JP2971293B2 - 溶血性連鎖球菌の産生する生理活性物質及びその製造法 - Google Patents
溶血性連鎖球菌の産生する生理活性物質及びその製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は溶血性連鎖球菌（以下
「溶連菌」と称す）の培養上澄から得られ、リンパ球増
殖、感染防御、抗腫瘍活性を有する新規タンパク質に関
する。
「溶連菌」と称す）の培養上澄から得られ、リンパ球増
殖、感染防御、抗腫瘍活性を有する新規タンパク質に関
する。
【０００２】
【従来の技術】溶連菌の生菌が抗腫瘍活性を有すること
は古くから知られているが、溶連菌が病原菌であること
から、これを即座に治療に供することは出来ず、過去に
おいて治療に供すべく種々の検討がなされてきた。例え
ば溶連菌の弱毒株の生菌を比較的高濃度のペニシリンＧ
の存在下で一定条件で処理し凍結乾燥したものがピシバ
ニールの商標名で抗腫瘍剤として知られている。
は古くから知られているが、溶連菌が病原菌であること
から、これを即座に治療に供することは出来ず、過去に
おいて治療に供すべく種々の検討がなされてきた。例え
ば溶連菌の弱毒株の生菌を比較的高濃度のペニシリンＧ
の存在下で一定条件で処理し凍結乾燥したものがピシバ
ニールの商標名で抗腫瘍剤として知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら菌体その
ものを原料とした場合、菌体そのものの維持管理および
処理方法の均一化等を極めて慎重に行う必要があるなど
安定供給する上で問題点を有していた。
ものを原料とした場合、菌体そのものの維持管理および
処理方法の均一化等を極めて慎重に行う必要があるなど
安定供給する上で問題点を有していた。
【０００４】これらの事情を鑑み、本発明は物理化学的
および生理学的に均一なタンパク質として得ることが出
来るようにしたものである。
および生理学的に均一なタンパク質として得ることが出
来るようにしたものである。
【０００５】本発明者らは溶連菌の培養上澄中の有効成
分を検索した結果、リンパ球の増殖、感染防御および抗
腫瘍活性を有する新規タンパク質を見出した。本発明は
この新規知見に基づき完成したものである。
分を検索した結果、リンパ球の増殖、感染防御および抗
腫瘍活性を有する新規タンパク質を見出した。本発明は
この新規知見に基づき完成したものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は溶連菌の培養上
澄から得られ、リンパ球増殖刺激活性、感染防御活性、
抗腫瘍活性を有する新規タンパク質に関する。
澄から得られ、リンパ球増殖刺激活性、感染防御活性、
抗腫瘍活性を有する新規タンパク質に関する。
【０００７】本発明において溶連菌としては、例えばSt
reptococcus pyogenes Su株（ATCC21060）, Streptococ
cus pyogenes Sv株（ATCC 21059）, Streptococcus pyo
genes T-12（ATCC 12353）および Streptococcus pyoge
nes C203（ATCC 12384）等が挙げられるが、特にこれら
に限定されるものではない。
reptococcus pyogenes Su株（ATCC21060）, Streptococ
cus pyogenes Sv株（ATCC 21059）, Streptococcus pyo
genes T-12（ATCC 12353）および Streptococcus pyoge
nes C203（ATCC 12384）等が挙げられるが、特にこれら
に限定されるものではない。
【０００８】溶連菌の培養上澄より目的とする生物学的
活性成分を得る製法は、例えば、溶連菌の培養上澄を硫
酸アンモニュウム沈澱法により濃縮、透析する。次にイ
オン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過、凍結乾燥
等によって分子量２万−３万の生理活性物質を精製する
ことにより得られる。
活性成分を得る製法は、例えば、溶連菌の培養上澄を硫
酸アンモニュウム沈澱法により濃縮、透析する。次にイ
オン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過、凍結乾燥
等によって分子量２万−３万の生理活性物質を精製する
ことにより得られる。
【０００９】
【作用】このようにして得られた生理活性物質は健康正
常人の末梢血およびマウス脾臓細胞よりFicoll-isopaqu
e法を用いて採取した末梢血単核細胞の増殖を促進し
た。マウスにヘルペスウイルスを感染させる２日前より
投与すると全ての動物は感染死を免れた。マウスに細菌
