KR20200046129A - 이중특이적 항체의 개선된 어셈블리 - Google Patents

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Abstract

이종다량체 단백질, 예컨대 이중특이적 항체의 효율적인 생산을 위한 방법이 본원에 기재된다. 이종다량체 단백질은 1종 초과의 표적 분자 또는 단일 표적 분자 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 방법은 달리 가능한 것보다 높은 수율 및 효율로 이종다량체 단백질의 어셈블리를 개선하기 위해 파라미터를 조절한다. 또한, 힌지-함유 폴리펩티드, 예컨대 절반-항체를 포함하는 조성물이 기재된다.

Description

이중특이적 항체의 개선된 어셈블리{IMPROVED ASSEMBLY OF BISPECIFIC ANTIBODIES}
본 발명은 2011년 10월 11일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/545863, 2011년 10월 12일에 출원된 61/546503, 2011년 11월 16일에 출원된 61/560704, 및 2012년 7월 27일에 출원된 61/676837에 관한 것이고 이를 우선권 주장한다. 각각의 상기-언급된 가출원의 개시내용은 그 전체내용이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 이종다량체 단백질, 예컨대 이중특이적 항체의 조성물 및 개선된 어셈블리 방법에 관한 것이다.
IgG 유형의 모노클로날 항체는 2개의 동일한 항원-결합 아암 및 불변 도메인 (Fc)을 함유한다. 그의 결합 아암에서 상이한 특이성을 갖는 항체는 통상적으로 자연에서 발생하지 않으며, 따라서 화학 공학 (예를 들어, 화학적 가교 등), 재조합 DNA 및/또는 세포-융합 기술의 도움으로 정교하게 만들어져야 한다.
이중특이적 항체는 2개의 상이한 항원에 동시에 결합할 수 있다. 이 특성은 종래의 모노클로날 항체로는 가능하지 않은 치료 전략의 개발을 가능하게 한다. 개발된 창의적인 이중특이적 항체 포맷의 큰 패널은 이들 분자에 대한 강한 관심을 반영한다. 문헌 [Berg J, Lotscher E, Steimer KS, et al., "Bispecific antibodies that mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus of any strain," Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88(11): 4723-4727 및 Fischer N and Leger O., "Biospecific Antibodies: Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies," Pathobiology (2007) 74:3-14]을 참조한다.
다중특이적 분자의 또 다른 부류는 재조합 융합 단백질이다. 면역조절 단백질의 세포외 도메인 및 이뮤노글로불린 (Ig)의 불변 (Fc) 도메인으로 이루어진 재조합 융합 단백질은 성장하고 있는 인간 치료제의 부류를 나타낸다. 이뮤노어드헤신은 단백질 서열의 결합 영역을 항체의 이펙터 도메인과 목적하는 특이성으로 결합시킨다. 이뮤노어드헤신은 치료제로서의 그의 잠재력에 유의한 2가지 중요한 특성을 갖는다: 표적 특이성 및 약동학 안정성 (항체와 대등한 생체내 반감기). 이뮤노어드헤신은 해로운 상호작용을 억제하거나 차단하기 위한 길항제, 또는 생리적 반응을 모방하거나 증진시키기 위한 효능제로서 사용될 수 있다. 문헌 [Chamow SM, Zhang DZ, Tan XY, et al., "A humanized, bispecific immunoadhesin-antibody that retargets CD3+ effectors to kill HIV-1-infected cells," J Hematother 1995; 4(5): 439-446]을 참조한다.
다른 다중특이적 분자는 다른 곳에서 논의된다. 그 예는 문헌 [Fisher et al., Pathobiology (2007) 74:3-14] (다양한 이중특이적 포맷의 개관); 미국 특허 번호 6,660,843 (Feige et al., 2003년 12월 9일 허여) (펩티바디); 미국 특허 공개 번호 2002-004587 (2002년 1월 10일 공개) (다중특이적 항체); 미국 특허 번호 7612181 (Wu et al., 2009년 11월 3일 허여) (이중 가변 도메인 포맷); 미국 특허 번호 6,534,628, [Nord K et al., Prot Eng (1995) 8:601-608, Nord K et al., Nat Biotech (1997) 15:772-777, 및 Groenwall et al., Biotechnol Appl Biochem. (2008) Jun;50(Pt 2):97-112] (아피바디); [Martens et al., Clin Cancer Res (2006), 12: 6144-6152 및 Jin et al., Cancer Res (2008) 68(11):4360-4368] (1-아암 항체); [Bostrom et al., Science (2009) 323:1610-1614] (이중 작용 Fab, 즉 혼합 원자가 항체)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 포맷은 당업자에게 공지되어 있다.
임상 등급 물질의 제조는 일반적으로 항체 및 특히 상기 기재된 다중특이적 분자에 대한 과제로 남아 있다. 상기 기재된 바와 같이, 혼합 결합 아암, 즉 서로 동일하지 않은 결합 아암을 갖는 분자의 생산을 위한 다수의 경로가 존재한다. 그러나 각각의 이러한 방법은 그의 결점을 갖는다.
화학적 가교는 적절한 종이 동종이량체 및 다른 바람직하지 않은 부산물로부터 정제될 필요가 여전히 있기 때문에 노동 집약적이다. 또한, 화학적 변형 단계는 단백질의 완전성을 변경하여 불량한 안정성으로 이어질 수 있다. 따라서, 이 방법은 종종 비능률적이며, 항체 활성의 손실로 이어질 수 있다.
세포-융합 기술 (예를 들어, 하이브리드 하이브리도마)은 무작위로 어셈블리되어 10가지의 항체 조합을 생성하는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 발현한다. 바람직한 이종다량체 항체는 단지 이에 따라 생산된 항체의 작은 분획이다. 바람직한 이종다량체 단백질의 정제는 생산 수율을 상당히 감소시키고, 제조 비용을 증가시킨다.
재조합 DNA 기술은 Fc 도메인을 포함하지 않는 다양한 이종다량체 포맷, 예를 들어 단일 쇄 Fv, 디아바디 등을 생성하는데 사용되어 왔다. 이러한 유형의 항체 분자에 대한 주요 단점은 Fc 도메인의 결핍, 및 이에 따른 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 활성화, Fc-수용체 결합 등)을 촉발하는 항체의 능력의 결핍이다. 따라서, 기능적 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체가 바람직하다.
재조합 DNA 기술은 또한 '노브 인투 홀(knob into hole)' 이중특이적 항체를 생성하는데 사용된다. 미국 특허 출원 20030078385 (Arathoon et al. - 제넨테크(Genentech))를 참조한다. 이러한 전략의 한 가지 제약은 2개의 모 항체의 경쇄가 동일한 세포에서 발현되는 경우에 바람직하지 않고/거나 불활성인 분자의 잘못된 쌍형성 및 형성을 방지하기 위해 동일하여야 한다는 것이다.
또한, 어닐링 및 정제 동안 제한 사건 중 하나는 산화환원 효율이다. 산화된 이종이량체는 전형적으로 이 단계 (바이오분석기 및 MS-TOF) 후에 오직 단백질의 70-80%를 구성한다. 항체의 나머지 20-30%는 이량체이고, 공유 연결이 결핍되어 있다 (SEC-LLS). 이것은 제거될 수 있으나, 전체 수율에 유의하게 영향을 미친다. 따라서, 항체 생산, 특히 이종이량체에서 전체 수율을 개선할 필요가 남아 있다. 이중특이적 항체, 이종이량체 등의 전체 수율을 개선할 수 있는 방법이 본원에 기재된다. 본 발명의 이들 및 다른 측면 및 이점은 본원에 제공된 발명의 설명으로부터 명백할 것이다
현재의 기술을 이용한 2개 이상의 힌지-함유 폴리펩티드로부터 어셈블리된 이종다량체 단백질, 예를 들어 2개 이상의 절반-항체로부터의 다중특이적 항체의 생산은 무엇보다도 생성물의 혼합물의 생산, 수율의 감소 및 이펙터 기능의 감소/제거를 포함하는 결점을 갖는다. 또한, 응집 및 침전은 종종 각각의 힌지-함유 폴리펩티드를 제조하는 동안 및 이종다량체의 어셈블리 또는 어닐링 동안 발생한다. 응집 및 침전은 바람직한 이종다량체의 수율을 크게 감소시킬 수 있다. 따라서, 보다 효율적으로 및 높은 수준으로 이종다량체 단백질을 생산하는 것이 바람직하다.
안정화제, 가용화제, 환원 조건, 선택된 pH 및 선택된 온도 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 것 중 하나 이상을 이용하거나 조정함으로써 이종다량체 단백질, 예를 들어 다중특이적 항체를 경제적으로 생산하는 효율적인 생산 공정/방법이 본원에 개시된다. 본원에 기재된 본 발명의 방법은 침전 및/또는 응집으로 인한 단백질의 손실을 감소시키고, 이종다량체 단백질 생산, 예컨대 이중특이적 항체의 생산의 전체 수율을 개선한다.
한 측면에서,
a. 제1 가용화제의 존재 하에 pH 4-9, 바람직하게는 5-9의 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 제1 힌지-함유 폴리펩티드는 이종다량체화 도메인을 포함하는 것인 단계;
b. 제2 가용화제의 존재 하에 pH 4-9, 바람직하게는 5-9의 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 이종다량체화 도메인을 포함하는 것인 단계;
c. 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 환원 조건에서 혼합하여 어셈블리 혼합물을 형성하는 단계; 및
d. 어셈블리 혼합물을 인큐베이션하여 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 형성하거나 생산하며, 여기서 제1 힌지-함유 폴리펩티드는 이종다량체화 도메인에서 제2 힌지-함유 폴리펩티드와 상호작용하는 것인 단계
를 포함하는, 이종다량체 단백질을 형성하거나 생산하는 방법이 제공된다.
이러한 측면의 특정 실시양태에서, 단계 a 및/또는 단계 b 후에 제1 및/또는 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 정제하는 단계를 수행한다. 특정한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 단백질 A에 의해 정제된다.
또 다른 측면에서,
a. 제1 가용화제의 존재 하에 pH 4-9, 바람직하게는 5-9의 제1 절반-항체를 제공하며, 여기서 제1 절반-항체는 이종다량체화 도메인을 포함하는 것인 단계;
b. 제2 가용화제의 존재 하에 pH 4-9, 바람직하게는 5-9의 제2 절반-항체를 제공하며, 여기서 제2 절반-항체는 이종다량체화 도메인을 포함하는 것인 단계;
c. 제1 및 제2 절반-항체를 환원 조건에서 혼합하여 어셈블리 혼합물을 형성하는 단계; 및
d. 어셈블리 혼합물을 인큐베이션하여 제1 및 제2 절반-항체를 포함하는 이중특이적 항체를 형성하거나 생산하며, 여기서 제1 절반-항체는 이종다량체화 도메인에서 제2 절반-항체와 상호작용하는 것인 단계
를 포함하는, 이중특이적 항체를 형성하거나 생산하는 방법이 제공된다.
이러한 측면의 특정 실시양태에서, 단계 a 및/또는 단계 b는 제1 및/또는 제2 절반-항체를 정제하는 단계에 선행한다. 특정한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 절반-항체는 단백질 A에 의해 정제된다.
추가 측면에서, 힌지-함유 폴리펩티드의 아르기닌 함유 혼합물을 제공하며, 여기서 상기 혼합물은 4 내지 9, 바람직하게는 5-9의 pH를 갖는 것인 단계, 약한 환원제를 첨가하는 단계 및 이종다량체를 생산하도록 하는 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 이종다량체를 생산하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서,
a. 단백질 A 정제된 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 수득하는 단계;
b. 단백질 A 정제된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 수득하는 단계;
c. 각각의 절반-항체의 pH를 4 내지 9로 조정하는 단계;
d. 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 혼합하여 어셈블리 혼합물을 수득하는 단계,
e. 몰 과량의 약한 환원제를 어셈블리 혼합물에 첨가하는 단계; 및
f. 어셈블리 혼합물을 인큐베이션하여 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 형성하는 단계
를 포함하는, 이종다량체 단백질을 생산하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서,
a. 단백질 A 정제된 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 수득하는 단계;
b. 단백질 A 정제된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 수득하는 단계;
c. 각각의 힌지-함유 폴리펩티드의 pH를 L-아르기닌의 존재 하에 4 내지 9로 조정하는 단계;
d. 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 혼합하여 혼합된 힌지-함유 폴리펩티드 풀을 수득하는 단계; 및
e. 인큐베이션하여 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 형성하는 단계
를 포함하는, 이종다량체 단백질을 생산하는 방법이 제공된다.
이러한 측면의 특정 실시양태에서, 혼합된 힌지-함유 폴리펩티드 풀은 환원 조건에서 인큐베이션된다. 특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체, 이뮤노어드헤신 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌은 20 mM-1M, 20 mM 내지 200 mM, 또는 50 mM-200 mM의 농도로 존재한다. 특정의 다른 실시양태에서, PVP는 단계 d 또는 단계 e에 첨가된다. 특정 실시양태에서, pH는 혼합 후에 조정된다.
본 출원인은 놀랍게도 힌지-함유 폴리펩티드, 예컨대 절반-항체의 중간 pH 유지가 힌지-함유 폴리펩티드의 이후의 어셈블리를 증진시키는 입체형태 이동을 촉진할 수 있다는 것을 발견하였다. 특정 실시양태에서, 중간 pH는 pH 4 내지 9, 바람직하게는 5 내지 9, 또는 pH 5 이상, pH 5.5 이상, pH 5.7 이상, pH 5 초과, pH 5.5 초과, pH 5.7 초과, 5 내지 9, 5 내지 8, 5.5 내지 8, 5.5 내지 9, 5.7 내지 8, 5.7 내지 9, 6 내지 8, 6 내지 9, 7 내지 8, 7.5 내지 8.5, 또는 7 내지 8.5이다. 가용화제는 힌지-함유 폴리펩티드의 pH-유도된 침전을 방지 또는 최소화하기 위해 첨가될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 가용화제는 중간 pH 유지 전에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 제1 가용화제 및 제2 가용화제는 각각 아르기닌, 히스티딘 및 수크로스, 바람직하게는 아르기닌 및/또는 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌은 아르기닌 염이고/거나 히스티딘은 히스티딘 염이다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌은 아르기닌 유도체이고/거나 히스티딘은 히스티딘 유도체이다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌 또는 히스티딘은 L-아르기닌 또는 L-히스티딘이다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌 또는 히스티딘은 아르기닌 HCl 또는 히스티딘 HCl이다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌 또는 히스티딘은 아르기닌 포스페이트 또는 히스티딘 포스페이트이다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 가용화제는 상이한 반면; 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 가용화제는 동일하다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 제1 가용화제 및 제2 가용화제는 둘 다 아르기닌을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 아르기닌은 20 mM 내지 1M, 20 mM 내지 1M 미만, 20 mM 내지 100 mM, 20 mM 내지 200 mM, 20 mM 내지 300 mM, 20 mM 내지 400 mM, 50 mM 내지 100 mM, 50 mM 내지 150 mM, 50 mM 내지 200 mM, 50 mM 내지 250 mM, 또는 50 mM 내지 300 mm, 바람직하게는 20 mM 내지 200 mM의 농도로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 가용화제는 아세틸-아르기닌을 포함하나 이에 제한되지는 않는 아르기닌 유도체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 제1 가용화제 및 제2 가용화제는 둘 다 20 mM 내지 1M, 20 mM 내지 1M 미만, 20 mM 내지 500 mM 미만, 20 mM 내지 100 mM, 20 mM 내지 200 mM, 20 mM 내지 300 mM, 20 mM 내지 400 mM, 50 mM 내지 100 mM, 50 mM 내지 150 mM, 50 mM 내지 200 mM, 50 mM 내지 250 mM, 50 mM 내지 300 mm, 50 mM 내지 400 mM, 50 mM 내지 500 mM, 또는 50 mM 내지 600 mM의 농도로 존재하는 히스티딘을 포함한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 가용화제는 50 mM의 농도로 첨가된다. 특정의 다른 실시양태에서, 가용화제는 200 mM의 농도로 첨가된다. 특정한 실시양태에서, 아르기닌 또는 히스티딘은 20 mM, 50 mM, 100 mM 또는 200 mM의 농도로 첨가된다. 특정의 다른 특정한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 아르기닌 및 히스티딘 둘 다의 존재 하에 제공된다. 다른 실시양태에서, 아르기닌 및 히스티딘은 각각 20 mM 내지 1M, 20 mM 내지 1M 미만, 20 mM 내지 100 mM, 20 mM 내지 200 mM, 20 mM 내지 300 mM, 20 mM 내지 400 mM, 50 mM 내지 100 mM, 50 mM 내지 150 mM, 50 mM 내지 200 mM, 50 mM 내지 250 mM, 또는 50 mM 내지 300 mM, 바람직하게는 50 mM 내지 200 mM의 농도로 존재한다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 중간 pH 유지 (즉, pH 조정) 전에 혼합된다. 특정의 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 pH를 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드에서 개별적으로 조정한 후에 혼합된다. 특정 실시양태에서, 가용화제는 pH 조정 전에 첨가된다.
특정 실시양태에서, 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 혼합 전에 개별적으로 정제되는 반면; 다른 실시양태에서, 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 혼합 후에 공동-정제된다. 특정한 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 어셈블리된 이종다량체 단백질은 추가의 정제에 적용될 수 있다.
단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 면역친화성 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 실리카 또는 이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상의 역상 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과, 및 다른 유사한 정제 방법, 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 방법이 정제에 이용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드, 예컨대 절반-항체는 단백질 A 또는 단백질 G 크로마토그래피에 의해 정제된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 단백질 A 정제 전에 혼합되고, 단백질 A 상에서 공동-정제된다. 특정 실시양태에서, pH는 단백질 A 정제된 폴리펩티드의 혼합 후에 조정된다. 다른 실시양태에서, pH는 단백질 A 정제된 폴리펩티드의 혼합 전에 조정된다. 특정 실시양태에서, 가용화제는 pH 조정 전에 첨가된다.
특정의 다른 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 HIC 또는 이온-교환 칼럼에 의해 정제된다. 적합한 정제 방법을 선택하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 예를 들어, 힌지-함유 폴리펩티드는 단백질 A 칼럼에 이어 이온-교환 칼럼에 의해 정제될 수 있고; 힌지-함유 폴리펩티드는 또한 단백질 A 칼럼에 이어 겔 여과 칼럼 및/또는 HIC에 의해 정제될 수 있다. 다른 예에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 단백질 A 칼럼에 의한 정제 전에 하나 이상의 이온-교환 칼럼에 의해 정제될 수 있다. 특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드의 임의의 정제 단계 동안 사용된 세척 및/또는 용리 완충제는 아르기닌 및/또는 히스티딘을 함유하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 산성 pH에서 단백질 A 매트릭스 또는 다른 칼럼 매트릭스로부터 용리된 절반-항체는 중간 pH로 조정된다. 이러한 후속적 pH 조정 (또한 중간 pH 유지로 지칭됨)은 힌지-함유 폴리펩티드, 예컨대 절반-항체의 침전을 유발할 수 있으며, 이에 따라 어셈블리된 이종다량체 단백질의 감소된 수율로 이어진다. 따라서, 특정 실시양태에서, 산성 pH에서 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼으로부터 용리된 절반-항체는 가용화제의 존재 하에 pH 조정 전에 제공된다. pH 조정 단계가 필요하지 않은 경우에, 특정 실시양태에서, 가용화제는 바람직하게는 침전 및/또는 응집을 방지하거나 감소시키기 위해 정제된 힌지-함유 폴리펩티드에 첨가된다.
중간 pH 유지 뿐만 아니라, 본 출원인은 놀랍게도 가열이 힌지-함유 폴리펩티드, 예컨대 절반-항체의 입체형태 이동 및/또는 어셈블리를 증진시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법의 단계 a-d 중, 하나, 그 초과 또는 모두가 15℃ 내지 39℃, 15℃ 내지 42℃, 18℃ 내지 37℃, 20℃ 내지 42℃, 20℃ 내지 25℃, 25℃ 내지 42℃, 25℃ 내지 35℃, 25℃ 내지 39℃, 30℃ 내지 35℃, 32℃ 내지 35℃ 또는 32℃ 내지 37℃, 바람직하게는 35℃ 내지 37℃의 온도에서 30분 이상 동안 가열된다. 특정 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 특히 실온에서 최대 72시간이다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 35℃에서 3시간이다. 특정의 다른 실시양태에서, 온도는 30℃, 35℃ 또는 37℃이거나 또는 약 30℃, 35℃ 또는 37℃이다.
그러나, 가열은 또한 응집 및/또는 침전을 증가시킬 수 있다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 가용화제가 가열 전에 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼으로부터 용리된 절반-항체에 첨가된다.
특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체, 이뮤노어드헤신, 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 Fc 성분을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 절반-항체는 IgG 절반-항체이다. 특정한 실시양태에서, IgG 절반-항체는 IgG1, IgG4 또는 IgG2 이소형이다. 특정의 유리한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 분자의 신호 펩티드는 특히 포유동물 세포에서 생산되는 경우에 절반-항체의 분비를 용이하게 하도록 유지된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 약 50 mM의 농도의 아르기닌, 및 대안적으로 또는 추가로 약 200 mM의 농도의 히스티딘의 존재 하에 pH 5-9의 제1 및 제2 절반-항체를 제공하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 절반-항체는 각각 상이한 항원 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하고, 어셈블리된 완전 항체는 이중특이적 항체이다. 특정의 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 절반-항체는 동일한 이소형인 반면; 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 절반-항체는 상이한 이소형이다.
