MX2009002576A - Lavado de arginina en purificacion de proteina utilizando cromatografia de afinidad. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con métodos para aislar un producto y/o reducir la turbidez y/o impurezas de un fluido de carga que comprende el producto y una o más impurezas al pasar el fluido de carga a través de un medio seguido de por lo menos una solución de lavado que comprende arginina o un derivado de arginina y recolectar el producto utilizando una solución de elución. La invención se relaciona adicionalmente con un producto preparado utilizando un método como se describe aquí.

Description

LAVADO DE ARGININA EN PURIFICACION DE PROTEINA UTILIZANDO CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de acuerdo con el 35 U.S.C. §1 19 (e) para la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 60/843,084 presentada en Septiembre 8, 2006, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

CAMPO TÉCNICO Esta solicitud se relaciona con la purificación de proteínas. En particular, esta solicitud se relaciona con métodos para purificar una proteína unida a un medio al pasar por lo menos una solución de lavado que contiene arginina o un derivado de arginina a través del medio, y recolectar la proteína purificada.

ANTECEDENTE Con el advenimiento de la tecnología de proteínas recombinantes, se puede producir una proteína de interés utilizando líneas de células anfitrionas procarióticas o eucarióticas cultivadas con ingeniería para expresar la proteína. El uso de la proteína recombinante deseada para aplicaciones farmacéuticas es generalmente contingente al ser capaz de recuperar confiablemente los niveles adecuados de proteína a partir de impurezas tal como proteínas de células anfitrionas, variantes de proteínas, y compuestos del medio de cultivo.

Se diseñan métodos de purificación de proteína convencionales para separar la proteína de interés de impurezas basado en diferencias de tamaño, carga, solubilidad, y grado de hidrofobicidad. Tales métodos incluyen los métodos cromatográfícos tales como cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de ¡ón, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad de metal inmovilizado, y cromatografía de hidroxiapatita. Estos métodos emplean frecuentemente un medio de separación que se puede diseñar para adherir selectivamente la proteína de interés o las impurezas. En el modo unido-eluido, la proteína deseada se une selectivamente al medio de separación y se eluye diferencialmente del medio por diferentes disolventes. En el modo de flujo pasante, las impurezas se unen específicamente al medio de separación mientras que la proteína de interés no, permitiendo así la recuperación de la proteína deseada en el "flujo pasante".

Los métodos actuales para la purificación de las proteínas, tal como anticuerpos, incluyen dos o más etapas cromatográficas. Por ejemplo, la primera etapa en el protocolo de purificación de proteína puede involucrar una etapa de cromatografía de afinidad que utiliza una interacción específica entre la proteína de interés y un reactivo de captura inmovilizado. Los adsorbentes de Proteína A son particularmente útiles para la captura por afinidad de proteínas tal como anticuerpos que contienen una región Fe. Sin embargo, existen numerosas desventajas para utilizar cromatografía de Proteína A para la purificación de proteína. En algunos casos, el escape del agente de captura de Proteína A resulta en contaminación del producto de proteína eluido, mientras que en otros casos, la captura por afinidad no separa las variantes de proteína, tal como formas agregadas de la proteína, de la proteína de interés. Adicionalmente, niveles variantes de turbidez y/o precipitados se pueden formar en el grupo de elución de Proteína A siguiendo neutralización del pH. Esta turbidez y/o precipitación puede conducir a que un producto significativo pierda en el grupo de elución de proteína neutralizada. De acuerdo con lo anterior, subsiste la necesidad de métodos de purificación que reduzcan las pérdidas de producto y mejoren la pureza del producto en el grupo de elución.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con métodos, en parte, para aislar un producto de un fluido de carga que contiene un producto, tal como un anticuerpo y una o más impurezas al pasar el fluido de carga a través de un medio que une el producto, seguido por pasar por lo menos un solución de lavado que contiene arginina o un derivado de arginina a través del medio, y recolectar el producto utilizando una solución de elución.

En un aspecto, se proporciona un método para aislar un producto, el método comprende proporcionar un fluido de carga que comprende un producto y una o más impurezas y poner en contacto el fluido de carga con un medio que puede unir el producto bajo condiciones adecuadas para unir el producto, obteniendo por lo tanto un medio unido. El método comprende adicionalmente poner en contacto el medio unido con una o más soluciones de lavado que comprenden arginina o un derivado de arginina, obteniendo por lo tanto un medio de lavado. El método comprende adicionalmente poner en contacto el medio de lavado con una solución de elución bajo condiciones adecuadas para eluir el producto. El eluido que comprende el producto se puede recolectar luego. El producto también se puede purificar y/o formular adicionalmente para uso terapéutico.

En algunas modalidades de este aspecto, el producto es una proteína, por ejemplo, una proteína terapéutica. En ciertas modalidades, el producto es un anticuerpo. En modalidades específicas, el anticuerpo se dirige contra o surge para uno de lo siguiente: Factor de Diferenciación y Crecimiento-8 (GDF-8), interleuquina-13 (IL-13), interleuquina-22 (IL-22), A-Beta, Receptor para los productos Finales de Glucación Avanzada (RAGE), y 5T4. En algunas modalidades, el producto es un fragmento de unión a antígeno. En algunas modalidades el producto es una proteína de fusión. En modalidades específicas, el producto es una proteína de fusión Ig. En ciertas modalidades, el producto es una proteína de fusión Fe, un inmunoconjugado, una citoquina, una interleuquina, una hormona, o una enzima terapéutica.

En algunas modalidades de este aspecto, el medio es una matriz, una resina o una columna de cromatografía. En modalidades específicas, el medio es una columna de cromatografía de Proteína A, por ejemplo, una columna de Proteína A recombinante, o una columna de cromatografía de Proteína G, por ejemplo, una columna de Proteína G recombinante.

En algunas modalidades de este aspecto, la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es de aproximadamente 0.1 M a aproximadamente 2.0 M. En ciertas modalidades, la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es de aproximadamente 0.1 M a aproximadamente 0.9 M. En una modalidad, la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es de aproximadamente 1 M. En ciertas otras modalidades, la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es de aproximadamente 1.1 M a aproximadamente 2.0 M. En aún otras modalidades, la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es de aproximadamente 0.5 M a aproximadamente 1.0 M. En aún otras modalidades, la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es mayor de aproximadamente 0.5 M y menor de aproximadamente 2.0 M. En otra modalidad, la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es mayor de aproximadamente 0.5 M y menor de aproximadamente 1.0 M. En modalidades específicas, el derivado de arginina es acetil arginina, agmatina, ácido argínico, N-alfa-butiroil-L-arginina, o N-alfa-pivaloil arginina.

En algunas modalidades de este aspecto, el pH de la solución de lavado es de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 8.0. En ciertas modalidades, el pH de la solución de lavado es mayor de aproximadamente 4.5 y menor de aproximadamente 8.0. En algunas modalidades, el pH de la solución de lavado es aproximadamente 7.5.

En algunas modalidades de este aspecto, la solución de elución comprende uno de: cloruro de sodio, arginina o un derivado de arginina, glicina, HEPES, y ácido acético. En ciertas modalidades, el amortiguador de elusión tiene un pH de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 4.0. En una modalidad específica, el amortiguador de elusión tiene un pH de aproximadamente 3.0.

En ciertas modalidades de este aspecto, una o más de las impurezas es una proteína de célula anfitriona, un ácido nucleico, una variante de producto, una endotoxína, una Proteína A, Proteína G, un virus o un fragmento de éste, un componente del medio de cultivo celular, o variante de producto, por ejemplo, producto ligado a subdisulfuro, producto de bajo peso molecular, producto de alto peso molecular, producto truncado y/o producto deformado. En algunas modalidades, en donde se une por lo menos una impureza al producto, el medio unido se pone en contacto con una o más soluciones de lavado a través del medio unido removiendo por lo tanto por lo menos una impureza que se une al producto.

En ciertas modalidades de este aspecto, el eluido comprende un producto aislado y la pureza del producto aislado de incrementa comparado con un método correspondiente en el cual menos de aproximadamente 0.1 M o derivado de arginina se utiliza en una solución de lavado. En algunas modalidades, el eluido comprende un producto aislado, y la proporción del producto a por lo menos una impureza se incrementa comparado con un método correspondiente en el que ninguna cantidad detectable de arginina o derivado de arginina se utiliza en una solución de lavado. En ciertas modalidades, el eluido comprende un producto, en donde la proporción del producto a la proteína de células anfitrión se incrementa en comparación con un método correspondiente en el que menos de aproximadamente 0.1 M de arginina o derivado de arginina se utiliza en una solución de lavado. En todavía modalidades adicionales, el eluido comprende un producto, en donde la proporción del producto a la proteína de célula anfitriona se incrementa comparado con un método correspondiente en el que no se utiliza ninguna cantidad detectable de arginina o derivado de arginina en una solución de lavado.

En otra modalidad de este aspecto, la turbidez del eluido se reduce en comparación con un método correspondiente en el que menos de aproximadamente 0.1 M de arginina o derivado de arginina se utiliza en una solución de lavado. En algunas modalidades, la turbidez del eluido se reduce comparado con un método correspondiente en el que no se utiliza ninguna cantidad de arginina o derivado de arginina en una solución de lavado.

En otro aspecto, se proporciona un método para aislar un anticuerpo. El método comprende proporcionar un fluido de carga que comprende el anticuerpo y una o más impurezas, y poner en contacto el fluido de carga con un medio de Proteina A o un medio de Proteína G, en donde el medio se puede unir al anticuerpo bajo condiciones adecuadas para unir el anticuerpo, resultando por lo tanto en un medio unido. El método comprende adicionalmente poner en contacto el medio unido con una o más soluciones de lavado, en donde por lo menos una solución de lavado comprende arginina o un derivado de arginina en una concentración mayor de 0.5 M y menor de aproximadamente 1.0 M, proporcionando por lo tanto un medio de lavado. El método comprender adicionalmente poner en contacto el medio de lavado con una solución de elución bajo condiciones adecuadas para eluir el anticuerpo; y recolectar un eluido que comprende el anticuerpo. Como un resultado de practicar este método, la proporción del anticuerpo a la proteína de célula anfitriona en el eluido se incrementa y el eluido tiene turbidez reducida comparado con un eluido recuperado en un método correspondiente en el que no se utiliza ninguna cantidad detectable de arginina en una solución de lavado.

En algunas modalidades de este aspecto, el Ph de la solución de lavado es mayor de aproximadamente 5.0 y menor de aproximadamente 8.0.

En otro aspecto, se proporciona un método para reducir la turbidez en un eluido que comprende un producto. El método comprende proporcionar un fluido de carga que comprende el producto y una o más impurezas, y poner en contacto en fluido de carga con un medio, en donde el medio puede unir al producto bajo condiciones adecuadas para unir el producto, proporcionando por lo tanto un medio unido. El método comprende adicionalmente poner en contacto el medio unido con una o más soluciones de lavado, en donde por lo menos una solución de lavado comprende arginina o un derivado de arginina, proporcionando por lo tanto un medio de lavado. El método comprende adicionalmente poner en contacto al medio de lavado con una solución de elución bajo condiciones adecuadas para eluir el producto, generando por lo tanto un eluido que comprende el producto, y neutralizar el pH del eluido. El método proporciona un eluido que tiene turbidez reducida comparado con un método correspondiente en el que ningún derivado de arginina o arginina detectable se utilizan en una solución de lavado.

En algunas modalidades de este aspecto, el pH del eluido neutralizado está entre aproximadamente 6.5 y aproximadamente 8.2. En ciertas modalidades, la solución de lavado comprende arginina o un derivado de arginina en una concentración mayor de 0.5 M y menor de aproximadamente 1 .0 M. En algunas modalidades, el pH de la solución de lavado es mayor de 5.0 y menor de aproximadamente 8.0. En algunas modalidades de este aspecto, el método no comprende filtración absortiva corriente arriba aniónica. En ciertas modalidades, el producto en el eluido se purifica adicionalmente y/o se formula para uso terapéutico.

En otro aspecto, se proporciona un método para reducir la turbidez e impurezas en un eluido que comprende un producto. El método comprende proporcionar un fluido de carga que comprende un producto y una o mas impurezas, y poner en contacto el fluido de carga con un medio, en donde el medio se puede unir al producto bajo condiciones adecuadas para unir el producto, proporcionando por lo tanto un medio unido. El método comprende adicionalmente poner en contacto el medio unido con una o mas soluciones de lavado, en donde por lo menos una solución de lavado comprende arginina o un derivado de arginina, proporcionando por lo tanto un medio de lavado. El método comprende adicionalmente poner en contacto el medio de lavado con una solución de elución bajo condiciones adecuadas para eluir el producto, generando por lo tanto un eluido que comprende el producto, y neutralizarlo. El método proporciona un eluido, en donde la proporción del producto a por lo menos una impureza en el eluido se incrementa y en donde el eluido tiene turbidez reducida comparado con un método correspondiente en el que no se utiliza ninguna cantidad detectable de arginina o derivado de arginina en una solución de lavado.

