas em primeiro lugar por meio do cultivo de todos os transformadores em um meio de cultivo que contém metotrexato (Mtx), um antagonista concorrente de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada, ao empregar-se DHFR do tipo selvagem, é a linhagem de células de ovário de hamster chinês (CHO) com deficiência da atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).

[0200] Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente hospedeiros do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou cotransformadas com sequências de DNA que codificam um anticorpo, proteína DHFR do tipo selvagem e outro marcador selecionável tal como aminoglicosídeo 3’-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas por meio de crescimento celular em um meio que contém um agente de seleção para o marcador selecionável, tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo canamicina, neomicina ou G418. Vide, por exemplo, a Patente NorteAmericana n°4.965.199.

80/118 [0201] iv. Componente promotor:

Os vetores de clonagem e de expressão normalmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é ligado operativamente ao ácido nucleico do(s) polipeptídeo(s) que contém(êm) articulação (por exemplo, anticorpo). São conhecidas sequências promotoras para eucariotes. Virtualmente todos os genes eucarióticos contêm uma região rica em AT localizada a cerca de 25 a 30 bases acima do local onde se inicia a transcrição. Outra sequência encontrada a 70 até 80 bases acima do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT, em que N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3’ da maior parte dos genes eucarióticos, encontra-se uma sequência AATAAA que pode ser o sinal de adição da extremidade póli A à extremidade 3’ da sequência de codificação. Todas essas sequências são inseridas adequadamente em vetores de expressão eucarióticos.

[0202] A transcrição de polipeptídeo(s) que contém(êm) articulação (por exemplo, meio-anticorpo) desejados a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como vírus de polioma, vírus da catapora, adenovirus (tal como Adenovirus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovirus, vírus da hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, tais como o promotor de actina ou promotor de imunoglobulina, ou de promotores de choque de calor, desde que esses promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

[0203] Os promotores inicial e posterior do vírus SV40 são convenientemente obtidos na forma de fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem viral de reprodução de SV40. O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é obtido convenientemente na forma de

81/118 fragmento de restrição Hindi 11 E. Um sistema de expressão de DNA em hospedeiros mamíferos, utilizando o vírus de papiloma bovino como vetor, é descrito na Patente Norte-Americana n° 4.419.446. Uma modificação deste sistema é descrita na Patente Norte-Americana n° 4.601.978. Vide também Reyes et al, Nature 297: 598-601 (1982) sobre a expressão de cDNA de βinterferona humana em células de camundongos sob o controle de um promotor timidino quinase de vírus simplex da herpes. Alternativamente podese utilizar a repetição de terminal longo do Vírus Sarcoma de Rous como promotor.

[0204] v. Componente elemento amplificador:

A transcrição de DNA codificador do(s) polipeptídeo(s) que contém(êm) articulação (tal como anticorpo) por eucariotes superiores pode ser aumentada por meio da inserção de uma sequência amplificadora no vetor. Muitas sequências amplificadoras são agora conhecidas a partir de genes de mamíferos (por exemplo, genes de globina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). Além disso, pode-se utilizar um amplificador de um vírus de células eucarióticas. Exemplos incluem o amplificador SV40 do lado posterior da origem de reprodução (bp 100-270), o amplificador promotor precoce de citomegalovírus, o amplificador de polioma do lado posterior da origem de reprodução e amplificadores de adenovirus. Vide também Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) para descrição de elementos amplificadores da ativação de promotores eucarióticos. O amplificador pode ser dividido no vetor em posição 5’ ou 3’ para a sequência codificadora de polipeptídeos de anticorpos, desde que se atinja a amplificação, mas encontra-se localizado geralmente em local a 5’ do promotor.

[0205] vi. Componente de término de transcrição:

Vetores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas também conterão tipicamente sequências necessárias para o

82/118 término de transcrição e para a estabilização do mRNA. Essas sequências são normalmente disponíveis a partir das regiões não traduzidas 5’ e, ocasionalmente, 3’ dos DNAs ou cDNAs virais ou eucarióticos. Essas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos na forma de fragmentos poliadenilados na parte não traduzida do mRNA codificador de anticorpo. Um componente de término de transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Vide WO 94/11026 e o vetor de expressão nela descrito.

[0206] vii. Seleção e transformação de células hospedeiras:

Células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores do presente incluem as células eucarióticas superiores descritas no presente, incluindo células hospedeiras de vertebrados. A propagação de células de vertebrados em cultivo (cultivo de tecidos) tornou-se procedimento rotineiro. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultivo em suspensão, Graham et al, J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 77: 4216 (1980)); células sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma da cervical humano (HELA, ATCC CCL 2), células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al, Annals N. Y. Acad. Sei. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e linhagem de

83/118 hepatoma humano (Hep G2).

[0207] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de clonagem ou de expressão descritos acima para a produção de polipeptídeo(s) que contém(êm) articulação desejado(s) (por exemplo, anticorpo) e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção de transformadores ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas.

[0208] viii. Cultivo das células hospedeiras:

As células hospedeiras utilizadas para a produção de polipeptídeo(s) que contém(êm) articulação desejado(s) (por exemplo, anticorpo) de acordo com a presente invenção podem ser cultivadas em uma série de meios. Meios disponíveis comercialmente, tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM, Sigma) são apropriados para o cultivo das células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al, Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al, Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes Norte-Americanas n° 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente NorteAmericana Ref. 30.985 pode ser utilizado como meio de cultivo para as células hospedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme o necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como droga GENTAMYCIN®), elementos de traço (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicose ou fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário pode

84/118 também ser incluído em concentrações apropriadas que seriam conhecidas dos técnicos no assunto. As condições de cultivo, tais como temperatura, pH e similares, são as utilizadas anteriormente com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para os técnicos comuns no assunto.

[0209] ix. Purificação de proteínas heteromultiméricas:

Ao utilizar-se técnicas recombinantes, os polipeptídeos que contêm articulação podem ser produzidos de forma intracelular ou secretados diretamente para o meio. Caso o polipeptídeo que contém articulação seja produzido de forma intracelular, como primeira etapa, os fragmentos particulados, sejam eles células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por meio de centrifugação ou ultrafiltragem. Quando o polipeptídeo que contém articulação for secretado para o meio, sobrenadantes desses sistemas de expressão são geralmente concentrados em primeiro lugar utilizando filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente, tal como unidade de ultrafiltragem Amicon ou Millipore Pellicon. Inibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluído em qualquer das etapas acima para inibir a proteólise e podem ser incluídos antibióticos para evitar o crescimento de contaminantes imprevistos.

[0210] A composição heteromultimérica preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, troca de íons, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise e cromatografia de afinidade, em que cromatografia de afinidade é a técnica de purificação preferida. Também são contempladas combinações dos métodos mencionados acima. A adequação da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A Proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiem em cadeias pesadas γ1, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al, J. Immunol. Meth. 62: 1-13

85/118 (1983)). Recomenda-se Proteína G para todos os isotipos de camundongos e para γ3 humano (Guss et al, 1986, EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). A matriz à qual é ligado o ligante de afinidade é mais frequentemente agarose, mas outras matrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de poros controlados ou póli(estirenodivinil)benzeno, permitem velocidades de fluxo mais altas e tempos de processamento mais curtos que o que pode ser atingido com agarose. Quando o anticorpo compreender um domínio Ch3, a resina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg NJ) é útil para purificação. Outras técnicas de purificação de proteínas, tais como o fracionamento sobre coluna de troca de íons, precipitação em etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia sobre silica, cromatografia sobre heparina SEPHAROSE®, cromatografia sobre uma resina de troca de ânions ou cátions (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatoconcentração, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amônio também são disponíveis, dependendo do anticorpo a ser recuperado.

[0211] Após qual(is)quer etapa(s) de purificação preliminar(es), a mistura que compreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrofóbica sob baixo pH, utilizando tampão de eluição sob pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sob baixas concentrações de sais (por exemplo, cerca de 0 a 0,25 M de sal). A produção das proteínas heteromultiméricas pode compreender, alternativa ou adicionalmente (a qualquer um dos métodos específicos acima), a diálise de uma solução que compreende uma mistura dos polipeptídeos.

[0212] x. Produção de anticorpos utilizando bacilovírus:

Bacilovírus recombinante pode ser gerado por meio da cotransfecção de um plasmídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de anticorpo e DNA de vírus BaculoGold® (Pharmingen) em uma célula de inseto tal como uma célula de Spodoptera frugiperda (tais como células Sf9; ATCC

86/118

CRL 1711) ou uma célula de Drosophila melanogaster S2, utilizando, por exemplo, lipofectina (disponível comercialmente por meio da GIBCO-BRL). Em um exemplo específico, uma sequência de anticorpos é fundida acima no fluxo de uma marca de epítopo contida em um vetor de expressão de bacilovírus. Essas marcas de epítopo incluem marcas póli-His. Pode-se empregar uma série de plasmídeos, que incluem plasmídeos derivados de plasmídeos disponíveis comercialmente tais como pVL1393 (Novagen) ou pAcGP67B (Pharmingen). Resumidamente, a sequência que codifica um anticorpo ou seu fragmento pode ser amplificada por meio de PCR com primers complementares às regiões 5’ e 3’. O primer 5’ pode incorporar locais de enzimas de restrição ladeadores (selecionados). O produto pode ser digerido em seguida com as enzimas de restrição selecionadas e subclonado no vetor de expressão.

[0213] Após transfecção com o vetor de expressão, as células hospedeiras (tais como células Sf9) são incubadas por quatro a cinco dias a 28 ^QC e o vírus liberado é colhido e utilizado para amplificações adicionais. Podese realizar infecção viral e expressão de proteínas conforme descrito, por exemplo, por O’Reilley et al (Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)).