절반-항체는 VL 도메인, VH 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 절반-항체는 또한 테더를 추가로 포함하는 단일 쇄 폴리펩티드일 수 있으며, 상기 단일 쇄 폴리펩티드는 서로에 대해 N-말단에서 C-말단으로의 방향으로 VL-테더-VH-힌지-CH2-CH3과 같이 위치한 도메인을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, 절반-항체는 CL 도메인 및 CH1 도메인을 추가로 포함하고; 추가 실시양태에서, 절반-항체는 테더를 추가로 포함하는 단일 쇄 폴리펩티드일 수 있으며, 여기서 상기 단일 쇄 폴리펩티드는 서로에 대해 N-말단에서 C-말단으로의 방향으로 VL-CL-테더-VH-CH1-힌지-CH2-CH3과 같이 위치한 도메인을 포함한다.
테더는 1개 이상의 글리신 (G) 및 세린 (S) 잔기를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 테더는 GGS 반복부를 포함한다. 테더는 예를 들어 15 내지 50개 아미노산 길이이다. 특정한 실시양태에서, 테더는 20 내지 32개 아미노산 길이, 예를 들어 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32개 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 테더는 절단가능하다. 다른 실시양태에서, 테더는 단백질로부터 절단가능하거나 그렇지 않을 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 테더는 동일한 효소에 의해 테더의 N 및 C 말단 또는 그 근처에서 2개의 부위로 절단가능하다. 한 실시양태에서, 테더는 프로테아제를 위한 절단 부위, 예컨대 푸린을 포함한다. 추가 실시양태에서, 테더는 절단 부위 RXRXRR (서열 1)에서 푸린에 의해 절단되며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 제1 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체이고, 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 단일 쇄 절반-항체이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 테더 및 Fc 성분 복합체를 포함하는 단백질을 제공하며, 여기서 테더는 단백질로부터 절단가능하거나 그렇지 않을 수 있다.
추가 실시양태에서, 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 이종다량체화 도메인을 포함한다. 이종다량체화 도메인은 노브 인투 홀 돌연변이, 류신 지퍼, 정전기성 등일 수 있다. 제1 힌지-함유 폴리펩티드는 노브를 포함할 수 있고, 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 홀을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체를 포함하고, 제1 절반-항체는 노브를 포함하고, 제2 절반-항체는 홀을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 pH를 조정하기 전에 아르기닌을 20mM 내지 1M의 최종 농도로 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아르기닌은 50mM - 600mM의 최종 농도로 첨가된다. 일부 실시양태에서, 아르기닌은 50mM - 100mM의 최종 농도로 첨가된다.
특정 실시양태에서, 방법은 pH 5 내지 8의 각 힌지-함유 폴리펩티드 단백질 A 풀을 인큐베이션한 후에 제1 및 제2 절반-항체를 혼합하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 단백질 A 풀은 혼합된 후에 pH가 5 내지 8로 조정된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 혼합된 절반-항체 또는 혼합된 힌지-함유 폴리펩티드 풀을 15℃ 내지 39℃, 바람직하게는 18℃ - 37℃, 보다 바람직하게는 20℃ - 25℃, 보다 바람직하게는 32℃ - 37℃의 온도에서 30분 이상 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다.
힌지-함유 폴리펩티드는 예를 들어 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 내의 바큘로바이러스 또는 포유동물 세포에 의해 생산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 박테리아 세포, 특히 이. 콜라이(E. coli)에 의해 생산된다. 특정의 다른 특정한 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 포유동물 세포, 특히 CHO 세포에 의해 생산된다. 특정한 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체를 포함한다.
힌지-함유 폴리펩티드는 상호작용하여 이종이량체화 도메인을 통해 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이종이량체화 도메인의 인터페이스에서 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드 사이의 상호작용은 돌출부-인투-함몰부 상호작용, 소수성 상호작용 및/또는 정전기적 상호작용이다. 특정의 다른 실시양태에서, 이종다량체화 도메인은 노브 (예를 들어, 돌출부), 홀 (예를 들어, 함몰부), 류신 지퍼, 코일드 코일, 또는 정전기적 상호작용을 형성할 수 있는 극성 아미노산 잔기, 또는 그의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 힌지-함유 폴리펩티드는 노브를 포함하고, 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 홀을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, 상호작용은 소수성 상호작용 및 정전기적 상호작용을 둘 다 포함한다. 특정의 예시적 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드의 이종다량체화 도메인은 노브 또는 홀 및 정전기적 상호작용을 형성할 수 있는 아미노산 잔기를 포함한다. 이종이량체화 도메인은 1가지 초과의 상호작용 방식, 예를 들어 노브 및 홀 (K&H) 및 소수성 상호작용, K&H 및 류신 지퍼 등을 포함할 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해된다. 특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 테더를 추가로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 어셈블리 혼합물은 이종다량체 단백질의 어셈블리를 촉진하는 조건 하에, 예컨대 pH가 7 내지 9이고, 온도가 15℃ 내지 39℃인 경우에 환원 조건, 바람직하게는 -50 내지 -600 mV, -100 내지 -600 mV, -200 내지 -600 mV, -100 내지 -500 mV, -150 내지 -300 mV, 보다 바람직하게는 -300 내지 -500 mV, 가장 바람직하게는 약 -400 mV의 산화 전위를 갖는 약한 환원 조건에 존재한다. 특정 실시양태에서, 환원제는 어셈블리 동안 바람직한 환원 조건을 제조하기 위해 단계 c 또는 단계 d에 첨가된다. 특정의 다른 실시양태에서, 환원제는 디티오트레이톨 (DTT), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 티오글리콜산, 아스코르브산, 티올 아세트산, 글루타티온 (GSH), 베타-메르캅토에틸아민, 시스테인/시스틴, 글루타티온 (GSH), 시스테아민/시스타민, 글리실시스테인, 및 베타-메르캅토에탄올, 바람직하게는 GSH로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 환원제, 바람직하게는 약한 환원제는 글루타티온 (GSH), 베타-메르캅토에틸아민, 시스테인/시스틴, 글루타티온 (GSH)/글루타티온 디술피드 (GSSG), 시스테아민/시스타민, 글리실시스테인, 및 베타-메르캅토에탄올, 및 바람직하게는 GSH로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 환원제는 DTT가 아니다.
특정의 다른 실시양태에서, 환원제는 힌지-함유 폴리펩티드의 총량에 대해 2-600X, 2-200X, 2-300X, 2-400X, 2-500X, 2-20X, 2-8X, 20-50X, 50-600X, 50-200X, 또는 100-300X 몰 과량, 바람직하게는 50-400X, 보다 바람직하게는 100-300X, 가장 바람직하게는 200X 몰 과량으로 어셈블리 혼합물에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 어셈블리 혼합물은 7 내지 9의 pH, 바람직하게는 pH 8.5를 갖는다. 특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체다.
일부 실시양태에서, 환원제는 혼합 전에 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드에 첨가된다. 바람직하게는 첨가는 혼합 전 1시간 미만, 보다 바람직하게는 15분 미만, 가장 바람직하게는 5분 미만이다.
특정 실시양태에서, 방법은 가열의 존재 또는 부재 하에 중간 pH 유지 단계 및 어셈블리 단계를 포함하나 이에 제한되지는 않는 단계 중 하나 이상에서 반응에 안정화제를 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 안정화제를 힌지-함유 폴리펩티드에 첨가하여 응집을 방지하거나 감소시킬 수 있다. 다른 예에서, 안정화제를 어셈블리 혼합물에 첨가하여 이종다량체 단백질의 어셈블리 동안 응집을 방지하거나 감소시킬 수 있다. 특정한 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 안정화제는 아르기닌, 히스티딘 및 폴리비닐피롤리돈 (PVP)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 아르기닌 또는 히스티딘은 아르기닌 염 또는 히스티딘 염이다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌 또는 히스티딘은 아르기닌 유도체 또는 히스티딘 유도체이다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌 또는 히스티딘은 아르기닌 HCl 또는 히스티딘 HCl이다. 특정 실시양태에서, 아르기닌은 아르기닌 포스페이트가 아니다.
특정의 다른 실시양태에서, 방법은 PVP의 존재 하에 어셈블리 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 관련된 실시양태에서, PVP는 40% (w/v)까지 첨가된다. 특정의 다른 실시양태에서, 어셈블리 혼합물에 존재하는 PVP는 2%-6% (w/v), 10%-20%, 2%-10%, 1%, 1.3%, 1.7%, 2%, 2.3%, 2.7%, 3%, 3.3%, 3.7% 또는 4%, 바람직하게는 0.1%-10%, 보다 바람직하게는 2%-6%, 가장 바람직하게는 4%의 농도이다. 특정 실시양태에서, PVP는 100 KD 이하, 30 KD 이하, 바람직하게는 10 KD이다. 특정의 다른 실시양태에서, PVP는 10% (w/v) 미만, 또는 5% (w/v) 미만으로 존재한다.
일부 실시양태에서, 안정화제는 20 mM 내지 1M, 20 mM 내지 1M 미만, 20 mM 내지 100 mM, 20 mM 내지 200 mM, 20 mM 내지 300 mM, 20 mM 내지 400 mM, 20 mM 내지 50 mM, 50 mM 내지 100 mM, 50 nM 내지 150 mM, 50 mM 내지 200 mM, 50 mM 내지 250 mM, 또는 50 mM 내지 300 mM의 농도로 존재하는 아르기닌이다. 다른 실시양태에서, 안정화제는 20 mM 내지 1M, 20 mM 내지 1M 미만, 20 mM 내지 100 mM, 20 mM 내지 200 mM, 20 mM 내지 300 mM, 20 mM 내지 400 mM, 20 mM 내지 50 mM, 50 mM 내지 100 mM, 50 nM 내지 150 mM, 50 mM 내지 200 mM, 50 mM 내지 250 mM, 또는 50 mM 내지 300 mM의 농도로 존재하는 히스티딘이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 아르기닌 또는 히스티딘은 50 mM 또는 200 mM의 농도로 첨가된다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌 및/또는 히스티딘은 20 mM 내지 200 mM, 20 mM 내지 100 mM, 50 mM 내지 200 mM 또는 50 mM 내지 100 mM의 농도로 첨가된다. 특정의 다른 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 힌지-함유 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 (a) 제1 항원 또는 항원의 제1 에피토프에 특이적인 제1 절반-항체를 발현하도록 조작된 제1 숙주 세포를 배양하는 단계; (b) 제2 항원 또는 동일한 항원의 제2 에피토프에 특이적인 제2 절반-항체를 발현하도록 조작된 제2 숙주 세포를 배양하는 단계; (c) pH 4-9, 바람직하게는 5-9의 단계 a의 배양물로부터 제1 가용화제의 존재 하에 제1 절반-항체를 수득하는 단계; (d) pH 4-9, 바람직하게는 5-9의 단계 b의 배양물로부터 제2 가용화제의 존재 하에 제2 절반-항체를 수득하는 단계; (e) 제1 및 제2 절반-항체를 환원 조건에서 혼합하여 어셈블리 혼합물을 형성하는 단계; 및 (f) 어셈블리 혼합물을 인큐베이션하여 제1 및 제2 절반-항체를 포함하는 이중특이적 항체를 형성하는 단계를 포함하는, 이중특이적 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 개별 배양물에서 배양되고, 제1 절반-항체 및 제2 절반-항체는 혼합 전에 제1 및 제2 숙주 세포의 배양물로부터 개별적으로 정제된다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 숙주 세포는 개별 배양물에서 배양되고, 배양물은 배합되고, 세포는 펠릿화, 임의로 균질화 및/또는 용해되고, 제1 및 제2 절반-항체는 임의의 적합한 방법에 의해 공동-정제된다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 절반-항체는 단백질 A 정제에 의해 공동-정제된다. 추가 실시양태에서, 제1 및 제2 숙주 세포는 혼합된 배양물에서 공동-배양되고, 제1 및 제2 절반-항체는 공동-정제된다.
숙주 세포는 예를 들어 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드 또는 절반-항체는 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포에 의해 생산된다. 특정의 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 특히 이. 콜라이이다.
특정의 추가 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단계 (d)에서 형성된 이종다량체 단백질 또는 이중특이적 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 어셈블리 이종다량체 단백질은 출원 전반에 걸쳐 기재된 방법 또는 당업계에 공지된 적합한 방법에 의해 추가로 정제될 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 힌지-함유 폴리펩티드 및 가용화제를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조성물의 pH는 pH 4-pH 9, 바람직하게는 pH 5-9이다. 특정 실시양태에서, 조성물의 pH는 pH 5 이상, pH 5.5 이상, pH 5.7 이상, pH 5 초과, pH 5.5 초과, pH 5.7 초과, 5 내지 9, 5 내지 8, 5.5 내지 8, 5.5 내지 9, 5.7 내지 8, 5.7 내지 9, 6 내지 8, 6 내지 9, 7 내지 8, 7.5 내지 8.5, 또는 7 내지 8.5이다. 특정 실시양태에서, 가용화제는 아르기닌, 히스티딘 및 수크로스, 바람직하게는 아르기닌 및/또는 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌은 아르기닌 염이고/거나 히스티딘은 히스티딘 염이다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌은 아르기닌 유도체이고/거나 히스티딘은 히스티딘 유도체이다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌 또는 히스티딘은 L-아르기닌 또는 L-히스티딘이다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌 또는 히스티딘은 아르기닌 HCl 또는 히스티딘 HCl이다.
특정한 실시양태에서, 가용화제는 아르기닌 또는 히스티딘이다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌 또는 히스티딘은 20 mM, 50 mM, 200 mM, 400 mM, 20 mM 내지 1M, 20 mM 내지 1 M 미만, 20 mM 내지 200 mM, 20 mM 내지 400 mM, 20 mM 내지 100 mM, 50 mM 내지 100 mM, 50mM 내지 200 mM, 50 mM 내지 300 mM 또는 50 mM 내지 400 mM의 농도로 존재한다. 특정한 실시양태에서, 조성물에 포함된 아르기닌 및 히스티딘은 둘 다 각각 20 mM, 50 mM, 200 mM, 400 mM, 20 mM 내지 1M, 20 mM 내지 1 M 미만, 20 mM 및 200 mM, 20 mM 내지 400 mM, 20 mM 내지 100 mM, 50 mM 내지 100 mM, 50mM 내지 200 mM, 50 mM 내지 300 mM 또는 50 mM 내지 400 mM의 농도로 존재한다. 특정의 다른 실시양태에서, 조성물은 구아니딘 HCl 또는 우레아를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 조성물은 대안적으로 또는 추가로 안정화제를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체를 포함한다. 특정의 다른 특정한 실시양태에서, 조성물은 오직 1가지 유형의 힌지-함유 폴리펩티드 또는 절반-항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 오직 1가지 유형의 절반-항체를 포함하며, 이는 노브 절반-항체이다. 특정의 다른 실시양태에서, 조성물은 오직 1가지 유형의 절반-항체를 포함하며, 이는 홀 절반-항체이다.
특정한 실시양태에서, 조성물은 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 추가로 포함하며, 여기서 제1 힌지-함유 폴리펩티드는 노브를 포함하고, 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 홀을 포함한다. 특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체이다. 특정의 다른 실시양태에서, 절반-항체는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소형이다.
본원에 개시된 모든 실시양태는 문맥상 달리 명백하게 언급되지 않는 한 조합될 수 있다. 또한, 상기 기재된 임의의 및 모든 실시양태가 문맥상 달리 명백하게 나타내지 않는 한 본 발명의 임의의 및 모든 측면에 적용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해 질 것이다. 그러나, 상세한 설명과 구체적 실시예가 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내지만, 단지 예시적으로 제공되는 것으로 이해되어야 하며, 이는 본 발명의 범위 및 취지 내의 다양한 변화 및 변형이 본 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문이다.
이종다량체 단백질, 예컨대 이중특이적 항체의 효율적인 생산을 위한 방법이 본원에 기재된다. 이종다량체 단백질은 1종 초과의 표적 분자 또는 단일 표적 분자 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 방법은 달리 가능한 것보다 높은 수율 및 효율로 이종다량체 단백질의 어셈블리를 개선하기 위해 파라미터를 조절한다. 또한, 힌지-함유 폴리펩티드, 예컨대 절반-항체를 포함하는 조성물이 기재된다.
도 1a는 완전히 산화된 절반-항체를 도시한다. "노브" 또는 "홀" 또는 다른 이종이량체화 도메인은 나타내지 않았다. 본 도면에 도시된 절반-항체는 IgG1 이소형이다. 당업자는 다른 이뮤노글로불린 이소형이 상응하는 쇄간 및 쇄내 결합을 갖는 절반-항체로서 계획될 수 있음을 인식할 것이다. 무손상 항체에서, 힌지 시스테인은 쇄간 디술피드 결합을 형성할 것이다.
도 1b는 이종다량체화 도메인을 갖는 전장 이중특이적 항체를 도시한다. 힌지 영역의 중쇄간 디술피드 결합은 도시하지 않았다. 나타낸 이종다량체화 도메인은 노브 인투 홀 포맷이다.
도 1c는 이종다량체화 도메인 (노브 인투 홀), 푸린 절단가능한 테더 및 임의의 여분 디술피드 결합 (S354)을 포함하는 이중특이적 항체의 카툰 표현이다. 힌지 영역의 중쇄간 디술피드 결합을 또한 나타낸다. 푸린 절단 부위는 삼각형으로 나타낸다. 푸린 절단가능한 테더가 노브를 포함하는 절반-항체 상에 나타날지라도, 이는 또한 홀 절반-항체 상에서 또는 노브 및 홀 절반-항체 둘 다 상에서 활용될 수 있다.
도 2a-b는 절반-항체의 입체형태 이동에 대한 pH의 효과를 입증하는 복합 크기 배제 크로마토그램을 보여준다. 도 2a는 상승된 pH가 큰 유체역학 반경을 생성하는 홀 절반-항체 입체형태 이동을 유도한다는 것을 보여준다. 이러한 입체형태 이동은 어셈블리 동안 이종이량체화를 증진시킨다. 도 2b는 상승된 pH가 비-공유 노브 절반-항체 동종이량체의 형성을 촉진한다는 것을 보여준다. 이러한 입체형태 이동은 어셈블리 동안 이중특이적 형성을 선호한다. 실시예 2를 참조한다.
도 3a-3b는 가용화제, 예컨대 아르기닌 (도 3a 및 b) 또는 히스티딘 히드로클로라이드 (도 3b)가 노브 절반-항체의 중간 pH-유도된 침전을 감소시킨다는 것을 보여주는 결과를 도시한다.
도 4a-b는 응집 및 이중특이적 항체 어셈블리에 대한 환원제, 예컨대 글루타티온의 효과를 입증하는 복합 크로마토그램을 보여준다. 글루타티온은 2-200X 몰 과량으로 첨가된다. 실시예 3을 참조한다.
도 5a는 IgG1 이중특이적 항체 형성 (어셈블리)의 비율에 대한 온도의 효과를 도시하는 그래프이다. 도 5b는 역상 크로마토그래피에 의해 분석된 바와 같이 증가된 온도가 pH 유지의 존재 또는 부재 하에서 200x 몰 과량의 글루타티온의 존재 하에 노브-인투-홀 이중특이적 IgG1 항체의 어셈블리를 촉진한다는 것을 보여준다. 도 5b는 또한 어셈블리 이전에 입체형태 이동을 구동하기 위한 절반 항체 풀의 pH 유지의 최적화가 어셈블리의 비율 및 효율을 개선한다는 것을 도시한다. 실시예 4를 참조한다.
도 6a는 형성된 이중특이적 항체의 안정화 및 응집체 형성의 감소에 대한 안정화제, 예컨대 PVP의 효과를 도시한다.
도 6b는 역상 크로마토그래피에 의해 분석된 바와 같이 PVP 및 히스티딘이 상승된 온도에서 노브-인투-홀 이중특이적 IgG4 항체의 어셈블리를 촉진한다는 것을 보여준다. 하부 곡선: 300x 글루타티온:Ab 비, pH = 8.5, ~ 400mM 아르기닌을 사용한 실온 어셈블리; 상부 곡선: 200x 글루타티온:Ab 비, pH = 8.0, 4% PVP, 50mM 아르기닌, 100 mM 히스티딘을 사용한 35℃에서의 가열된 어셈블리.
도 6c는 PVP가 가열된 어셈블리 동안 IgG4 노브-인투-홀 이중특이적 항체의 응집을 37℃ 및 pH 8에서 6시간 동안 감소시킨다는 것을 입증한다. 실시예 5를 참조한다.
도 7은 히스티딘이 IgG4 홀 절반-항체의 열-유도된 응집을 37℃ 및 pH 8에서 3시간 동안 감소시킨다는 것을 도시한다.
이제 오직 하기 정의 및 예를 이용하여 참조의 방식으로 본 발명을 상세히 기재할 것이다. 본원에 인용된 모든 특허 및 공개 (상기 특허 및 공개에 개시되어 있는 모든 서열 포함)는 명백히 참조로 포함된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 전문 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, New York (1994), 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)]은 당업자에게 본 발명에서 사용된 다수의 용어의 일반적인 사전을 제공한다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 등가의 모든 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있긴 하지만, 바람직한 방법 및 물질이 기재된다. 수치 범위는 그 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 각각 핵산은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 배향으로 기재되고; 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복실 배향으로 기재된다. 진료의는 당업계의 정의 및 용어에 대해 특히 문헌 [Sambrook et al., 1989, 및 Ausubel FM et al., 1993]에 집중한다. 본 발명이 기재된 특정한 방법론, 프로토콜 및 시약으로 제한되지는 않으며, 이는 이들이 달라질 수 있기 때문인 것으로 이해되어야 한다.
수치 범위는 그 범위를 정의하는 숫자를 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 각각 핵산은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 배향으로 기재되고; 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복실 배향으로 기재된다.
본원에 사용된, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 예를 들어, "숙주 세포"에 대한 언급은 하나 이상의 숙주 세포를 의미한다.
본원에 제공된 표제는 전체로서 본 명세서를 참조로 할 수 있는 본 발명의 다양한 측면 또는 실시양태를 제한하지 않는다. 따라서, 바로 다음에 정의된 용어들은 전체로서 본 명세서를 참조로 하여 보다 상세히 정의된다.