En algunas modalidades de este aspecto, el pH del eluido neutralizado está entre aproximadamente 6.5 y aproximadamente 8.2. En ciertas modalidades, la solución de lavado comprende arginina o un derivado de arginina en una concentración mayor de 0.5 M y menor de aproximadamente 1.0 M. En algunas modalidades, el pH de la solución de lavado es mayor de 5.0 y menor de aproximadamente 8.0. En algunas modalidades de este aspecto, es método no comprende filtración absortiva corriente arriba aniónica. En ciertas modalidades el producto en el eluido de purifica adicionalmente y/o se formula para uso terapéutico. La invención también se relaciona con varios métodos y productos como se menciona en las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos científicos y técnicos utilizados aquí tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por el experto en la técnica a la que pertenece ésta invención. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí en la práctica o prueba de la presente invención, se describen adelante métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas aquí se incorporan como referencia en su totalidad. Adicionalmente, los materiales, métodos, y ejemplos son sólo ilustrativos y no están destinados a ser limitantes.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada, dibujos, y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica de barras que describe los resultados de experimentos que ensayan el porcentaje de recuperación (%), turbidez, HCP ("proteínas de células anfitrionas") y LRV ("valor de remoción log") de GDF-8 mAb-1 luego de una etapa de columna para Proteína A.

La Figura 2 es una gráfica de barras que describe los resultados de experimentos que ensayan el porcentaje de recuperación (%), turbidez, HCP y LRV de GDF-8 mAb-2 luego de una etapa de columna para Proteína A.

La Figura 3 es una gráfica de barras que describe los resultados de experimentos que ensayan el porcentaje de recuperación (%), turbidez, HCP y LRV de IL-13 mAb-1 luego de una etapa de columna para Proteína A.

La Figura 4 es una gráfica de barras que describe los resultados de experimentos que ensayan el porcentaje de recuperación (%), turbidez, HCP y LRV de IL-22 mAb luego de una etapa de columna para Proteína A.

La Figura 5 es una gráfica de barras que describe los resultados de experimentos que ensayan el porcentaje de recuperación (%), turbidez, HCP y LRV de RAGE mAb luego de una etapa de columna para Proteína A.

La Figura 6 es una gráfica de barras que describe los resultados de experimentos que ensayan la turbidez IL-13 mAb-2 luego de una etapa de columna para Proteína A.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para purificar y recuperar productos a partir de un fluido de carga que contiene una o más impurezas que utilizan un procedimiento que incluye un lavado de arginina o lavado con un derivado de arginina. La invención se puede aplicar a preparación a gran escala de proteínas para propósito terapéutico y/o diagnóstico.

A. Definiciones Con el fin de que la presente invención se puede entender más fácilmente, se definen aquí ciertos términos utilizados. Se establecen definiciones a través de la descripción detallada.

El término "producto" se refiere a una molécula producida por humano o por un proceso natural. Un "producto" puede incluir, sin limitación, una proteína, por ejemplo, una proteína terapéutica, que incluye una proteína de fusión Ig que incluye, proteínas que contienen Fe. Otras proteínas incluyen un inmunoconjugado, una citoquina, una interleuquina, una hormona, una enzima terapéutica, un virus, un suero terapéutico, una toxina, una antitoxina, una vacuna, un componente sanguíneo o derivado, o cualquier producto análogo. La proteína puede ser una proteína secretada. La proteína puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, un receptor soluble, una fusión de receptor, una citoquina, un factor de crecimiento, una enzima, o un factor de coagulación. Como se utiliza aquí, los términos "producto" y "proteína de interés" se utilizan intercambiablemente.

El término "proteína" como se utiliza aquí, se refiere a uno o más polipéptidos que pueden funcionar como una unidad. El término "polipéptido" como se utiliza aquí, se refiere a una cadena secuencial de aminoácidos ligados por vía de enlaces péptído.

Una proteína terapéutica puede ser, por ejemplo, una proteína secretada Las proteínas terapéuticas incluyen anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, receptores solubles, fusiones de receptor, citoquinas, factores de crecimiento, enzimas o factores de coagulación, algunos de los cuales se describen en más detalle aquí adelante. La anterior lista de proteínas es únicamente de naturaleza de ejemplo, y no está destinada a ser una limitación. Una persona medianamente versada en la técnica entenderá que cualquier proteína se puede utilizar de acuerdo con la presente invención y será capaz de seleccionar la proteína particular a ser producida con base en lo que se necesite. El término "medio de cultivo condicionado" como se utiliza aquí se refiere al sobrenadante que se genera de la remoción de las células y los residuos celulares mediante un método de separación, tal como centrifugación y/o microfiltración a partir del medio de cultivo celular que se ha expuesto a las células anfítrionas, que pueden secretar polipéptidos recombinantes deseados de interés. El medio condicionado puede contener, por ejemplo, el polipéptido recombínante secretado, o producto de interés; nutrientes seleccionados (por ejemplo vitaminas, aminoácidos, cofactores y minerales); complementos/factores de crecimiento adicionales que incluyen insulina; y exógenos adicionales, o proteínas de célula anfitriona e impurezas. El término medio de cultivo condicionado incluye medio condicionado clarificado, medio condicionado filtrado y medio de cultivo celular condicionado.

El término "fluido de carga" s refiere a un líquido que contiene el producto a ser aislado y una o más impurezas. Un fluido de carga entra en contacto con un medio (por ejemplo, se pasa a través de un medio) bajo condiciones de operación de la invención descrita adelante.

El término "impureza" se refiere a cualquier molécula externa o indeseable que está presente en una solución tal como un fluido de carga. Una impureza puede ser una macromolécula biológica tal como ADN, ARN, o una proteína, diferente de la proteína de interés que se purifica, que también está presente en una muestra de la proteína de interés que se purifica. Impurezas incluyen, por ejemplo, variantes de proteína indeseables, tal como proteínas agregadas, proteínas deformes, proteínas ligadas a subdisulfuro, especies de alto peso molecular, fragmentos y especies de bajo peso molecular, y especies desamidadas; otras proteínas de las células anfitrionas que secretan la proteína se purifican, ADN de células anfitrionas, componentes de medio de cultivo celular, moléculas que son parte de un adsorbente utilizado para cromatografía de afinidad que lixivia dentro de una muestra durante etapas de purificación anteriores, por ejemplo, Proteína A; una endotoxina; un ácido nucleico; un virus, o fragmento de cualquiera de los anteriores.

El término "medio" se refiere a una matriz de afinidad o resina que puede sufrir una interacción de biomacromolécula-ligando con un producto a ser aislado durante un proceso de separación macromolecular. El medio puede ser, sin limitación, una columna de cromatografía de Proteína A o una columna de cromatografía de Proteína G.

El término "medio unido" se refiere a un medio unido con un producto a ser aislado y también unido con una o más impurezas. Un medio unido se puede crear al pasar un fluido de carga a través de un medio bajo condiciones adecuadas para unir el producto.

El término "medio lavado" se refiere a un medio unido que se lava mediante una o más soluciones de lavado, y por lo menos una solución de lavado contiene arginina o un derivado de arginina. Un medio de lavado se puede crear al poner en contacto un medio unido con una o más soluciones de lavado, y por lo menos una solución de lavado incluye arginina o un derivado de arginina. En el medio de lavado, la pureza del producto a ser aislada se incrementa generalmente con relación al fluido de carga en el medio unido (es decir, la proporción del producto para una o más impurezas se incrementa).

El término "modo unión-eluido" se refiere a una técnica de preparación del producto en la que por lo menos un producto contenido en un fluido de carga se une a un medio (por ejemplo, una resina cromatográfica).

El término "anticuerpo" se refiere a cualquier ¡nmunoglobulina o su fragmento, y abarca cualquier polipéptido que comprende un sitio de unión a antígeno. El término incluye, pero no se limita a, anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecíficos, poliespecíficos, no específicos, humanizados, humanos, monocatenarios, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, injertados, y generados in vitro. Fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, que pueden retener la función de unión a antígeno. Típicamente, tales fragmentos incluyen un dominio de unió a antígeno.

El término "IL-13" se refiere a interleuquina-13, que incluye la forma precursora no procesada de longitud completa del IL-13, así como también las formas maduras que resultan del clivaje post-traducción. La ¡nterleuquina-13 (IL-13) es una citoquina caracterizada previamente secretada por linfocitos T y mastocitos (McKenzie ef al. (1993) Proc. Nati. Acad. ScL USA 90:3735-39; Bost et al. (1996) Immunology 87:663-41 ). El término también se refiere a cualesquier fragmentos y variantes de IL-13 que mantiene por lo menos algunas actividades biológicas asociadas con el IL-13 maduro, que incluye secuencias que se han modificado. El término "IL-13" incluye IL-13 humano, así como también otros IL-13 derivados de especies de vertebrados. Varias aplicaciones pendientes describen anticuerpos contra IL-13 de mono y humano, péptidos IL-13, vectores y células anfitrionas que producen el mismo que se pueden utilizar en los métodos descritos aquí, por ejemplo, Publicaciones de Solicitud U.S. Nos. 2006/0063228A y 2006/0073148. Los contenidos de todas éstas publicaciones se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

El IL-13 comparte varia actividad biológica con IL-4. Por ejemplo, el IL-4 o IL-13 pueden originar conmutación de isotipo IgE en células B. (Tomkinson et al. (2001 ) J. Immunol. 166:5792-5800). Adicionalmente, niveles incrementados de CD23 de superficie celular y CD23 en suero (sCD23) se han reportado en pacientes asmáticos (Sanchez-Guererro et al. (1994) Allergy 49:587-92; DiLorenzo et al. (1999) Allergy Asthma Proc. 20:1 19-25). Adicionalmente, el IL-4 o IL-13 pueden regular ascendentemente la expresión del MHC clase II y el receptor IgE de baja afinidad (CD23) sobre células B y monocitos, que resulta en presentación mejorada de antígeno y función de macrófago regulada (Tomkinson et al., supra). Estas observaciones indican que el IL-13 juega un papel importante en el desarrollo de eosinofilia de vías aéreas e hipersensibilidad de las vías aéreas (AHR) (Tomkinson eí al., supra; Wills-Karp eí al. (1998) Science 282:2258-61 ). De acuerdo con la anterior, la inhibición del IL-13 puede ser útil en aliviar la patología de ciertas afecciones inflamatorias y/o alérgicas, que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades respiratorias, por ejemplo, asma; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); otras afecciones que involucran inflamación de las vías aéreas, eosinofilia, fibrosis y producción excesiva de moco, por ejemplo, fibrosis quística y fibrosis pulmonar; trastornos atópicos, por ejemplo, dermatitis atópica, urticaria, eczema, rinitis alérgica, afecciones inflamatorias y/o autoinmunes de, la piel (por ejemplo, dermatitis atópica), órganos gastrointestinales (por ejemplo, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), tal como colitis ulcerativa y/o enfermedad de Crohn), hígado (por ejemplo, cirrosis, carcinoma hepatocelular); escleroderma; tumores o cánceres (por ejemplo, tumores sólidos o de tejido blando), tal como leucemia, glioblastoma, y linfoma, por ejemplo, linfoma de Hodgkin; infecciones víricas (por ejemplo, de HTLV-I); fibrosis de otros órganos, por ejemplo, fibrosis del hígado, (por ejemplo, fibrosis originada por un virus de la hepatitis B y/o C).