[0214] Anticorpo marcado com póli-His expresso pode ser purificado em seguida, por exemplo, por meio de cromatografia de afinidade de quelato de NI2+ conforme segue. Extratos podem ser preparados a partir de células Sf9 infectadas por vírus recombinante conforme descrito por Rupert et al (Nature 362: 175-179 (1993)). Resumidamente, células Sf9 são lavadas, novamente suspensas em tampão de sonicação (25 ml de HEPES, pH 7,9; 12,5 mM de MgCI₂; 0,1 mM de EDTA; 10% glicerol; 0,1% NP-40; 0,4 M de KCI) e sonicados por duas vezes por vinte segundos sobre gelo. Os sonicados são liberados por meio de centrifugação e o sobrenadante é diluído por cinquenta vezes em tampão de carregamento (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCI, 10%

87/118 glicerol, pH 7,8) e filtrados através de um filtro de 0,45 pm. Coluna de Ni2+NTA agarose (disponível comercialmente por meio da Qiagen) é preparada com volume de leito de 5 ml, lavada com 25 ml de água e equilibrada com 25 ml de tampão de carregamento. O extrato celular filtrado é carregado sobre a coluna a 0,5 ml por minuto. A coluna é lavada até a linha base A280 com tampão de carga, ponto em que se inicia a coleta de frações. Em seguida, a coluna é lavada com tampão de lavagem secundário (50 mM de fosfato; 300 mM de NaCI, 10% glicerol, pH 6,0), que elui proteína ligada de forma não específica. Após atingir-se novamente a linha base A280, a coluna é desenvolvida com gradiente de 0 a 500 mM de imidazol no tampão de lavagem secundário. Frações de 1 ml são recolhidas e analisadas por meio de SDSPAGE e manchas de prata ou Western Blot com NÍ2+-NTA conjugado a fosfatase alcalina (Qiagen). Frações que contêm o anticorpo marcado com His10 eluído são reunidas e dialisadas contra tampão de carregamento.

[0215] Alternativamente, a purificação do anticorpo pode ser realizada utilizando técnicas de cromatografia conhecidas, que incluem, por exemplo, cromatografia de coluna de Proteína A ou Proteína G. Em uma realização, o anticorpo de interesse pode ser recuperado da fase sólida da coluna por meio de eluição em uma solução que contém um agente caotrópico ou detergente suave. Exemplos de agentes caotrópicos e detergentes suaves incluem, mas sem limitações, guanidina-HCI, ureia, perclorato de lítio, arginina, histidina, SDS (dodecil sulfato de sódio), Tween, Triton e NP-40, todos os quais são disponíveis comercialmente.

[0216] iv. Moléculas alvo:

Exemplos de moléculas que podem ser dirigidas por uma proteína heteromultimérica de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitações, proteínas de soro solúveis e seus receptores e outras proteínas ligadas por membrana (tais como adesinas). Vide WO 2011/133886, que é

88/118 incorporada integralmente ao presente como referência.

[0217] Em outra realização, a proteína heteromultimérica de acordo com a presente invenção é capaz de ligar uma, duas ou mais citoquinas, proteínas relativas a citoquinas e receptores de citoquinas selecionados a partir do grupo que consiste de BMPI, BMP2, BMP3B (GDFIO), BMP4, BMP6, BMP8, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGFI (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1 , IGF2, IFNAI, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNBI, IFNG, IFNWI, FELI, FELI (EPSELON), FELI (ZETA), IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA (TNF-b), LTB, TNF (TNF-a), TNFSF4 (ligante 0X40), TNFSF5 (ligante CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligante CD27), TNFSF8 (ligante CD30), TNFSF9 (ligante 4-1 BB), TNFSFIO (TRAIL), TNFSF1 I (TRANCE), TNFSF12 (AP03L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILIR1 , IL1 R2, IL1 RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, ILIORA, ILIORB, IL11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1 HY1, IL1 RAP, IL1 RAPL1, IL1 RAPL2, IL1 RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIFI, HGF, LEP (leptina), PTN eTHPO.

[0218] Em outra realização, uma molécula alvo é uma quimiocina, receptor de quimiocina ou proteína relativa a quimiocina selecionada a partir do grupo que consiste de CCLI (I- 309), CCL2 (MCP -1 / MCAF), CCL3 (MIP-la), CCL4 (MIP-lb), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP- 3), CCL8 (mcp-2), CCLH (eotaxina), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-ld), CCL16

89/118 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MDP-3b), CCL20 (MIP- 3a), CCL21 (SLC I êxodo 2), CCL22 (MDC I STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF2 I eotaxina 2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina 3), CCL27 (CTACK I ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP 10), CXCL11 (l-TAC), CXCL12 (SDFI), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (linfotactina), XCL2 (SCM-lb), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6 I JAB61 ), CCR1 (CKRI I HM145), CCR2 (mcp-IRB I RA), CCR3 (CKR3 I CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5 I ChemR13), CCR6 (CMKBR6 I CKR-L3 I STRL22 I DRY6), CCR7 (CKR7 I EBII), CCR8 (CMKBR8 I TERI I CKR- LI), CCR9 (GPR-9-6), CCRLI (VSHKI), CCRL2 (L-CCR), XCRI (GPR5 I CCXCRI), CMKLRI, CMKORI (RDCI), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCRIO), GPR31 , GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33 I Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (ILSRb), LTB4R (GPR16), TCPIO, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCCIO (CIO), EPO, FY (DARC), GDF5, HDFIA, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREMI, TREM2 e VHL.

[0219] Em outra realização, as proteínas heteromultima c de acordo com a presente invenção são capazes de ligar um ou mais alvos selecionados a partir do grupo que consiste de ABCFI; ACVRI; ACVRIB; ACVR2; ACVR2B; ACVRLI; AD0RA2A; Aggrecan; AGR2; AICDA; AIFI; AIGI; AKAPI; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPTI; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOCI; AR; AZGPI (glicoproteína a de zinco); B7.1; B7.2; BAD; BAFF (BLys); BAGI; BAH; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMPI; BMP2; BMP3B (GDFIO); BMP4; BMP6; BMP8; BMPRIA; BMPRIB; BMPR2; BPAGI (plectina); BRCAI; C19orflO (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANTI; CASP1; CASP4; CAVI; CCBP2 (D6 / JAB61); CCLI (1 -309); CCLII (eotaxina); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-ld); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18

90/118 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP-1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MTP-2); SLC; êxodo 2; CCL22 (MDC / STC-I); CCL23 (MPIF- 1); CCL24 (MPIF-2 / eotaxina 2); CCL25 (TECK); CCL26 (eotaxina 3); CCL27 (CTACK / ILC); CCL28; CCL3 (MTP-la); CCL4 (MDP-lb); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP3); CCL8 (mcp-2); CCNAI; CCNA2; CCNDI; CCNEI; CCNE2; CCRI (CKRI / HM145); CCR2 (mcp-IRB / RA);CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBII); CCR8 (CMKBR8 / TERI / CKR-LI); CCR9 (GPR-9-6); CCRLI (VSHKI); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CDIC; CD20; CD200; CD22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81 ; CD83; CD86; CDHI (E-caderina); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKNIA (p21 Wapl/Cipl); CDKNIB (p27Kipl); CDKNIC; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CERI; CHGA; CHGB; Chitinase; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7 (claudina 7); CLN3; CLU (clusterina); CMKLRI; CMKORI (RDCI); CNRI; COL18A1; COLIAI; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSFI (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNBI (bcatenina); CTSB (catepsina B); CX3CL1 (SCYDI); CX3CR1 (V28); CXCLI (GROI); CXCL10 (IP-10); CXCLII (l-TAC / IP-9); CXCL12 (SDFI); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78 / LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo); CYB5; CYCI; CYSLTRI; DAB2IP; DES; DKFZp451 J01 18; DNCLI; DPP4; E2F1; ECGFI; EDGI; EFNAI; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESRI; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCERIA; FCER2; FCGR3A; FGF; FGFI (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12;

91/118

FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FELI (EPSILON); FILI (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI (fibronectina); FLTI; FOS; FOSLI (FRA-I); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEBI; GAGECI; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCRIO); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCCIO (CIO); GRP; GSN (Gelsolina); GSTPI; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIFIA; HDPI; histamina e receptores de histamina; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOXI; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNAI; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFNgama; DFNWI; IGBPI; IGFI; IGFIR; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-I; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11 RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1 A; IL1 B; ILIF10; IL1 F5; IL1 F6; IL1 F7; IL1 F8; IL1 F9; IL1 HYI; IL1 RI; IL1 R2; IL1 RAP; IL1 RAPL1 ; IL1 RAPL2; IL1 RL1; IL1 RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20RA; IL21R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (glicoproteina 130); EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA;INSL3; INSL4; IRAKI; ERAK2; ITGAI; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 integrin); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b 4 integrina); JAGI; JAKI; JAK3; JUN; K6HF; KAII; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (Queratina 19); KRT2A; KHTHB6 (queratina tipo H específica de cabelos); LAMAS; LEP (leptina); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG ou Omgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIBI; midquina; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (metalotionectina III); MTSSI; MUCI (mucina); MYC; MYD88; NCK2; neurocan;

92/118

NFKBI; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR- Nogo66 (Nogo); NgRp75; NgR-Troy; NMEI (NM23A); N0X5; NPPB; NROBI; NR0B2; NRIDI; NR1 D2; NR1 H2; NR1 H3; NR1 H4; NR1 I2; NR1 I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRPI; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRDI; P2RX7; PAP; PARTI; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAMI; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; fosfacan; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDCI; PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21 Rac2); RARB; RGSI; RGS13; RGS3; RNFIIO (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1 D2 (lipofilina B); SCGB2A1 (mamaglobina 2); SCGB2A2 (managlobina 1 ); SCYEI (citoquina ativadora de monócitos endoteliais); SDF2; SERPINAI; SERPINA3; SERP1 NB5 (maspina); SERPINEI (PAI-I); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPI; SPRRIB (Sprl); ST6GAL1; STABI; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCPIO; TDGFI; TEK; TGFA; TGFBI; TGFBIII; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI (trombospondina 1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; fator de tecido; TLRIO; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSFIA; TNFRSFIB; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSFIO (TRAIL); TNFSFI 1 (TRANCE); TNFSF12 (APO3L); TNFSF13 (abril); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (ligante 0X40); TNFSF5 (ligante CD40); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (ligante CD27); TNFSF8 (ligante CD30); TNFSF9 (ligante 4-1 BB); TOLLIP; receptores similares a Toll; TOP2A (topoisomerase Ea); TP53; TPMI; TPM2; TRADD; TRAFI; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREMI; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; versican; VHL C5; VLA-4; XCLI (linfotactina); XCL2 (SCM-lb); XCRI(GPR5 / CCXCRI); YYI e ZFPM2.