본원에 개시된 모든 실시양태는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 조합될 수 있다. 또한, 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 하기 기재된 임의의 및 모든 실시양태는 본 발명의 임의의 및 모든 측면에 적용된다.
I. 정의
본 발명은 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "힌지-함유 폴리펩티드"는 1개 이상의 힌지 영역을 함유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 힌지 영역은 다중 도메인, 예를 들어 결합 도메인 및 이펙터 도메인을 연결하고, 이량체화 또는 다량체화를 위한 폴리펩티드에 일부 구조적 가용성을 제공한다. 예로서, 결합 도메인은 항체의 항원 결합 도메인 또는 수용체의 리간드 결합 도메인일 수 있고, 이펙터 도메인은 항체의 Fc 성분일 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 힌지-함유 폴리펩티드는 제2 힌지-함유 폴리펩티드와 상이하고, 생성된 이량체 또는 다량체는 이종이량체 또는 이종다량체이다. 특정한 실시양태에서, 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 동일한 표적 단백질 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 특정의 다른 실시양태에서, 제1 힌지-함유 폴리펩티드는 제2 힌지-함유 폴리펩티드와 상이한 표적 결합 특이성을 갖고, 생성된 이종이량체 또는 이종다량체는 2종 이상의 상이한 표적 단백질에 결합한다. 특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 자연 발생 또는 조작된 이종이량체화 도메인을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 또 다른 힌지-함유 폴리펩티드와 1개 이상의 디술피드 결합을 형성할 수 있는 힌지 영역에서 1개 이상의 시스테인 잔기를 포함한다.
힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체, 이뮤노어드헤신, 및 그의 기능적 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 용어 "기능적 단편"은 여전히 원하는 기능을 보유하는, 예를 들어 표적 또는 항원-결합 활성, Fc 이펙터 활성 및/또는 이량체화/다량체화 능력을 보유하는 힌지-함유 폴리펩티드의 단편, 즉 전장보다 작은 것을 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 제1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 각각 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 절반-항체이고, 생성된 이량체 또는 다량체는 이중특이적 또는 다중특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 생성된 이종다량체 단백질은 절반-항체 및 이뮤노어드헤신을 포함한다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 이러한 다중특이적 항체는 VHVL 단위가 폴리에피토프 특이성을 갖는, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체, 각각의 VHVL 단위가 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 각각의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디 및 트리아바디, 공유 또는 비공유 연결된 항체 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는다. "폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. "단일특이적"은 오직 1개의 에피토프에 결합하는 능력을 지칭한다. 한 실시양태에 따르면, 다중특이적 항체는 각각의 에피토프에 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 결합하는 IgG 항체이다.
자연 발생 기본적 4-쇄의 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 이종사량체 당단백질이다 (IgM 항체는 J 쇄로 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 5개의 기본 이종사량체 단위로 구성되고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 포함하는 한편, 분비된 IgA 항체는 중합되어 J 쇄와 함께 2-5개의 기본적 4-쇄 단위를 포함하는 다가 회합체를 형성할 수 있다). IgG의 경우에, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 H 쇄에 연결되지만, 2개의 H 쇄는 H 쇄 이소형에 따라 1개 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된다. 또한, 각각의 H 쇄 및 L 쇄는 일정한 간격을 두고 이격된 쇄내 디술피드 가교를 갖는다. 각각의 H 쇄는 N-말단에 가변 도메인 (VH)을 가지며, 이어서 α 및 γ 쇄 각각의 경우에 3개의 불변 도메인 (CH), μ 및 ε 이소형의 경우에 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 쇄는 N-말단에 가변 도메인 (VL), 이어서 C-말단에 불변 도메인 (CL)을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 인터페이스를 형성한다고 여겨진다. VH 및 VL의 쌍형성은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 상이한 클래스의 항체의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조한다.
임의의 척추동물 종으로부터의 L 쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 및 람다라고 불리는 명백하게 특징적인 2종의 유형 중 1종에 배정될 수 있다. 이뮤노글로불린은 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라 상이한 부류 또는 이소형으로 배정될 수 있다. 5종의 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭되는 중쇄를 갖는다. γ 및 α 부류는 CH 서열 및 기능에 있어서의 상대적으로 작은 차이점에 기초하여 하위부류로 추가로 분류되는데, 예를 들어 인간은 하위부류: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 발현한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 절편의 서열이 항체마다 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 특정한 항체마다 그의 특정한 항원에 대한 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성이 가변 도메인의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 대신, V 영역은 "초가변 영역"이라 불리는 극단적인 가변성의 더 짧은 영역 (각각 9-12개 아미노산 길이)으로 분리된 프레임워크 영역 (FR) (15-30개 아미노산)이라 불리는 비교적 불변성의 스트레치로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, 베타-시트 형태를 주로 채택하는 4개의 FR을 포함하고, 이들은 상기 베타-시트 구조를 연결하며 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.
본원에 사용된 경우에 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열 내에서 초가변적이고/거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 높은 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체에 정밀한 특이성을 부여하는데 특유의 역할을 수행한다고 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 이루어진 자연 발생 낙타류 항체는 경쇄의 부재 하에 기능적이고 안정하다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.
다수의 HVR 설명이 사용되고 있고 본원에 포괄된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하며, 가장 통상적으로 사용된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 대신, 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM HVR은 카바트 HVR 및 코티아 구조적 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 각각의 이러한 HVR로부터의 잔기는 하기 언급된다.
Figure pat00001
HVR은 하기와 같이 "확장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 이들 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"프레임워크 영역" (FR)은 CDR 잔기가 아닌 가변 도메인 잔기들이다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 확인되는 4개의 FR을 갖는다. CDR이 카바트에 따라 정의되는 경우, 경쇄 FR 잔기는 약 잔기 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) 및 98-107 (LCFR4)에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기에서 약 잔기 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) 및 103-113 (HCFR4)에 위치한다. CDR이 초가변 루프의 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 경쇄의 약 잔기 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) 및 97-107 (LCFR4)에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기의 약 잔기 1-25 (HCFRI), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) 및 102-113 (HCFR4)에 위치한다. 일부 경우에, CDR이 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR의 아미노산과 초가변 루프의 아미노산 둘 다를 포함하는 경우에는 FR 잔기가 그에 따라 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35를 포함하는 경우, 중쇄 FR1 잔기는 위치 1-25에 존재하고 FR2 잔기는 위치 36-49에 존재한다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 카바트에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우, 하위군은 카바트에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우, 하위군은 카바트에서와 같은 하위군 III이다.
"무손상" 항체의 한 예는 항원-결합 부위 뿐만 아니라 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 (Db); 탠덤 디아바디 (taDb); 선형 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]); 1-아암 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3 및 (scFV)4-Fc를 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 포함한다.
본원에 사용된, "절반-항체"는 1개의 이뮤노글로불린 경쇄와 회합된 1개의 이뮤노글로불린 중쇄를 지칭한다. 예시적인 절반-항체는 도 1a에 도시되어 있다. 당업자는 절반-항체가 그의 단편을 포함할 수 있고, 또한 이 예를 들어, 카멜리다에(camelidae) 기원의, 단일 가변 도메인으로 이루어진 항원 결합 도메인을 가질 수 있음을 용이하게 알 것이다.
본 발명자들은 놀랍게도 낮은 pH에서 단백질 A 칼럼 또는 다른 매트릭스로부터 용리된 절반-항체의 pH 최적화 또는 조정이 힌지-함유 폴리펩티드, 예컨대 절반-항체의 입체형태 이동을 유도한다는 것을 발견하였다. 중간 pH로의 pH 최적화 (때때로 본 개시내용 전반에 걸쳐 pH 유지 또는 중간 pH 유지로 지칭됨)는 절반-항체의 침전 또는 응집을 일으킬 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 이종다량체 단백질을 생산하는 방법은 각각 제1 또는 제2 가용화제의 존재 하에 pH 5-9의 제1 또는 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 제공하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 가용화제는 힌지-함유 폴리펩티드, 예컨대 절반-항체의 침전을 방지하거나 감소시키는 시약으로 정의된다. 적합한 가용화제는 아르기닌 및 히스티딘, 또는 그의 염 또는 유도체, 및 수크로스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 가용화제는 아르기닌 및/또는 히스티딘이다. 특정 실시양태에서, 가용화제는 중간 pH 유지 및/또는 가열에 의해 유도된 침전을 방지하거나 감소시킨다. 특정한 실시양태에서, 가용화제는 중간 pH 유지 전에 (즉 중간 pH로 조정하기 전에) 및/또는 가열 전에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 아르기닌 또는 히스티딘은 아르기닌 염 또는 히스티딘 염이다. 특정의 다른 실시양태에서, 아르기닌 또는 히스티딘은 아르기닌 유도체 또는 히스티딘 유도체이다. 침전의 감소는 원하는 어셈블리된 최종 생성물의 증가된 수율로 이어질 수 있다.
이미다졸 및 구아니딘은 일반적 단백질 제조 및 정제를 위해 단백질을 가용화시키는데 사용될 수 있다. 그러나, 놀랍게도 각각 히스티딘 또는 아르기닌을 고려하지 않은 경우에 이미다졸 및 구아니딘은 단독으로 본원에 기재된 바와 같은 어셈블리된 이종다량체 단백질, 예컨대 이중특이적 항체의 전체 수율을 개선하는데 불충분한 것으로 밝혀졌다. 특정 실시양태에서, 이미다졸 및 구아노신은 단백질을 변성시킬 수 있다.
유사하게, 세제, 예컨대 구아니딘 HCl 및 우레아는 통상적으로 응집/침전을 감소시키는데 사용되나, 일반적으로 이들은 단백질을 완전히 변성시킬 수 있다. 따라서, 특성 실시양태에서, 가용화제는 관심 단백질을 변성시키지 않고 침전을 방지하거나 감소시킨다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 가용화제는 구아니딘 HCl, 구아니딘, 이미다졸 또는 우레아가 아니다. 그리고, 특정의 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 구아니딘 HCl 또는 우레아를 포함하지 않는다. 특정의 다른 실시양태에서, 가용화제는 트윈 또는 PEG가 아니다.
또한, 안정화제는 예를 들어 힌지-함유 폴리펩티드 또는 절반-항체의 혼합 시에 또는 그 직후에 각각의 절반-항체 중간 pH 유지 동안 또는 어셈블리 동안 첨가될 수 있다. 안정화제는 어셈블리 전에, 그 동안 및/또는 그 후에 힌지-함유 폴리펩티드 또는 절반-항체의 응집을 방지하거나 감소시키기 위해 본 발명의 방법의 단계 중 하나 이상 또는 모두의 반응물에 첨가될 수 있다.
응집체는 고분자량 종으로, 절반-항체와 관련하여, 150 kDa 초과의 분자량을 갖는 고분자량 종으로 검출될 수 있다. 응집체는 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피 또는 다른 적합한 방법에 의해 검출 및 정량화된다. 특정의 다른 실시양태에서, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 검출된 응집체는 0.2 um 멸균 필터를 통과할 수 있다. 다른 한편, 침전된 단백질은 매우 큰 복합체를 형성할 수 있는 변성 단백질 또는 응집된 단백질로 구성될 수 있다. 여러 시약을 시험하였으며, 안정화제, 예를 들어 이미다졸, 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES), 시클로덱스트린, CuSO4 및 NaOAc로서 사용하기에 비효율적이거나 적합하지 않은 것을 결정하였다. 따라서, 특정 실시양태에서, 안정화제는 무기 염 또는 전이 금속을 포함하지 않는다. 적합한 안정화제는 PVP, 히스티딘 및 아르기닌을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 응집의 감소는 원하는 어셈블리된 최종 생성물의 증가된 수율로 이어질 수 있다.
PVP는 피롤리돈 기를 갖는 수용성 비하전된 중합체이다. 특정 실시양태에서, 다른 비하전된 극성 중합체, 다른 시약 또는 화합물, 특히 본원에 기재된 적합한 안정화제와 유사한 구조 및 특성을 갖는 화합물이 본 발명에 사용하기에 적합한 안정화제일 수 있다. 본원에 제공된 방법을 비롯하여 당업계에 공지된 방법에 의해 응집의 수준에 대한 화합물의 효과를 분석함으로써 적합한 안정화제를 결정하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다.
시약은 가용화제 및 안정화제 둘 다로서 특성화될 수 있다. 예를 들어, 아르기닌은 중간 pH 유지 및/또는 가열 동안 절반-항체의 침전을 감소시키기 위한 가용화제로서 뿐만 아니라 어셈블리 단계 동안 응집을 감소시키기 위한 안정화제로서 사용될 수 있다. 유사하게, 히스티딘은 중간 pH 유지 및/또는 가열 동안 침전을 감소시키기 위한 가용화제로서 뿐만 아니라 절반 항체의 응집을 감소시키기 위한 안정화제로서 사용될 수 있다. 임의의 특정한 메카니즘에 제한되지 않고, 특정 실시양태에서, 가용화제 및 안정화제는 둘 다 응집으로 이어질 수 있는 단백질 표면 상의 소수성 패치의 상호작용을 방지함으로써 작용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 가용화제 및 안정화제는 둘 다 단백질의 바람직하지 않은 상호작용을 방지하기 위해 클라트레이트를 형성함으로써 기능할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단일 쇄 절반-항체"는 VL 도메인, 임의로 CL 도메인, 테더, VH 도메인, 임의로 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 단일 쇄 폴리펩티드를 지칭하며, 여기서 상기 도메인은 서로에 대해 N-말단에서 C-말단으로의 방향으로 VL-테더-VH-힌지-CH2-CH3 또는 VL-CL-테더-VH-CH1-힌지-CH2-CH3과 같이 위치한다.
표현 "단일 도메인 항체" (sdAb) 또는 "단일 가변 도메인 (SVD) 항체"는 일반적으로 단일 가변 도메인 (VH 또는 VL)이 항원 결합을 부여할 수 있는 항체를 지칭한다. 즉, 단일 가변 도메인은 표적 항원을 인식하기 위해 또 다른 가변 도메인과의 상호작용을 필요로 하지 않는다. 단일 도메인 항체의 예는 낙타류 (라마 및 낙타) 및 연골어류 (예를 들어, 너스 상어)로부터 유래된 것 및 인간 및 마우스 항체로부터 재조합 방법으로 유래된 것을 포함한다 (문헌 [Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; Febs Lett (1994) 339:285-290]; WO00/29004; WO 02/051870).
표현 "선형 항체"는 일반적으로 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]에 기재된 항체를 지칭한다. 간략하게, 이들 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
본원에 언급된 용어 "노브-인투-홀" 또는 "KnH" 기술은 돌출부 (노브)를 하나의 폴리펩티드 내로 및 함몰부 (홀)를 다른 폴리펩티드 내로 이들이 상호작용하는 인터페이스에서 도입함으로써 시험관내에서 또는 생체내에서 함께 2개의 폴리펩티드의 쌍형성을 지시하는 기술을 지칭한다. 예를 들어, KnH는 항체의 Fc:Fc 결합 인터페이스, CL:CH1 인터페이스 또는 VH/VL 인터페이스에서 도입되었다 (예를 들어, US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431 및 문헌 [Zhu et al. (1997) Protein Science 6:781-788]). 이것은 특히 다중특이적 항체의 제조 동안 함께 2개의 상이한 중쇄의 쌍형성을 유도하는데 유용하다. 예를 들어, 그의 Fc 영역에 KnH를 갖는 다중특이적 항체는 각각의 Fc 영역에 연결된 단일 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있거나, 또는 유사하거나 상이한 경쇄 가변 도메인과 쌍형성하는 상이한 중쇄 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있다. KnH 기술은 또한 2개의 상이한 수용체 세포외 도메인이 함께 쌍형성하도록 하거나, 또는 상이한 표적 인식 서열 (예를 들어, 아피바디, 펩티바디 및 다른 Fc 융합체 포함)을 포함하는 임의의 다른 폴리펩티드 서열이 쌍형성하는데 사용될 수 있다.
항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라고 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편이 생산되는데, 이 명칭은 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. Fab 단편은 H 쇄의 가변 영역 도메인 (VH) 및 1개 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 함께 전체 L 쇄로 이루어진다. 항체의 펩신 처리는 2가 항원-결합 활성을 갖는 2개의 디술피드 연결된 Fab 단편에 대략적으로 상응하며 항원을 여전히 가교할 수 있는 큰 단일 F(ab')2 단편을 생성한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 추가된 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생산된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
Fc 단편은 디술피드에 의해 함께 결합되어 있는 H 쇄 둘 다의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정되고, 이 영역은 또한 특정 유형의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부분이다.
"Fv"는 강한 비공유 회합 상태의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 2개 도메인이 폴딩되어 6개의 초가변 루프 (H 및 L 쇄로부터 각각 3개의 루프)가 형성되는데, 이는 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 종종 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도로도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"단일-쇄 Fv" ("sFv" 또는 "scFv"로도 약칭됨)는 단일 폴리펩티드 쇄 내로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성하게 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함한다. sFv에 대해, 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Malmborg et al., J. Immunol. Methods 183:7-13, 1995]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 VH 및 VL 도메인 사이의 짧은 링커 (약 5-10개 잔기)로 sFv 단편 (상기 단락 참조)을 구축함으로써 V 도메인의 쇄내 쌍형성이 아닌 쇄간 쌍형성을 달성하여 2가 단편, 즉 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 생성하여 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디아바디는 2개 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄에 존재하는 2개의 "가교" sFv 단편으로 이루어진 이종이량체이다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
용어 "1-아암 항체" 또는 "1-아암 항체들"은 (1) CH2 도메인, CH3 도메인 또는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 펩티드 결합에 의해 연결된 가변 도메인 및 (2) 제2 CH2, CH3 또는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 항체를 지칭하고, 여기서 가변 도메인은 제2 CH2, CH3 또는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 펩티드 결합에 의해 연결되지 않는다. 한 실시양태에서, 1-아암 항체는 3개의 폴리펩티드, 즉 (1) 가변 도메인 (예를 들어, VH), CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드, (2) 가변 도메인 (예를 들어, VL) 및 CL 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드, 및 (3) CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 제3 폴리펩티드는 가변 도메인을 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 1-아암 항체는 불변 중쇄를 연결하는 디술피드 결합을 형성하는 2개의 시스테인 잔기를 함유하는 부분적인 힌지 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 1-아암 항체의 가변 도메인은 항원 결합 영역을 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 1-아암 항체의 가변 도메인은 단일 가변 도메인이고, 여기서 각각의 단일 가변 도메인은 항원 결합 영역이다.
본 발명의 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편 (단, 이는 원하는 생물학적 활성을 나타냄)이다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 영장류화 항체를 포함한다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화도 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에 없는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 임의로, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 것을 또한 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
본원에 사용된 "복합체" 또는 "복합체화된"은 펩티드 결합이 아닌 결합 및/또는 힘 (예를 들어, 반 데르 발스, 소수성, 친수성 힘)을 통해 서로 상호작용하는 2개 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 한 실시양태에서, 복합체는 이종다량체이다. 본원에 사용된 용어 "단백질 복합체" 또는 "폴리펩티드 복합체"는 단백질 복합체 내의 단백질에 접합된 비-단백질 개체 (예를 들어, 화학 분자, 예컨대 독소 또는 검출 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 갖는 복합체를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
본원에 사용된 용어 "이종다량체" 또는 "이종다량체성"은 비-펩티드성, 공유 결합 (예를 들어, 디술피드 결합) 및/또는 비-공유 상호작용 (예를 들어, 수소 결합, 이온성 결합, 반 데르 발스 힘 및 소수성 상호작용)에 의해 서로 상호작용하는 2개 이상의 폴리펩티드를 설명하며, 여기서 적어도 2개의 분자는 서로 상이한 서열을 갖는다.
본원에 사용된 "이종다량체화 도메인"은 이종다량체 형성의 촉진 및 동종다량체 형성의 방해를 위한, 생물학적 분자에 대한 변경 또는 부가를 지칭한다. 동종이량체보다 이종이량체를 형성하는 것이 강하게 우세한 임의의 이종이량체화 도메인은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예시적인 예는, 예를 들어 미국 특허 출원 20030078385 (Arathoon et al. - 제넨테크; 노브 인투 홀 기재); WO2007147901 (Kjærgaard et al. - 노보 노르디스크(Novo Nordisk): 이온성 상호작용 기재); WO 2009089004 (Kannan et al. - 암젠(Amgen): 정전기적 스티어링 효과 기재); WO 2010/034605 (Christensen et al. - 제넨테크; 코일드 코일 기재)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 예를 들어 류신 지퍼를 기재하는 문헌 [Pack, P. & Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992)] 또는 헬릭스-턴-헬릭스 모티프를 기재하는 문헌 [Pack et al., Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993)]을 참조한다. 어구 "이종다량체화 도메인" 및 "이종이량체화 도메인"은 본원에서 교환가능하게 사용된다. 특정 실시양태에서, 힌지-함유 폴리펩티드는 하나 이상의 이종이량체화 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "이뮤노어드헤신"은 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합한 분자를 나타낸다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 아미노산 서열이 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 서열인 (즉, 항체의 불변 영역에 비해 "이종성"인) 목적하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열 (예를 들어, IgG의 CH2 및/또는 CH3 서열)의 융합체를 포함한다. 예시적인 어드헤신 서열은 관심 단백질에 결합하는 수용체 또는 리간드의 일부를 포함하는 인접 아미노산 서열을 포함한다. 어드헤신 서열은 또한 관심 단백질에 결합하는 서열일 수 있지만, 수용체 또는 리간드 서열이 아니다 (예를 들어, 펩티바디 내의 어드헤신 서열). 상기 폴리펩티드 서열은 파지 디스플레이 기술 및 고처리량 분류 방법을 포함하는 다양한 방법에 의해 선택 또는 확인될 수 있다. 이뮤노어드헤신 내의 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 얻을 수 있다.