El término "GDF-8" se refiere al Factor-8 de Diferenciación y Crecimiento y factores que son estructuralmente o funcionalmente relacionados con el GDF-8, por ejemplo, BMP-1 1 y otros factores que pertenecen a la superfamilía TGF-ß. El término se refiere a la forma precursora no procesada de longitud completa del GDF-8, así como también las formas propéptido y maduras que resultan del clivaje post-traducciona.l. El término también se refiere a cualesquier fragmentos y variantes del GDF-8 que mantienen por lo menos alguna actividad biológica asociada con el GDF-8 maduro, que incluye secuencias que se han modificado. Las secuencias de amino ácido del GDF-8 humano, así como también GDF-8 de otras especies vertebradas se describen (que incluyen murinos, babuinos, bovinos, y pollos), por ejemplo, US 2004-0142382, US 2002-0157125, y McPherron et al. (1997) Proc. Nal Acad. Sci. U.S.A., 94:12457-12461 , los contenidos de todos se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Ejemplos de anticuerpos neutralizantes contra GDF-8 se describen en, por ejemplo, US 2004-0142382, y se pueden utilizar para tratar de evitar afecciones en las que es deseable un incremento en el tejido muscular o la densidad ósea. Trastornos y enfermedades de ejemplo incluyen trastornos neuromusculares y musculares tales como distrofia (que incluye distrofia muscular de Duchenne); esclerosis lateral amiotrófíca; atrofia muscular; atrofia de órganos; debilidad; síndrome de túnel; enfermedad pulmonar obstructiva congestiva; sarcopenia, caquexia, y otros síndromes de desgaste muscular; trastornos de tejido adiposo (por ejemplo, obesidad); diabetes tipo 2; tolerancia deteriorada a la glucosa; síndromes metabólícos (por ejemplo, síndrome X); resistencia a la insulina inducida por trauma tal como quemaduras o desbalance de nitrógeno; y enfermedades degenerativas óseas (por ejemplo, osteoartritis y osteoporosis).

GDF-8, también conocido como miostatina, es una proteína secretada y es un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento de transformación beta (TGF-ß) de factores de crecimiento relacionados estructuralmente, todos los cuales poseen propiedades morfogenéticas y reguladoras del crecimiento fisiológicamente importantes. (Kingsley et al (1994) Genes Dev., 8: 133-146; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol Immunol, 228: 235-272). De manera similar al TGF-ß, el GDF-8 humano se sintetiza como una proteína precursora grande de aminoácido 375. La proteína GDF-8 precursora forma un homodímero. Durante el procesamiento, se diva el propéptído de terminal amino en Arg-266. El propéptído olivado, conocido como el "péptído asociado a latencia" (LAP), puede permanecer unido no covalentemente al homodímero, inactivando por lo tanto el complejo (Miyazono et al (1988) J. Biol. Chem. 263: 6407-6415; Wakefíeld et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 7646-7654; Brown et al (1990) Growth Factors, 3: 35-43; and Thies et al. (2001 ) Growth Factors, 18: 251 -259). El complejo GDF-8 maduro con el propéptído se denomina comúnmente como el "complejo latente pequeño" (Gentry et al (1990) Biochemistry, 29: 6851 - 6857; Oexynck et al (1995) Nature, 316: 701 -705; y Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol, 12: 597-641 ). Otras proteínas también se conocen por unirse al GDF-8 maduro e inhibir su actividad biológica. Tales proteínas inhibidoras incluyen proteínas de folistatina y proteínas relacionadas con folistatina (Gamer et al. (1999) Dev. Bíol, 208: 222-232).

El término "RAGE" se refiere al receptor para productos finales de glucación avanzada. El RAGE es un miembro de superficie celular multiligando de la superfamilia de inmunoglobulina. El RAGE consiste de un dominio extracelular, un único dominio de expansión de membrana, y una cola citosólica. El dominio extracelular del receptor consiste de un dominio de inmunoglobulina tipo V seguido por dominios de inmunoglobulina tipo C. el RAGE también existe en una forma soluble (sRAGE). El RAGE es un receptor de reconocimiento de patrón que une varias clases diferentes de moléculas endógenas que conducen a varias respuestas celulares, que incluyen secreción de citoquina, tensión oxidante celular incrementada, migración celular y excrecencia de neuritis. Los ligandos del RAGE incluyen productos finales de glucación avanzada (AGE), que forman estados hiperglucémicos prolongados. Adícionalmente al AGE, ligandos conocidos de RAGE incluyen proteínas que tienen fibrilas de laminas ß que se caracterizan por depósitos amiloideas y mediadores pro-inflamatorios, que incluyen S 100/ calgranulinas (por ejemplo, SI00A12, S100B, S100A8-A9), amiloides de suero (SAA) (forma fibrílar), proteína beta Amiloide (A-Beta), y proteína 1 cromosómica caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGBI, también conocido como anfoterina). El RAGE se expresa por muchos tipos celulares, por ejemplo, células de músculo liso y endotelial, macrófagos y linfocitos, y en muchos tejidos diferentes, que incluyen tejido de pulmón, corazón, riñon, músculo esquelético y cerebro. La expresión se incrementa en estados inflamatorios crónicos tal como artritis reumatoide nefropatía diabética. Aunque su función fisiológica no es clara, el RAGE está involucrado en la respuesta inflamatoria y puede tener un papel en diversos procesos del desarrollo, que incluyen diferenciación de mioblastos y desarrollo neural. Un número de enfermedades humanas significativas se asocia con una producción incrementada de ligandos para el RAGE o con la producción incrementada del RAGE en sí misma. Estos trastornos incluyen, por ejemplo, muchas enfermedades inflamatorias crónicas, que incluyen artritis reumatoide y soriática y enfermedad intestinal, canceres, diabetes y neuropatía diabética, amiloidosis sepsía y enfermedades cardiovasculares. Por ejemplo, uno de los ligandos para el RAGE, HMGB-I , se ha mostrado que es un mediador tardío de letalidad en dos modelos des sepsis de murino, y la interacción entre el RAGE y los ligandos tal como el HMGBI se considera que juega un papel importante en la patogenia de la sepsis y otras enfermedades inflamatorias.

El término "A-Beta" se refiere al constituyente principal de las placas amiloides dentro el cerebro. El péptido A-Beta es un fragmento interno 4-kDa de 39-43 aminoácidos de una glucoproteína de transmembrana mayor denominada proteína precursora amiloide (APP). Como un resultado del procesamiento proteolítico del APP por diferentes enzimas secretasa, el A-Beta se encuentra principalmente en una forma corta, 40 aminoácidos de longitud, y una forma larga, que varia de 42-43 aminoácidos de longitud. Parte del dominio de transmembrana hidrófobo del APP se encuentra en el extreme carboxi del A-Beta, y puede contra A-Beta para agregarse en placas, particularmente en el caso de la forma larga. La acumulación de placas amiloides en el cerebro conduce eventualmente a la muerte de las células neuronales. Los síntomas físicos asociados con este tipo de deterioro neuronal caracterizan la enfermedad de Alzheimer (AD). La acumulación de las placas amiloides dentro del cerebro también se asocia con el síndrome de Down y otros trastornos cognitivos.

Se han correlacionado varias mutaciones dentro de la proteína APP con la presencia de AD (ver, por ejemplo, Goate et al., Nature 349:704, 1991 (valina 717 a isoleucina); Chartier Harían et al. Nature 353:844, 1991 (valina 717 a glucina); Murrell et al., Science 254:97, 1991 (valina 717 a fenilalanina); Mullan et al., Nature Genet. 1 :345, 1992 (una mutación doble que cambia lisina 595-metionina 596 a asparagina 595-leucina 596), cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad). Tales mutaciones se consideran que originan el AD al incrementar o alterar el procesamiento del APP a A-Beta, procesando particularmente de APP a cantidades incrementadas de la forma larga de A-Beta (es decir, A-Beta 1 -42 y A-Beta 1- 43). Las mutaciones en otros genes, tal como los genes presenilina, PSI y PS2, se consideran que afectan indirectamente el procesamiento del APP para generar cantidades incrementadas de la forma larga A-Beta (ver Hardy, TINS 20: 154, 1997, incorporado aquí como referencia en su totalidad). En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-A-Beta se purifican de acuerdo con la presente invención.

Como se utiliza aquí, el término "IL-22" se refiere a interleuquina-22, que incluye la forma precursora no procesada de longitud completa del IL-22, así como también las formas madura que resultan del clivaje posttransduccional. El término también se refiere a cualquier fragmento y variante de IL-22 que mantiene por lo menos la misma actividad biológica asociada con el IL-22 maduro, que incluyen secuencias que se han modificado. El término "IL-22" incluye IL-22 humano, así como también otras especies de vertebrados. La secuencias de nucleótido y aminoácido del IL-22 de roedor y humano, así como también los anticuerpos contra IL-22 se describen en, por ejemplo la Publicación de la Solicitud U.S No. 2003-0157106, 2005-0153400, 2005-0042220 y 2005-0158760, y Patente U.S. No. 6, 939,545. Los contenidos de todas estas publicaciones se incorporan como referencia aquí en su totalidad.

La Interleuquina -22 (IL-22) es una citoquina clase II caracterizada previamente que muestra homología de secuencia para IL-10. Su expresión se regula en forma ascendente en las células T por el IL-9 o Concanavalin A (ConA) (Dumoutier L. et al. (2000) Proc Nati Acad Sci USA 97(18): 10144- 9). Estudios han mostrado que la expresión del IL-22 mARN se induce in vivo en respuesta a la administración de lipopolisacaridos (LPS), y que el IL-22 modula parámetros indicadores de una respuesta de fase aguda (Dumoutier L. et al. (2000) supra; Pittman D. et al. (2001 ) Genes and Immunity 2: 172), y que una reducción de la actividad IL-22 al utilizar un anticuerpo anti -IL-22 neutralizante alivia los síntomas inflamatorios en un modelo de artritis inducido por colágeno en ratón (CIA). Así, los antagonista IL-22, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-22 neutralizantes y sus fragmentos, se pueden utilizar para inducir las supresión inmune in vivo, por ejemplo, para tratar trastornos autoinmunes (por ejemplo, trastorno artríticos tal como artritis reumatoide); enfermedades respiratorias (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD)); afecciones inflamatorias de, por ejemplo,. La piel (por ejemplo,. soriasis), sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), sistema nerviosos (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), ríñones (por ejemplo, nefritis), hígado (por ejemplo, hepatitis) y páncreas (por ejemplo, pancreatitis).

El término "proteínas de célula anfitriona (HCP)" se refiere a proteínas no producto producidas por una célula anfitriona durante cultivo celular o fermentación. De acuerdo con lo anterior, en algunas modalidades, un eluido que contiene un producto tiene un HCP presente en menos de 100 partes por millón (ppm) HCP (por ejemplo, menos de aproximadamente 50 ppm, o menos de aproximadamente 20 ppm), La composición HCP es extremadamente heterogénea y dependiente del producto de proteína y procedimiento de purificación utilizado. Antes de cualquier aprobación de comercialización de un producto biológico para uso terapéutico, el nivel de proteínas contaminantes (tal como HCP) en el producto se debe medir cuantitativamente de acuerdo con las directrices del ICH y FDA.

El término "efluente de columna" se refiere al líquido que sale a un medio o columna durante un ciclo de carga, o en el periodo durante el cual se aplica una carga.

B. Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona métodos para purificar y recupera productos a partir de un fluido de carga que contiene una o más impurezas que utilizan un procedimiento que incluye lavar un medio unido con arginina o un derivado de arginina. En una modalidad preferida, el medio es una columna de cromatografía de Proteína A.

En una modalidad, un producto es una proteína, por ejemplo, una proteína terapéutica, que incluye anticuerpos de péptido. En otras modalidades, el producto es una proteína secretada; una proteína de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión a receptor o una proteína de fusión Ig, que incluye las proteínas de fusión Fe; un receptor soluble; un factor de crecimiento; una enzima; un factor de coagulación; una proteína que contiene Fe; un inmunoconjugado; una citoquina; una interleuquina; una hormona o una enzima terapéutica.

En modalidades adicionales de la invención, el producto es proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que tiene una región CH2/CH3 y por lo tanto es apta para purificación mediante cromatografía de Proteína A. El término "región CH2/CH3" se refiere a aquellos residuos de amino ácido en la región Fe de una molécula de inmunoglobulina que interactúa con la Proteína A. En algunas modalidades, la región CH2/CH3 contiene una región CH2 intacta seguida por una región CH3 intacta. En otras modalidades, la región CH2/CH3 contiene una región Fe de una inmunoglobulina. Ejemplos de proteínas que contienen la región CH2/CH3 incluye anticuerpos, inmunoadhesinas y proteínas de fusión que incluyen una proteína de interés fusionada a, o conjugada con, una región CH2/CH3.

En ciertas modalidades, por lo menos una impureza se une al medio y/o el producto cuando el fluido de carga se carga al medio, y por lo menos una solución de lavado que contiene arginina o un derivado de arginina se utiliza para remover la impureza que se une al medio y/o el producto.

La proteína puede ser una proteína secretada. La proteína puede ser un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, un receptor soluble, una fusión a receptor, una citoquína, un factor de crecimiento, una enzima, o un factor de coagulación.