感染（リステリア菌、溶連菌）させる前に本物質を投与
しておくと感染死を免れた。さらに、マウスに腫瘍を移
植する前に本物質を投与しておくと有意に延命および転
移抑制効果を示した。以上のような有効作用を有してい
る。
常人の末梢血およびマウス脾臓細胞よりFicoll-isopaqu
e法を用いて採取した末梢血単核細胞の増殖を促進し
た。マウスにヘルペスウイルスを感染させる２日前より
投与すると全ての動物は感染死を免れた。マウスに細菌
感染（リステリア菌、溶連菌）させる前に本物質を投与
しておくと感染死を免れた。さらに、マウスに腫瘍を移
植する前に本物質を投与しておくと有意に延命および転
移抑制効果を示した。以上のような有効作用を有してい
る。
【００１０】以下本発明について詳細に説明する。
【００１１】本発明に使用される溶連菌としては溶連菌
に属する菌ならどれでも良い。例えば、溶連菌Ｔ−１２
株を液体培地（ミンチビーフ１０ｇ、トリプトン２０
ｇ、ブドウ糖２ｇ、重炭酸ナトリウム２ｇ、塩化ナトリ
ウム２ｇ、無水リン酸二ナトリウム０．４ｇを蒸留水１
リットルに溶かしｐＨを７．８に調整し、１１５℃で１
０分間高圧滅菌する）に植え、３７℃で２４時間以内、
振盪あるいは撹拌培養する。本培養液より遠心分離器等
で生理活性物質を含む上澄を得る。
に属する菌ならどれでも良い。例えば、溶連菌Ｔ−１２
株を液体培地（ミンチビーフ１０ｇ、トリプトン２０
ｇ、ブドウ糖２ｇ、重炭酸ナトリウム２ｇ、塩化ナトリ
ウム２ｇ、無水リン酸二ナトリウム０．４ｇを蒸留水１
リットルに溶かしｐＨを７．８に調整し、１１５℃で１
０分間高圧滅菌する）に植え、３７℃で２４時間以内、
振盪あるいは撹拌培養する。本培養液より遠心分離器等
で生理活性物質を含む上澄を得る。
【００１２】次いでこの上澄液から通常用いられている
精製手段により分子量２万−３万の精製生理活性物質を
得る事ができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロ
マト、ゲル濾過、凍結乾燥などにより精製を行い、純化
された生理活性物質を得ることができる。
精製手段により分子量２万−３万の精製生理活性物質を
得る事ができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロ
マト、ゲル濾過、凍結乾燥などにより精製を行い、純化
された生理活性物質を得ることができる。
【００１３】本発明の生理活性物質の物理化学的性質お
よび生物学的性質は次のとおりである。
よび生物学的性質は次のとおりである。
【００１４】（Ｉ）分子量 （ｉ）分子量約２．３万−２．７万（ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法）、（ｉｉ）分子量約２．０
万−３．０万（ゲル濾過法）
リルアミドゲル電気泳動法）、（ｉｉ）分子量約２．０
万−３．０万（ゲル濾過法）
【００１５】（ＩＩ）アミノ酸分析（表１）
【００１６】
【表１】
【００１７】（ＩＩＩ）等電点 等電点８．０−１０．０エレクトロフォーカッシング
（ファルマシア社）による。
（ファルマシア社）による。
【００１８】（ＩＶ）酸およびアルカリに対する安定性 塩酸（ｐＨ４．０）および水酸化ナトリウム（ｐＨ９．
０）に１０分の処理で安定。
０）に１０分の処理で安定。
【００１９】（Ｖ）熱安定性 １００℃ ５分間で安定、−２０℃から−８０℃で６カ
月間安定。
月間安定。
【００２０】（ＶＩ）各種分解酵素活性に対する安定性 トリプシン、フォスフォリパーゼＡ2およびＣ、プロテ
イナーゼＫ、ニューラミニデース、ガラクトオキシデー
ス処理で安定。
イナーゼＫ、ニューラミニデース、ガラクトオキシデー
ス処理で安定。
【００２１】（ＶＩＩ）従来から知られている菌体由来
物質との相違点 ストレプトコッカルエクソトキシンＡ（Streptococcal
pyrogenic exotoxin A）によるリンパ球増殖はインター
ロイキン２（ＩＬ−２）の産生を伴う反応であるが、本
物質の反応にはＩＬ−２の関与はない。さらに抗ストレ
プトコッカルエクソトキシンＡ血清（ウサギ）と反応を
示さないことから、これら毒素とは異なっている。
物質との相違点 ストレプトコッカルエクソトキシンＡ（Streptococcal
pyrogenic exotoxin A）によるリンパ球増殖はインター
ロイキン２（ＩＬ−２）の産生を伴う反応であるが、本
物質の反応にはＩＬ−２の関与はない。さらに抗ストレ
プトコッカルエクソトキシンＡ血清（ウサギ）と反応を
示さないことから、これら毒素とは異なっている。
【００２２】（ＶＩＩＩ）生物学的特徴 作用１：人およびマウスのリンパ球増殖作用 作用２：細菌およびウイルスの感染防御作用 作用３：抗腫瘍作用
【００２３】以下に本発明による生理活性物質の製造法