관심 항원에 "결합하는" 본 발명의 항체는, 항체가 항원을 발현하는 세포 또는 조직의 표적화시에 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 항원에 결합하되 다른 단백질과는 유의하게 교차반응하지 않는 항체이다. 이러한 실시양태에서, "비-표적" 단백질에 대한 항체의 결합 정도는, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전법 (RIA) 또는 ELISA에 의해 측정시 특정한 표적 단백질에 대한 항체 결합의 약 10％ 미만일 것이다. 표적 분자에 대한 항체의 결합에 대해, 용어 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인"은 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다 (예를 들어, 비-특이적 상호작용은 소 혈청 알부민 또는 카세인에 대한 결합일 수 있음). 특이적 결합은, 예를 들어 분자의 결합을 대조군 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 비-표지된 표적과의 경쟁에 의해 측정할 수 있다. 이 경우에, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면 특이적 결합이다. 본원에 사용된 용어 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인"은, 예를 들어 표적에 대해 적어도 약 200 nM, 대안적으로 적어도 약 150 nM, 대안적으로 적어도 약 100 nM, 대안적으로 적어도 약 60 nM, 대안적으로 적어도 약 50 nM, 대안적으로 적어도 약 40 nM, 대안적으로 적어도 약 30 nM, 대안적으로 적어도 약 20 nM, 대안적으로 적어도 약 10 nM, 대안적으로 적어도 약 8 nM, 대안적으로 적어도 약 6 nM, 대안적으로 적어도 약 4 nM, 대안적으로 적어도 약 2 nM, 대안적으로 적어도 약 1 nM 또는 그 초과의 Kd를 갖는 분자로 나타날 수 있다. 한 실시양태에서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하고 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는 것을 나타낸다.
"결합 친화도"는 일반적으로, 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 전체 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 예를 들어, Kd는 약 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM 일 수 있거나, 또는 이보다 강할 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 항원에 서서히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 신속하게 결합하고 보다 길게 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 목적상, 이들 중 임의의 방법이 이용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 25℃에서 비아코어™-2000 또는 비아코어™-3000 (비아코어, 인크(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이) 및 고정된 항원 CM5 칩 (~ 10 반응 단위 (RU))을 사용한 표면 플라즈몬 공명 검정을 이용하여 측정한다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후, 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주입한다. 항원 주사 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1M 에탄올아민을 주입한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (예를 들어, 0.78 nM → 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS (PBST) 내에서 주입한다. 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는 회합 및 해리 센서그램을 동시에 적합시켜 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M-1 S-1을 초과하면, 분광계, 예컨대 정지 유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 적색 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(Aminco) 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정된 바와 같이, 온-레이트는 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 대역투과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 "온-레이트", "회합의 비율" 또는 "회합률" 또는 "kon"은 25℃에서 비아코어™-2000 또는 비아코어™-3000 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이) 및 고정된 항원 CM5 칩 (~ 10 반응 단위 (RU))을 사용하여 상기 동일한 표면 플라즈몬 공명 기술에 의해 측정할 수 있다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후, 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주입한다. 항원 주사 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1M 에탄올아민을 주입한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (예를 들어, 0.78 nM → 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS (PBST) 내에서 주입한다. 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)은 회합 및 해리 센서그램을 동시에 적합시켜 단순 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 그러나, 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M-1 S-1을 초과하면, 온-레이트는 바람직하게는 분광계, 예를 들어 정지 유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코 분광광도계 (써모스펙트로닉)에서 측정된 바와 같이 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역투과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 예컨대 항체, 그의 단편 또는 유도체와 관련하여 "생물학적 활성인" 및 "생물학적 활성" 및 "생물학적 특성"은 달리 명시된 경우를 제외하고 생물학적 분자에 결합하는 능력을 갖는다는 것을 의미한다.
"펩티바디" 또는 "펩티바디들"은 무작위로 생성된 펩티드 및 Fc 도메인의 융합체를 지칭한다. 2003년 12월 9일에 허여된 미국 특허 번호 6,660,843 (Feige et al.) (그의 전체내용이 참조로 포함됨)을 참조한다. 이는 N-말단, C-말단, 아미노산 측쇄, 또는 1개 초과의 이들 부위에 연결된 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 펩티바디 기술을 이용함으로써 하나 이상의 리간드 또는 수용체, 종양-귀소 펩티드, 막 수송 펩티드 등을 표적화하는 펩티드를 포함하는 치료제를 설계할 수 있다. 펩티바디 기술은 선형 및 디술피드-제한된 펩티드, "탠덤 펩티드 다량체" (즉, Fc 도메인의 단일 쇄 상의 하나 초과의 펩티드)를 포함하는 다수의 상기 분자의 설계에 유용한 것으로 입증되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,660,843; 2003년 10월 16일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2003/0195156 (2002년 11월 21일에 공개된 WO 02/092620에 대응함); 2003년 9월 18일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2003/0176352 (2003년 4월 17일에 공개된 WO 03/031589에 대응함); 1999년 10월 22일에 출원된 미국 일련 번호 09/422,838 (2000년 5월 4일에 공개된 WO 00/24770에 대응함); 2003년 12월 11일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2003/0229023; 2003년 7월 17일에 공개된 WO 03/057134; 2003년 12월 25일에 공개된 미국 특허 출원 번호 2003/0236193 (2004년 4월 8일에 출원된 PCT/US04/010989에 대응함); 2003년 9월 18일에 출원된 미국 일련 번호 10/666,480 (2004년 4월 1일에 공개된 WO 04/026329에 대응함) (이들 각각은 그 전체내용이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
"아피바디들" 또는 "아피바디"는 Fc 영역에 펩티드 결합에 의해 연결된 단백질의 사용을 지칭하고, 여기서 단백질은 표적 분자에 대한 결합 표면을 제공하는 스캐폴드로서 사용된다. 단백질은 종종 자연 발생 단백질, 예를 들어 스타필로코쿠스 단백질 A 또는 IgG-결합 B 도메인, 또는 그로부터 유래된 Z 단백질 (문헌 [Nilsson et al. (1987), Prot Eng 1, 107-133], 및 미국 특허 번호 5,143,844 참조) 또는 그의 단편 또는 유도체이다. 예를 들어, 아피바디는 표적 분자(들)에 대한 변경된 결합 친화도를 갖는 Z 단백질 변이체로부터 생성될 수 있고, Z 단백질의 절편은 표적 분자에 결합할 수 있는 변이체의 라이브러리를 생성하기 위해 무작위 돌연변이 유발에 의해 돌연변이된다. 아피바디의 예는 미국 특허 번호 6,534,628, 문헌 [Nord K et al., Prot Eng 8:601-608 (1995) 및 Nord K et al., Nat Biotech 15:772-777 (1997). Biotechnol Appl Biochem. 2008 Jun;50(Pt 2):97-112]을 포함한다.
"단리된" 이종다량체 또는 복합체는 그의 천연 세포 배양 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 이종다량체 또는 복합체를 의미한다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 이종다량체의 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이종다량체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시에 단백질의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 수준까지, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다.
본 발명의 이종다량체는 일반적으로 실질적 균질성으로 정제된다. 어구 "실질적으로 균질한", "실질적으로 균질한 형태" 및 "실질적 균질성"은 생성물에 목적하지 않는 폴리펩티드 조합으로부터 유래하는 부산물 (예를 들어, 동종다량체)이 실질적으로 결여됨을 나타내기 위해 사용된다.
순도와 관련하여 표현된 실질적 균질성은 부산물의 양이 10 중량%, 9 중량%, 8 중량%, 7 중량%, 6 중량%, 4 중량%, 3 중량%, 2 중량% 또는 1 중량%을 초과하지 않거나, 1 중량% 미만인 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 부산물은 5% 미만이다.
"생물학적 분자"는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 및 그의 조합을 지칭한다. 한 실시양태에서, 생물학적 분자는 자연에 존재한다.
본원에 개시된 다양한 항체를 기재하는 데 사용되는 경우 "단리된"은 항체를 발현하는 세포 또는 세포 배양물로부터 확인 및 분리되고/되거나 회수된 항체를 의미한다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 전형적으로 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질해질 때까지 정제될 것이다. 폴리펩티드 자연 환경의 적어도 한 성분도 존재하지 않을 것이므로, 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에 사용된 "연결된" 또는 "연결"은 제1 및 제2 아미노산 서열 사이의 직접적인 펩티드 결합 연결, 또는 제1 및 제2 아미노산 서열에 및 이들 사이에 결합된 펩티드인 제3 아미노산 서열을 포함하는 연결을 의미한다. 예를 들어, 링커 펩티드가 1개의 아미노산 서열의 C-말단 말단부 및 다른 아미노산 서열의 N-말단 말단부에 결합된다.
본원에 사용된 "링커"는 길이가 2개 이상의 아미노산인 아미노산 서열을 의미한다. 링커는 중성 극성 또는 비극성 아미노산으로 구성될 수 있다. 링커는 예를 들어 2 내지 100개 아미노산 길이, 예컨대 2 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들어 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다. 링커는 예를 들어 자가-절단, 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 "절단가능"할 수 있다. 아미노산 서열 내의 절단 부위 및 이러한 부위에서 절단하는 효소 및 화학물질은 당업계에 공지되어 있고, 또한 본원에 기재된다.
본원에 사용된 "테더"는 2개의 다른 아미노산 서열을 연결하는 아미노산 링커를 의미한다. 본원에 사용된 테더는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인의 N-말단을 이뮤노글로불린 경쇄 불변 도메인의 C-말단과 연결할 수 있다. 특정 실시양태에서, 테더는 약 15 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들어 20 내지 26개 아미노산 길이 (예를 들어, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개 아미노산 길이)이다. 테더는 예를 들어 당업계의 표준 방법 및 시약을 사용하여 자가-절단, 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 "절단가능"할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 테더는 Gly-Gly-Ser 반복부를 포함한다.
"링커" 또는 "테더"의 효소적 절단은 엔도펩티다제, 예를 들어 Lys-C, Asp-N, Arg-C, V8, Glu-C, 키모트립신, 트립신, 펩신, 파파인, 트롬빈, 게네나제, 인자 Xa, TEV (담배 식각 바이러스 시스테인 프로테아제), 엔테로키나제, HRV C3 (인간 리노바이러스 C3 프로테아제), 키니노게나제, 뿐만 아니라 서브틸리신-유사 전구단백질 컨버타제 (예를 들어, 푸린 (PC1), PC2 또는 PC3) 또는 N-아르기닌 이염기성 컨버타제의 사용을 수반할 수 있다. 화학적 절단은 예를 들어 히드록실아민, N-클로로숙신이미드, N-브로모숙신이미드 또는 브로민화시아노겐의 사용을 수반할 수 있다.
본원에 사용된 "Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위"는 Lys-C 엔도펩티다제에 의해 C-말단 측에서 절단될 수 있는 아미노산 서열의 리신 잔기이다. Lys-C 엔도펩티다제는 리신 잔기의 C-말단 측에서 절단된다. 특정 실시양태에서, 절반-항체는 Lys-C 엔도펩티다제에 의한 테더의 절단시에 절반-항체 또는 어셈블리된 이중특이적 항체의 구조를 보존하기 위해 내인성 Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 제거하기 위한 힌지 영역 내의 K222A 돌연변이를 추가로 포함한다.
"힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG1의 Glu216으로부터 Pro230으로 확장된 것으로 정의된다 (문헌 [Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)]). 다른 IgG 이소형의 힌지 영역은 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫번째 및 마지막 시스테인 잔기를 IgG1 서열과 동일한 위치에 배치하여 정렬될 수 있다.
Fc 영역의 "보다 낮은 힌지 영역"은 통상적으로 힌지 영역에 바로 C-말단인 잔기의 스트레치, 즉 Fc 영역의 잔기 233 내지 239로서 정의된다. 본 발명 이전에, FcγR 결합은 일반적으로 IgG Fc 영역의 하부 힌지 영역에서 아미노산 잔기에 의한 것이었다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 통상적으로 IgG의 약 잔기 231로부터 약 340까지 이어진다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 근접하게 쌍형성하지 않는다는 점에서 특징적이다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 배치된다. 탄수화물이 도메인-도메인 쌍형성에 대한 대안을 제공하고 CH2 도메인의 안정화를 도울 수 있는 것으로 추정되었다. 문헌 [Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)].
"CH3 도메인"은 Fc 영역 내의 CH2 도메인에 대해 C-말단인 잔기의 스트레치 (즉, IgG의 약 아미노산 잔기 341에서 약 아미노산 잔기 447까지)를 포함한다.
용어 "Fc 영역"은 본원에서 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는, 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 그의 카르복실-말단까지의 범위로 경계지어진다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 조작으로 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않는 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 갖는다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절 등을 포함한다. 상기 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 결합할 것을 필요로 하고, 예를 들어 본원의 정의에서 개시된 바와 같은 다양한 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 그의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 1개의 아미노산 변형, 바람직하게는 1개 이상의 아미노산 치환(들)을 통해 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 1개 이상의 아미노산 치환을 갖고, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 약 80% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 보유할 것이다.
본원에서 사용된 "Fc 복합체"는 함께 상호작용하는 Fc 영역의 2개의 CH2 도메인 및/또는 함께 상호작용하는 Fc 영역의 2개의 CH3 도메인을 지칭하고, 여기서 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인은 펩티드 결합이 아닌 결합 및/또는 힘 (예를 들어, 반 데르 발스, 소수성, 친수성 힘)을 통해 상호작용한다.
본원에 사용된 "Fc 성분"은 Fc 영역의 힌지 영역, CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 지칭한다.
본원에 사용된 "Fc CH 성분" 또는 "FcCH"는 Fc 영역의 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예컨대, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본 발명에서, "환원 조건"은 반응물의 산화환원 전위가 음의 값 (-)임을 의미하도록 반응물 (예를 들어, 어셈블리 혼합물)에서의 산화환원 전위에 기초하여 정의된다. 환원 조건 하에 반응의 산화환원 전위는 바람직하게는 약 -50 내지 -600 mV, -100 내지 -600 mV, -200 내지 -600 mV, -100 내지 -500 mV, -150 내지 -300 mV, 보다 바람직하게는 약 -300 내지 -500 mV, 가장 바람직하게는 약 -400 mV이다.
원하는 환원 조건을 제조하기 위한 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 원하는 환원 조건은 반응물 (예컨대, 본 발명의 어셈블리 혼합물)에 환원제/환원 작용제를 첨가하여 제조될 수 있다. 적합한 환원제는 디티오트레이톨 (DTT), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 티오글리콜산, 아스코르브산, 티올 아세트산, 글루타티온 (GSH), 베타-메르캅토에틸아민, 시스테인/시스틴, GSH/글루타티온 디술피드 (GSSG), 시스테아민/시스타민, 글리실시스테인, 및 베타-메르캅토에탄올, 바람직하게는 GSH를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정한 실시양태에서, 환원제는 GSH, 베타-메르캅토에틸아민, 시스테인/시스틴, GSH/GSSG, 시스테아민/시스타민, 글리실시스테인, 및 베타-메르캅토에탄올, 바람직하게는 GSH를 포함하나 이에 제한되지는 않는 약한 환원제이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 환원제는 GSH이다. 반응물에서 원하는 환원 조건을 달성하기에 적합한 농도에서 및 이에 적합한 실험 조건 하에 적합한 환원제를 선택하는 것을 당업자의 능력 범위 내에 있다. 예를 들어, 20℃에서 10g/L의 이중특이적 항체 단백질 농도를 갖는 용액 중 10 mM L-환원된 글루타티온은 약 -400 mV의 출발 산화환원 전위를 발생시킬 것이다. 당업자는 주어진 반응에서 산화환원 전위를 측정하기 위한 임의의 적합한 방법을 이용할 수 있다.
반응의 환원 조건은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 추정 및 측정된다. 예를 들어, 환원 조건은 레자주린 인디케이터 (환원 조건에서 청색에서 무색으로 색이 변함)를 이용하여 측정될 수 있다. 보다 정확한 측정을 위해, 산화환원-전위 측정기 (예컨대, 브로들리 제임스(BROADLEY JAMES)®에 의해 만들어진 ORP 전극)가 이용될 수 있다.
대안적으로, 환원 조건은 약 10 mmHg 이하, 바람직하게는 약 5 mmHg 이하, 보다 바람직하게는 약 3 mmHg 이하의 감압에서, 약 1 내지 60분, 바람직하게는 약 5 내지 40분 동안 용존 기체, 특히 용존 산소를 제거함으로써 제조될 수 있다.
본 발명에서, 환원 조건은 어셈블리 단계에 걸쳐 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드 (예컨대, 절반-항체)를 혼합한 직후로부터 유지되는 것이 바람직하다. 특정 실시양태에서, 반응 또는 어셈블리 혼합물은 바람직하게는 반응 시간의 약 50% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 90% 이상 동안 환원 조건에서 유지된다. 반응 매질의 산화환원-전위는 약 -200 내지 -600 mV, 보다 바람직하게는 -300 내지 -500 mV, 가장 바람직하게는 약 -400 mV로 반응 시간의 약 50% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 90% 이상 동안 유지되는 것이 특히 바람직하다.
특정한 실시양태에서, 환원 조건은 약한 환원 조건이다. 본원에 사용된 용어 "약한 환원제" 또는 "약한 환원 조건"은 25℃에서 음의 산화 전위를 갖는 환원제 또는 이러한 환원제에 의해 제조된 환원 조건을 지칭한다. 환원제의 산화 전위는 바람직하게는 pH가 7 내지 9이고, 온도가 15℃ 내지 39℃인 경우에 -50 내지 -600 mV, -100 내지 -600 mV, -200 내지 -600 mV, -100 내지 -500 mV, -150 내지 -300 mV, 보다 바람직하게는 약 -300 내지 -500 mV, 가장 바람직하게는 약 -400 mV이다. 당업자는 원하는 환원 조건을 제조하기 위한 적합한 환원제를 선택할 수 있을 것이다. 숙련된 연구원은 강한 환원제, 즉 동일한 농도, pH 및 온도에서 상기 언급된 환원제보다 더 큰 음의 값의 산화 전위를 갖는 것을 보다 낮은 농도에서 사용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 단백질은 상기 언급된 조건 하에 인큐베이션하는 경우에 환원제의 존재 하에 디술피드 결합을 형성할 수 있을 것이다. 약한 환원제의 예는 글루타티온, 베타-메르캅토에틸아민, 시스틴/시스테인, GSH/GSSG, 시스테아민/시스타민, 글리실시스테인 및 베타-메르캅토에탄올을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 200X 몰비의 GSH:항체와 유사한 산화 전위가 다른 환원제를 사용한 효율적인 어셈블리가 예상될 수 있는 약한 환원 조건에 대한 참조 지점으로 이용될 수 있다.
"어셈블리 혼합물"은 제1 힌지-함유 폴리펩티드, 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 용액이다. 특정 실시양태에서, 어셈블리 혼합물은 환원 조건에 존재한다. 일부 실시양태에서, 어셈블리 혼합물은 약한 환원 조건에 존재한다. 특정의 다른 실시양태에서, 어셈블리 혼합물은 약한 환원제를 추가로 포함한다. 어셈블리 혼합물의 산화 전위는 pH가 7 내지 9이고, 온도가 15℃ 내지 39℃인 경우에 -50 내지 -600 mV, -100 내지 -600 mV, -200 내지 -600 mV, -100 내지 -500 mV, -150 내지 -300 mV, 보다 바람직하게는 약 -300 내지 -500 mV, 가장 바람직하게는 약 -400 mV이다.
달리 나타내지 않는 한, 본 실시예에 언급된 상업적으로 입수가능한 시약은 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. ATCC 등록 번호에 의해, 하기 실시예 및 명세서 전반에 걸쳐 확인되는 세포의 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, 버지니아주 마나사스)이다. 달리 나타내지 않는 한, 본 발명은 본원의 상기 및 하기 문헌에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 기술의 표준 절차를 이용한다: 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc., NY, 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991].
본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급한 정수 또는 정수 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수 군을 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
II. 이종다량체 단백질의 구축
전형적으로, 본원에 기재된 이종다량체 단백질은 항체 Fc 영역의 중요한 부분을 포함할 것이다. 그러나, 다른 측면에서, 중쇄는 오직 CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인의 일부를 포함한다.
이종다량체화 도메인
이종다량체 단백질은 이종다량체화 도메인을 포함한다. 이종이량체 분자의 실질적으로 균질한 집단을 생성하기 위해, 이종이량체화 도메인은 동종이량체보다 이종이량체를 형성하는 것이 강하게 우세해야 한다. 본원에 예시된 이종다량체 단백질은 이종다량체화를 용이하게 하기 위해 노브 인투 홀 기술을 이용하지만, 당업자는 본 발명에 유용한 다른 이종다량체화 도메인을 인식할 것이다.
노브 인투 홀
다중특이적 항체를 생산하는 방법으로서의 노브 인투 홀의 이용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 1998년 3월 24일에 승인된 미국 특허 번호 5,731,168 (제넨테크에게 양도됨), 2009년 7월 16일에 공개된 PCT 공개 번호 WO2009089004 (암젠에게 양도됨) 및 2009년 7월 16일에 공개된 미국 특허 공개 번호 20090182127 (노보 노르디스크 A/S에게 양도됨)을 참조한다. 또한, 문헌 [Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26(6):649-658 및 Kontermann (2005) Acta Pharacol. Sin., 26:1-9]을 참조한다. 간략한 논의가 본원에 제공된다.