En algunas modalidades de la invención, la proteína purificada que utiliza el método de la invención es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de éste. Como se utiliza aquí, el término "anticuerpo" incluye una proteína que comprende por lo menos uno, y típicamente dos dominios VH o sus porciones, y/o por lo menos uno, y típicamente dos dominios VL o sus porciones. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulína pesadas y dos cadenas de ¡nmunoglobulínas livianas, en donde las cadenas de inmunoglobulína pesada y liviana se interconectan mediante, por ejemplo, enlaces de disulfuro. Los anticuerpos, o una porción de éstos se puede obtener a partir de cualquier origen, que incluye, pero no se limita a, roedores, primates (por ejemplo, primate humano y no humano), camélidos, tiburones así como también producidos recombinantemente, por ejemplo, quiméricos, humanizados y/o generados in vitro, por ejemplo, medíante métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.

Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1 ; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados mediante un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb, que consiste de un domino VH; (vi) un dominio variable de camélído o camelizado, por ejemplo, un dominio VHH; (vii) un Fv monocatenario (scFv); (viii) un anticuerpo biespecífíco; y (ix) uno o más fragmentos de unión a antígeno de una inmunoglobulína fusionada a una región Fe. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican para genes separados, ellos se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que les permite ser hechos como una única cadena de proteína en la que el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); ver, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-26; Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83). Tales anticuerpos monocatenarios también están destinados a ser abarcados dentro del término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en la técnica, y los fragmentos se evalúan para función en la misma forma ya que son anticuerpos intactos.

En algunas modalidades, el término "fragmento de unión a antígeno" abarca anticuerpos de dominio único. Los anticuerpos de dominio único pueden incluir anticuerpos cuyas regiones de determinación de complementariedad son parte de un polipéptido de dominio único. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de cadena pesada, anticuerpos desprovistos naturalmente de cadenas livianas, anticuerpos de dominio único derivados de anticuerpos de anticuerpos de cadena 4 convencional, anticuerpos construidos por ingeniería y andamios de dominio único diferentes de aquellos derivados de los anticuerpos. Anticuerpos de dominio único pueden ser cualquiera de la técnica, o cualquier anticuerpo de dominio único futuro. Anticuerpos de dominio único se pueden derivar de cualquier especie que incluye, pero no se limita a ratón, humano, camello, llama, cabra, conejo, vaca, y tiburón. De acuerdo con un aspecto de la invención, un anticuerpo de dominio único como se utiliza aquí es un anticuerpo de dominio único de ocurrencia natural conocido como anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas livianas. Tales anticuerpos de dominio único se describen en la WO 9404678 por ejemplo. Por razones de claridad, este dominio variable derivado de un anticuerpo de cadena pesada desprovisto naturalmente de cadena liviana se conoce aquí como un VHH o nanocuerpo para distinguirlo del VH convencional de cuatro cadenas de inmunoglobulina. Tal una molécula VHH se puede derivar de anticuerpos que surgen en especies camélida, por ejemplo en camellos, llamas, dromedarios, alpaca y guanaco. A pesar que otras especies camélidas pueden producir anticuerpos de cadena pesada desprovistos naturalmente de cadenas livianas, tales VHH están dentro del alcance de la invención.

El fragmento de unión a antígeno puede, opcionalmente, incluir adicionalmente un grupo funcional que mejora uno o más de, por ejemplo, estabilidad, función de célula efectora o fijación de complemento. Por ejemplo, el fragmento de unión a antígeno puede incluir adicionalmente un grupo funcional pegilado, albúmina, o una región constante de cadena liviana o pesada.

Adicionalmente, los métodos de la presente invención se pueden utilizar para purificar fármacos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP™) (Trubion Pharmaceuticals, Seattle, WA). El SMIP son polipéptidos monocatenarios compuestos de un dominio de unión ara una estructura cognato tal como un antígeno, un contrareceptor o similar, un polipéptido de región de bisagra que tiene uno o ningún residuo cisteína, y dominios CH2 y CH3 de inmunoglobulina (ver también www.trubion.com). El SMIP y sus usos y aplicaciones se describen en, por ejemplo, la Solicitud de Patente Publicada U.S. Nos. 2003/01 18592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534, y 2005/0238646, y miembros de familia de patentes relacionadas de éstos, todos los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Diferente de anticuerpos "biespecíficos" o "bifuncionales", un anticuerpo se entiende que tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena liviana/pesada diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una variedad de métodos que incluyen fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab'. Ver, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny ef al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

En modalidades donde la proteína es un anticuerpo o un fragmento de este, este puede incluir por lo menos una, o dos cadenas pesadas de longitud completa, y por lo menos una, o dos cadenas livianas. Alternativamente, los anticuerpos o sus fragmentos pueden incluir sólo un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento Fv monocatenario). El anticuerpo o su fragmento puede ser un anticuerpo de especificidad única o monoclonal. El anticuerpo o su fragmento también puede ser un anticuerpo humano, humanizado, quimérico, injertado con CDR, o generado in vitro. En aún otras modalidades, el anticuerpo tiene una región constante de cadena pesada seleccionada de, por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, o lgG4. En otra modalidad, el anticuerpo tiene una cadena liviana seleccionada de, por ejemplo, kappa o lambda. En una modalidad, la región constante se altera, por ejemplo, muta, para modificar las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, para incrementar o reducir uno o más de: unión de receptor Fe, glucosilación de anticuerpo, el número de residuos de cisteína, función de célula efectora, o función complemento). Típicamente, el anticuerpo o su fragmento se une específicamente a un antígeno predeterminado, por ejemplo, un antígeno asociado con un trastorno, por ejemplo, un trastorno neurodegenerativo, metabólico, inflamatorio, autoinmune y/o un trastorno maligno. Anticuerpos de ejemplo que se pueden separar por los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos contra RAGE, péptído A-Beta, interleuquína-13 (IL-13), interleuquina-22 (IL-22), 5T4, y factor de crecimiento y diferenciación-8 (GDF-8).

Las preparaciones de anticuerpo utilizadas con varios métodos descritos aquí pueden ser de un número de fuentes que incluyen, pero no se limitan a, suero de animales inmunizados, fluido de ascitos, sobrenadantes de mieloma o hibridoma, medio de cultivo condicionado derivado de cultivar una linea de célula recombinante que expresa la molécula de anticuerpo, o de un extracto celular de células que producen anticuerpo. En una modalidad de la invención, el producto es un anticuerpo de medio de cultivo condicionado de una línea de célula recombinante que produce anticuerpo. Aunque existe alguna variación de línea celular a línea celular y entre los varios productos de anticuerpo, basado en la descripción aquí, está bien dentro de la experticia del experto en la técnica adaptar la invención aquí a una combinación particular de proteína de anticuerpo y línea celular de producción.

En ciertas modalidades, por lo menos una impureza se une al medio y/o el producto cuando el fluido de carga se carga al medio, y por lo menos una solución de lavado que contiene arginina o un derivado de arginina se utilizan para remover la impureza que se une al medio y/o al producto. En una modalidad de la invención, el producto purificado contiene menos del 60 % de impurezas (por ejemplo, proteínas de célula anfitriona), en una modalidad, el 40% impurezas, en una modalidad, 20 % impurezas, en una modalidad, 10% impurezas, en una modalidad, 5% impurezas, en una modalidad, menos de 3% impurezas, y en otra modalidad menos de 1 % impurezas. La impurezas incluyen, pero no se limitan a, variantes de proteína indeseables, tal como proteínas agregadas, especies de alto peso molecular, especies de bajo peso molecular y fragmentos, y especies desarrimadas; otras proteínas de las células anfitrionas que secretan la proteína que se purifica; AND de células anfitrionas; componente del medio de cultivo celular, moléculas que son parte de un absorbente utilizado para cromatografía de afinidad que lixivian en una muestra durante etapas de purificación anteriores, por ejemplo, proteína A y proteína G; una endotoxina; un ácido nucleico; un virus, o un fragmento de cualquiera de los anteriores.

El medio utilizado en un método descrito aquí es, por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad, una columna de cromatografía de interacción hidrófoba, una columna de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado, una columna de cromatografía de exclusión de tamaño, una diafiltracíón, ultrafiltración, filtración de remoción vírica, y/o columna de cromatografía de intercambio de ión, una columna de cromatografía de proteína A o columna de cromatografía de proteína G. una columna de cromatografía de proteína A puede ser, por ejemplo; PROSEP-A™ (Millipore, U.K.), Protein A Sepharose FAST FLOW™ (GE Healthcare, Piscataway, N.J.), TOYOPEARL™ 650M Protein A (TosoHass Co., Philadelphia, Pa.), or MabSelect™ column (GE Healthcare, Piscataway, N. J.).

Antes de poner en contacto el medio con un fluido de carga, puede ser necesario ajustar los parámetros tal como el pH, resistencia iónica, y temperatura en algunos casos la adición de sustancias de diferentes clases. Así, es una etapa opcional desarrollar un equilibrio del medio al lavarlo con una solución (por ejemplo, un amortiguador para ajustar el pH, resistencia iónica, etc., o para la introducción de un detergente) que llevan las características necesarias para unión y purificación del producto.

En alguna modalidad de la invención, una columna de proteína A se equilibra y lava con una solución de lavado que contiene arginina o un derivado de arginina, con lo cual lleva las características necesarias para purificar el producto. En una modalidad de la invención, la columna de proteína A se puede equilibrar utilizando una solución que contiene una sal, por ejemplo, aproximadamente 100 mM a aproximadamente 150 mM NaP04, aproximadamente 100 mM a aproximadamente 150 mM acetato de sodio, y aproximadamente 100 mM a aproximadamente 150 mM NaCI. El pH del amortiguador de equilibrio puede variar de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. En una modalidad, el pH del amortiguador de equilibrio es de aproximadamente 7.5. El amortiguador de equilibrio puede contener aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM Tris. En otra modalidad, el amortiguador puede contener aproximadamente 20 mM Tris. Después de poner en contacto al medio (por ejemplo, una columna de proteína A) con el fluido de carga, se lava el medio unido. De acuerdo con la invención, la solución de lavado utilizada en el método descrito aquí contiene arginina o un derivado de arginina. El derivado de arginina puede ser, pero no se limita a, acetil arginina, agmatina, ácido argínico, N-alfa- butiroil-L-arginina, o N-alfa-pivaloil arginina.

La concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado está entre aproximadamente 0.1 M y aproximadamente 2.0 M (por ejemplo, 0.1 M, 0.4 M, 0.5 M, 1.0 M, 1.5 M, o 2.0 M), o entre aproximadamente 0.5 M y aproximadamente 1.0 M (por ejemplo, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, o 1 .0 M). en ciertas modalidades, la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es de aproximadamente 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, o 0.9 M. en ciertas modalidades, la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es de aproximadamente 1 .1 M, 1 .2 M, 1.3 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1 .7 M, 1.8 M, 1 .9 M, o 2.0 M. en ciertas modalidades, la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es mayor de aproximadamente 0.5 M y menor de aproximadamente 2.0 M (por ejemplo, 0.55 M, 0.75 M, 1.0 M, 1 .25 M, 1.5 M, o 1 .75 M, o 2.0 M), o más de aproximadamente 0.5 M y menor de aproximadamente 1.0 M (por ejemplo, 0.55 M, 0.75 M, o 1.0 M). En una modalidad, la concentración de arginina no es 1 M. en algunas modalidades, la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es mayor de 1 M. en algunas modalidades, la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es menor de 1 M. en modalidades adicionales, la solución de lavado puede contener aproximadamente 0.1 M a aproximadamente 0.9 M de arginina o de derivado de arginina, en ciertas modalidades, la concentración de arginina o derivado de arginina puede ser de aproximadamente 0.2 M a aproximadamente 0.8 M, aproximadamente 0.3 M a aproximadamente 0.7 M, o aproximadamente 0.4 M a aproximadamente 0.6 M. en modalidades adicionales, la solución de lavado puede contener aproximadamente 1.1 M a aproximadamente 3.0 M, o aproximadamente 1.1 M a aproximadamente 2.0 M arginina o derivados de arginina. En ciertas modalidades, la concentración arginina o derivados de arginina es de aproximadamente 1 .2 M a aproximadamente 2.8 M, aproximadamente 1.3 M a aproximadamente 2.6 M, aproximadamente 1 .4 M a aproximadamente 2.4 M, aproximadamente 1.5 M a aproximadamente 2.2 M, aproximadamente 1.6 M a aproximadamente 2.0 , o aproximadamente 1 .8 M a aproximadamente 2.0 . En ciertas modalidades, la concentración arginina o derivados de arginina es de aproximadamente 1 .2 M a aproximadamente 1.9 M, aproximadamente 1.3 M a aproximadamente 1.8 M, aproximadamente 1.4 M a aproximadamente 1 .7 M, o aproximadamente 1.5 M a aproximadamente 1.6 M.