および生理活性作用に関して更に実施例をもって示す
が、本発明が以下の実施例にのみ限定されるものではな
い。
および生理活性作用に関して更に実施例をもって示す
が、本発明が以下の実施例にのみ限定されるものではな
い。
【００２４】
【実施例１】 生理活性物質の製造法 以下の操作は４℃で行い、遠心分離は８０００Ｘｇ、３
０分の条件で行った。Streptococcus pyogenes T-I2の
培養上澄１４ｌに６０％飽和になるように硫安を加え、
１時間静置し、沈澱画分を遠心分離で回収した後、２０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に透析した。同緩衝液で
平衡化したＣＭセルロース５２（ワットマン社製）をカ
ラム（３０×５０ｃｍ）につめ、透析内液を添加し、
０．１Ｍ酢酸緩衝液を流し溶出される画分を捨て、さら
に０．５Ｍ酢酸緩衝液で溶出した活性画分を回収し、蒸
留水に透析後、凍結乾燥した。次に２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したセファクリルＳ−
２００（２．０×１００ｃｍ）（ファルマシア社製）の
カラムに添加し、同緩衝液で溶出して分子量約２万−３
万の分画を集め濃縮した。さらにこれをセファデックス
Ｇ−５０（１．２×１００ｃｍ）（ファルマシア社製）
のカラムに添加し、同緩衝液で溶出した。最初に溶出す
る画分を捨て、ほぼ分子量２万−３万の活性画分を回収
し、凍結乾燥した。続いて同一カラムで再び分画して精
製品とした（図１参照）。この精製行程でリンパ球増殖
活性物質の比活性は約６００倍に精製され、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド電気泳動分析で単一のバンドとして得
られた。
０分の条件で行った。Streptococcus pyogenes T-I2の
培養上澄１４ｌに６０％飽和になるように硫安を加え、
１時間静置し、沈澱画分を遠心分離で回収した後、２０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に透析した。同緩衝液で
平衡化したＣＭセルロース５２（ワットマン社製）をカ
ラム（３０×５０ｃｍ）につめ、透析内液を添加し、
０．１Ｍ酢酸緩衝液を流し溶出される画分を捨て、さら
に０．５Ｍ酢酸緩衝液で溶出した活性画分を回収し、蒸
留水に透析後、凍結乾燥した。次に２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したセファクリルＳ−
２００（２．０×１００ｃｍ）（ファルマシア社製）の
カラムに添加し、同緩衝液で溶出して分子量約２万−３
万の分画を集め濃縮した。さらにこれをセファデックス
Ｇ−５０（１．２×１００ｃｍ）（ファルマシア社製）
のカラムに添加し、同緩衝液で溶出した。最初に溶出す
る画分を捨て、ほぼ分子量２万−３万の活性画分を回収
し、凍結乾燥した。続いて同一カラムで再び分画して精
製品とした（図１参照）。この精製行程でリンパ球増殖
活性物質の比活性は約６００倍に精製され、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド電気泳動分析で単一のバンドとして得
られた。
【００２５】
【実施例２】 リンパ球増殖効果 健康正常人末梢血あるいはマウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｂ
ＡＬＢ／ｃ）の脾臓よりフィコールアイソパック（ファ
ルマシア社製）を用いて単核細胞を採取し、本活性物質
のリンパ球増殖作用を［3Ｈ］サイミジンの取り込み量
で測定した。リンパ球の培養液はＬ−グルタミン添加Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地を用い、自己血清を５６℃で３０分
非動化し、１０％の割合で培地に添加した。本活性物質
を０．０１−１０μｇ／ｍｌに単核細胞に加え培養する
と５日から８日まで細胞の強い増殖が起こった。しか
も、ヒトのインターロイキン２に依存しない特異反応で
あった。この事実は、これまで報告されているＴ細胞増
殖因子であるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）やコンカ
ナバリンＡと異なった新規活性物質であることが明らか
となった。本発明による精製品のセファデックスＧ−５
０における溶出曲線と生理活性を図１に示した。図１の
縦軸は吸光度Ａ２３０ｎｍ、Ａ２８０ｎｍおよびリンパ
球増殖率（本物質添加による［3Ｈ］サイミジンの取り
込みの最大値を１００とし非添加を１として算出）を示
し、横軸は溶出量を示す。
ＡＬＢ／ｃ）の脾臓よりフィコールアイソパック（ファ