"돌출부"는, 제1 폴리펩티드의 인터페이스로부터 돌출하여 이종다량체를 안정화하도록 인접한 인터페이스 (즉, 제2 폴리펩티드의 인터페이스)에 있는 상보적 함몰부에 위치가능하고 따라서 예를 들어 동종다량체 형성에 비해 이종다량체 형성이 유리한, 1개 이상의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 돌출부는 본래 인터페이스에 존재할 수 있거나, 또는 합성적으로 (즉, 인터페이스를 코딩하는 핵산을 변경하여) 도입될 수 있다. 통상적으로, 제1 폴리펩티드의 인터페이스를 코딩하는 핵산을 돌출부를 코딩하도록 변경한다. 이를 달성하기 위해, 제1 폴리펩티드의 인터페이스에 있는 1개 이상의 "본래" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산을, 본래 아미노산 잔기보다 큰 측쇄 부피를 갖는 1개 이상의 "유입" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산으로 대체한다. 1개 초과의 본래 및 상응하는 유입 잔기가 있을 수 있다. 대체되는 본래 잔기의 수에 대한 상한은 제1 폴리펩티드의 인터페이스에 있는 총 잔기의 수이다. 다양한 아미노산 잔기의 측쇄 부피가 하기 표에 나타나 있다.
[표 1]
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돌출부를 형성하기 위한 바람직한 유입 잔기는 일반적으로 자연 발생 아미노산 잔기이며, 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W)으로부터 선택된다. 가장 바람직한 잔기는 트립토판 및 티로신이다. 한 실시양태에서, 돌출부를 형성하기 위한 본래 잔기는 작은 측쇄 부피를 갖는다 (예컨대, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌 또는 발린). 돌출부를 형성하기 위한 CH3 도메인의 예시적인 아미노산 치환은 T366W 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"함몰부"는 제2 폴리펩티드의 인터페이스로부터 후퇴되어 제1 폴리펩티드의 인접한 인터페이스에 있는 상응하는 돌출부를 수용하는 1개 이상의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 함몰부는 본래 인터페이스에 존재할 수 있거나, 또는 합성적으로 (예를 들어, 인터페이스를 코딩하는 핵산을 변경하여) 도입될 수 있다. 통상적으로, 제2 폴리펩티드의 인터페이스를 코딩하는 핵산을 함몰부를 코딩하도록 변경한다. 이를 달성하기 위해, 제2 폴리펩티드의 인터페이스에 있는 1개 이상의 "본래" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산을, 본래 아미노산 잔기보다 작은 측쇄 부피를 갖는 1개 이상의 "유입" 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA로 대체한다. 1개 초과의 본래 및 상응하는 유입 잔기가 있을 수 있다. 대체되는 본래 잔기의 수에 대한 상한은 제2 폴리펩티드의 인터페이스에 있는 총 잔기의 수이다. 다양한 아미노산의 측쇄 부피가 상기 표 1에 제시되어 있다. 함몰부를 형성하기 위한 바람직한 유입 잔기는 통상적인 자연 발생 아미노산 잔기이며, 바람직하게는 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T) 및 발린 (V)으로부터 선택된다. 가장 바람직한 잔기는 세린, 알라닌 또는 트레오닌이다. 한 실시양태에서, 함몰부를 형성하기 위한 본래 잔기는 큰 측쇄 부피를 갖는다 (예컨대, 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌 또는 트립토판). 함몰부를 생성하기 위한 CH3 도메인의 예시적인 아미노산 치환은 T366S, L368A, Y407A, Y407T 및 Y407V 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 노브 절반-항체는 T366W 치환을 포함하고, 홀 절반-항체는 T366S/L368A/Y407V 치환을 포함한다.
"본래" 아미노산 잔기는 본래 잔기보다 작거나 큰 측쇄 부피를 가질 수 있는 "유입" 잔기에 의해 대체되는 것이다. 유입 아미노산 잔기는 자연 발생 또는 비-자연 발생의 아미노산 잔기일 수 있으나, 바람직하게는 자연 발생 아미노산 잔기이다. "자연 발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩되고 상기 표 1에 열거된 잔기이다. "비-자연 발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩되지 않으나 폴리펩티드 쇄 내에서 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유적으로 결합할 수 있는 잔기를 지칭한다. 비-자연 발생 아미노산 잔기의 예는, 예를 들어 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 문헌 [Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]에 기재된 것과 같은 기타 아미노산 잔기 유사체이다. 이러한 비-자연 발생 아미노산 잔기를 생성하기 위해, 문헌 [Noren et al. Science 244: 182 (1989)] 및 [Ellman et al., 상기 문헌]의 절차가 이용될 수 있다. 간략하게, 이는 비-자연 발생 아미노산 잔기를 사용한 억제제 tRNA의 화학적 활성화, 후속의 시험관 내 전사 및 RNA의 번역을 포함한다. 본 발명의 방법은 1개 이상의 본래 아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함하지만, 1개 초과의 본래 잔기가 대체될 수도 있다. 통상적으로, 제1 또는 제2 폴리펩티드의 인터페이스에 있는 총 잔기 개수를 넘지 않는 잔기가 대체된 본래 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 전형적으로, 대체를 위한 본래 잔기는 "매립된다". "매립된"은 잔기가 본질적으로 용매에 접근가능하지 않다는 것을 의미한다. 일반적으로, 유입 잔기는 가능한 산화를 방지하거나 디술피드 결합의 잘못된 쌍형성을 방지하기 위해, 시스테인이 아니다.
돌출부는 함몰부에 "위치가능"하며, 이는, 각각 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 인터페이스에 있는 돌출부 및 함몰부의 공간적 배치 및 돌출부 및 함몰부의 크기가, 돌출부가 인터페이스에서 제1 및 제2 폴리펩티드의 정상적 회합을 유의하게 방해하지 않으면서 함몰부에 위치될 수 있도록 한다는 것을 의미한다. 돌출부, 예컨대 Tyr, Phe 및 Trp는 전형적으로 인터페이스의 축으로부터 수직으로 연장되지 않고 바람직한 입체형태를 갖기 때문에, 돌출부의 상응하는 함몰부와의 정렬은 X선 결정학 또는 핵 자기공명 (NMR)에 의해 수득되는 구조와 같은 3차원 구조에 기초된 돌출부/함몰부 쌍을 모델링하는 것에 의존한다. 이는 당업계에 널리 수용되는 기술을 이용하여 달성될 수 있다.
"본래 또는 주형 핵산"은 돌출부 또는 함몰부를 코딩하기 위해 "변경" (즉, 유전자 조작 또는 돌연변이)될 수 있는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 의미한다. 본래 또는 출발 핵산은 자연 발생 핵산일 수 있거나, 앞서 변경된 핵산을 포함할 수 있다 (예를 들어, 인간화 항체 단편). 핵산의 "변경"은 본래 핵산이 관심 아미노산 잔기를 코딩하는 하나 이상의 코돈을 삽입, 결실 또는 대체에 의해 돌연변이시키는 것을 의미한다. 일반적으로, 본래 잔기를 코딩하는 코돈은 유입 잔기를 코딩하는 코돈으로 대체된다. DNA를 이러한 방식으로 유전자 변형하는 기술이 문헌 [Mutagenesis: a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991)]에서 검토되었으며, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발 및 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 돌연변이유발을 포함한다. 본래/주형 핵산을 돌연변이시킴으로써, 본래/주형 핵산에 의해 코딩되는 본래/주형 폴리펩티드가 상응하게 변경된다.
돌출부 또는 함몰부는 합성적 수단, 예를 들어 재조합 기술, 시험관내 펩티드 합성, 앞서 기재된 비-자연 발생 아미노산 잔기의 도입을 위한 기술, 펩티드의 효소적 또는 화학적 커플링 또는 이들 기술의 일부 조합에 의해 제1 또는 제2 폴리펩티드의 인터페이스로 "도입"될 수 있다. 따라서, "도입되는" 돌출부 또는 함몰부는 "비-자연 발생" 또는 "비-천연"의 것이며, 이는 자연에 또는 본래 폴리펩티드에 존재하지 않는다는 것을 의미한다 (예컨대, 인간화 모노클로날 항체).
일반적으로, 돌출부를 형성하기 위한 유입 아미노산 잔기는 상대적으로 적은 수 (예를 들어, 약 3-6개)의 "회전이성질체"를 갖는다. "회전이성질체"는 아미노산 측쇄의 에너지적으로 유리한 입체형태이다. 다양한 아미노산 잔기의 회전이성질체의 수가 문헌 [Ponders and Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987)]에 검토되어 있다.
III. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 이종다량체 단백질 (예를 들어, 이중특이적 항체)의 재조합 생산을 위해, 이를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 (DNA 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터에 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차를 이용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리 및 서열분석된다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터의 선택은 부분적으로는 사용되는 숙주 세포에 따라 달라진다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 (일반적으로 포유동물, 그러나 또한 진균 (예를 들어, 효모), 곤충, 식물, 및 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포) 기원의 것이다. IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 포함하여 임의의 이소형 불변 영역이 이러한 목적에 사용될 수 있으며, 이러한 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음을 인지할 것이다. 특정 실시양태에서, 불변 영역은 IgG, 특히 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터의 것이다.
숙주 세포는 이종이량체화 도메인을 포함하는 힌지-함유 폴리펩티드를 발현하도록 조작되며, 여기서 숙주 세포는 제2 이종이량체화 도메인을 포함하는 힌지-함유 폴리펩티드를 발현하지 않는다.
a. 원핵 숙주 세포를 사용하는 이종다량체 단백질의 생성
i. 벡터 구축
본 발명의 이종다량체 단백질 (예를 들어, 항체)의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 예컨대 항체 생산 세포, 예컨대 하이브리도마 세포로부터 단리되어 서열분석될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 일단 수득된 후에, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 원핵 숙주에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제 및 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입된다. 입수가능하고 당업계에 공지된 다수의 벡터를 본 발명의 목적에 사용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정한 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 다) 및 벡터가 존재하게 되는 특정한 숙주 세포와의 상용성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 상기 숙주에 대하여 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 부위, 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열을 포함한다. 예를 들어, 이. 콜라이는 전형적으로 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환시킨다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라시클린 (Tet) 내성을 코딩하는 유전자를 함유하고, 따라서 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 그의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지 또한 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유할 수 있거나, 또는 상기 프로모터를 함유하도록 변형될 수 있다. 특정한 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 미국 특허 번호 5,648,237 (Carter et al.)에 상세하게 기재되어 있다.
또한, 숙주 미생물과 상용성인 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파지 벡터를 상기 숙주에 대한 형질전환 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지, 예컨대 λGEM.TM.-11이 이. 콜라이 LE392와 같은 감수성 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있는 재조합 벡터의 제조에 활용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 2종 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 시스트론의 발현을 조정하는, 시스트론의 상류 (5')에 위치하는 비번역 조절 서열이다. 원핵 프로모터는 전형적으로 2종의 부류의 프로모터, 즉 유도성 및 구성적 프로모터로 분류된다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어 영양소의 존재 또는 부재, 또는 온도의 변화에 반응하여 그의 제어 하에 시스트론의 증가된 수준의 전사를 개시시키는 프로모터이다.
다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 공지되어 있다. 선택된 프로모터는, 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터 내로 삽입함으로써, 예를 들어 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 다수의 이종 프로모터를 둘 다 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종 프로모터는 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터에 비해 발현된 표적 유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 가능하게 하기 때문에 이것이 이용된다.
원핵 숙주와 함께 사용하기 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 박테리아에서 기능적인 다른 프로모터 (예컨대, 다른 공지된 박테리아 또는 파지 프로모터)도 적합하다. 이들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있고, 따라서 당업자는 임의의 요구되는 제한 부위를 공급하기 위한 링커 또는 어답터를 사용하여 이들 서열을 이종다량체 단백질의 유전자, 예를 들어 표적 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 시스트론에 작동가능하게 라이게이션시킬 수 있다 (문헌 [Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269]).
본 발명의 한 측면에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 발현된 폴리펩티드의 막을 가로지른 전위를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내에 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택되는 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종 폴리펩티드에 천연인 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우에, 신호 서열이, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 발현 시스템의 시스트론 둘 다에 사용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 그의 변이체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 이뮤노글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있으며, 따라서 각 시스트론 내의 분비 신호 서열의 존재를 요구하지 않는다. 이와 관련하여, 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄가 발현되고, 폴딩되고, 어셈블리되어, 세포질 내에서 기능적 이뮤노글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 이. 콜라이 trxB - 균주)는 디술피드 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공함으로써, 발현된 단백질 서브유닛의 적절한 폴딩 및 어셈블리를 허용한다. 문헌 [Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995)]을 참조한다.
본 발명의 이종다량체 단백질 (예를 들어, 항체)의 발현에 적합한 원핵 숙주 세포는 아르카에박테리아 및 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함한다. 유용한 박테리아의 예는 에스케리키아(Escherichia) (예를 들어, 이. 콜라이), 바실루스 (예를 들어, 비. 서브틸리스(B. subtilis)), 엔테로박테리아, 슈도모나스(Pseudomonas) 종 (예를 들어, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 시겔라(Shigella), 리조비움, 비트레오실라(Vitreoscilla) 또는 파라코쿠스(Paracoccus)를 포함한다. 한 실시양태에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 한 실시양태에서, 이. 콜라이 세포가 본 발명에서 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예는 유전자형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kan R 을 갖는 균주 33D3 (미국 특허 번호 5,639,635)을 비롯한, 균주 W3110 (문헌 [Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 기탁 번호 27,325) 및 그의 유도체를 포함한다. 다른 균주 및 그의 유도체, 예컨대 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이λ 1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 한 실시양태에서, 이. 콜라이 Δlpp가 특정한 용도를 발견한다. 이들 예는 제한적이기보다는 예시적이다. 규정된 유전자형을 갖는 임의의 상기-언급된 박테리아의 유도체를 구축하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 박테리아 세포 내의 레플리콘의 복제능을 고려하여 적절한 박테리아를 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, pBR322, pBR325, pACYC177 또는 pKN410과 같은 널리 공지된 플라스미드가 레플리콘을 공급하는데 사용되는 경우에, 이. 콜라이, 세라티아 또는 살모넬라 종이 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비해야 하며, 추가의 프로테아제 억제제가 바람직하게는 세포 배양물에 혼입될 수 있다.
ii. 폴리펩티드 생산
숙주 세포를 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양시킨다.
형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 구성요소에 의해 복제가능하도록 DNA를 원핵 숙주 내로 도입시키는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 그 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리는 실질적인 세포 벽 장벽을 함유하는 박테리아 세포에 일반적으로 사용된다. 또 다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 통상적으로 사용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 사용되는 원핵 세포를 당업계에 공지되어 있는, 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예는 필수 영양 보충물이 부가된 루리아 브로쓰 (LB)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하는, 발현 벡터의 구조를 기초로 하여 선택된 선택제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린은 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포를 성장시키기 위한 배지에 첨가된다.
또한, 탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 이외의 임의의 필요한 보충물이, 단독으로, 또는 복합 질소 공급원과 같은 또 다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 도입되어 적절한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포를 적합한 온도에서 배양한다. 이. 콜라이 성장을 위해, 바람직한 온도 범위는 예를 들어 약 20℃ 내지 약 39℃, 보다 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃, 보다 더 바람직하게는 약 30℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 이. 콜라이의 경우에, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 보다 바람직하게는 약 7.0이다.
유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용되는 경우에, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에서 유도된다. 본 발명의 한 측면에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사의 제어에 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위한 포스페이트-제한 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (예를 들어, 문헌 [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147] 참조). 당업계에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 구축물에 따라 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 힌지-함유 숙주 세포는 개별적으로 배양되고, 발현된 본 발명의 폴리펩티드는 개별적으로 숙주 세포의 원형질막공간 내로 분비되고 그로부터 회수된다. 제2 실시양태에서, 제1 및 제2 힌지-함유 숙주 세포는 개별적으로 배양되고, 힌지-함유 폴리펩티드의 단리 전에, 2개의 숙주 세포 배양물을 함께 혼합하고, 세포를 펠릿화한다. 제3 실시양태에서, 제1 및 제2 힌지-함유 숙주 세포는 개별적으로 배양되고, 개별적으로 원심분리 및 재현탁되고, 이어서 힌지-함유 폴리펩티드를 단리하기 전에 혼합한다. 제4 실시양태에서, 제1 및 제2 힌지-함유 숙주 세포는 동일한 배양 용기에서 함께 배양된다. 전형적으로, 단백질 회수는 전형적으로 삼투 쇼크, 음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물 세포 막을 파괴하는 것을 포함한다. 세포가 파괴되면, 세포 용해물 또는 전세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은 예를 들어 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지 내로 전달 또는 분비되고, 그 안에서 단리할 수 있다. 외인성 서열 태그 (또는 에피토프 태그)로 발현된 재조합 단백질은 정제 단계를 용이하게 할 수 있다. 외인성 서열 태그 (His 태그 및 GST 태그를 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 함유하는 단백질의 클로닝 및 정제의 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상청액을 여과하고 농축하여 생산된 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드를, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정과 같은 통상적으로 공지된 방법을 이용하여 추가로 단리하고 확인할 수 있다. 단리된 폴리펩티드는 이종다량체 단백질을 생산하는데 사용될 것이다.
본 발명의 한 측면에서, 이종다량체 단백질 (예를 들어, 항체) 생산은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식 발효 절차가 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이들 발효기는 산소 및 영양소, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분배시키기 위해 교반기 임펠러를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로, 부피가 대략 100 리터 이하인 발효기 내에서의 발효를 지칭하는데, 이는 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 전형적으로 세포를 적합한 조건 하에서 목적하는 밀도, 예를 들어 약 180-220의 OD550으로 성장시킨 후에 개시되며, 이 단계에서 세포는 초기 고정상에 있다. 당업계에 공지되고 상기 기재된 바와 같이, 사용되는 벡터 구축물에 따라 다양한 유도제를 사용할 수 있다. 세포를 유도 전에 보다 짧은 기간 동안 성장시킬 수 있다. 세포를 통상적으로 약 12-50시간 동안 유도하지만, 보다 길거나 보다 짧은 유도 시간이 사용될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비된 이종다량체 단백질 (예를 들어, 항체)의 적당한 어셈블리와 폴딩을 개선하기 위해, 샤페론 단백질, 예컨대 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (샤페론 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)를 과다발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 공동-형질전환시킬 수 있다. 샤페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생산된 이종 단백질의 적절한 폴딩 및 용해도를 용이하게 하는 것으로 입증되었다. 문헌 [Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605]; 미국 특허 번호 6,083,715 (Georgiou et al.); 미국 특허 번호 6,027,888 (Georgiou et al.); [Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210].
발현된 이종 단백질 (특히, 단백질분해에 감수성인 단백질)의 단백질분해를 최소화하기 위해, 단백질분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주를 변형시켜, 공지된 박테리아 프로테아제, 예컨대 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 그의 조합물을 코딩하는 유전자에서 유전자 돌연변이(들)를 수행할 수 있다. 일부 이. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 이용가능하며, 예를 들어 문헌 [Joly et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2773-2777]; 미국 특허 번호 5,264,365 (Georgiou et al.); 미국 특허 번호 5,508,192 (Georgiou et al.); [Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 단백질분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 샤페론 단백질을 과다발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주가 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로 사용된다. 제2 실시양태에서, 이. 콜라이 균주는 외부 막의 지단백질이 결핍된다 (Δlpp).
iii. 이종다량체 단백질 정제
한 실시양태에서, 추가의 검정 및 용도를 위한 실질적으로 균질한 제제를 수득하기 위해 본원에서 이종다량체 단백질을 추가로 정제하였다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 또는 DEAE와 같은 이온-교환 수지 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어 세파덱스 G-75를 이용하는 겔 여과.
한 측면에서, 고체 상에 고정된 단백질 A가, 예를 들어 본 발명의 절반-항체 또는 전장 항체 생성물의 면역친화성 정제에 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 고 친화도로 결합하는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 41 kD 세포벽 단백질이다. 문헌 [Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13]. 단백질 A가 고정되는 고체 상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼, 보다 바람직하게는 제어된 기공 유리 칼럼 또는 규산 칼럼이다. 일부 용도에서, 오염물의 비특이적 부착을 방지하기 위하여 칼럼을 글리세롤과 같은 시약으로 코팅한다.
정제의 제1 단계로서, 상기 기재된 바와 같은 세포 배양물로부터 유래된 제제를 단백질 A 고정된 고체 상에 적용하여 관심 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하게 할 수 있다. 그 후, 고체 상을 세척하여 고체 상에 비-특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 이종다량체 단백질 (예를 들어, 항체)을 고체 상으로부터 용리에 의해 회수한다.
b. 진핵 숙주 세포를 사용하는 이종다량체 단백질의 생산:
벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
i. 신호 서열 성분
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 신호 서열, 또는 관심 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 바람직하게 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 포유동물 세포 발현시에는, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스성 분비 리더, 예를 들어 단순 헤르페스 gD 신호가 이용가능하다. 이러한 전구체 영역을 위한 DNA는 바람직한 이종다량체 단백질(들) (예를 들어, 항체)을 코딩하는 DNA에 리딩 프레임으로 라이게이션된다.
ii. 복제 기점
일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 기점은 오직 초기 프로모터를 포함하기 때문에 전형적으로 사용될 수 있다
iii. 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택 마커라고도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 관련이 있는 경우에는 영양요구성 결핍을 보충하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다.
선택 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고, 따라서 선택 요법에서 생존한다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포에 적합한 선택 마커의 또 다른 예는 항체 핵산을 취하는 세포 성분의 확인을 가능하게 하는 것, 예컨대 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 우선 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR을 사용할 때의 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.