93/118 [0220] Moléculas alvo moleculares preferidas para anticorpos englobadas pela presente invenção incluem proteínas CD tais como os membros CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD20, CD34; CD64, CD200 da família de receptores de ErbB, tais como o receptor EGF, receptor HER2, HER3 ou HER4; moléculas de adesão celular tais como LFA-1, Mad, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, alfa4/beta7 integrina e alfav/beta3 integrina, incluindo suas subunidades alfa ou beta (tais como anticorpos anti-CD11a, anti-CD18 ou antiCD11b); fatores de crescimento tais como VEGF-A e VEGF-C; fator de tecido (TF); alfa interferona (alfalFN); TNFalfa, interleucina tal como IL-1 beta, IL-3, IL4, IL-5, IL-8, IL-9, IL-13, IL-17A/F, IL-18, IL-13Ralfa1, IL-13Ralfa2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; antígenos do grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor da obesidade (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteína RANKL, RANK, RSV F, proteína C etc.

[0221] Em uma realização, as proteínas heteromultiméricas de acordo com a presente invenção ligam proteína relativa a receptor de lipoproteína com baixa densidade (LRP) 1 ou LRP 8 ou receptor de transferrina e pelo menos um alvo selecionado a partir do grupo que consiste de (1) betassecretase (BACE1 ou BACE2), (2) alfassecretase, (3) gamassecretase, (4) taussecretase, (5) proteína precursora de amiloide (APP), (6) receptor da morte 6 (DR6), (7) peptídeo amiloide beta, (8) alfassinucleína, (9) Parkin, (10) Huntingtin, (11) p75 NTR e (12) caspase 6.

[0222] Em uma realização, as proteínas heteromultiméricas de acordo com a presente invenção ligam-se a pelo menos duas moléculas alvo selecionadas a partir do grupo que consiste de: IL-1 alfa e IL-1 beta, IL-12 e IL18; IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-5 e IL-4; IL-13 e IL-1 beta; IL-13 e IL- 25; IL-13 e TARC; IL-13 e MDC; IL-13 e MEF; IL-13 e TGF-β; IL-13 e LHR agonist; IL-12 e TWEAK, IL-13 e CL25; IL-13 e SPRR2a; IL-13 e SPRR2b; IL13 e ADAM8, IL-13 e PED2, IL17A e IL17F, CD3 e CD19, CD138 e CD20;

94/118

CD138 e CD40; CD19 e CD20; CD20 e CD3; CD38 e CD138; CD38 e CD20; CD38 e CD40; CD40 e CD20; CD-8 e IL-6; CD20 e BR3, TNF alfa e TGF-beta, TNF alfa e IL-1 beta; TNF alfa e IL-2, TNF alfa e IL-3, TNF alfa e IL-4, TNF alfa e IL-5, TNF alfa e IL6, TNF alfa e IL8, TNF alfa e IL-9, TNF alfa e IL-10, TNF alfa e IL-1 1 , TNF alfa e IL-12, TNF alfa e IL-13, TNF alfa e IL-14, TNF alfa e IL-15, TNF alfa e IL-16, TNF alfa e IL-17, TNF alfa e IL-18, TNF alfa e IL-19, TNF alfa e IL-20, TNF alfa e IL-23, TNF alfa e IFNalfa, TNF alfa e CD4, TNF alfa e VEGF, TNF alfa e MIF, TNF alfa e ICAM-1 , TNF alfa e PGE4, TNF alfa e PEG2, TNF alfa e ligante RANK, TNF alfa e Te38; TNF alfa e BAFF; TNF alfa e CD22; TNF alfa e CTLA-4; TNF alfa e GP130; TNFa e IL-12p40; VEGF e HER2, VEGF-A e HER2, VEGF-A e PDGF, HER1 e HER2, VEGF-A e VEGF-C, VEGF-C e VEGF-D, HER2 e DR5,VEGF e IL-8, VEGF e MET, VEGFR e receptor MET, VEGFR e EGFR, HER2 e CD64, HER2 e CD3, HER2 e CD16, HER2 e HER3; EGFR(HERI ) e HER2, EGFR e HER3, EGFR e HER4, IL-13 e CD40L, IL4 e CD40L, TNFR1 e IL-1 R, TNFR1 e IL-6R e TNFR1 e IL-18R, EpCAM e CD3, MAPG e CD28, EGFR e CD64, CSPGs e RGM A; CTLA-4 e BTNO2; IGF1 e IGF2; IGF1/2 e Erb2B; MAG e RGM A; NgR e RGM A; NogoA e RGM A; OMGp e RGM A; PDL-I e CTLA-4; e RGM A e RGM B.

[0223] Antígenos solúveis ou seus fragmentos, opcionalmente conjugados a outras moléculas, podem ser utilizados como imunogenes para a geração de anticorpos. Para moléculas transmembranosas, tais como receptores, seus fragmentos (por exemplo, o domínio extracelular de um receptor) podem ser utilizados como imunogene. Alternativamente, células que expressam a molécula transmembranosa podem ser utilizadas como imunogene. Essas células podem ser derivadas de uma fonte natural (tal como linhagens de células cancerosas) ou podem ser células que foram transformadas por meio de técnicas recombinantes para expressar a molécula transmembranosa. Outros antígenos e suas formas úteis de preparo de

95/118 anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto.

[0224] v. Realizações:

A presente invenção fornece realizações adicionais conforme descrito abaixo. Em uma primeira realização, é fornecido um método de produção de proteína heteromultimérica, em que o mencionado método compreende: obtenção de um primeiro polipeptídeo que contém articulação purificado por proteína A; obtenção de um segundo polipeptídeo que contém articulação purificado por proteína A; ajuste do pH de cada meio-anticorpo em 4 a 9; mistura dos primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação para obter um conjunto de polipeptídeo que contém articulação misturado; adição de excesso molar de um redutor fraco ao conjunto de polipeptídeo que contém articulação misturado; e incubação do conjunto de polipeptídeo que contém articulação misturado com o redutor fraco para formar uma proteína heteromultimérica que compreende os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação.

[0225] Em uma segunda realização e de acordo com a primeira realização, os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação podem ser selecionados a partir de um meio-anticorpo, imunoadesina e seus fragmentos. Em uma terceira realização e de acordo com a primeira realização, o primeiro polipeptídeo que contém articulação é um meio-anticorpo. Em uma quarta realização e de acordo com a primeira realização, o segundo polipeptídeo que contém articulação é um componente Fc. Em uma quinta realização e de acordo com a terceira realização, o meio-anticorpo compreende um domínio VL, domínio CL, domínio VH, domínio CH1, domínio de articulação, domínio CH2 e domínio CH3. Em uma sexta realização e de acordo com a quinta realização, o meio-anticorpo é uma cadeia de polipeptídeo simples que compreende adicionalmente um téter em que os mencionados domínios são posicionados entre si em direção N-terminal para C-terminal

96/118 conforme segue: VL-CL-téter-VH-CH1-articulação-CH2-CH3. Em uma sétima realização e de acordo com a primeira realização, os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação são misturados antes da purificação com proteína A e copurificados sobre proteína A. Em uma oitava realização e de acordo com a primeira realização, os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação compreendem um domínio de heteromultimerização. Em uma nona realização e de acordo com a oitava realização, o domínio de heteromultimerização é selecionado a partir de uma mutação de botão em orifício, fechos de leucina, eletrostática etc. Em uma décima realização e de acordo com a nona realização, o primeiro polipeptídeo que contém articulação compreende um botão e o segundo polipeptídeo que contém articulação compreende um orifício. Em uma décima-primeira realização e de acordo com a primeira realização, o pH é ajustado após mistura. Em uma décima-segunda realização e de acordo com a primeira ou a décima-primeira realização, o método compreende ainda a adição de L-arginina até concentração final de 20 mM a 1 M antes do ajuste do pH. Em uma décima-terceira realização e de acordo com a primeira realização, o método compreende adicionalmente a incubação do conjunto misturado sob temperatura de 15 ^QC a 39 ^QC por pelo menos trinta minutos. Em uma décima-quarta realização e de acordo com a primeira realização, a mistura de montagem possui potencial de oxidação de 200 a -600 mV, de maior preferência de -300 a -500 mV e, de preferência superior, cerca de -400 mV. Em uma décima-quinta realização e de acordo com a primeira realização, o redutor fraco é selecionado a partir de GSH, betamercaptoetilamina, cisteína/cisteína, GSH/GSSG, cisteamina/cistamina, gliciclcisteína e betamercaptoetanol. Em uma décima-sexta realização e de acordo com a primeira realização, o redutor fraco é adicionado em excesso molar de 50-600. Em uma décima-sétima realização e de acordo com a primeira realização, o redutor fraco é adicionado antes da mistura. Em uma

97/118 décima-oitava realização e de acordo com a décima-sétima realização, a adição é realizada em menos de uma hora antes da mistura. Em uma décimanona realização e de acordo com a primeira realização, a etapa de incubação da mistura de montagem é realizada sob temperatura de 15 ^QC a 39 ^QC na presença de polivinilpirrolidona (PVP). Em uma vigésima realização e de acordo com a décima-nona realização, histidina é adicionada antes, simultaneamente ou depois de PVP. Em uma 21^ã realização e de acordo com a décima-nona realização, PVP é adicionada até 40% (p/v).