El pH de la solución de lavado está generalmente entre aproximadamente 4.5 y aproximadamente 8.0, por ejemplo, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 y 8.0. En algunos casos el pH de la solución de lavado es mayor de 5.0 y menor de aproximadamente 8.0, por ejemplo, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 y 8.0. La solución de lavado puede contener 20 mM a 50 mM Tris (por ejemplo, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM). En una modalidad el medio de unido se lava con 5 volúmenes de columna de la solución de lavado, seguido por una etapa de elusion, En ciertas modalidades de la invención, el producto se puede eluir de un medio de lavado, por ejemplo, una columna de proteína A. para eluir un producto de una columna de proteína A, el medio de lavado se pone en contacto con un amortiguador de elusión. En algunas modalidades, el amortiguado de elusión contiene aproximadamente 15 mM a aproximadamente 50 mM NaCI. En otras modalidades, el amortiguador de elusión puede contener aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM de arginina o derivados de arginina. En modalidades adicionales, el amortiguador de elusión puede contener 50 mM a 150 mM glicina. El amortiguador de elusión también puede contener aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM HEPES. El amortiguador de elusión también puede contener aproximadamente 25 mM a aproximadamente 50 mM de ácido acético. El pH del amortiguador de elusión puede variar de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 4.0. En una modalidad, el pH del amortiguador de elusión es aproximadamente 3.0.

El medio se puede limpiar opcionalmente, es decir, pelar y regenerar, después de elusión del anticuerpo. Este procedimiento se desarrolla típicamente de manera regular para minimizar la conformación de impureza sobre la superficie de la fase sólida y/o para esterilizar la matriz para evitar la contaminación del producto con microorganismos.

Los componentes de amortiguador se pueden ajustar de acuerdo con el conocimiento de la persona experta en la técnica. Se proporcionan rangos de composición de amortiguador de muestra en los ejemplos adelante. No todos los amortiguadores o etapas son necesarias, pero se proporcionan solo para ilustración. Se puede utilizar una detección de alto rendimiento, como se describe en los ejemplos, para optimizar eficientemente las condiciones de amortiguación para la cromatografía de columna de proteina A.

En una modalidad del método, el eluido incluye un producto aislado y la pureza del producto aislado se incrementa comparado con un método correspondiente en el que menos de aproximadamente 0.1 M de arginina o derivado de arginina se utiliza en una solución de lavado.

En otra modalidad, el eluido incluye un producto aislado, y la proporción del producto a por lo menos una impureza se incrementa comparado con un método correspondiente en el que ninguna cantidad detectable de arginina o derivado de arginina se utiliza en una solución de lavado.

En algunos casos, el eluido contiene un producto, y la proporción del producto con la proteína de célula anfitriona se incrementa comparado con un método correspondiente en el que menos de aproximadamente 0.1 M de arginina o derivados de arginina se utiliza en una solución de lavado.

El eluido puede incluir un producto y la proporción del producto con la proteína de célula anfitriona se incrementa comparado con un método correspondiente en el que ninguna cantidad detecTabla de arginina o derivados de arginina se utiliza en una solución de lavado.

La turbidez proporciona una medida de producto insoluble, impurezas insolubles, y complejos insolubles de productos e impurezas. La turbidez también se puede originar por partículas subcelulares y residuos celulares. En general, la menor turbidez en el eluido se asocia con una calidad más deseable del producto. La turbidez se puede ensayar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar métodos nefelométrico (Baker et al., Trends Biotechnol. 2002 Apr; 20(4): 149-56) o densidad óptica. La densidad óptica se ensaya generalmente al medir la absorbancia en un rango de aproximadamente 320 nm a aproximadamente 650 nm.

En algunos casos, la turbidez del eluido se reduce comparado con la turbidez del eluido en un método correspondiente en el que menos de aproximadamente 0.1 M de arginina o derivados de arginina se utiliza en una solución de lavado. En ciertas modalidades, la turbidez del eluido se reduce comparado con un método correspondiente en el que ninguna cantidad detectable de arginina o derivados de arginina se utiliza en una solución de lavado.

En ciertas modalidades, el método de la presente invención resulta en turbidez reducida en un eluido que contiene un producto. En otras modalidades, el método resulta en la turbidez reducida así como también impurezas reducidas en el eluido que contiene el producto comparado con un método correspondiente en el que ninguna cantidad detectable de arginina o derivados de arginina se utiliza en una solución de lavado. En ciertas modalidades, el método no incluye el uso de cualquier filtración en la dirección 5' adicional, por ejemplo, una filtración absorptiva en la dirección 5'.

Aunque el método de purificación de la presente invención se puede utilizar solo, este se puede utilizar en combinación con otras técnicas de purificación. En una modalidad, se pueden utilizar uno o más procesos, por ejemplo para preparar un fluido de carga para reducir la exposición de carga de los contaminantes o impurezas mientras se emplean los métodos descritos aquí. En algunos casos, se utiliza uno o más procesos para procesar el eluido, por ejemplo, para remover contaminantes o impurezas que están en el eluido.

La presente invención también se relaciona común producto preparado de acuerdo con un método descrito aquí. En general, será típicamente deseable aislar adicionalmente y/o purificar productos aislados de acuerdo con la presente invención y formularlos para uso farmacéuticos de acuerdo con métodos estándar. Para proteínas, ver por ejemplo, Protein Purifícation Principies and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgíns, S.J. and Hames, B. D. (eds.), and Deutscher, M.P., Simón, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997, incorporado aquí como referencia. Una persona medianamente versada en la técnica apreciara que las técnicas exactas utilizadas variaran dependiendo del carácter del producto. Los productos de la invención que tienen actividad farmacológica serán útiles en la preparación de farmacéuticos. Estos se pueden administrar a un sujeto o se pueden formular primero para suministro mediante cualquier ruta disponible que incluye, pero no se limita a ruta parenteral {por ejemplo, intravenosa), intradérmica, subcutánea, oral, nasal, bronquial, oftálmica, transdérmica (tópica), transmucosa, rectal, y vaginal.

Una composición farmacéutica del producto se formula por ser compatible con su ruta de administración propuesta de acuerdo con los método conocidos en la técnica, ver por ejemplo, Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), and the "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ. (1998). En algunas modalidades, el producto se formula utilizando agua estéril (por ejemplo, SWFI), solución salina amortiguada (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato), poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido), o sus mezclas adecuadas.

Ejemplos no limitantes de productos que se pueden recuperar utilizando los métodos descritos aquí incluyen una proteína a un péptido, por ejemplo, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína recombinante, una proteína secretada naturalmente, una proteína o un péptido que se construye con ingeniería para ser secretada, un producto no proteína que se produce mediante una célula, o una combinación de los anteriores productos.

EJEMPLOS La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan solo para propósito de ilustración. Ellos no están constituidos como limitantes del alcance o contenido de la invención de ninguna forma.

Se conducen experimentos para identificar métodos que sean útiles para el aislamiento de un producto que se produce mediante una bacteria celular o tejido, en protocolos que utilizan un medio de afinidad como parte del proceso de aislamiento. En estos experimentos, se utiliza columna de proteína A MabSelect™ para unirse al producto.

EJEMPLO 1 GDF-8 mAb-1 : Comparación de Amortiguador de lavado de Proteína A para HCP y reducción de Turbidez y Recuperación de Producto Se desarrolla primero la evaluación de varias soluciones de lavado utilizando un método de detección de alto rendimiento (HTS). Se carga inicialmente una columna de proteína A MabSelect™ con medio de cultivo condicionado de un proceso de cultivo de de células de ovario de Hámster Chino ("CHO"). La resina MabSelect™ se coloca en suspensión luego y 100 µ? de la suspensión de resina se suministra en cada pozo de una placa de microtítulo de 96 pozos. Cada pozo de la placa de microtítulo se lava luego con una solución de prueba bajo evaluación, y se eluye posteriormente con un amortiguador de pH bajo. El grupo de elución de cada pozo se ensaya para turbidez pico mediante A320 y para la recuperación del producto mediante A280. basado en los resultados de los experimentos HTS, la soluciones de prueba que producen la recuperación más alta y la menor turbidez se seleccionan para pruebas adicionales utilizando series de exploración de columna a pequeña escala. En las series de exploración de columna, se equilibra una columna para proteína A MabSelect con un amortiguador que contiene 10 mM Tris, 100 mM NaCI pH 7.5, y se carga con medio de cultivo condicionado CHO que contiene GDF-8 mAb-1 . La columna se lava a chorro luego con 5 volúmenes de columna (CV) del amortiguador de equilibrio, y se lava posteriormente con 5 CV de una solución de prueba bajo evaluación. El producto unido se eluye posteriormente en un amortiguador de bajo pH. La turbidez pico neutralizada se mide mediante A320 o mediante un turbidímetro, se determina la recuperación del producto por A280, y el nivel de HCP se determina por un ELISA. Los tamaños de columna utilizados para la evaluación inicial son 0.5 cm o 1 .1 cm de diámetro con altura de lecho de 8 a 25cm. La Tabla 1 resume las condiciones de operación de columna para todos los experimentos descriptos en el ejemplo 1 .

Tabla 1 : Condiciones de operación de columna de Proteína A MabSelect Fase de Composición de Volúmenes de Velocidad lineal Operación de solución columna (cm hr'1) columna Equilibrio 10mM Tris. 100 5 360/450 mM NaCI. pH 7.5 Carga Medio de cultivo NA 240 condicionado Post Carga 10mM Tris, 100 2 240 Chorro mM NaCI. pH =7.5 Lavado 1 Variable (ver 5 300 Tabla 2) Pre-Elusión 10mM Tris, 100 5 450 chorro mM NaCI. pH = 7.5 Elusión 50mM NaCI, 100 6 150 mM L arqinina HCL, pH=30 Neutralización 2M HEPES 5.0%(v/v) pH = 80 adicción Post Elusión 50mM Tris, 4 450 Chorro pH = 8.5 Pelado 6M guanidina 2 150 HCL Post Pelado 10mM Tris, 100 4 150/450 Chorro mM NaCI. pH=7.5 Almacenamiento 16% (v/v) etanol 4 360 Para cada serie, la columna para pretina A MabSelect™ se equilibra con 5 volúmenes de columna de 10 m Tris, 100 mM NaCI, pH 7.5 y se carga posteriormente a aproximadamente 35 mg de producto de resina/mL. La columna se lava a chorro con 1 volumen de columna de amortiguador de equilibrio 5 volúmenes de columna (CV) de lavado de prueba bajo evaluación (ver Tabla 2). La fase de lavado es seguida por 5 lavados a chorro CV de 10 mM Tris, 100 mM NaCI, pH 7.5. El producto unido se eluye luego de la columna con 100 mM L-arginina, 50 mM NaCI, pH 3.0. El grupo de productos se neutraliza posteriormente a pH 7.5 con 2 M HEPES, pH 8.0. La columna se pela con 2 CV de 6 M de HCI guanidina. La Guanidina se remueve de la columna 4 CV de 10 mM Tris, 100 mM NaCI, pH 7.5 antes de ser almacenado en 16% etanol (4 CV). Todas las operaciones de columna se desarrollan a temperatura ambiente.

Las varias soluciones de lavado evaluadas para HCP y reducción de turbidez de grupo pico se listan en la Tabla 2. Se utiliza la precipitación severa y se observa la pérdida de producto en el grupo de elución de proteína A en donde la solución de lavado de NaCI 1 M de control (Figura 1 ). En adicción, la depuración de HCP a través de la etapa de columna para proteína A es menor de 1 log10. Comparado con soluciones de lavado alternas tal como 10% ¡sopropanol (IPA), 0.5 M Guanidina-HCI (GuHCI), o 2 M Tris-HCI, el lavado de arginina es más efectivo al reducir el HCP y la turbidez del grupo de elución mientras mantiene buena recuperación de producto (Figura 1 ).

Tabla 2: Lista de soluciones de lavado evaluadas No. Composición de Solución 1 1 M NaCI, 20 mM Tris, pH 7.5 2 0.5 M arginina, 20 mM Tris, pH 7.5 3 0.5 M GuHCI, 20 mM Tris, pH 7.5 4 10% IPA, 20 mM Tris, pH 7.5 5 1 M arginina, 20 mM Tris, pH 7.5 6 1 M arginina, 20 mM acetato de sodio, pH 7.5 7 2 M Tris, pH 7.5 EJEMPLO 2 GDF-8 mAb-2: Comparación de Amortiguadores de Lavado para Proteína A para HCP y Reducción de Turbidez y Recuperación de producto El medio de cultivo condicionado de un proceso de cultivo de células CHO que contienen GDF-8 mAb-2 se purifica a pequeña escala utilizando una columna para proteína A MabSelect™. Los tamaños de columna utilizados para la evaluación inicial son 0.5 cm o 1.1 cm de diámetro con altura de lecho de 8 cm a 25 cm. las condiciones de operación de proteína A utilizadas para purificación de GDF-8 mAb-2, así como también las soluciones de lavado evaluadas para HCP y reducción de turbidez de grupo pico son las mismas como aquellas utilizadas en el ejemplo 1 (refiérase a la Tabla 2 para soluciones de prueba evaluadas).