대안적으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 또 다른 선택 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스페라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질감염되거나 공동-형질감염된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)를, 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선택 마커에 대한 선택제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 번호 4,965,199를 참조한다.
iv. 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 바람직한 힌지-함유 폴리펩티드(들) (예를 들어, 항체) 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터 서열은 진핵생물에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에서 발견되는 AT-풍부 부위를 갖는다. 다수의 유전자의 전사 출발점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에 존재하는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에 존재한다. 모든 이러한 서열들이 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터 바람직한 힌지-함유 폴리펩티드(들) (예를 들어, 절반-항체)의 전사는 프로모터가 숙주 세포 시스?과 상용성이라면, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터로부터, 또는 열-쇼크 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 제어된다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스성 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터가 HindIII E 제한 단편으로 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템이 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형이 미국 특허 번호 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 헤르페스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해서는 또한 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복부를 프로모터로 사용할 수 있다.
v. 인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의한 바람직한 힌지-함유 폴리펩티드(들) (예를 들어, 항체)를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 다수의 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린 유전자)로부터 공지되어 있다. 또한, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 수 있다. 그 예는 복제 기점의 후측 (bp 100-270)의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 후측의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵 프로모터의 활성화를 증진시키기 위한 요소의 설명에 대해서는 또한 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 증진이 달성되는 한, 인핸서는 위치 5' 또는 3'에서 항체 폴리펩티드 코딩 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터부터 부위 5'에 위치한다.
vi. 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터는 전형적으로 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열 또한 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 유용한 전사 종결 성분 중 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 여기에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
vii. 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터에서 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 비롯한 본원에 기재된 고등 진핵 세포를 포함한다. 배양 (조직 배양)시의 척추동물 세포의 증식은 상용 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁 배양하에 성장하도록 서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 바람직한 힌지-함유 폴리펩티드(들) (예를 들어, 항체) 생산을 위한 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형시킨 통상의 영양 배지에서 배양한다.
viii. 숙주 세포의 배양
본 발명의 바람직한 힌지-함유 폴리펩티드(들) (예를 들어, 항체)를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 햄 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 ((MEM), (시그마)), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지 ((DMEM), 시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 배지 중 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오시드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 겐타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 또한, 임의의 다른 필요한 보충물을 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함시킬 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 이용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.
ix. 이종다량체 단백질의 정제
재조합 기술을 이용할 때, 힌지-함유 폴리펩티드는 세포 내에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 힌지-함유 폴리펩티드가 세포 내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서 입자형 파편인 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 힌지-함유 폴리펩티드가 배지로 분비되는 경우, 일반적으로는 우선 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 이종다량체 조성물은, 예를 들어 이온 교환, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 상기 언급된 기술의 조합이 또한 고려된다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하여 항체를 정제하하는데 사용될 수 있다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (문헌 [Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 회수할 항체에 따라, 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전이 이용될 수도 있다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물을, pH 약 2.5-4.5의 용리 완충제를 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염으로부터)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용할 수 있다. 이종다량체 단백질의 생산은 (임의의 상기 특정한 방법에) 대안적으로 또는 추가로 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는 용액을 투석하는 것을 포함한다.
x. 바큘로바이러스를 사용하는 항체 생산
재조합 바큘로바이러스는, 예를 들어 리포펙틴 (깁코(GIBCO)-BRL로부터 상업적으로 입수가능함)을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 플라스미드 및 바큘로골드(BaculoGold)™ 바이러스 DNA (파밍겐(Pharmingen))를 곤충 세포, 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 (예를 들어, Sf9 세포; ATCC CRL 1711) 또는 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) S2 세포 내로 공동-형질감염시킴으로써 생성될 수 있다. 특정한 예에서, 항체 서열은 바큘로바이러스 발현 벡터 내에 함유된 에피토프 태그의 상류에 융합된다. 상기 에피토프 태그는 폴리-His 태그를 포함한다. 상업적으로 입수가능한 플라스미드, 예를 들어 pVL1393 (노바젠(Novagen)) 또는 pAcGP67B (파밍겐)로부터 유래된 플라스미드를 비롯하여 다양한 플라스미드가 사용될 수 있다. 간략하게, 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 서열은 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 5' 프라이머는 측면에 접하는 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서, 생성물을 선택된 제한 효소로 소화시키고, 발현 벡터 내로 서브클로닝시킨다.
발현 벡터로 형질감염시킨 후에, 숙주 세포 (예를 들어, Sf9 세포)를 28℃에서 4-5일 동안 인큐베이션하고, 방출된 바이러스를 수확하고 추가의 증폭을 위해 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 예를 들어 문헌 [O'Reilley et al. (Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual. Oxford: Oxford University Press (1994))]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.
이어서, 발현된 폴리-His 태그 부착된 항체를, 예를 들어 다음과 같이 Ni2+-킬레이트 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 추출물을 문헌 [Rupert et al. (Nature 362:175-179 (1993))]에 의해 기재된 바와 같이 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 제조할 수 있다. 간략하게, Sf9 세포를 세척하고, 초음파분해 완충제 (25 mL HEPES pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl) 내에 재현탁하고, 얼음 상에서 20초 동안 2회 초음파분해한다. 초음파분해물을 원심분리에 의해 정화하고, 상청액을 로딩 완충제 (50 mM 포스페이트, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8) 내에 50배 희석하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과한다. Ni2+-NTA 아가로스 칼럼 (퀴아겐 (Qiagen)으로부터 상업적으로 이용가능함)을 5 mL의 층 부피로 제조하고, 25 mL의 물로 세척하고, 25 mL의 로딩 완충제로 평형화시킨다. 여과된 세포 추출물 칼럼 상으로 0.5 mL/분으로 로딩한다. 칼럼을 로딩 완충제로 A280 기준선까지 세척하고, 이 시점에서 분획 수집을 시작하였다. 이어서, 칼럼을 비특이적으로 결합된 단백질을 용리시키는 2차 세척 완충제 (50 mM 포스페이트, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)로 세척한다. 다시 A280 기준선에 도달한 후, 칼럼을 2차 세척 완충제에서 0 → 500 mM 이미다졸 구배로 전개시킨다. 분획 1 mL를 수집하고, SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알칼리성 포스파타제에 접합된 Ni2+-NTA (퀴아젠)로의 웨스턴 블롯에 의해 분석한다. 용리된 His10-태그 부착된 항체를 함유하는 분획을 모으고 로딩 완충제에 대해 투석한다.
대안적으로, 항체의 정제는 공지의 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 관심 항체는 카오트로픽제 또는 순한 세제를 함유하는 용액 내로 용리에 의해 칼럼의 고체 상으로부터 회수할 수 있다. 예시적인 카오트로픽제 및 순한 세제는 구아니딘-HCl, 우레아, 리튬 퍼클로레이트, 아르기닌, 히스티딘, SDS (소듐 도데실 술페이트), 트윈, 트리톤 및 NP-40을 포함하나 이에 제한되지는 않고, 이들은 모두 상업적으로 입수가능하다.
IV. 표적 분자
본 발명의 이종다량체 단백질에 의해 표적화될 수 있는 분자의 예는 가용성 혈청 단백질 및 그의 수용체 및 다른 막 결합 단백질 (예를 들어, 어드헤신)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 그 전체내용이 본원에 참조로 포함된 WO2011/133886을 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체 단백질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개, 2개 또는 그 초과의 시토카인, 시토카인-관련 단백질 및 시토카인 수용체에 결합할 수 있다: BMPI, BMP2, BMP3B (GDFIO), BMP4, BMP6, BMP8, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGFI (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNAI, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNBI, IFNG, IFNWI, FELI, FELI (EPSELON), FELI (ZETA), IL1A, IL1 B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA (TNF-b), LTB, TNF (TNF-a), TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1 BB 리간드), TNFSFIO (TRAIL), TNFSF1 I (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILIR1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, ILI0RA, ILI0RB, IL11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIFI, HGF, LEP (렙틴), PTN, 및 THPO.
또 다른 실시양태에서, 표적 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 케모카인, 케모카인 수용체 또는 케모카인-관련 단백질이다: CCLI (I-309), CCL2 (MCP-1 / MCAF), CCL3 (MIP-la), CCL4 (MIP-lb), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCLH (에오탁신), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-ld), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (SLC / 엑소두스-2), CCL22 (MDC / STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2 / 에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26 (에오탁신-3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP 10), CXCL11 (l-TAC), CXCL12 (SDFI), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (림포탁틴), XCL2 (SCM-lb), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6 / JAB61), CCR1 (CKRI / HM145), CCR2 (mcp-IRB / RA), CCR3 (CKR3 / CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5 / ChemR13), CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6), CCR7 (CKR7 / EBII), CCR8 (CMKBR8 / TERI / CKR-LI), CCR9 (GPR-9-6), CCRLI (VSHKI), CCRL2 (L-CCR), XCRI (GPR5 / CCXCRI), CMKLRI, CMKORI (RDCI), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCRIO), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9 / CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR / STRL33 / Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPR16), TCPIO, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCCIO (CIO), EPO, FY (DARC), GDF5, HDFIA, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREMI, TREM2, 및 VHL.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 이종다량체 단백질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적에 결합할 수 있다: ABCFI; ACVRI; ACVRIB; ACVR2; ACVR2B; ACVRLI; AD0RA2A; 아그레칸; AGR2; AICDA; AIFI; AIGI; AKAPI; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPTI; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOCI; AR; AZGPI (아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF (BLys); BAGI; BAH; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMPI; BMP2; BMP3B (GDFIO); BMP4; BMP6; BMP8; BMPRIA; BMPRIB; BMPR2; BPAGI (플렉틴); BRCAI; C19orflO (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANTI; CASP1; CASP4; CAVI; CCBP2 (D6 / JAB61); CCLI (1-309); CCLII (에오탁신); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-Id); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP-1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MTP-2); SLC; 엑소두스-2; CCL22 (MDC / STC-I); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2 / 에오탁신-2); CCL25 (TECK); CCL26 (에오탁신-3); CCL27 (CTACK / ILC); CCL28; CCL3 (MTP-la); CCL4 (MDP-lb); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNAI; CCNA2; CCNDI; CCNEI; CCNE2; CCRI (CKRI / HM145); CCR2 (mcp-IRB / RA);CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBII); CCR8 (CMKBR8 / TERI / CKR-LI); CCR9 (GPR-9-6); CCRLI (VSHKI); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CDIC; CD20; CD200; CD22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CDHI (E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKNIA (p21Wapl / Cipl); CDKNIB (p27Kipl); CDKNIC; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CERI; CHGA; CHGB; 키티나제; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7 (클라우딘-7); CLN3; CLU (클러스테린); CMKLRI; CMKORI (RDCI); CNRI; COL18A1; COLIAI; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSFI (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNBI (b-카테닌); CTSB (카텝신 B); CX3CL1 (SCYDI); CX3CR1 (V28); CXCLI (GROI); CXCL10 (IP-10); CXCLII (l-TAC / IP-9); CXCL12 (SDFI); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78 / LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9 / CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR / STRL33 / Bonzo); CYB5; CYCI; CYSLTRI; DAB2IP; DES; DKFZp451 J01 18; DNCLI; DPP4; E2F1; ECGFI; EDGI; EFNAI; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESRI; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCERIA; FCER2; FCGR3A; FGF; FGFI (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FELI (EPSILON); FILI (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI (피브로넥틴); FLTI; FOS; FOSLI (FRA-I); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEBI; GAGECI; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCRIO); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCCIO (CIO); GRP; GSN (겔소린); GSTPI; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIFIA; HDPI; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOXI; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNAI; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; DFNWI; IGBPI; IGFI; IGFIR; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-I; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1B; ILIF10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HYI; IL1RI; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20RA; IL21R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (당단백질 130); EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAKI; ERAK2; ITGAI; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b 4 인테그린); JAGI; JAKI; JAK3; JUN; K6HF; KAII; KDR; KITLG; KLF5 (GC 박스 BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (케라틴 19); KRT2A; KHTHB6 (모발-특이적 유형 H 케라틴); LAMAS; LEP (렙틴); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG 또는 Omgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIBI; 미드카인; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (메탈로티오넥틴-lll); MTSSI; MUCI (뮤신); MYC; MYD88; NCK2; 뉴로칸; NFKBI; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NMEI (NM23A); N0X5; NPPB; NROBI; NR0B2; NRIDI; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRPI; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRDI; P2RX7; PAP; PARTI; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAMI; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDCI; PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21 Rac2); RARB; RGSI; RGS13; RGS3; RNFIIO (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1 D2 (리포필린 B); SCGB2A1 (맘마글로빈2); SCGB2A2 (맘마글로빈1); SCYEI (내피 단핵구-활설화 시토카인); SDF2; SERPINAI; SERPINA3; SERP1NB5 (마스핀); SERPINEI (PAI-I); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPI; SPRRIB (Sprl); ST6GAL1; STABI; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCPIO; TDGFI; TEK; TGFA; TGFBI; TGFBIII; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI (트롬보스폰딘-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; 조직 인자; TLRIO; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSFIA; TNFRSFIB; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSFIO (TRAIL); TNFSFI1 (TRANCE); TNFSF12 (APO3L); TNFSF13 (아프릴); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (OX40 리간드); TNFSF5 (CD40 리간드); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 리간드); TNFSF8 (CD30 리간드); TNFSF9 (4-1 BB 리간드); TOLLIP; Toll-유사 수용체; TOP2A (토포이소머라제 Ea); TP53; TPMI; TPM2; TRADD; TRAFI; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREMI; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCLI (림포탁틴); XCL2 (SCM-lb); XCRI(GPR5 / CCXCRI); YYI; 및 ZFPM2.
본 발명에 포괄되는 항체에 바람직한 분자 표적 분자는 CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD20, CD34; CD64, ErbB 수용체 패밀리의 CD200 구성원, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예를 들어 LFA-1, Mad, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 알파4/베타7 인테그린, 및 알파v/베타3 인테그린, 예를 들어 그의 알파 또는 베타 서브유닛 (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예컨대 VEGF-A, VEGF-C; 조직 인자 (TF); 알파 인터페론 (알파IFN); TNF알파, 인터류킨, 예컨대 IL-1베타, IL-3, IL-4, IL-5, IL-8, IL-9, IL-13, IL17A/F, IL-18, IL-13R알파1, IL13R알파2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; RANKL, RANK, RSVF 단백질, 단백질 C 등을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체 단백질은 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 (LRP)-1 또는 LRP-8 또는 트랜스페린 수용체, 및 1) 베타-세크레타제 (BACE1 또는 BACE2), 2) 알파-세크레타제, 3) 감마-세크레타제, 4) 타우-세크레타제, 5) 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 6) 사멸 수용체 6 (DR6), 7) 아밀로이드 베타 펩티드, 8) 알파-시누클레인, 9) 파킨, 10) 헌팅틴, 11) p75 NTR, 및 12) 카스파제-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 표적에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 표적 분자에 결합한다: IL-1 알파 및 IL-1 베타, IL-12 및 IL-18; IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-5 및 IL-4; IL-13 및 IL-1 베타; IL-13 및 IL-25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MEF; IL-13 및 TGF-β; IL-13 및 LHR 효능제; IL-12 및 TWEAK, IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; IL-13 및 ADAM8, IL-13 및 PED2, IL17A 및 IL17F, CD3 및 CD19, CD138 및 CD20; CD138 및 CD40; CD19 및 CD20; CD20 및 CD3; CD38 및 CD138; CD38 및 CD20; CD38 및 CD40; CD40 및 CD20; CD-8 및 IL-6; CD20 및 BR3, TNF알파 및 TGF-베타, TNF알파 및 IL-1 베타; TNF알파 및 IL-2, TNF 알파 및 IL-3, TNF알파 및 IL-4, TNF알파 및 IL-5, TNF알파 및 IL6, TNF알파 및 IL8, TNF알파 및 IL-9, TNF알파 및 IL-10, TNF알파 및 IL-11, TNF알파 및 IL-12, TNF알파 및 IL-13, TNF알파 및 IL-14, TNF알파 및 IL-15, TNF알파 및 IL-16, TNF알파 및 IL-17, TNF알파 및 IL-18, TNF알파 및 IL-19, TNF알파 및 IL-20, TNF알파 및 IL-23, TNF알파 및 IFN알파, TNF알파 및 CD4, TNF알파 및 VEGF, TNF알파 및 MIF, TNF알파 및 ICAM-1, TNF알파 및 PGE4, TNF알파 및 PEG2, TNF알파 및 RANK 리간드, TNF알파 및 Te38; TNF알파 및 BAFF; TNF알파 및 CD22; TNF알파 및 CTLA-4; TNF알파 및 GP130; TNFa 및 IL-12p40; VEGF 및 HER2, VEGF-A 및 HER2, VEGF-A 및 PDGF, HER1 및 HER2, VEGF-A 및 VEGF-C, VEGF-C 및 VEGF-D, HER2 및 DR5, VEGF 및 IL-8, VEGF 및 MET, VEGFR 및 MET 수용체, VEGFR 및 EGFR, HER2 및 CD64, HER2 및 CD3, HER2 및 CD16, HER2 및 HER3; EGFR(HERI) 및 HER2, EGFR 및 HER3, EGFR 및 HER4, IL-13 및 CD40L, IL4 및 CD40L, TNFR1 및 IL-1R, TNFR1 및 IL-6R 및 TNFR1 및 IL-18R, EpCAM 및 CD3, MAPG 및 CD28, EGFR 및 CD64, CSPG 및 RGM A; CTLA-4 및 BTNO2; IGF1 및 IGF2; IGF1/2 및 Erb2B; MAG 및 RGM A; NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; PDL-I 및 CTLA-4; 및 RGM A 및 RGM B.
가용성 항원 또는 그의 단편 (임의로 또 다른 분자에 접합됨)이 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 막횡단 분자, 예컨대 수용체에 대해, 그의 단편 (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 막횡단 분자를 발현하는 세포가 면역원으로 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원 (예를 들어, 암 세포주)으로부터 유래될 수도 있고, 또는 막횡단 분자를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수도 있다. 항체의 제조에 유용한 다른 항원 및 그의 형태가 당업자에게 명백할 것이다.
V. 실시양태
본 발명은 하기 기재된 바와 같은 추가의 실시양태를 제공한다. 제1 실시양태에서, 단백질 A 정제된 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 수득하는 단계; 단백질 A 정제된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 수득하는 단계; 각각의 절반-항체의 pH를 4 내지 9로 조정하는 단계; 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 혼합하여 혼합된 힌지-함유 폴리펩티드 풀을 수득하는 단계; 혼합된 힌지-함유 폴리펩티드 풀에 몰 과량의 약한 환원제를 첨가하는 단계; 및 혼합된 힌지-함유 폴리펩티드 풀을 약한 환원제와 인큐베이션하여 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 형성하는 단계를 포함하는, 이종다량체 단백질을 생산하는 방법이 제공된다.
제2 실시양태에서 및 제1 실시양태에 따르면, 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체, 이뮤노어드헤신 및 그의 단편으로부터 선택될 수 있다. 제3 실시양태에서 및 제1 실시양태에 따르면, 제1 힌지-함유 폴리펩티드는 절반-항체이다. 제4 실시양태에서 및 제1 실시양태에 따르면, 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 Fc 성분이다. 제5 실시양태에서 및 제3 실시양태에 따르면, 절반-항체는 VL 도메인, CL 도메인, VH 도메인, CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 제6 실시양태에서 및 제5 실시양태에 따르면, 절반-항체는 테더를 추가로 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄이며, 여기서 상기 도메인은 서로에 대해 N-말단에서 C-말단으로의 방향으로 VL-CL-테더-VH-CH1-힌지-CH2-CH3과 같이 위치한다. 제7 실시양태에서 및 제1 실시양태에 따르면, 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 단백질 A 정제 전에 혼합되고, 단백질 A 상에서 공동-정제된다. 제8 실시양태에서 및 제1 실시양태에 따르면, 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 이종다량체화 도메인을 포함한다. 제9 실시양태에서 및 제8 실시양태에 따르면, 이종다량체화 도메인은 노브 인투 홀 돌연변이, 류신 지퍼, 정전기성 등으로부터 선택된다. 제10 실시양태에서 및 제9 실시양태에 따르면, 제1 힌지-함유 폴리펩티드는 노브를 포함하고, 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 홀을 포함한다. 제11 실시양태에서 및 제1 실시양태에 따르면, pH는 혼합 후에 조정된다. 제12 실시양태에서 및 제1 또는 제11 실시양태에 따르면, 방법은 pH를 조정하기 전에 L-아르기닌을 20mM 내지 1M의 최종 농도로 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 제13 실시양태에서 및 제1 실시양태에 따르면, 방법은 혼합된 풀을 15℃ 내지 39℃의 온도에서 30분 이상 동안 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 제14 실시양태에서 및 제1 실시양태에 따르면, 어셈블리 혼합물은 -200 내지 -600 mV, 보다 바람직하게는 -300 내지 -500 mV, 가장 바람직하게는 약 -400 mV의 산화 전위를 갖는다. 제15 실시양태에서 및 제1 실시양태에 따르면, 약한 환원제는 GSH, 베타-메르캅토에틸아민, 시스테인/시스테인, GSH/GSSG, 시스테아민/시스타민, 글리실시스테인, 및 베타-메르캅토에탄올로부터 선택된다. 제16 실시양태에서 및 제1 실시양태에 따르면, 약한 환원제는 50-600 몰 과량으로 첨가된다. 제17 실시양태에서 및 제1 실시양태에 따르면, 약한 환원제는 혼합 전에 첨가된다. 제18 실시양태에서 및 제17 실시양태에 따르면, 첨가는 혼합 1시간 미만 전에 수행된다. 제19 실시양태에서 및 제1 실시양태에 따르면, 어셈블리 혼합물을 인큐베이션하는 단계는 15℃ 내지 39℃의 온도에서 폴리비닐피롤리돈 (PVP)의 존재 하에 수행된다. 제20 실시양태에서 및 제19 실시양태에 따르면, 히스티딘은 PVP 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 첨가된다. 제21 실시양태에서 및 제19 실시양태에 따르면, PVP는 40% (w/v)까지 첨가된다.