[0226] Em uma 22- realização, a presente invenção fornece um método de produção de anticorpo biespecífico, em que o mencionado método compreende:

a. obtenção de um primeiro meio-anticorpo purificado por proteína A;

b. obtenção de um segundo meio-anticorpo purificado por proteína A;

c. adição de uma solução de L-arginina a cada meioanticorpo;

d. ajuste do pH de cada meio-anticorpo em 4 a 9;

e. mistura dos primeiro e segundo conjuntos de meioanticorpos para obter um conjunto de meio-anticorpos misturados;

f. adição de excesso molar de um redutor fraco ao conjunto de meio-anticorpos misturados; e

g. incubação do conjunto de meio-anticorpos misturados sob temperatura de 15 ^QC a 39 ^QC na presença de PVP;

em que é produzido um anticorpo biespecífico que compreende os primeiro e segundo meio-anticorpos.

[0227] Em uma 23^ã realização, a presente invenção fornece um método de produção de heteromultímero, em que o mencionado método

98/118 compreende: (a) fornecimento de uma mistura que contém L-arginina de pelo menos dois polipeptídeos que contêm articulação diferentes, em que a mencionada mistura possui pH de 7 a 9; (b) adição de excesso molar de um redutor fraco; e (c) incubação da mistura sob condições por meio das quais é produzido um heteromultímero.

[0228] Em uma 24^ã realização e de acordo com a 22- realização, o primeiro meio-anticorpo é um polipeptídeo de fita simples que compreende: (a) uma cadeia leve com comprimento total que compreende um domínio VL e um domínio CL; (b) um téter; e (c) uma cadeia pesada com comprimento total que compreende um domínio VH, domínio CH1, articulação, domínio CH2 e domínio CH3; em que o mencionado polipeptídeo compreende domínios das cadeias leve e pesada posicionados entre si em direção N-terminal para Cterminal conforme segue: VI-CL-CL/VH-téter-VH-CH1-articulação-CH2-CH3. Em uma 25^ã realização e de acordo com a 24^ã realização, o polipeptídeo de fita simples compreende adicionalmente um domínio de heteromultimerização. Em uma 26^ã realização e de acordo com a 25^ã realização, o domínio de heteromultimerização é um orifício (tal como cavidade) ou botão (tal como protuberância). Em uma 21- realização e de acordo com a 26^ã realização, o segundo meio-anticorpo compreende um orifício quando o primeiro meioanticorpo compreender um botão. Em uma 28^ã realização e de acordo com a 26^ã realização, o segundo meio-anticorpo compreende um botão quando o primeiro meio-anticorpo compreender um orifício. Em uma 29^ã realização e de acordo com a 24^ã realização, o téter compreende repetições GGS. Em uma 30^ãrealização e de acordo com a 24^ã realização, o téter contém de 15 a 50 aminoácidos.

[0229] Em uma 31^ã realização, a presente invenção fornece um método de produção de proteínas heteromultiméricas, em que o mencionado método compreende: (a) obtenção de um primeiro polipeptídeo que contém

99/118 articulação purificado por proteína A; (b) obtenção de um segundo polipeptídeo que contém articulação purificado por proteína A; (c) ajuste do pH de cada polipeptídeo que contém articulação em 4 a 9 na presença de L-arginina; (d) mistura dos primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação para obter um conjunto de polipeptídeo que contém articulação misturado; e incubação para formar uma proteína heteromultimérica que compreende os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação.

[0230] Em uma 32^ã realização e de acordo com a primeira ou a 31^ã realização, pelo menos um dos meio-anticorpos é um polipeptídeo de fita simples que compreende: (a) uma cadeia leve com comprimento total que compreende um domínio VL e um domínio CL; (b) um téter; (c) uma cadeia pesada com comprimento total que compreende um domínio VH, domínio CH1, articulação, domínio CH2 e domínio CH3.

[0231] Em uma 33^ã realização e de acordo com a primeira realização, o primeiro polipeptídeo que contém articulação é uma cadeia de polipeptídeo de fita simples que compreende domínios das cadeias leve e pesada posicionados entre si em direção N-terminal para C-terminal conforme segue: VL-CL-VH-CH1-articulação-CH2-CH3. Em uma 34^ã realização e de acordo com a 33^ã realização, a cadeia de polipeptídeo de fita simples compreende adicionalmente um téter em que os mencionados domínios são posicionados entre si em direção N-terminal para C-terminal conforme segue: VL-CL-téter-VH-CH1-articulação-CH2-CH3.

[0232] Em uma 35^ã realização, a presente invenção fornece um método de produção de heteromultímeros, em que o mencionado método compreende o fornecimento de uma L-arginina que contém uma mistura de polipeptídeos que contêm articulação, em que a mencionada mistura possui pH de 4 a 9, adição de um redutor fraco e incubação sob condições de produção de heteromultímeros.

100/118 [0233] Em uma 36^ã realização, a presente invenção fornece uma célula hospedeira que foi elaborada para expressar um meio-anticorpo, em que o mencionado meio-anticorpo é um polipeptídeo de fita simples que compreende um téter, domínio VL, domínio CL, domínio VH, domínio CH1, domínio de articulação, domínio CH2 e um domínio CH3, em que os mencionados domínios são posicionados entre si em direção N-terminal para C-terminal conforme segue: VL-CL-téter-VH-CH1-articulação-CH2-CH3. Em uma 37^ã realização e de acordo com a 36^ã realização, o polipeptídeo de fita simples compreende adicionalmente um domínio de heterodimerização. Em uma 38^ã realização e de acordo com a 36^ã ou a 37^ã realização, a célula hospedeira é selecionada a partir de células procarióticas, células eucarióticas, células de mamíferos ou células vegetais. Em uma 39^ã realização e de acordo com a 38^ã realização, a célula hospedeira é uma célula procariótica. Em uma 40^ã realização e de acordo com a 39^ã realização, a célula procariótica é uma célula de E. coli. Em uma 41^ã realização e de acordo com a 40^ã realização, a célula de E. coli possui deficiência de Ipp. Em uma 42^ã realização e de acordo com a 38^ã realização, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Em uma 43^ã realização e de acordo com a 41^ã realização, a célula de mamífero é uma célula de CHO. Em uma 44^ã realização e de acordo com a 36^ã ou 37^ãrealização, a célula hospedeira compreende um vetor que codifica o meioanticorpo de fita simples. Em uma 45^ã realização e de acordo com a 36^ã ou 37^ãrealização, o polipeptídeo de fita simples compreende adicionalmente um domínio de heterodimerização. Em uma 46^ã realização e de acordo com a 45^ãrealização, o domínio de heterodimerização é selecionado a partir de um botão, orifício, um ou mais aminoácidos carregados dentro da interface que são eletrostaticamente desfavoráveis à formação de homodímero mas eletrostaticamente favoráveis à formação de heterodímero, um ou mais aminoácidos são alterados para aumentar as interações iônicas

101/118 intramoleculares, uma bobina enrolada e um fecho de leucina.

[0234] Em uma 47^ã realização, a presente invenção fornece uma mistura de células hospedeiras que compreende uma primeira célula hospedeira elaborada para expressar um primeiro meio-anticorpo de fita simples e uma segunda célula hospedeira elaborada para expressar um componente Fc. Em uma 48^ã realização e de acordo com a 36^ã realização, o meio-anticorpo produzido por uma célula hospedeira compreende um domínio de heterodimerização.

[0235] Na descrição experimental que se segue, aplicam-se as abreviações a seguir: eq (equivalentes); M (molar); μΜ (micromolar); N (normal); mol (moles); mmol (milimoles); pmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramas); mg (miligramas); kg (quilogramas); pg (microgramas); I (litros); ml (mililitros); μΙ (microlitres); cm (centímetros); mm (milímetros); pm (micrômetros); nm (nanometres); °C (graus centígrados); h (horas); min (minutos); seg (segundos); mseg (milissegundos).

Exemplos [0236] A presente invenção é descrita em detalhes adicionais nos exemplos a seguir que não se destinam, de nenhuma forma, a limitar o escopo da presente invenção conforme reivindicado. As Figuras anexas destinam-se a ser consideradas partes integrais do relatório descritivo e da descrição da presente invenção. Todas as referências mencionadas são incorporadas especificamente ao presente como referência para todo o descrito no presente.

Exemplo 1 [0237] Expressão e purificação:

Este exemplo ilustra a expressão e a purificação de meioanticorpos.

[0238] Exemplos de métodos de construção e expressão de meio-anticorpos em E. coli podem ser encontrados, por exemplo, no Pedido

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Norte-Americano copendente 2011/0287009, que é incorporado integralmente ao presente como referência. Encontra-se dentro da capacidade dos técnicos no assunto modificar e ajustar as condições de expressão e cultivo.

[0239] Expressão de meio-anticorpos em células de E. coli: Construção de plasmídeos de expressão:

As sequências de codificação de DNA de cadeia leve e pesada foram clonadas em um plasmídeo de expressão que continha elementos promotores separados para cada uma das sequências e resistência a antibióticos para seleção de células bacterianas que contêm o plasmídeo de expressão. As construções de vetor também codificam o sinal de secreção de enterotoxina II estável ao aquecimento (STII) (Picken et al, 1983, Infect. Immun. 42: 269-275 e Lee et al, 1983, Infect. Immun. 42: 264-268) para exportação dos polipeptídeos de anticorpos para o espaço periplasmático da célula bacteriana. A transcrição de cada cadeia é controlada pelo promotor phoA (Kikuchi et al, 1981, Nucleic Acids Res., 9: 56715678) e é fornecido controle da tradução por variantes de sequência de sinal de STII descritas anteriormente com resistência de tradução relativa medida, que contêm mudanças de códon silenciosas na região de início de tradução (TIR) (Simmons e Yansura, Nature Biotechnol., 14: 629-634 e Simmons et al, 2002, J. Immunol. Methods, 263:133-147).