La precipitación severa y la pérdida de producto se observa en el grupo de elución para proteína A cuando la se utiliza solución de lavado 1 M NaCI de control (Figura 2).adicionalmente, la depuración del HCP a través de la etapa de la etapa de columna para proteína A es menor de 1 log10. Comparado con soluciones de lavado alternas tal como 10% isopropanol, 0.5 M Guanidina-HCI (GuHCI), o 2 M Tris-HCI, un lavado de arginina es más efectivo en la remoción del HCP y en la reducción de la turbidez de grupo de elución mientras mantiene >75% de recuperación de producto (Figura 2). EJEMPLO 3 IL-13 mAb-1 : Comparación de Amortiguadores de Lavado para Proteína A para HCP y Reducción de Turbidez y Recuperación de Producto La evaluación de varias soluciones de lavado para turbidez y reducción de HCP a través de una etapa de columna de proteína A se desarrolla inicialmente utilizando un método de detección de alto rendimiento (HTS). Una columna de 25 mL se empaca con resina MabSelect™ y se carga con medio de cultivo condicionado de células CHO a una exposición de carga final de 25 mg de IL- 13 mAb-1 por mL de resina. Luego la resina se coloca en suspensión y 100 pL de la suspensión de resina se suministra en cada pozo de una placa de microtitulo de 96 pozos. Cada pozo de la placa de microtitulo se lava luego con la solución de prueba bajo evaluación, y el producto unido se eluye con 50 mM glicina, 35 mM NaCI, pH 3.0. La Tabla 3 lista todas las soluciones de lavado evaluadas en este estudio. El grupo de elución de cada pozo se mide mediante un A320 para turbidez de pico y A280 para recuperación de producto.

Tabla 3: Soluciones de lavado evaluadas en detección HTS #1 Solución de lavado Ph Concentración NaCI - Control 7.5 0.15-3.5 M Tween 80 con 150mM 7.5 0.05-10% NaCI Guanidina HCI 7.5 0.1 -2.0 M CTAB* 7.5 0.1 -10% Alcohol isopropilico (IPA 7.5 1.0-10.0% Sulfato Dodecil Sodio 7.5 0.05-0.7% (SDS) Propilenglicol 7.5 5.0-40.0% Propilenglicol (bajo pH) 5.0 2.0-20.0% Propilenglicol (bajo pH) 6.0 5.0-30.0% Tween 80 con 0.5 M 7.5 0.05-1.0% NaCI CHAPS** 7.5 0.05-1.0% UREA 7.5 0.1 -2.0 M Sulfato de Sodio 7.5 0.1 -0.8 M Sacarosa 7.5 1 .0-10.0% Glicina 7.5 0.1 -1.0 M Glicerol 7.5 1 .0-10.0% CaCI2 7.5 0.25-2.5 M CaCI2 (bajo pH) 6.0 0.1 -1.75 M CaCI2 (bajo pH) 5.0 0.1 -1.75 M Arginina 7.5 0.1 -1.0 M Arginina(bajo pH) 6.0 0.1 -1.0 M Arginina(bajo pH) 5.0 0.1 -1.0 M Tris 7.5 1 -2 M *Cetiltrimetilammoniobromuro, cargado (1 mM = CMC) **sulfonato de 3-[(3-Colamidopropil)-dimetil-amonio]-1 -propano La efectividad de la solución de lavado bajo evaluación evalúa al comparar los valores A320 normalizados de los grupos de elusión neutralizados. Cinco soluciones de prueba, Arginina, CaCI2, Guanidina HCI, IPA y Tris son más efectivas que el lavado de control NaCI 1 M al reducir valores de turbidez de grupo pico neutralizado. Arginina, CaCI2, Tris e IPA se prueban adicionalmente utilizando series de exploración de columna a escala pequeña. Se utilizan columnas de 1.1 cm (diámetro) x 8 cm (altura de lecho) para estas evaluaciones. El medio de cultivo condicionado de cultivo de CHO que contienen el anticuerpo monoclonal se purifica a pequeña escala utilizando una columna para proteína A MabSelect™ operada a temperatura ambiente. La exposición de carga se fija a 30 mg/mL de resina para estas series. Las condiciones de operación utilizadas para series de exploración se resumen en la Tabla 4. En resumen, la columna para proteína A MabSelect™ equilibra y carga con medio de cultivo condicionado de células CHO que contienen IL- 13 mAb-1. La columna se lava luego con 5 volúmenes de columna de un amortiguador alto en sal seguido por 5 volúmenes de columna de la solución de lavado bajo evaluación. La columna se lava luego con una serie de soluciones bajas en sal en preparación para la etapa de elusión. El producto unido se eluye con 50 mM de glicina, 15 mM NaCI, pH 3.0. La turbidez pico neutralizada se mide mediante un turbidímetro, se determina la recuperación de producto por A280, y el nivel HCP se determina por ELISA. Los resultados de este experimento se resumen en la Figura 3.

Tabla 4: Condiciones de Operación Utilizadas para Series de Exploración Operación Composición de Volúmenes de Velocidad de fluio solución columna (CV) (cm hr"1) Equilibrio 150mM NaCI, 20 5 300 mM Tris; DH = 7.5 Carga Medio de cultivo = 300 condicionado lavado a chorro 10mM NaCI, 20 5 300 Post Carqa mM Tris; pH =7.5 Lavado Solución de 5 300 prueba Lavado a chorro 35mM NaCI, 50 5 300 pre-Elusión 1 mM Tris; DH =7.5 Lavado a chorro 5mM NaCI, 10 5 300 pre-Elusión 2 mM Tris; DH =7.5 Elusión 15mM NaCI, 50 5(volumen de pico 300 mM Tris; 3CV) pH =3.0 Pelado 6.0 M quanidina 5 300 HCL Almacenamiento 16% (V/V) etanol 5 300 neutralización 2.0 M Tris; 1 % (vM 300 pH =8.5 Los valores de turbidez de grupo de pico neutralizado cuando la solución de lavado de control NaCI 1 M se utiliza es ~20 NTU, y es significativamente menor que aquel reportado en los ejemplos 1 y 2. la arginina, CaCI2, y Tris son más efectivos en reducir la turbidez de grupo de pico neutralizado comparado con el control NaCI 1 M. sin embargo, de las tres soluciones de lavado que son efectivas en reducir la turbidez de grupo pico neutralizada, la arginina es más efectiva en reducir el HCP sin impactar la recuperación del producto. La reducción de HCP a través de la etapa de proteína A MabSelect™ con lavado pH 5.0, 0.4 M Arginina, es 3.5 veces mayor que los valores correspondientes con el lavado de control NaCI 1 M (Figura 3).

EJEMPLO 4 IL-22 mAb: Comparación de Amortiguador de Lavado para Proteína A para HCP y Reducción de Turbidez y Recuperación de Producto.

La evaluación de varias soluciones de lavado para turbidez y reducción de HCP a través de etapa de columna para proteína A se desarrolla inicialmente utilizando un método HTS. Se empaca una columna de 25 mL con resina MabSelect™ uy se carga con medio condicionado de células CHO a una exposición de carga final de 25 mg de IL-22 mAb por mL de resina. La resina se coloca en suspensión luego y 100 µ? de la suspensión de resina se suministra a cada pozo de una placa de microtítulo de 96 pozos. Cada pozo de placa de microtítulo se lava luego con la solución de prueba bajo evaluación, y el producto unido se eluye con un amortiguador de bajo pH. Los grupos de elusión se neutralizan luego con un amortiguador de alto pH y se ensayan para turbidez pico mediante A320 y para recuperación de producto mediante A280. basados en los resultados de los experimentos HTS, las soluciones de prueba que producen la mayor recuperación y la menor turbidez se seleccionan para prueba adicional utilizando series de expiración de columna a pequeña escala, las condiciones para estas se resumen en la Tabla 5.

Tabla 5: Condiciones de Prueba para Series de Exploración de Columna.

Para cada serie, se equilibra la columna para proteína A MabSelect™ de 0.5 cm (a) x 20 cm (h) con 5 volúmenes de columna (CV) de 20 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 7.5 y se carga posteriormente a aproximadamente 35 mg de producto/mL de resina. La columna se lava luego don 5 CV de la solución de prueba. La fase de lavado está seguida por un lavado a chorro pre-elusión 3 CV de 5 mM Tris, 20-30 mM NaCI, pH 7.5. El producto unido se eluye luego de la columna con un amortiguador de bajo pH y se neutraliza con pH 7.5 con una solución de prueba. La columna se pela con 5 CV de 50 mM NaOH, 500 mM de sulfato de sodio y se almacena en 5 CV de 16% (v/v) etanol, 50 mM Tris, pH 7.5. Se desarrollan todas las operaciones de columna a temperatura ambiente y se resumen en la Tabla 6.

Tabla 6: Condición de Operación para Series de expiración de Columna Operación Composición de Volúmenes Velocidad de solución de columna flujo (CV) (cm hr"1) Equilibrio 150mM NaCI, 20 mM 5 300 Tris; pH 7.5 Carpa Medio de cultivo — 300 condicionado Lavado Solución de 5 300 prueba(ver tabla 5) Lavado a chorro 20-30 mM NaCI, 5 3 300 pre-Elusión mM Tris; pH 7.5 Elusión Solución de 5(volumen 300 prueba(ver tabla 5) de pico 3CV) Pelado 50mM NaOH, 500 5 300 mM sulfato de sodio Almacenamiento 16% (V/V) etanol 50 5 300 mM Tris; pH 7.5 neutralización Solución de 300 prueba(ver tabla 5) Como se muestra en la Figura 4, todas las condiciones de prueba resultan en recuperación de producto comparable. El lavado de arginina utilizado en la Serie 2 y el lavado Tris utilizado en la Serie 5 proporcionan la mayor reducción de HCP. El lavado de Arginina utilizado en la Serie 2, sin embargo, tiene un nivel de turbidez casi dos veces menor que el lavado Tris utilizado en la Seria 5.

EJEMPLO 5 RAGE mAb: Comparación de Amortiguador de Lavado para Proteína A para HCP y Reducción de Turbidez y Recuperación de Producto La evaluación de varias soluciones de lavado para turbidez y reducción de HCP a través de la etapa de columna para proteína A se desarrolla inicialmente utilizando un método HTS. Se empaca una columna de 25 mL con resina MabSelect™ y se carga con medio de cultivo condicionado de células CHO a una exposición de carga final 25 mg de mAb RAGE por mL de resina. La resina se pone en suspensión luego y 100 µ? de la suspensión de resina se suministra a cada pozo de una placa de microtítulo de 96 pozos. Cada pozo de la placa de microtítulo se lava luego con la solución de prueba bajo evaluación, y el producto unido se eluye con un amortiguador de pH bajo. Los grupos de elusión se neutralizan con un amortiguador de alto pH y se ensayan para turbidez pico mediante A320 y para recuperación de producto mediante A280. El experimento HTS resulta en la recuperación aceptable y turbidez para la mayoría de soluciones probadas. Basado en estos resultados y la experiencia anterior, se evalúa la arginina y se selecciona como la condición de lavado para este producto.

Se equilibra la columna para proteína A MabSelect™ de 5 cm (d) x 23 cm (a) con 5 volúmenes de columna (CV) de 20 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 7.5 y se carga posteriormente a aproximadamente 35 mg producto/mL de resina. La columna se lava luego con 5 CV de 0.5 M Arginina, 50 mM Tris, pH 7.5. La fase de lavado es seguida por un lavado a chorro de pre-elusión de 3 CV de 39 mM NaCI, 5 mM Tris, pH 7.5. El producto unido se eluye luego de la columna con 22 mM NaCI, 50 mM Glicina, pH 3.0 y se neutraliza a pH 7.5 con 2.0 M Tris, pH 8.2. La columna se pela con 5 CV de 50 mM NaOH, 500 mM de sulfato de sodio y se almacena en 5 CV de 16% (v/v) etanol, 50 mM Tris, pH 7.5. Todas las operaciones de columna se desarrollan a temperatura ambiente y se resumen en la Tabla 7.

Tabla 7: Condiciones de Operación para Series de Exploración de Columna.