제22 실시양태에서, 본 발명은
a. 단백질 A 정제된 제1 절반-항체를 수득하는 단계;
b. 단백질 A 정제된 제2 절반-항체를 수득하는 단계;
c. L-아르기닌 용액을 각각의 절반-항체에 첨가하는 단계;
d. 각각의 절반-항체의 pH를 4 내지 9로 조정하는 단계;
e. 제1 및 제2 절반-항체 풀을 혼합하여 혼합된 절반-항체 풀을 수득하는 단계;
f. 몰 과량의 약한 환원제를 혼합된 절반-항체 풀에 첨가하는 단계;
g. 혼합된 절반-항체 풀을 15℃ 내지 39℃의 온도에서 PVP의 존재 하에 인큐베이션하는 단계
를 포함하며, 이에 의해 제1 및 제2 절반-항체를 포함하는 이중특이적 항체가 생산되는 것인, 이중특이적 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
제23 실시양태에서, 본 발명은 (a) 2종 이상의 상이한 힌지-함유 폴리펩티드의 L-아르기닌 함유 혼합물을 제공하며, 여기서 상기 혼합물은 7 내지 9의 pH를 갖는 것인 단계, (b) 몰 과량의 약한 환원제를 첨가하는 단계 및 (c) 혼합물을 이종다량체가 생산되는 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 이종다량체를 생산하는 방법을 제공한다.
제24 실시양태에서 및 제22 실시양태에 따르면, 제1 절반-항체는 (a) VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 전장 경쇄; (b) 테더, (c) VH 도메인, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 전장 중쇄를 포함하는 단일 쇄 폴리펩티드이며; 상기 폴리펩티드는 서로에 대해 N-말단에서 C-말단으로의 방향으로 VL-CL-CL/VH 테더-VH-CH1-힌지-CH2-CH3과 같이 위치한 경쇄 및 중쇄의 도메인을 포함한다. 제25 실시양태에서 및 제24 실시양태에 따르면, 단일 쇄 폴리펩티드는 이종다량체화 도메인을 추가로 포함한다. 제26 실시양태에서 및 제25 실시양태에 따르면, 이종다량체화 도메인은 홀 (예를 들어, 함몰부) 또는 노브 (예를 들어, 돌출부)이다. 제27 실시양태에서 및 제26 실시양태에 따르면, 제1 절반-항체가 노브를 포함하는 경우에 제2 절반-항체는 홀을 포함한다. 제28 실시양태에서 및 제26 실시양태에 따르면, 제1 절반-항체가 홀을 포함하는 경우에 제2 절반-항체는 노브를 포함한다. 제29 실시양태에서 및 제24 실시양태에 따르면, 테더는 GGS 반복부를 포함한다. 제30 실시양태에서 및 제24 실시양태에 따르면, 테더는 15-50개 아미노산이다.
제31 실시양태에서, 본 발명은 (a) 단백질 A 정제된 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 수득하는 단계; (b) 단백질 A 정제된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 수득하는 단계; (c) 각각의 힌지-함유 폴리펩티드의 pH를 L-아르기닌의 존재 하에 4 내지 9로 조정하는 단계; (d) 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 혼합하여 혼합된 절반-항체 풀을 수득하고, 인큐베이션하여 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 형성하는 단계를 포함하는, 이종다량체 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
제32 실시양태에서 및 제1 또는 제31 실시양태에 따르면, 절반-항체 중 적어도 하나는 (a) VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 전장 경쇄; (b) 테더; (c) VH 도메인, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 전장 중쇄를 포함하는 단일 쇄 폴리펩티드이다.
제33 실시양태에서 및 제1 실시양태에 따르면, 제1 힌지-함유 폴리펩티드는 서로에 대해 N-말단에서 C-말단으로의 방향으로 VL-CL-VH-CH1-힌지-CH2-CH3과 같이 위치한 경쇄 및 중쇄의 도메인을 포함하는 단일 쇄 폴리펩티드이다. 제34 실시양태에서 및 제33 실시양태에 따르면, 단일 폴리펩티드 쇄는 테더를 추가로 포함하며, 여기서 상기 도메인은 서로에 대해 N-말단에서 C-말단으로의 방향으로 VL-CL-테더-VH-CH1-힌지-CH2-CH3과 같이 위치한다.
제35 실시양태에서, 본 발명은 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 L-아르기닌 함유 혼합물을 제공하며, 상기 혼합물은 4 내지 9의 pH를 갖는 것인 단계, 약한 환원제를 첨가하는 단계 및 이종다량체가 생산되도록 하는 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 이종다량체를 생산하는 방법을 제공한다.
제36 실시양태에서, 본 발명은 절반-항체를 발현하도록 조작된 숙주 세포를 제공하며, 여기서 상기 절반-항체는 테더, VL 도메인, CL 도메인, VH 도메인, CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 단일 쇄 폴리펩티드이고, 상기 도메인은 서로에 대해 N-말단에서 C-말단으로의 방향으로 VL-CL-테더-VH-CH1-힌지-CH2-CH3과 같이 위치한다. 제37 실시양태에서 및 제36 실시양태에 따르면, 단일 폴리펩티드 쇄는 이종이량체화 도메인을 추가로 포함한다. 제38 실시양태에서 및 제36 또는 제37 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 원핵 세포, 진핵 세포, 포유동물 세포 또는 식물 세포로부터 선택된다. 제39 실시양태에서 및 제38 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 제40 실시양태에서 및 제39 실시양태에 따르면, 원핵 세포는 이. 콜라이 세포이다. 제41 실시양태에서 및 제40 실시양태에 따르면, 이. 콜라이 세포는 lpp 결손이다. 제42 실시양태에서 및 제38 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 제43 실시양태에서 및 제41 실시양태에 따르면, 포유동물 세포는 CHO 세포이다. 제44 실시양태에서 및 제36 또는 제37 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 단일 쇄 절반-항체를 코딩하는 벡터를 포함한다. 제45 실시양태에서 및 제36 또는 제37 실시양태에 따르면, 절반-항체는 이종이량체화 도메인을 추가로 포함한다. 제46 실시양태에서 및 제45 실시양태에 따르면, 이종이량체화 도메인은 노브, 홀, 동종이량체 형성에는 정전기적으로 불리하나 이종다량체 형성에는 정전기적으로 유리한 인터페이스 내의 하나 이상의 하전된 아미노산, 분자내 이온성 상호작용을 증진시키도록 변경된 하나 이상의 아미노산, 코일드 코일 및 류신 지퍼로부터 선택된다.
제47 실시양태에서, 본 발명은 제1 단일 쇄 절반-항체를 발현하도록 조작된 제1 숙주 세포 및 Fc 성분을 발현하도록 조작된 제2 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포의 혼합물을 제공한다. 제48 실시양태에서 및 제36 실시양태에 따르면, 숙주 세포에 의해 생산된 절반-항체는 이종이량체화 도메인을 포함한다.
하기 실험 개시내용에서, 하기 약어를 적용한다: eq (당량); M (몰); μM (마이크로몰); N (노르말); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); g (그램); mg (밀리그램); kg (킬로그램); μg (마이크로그램); L (리터); ml (밀리리터); μl (마이크로리터); cm (센티미터); mm (밀리미터); μm (마이크로미터); nm (나노미터); ℃. (섭씨 온도); h (시간); min (분); sec (초); msec (밀리초).
실시예
본 발명은 하기 실시예에 추가로 상세히 기재되며, 이는 청구된 바와 같은 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다. 첨부되는 도면은 본 발명의 명세서 및 설명의 통합 부분으로서 간주되어야 한다는 것을 의미한다. 인용된 모든 참고문헌은 그에 기재된 모든 것이 구체적으로 본원에 참조로 포함된다.
실시예 1: 발현 & 정제
본 실시예는 절반-항체의 발현 및 정제를 설명한다.
이. 콜라이에서 절반-항체의 구축 및 발현의 예시적인 방법은 예를 들어 그의 전체내용이 본원에 참조로 포함되는 동시-계류 출원 U.S. 2011/0287009에서 찾아볼 수 있다. 배양 및 발현 조건을 변형하고 조정하는 것은 당업자의 능력 내에 있다.
이. 콜라이 세포에서 절반-항체의 발현
발현 플라스미드의 구축
중쇄 및 경쇄 DNA 코딩 서열을 둘 다, 각각의 서열 및 항생제 내성에 대한 개별 프로모터 요소를 함유하는 발현 플라스미드로 클로닝하여 발현 플라스미드를 함유하는 박테리아 세포를 선택하였다. 벡터 구축물은 또한 박테리아 세포의 주변세포질 공간으로의 항체 폴리펩티드의 유출을 위해 내열성 장독소 II (STII) 분비 신호를 코딩한다 (문헌 [Picken et al., 1983, Infect. Immun. 42:269-275, 및 Lee et al., 1983, Infect. Immun. 42:264-268]). 각각의 쇄의 전사는 phoA 프로모터에 의해 제어되고 (문헌 [Kikuchi et al., 1981, Nucleic Acids Res., 9:5671-5678]), 번역 제어는 번역 개시 영역 (TIR)에 침묵 코돈 변화를 함유하는, 측정된 상대 번역 강도의 이전에 기재된 STII 신호 서열 변이체에 의해 제공된다 (문헌 [Simmons and Yansura, 1996, Nature Biotechnol. 14:629-634 및 Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods, 263:133-147]).
각각의 절반-항체는 미국 특허 번호 7,642,228에 기재된 바와 같이 중쇄 내로 조작된 노브 (돌출부) 또는 홀 (함몰부)을 갖는다. 간략하게, CH3 노브 돌연변이체를 먼저 생성하였다. 이어서, CH3 홀 돌연변이체의 라이브러리를 파트너 CH3 도메인 상의 노브에 근접하여 있는 잔기 366, 368 및 407을 임의 추출함으로써 생성하였다. 하기 실시예에서, 노브 돌연변이는 T366W이고, 홀은 IgG1 또는 IgG4 백본에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 갖는다. 다른 이뮤노글로불린 이소형의 동등한 돌연변이는 당업자에 의해 만들어질 수 있다. 또한, 당업자는 이중특이적 항체에 사용된 2개의 절반-항체가 동일한 이소형인 것이 바람직하다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
발현 및 정제
노브 또는 홀 돌연변이를 함유하는 절반-항체를, 박테리아 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이에서 중쇄 및 경쇄를 발현시킴으로써 개별 배양물에서 생성하였다. 발현 플라스미드를 이. 콜라이 숙주 균주 33D3 (문헌 [Ridgway et al. (1999) 59 (11): 2718]) 또는 64B4 (W3110 .DELTA.fhuA .DELTA.phoA ilvG+.DELTA.prc spr43H1 .DELTA.degP .DELTA.manA lacI.sup.q .DELTA.ompT)에 도입하고, 형질전환체를 카르베니실린 함유 LB 플레이트 상에서 선택하였다. 이어서, 형질전환체를 사용하여 카르베니실린을 함유하는 LB 종균 배양물에 접종하고, 이를 30℃에서 진탕시키면서 밤새 성장시켰다. 종균 배양물을 카르베니실린을 함유하는 포스페이트 제한 배지 C.R.A.P. (문헌 [Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods, 263:133-147)로 100X 희석하고, 배양물을 30℃에서 진탕시키면서 24시간 동안 성장시켰다. 배양물을 원심분리하고, 세포 펠릿을 항체 정제 시작시까지 동결시켰다. 펠릿을 해동시키고, 25 mM 트리스-염기 (염산을 사용하여 pH 7.5로 조정됨), 125 mM NaCl 및 5 mM EDTA (TEB 또는 트리스 추출 완충제)를 함유하는 추출 완충제 중에 세포 펠릿 5 그램당 100mL TEB의 부피 대 중량 비로 재현탁시키고, 재현탁된 혼합물을 마이크로플루이딕스 코포레이션(Microfluidics Corporation) 모델 110F 마이크로플루이다이저 (매사추세츠주 뉴턴)를 통해 3회 통과시킴으로써 마이크로유체를 이용하여 세포를 파괴하여 추출하였다. 이어서, 박테리아 세포 추출물을 15,000Xg에서 20분 동안 원심분리하여 정화시키고, 상청액을 수집하고, 0.22 마이크로미터 아세테이트 필터를 통해 여과한 후, 정제하였다.
각각의 절반-항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 개별적으로 정제하였다. 노브 절반-항체로부터의 정화된 세포 추출물을 지이 헬스케어(GE Healthcare, 뉴저지주 피스카타웨이)로부터의 1mL 하이트랩 맵셀렉트 슈어(HiTrap MABSELECT SURE)™ 칼럼 상에 2 mL/분으로 로딩하였다. 로딩 후에, 칼럼을 10 칼럼 부피 (CV)의 40 mM 시트르산나트륨, pH 6.0, 125 mM 염화나트륨 및 5 mM EDTA에 이어서 5 칼럼 부피의 20 mM 시트르산나트륨 (pH 6.0)으로 세척하여, 양이온 교환 칼럼에 의한 포획을 용이하게 하였다. 친화도 포획된 절반-항체를 10 칼럼 부피 (CV)의 0.2 mM 아세트산 (pH 2-3)으로 용리하였다.
CHO 세포에서 절반-항체의 발현
발현 플라스미드의 구축.
중쇄 및 경쇄 cDNA는 둘 다 시토메갈로바이러스 극초기 유전자 프로모터 및 인핸서 (CMV)의 제어 하에 있다. 각각의 CMV 전사 시작 부위 뒤에 스플라이스 공여자 및 수용자 서열이 존재하며, 이들은 최종 전사체로부터 제거되는 인트론을 규정한다 (문헌 [Lucas et al., High-level production of recombinant proteins in CHO cells using a dicistronic DHFR intron expression vector. Nucl. Acid Res. (1996) 24:1774-9]). 글루타민 신테타제 (GS) 효소를 적합한 세포주 개발을 위한 선택 마커로 사용하였으며 (문헌 [Sanders et al., Amplification and cloning of the Chinese hamster glutamine synthetase gene. The EMBO J (1984) 3:65-71]), 이는 SV40 초기 프로모터 및 인핸서의 제어 하에 있다.
세포 배양.
CHO 세포를 진탕 플라스크 용기 중의 독점 DMEM/F12-기재 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 세포를 3x105개/mL의 시딩 밀도로 3 내지 4일마다 계대배양하였다.
안정한 형질감염.
CHO 세포를 제조업체의 제안 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)에 따라 리포펙타민 2000 CD를 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 원심분리하고, 다양한 농도의 메티오닌 술폭시민 (MSX)을 포함하는 DMEM/F-12-기반 선택 (글루타민-무함유) 배지에 시딩하였다. 시딩하고 약 3주 후에, 개별 콜로니를 96-웰 플레이트에 피킹하였다. 피킹된 콜로니를 ELISA 분석을 위해 상청액을 채취함으로써 항체 생산에 대해 평가하였다. 상위 클론을 확대하고, 항체 역가, 선호 대사 (주로 락테이트 소비) 및 허용되는 생성물 품질 특성을 기반으로 평가하였다.
발현:
각각의 절반 항체를 CHO 세포에서 발현시켰다. 2L 배양물을 성장시키고, 수확하였다.
절반-항체의 정제.
각각의 절반 항체를 맵셀렉트 슈어™ 칼럼 상에서 포획하였다. 이어서, 칼럼을 4 칼럼 부피 (CV)의 하기 완충제로 세척하였다: 50 mM 트리스 pH 8.0, 150 mM NaCl로 이루어진 평형 완충제, 및 0.4M 인산칼륨 pH 7.0으로 이루어진 세척 완충제. 각각의 아암을 pH 2.9의 0.15 M 아세트산나트륨으로 용리하였다.
절반-항체의 발현 및 정제의 상기 기재된 방법은 일반적으로 상이한 이소형의 IgG에 적용가능하다.
실시예 2: 가용화제 & pH 유지
하기 실시예는 중간 pH의 절반-항체의 인큐베이션이 어떻게 입체형태 이동 및 증가된 어셈블리 효율을 구동하였으며, 가용화제, 예컨대 아르기닌 및 히스티딘의 첨가가 어떻게 절반-항체의 중간 pH-유도된 침전을 감소시켰는지에 대해 상세하게 기재한다.
절반-항체 단백질 A 풀은 보통 항체의 비-용매 노출된 표면에 있는 소수성 패치를 함유할 가능성이 있는 CH2 및 CH3 도메인의 노출된 내부 표면으로 인해 본래 불안정하다. 따라서, 4 초과의 pH로 조정되는 경우에 절반-항체 단백질 A 풀은 침전하는 경향이 있다. 본 발명자들은 존재하는 L-아르기닌의 최소 농도 (특정 예에서 ≥50mM)를 사용하여 절반 항체가 pH 조정시에 용액에서 안정화되고 유지된다는 것을 발견하였다. 가용화제, 예컨대 아르기닌의 이러한 첨가는 용액 중에 절반 항체를 유지하고, pH 조정시에 탁도를 감소시키고, 이중특이적 어셈블리 수율을 증가시켰다. 도 3을 참조한다. 아르기닌은 또한 동결 동안 응집 형성으로부터 이중특이적 절반 항체 및 정제된 이중특이적을 보호하였다. 유사한 침전-감소 효과가 또한 히스티딘에서 나타났다.
실시예 1의 단백질 A 칼럼으로부터 회수된 단백질은 본 실시예에서 출발 물질로 사용하였다.
L-아르기닌 (1M, pH 9)을 단백질 A 정제된 단백질에 50-600 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 이후에, 용액을 필요에 따라 1.5M 트리스 염기, pH 11을 사용하여 보다 높은 pH로 적정하였다. 단백질 A 칼럼으로부터의 산성 용리 후에 중간 pH로 상승시키는 단계가 중간 pH 유지로 언급된다.
CH3 도메인 내의 노브 및 홀 돌연변이로 인해 이중특이적 항체는 표준 항체와 비교하여 상이한 정도의 가요성을 갖는다. CH2 및 CH3 도메인의 이러한 특징적인 가요성 및 노출된 내부 표면의 결과로 절반 항체는 pH 조정시에 입체형태 이동이 일어나는 것으로 나타났다. 도 2를 참조한다. 이 실험에서, 노브는 pH를 4 초과의 pH로 조정한 경우에 단량체로부터 비-공유 연결된 동종이량체로의 이동을 경험하였다. 도 2b를 참조한다. 홀은 크기 배제 크로마토그래피 체류 시간을 기반으로 보다 작은 유체역학 반경으로부터 보다 큰 유체역학 반경으로의 입체형태 이동을 경험하였다. 이동은 pH 5에서 발생하기 시작하였으며, pH ≥ 7에서 이동이 완료되었다. 도 2a를 참조한다.
항체의 응집 및 올리고머 상태의 결정을 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 간략하게, 단백질 A 정제된 항체를 정제했고 애질런트(Agilent) HPLC 1200 시스템의 상의 도소(Tosoh) TSK겔 SW2000 칼럼에 적용하였다. 단백질 (이. 콜라이에서 생산된 IgG1 절반-항체)는 0.2M K3PO4 0.25M KCl pH 6.2로 0.5mL/분의 유량으로 용리하였다. 용리된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 영역의 통합에 의해 정량화하였다. 도 2a & b를 참조한다. 이러한 이동은 절반 항체, 특히 CH3 도메인에서 돌연변이를 갖는 노브 및 홀 절반-항체의 보다 높은 가요성으로 인해 pH 변화에 의해 유발된 폴딩 중간체를 나타낼 수 있다.
그러나, 중간 pH 유지는 절반-항체의 침전을 발생시킬 수 있다. 도 3a에 나타난 바와 같이, 아르기닌의 존재는 단백질 A 정제된 IgG1 노브 절반-항체의 pH-유도된 탁도를 감소시켰다. 이러한 실험에서, 1M 아르기닌을 사용하여 이. 콜라이 생산된-IgG1 절반-항체 단백질 A 풀에서 pH를 적정하였다. 최종 아르기닌 농도는 pH를 5.5로 적정하였을 때 약 50 mM, pH 7.5에서는 약 200 mM 및 pH 8.5에서는 약 400 mM이었다 (도 3a 참조). 아르기닌의 존재는 또한 15%까지 노브-인투-홀 이중특이적 항체의 어셈블리 수율을 개선하였다 (데이터는 제시되지 않음).
유사하게, 히스티딘은 침전으로 인한 pH-유도된 탁도를 감소시킬 수 있었다. "노브" IgG1 절반-항체를 맵셀렉트 슈어™ 칼럼 상에서 이. 콜라이 균질물로부터 정제하여 12 g/L 절반-항체의 농도를 갖는 단백질 A 풀을 생성하였다. 1/4 부피의 아르기닌-히드로클로라이드 또는 히스티딘-히드로클로라이드를 200 mM의 최종 첨가제 농도로 첨가하고, 동등 부피의 정제수를 "없음" 대조군을 위해 첨가하였다. 샘플 pH를 진한 수산화나트륨 (50% w/v NaOH 용액 또는 19.1 N)을 적가하여 증가시키고, 데이터 점을 기록하였다. pH는 오리온 로스(Orion Ross) 81-03 마이크로프로브를 사용하여 측정하였다. 용액의 탁도를 해치(Hach) 2100 실험실 탁도 측정기를 이용하여 측정하였다.
도 3b의 데이터는 아르기닌 (200 mM) 및 히스티딘 (200 mM)이 둘 다 이. 콜라이로부터 단리된 IgG1에서 pH-유도된 침전을 감소시켰다는 것을 보여주었다. 요약하여, 중간 pH는 비-특이적 어셈블리를 위해 절반-항체 입체형태 이동을 유도하고, 중간 pH 유지 단계에 첨가된 가용화제는 pH-유도된 침전을 감소시켰다.
실시예 3: 환원
하기 실시예는 환원 조건의 사용이 어떻게 응집을 감소시켜 바람직한 이종다량체, 예를 들어 이중특이적 항체를 보다 많이 형성하는지에 대해 상세하게 기재한다. 예를 들어, 어셈블리 혼합물에 첨가된 글루타티온은 노브-인투-홀 이중특이적 어셈블리에 유리한 약한 환원 조건을 생성한다. 유사한 부류, 예컨대 BMEA (베타-메르캅토에틸아민)의 다른 환원제는 유사한 효과를 나타낼 수 있다.