[0240] Cada meio-anticorpo continha um botão (protuberância) ou orifício (cavidade) elaborado na cadeia pesada conforme descrito na Patente Norte-Americana n^Q 7.642.228. Resumidamente, um mutante de botão CH3 foi gerado em primeiro lugar. Foi criada em seguida uma biblioteca de mutantes de orifício CH3 por meio da aleatorização dos resíduos 366, 368 e 407 que se encontram nas proximidades do botão sobre o domínio CH3 parceiro. Nos exemplos a seguir, a mutação de botão foi T366W e o orifício continha as mutações T366S, L368A e Y407V em uma cadeia principal de lgG1 ou lgG4. Mutações equivalentes em outros isotipos de imunoglobulina

103/118 podem ser elaboradas pelos técnicos no assunto. Além disso, os técnicos no assunto apreciarão facilmente que se prefere que os dois meio-anticorpos utilizados para o biespecífico sejam o mesmo isotipo.

[0241] Expressão e purificação:

Meio-anticorpos que contêm as mutações de botão ou orifício foram gerados em cultivos separados por meio da expressão das construções de cadeia leve e pesada em uma célula hospedeira bacteriana, tal como E. coli. Os plasmídeos de expressão foram introduzidos em linhagens de hospedeiro E. coli 33D3 (Ridgway et al (1999) 59 (11): 2718) ou 64B4 (W3110 .DELTA.fhuA .DELTA.phoA ilvG+.DELTA.prc spr43H1 .DELTA.degP . DELTA. manA lacl.sup.q .DELTA.ompT) e os transformadores foram selecionados sobre placas LB que contêm carbenicilina. Foram utilizados em seguida transformadores para inocular um cultivo inicial de LB que contém carbenicilina e este foi cultivado por uma noite com agitação a 30 ^QC. O cultivo inicial foi diluído 100X em meios limitadores de fosfato C. R. A. P. (Simmons et al, 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147) que contêm carbenicilina e o cultivo cresceu por 24 horas com agitação a 30 ^QC. Os cultivos foram centrifugados e as pelotas celulares foram congeladas até o início da purificação de anticorpos. As pelotas foram descongeladas e novamente suspensas em um tampão de extração que contém 25 mM de base Tris ajustada em pH 7,5 com ácido clorídrico, 125 mM de NaCI e 5 mM de EDTA (tampão de extração Tris ou TEB) com razão entre volume e peso de 100 ml de TEB por cinco gramas de pelota celular e extraídas por meio de rompimento das células utilizando microfluidos por meio de passagem da mistura novamente suspensa através de um microfluidificador da Microfluidics Corporation modelo 11 OF (Newton, Mass.) por três vezes. O extrato de células bacterianas foi clarificado em seguida por meio de centrifugação por vinte minutos a 15.000 Xg e o sobrenadante foi coletado e filtrado através de um

104/118 filtro de acetato de 0,22 micron antes da purificação.

[0242] Cada meio-anticorpo foi purificado separadamente por meio de cromatografia de afinidade de Proteína A. Extratos celulares clarificados do meio-anticorpo de botão foram carregados sobre uma coluna de 1 ml de HiTrap MABSELECT SURE® da GE Healthcare (Piscataway NJ) a 2 ml/min. Após carregamento, a coluna foi lavada com dez volumes de coluna (CV) de 40 mM de citrato de sódio, pH 6,0, 125 mM de cloreto de sódio e 5 mM de EDTA seguidos por cinco volumes de coluna de 20 mM de citrato de sódio sob pH 6,0 para facilitar a captura pela coluna de troca de cátions. Os meioanticorpos capturados por afinidade foram eluídos com dez volumes de coluna (CV) de 0,2 mM de ácido acético (pH 2-3).

[0243] Expressão de meio-anticorpos em células de CHO: Construção de plasmídeos de expressão:

Os cDNAs de cadeia pesada e de cadeia leve estavam sob o controle de promotor e amplificador de gene inicial imediato de citomegalovírus (CMV). Cada local de início de transcrição de CMV é seguido por sequências doadoras e receptoras de divisão, que definem introns que são removidos dos transcritos finais (Lucas et al, High-Level Production of Recombinant Proteins in CHO Cells Using a Dicistronic DHFR Intron Expression Vector, Nucl. Acid Res. (1996) 24: 1774-9). A enzima sintetase de glutamina (GS) foi utilizada como marcador de seleção para ο desenvolvimento de linhagem de células estáveis (Sanders et al, Amplification and Cloning of the Chinese Hamster Glutamine Synthetase Gene, The EM BO J. (1984) 3:65-71) e estava sob o controle de amplificador e promotor inicial SV40.

[0244] Cultivo celular:

Células de CHO foram cultivadas em um meio com base em DMEM/F12 patenteado em recipientes de frasco de agitação a 37 ^QC e CO₂ a 5%. As células passaram com densidade de semeadura de 3 x 10⁵/ml, a cada três a quatro dias.

105/118 [0245] Transfecção estável:

Células de CHO foram transfectadas utilizando lipofectamina 2000 CD de acordo com as recomendações do fabricante (Invitrogen, Carlsbad CA). Células transfectadas foram centrifugadas e semeadas em meio seletivo com base em DMEM/F-12 (livre de glutamina) com várias concentrações de metionina sulfoximina (MSX). Cerca de três semanas após a semeadura, colônias individuais foram tomadas em placas com 96 cavidades. As colônias tomadas foram avaliadas para determinar a produção de anticorpos tomandose o sobrenadante para análise por ELISA. Clones superiores foram escalonados e avaliados com base em títulos de anticorpo, metabolismo favorável (principalmente consumo de lactato) e atributos de qualidade de produto aceitáveis.

[0246] Expressão:

Cada meio-anticorpo foi expresso em células de CHO. Dois litros de cultivo foram cultivados e colhidos.

[0247] Purificação de meio-anticorpos:

Cada meio-anticorpo foi capturado em uma coluna MABSELECT SURE®. A coluna foi lavada em seguida com quatro volumes de coluna (CV) dos tampões a seguir: um tampão de equilíbrio que consiste de 50 mM de TRIS pH 8,0, 150 mM de NaCI e um tampão de lavagem que consiste de 0,4 M de fosfato de potássio, pH 7,0. Cada braço foi eluído em 0,15 M de acetato de sódio sob pH 2,9.

[0248] Os métodos descritos acima de expressão e purificação de meio-anticorpos são geralmente aplicáveis a IgG de diferentes isotipos.

Exemplo 2 [0249] Solubilizante e manutenção de pH:

O exemplo a seguir detalha como a incubação de meioanticorpos sob pH intermediário dirigiu a alteração de conformação e aumentou

106/118 a eficiência de montagem e a forma como a adição de urn solubilizante tai como arginina e histidina reduziu a precipitação induzida por pH intermediário de meio-anticorpos.

[0250] Conjuntos de proteína A de meio-anticorpos são inerentemente instáveis devido à superfície interna exposta dos domínios CH2 e CH3 que são propensos a conter emplastros hidrofóbicos que normalmente se encontram na superfície não exposta a solvente de anticorpos. Desta forma, quando ajustado a pH de mais de 4, conjuntos de proteína A de meioanticorpos tendem a precipitar-se. Os inventores do presente descobriram que, com concentração mínima de L-arginina presente (em certos exemplos > 50 mM), o meio-anticorpo foi estabilizado e permaneceu em solução mediante ajuste do pH. Esta adição de um solubilizante tal como arginina manteve o meio-anticorpo em solução, reduziu a turvação mediante ajuste de pH e aumentou o rendimento de montagem biespecífica. Vide a Figura 3. Arginina também protegeu meio-anticorpos biespecíficos e biespecíficos purificados contra a formação de agregação durante o congelamento. Também se observou efeito de redução de precipitação similar em histidina.

[0251] A proteína recuperada das colunas de proteína A no Exemplo 1 foi utilizada como material de partida para este exemplo.

[0252] Adicionou-se L-arginina (1 M, pH 9) à proteína purificada Proteína A até concentração final de 50 a 600 mM. A solução foi titulada em seguida até pH mais alto utilizando 1,5 M de base Tris, pH 11, conforme o necessário. A etapa de elevação até pH intermediário após a eluição ácida da coluna de Proteína A é denominada manutenção de pH intermediário.

[0253] Devido às mutações de botão e orifício no domínio CH3, anticorpos biespecíficos possuem diferentes graus de flexibilidade em comparação com anticorpos padrão. Como resultado desta flexibildiade exclusiva e das superfícies internas expostas dos domínios CH2 e CH3, meio

107/118 anticorpos aparentemente sofreram alterações de conformação mediante ajuste de pH. Vide a Figura 2.

[0254] Neste experimento, os botões sofreram alteração de monômero para homodímero não ligado covalentemente quando o pH foi ajustado em pH de mais de 4. Vide a Figura 2B. Os orifícios sofreram alteração de conformação de um raio hidrodinâmico menor para um raio hidrodinâmico maior com base no tempo de retenção de cromatografia de exclusão de tamanhos. A alteração começou a ocorrer sob pH 5 e pH > 7 levou a alteração até o término. Vide a Figura 2A.