Operación Composición de Volúmenes de Velocidad de solución columna (CV) flujo (cm hr1) Equilibrio 150mM NaCI, 20 5 300 mM Tris; pH 7.5 Carqa Medio de cultivo — 300 condicionado Lavado 0.5 mM arqinina, 50 5 300 mM Tris; pH 7.5 Lavado a chorro 39 mM NaCI, 5 mM 3 300 pre-Elusión Tris; pH 7.5 Elusión 22 mM NaCI, 50 5(volumen de 300 mM qlicina; pico 3CV) pH 3.0 Pelado 50mM NaOH, 500 5 300 mM sulfato de sodio Almacenamiento 16% (V/V) etanol 5 300 50 mM Tris; pH 7.5 neutralización 20 M Tris; 0.9%(v/v) 300 pH 8.2 Como se muestra en la Figura 5, el lavado de arginina resulta en la recuperación ceptable de producto, mientras que proporciona niveles deseables de remoción de HCP reducción en turbidez pico neutralizada.

EJEMPLO 6 A-Beta mAb: Comparación de Amortiguadores de Lavado para Proteína A para HCP y Reducción de Turbidez y Recuperación de Producto La evaluación de varias soluciones de lavado se desarrolla primero utilizando un método detección de alto rendimiento (HTS). Se carga inicialmente una columna para proteína A MabSelect con medio condicionado de un proceso de cultivo de células de ovario de Hámster chino (CHO). La resina MabSelect se pone en suspensión luego y 100 pL de la suspensión de resina se suministra a cada pozo de una placa de microtítulo de 96 pozos. Cada pozo de la placa de microtítulo se lava luego con una solución de prueba bajo evaluación (ver Tabla 8), y se eluye posteriormente con un amortiguador de bajo pH. El grupo de elución de cada pozo se ensaya para turbidez pico por A320 y para recuperación de producto por A280. Basado en los resultados de estos experimentos HTS, las soluciones de prueba que producen la mayor recuperación y la mayor remoción de HCP se seleccionan para prueba adicional utilizando series de columna a pequeña escala. Estas soluciones de lavado son arginina y CaCI2.

Tabla 8: Soluciones de Lavado HTS Probadas En las series de columna, una columna de 1 .6cm (de diámetro) x 15 cm (de altura) se utiliza para estas evaluaciones. La columna para proteína A MabSelect se equilibra con un amortiguador que contiene 50 mM Tris, 0.15M NaCI pH 7.5, y se cargan con medio condicionado de células CHO que contienen mAb A-Beta a 40 mg/mL. La columna se lava a chorro luego con 2 volúmenes de columna (CV) de amortiguador de equilibrio, y se lava posteriormente con 5 CV de arginina o CaCI2. La columna se lava luego con 10 mM Tris, 10 mM NaCI pH 7.5 en preparación para la etapa de elusión. El producto unido se eluye posteriormente con 50 mM glicina, 10 mM NaCI pH 3.0. La turbidez pico neutralizada se mide por A320 o por un turbidímetro, se determina la recuperación de producto por A280, y el nivel HCP se determina por un ELISA. Tabla 9 resume las condición de columna para todos los experimentos descritos en este ejemplo.

Tabla 9: Condiciones de Operación de Columna para Proteína A Operación Composición de solución Volúmen Velocidad es de de flujo columna (cm hr"1) (CV) Equilibrio 50mM Tris, 0.15mM NaCI 5 <300 pH 7.5 Carga Medio de cultivo condicionado NA <300 Lavado a chorro 50mM Tris, 0.15mM NaCI 2 <300 post carga pH 7.5 Lavado 1 0.5 M Arginina 5 <300 50mM Tris pH 7.5 1 .0 M Arginina W/ 0.5 M CaCI2 0.1 M CaCI2 Lavado 2 10mM Tris, 10mM NaCI 5 pH 7.5 Elusión 50mM glicina, 10 mM NaCI 4 <300 pH 3.0 Neutralización 2 M Hepes pH 8.5 o 2M Tris pH -1 % 9.0 Pelado 50mM NaOH, 0.5 M sulfato de 5 <300 sodio Lavado pelado 50mM Tris, 0.15mM NaCI 5 pH 7.5 Almacenamiento 16% (V/V) etanol <300 Tabla 10: Datos para Proteína A para Estudios de Lavado La Tabla 10 muestra los resultados de recuperación y los valores HCP para los experimentos de lavado para A-Beta mAb. La Arginina y CaC12 son soluciones de lavado comparables para reducción de proteína de célula anfitriona y turbidez de grupo de pico final. La Arginina 0.5M se selecciona como la solución de lavado para el proceso A-Beta mAb basado en la menor prendida de producto durante el lavado.

EJEMPLO 7 IL-13 mAb-2: Comparación de Amortiguador de lavado para Proteína A para HCP y Reducción de Turbidez y Recuperación de Producto.

La Evaluación de varias soluciones de lavado para reducción de turbidez a través de la etapa de columna de proteina A se desarrolla inicialmente utilizando un método de detección de alto rendimiento (HTS). Se empaca una columna de 25 mL con resina MabSelect™ y se carga con medio condicionado CHO a una exposición de carga final de 50 mg de IL-13 mAb-2 por mL de resina. Luego la resina se coloca en suspensión y 100 uL de la suspensión de resina se suministra en cada pozo de una placa de microtítulo de 96 pozos. Cada pozo de la placa de microtítulo se lava luego con una solución de prueba bajo evaluación, el producto unido se eluye, y el grupo de elución ácido se neutraliza.

Para el HTS, se utilizan varios lavados de excipiente, amortiguadores de elusión y valorantes, de forma combinada y con concentraciones variantes. Los lavados de excipiente utilizados en el HTS son cloruro de calcio, cloruro de sodio, Tris, y Arginina. Los amortiguadores de elusión utilizados en el HTS son glicina, HEPES, y ácido acético junto con concentraciones variantes de NaCI. Los valorantes utilizados en el HTS son Tris, HEPES e Imidazol.

Utilizar A320 como un surrogado para precipitación, la efectividad de las soluciones de lavado se evalúa al comparar los valores A320 normalizados de los grupos de elusión neutralizados. La arginina prueba la mayor efectividad en reducir las lecturas A320 del pico eluido. Basado en los resultados de estos experimentos HTS, las soluciones de prueba que producen la mayor recuperación y la menor turbidez se seleccionan para pruebas adicionales utilizando series de exploración de columna a pequeña escala. Esto conduce a la prueba adicional de cloruro de calcio, arginina, y cloruro de sodio (control) como amortiguadores de lavado en ensayo de columna a pequeña escala.

El medio de cultivo condicionado de un proceso de cultivo CHO que contiene IL-13 mAb-2 se purifica a pequeña escala utilizando columna para proteina A abSelect™ operado a temperatura ambiente. Los tamaños de columna utilizados para la evaluación inicial son 1 .1 cm de diámetro con altura de lecho de 20 cm a 25 cm. La exposición de carga se fija en 35 mg/mL de resina para estas series. Las condiciones utilizadas para las series de exploración se resumen en la Tabla 11.

Tabla 11 : Condiciones de Operación Utilizadas para Series de Exploración Operación Composición de solución Volúmenes de Velocidad de columna (CV) flujo (cm hr"1) Equilibrio 150mM NaCI, 50 mM Tris; pH 5 300 7.5 Carga Medio de cultivo condicionado - 240 Lavado a 150mM NaCI, 50 mM Tris; pH 5 300 chorro post 7.5 carga Lavado Solución de prueba (ver Tabla 5 300 12) Pre-Elusión 10mM Tris, concentración NaCI 3 300 lavado igual a amortiguar de elusión, pH 7.5 Elusión Ver Tabla 13 6 CV(3 CV 300 volumen pico) Pelado 50mM NaOH, 500 mM sulfato 5 180 de sodio Almacenamie 16% (V/V) etanol, 50mM Tris, 5 300 nto 150 mM NaCI, pH 7.5 Neutralización Ver Tabla 13 -1 -5% (v/v) Tabla 12: Lista de soluciones de lavado evaluadas Tabla 13: Lista de amortiguadores de titración y elusión empleados Referencia Amortiguador de elusión A 50mM glicina, 20mM NaCI, pH 3.1 B 50mM glicina, 50mM NaCI, pH 3.1 C 50mM ácido acético , 20mM NaCI, pH 3.1 valorante D 2.0 M Tris, pH 9.0 E 2.0 M HEPES, pH 9.0 F 2.0 M Imidazol, pH 8.0 En resumen, la columna para proteína A MabSelect™ se equilibra y carga con medio condicionado CHO que contiene IL- 13 mAb-2. Luego la columna se lava con 5 CV de un amortiguador de sal 5 CV de la solución de lavado bajo evaluación. Luego se lava la columna con 3 CV de una solución baja en sal en preparación para la etapa de elusión. El producto unido se eluye luego con solución que contiene glicina o ácido acético como en la especie de amortiguación con un pH of 3.1 . Este grupo de pico se neutraliza independientemente con tres diferente valorantes. La turbidez de pico neutralizada se mide con un turbidímetro, la recuperación de producto de mide por A280, y el nivel HCP se cuantifica con ELISA. Los resultados de estos experimentos se resumen en la Figura 6.

En cada concentración ensayada y con varios amortiguadores de elusión (ver Tabla 13), se encuentra que la arginina es más efectiva que el cloruro de calcio o cloruro de sodio en reducir la turbidez de grupo de pico neutralizada y ácida. Este hallazgo es consiste sin los grupos ácidos se neutralizan con This, HEPES, o valorante imidazol (ver Tabla 13).

Adicionalmente, se demuestra que el efecto de un lavado de arginina no se restringe a un pH discreto, final del grupo neutralizado. A través de un rango de pH de 7.5-8.2 (por ejemplo, 7.5, 7.7, 7.9, 8.0, 8.1 , y 8.2), los valores de turbidez de pico neutralizado se reducen cuando se incrementa el pH. A través de este mismo rango, sin embargo, el empleo de lavados de arginina siempre resulta en un menor NTU que si se utiliza cloruro de calcio.

La recuperación de producto cargado es >95% para cada lavado ensayado con excipiente. Los datos de HTS indican que la menor recuperación medible se puede obtener al lavar con >1 .5 M de cloruro de calcio, por lo cual esta concentración no se ensayo La especie de lavado examinada no se puede diferenciar basada en la concentración final de HCP, HMW, y proteína A en el grupo pico. Sin embargo, un análisis de la fracción de lavado eluida con 1 .0 M de lavado de Arginina revela consistentemente niveles significativos de HCP. Los niveles HCP en la fracción de lavado son ~49000 ppm mientras solo -22000 ppm en el pico. Esto es evidencia de que el lavado con arginina remueve selectivamente el HCP.

Todas las referencias citadas aquí se incorporan como referencia en su totalidad para todos los propósitos al mismo grado como si cada publicación individual o patente o solicitud de patente se indicara individual y específicamente para ser incorporada como referencia en su totalidad para todos los propósitos. Al grado en que las publicaciones y patente o solicitudes de patente incorporadas como referencia contradicen la descripción contenida en la especificación, la especificación está destinada a remplazar y/o tomar precedencia sobre cualquier tal material contradictorio.

Todos los números que expresan cantidades de ingrediente, condiciones de reacción, y así sucesivamente utilizados en la especificación y en reivindicaciones se entiende que se modifica en todos los casos por el término "aproximadamente". De acuerdo con lo anterior, al menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la especificación y reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas buscadas para ser obtenidas por la presente intención. Por último, y no como un intento por limitar la solicitud de la doctrina de equivalente para el alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico se debe constituir en claridad del número de dígitos significativos y métodos de redondeo ordinarios.