이중특이적 항체를 형성하는 노브 및 홀 절반 항체의 어셈블리 동안 응집이 발생할 수 있다. 글루타티온 수준의 증가는 어셈블리 동안 응집의 양을 최소화한다. 대조적으로, 고농도의 강한 환원제, 예컨대 DTT는 때때로 응집을 증가시킬 수 있다. 특정한 메카니즘에 제한되지 않고, 영구적으로 디술피드 결합을 감소시키는 대신에 글루타티온은 적절한 디술피드 형성을 위한 촉매로서 작용하는 디술피드를 셔플링하는 것으로 보인다. 강한 환원제를 사용하는 경우에 재산화를 위해 요구되는 바와 같은 완충제 교환은 글루타티온 어셈블리 사용시에 관심 이중특이적 생성물에서 힌지 영역 디술피드를 형성하기 위해 요구되지 않는다. 화학적 재산화제의 첨가는 약한 환원제, 예컨대 글루타티온을 사용하는 경우에 요구되지 않는다.
글루타티온 농도는 어셈블리 혼합물에 존재하는 힌지-함유 폴리펩티드 또는 절반-항체의 양과 관련하여 몰농도로 또는 몰비로 표현될 수 있다. 어셈블리 혼합물에서 단백질 농도에 대한 환원제 대조군의 표적 몰비를 이용하여, 다양한 단백질 농도의 결과로서 과다 환원 또는 과소 환원을 방지한다.
본 실시예에서, 글루타티온을 혼합된 절반-항체에 2 내지 200x 몰 과량으로 첨가하였다. 샘플을 46시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. RP-HPLC (역상-고성능 액체 크로마토그래피)에서, 모든 샘플을 0.1% 트리플루오로아세트산을 사용하여 1.0 mg/ml의 최대 농도로 희석하였다. 단백질 농도를 280 nm에서의 광도 측정에 의해 결정하였다. 0.1% 트리플루오로아세트산의 4개의 샘플을 샘플 분석 전에 주사하였다. 이는 칼럼이 완전히 평형화되는 것을 보장하였다. 단백질 A 정제된 이. 콜라이-생산 IgG1 절반-항체를 애질런트 HPLC 1200 시스템 상에서 포로스(Poros) R2/20 2.1mmD x 20mmL에 적용하였다. 단백질을 38 - 49% 완충제 A → 0.09% 트리플루오로아세트산 80% 아세토니트릴 (완충제 B)의 선형 구배로 20분 내에 0.5mL/분의 유량으로 용리하였다. 용리된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 영역의 통합에 의해 정량화하였다. 도 4a에 나타난 바와 같이, 이중특이적 형성의 수준은 증가된 글루타티온:Ab 몰비에 따라 증가하였다. 도 4a를 참조한다.
항체의 응집 및 올리고머 상태의 결정을 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 수행하였다. 간략하게, 단백질 A 정제된 이. 콜라이-생산 IgG1 절반-항체를 애질런트 HPLC 1200 시스템 상에서 도소 TSK겔 SW2000 칼럼에 적용하였다. 단백질을 0.2M K3PO4 0.25M KCl pH 6.2를 사용하여 0.5mL/분의 유량으로 용리하였다. 용리된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 영역의 통합에 의해 정량화였다. 관찰된 150kD 피크는 이중특이적 항체의 형성으로 인한 것으로 확인되었다. 도 4b를 참조한다.
관찰할 수 있는 바와 같이 원치않는 단량체 (즉, 절반 항체, 노브 또는 홀) 및 동종이량체로부터 이종다량체, 즉 이중특이적 항체로의 피크의 이동이 있다 (도 4a 및 b). 요악하여, 데이터는 절반-항체에 대한 글루타티온의 몰비의 증가가 응집을 감소시키고 이중특이적 형성을 개선한다는 것을 보여준다 (도 4b).
실시예 4: 온도
본 실시예는 절반-항체의 안정성 및 이종다량체의 어셈블리에 대한 온도의 효과를 설명한다.
절반-항체의 용액의 온도는 어셈블리의 비율에 상당한 영향을 미쳤다. 고온에서 이. 콜라이-생산 IgG1 절반-항체의 개선된 어셈블리의 한 예는 도 5a에 제시된다.
이중특이적 어셈블리에 대한 온도의 효과를 보여주는 또 다른 예는 도 5b에 제시된다. 이 실험에서, 2개의 IgG1 절반-항체를 이. 콜라이에서 생산하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 단백질 A 상에서 정제하였다. 절반 항체를 합하고, 가열 및/또는 중간 pH 유지의 존재 또는 부재 하에 상이한 조건 하에서 이중특이적 어셈블리를 시험하기 위해 4개의 분취액으로 나누었다.
도 5b에 나타난 바와 같이, 가변 조건 하에 글루타티온의 200 몰 과량은 이중특이적 IgG1 항체 형성의 비율을 개선하였다. 대조군 조건 (실온, 약 20℃, 절반-항체는 pH 4에서 유지되고, 중간 pH 유지는 없음)은 보다 느린 속도일지라도 이중특이적의 어셈블리를 허용하였다. 단백질 A 정제된 절반-항체를 중간 pH (노브 절반-항체의 경우에 pH 5; 홀 절반-항체의 경우에 pH 7)에 실온에서 16시간 동안 유지하는 것은 보다 높은 온도로 올리지 않고 이중특이적 항체 형성의 비율을 개선하였다 (도 5b에서 어셈블리 혼합물이 pH 8.5에서 "pH 최적화됨"). 중간 pH 유지 단계 없이 37℃로 온도를 증가시키는 것은 대조군에 비해 이중특이적 항체 어셈블리의 비율을 증가시켰고, 이는 pH 유지 단계에 비해 및 실온에서 수행된 어셈블리보다 더 빨랐다. 그러나, 가장 빠른 어셈블리 비율은 단백질 A 정제된 절반-항체를 중간 pH (상기와 같음)에서 유지한 후에 승온 (즉, 37℃)에서 pH 8.5에서 어셈블리한 경우에 관찰되었다. 이러한 조건 하에, 약 80%의 이중특이적 어셈블리가 오직 약 6시간 내에 달성되었다 (도 5b). 요약하여, 전체 어셈블리 비율은 가열에 의해 증가하였으며, pH 유지 및 가열은 어셈블리에 대해 상승작용 효과를 나타내었다.
열-증진된 어셈블리가 또한 IgG4 이중특이적 항체에서 관찰되었다. 도 6b의 결과는 PVP 및 히스티딘의 존재 하에 이. 콜라이 배양물에 의해 생산된 가열된 IgG4 절반-항체가 이. 콜라이-생산된 IgG1 절반-항체의 어셈블리와 유사한 어셈블리 결과에 도달하였다는 것을 보여준다. 이중특이적의 양은 상기 기재된 바와 같이 역상 HPLC를 이용하여 분석하였다. 데이터는 함께 가열이 비-특이적 형성을 용이하게 하였다는 것을 보여준다.
실시예 5: 안정화제
하기 실시예는 안정화제가 어떻게 어셈블리 및/또는 중간 pH 유지 동안 가열 및/또는 상승된 pH의 결과로서 응집을 감소시킬 수 있는지를 상세하게 기재한다.
폴리비닐피롤리돈 (PVP)는 피롤리돈 기를 갖는 수용성 비하전 중합체이다. PVP는 가열된 어셈블리 동안 응집을 감소시켰다. 특정한 메카니즘에 제한되지 않고, PVP는 아마도 이중특이적의 소수성 패치와 상호작용함으로써 이중특이적의 폴딩 중간체를 안정화시키거나 절반 항체를 응집으로부터 보호하는 작용을 할 수 있다.
응집체 형성에 대한 PVP의 효과를 실시예 3에 기재된 바와 같은 조건 하에 SEC를 이용하여 분석하였다. PVP의 첨가는 어셈블리 풀에 존재하는 고분자량 종 (HMWS)을 PVP를 첨가하지 않은 경우의 4% NMWS와 비교하여 4% PVP (w/v)를 갖는 12% HMWS로 최소화하였다. 도 6a를 참조한다. 모든 샘플은 200 mM 아르기닌의 존재 하에 가열된 이. 콜라이-생산된 IgG1이었다.
다음에, IgG4 이중특이적 항체의 어셈블리를 시험하였다. 도 6b에 나타난 바와 같이, PVP 및 히스티딘의 존재 하에 가열된 어셈블리는 이. 콜라이-생산된 IgG4 이중특이적 어셈블리를 도 5a에 제시된 이. 콜라이에 의해 생산된 IgG1의 가열된 어셈블리와 유사한 수준으로 크게 개선하였다. 아르기닌은 가용화제 및 pH 적정제로서 가열된 샘플 및 실온 샘플 둘 다에 존재하였다. PVP 뿐만 아니라, 또 다른 안정화제 히스티딘을 가열된 중간 pH 유지 단계 전에 첨가하여 이 단계 동안 절반-항체를 안정화시켰다. 이러한 결과는 PVP 및 히스티딘이 둘 다 IgG4 이중특이적 어셈블리를 IgG1 이중특이적 어셈블리와 유사한 수준으로 개선하였다는 것을 보여준다 (도 6b를 5b와 비교함).
도 6c는 PVP가 IgG4 이중특이적 항체의 가열된 어셈블리 동안 HMWS의 형성을 최소화하는 또 다른 예를 제시한다.
절반-항체 단백질 A 풀의 가열은 중간 pH에서의 인큐베이션시에 절반 항체의 입체형태 이동을 가속화하였다. 그러나 가열은 이. 콜라이에서 생산된 IgG4 절반-항체로부터 특히 IgG4 노브 및 홀 이중특이적 항체 어셈블리에 대한 응집을 유발할 수 있다. 따라서, IgG4 절반-항체가 어셈블리 동안 가열된 경우에 추가의 가용화제 및/또는 안정화제를 첨가하였다.
이. 콜라이 IgG4 홀 절반-항체의 입체형태 이동은 실온에서의 인큐베이션 48시간 후에 검출되었다. IgG4 홀 절반-항체를 37℃에서 인큐베이션한 경우에, 입체형태 이동이 약 3시간 내에 검출되었다 (데이터는 제시되지 않음). 그러나, 가열은 SEC에 의해 결정된 바와 같이 응집의 증가로 이어졌다. 도 7, 좌측 패널을 참조한다. 이 실험에서, 히스티딘을 가열된 중간 pH 유지 단계 동안 첨가하여 절반-항체의 응집의 감소에 대한 그의 효과를 시험하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 가열 동안 히스티딘의 존재는 절반 항체의 입체형태 이동에 영향을 미치지 않고 11% 고분자량 종 (HMWS, 히스티딘 없음)에서 6% HMWS (200 mM 히스티딘)으로 응집의 수준을 최소화하였다. 따라서, 결과는 안정화제가 비-특이적 항체의 어셈블리 뿐만 아니라 절반-항체의 중간 pH 유지 둘 다 동안 응집체 형성을 감소시켰다는 것을 보여준다.
실시예 6 - 어셈블리
본 실시예는 2가지 예시적인 이뮤노글로불린 이소형, 즉 IgG1 및 IgG4에 대한 프로토콜을 제공한다. 절반-항체를 2가지 상이한 숙주 세포 중 하나, 즉 이. 콜라이 또는 CHO에서 생산하였다. 본원에 기재된 방법은 동일한 또는 다른 공급원에서 생산된 다른 항체 이소형에 적용될 수 있는 것으로 이해된다. 당업계의 지식 및 본 출원에 개시된 교시에 기초하여 통상적인 실험에 의해 프로토콜을 변경하는 것은 당업자의 능력 내에 있다.
또한, 제1 숙주 세포 (예를 들어, CHO)에서 생산된 절반-항체를 포함하는 항체의 형성은 제2 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이)에서 생산된 상보적 절반-항체와 어셈블리될 수 있는 것으로 이해된다 (데이터는 제시되지 않음). 따라서, 예를 들어, CHO에서 생산된 노브 절반-항체는 이. 콜라이에서 생산된 홀 절반-항체와 어셈블리될 수 있거나 또는 그 반대의 경우도 가능하다.
본 실시예에 기재된 4가지 모든 어셈블리 절차는 4시간 후에 안정상태에 도달하는 어셈블리를 생성하였고, 어셈블리 동안 10% 미만의 응집체 및 최소 응집을 생산하였다.
A. 이. 콜라이로부터의 IgG1:
절반-항체의 입체형태 변화: 단백질 A 풀이 7 미만의 pH인 경우에, 양쪽 절반-항체 풀의 pH를 1M 아르기닌 (pH 9)을 사용하여 pH 7로 조정하고, 양쪽 풀을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 대안적으로, 풀을 실온에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 풀이 이미 48시간 이상 동안 pH 7에 있었다면, 이 단계는 생략한다. 용액을 pH 7로 만들기 위해 첨가된 아르기닌의 양을 정량화하였다.
(가온 중인) 풀을 합하고, pH를 1M 아르기닌 (pH 9)을 사용하여 pH 8.5로 조정하였다. 이 단계에 첨가된 아르기닌의 양을 정량화하였다.
2M 아르기닌 (pH 8.5)을 아르기닌의 최종 농도가 0.5 M일 때까지 첨가하였다.
0.5 M 아르기닌 (최종 pH 8.5) 중 200 mM 환원된 글루타티온 (GSH)을 GSH:Ab 비가 200X일 때까지 첨가하였다 (예: 절반-항체의 각각의 mg에 대해 6.88 μL의 글루타티온 용액을 첨가함).
글루타티온 절반-항체 용액을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하여 절반-항체의 이중특이적 항체로의 어셈블리를 허용하였다.
B. CHO로부터의 IgG1:
이. 콜라이에 대해 상기 기재된 바와 같이 어셈블리하였다. 중간 pH 유지를 위해 pH를 pH 7 이상으로 올릴 필요는 없을 것이다. 글루타티온 첨가 후의 어셈블리 시간은 2시간 후에 완료에 도달할 수 있다.
C. CHO로부터의 IgG4:
상기 (CHO로부터의 IgG1)와 동일한 조건 하에 어셈블리하였다. 히스티딘 및 PVP는 요구되지 않을 수 있다.
D. 이. 콜라이로부터의 IgG4:
상기 프로토콜을 이용한 이. 콜라이로부터의 IgG4의 어셈블리는 높은, 즉 ~35%의 응집체 수준을 발생시켰다. 이는 어셈블리 조건의 변형을 필요로 한다:
0.2 M 히스티딘 및 50 mM 아르기닌을 함유하는 단백질 A 풀 조성물이 허용되는 결과를 나타낸 것으로 결정되었다 (데이터는 제시되지 않음). 따라서, 최종 결과를 제공하기 위한 여러 방법이 연구되었고, 허용되는 결과를 제공하는 것으로 결정되었다.
제1 방법은 0.2 M His & 50 mM Arg를 함유하도록 단백질 A 정제 동안 변경된 용리액 (pH 3) 및 세척 완충제 (pH 7)를 사용하였다. 이는 0.2M His 및 50 mM Arg, pH 4를 함유하는 최종 단백질 A 풀을 생성하였고, 이어서 이를 1.5M 트리스 염기 (pH 11)를 사용하여 pH 8로 적정하였다.
제2 대안적 방법은 히스티딘 HCl의 0.8M 용액 (0.8 M의 용해도를 가짐)을 활용하였다. 1/3 부피의 히스티딘 HCl을 0.2M His의 최종 농도에 도달하도록 단백질 A 풀(들)에 첨가하였다. 이어서, 1/40 부피의 2M Arg를 첨가하였다.
제3 대안적 방법은 0.2 M His & 50 mM Arg 완충제 (바람직하게는, pH 8)로 단백질 A 풀의 완충제를 교환하는 것이다.
최종 대안적 방법은 히스티딘을 단백질 A 풀(들) (31.03 g/L)에 직접 첨가한 후에, 1/40 부피의 2M Arg를 첨가하는 것이다.
0.2M 히스티딘 및 50 mM Arg 중 스펙트럼 PVP K-15의 1/4 부피의 20% w/v 용액을 단백질 A 풀(들)에 첨가하였다.
PVP가 또한 낮은 글루타티온 조건 하에 IgG1에 대한 어셈블리 동안 응집을 최소화시킨다는 것에 주목하였다.
절반-항체의 입체형태 변화: 단백질 A 풀(들)의 pH를 0.2M 히스티딘 및 50 mM Arg 및 4% PVP K-15 (pH 11)를 포함하는 1.5M 트리스 염기를 이용하여 pH 8.0으로 조정하고, 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 대안적으로, 풀(들)을 48시간 동안 실온에서 인큐베이션할 수 있다.
0.2 M 히스티딘, 4% PVP, 50mM 아르기닌 중 200 mM 환원된 글루타티온 (GSH); 최종 pH 8.0을 GSH:Ab 비가 200X (예: 절반-항체의 각각의 mg에 대해 6.88 μL의 글루타티온 용액을 첨가함)일 때까지 참가하였다. 절반-항체 풀을 합하지 않은 경우에 이들을 이 시점에 합하였다.
모든 절반-항체는 이중특이적 항체의 형성을 허용하기 위해 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이 시점에서 이중특이적 항체 퍼센트는 안정상태에 도달하였다.
이중특이적 항체의 양이 안정상태에 도달하면 용액은 이후의 크로마토그래피 단계 상에서의 가공을 위해 저온에 저장되거나 보다 낮은 pH로 조정될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 치료 단백질, 예컨대 이중특이적 항체의 제조에서의 용도를 발견한다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적 목적을 위한 것이고, 이를 고려한 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이고, 본원의 취지 및 범위, 및 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 공개, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체내용이 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL. <120> IMPROVED ASSEMBLY OF BISPECIFIC ANTIBODIES <130> P4764R1-WO <150> 61/676837 <151> 2012-07-27 <150> 61/560704 <151> 2011-11-16 <150> 61/546503 <151> 2011-10-12 <150> 61/545863 <151> 2011-10-11 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is any amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X is any amino acid residue <400> 1 Arg Xaa Arg Xaa Arg Arg 1 5

Claims (24)

  1. a. 단백질 A 정제된 제1 힌지-함유 폴리펩티드를 수득하며, 여기서 제1 힌지-함유 폴리펩티드는 이종이량체화 도메인을 포함하는 것인 단계;
    b. 단백질 A 정제된 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 수득하며, 여기서 제2 힌지-함유 폴리펩티드는 이종이량체화 도메인을 포함하는 것인 단계;
    c. 각각의 힌지-함유 폴리펩티드의 pH를 pH 4 내지 9로 조정하는 단계;
    d. 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 혼합하여 어셈블리 혼합물을 수득하는 단계;
    e. 어셈블리 혼합물에 몰 과량의 약한 환원제를 첨가하는 단계; 및
    f. 어셈블리 혼합물을 인큐베이션하여 제1 및 제2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 단백질을 형성하는 단계
    를 포함하는, 이종다량체 단백질을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 및/또는 제2 힌지-함유 폴리펩티드가 절반-항체, 이뮤노어드헤신 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 제1 및/또는 제2 힌지-함유 폴리펩티드가 절반-항체인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제1 및/또는 제2 힌지-함유 폴리펩티드가 Fc 성분을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 가용화제의 존재 하에 단계 c에서 제1 및/또는 제2 힌지-함유 폴리펩티드가 pH 4-9로 조정되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단계 c에서 각각의 힌지-함유 폴리펩티드의 pH가 pH 5-8로 조정되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, pH를 혼합 후에 조정하는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 어셈블리 혼합물을 15℃ 내지 39℃의 온도에서, 바람직하게는 37℃에서 30분 이상 동안 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 어셈블리 혼합물이 pH 8에서 인큐베이션되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 단계 f에서 어셈블리 혼합물이 -200 내지 -600 mV, 보다 바람직하게는 -300 내지 -500 mV, 가장 바람직하게는 약 -400 mV의 산화 전위를 갖는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 약한 환원제가 GSH, 베타-메르캅토에틸아민, GSH/GSSG, 시스테아민/시스타민, 글리실시스테인 및 베타-메르캅토에탄올로부터 선택된 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 약한 환원제가 50-200X 몰 과량으로 첨가되는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 약한 환원제가 100-300X 몰 과량으로 첨가되는 것인 방법.
  14. 제1항, 제3항, 제6항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약한 환원제가 GSH이고 GSH가 어셈블리 혼합물에 50-200X 몰 과량으로 첨가되는 것인 방법.
  15. 제1항, 제3항, 제6항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약한 환원제가 GSH이고 GSH가 어셈블리 혼합물에 100-300X 몰 과량으로 첨가되는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 아르기닌, 히스티딘 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)인 안정화제의 존재 하에 어셈블리 혼합물이 15℃ 내지 39℃의 온도에서, 바람직하게는 37℃에서 인큐베이션되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 안정화제가 40% (w/v)까지 첨가되는 PVP인 방법.
  18. 제1항, 제3항, 제6항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이종다량체화 도메인이 노브(knob), 홀(hole), 류신 지퍼, 코일드 코일, 또는 정전기적 상호작용을 형성할 수 있는 극성 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 제1 힌지-함유 폴리펩티드가 노브를 포함하고 제2 힌지-함유 폴리펩티드가 홀을 포함하는 것인 방법.
  20. 제8항에 있어서, 제1 힌지-함유 폴리펩티드가 노브를 포함하고 제2 힌지-함유 폴리펩티드가 홀을 포함하는 것인 방법.
  21. 제12항에 있어서, 제1 힌지-함유 폴리펩티드가 노브를 포함하고 제2 힌지-함유 폴리펩티드가 홀을 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항, 제3항, 제6항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지-함유 폴리펩티드가 박테리아 세포, 효모 세포, 바큘로바이러스 또는 포유동물 세포에 의해 생산되는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 힌지-함유 폴리펩티드가 박테리아 세포, 바람직하게는 이. 콜라이 세포에 의해 생산되는 것인 방법.
  24. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 노브가 T366W 치환을 포함하고 홀이 T366S, L368A 및 Y407V 치환을 포함하는 것인 방법.
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