[0255] Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para determinação da agregação e do estado oligomérico de anticorpos foi realizada por meio de cromatografia HPLC. Resumidamente, anticorpos purificados por proteína A foram aplicados a uma coluna Tosoh TSK gel SW2000 em um sistema HPLC 1200 da Agilent. Proteína (meio-anticorpo lgG1 produzido em E. coli) sofreu eluição com 0,2 M de K₃PO₄ e 0,25 M de KCI sob pH 6,2 em velocidade de fluxo de 0,5 ml/min. A proteína que sofreu eluição foi quantificada por meio de absorção de UV e integração de áreas de pico. Vide as Figuras 2A e B. Esta alteração pode representar um intermediário de dobra que foi induzido por alteração de pH devido à flexibilidade mais alta do meioanticorpo, especialmente meio-anticorpos de botão e orifício com mutações no domínio CH3.

[0256] A manutenção de pH intermediário, entretanto, pode resultar em precipitação de meio-anticorpos. Conforme exibido na Figura 3A, a presença de arginina reduziu a turvação induzida por pH dos meio-anticorpos de botão lgG1 purificados por Proteína A. Neste experimento, utilizou-se 1 M de arginina para titular o pH nos conjuntos de Proteína A de meio-anticorpos lgG1 produzidos por E. coli. A concentração final de arginina foi de cerca de 50 mM quando o pH foi titulado em 5,5, cerca de 200 mM sob pH 7,5 e cerca de

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400 mM sob pH 8,5 (vide a Figura 3A). A presença de arginina também aumentou o rendimento de montagem do anticorpo biespecífico de botão em orifício em 15% (dados não exibidos).

[0257] De forma similar, histidina foi capaz de reduzir a turvação induzida por pH devido à precipitação. Meio-anticorpo lgG1 de “botão” foi purificado a partir de homogeneizado de E. coli sobre uma coluna MABSELECT SURE®, o que resulta em um conjunto de Proteína A com concentração de 12 g/l de meio-anticorpo. Um quarto de volume de cloridrato de arginina ou cloridrato de histidina foi adicionado até concentração aditiva final de 200 mM, com volume equivalente de água purificada adicionado para o controle “nenhum”. O pH da amostra aumentou utilizando hidróxido de sódio concentrado (solução de NaOH a 50% p/v ou 19,1 N) adicionado em gotas e os pontos de dados foram registrados. O pH foi medido utilizando uma microssonda Orion Ross 81-03. A turvação da solução foi medida utilizando um medidor de turvação de laboratório Hach 2100.

[0258] Os dados da Figura 3B demonstraram que arginina (200 mM) e histidina (200 mM) reduziram a precipitação induzida por pH em lgG1 isolado de E. coli. Em resumo, pH intermediário induziu a alteração de conformação de meio-anticorpos em favor de montagem biespecífica e um solubilizante adicionado à etapa de manutenção de pH intermediário reduziu a precipitação induzida por pH reduzido.

Exemplo 3 [0259] Redução:

O exemplo a seguir detalha como o uso de uma condição redutora reduz a agregação, o que resulta em mais formação do heteromultímero desejado, tal como um anticorpo biespecífico. Glutationa adicionada a uma mistura de montagem, por exemplo, cria uma condição fracamente redutora que é vantajosa para montagem biespecífica de botão em

109/118 orifício. Outros redutores em uma classe similar tal como BMEA (betamercaptoetilamina) podem possuir efeito similar.

[0260] A agregação pode ocorrer durante a montagem dos meioanticorpos de botão e orifício para formar biespecíficos. O aumento dos níveis de glutationa minimiza a quantidade de agregação durante a montagem. Por outro lado, redutores fortes tais como DTT em altas concentrações podem às vezes aumentar a agregação. Sem limitações a mecanismos específicos, em vez de reduzir as ligações de dissulfeto permanentemente, glutationa aparentemente altera dissulfetos que agem como catalisador para formação apropriada de dissulfeto. Com conjuntos de glutationa, não é necessária a troca de tampão para formar os dissulfetos da região de articulação no produto biespecífico de interesse, como é necessário para reoxidação ao utilizar-se um redutor forte. A adição de um reoxidante químico não é necessária ao utilizarse um redutor fraco tal como glutationa.

[0261] As concentrações de glutationa podem ser expressas em termos de molaridade ou em termos de razão molar com relação à quantidade dos polipeptídeos que contêm articulação ou meio-anticorpos presentes na mistura de montagem. O uso de razão molar alvo de controles redutores para a concentração de proteína na mistura de montagem evita a redução excessiva ou a redução insuficiente como resultado de concentrações de proteína variáveis.

[0262] Neste exemplo, adicionou-se glutationa aos meioanticorpos misturados em excesso molar de 2 a 200x. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 46 horas. Em HPLC RP (cromatografia de líquidos de alto desempenho em fase reversa), todas as amostras foram diluídas com ácido trifluoroacético a 0,1% até concentração máxima de 1,0 mg/ml. A concentração de proteína foi determinada por meio de medições fotométricas a 280 nm. Quatro amostras de ácido trifluoroacético a 0,1% foram

110/118 injetadas antes da análise de amostras. Isso garantiu que a coluna fosse completamente equilibrada. Meio-anticorpos lgG1 produzidos por E. coli purificados por Proteína A foram aplicados a Poros R2/20 2,1 mm D x 20 mm L em um sistema HPLC 1200 da Agilent. Proteína foi eluída com gradiente linear de 38 a 49% de Tampão A a 0,09% de ácido trifluoroacético e 80% de acetonitrila (Tampão B) em vinte minutos sob velocidade de fluxo de 0,5 ml/min. A proteína que sofreu eluição foi quantificada por meio de absorção de UV e integração de áreas de pico. Conforme exibido na Figura 4A, o nível de formação biespecífica aumentou com o aumento da razão molar glutationa:Ab. Vide a Figura 4A.

[0263] Realizou-se cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para determinação da agregação e do estado oligomérico de anticorpos. Resumidamente, meio-anticorpos lgG1 produzidos por E. coli e purificados por proteína A foram aplicados a uma coluna Tosoh TSKgel SW2000 em um sistema HPLC 1200 da Agilent. Proteína sofreu eluição com 0,2 M de K₃PO₄ e 0,25 M de KCI sob pH 6,2 em velocidade de fluxo de 0,5 ml/min. A proteína que sofreu eluição foi quantificada por meio de absorção de UV e integração de áreas de pico. Confirmou-se que o pico de 150 kD observado deve-se à formação de anticorpo biespecífico. Vide a Figura 4B.

[0264] Como se pode observar, existe alteração de picos dos monômeros indesejados (ou seja, meio-anticorpos, seja de botão ou orifício) e homodímeros para o heteromultímero, ou seja, um anticorpo biespecífico (Figuras 4A e B). Em resumo, os dados demonstram que o aumento da razão molar entre glutationa e meio-anticorpos reduziu a agregação e aumentou a formação biespecífica (Figura 4B).

Exemplo 4 [0265] Temperatura:

Este exemplo ilustra o efeito da temperatura sobre a estabilidade

111/118 de meio-anticorpos e a montagem do heteromultimero.

[0266] A temperatura da solução dos meio-anticorpos apresentou impacto dramático sobre a velocidade de montagem. Um exemplo de aumento da montagem de meio-anticorpos lgG1 produzidos por E. co//sob temperatura mais alta é exibido na Figura 5A.

[0267] Outro exemplo que exibe o efeito da temperatura sobre montagem biespecífica é exibido na Figura 5B. Neste experimento, dois meioanticorpos lgG1 foram produzidos em E. coli e purificados sobre a Proteína A conforme descrito no Exemplo 1. Os meio-anticorpos foram combinados e divididos em quatro parcelas para teste de montagem biespecífica sob condições diferentes com ou sem aquecimento e/ou manutenção de pH intermediário.

[0268] Conforme exibido na Figura 5B, excesso molar de 200 de glutationa sob condições variáveis aumentou a velocidade de formação de anticorpo lgG1 biespecífico. As condições de controle (temperatura ambiente, cerca de 20 ^QC, o meio-anticorpo foi mantido sob pH 4, sem manutenção de pH intermediário) permitiram a montagem do biespecífico, embora em velocidade mais baixa. A manutenção dos meio-anticorpos purificados por Proteína A sob pH intermediário (pH 5 para meio-anticorpo de botão; pH 7 para meio-anticorpo de orifício) por 16 horas à temperatura ambiente aumentou a velocidade de formação de anticorpos biespecíficos sem caminhar para temperatura mais alta (a mistura de montagem possuía pH 8,5 em “pH otimizado” na Fig. 5B). O aumento da temperatura para 37 ^QC sem uma etapa de manutenção de pH intermediária aumentou a velocidade de montagem de anticorpo biespecífico sobre o controle e foi mais rápido com relação a uma etapa de manutenção de pH e à montagem realizada à temperatura ambiente. A velocidade de montagem mais alta, entretanto, foi observada quando os meio-anticorpos purificados por Proteína A foram mantidos sob pH intermediário (conforme

112/118 acima) e montados em seguida sob pH 8,5 sob temperatura elevada (ou seja, 37 ^QC). Sob esta condição, atingiu-se cerca de 80% de montagem biespecífica em apenas cerca de seis horas (Figura 5B). Em resumo, a velocidade de montagem geral aumentou por meio de aquecimento e a manutenção de pH e o aquecimento apresentaram efeito sinérgico sobre a montagem.

[0269] Montagem amplificada por calor também foi observada em anticorpo biespecífico lgG4. Os resultados da Figura 6B demonstram que, na presença de PVP e histidina, meio-anticorpos lgG4 aquecidos produzidos pelo cultivo de E. coli atingiram resultados de montagem similares à montagem de meio-anticorpos lgG1 produzidos por E. coli. A quantidade de biespecífico foi analisada utilizando HPLC de fase reversa conforme descrito acima. Tomados em conjunto, os dados demonstram que o aquecimento facilitou a formação de biespecíficos.

Exemplo 5 [0270] Estabilizantes:

O exemplo a seguir detalha como os estabilizantes podem reduzir a agregação como resultado do aquecimento e/ou pH elevado durante a montagem e/ou manutenção de pH intermediário.