Se pueden hacer variaciones y modificaciones de esta invención sin apartarse de su espíritu y alcance, como será evidente para aquellos expertos en la técnica. Las modalidades específicas descritas aquí se ofrecen solo por vía de ejemplo y no significan que son limitantes de ninguna forma. Se pretende que la especificación y ejemplos se consideren solo como ejemplos, con un espíritu y alcance verdadero de la invención que se indica por las siguientes reivindicaciones.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un método para aislar un producto, el método comprende: (a) proporcionar un fluido de carga que comprende un producto y una o más impurezas; (b) poner en contacto el fluido de carga con un medio, en donde el medio puede unir el producto bajo condiciones adecuadas para unir el producto, proporcionando por lo tanto un medio unido; (c) poner en contacto el medio unido con una o más soluciones de lavado a través del medio unido, en donde por lo menos una solución de lavado comprende arginina, en donde la concentración de arginina no es 1 M, proporcionando por lo tanto un medio de lavado; (d) poner en contacto el medio de lavado con una solución de elución bajo condiciones adecuadas para eluir el producto, y (e) recolectar un eluido que comprende el producto. Un método para aislar un producto, el método comprende: (a) proporcionar un fluido de carga que comprende un producto y una o más impurezas; (b) poner en contacto el fluido de carga con un medio, en donde el medio puede unir el producto bajo condiciones adecuadas para unir el producto, proporcionando por lo tanto un medio unido; (c) poner en contacto el medio unido con una o más soluciones de lavado a través del medio unido, en donde por lo menos una solución de lavado comprende arginina, en donde la concentración de arginina es aproximadamente 0.1 M a aproximadamente 0.9 M, proporcionando por lo tanto un medio de lavado; (d) poner en contacto el medio de lavado con una solución de elución bajo condiciones adecuadas para eluir el producto, y (e) recolectar un eluido que comprende el producto. Un método para aislar un producto, el método comprende: (a) proporcionar un fluido de carga que comprende un producto y una o más impurezas; (b) poner en contacto el fluido de carga con un medio, en donde el medio puede unir el producto bajo condiciones adecuadas para unir el producto, proporcionando por lo tanto un medio unido; (c) poner en contacto el medio unido con una o más soluciones de lavado a través del medio unido, en donde por lo menos una solución de lavado comprende arginina, en donde la concentración de arginina es aproximadamente 1.1 M a aproximadamente 2.0 M, proporcionando por lo tanto un medio de lavado; (d) poner en contacto el medio de lavado con una solución de elución bajo condiciones adecuadas para eluir el producto, y (e) recolectar un eluido que comprende el producto. Un método para aislar un producto, el método comprende: (a) proporcionar un fluido de carga que comprende un producto y una o más impurezas; (b) poner en contacto el fluido de carga con un medio, en donde el medio puede unir el producto bajo condiciones adecuadas para unir el producto, proporcionando por lo tanto un medio unido; (c) poner en contacto el medio unido con una o más soluciones de lavado a través del medio unido, en donde por lo menos una solución de lavado comprende un derivado de arginina, proporcionando por lo tanto un medio de lavado; (d) poner en contacto el medio de lavado con una solución de elución bajo condiciones adecuadas para eluir el producto, y (e) recolectar un eluido que comprende el producto. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde el producto es una proteína. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde el producto es un anticuerpo. El método de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es específico para GDF-8. El método de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es específico para IL-13. El método de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es específico para IL-22. El método de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es específico para RAGE. El método de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es específico para A-Beta. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde el producto es un fragmento de unión a antígeno. 13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde el producto es una proteína de fusión Ig. 14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde el producto es una proteína de fusión. , una proteína que contiene Fe, un inmunoconjugado, una citoquina, una interleuquina, una hormona, o una enzima terapéutica. 15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -14, en donde el medio es una columna de cromatografía para proteína A. 16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -14, en donde el medio es una columna de cromatografía para proteína G. 17. El método de la reivindicación 4, en donde la concentración del derivado de arginina en la solución de lavado es aproximadamente 0.1 M a aproximadamente 2.0 M. 18. El método de la reivindicación 1 , en donde la concentración de arginina en la solución de lavado es aproximadamente 0.1 M a aproximadamente 0.9 M. 19. El método de la reivindicación 1 , en donde la concentración de arginina en la solución de lavado es aproximadamente 1 .1 M a aproximadamente 2.0 M. 20. El método de la reivindicación 1 , en donde la concentración de arginina en la solución de lavado es aproximadamente 0.5 M. 21 . El método de la reivindicación 4, en donde el derivado de arginina es acetil arginina, agmatina, ácido argínico, N-alfa-butiroil-L-arginina, o N-alfa-pivaloil arginina. 22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -21 , en donde el pH de la solución de lavado es aproximadamente 4.5 a aproximadamente 8.0. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -21 , en donde el pH de la solución de lavado es mayor de 4.5 y menor de aproximadamente 8.0. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -21 , en donde el pH de la solución de lavado es aproximadamente 7.5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-24, en donde una o más de las impurezas son una proteína de célula anfitriona, un ácido nucleico, una variante de producto, una endotoxina, Proteína A, o Proteína G. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -24, en donde una o más de las impurezas es un virus o su fragmento. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -26, en donde la solución de elución comprende por lo menos una de cloruro de sodio, arginina o un derivado de arginina, glicina, HEPES, y ácido acético. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -27, en donde la solución de elución tiene un pH de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -28, en donde el eluido comprende un producto aislado y la pureza del producto aislado se incrementa comparado con un método correspondiente en el que se utiliza menos de aproximadamente 0.1 M de arginina o derivado de arginina en una solución de lavado. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -28, en donde el eluido comprende un producto aislado, y en donde la proporción del producto con por lo menos una impureza se incrementa comparado con un método correspondiente en el que no se utiliza ninguna cantidad no detectable de arginina o derivado de arginina en una solución de lavado. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -28, en donde el eluido comprende un producto, y en donde la proporción del producto con proteína de célula anfitriona se incrementa comparado con un método correspondiente en el que se utiliza menos de aproximadamente 0.1 M de arginina o derivado de arginina en una solución de lavado. 32. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -28, en donde el eluido comprende un producto, y en donde la proporción del producto con proteína de célula anfitriona se incrementa comparado con un método correspondiente en el que no se utiliza ninguna cantidad no detectable de arginina o derivado de arginina en una solución de lavado. 33. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -32, en donde se reduce la turbidez del eluido comparada con un método correspondiente en el que se utiliza menos de aproximadamente 0.1 M de arginina o derivado de arginina en una solución de lavado. 34. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -32, en donde se reduce la turbidez del eluido comparada con un método correspondiente en el que no se utiliza ninguna cantidad no detectable de arginina o derivado de arginina en una solución de lavado. 35. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -34, en donde el producto en el eluido se purifica adicionalmente y/o se formula para uso terapéutico. 36. Un producto preparado por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -35. 37. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -35, en donde en la etapa (a), por lo menos una impureza se une al producto y en la etapa (c), poner en contacto el medio unido con una o más soluciones de lavado a través del medio unido que remueve dicha por lo menos una impureza que se une al producto. 38. Un método para aislar un anticuerpo, el método comprende: (a) proporcionar un fluido de carga que comprende el anticuerpo y una o más impurezas; (b) poner en contacto el fluido de carga con un medio de Proteína A o medio de Proteina G, en donde el medio puede unir el anticuerpo bajo condiciones adecuadas para unir el anticuerpo, proporcionando por lo tanto un medio unido; (c) poner en contacto el medio unido con una o más soluciones de lavado, en donde por lo menos una solución de lavado comprende arginina o un derivado de arginina, en donde la concentración de arginina no es 1 M, proporcionando por lo tanto un medio de lavado; (d) poner en contacto el medio de lavado con una solución de elución bajo condiciones adecuadas para eluir el anticuerpo; y (e) recolectar un eluido que comprende el anticuerpo, en donde se incrementa la proporción del anticuerpo con la proteína de célula anfitriona en el eluido y en donde el eluido tiene turbidez reducida comparada con un eluido recuperado en un método correspondiente en el que no se utiliza ninguna cantidad no detectable de arginina en una solución de lavado. El método de la reivindicación 38, en donde en la etapa (c) el pH de la solución de lavado es aproximadamente 4.5 a aproximadamente 8.0. El método de la reivindicación 38, en donde la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es aproximadamente 0.1 M a aproximadamente 0.9 M. El método de la reivindicación 38, en donde la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es aproximadamente 1 .1 M a aproximadamente 2.0 M. El método de la reivindicación 38, en donde la concentración de arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es aproximadamente 0.5 M. Un método para reducir turbidez en un eluido que comprende un producto, el método comprende: (a) proporcionar un fluido de carga que comprende el producto y una o más impurezas; (b) poner en contacto el fluido de carga con un medio, en donde el medio puede unir el producto bajo condiciones adecuadas para unir el producto, proporcionando por lo tanto un medio unido; (c) poner en contacto el medio unido con una o más soluciones de lavado, en donde por lo menos una solución de lavado comprende arginina o un derivado de arginina, en donde la concentración de arginina no es 1 M, proporcionando por lo tanto un medio de lavado; (d) poner en contacto el medio de lavado con una solución de elución bajo condiciones adecuadas para eluir el producto, generando por lo tanto un eluido que comprende el producto; y (e) neutralizar el eluido, en donde el eluido tiene turbidez reducida comparada con un método correspondiente en el que no se utiliza arginina detectable o derivado de arginina en una solución de lavado. El método de la reivindicación 43, en donde el pH del eluido neutralizado está entre aproximadamente 6.5 y aproximadamente 8.2. El método de la reivindicación 43 o 44, en donde en la etapa (c) la solución de lavado comprende el derivado de arginina en una concentración de aproximadamente 0.1 M a aproximadamente 2.0 M. El método de la reivindicación 43 o 44, en donde en la etapa (c) la solución de lavado comprende arginina o un derivado de arginina en una concentración de aproximadamente 0.1 M a aproximadamente 0.9 M. El método de la reivindicación 43 o 44, en donde en la etapa (c) la solución de lavado comprende arginina o un derivado de arginina en una concentración de aproximadamente 1 .1 M a aproximadamente 2.0 M. El método de la reivindicación 43 o 44, en donde en la etapa (c) la solución de lavado comprende arginina o un derivado de arginina en una concentración de aproximadamente 0.5 M. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 43-48, en donde el pH de la solución de lavado es aproximadamente 4.5 a aproximadamente 8.0. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 43-49, en donde el método no comprende filtración absortiva ascendente aniónica. Un método para reducir turbidez e impurezas en un eluido que comprende un producto, el método comprende: (a) proporcionar un fluido de carga que comprende el producto y una o más impurezas; (b) poner en contacto el fluido de carga con un medio, en donde el medio puede unir el producto bajo condiciones adecuadas para unir el producto, proporcionando por lo tanto un medio unido; (c) poner en contacto el medio unido con una o más soluciones de lavado, en donde por lo menos una solución de lavado comprende arginina o un derivado de arginina, en donde la concentración de arginina no es 1 M, proporcionando por lo tanto un medio de lavado; (d) poner en contacto el medio de lavado con una solución de elución bajo condiciones adecuadas para eluir el producto, generando por lo tanto un eluido que comprende el producto; y (e) neutralizar el eluido, en donde se incrementa la proporción del producto con por lo menos una impureza en el eluido y el eluido tiene turbidez reducida comparada con un método correspondiente en el que no se utiliza arginina detectable o derivado de arginina en una solución de lavado. 52. El método de la reivindicación 51 , en donde en la etapa (c) la concentración del derivado de arginina en la solución de lavado es aproximadamente 0.1 M a aproximadamente 2.0 M. 53. El método de la reivindicación 51 , en donde en la etapa (c) la concentración de la arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es aproximadamente 0.1 M a aproximadamente 0.9 M. 54. El método de la reivindicación 51 , en donde en la etapa (c) la concentración de la arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es aproximadamente 1 .1 M a aproximadamente 2.0 M. 55. El método de la reivindicación 51 , en donde en la etapa (c) la concentración de la arginina o derivado de arginina en la solución de lavado es aproximadamente 0.5 M. 56. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 51 -55, en donde el pH de la solución de lavado es aproximadamente 4.5 a aproximadamente 8.0. 57. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 51 -56, en donde el método no comprende filtración absortiva ascendente aniónica. 58. Un método para aislar un producto, el método comprende: (a) proporcionar un fluido de carga que comprende un producto y una o más impurezas; (b) poner en contacto el fluido de carga con un medio, en donde el medio puede unir el producto bajo condiciones adecuadas para unir el producto, proporcionando por lo tanto un medio unido; (c) poner en contacto el medio unido con una o más soluciones de lavado a través del medio unido, en donde por lo menos una solución de lavado comprende arginina, en donde la concentración de arginina o un derivado de arginina es mayor de 1.0 M, proporcionando por lo tanto un medio de lavado; (d) poner en contacto el medio de lavado con una solución de elución bajo condiciones adecuadas para eluir el producto, y (e) recolectar un eluido que comprende el producto. Un método para aislar un producto, el método comprende: (a) proporcionar un fluido de carga que comprende un producto y una o más impurezas; (b) poner en contacto el fluido de carga con un medio, en donde el medio puede unir el producto bajo condiciones adecuadas para unir el producto, proporcionando por lo tanto un medio unido; (c) poner en contacto el medio unido con una o más soluciones de lavado a través del medio unido, en donde por lo menos una solución de lavado comprende arginina, en donde la concentración de arginina o un derivado de arginina es menor de 1.0 M, proporcionando por lo tanto un medio de lavado; (d) poner en contacto el medio de lavado con una solución de elución bajo condiciones adecuadas para eluir el producto, y (e) recolectar un eluido que comprende el producto. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 59, en donde el producto en el eluido se purifica adicionalmente y/o se formula para terapéutico.