[0271] Polivinilpirrolidona (PVP) é um polímero não carregado hidrossolúvel com um grupo pirrolidona. PVP reduziu a agregação durante a montagem aquecida. Sem limitações a mecanismos específicos, PVP pode agir para estabilizar um intermediário de dobra do biespecífico ou proteger os meioanticorpos contra a agregação provavelmente pela interação com os emplastros hidrofóbicos do biespecífico.

[0272] O efeito de PVP sobre a formação de agregados foi analisado utilizando SEC sob as condições descritas no Exemplo 3. A adição de PVP minimizou as substâncias com alto peso molecular (HMWS) presentes no conjunto montado para 12% HMWS com PVP a 4% (p/v) em comparação

113/118 com NMWS a 4% sem a adição de PVP. Vide a Figura 6A. Todas as amostras foram lgG1 produzido por E. co//aquecido na presença de 200 mM de arginina.

[0273] Em seguida, foi testada a montagem de anticorpo biespecífico lgG4. Conforme exibido na Figura 6B, montagem aquecida na presença de PVP e histidina aumentou muito a montagem de lgG4 biespecífico produzido por E. coli até níveis similares à montagem aquecida de lgG1 produzido por E. coli exibida na Figura 5A. Arginina estava presente na amostra aquecida e na amostra à temperatura ambiente na forma de solubilizante e titulador de pH. Além de PVP, outro estabilizante histidina foi adicionado antes da etapa de manutenção de pH intermediário aquecida para estabilizar meio-anticorpo durante esta etapa. Os resultados demonstram que PVP e histidina aumentaram a montagem biespecífica de lgG4 para níveis similares à montagem bispecífica de IgG 1 (compare as Figuras 6B e 5B).

[0274] A Figura 6C apresenta outro exemplo no qual PVP minimizou a formação de HMWS durante a montagem aquecida de um anticorpo biespecífico lgG4.

[0275] Aquecimento dos conjuntos de Proteína A e meioanticorpos acelerou as alterações de conformação dos meio-anticorpos mediante incubação sob pH intermediário. O aquecimento pode, entretanto, causar agregação, especialmente para a montagem de anticorpos biespecíficos de botão e orifício lgG4 a partir de meio-anticorpos lgG4 produzidos em E. coli. Desta forma, solubilizante e/ou estabilizantes adicionais foram agregados mediante aquecimento dos meio-anticorpos lgG4 durante a montagem.

[0276] Alteração de conformação de meio-anticorpo de orifício lgG4 de E. coli foi detectada após 48 horas de incubação à temperatura ambiente. Quando os meio-anticorpos de orifício lgG4 foram incubados a 37 ^QC, detectou-se alteração de conformação em cerca de três horas (dados não

114/118 exibidos). O aquecimento, entretanto, gerou aumento da agregação conforme determinado por meio de SEC. Vide a Figura 7, painel esquerdo. Neste experimento, adicionou-se histidina durante a etapa de manutenção de pH intermediário aquecida para testar o seu efeito sobre a redução da agregação de meio-anticorpos. Conforme exibido na Figura 7, a presença de histidina durante o aquecimento minimizou o nível de agregação de 11% de substâncias com alto peso molecular (HMWS, sem histidina) para 6% de HMWS (200 mM de histidina), sem afetar a alteração de conformação dos meio-anticorpos. Os resultados demonstram, portanto, que um estabilizador reduziu a formação de agregados durante a montagem de anticorpos biespecíficos, bem como a manutenção de pH intermediário de meio-anticorpos.

Exemplo 6 [0277] Montagem:

Este exemplo fornece protocolos para dois exemplos de isotipos de imunoglobulina, ou seja, lgG1 e lgG4. Os meio-anticorpos foram produzidos em uma dentre duas células hospedeiras diferentes, ou seja, E. coli ou CHO. Compreende-se que os métodos descritos no presente podem ser aplicados a outros isotipos de anticorpos produzidos na mesma ou em outras fontes. Encontra-se dentro da capacidade dos técnicos no assunto a modificação dos protocolos por meio de experimentação rotineira com base no conhecimento da técnica e nos ensinamentos descritos no presente pedido.

[0278] Compreende-se ainda que a formação de um anticorpo que compreende um meio-anticorpo produzido em uma primeira célula hospedeira (tal como CHO) pode ser montada com um meio-anticorpo complementar produzido em uma segunda célula hospedeira (tal como E. coli) (dados não exibidos). Desta forma, por exemplo, um meio-anticorpo de botão produzido em CHO pode ser montado com um meio-anticorpo de orifício produzido em E. coli ou vice-versa.

115/118 [0279] Todos os quatro procedimentos de montagem descritos no presente exemplo resultaram em montagens que se estabilizaram após quatro horas e produziram menos de 10% de agregado e agregação mínima durante a montagem.

[0280] a. lgG1 de E. coli:

Alteração de conformação de meio-anticorpos: Caso os conjuntos de proteína A possuíssem pH de menos de 7, o pH dos dois conjuntos de meio-anticorpos foi ajustado em pH 7 utilizando 1 M de arginina (pH 9) e os dois conjuntos foram incubados a 37 ^QC por três horas. Alternativamente, os conjuntos foram incubados à temperatura ambiente por 48 horas. Caso os conjuntos já estivessem em pH 7 por 48 horas ou mais, pular esta etapa. A quantidade de arginina adicionada para fazer com que a solução chegasse a pH 7 foi determinada.

[0281] Os conjuntos (ainda quentes) foram combinados e o pH foi ajustado em pH 8,5 utilizando 1 M de arginina (pH 9). A quantidade de arginina adicionada nesta etapa foi determinada.

[0282] Foram adicionados 2 M de arginina (pH 8,5) até que a concentração final de arginina fosse de 0,5 M.

[0283] 200 mM de glutationa reduzida (GSH) em 0,5 M de arginina (pH final 8,5) foram adicionados até que a razão GSH:Ab fosse de 200X (ex.: adicionar 6,88 pl da solução de glutationa para cada mg de meioanticorpo).

[0284] A solução de meio-anticorpo de glutationa foi incubada a 37 ^QC por quatro horas para permitir a montagem dos meio-anticorpos em um anticorpo biespecífico.

[0285] b. lgG1 de CHO:

Montado conforme descrito acima para E. coli. O pH pode não necessitar ser elevado para pH 7 ou acima para a manutenção de pH

116/118 intermediário. O tempo de montagem após a adição de glutationa pode atingir o término após duas horas.

[0286] c. lgG4deCHO:

Montado com as mesmas condições acima (lgG1 de CHO). Histidina e PVP podem não ser necessários.

[0287] d. lgG4 de E. coli:

A montagem de lgG4 a partir de E. coli utilizando os protocolos acima resultou em altos níveis de agregado, ou seja, cerca de 35%. Isso necessitou de modificações de condições de montagem.

[0288] Determinou-se que a composição de conjunto de Proteína A contendo 0,2 M de histidina e 50 mM de arginina gerou resultados aceitáveis (dados não exibidos). Desta forma, diversas maneiras de fornecimento do resultado final foram pesquisadas e determinadas para fornecer resultados aceitáveis.

[0289] Um primeiro método utilizou eluição alterada (pH 3) e tampões de lavagem (pH 7) durante a purificação de Proteína A para conter 0,2 M de His e 50 mM de Arg. Isso resultou no conjunto final de Proteína A contendo 0,2 M de His e 50 mM de Arg, pH 4, que foi titulado em seguida até pH 8 utilizando 1,5 M de base Tris (pH 11).

[0290] Um segundo método alternativo utilizou uma solução de 0,8 M de Histidina HCI (que possui solubilidade de 0,8 M). Um terço de volume de Histidina HCI foi adicionado ao(s) conjunto(s) de Proteína A para atingir concentração final de 0,2 M de His. Em seguida, foi adicionado 1/40 de volume de 2 M de Arg.

[0291] Um terceiro método alternativo foi a troca de tampão dos conjuntos de Proteína A para um tampão de 0,2 M de His e 50 mM de Arg (preferencialmente sob pH 8).

[0292] Um método alternativo final foi a adição de histidina

117/118 diretamente ao(s) conjunto(s) de Proteína A (31,03 g/l) e adição em seguida de 1/40 do volume de 2 M de Arg.

[0293] Um quarto de volume de uma solução de 20% p/v Spectrum PVP K-15 em 0,2 M de histidina e 50 mM de Arg foi adicionado ao(s) conjunto(s) de Proteína A.

[0294] Observou-se que PVP também minimizou a agregação durante a montagem para IgG 1 sob condições de baixo teor de glutationa.

[0295] Alteração de conformação de meio-anticorpos: O pH do(s) conjunto(s) de proteína A foi ajustado em pH 8,0 utilizando 1,5 M de base Tris com 0,2 M de histidina e 50 mM de Arg e PVP K-15 a 4% (pH 11) e incubado a 37 ^QC por três horas. Alternativamente, o(s) conjunto(s) poderá(ão) ser incubado(s) à temperatura ambiente por 48 horas.

[0296] 200 mM de glutationa reduzida (GSH) em 0,2 M de histidina, PVP a 4%, 50 mM de arginina (pH final 8,0) foram adicionados até que a razão GSH:Ab fosse de 200X (ex.: adicionar 6,88 μΙ da solução de glutationa para cada mg de meio-anticorpo). Caso os conjuntos de meioanticorpos não tenham sido combinados, eles foram combinados nesse ponto.

[0297] Os meio-anticorpos reunidos foram incubados a 37 ^QC por quatro horas para permitir a formação do anticorpo biespecífico. Nesse momento, o percentual de anticorpo biespecífico estabilizou-se.

[0298] Após o nivelamento da quantidade de anticorpo biespecífico, a solução pode ser armazenada sob baixa temperatura ou ajustada em pH mais baixo para processamento em etapas de cromatografia subsequentes.

[0299] Os métodos descritos no presente encontram uso na fabricação de proteínas terapêuticas, tais como anticorpos biespecíficos.

[0300] Compreende-se que os exemplos e realizações descritos no presente destinam-se apenas a fins ilustrativos e que diversas modificações

118/118 ou alterações à sua luz serão sugeridas para os técnicos no assunto e deverão ser incluídas dentro do espírito e propósito do presente pedido e do escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados no presente são integralmente incorporadas como referência para todos os propósitos.

Claims

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA HETEROMULTIMÉRICA, dito método caracterizado por compreender:

(a) obtenção de um primeiro polipeptídeo que contém articulação purificado por proteína A que compreende um domínio de heterodimerização;

(b) obtenção de um segundo polipeptídeo que contém articulação purificado por proteína A, em que o segundo polipeptídeo que contém articulação compreende um domínio de heterodimerização;

(c) ajuste do pH de cada polipeptídeo que contém articulação para pH entre 4 a 9;

(d) mistura dos primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação para obter uma mistura de montagem (assembly mixture)·, (e) adição de excesso molar de um redutor fraco à mistura de montagem; e (f) incubação da mistura de montagem para formar uma proteína heteromultimérica que compreende os primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos primeiro e segundo polipeptídeos que contêm articulação compreenderem um meio-anticorpo, imunoadesina ou seus fragmentos.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo polipeptídeo que contém articulação ser um meio-anticorpo.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo polipeptídeo que contém articulação compreender um componente Fc.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa (c), o primeiro e/ou segundo polipeptídeos que contêm articulação ser ajustado para pH entre 4 e 9 na presença de um solubilizante.

2/8

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo pH de cada polipeptídeo que contém articulação na etapa (c) ser ajustado para pH entre 5 e 8.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo pH ser ajustado após mistura.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender adicionalmente incubar a mistura de montagem a uma temperatura entre 15 ^QC e 39 ^QC, preferencialmente 37 ^QC, por pelo menos 30 minutos.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela mistura de montagem ser incubada a pH 8.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela mistura de montagem na etapa (f) possuir um potencial de oxidação de 200 a -600 mV, de maior preferência de -300 a -500 mV e, de preferência superior, cerca de -400 mV.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo redutor fraco ser selecionado a partir de GSH, betamercaptoetilamina, GSH/GSSG, cisteamina/cistamina, glicilcisteína e betamercaptoetanol.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo redutor fraco ser adicionado em excesso molar de 50-200X.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo redutor fraco ser adicionado em excesso molar de 100-300X.

14. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1, 3, 6 a 8, caracterizado pelo redutor fraco ser GSH adicionado à mistura de montagem em excesso molar de 50-200X.

15. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1, 3, 6 a 8, caracterizado pelo redutor fraco ser GSH adicionado à mistura de montagem em excesso molar de 100-300X.

3/8

16. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 14 a 15, caracterizado pela incubação da mistura de montagem ser realizada a uma temperatura entre 15 ^QC e 39 ^QC, preferencialmente 37 ^QC, na presença de um estabilizador que é arginina, histidina ou Polivinilpirrolidona (PVP).

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo estabilizador ser PVP adicionado em até 40% (p/v).

18. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1, 3, 6 a 8, caracterizado pelo domínio de heteromultimerização compreender um ou mais dentre um botão (knob), orifício, fecho de leucina, bobina enrolada, ou resíduo de aminoácido polar capaz de formar uma interação eletrostática.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo que contém articulação compreender um botão e o segundo polipeptídeo que contém articulação compreender um orifício.

20. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 14 a 15, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo que contém articulação compreender um botão e o segundo polipeptídeo que contém articulação compreender um orifício.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo que contém articulação compreender um botão e o segundo polipeptídeo que contém articulação compreender um orifício.

22. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1, 3, 6 a 8, caracterizado pelo polipeptídeo que contém articulação ser produzido por uma célula bacteriana, uma célula de levedura, um bacilovírus ou uma célula de mamífero.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo polipeptídeo que contém articulação ser produzido por uma

4/8 célula bacteriana, preferencialmente E. coli.

24. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ANTICORPO BIESPECÍFICO, caracterizado por compreender as etapas de:

(a) fornecimento de um primeiro meio-anticorpo sob pH 5-9 na presença de um primeiro solubilizante, em que o primeiro meio-anticorpo compreende um domínio de heteromultimerização;

(b) fornecimento de um segundo meio-anticorpo sob pH 5-9 na presença de um segundo solubilizante, em que o segundo meio-anticorpo compreende um domínio de heteromultimerização;

(c) mistura dos primeiro e segundo meio-anticorpos para formar uma mistura de montagem em condição redutora; em que GSH é adicionado à mistura como um redutor; e (d) incubação da mistura de montagem para formar um anticorpo biespecífico que compreende os primeiro e segundo meio-anticorpos, em que o primeiro meio-anticorpo interage com o segundo meio-anticorpo no domínio de heteromultimerização.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo primeiro solubilizante e o segundo solubilizante serem selecionados a partir do grupo que consiste em arginina, histidina e sacarose, preferencialmente a partir do grupo que consiste em arginina e histidina.

26. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 25, caracterizado pelo primeiro solubilizante e o segundo solubilizante serem o mesmo.

27. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 25 a 26, caracterizado pela arginina ser um sal de arginina ou um derivado de arginina e/ou a histidina ser um sal de histidina ou um derivado de histidina.

28. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pela arginina ser arginina HCI e/ou a histidina ser histidina HCI.

5/8

29. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 25 a 28, caracterizado pela arginina ou histidina estar presente em uma concentração entre 20 mM e 200 mM, preferencialmente em uma concentração entre 50 mM e 200 mM.

30. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 25 a 29, caracterizado pela arginina ou histidina estar presente em uma concentração entre 50 mM a 200 mM.

31. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 25 a 30, caracterizado pelo solubilizante ser arginina.

32. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 25 a 30, caracterizado pelo primeiro meio-anticorpo da etapa (a) e/ou o segundo meioanticorpo da etapa (b) encontrar-se na presença de ambos arginina e histidina.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por cada um dentre a arginina e histidina estar presente em uma concentração entre 50 mM e 200 mM.

34. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 33, caracterizado pelo primeiro meio-anticorpo e o segundo meio-anticorpo serem purificados antes da mistura.

35. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 25 a 33, caracterizado pelo primeiro meio-anticorpo e o segundo meio-anticorpo serem copurificados.

36. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 35, caracterizado pela etapa (a) ser precedida pela etapa de purificação do primeiro meio-anticorpo e/ou a etapa (b) ser precedida pela etapa de purificação do segundo meio-anticorpo.

37. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 36, caracterizado pelo primeiro e segundo meio-anticorpos serem produzidos por uma célula bacteriana, uma célula de levedura, um bacilovírus ou uma célula

6/8 de mamífero.

38. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 37, caracterizado pelos primeiro e segundo meio-anticorpos serem produzidos por uma célula de mamífero, preferencialmente uma célula de CHO.

39. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 38, caracterizado pelo meio-anticorpo ser um meio-anticorpo IgG, preferencialmente isotipo lgG1, lgG2 ou lgG4.

40. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 39, caracterizado pelo meio-anticorpo compreender um domínio VL, domínio VH, domínio de articulação, domínio CH₂ e domínio CH₃.

41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo meio-anticorpo compreender um polipeptídeo de fita simples que compreende adicionalmente um téter e em que dito polipeptídeo de fita simples compreende domínios posicionados entre si em direção N-terminal para C-terminal conforme segue: VL -téter-VH-articulação-CH₂-CH₃.

42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo meio-anticorpo compreender adicionalmente um domínio CL e um domínio CHi.

43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo meio-anticorpo compreender um polipeptídeo de fita simples que compreende adicionalmente um téter, e em que dito polipeptídeo de fita simples compreende domínios posicionados entre si em direção N-terminal para C-terminal conforme segue: VL-CL-téter-VH-CHi-articulação-CH₂-CH₃.

44. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 43, caracterizado por uma ou mais das etapas (a)-(d) serem aquecidas a uma temperatura entre 25 ^QC e 42 ^QC, preferencialmente a uma temperatura entre 35 °-C e 37 °-C.

45. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 44,

7/8 caracterizado pelo primeiro meio-anticorpo da etapa (a) e o segundo meioanticorpo da etapa (b) serem aquecidos.

46. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 44 a 45, caracterizado pela mistura de montagem da etapa (d) ser aquecida.

47. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 44 a 46, caracterizado por todas as etapas (a)-(d) serem aquecidas.

48. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 47, caracterizado pela condição de redução possuir um potencial de oxidação entre -200 e -600 mV, de maior preferência entre -300 a -500 mV e, de preferência superior, cerca de -400 mV.

49. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 48, caracterizado pelo redutor ser adicionado em excesso molar de 100-300X à mistura de montagem.

50. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 48, caracterizado pelo redutor ser adicionado em excesso molar de 200X à mistura de montagem.

51. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 50, caracterizado pela interação entre o primeiro e o segundo meio-anticorpos ser uma interação hidrofóbica e/ou uma interação eletrostática.

52. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 50, caracterizado pelo domínio de heteromultimerização compreender um ou mais dentre um botão (tal como protuberância), um orifício (tal como cavidade), fecho de leucina, bobina enrolada ou um resíduo de aminoácido polar capaz de formar uma interação eletrostática.

53. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo que contém articulação compreender um botão e o segundo polipeptídeo que contém articulação compreender um orifício.

8/8

54. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 53, caracterizado por compreender adicionalmente a adição de um estabilizador em uma ou mais dentre as etapas (a)-(d).

55. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo estabilizador ser adicionado à etapa (c) ou à etapa (d) e em que o estabilizador é arginina e/ou PVP.

56. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo estabilizador ser adicionado à etapa (a) ou à etapa (b).

57. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 24 a 56, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de recuperação do anticorpo biespecífico após a etapa (d).