ルマシア社製）を用いて単核細胞を採取し、本活性物質
のリンパ球増殖作用を［3Ｈ］サイミジンの取り込み量
で測定した。リンパ球の培養液はＬ−グルタミン添加Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地を用い、自己血清を５６℃で３０分
非動化し、１０％の割合で培地に添加した。本活性物質
を０．０１−１０μｇ／ｍｌに単核細胞に加え培養する
と５日から８日まで細胞の強い増殖が起こった。しか
も、ヒトのインターロイキン２に依存しない特異反応で
あった。この事実は、これまで報告されているＴ細胞増
殖因子であるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）やコンカ
ナバリンＡと異なった新規活性物質であることが明らか
となった。本発明による精製品のセファデックスＧ−５
０における溶出曲線と生理活性を図１に示した。図１の
縦軸は吸光度Ａ２３０ｎｍ、Ａ２８０ｎｍおよびリンパ
球増殖率（本物質添加による［3Ｈ］サイミジンの取り
込みの最大値を１００とし非添加を１として算出）を示
し、横軸は溶出量を示す。
【００２６】
【実施例３】 細胞感染における本物質の効果 マウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ）、雄４週齡を用い、溶連菌
（Streptococcus pyogenes C203）を３×１０個、腹腔
内に感染させる４日から１日前に本物質１００μｇを１
日１回腹腔内に投与し、７日後の生死で判定した。本物
質を投与しない対象群では全て死亡したのに対し、４日
から１日の間に本物質を投与したマウスでは全て生存し
た。本物質の投与により顕著な感染防御効果を示した。
また、マウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ）、雄４週齡を用い、リ
ステリア菌（Listeriamonocytogeneses EGD）を３．４
×１０5個を静脈内に感染させる４日から１日前に本物
質１００μｇを１日１回腹腔内に投与し、感染１４日後
の生死で判定した。本物質を投与しない対象群は全て死
亡したのに対し、４日間前投与したマウスでは７匹中５
匹が生存した。つまり生存率７１．４％と高い感染防御
効果があった。
（Streptococcus pyogenes C203）を３×１０個、腹腔
内に感染させる４日から１日前に本物質１００μｇを１
日１回腹腔内に投与し、７日後の生死で判定した。本物
質を投与しない対象群では全て死亡したのに対し、４日
から１日の間に本物質を投与したマウスでは全て生存し
た。本物質の投与により顕著な感染防御効果を示した。
また、マウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ）、雄４週齡を用い、リ
ステリア菌（Listeriamonocytogeneses EGD）を３．４
×１０5個を静脈内に感染させる４日から１日前に本物
質１００μｇを１日１回腹腔内に投与し、感染１４日後
の生死で判定した。本物質を投与しない対象群は全て死
亡したのに対し、４日間前投与したマウスでは７匹中５
匹が生存した。つまり生存率７１．４％と高い感染防御
効果があった。
【００２７】
【実施例４】 ウイルス感染における本物質の効果 マウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ）、雄６週齡を用い、ヘルペス
ウイルス（HSV-1,Miyama株）を１０ＰＦＵを腹腔内に感
染させる３日前、２日前、１日前のいずれか１回、ある
いは３日間１回、本物質１００μｇを腹腔内に投与し、
ウイルス感染２０日後の生存率で判定した。本物質を投
与しない対象群では全て死亡したのに対し、３日間本物
質を投与したマウスでは全て生存した。本物質の投与に
より顕著な感染防御効果を示した。
ウイルス（HSV-1,Miyama株）を１０ＰＦＵを腹腔内に感
染させる３日前、２日前、１日前のいずれか１回、ある
いは３日間１回、本物質１００μｇを腹腔内に投与し、
ウイルス感染２０日後の生存率で判定した。本物質を投
与しない対象群では全て死亡したのに対し、３日間本物
質を投与したマウスでは全て生存した。本物質の投与に
より顕著な感染防御効果を示した。
【００２８】
【実施例５】 抗腫瘍効果 マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）、雄６週齡を用い、腫瘍細胞は
肝転移型のＲＬ♂１を２×１０6細胞を静脈内に移植す
る前１日１回、３日間、本物質１００μｇを腹腔内に投
与し、腫瘍移植１４日後における肝臓の腫瘍結節数で転
移を判定した。本物質を投与しない対象群の結節数は１
４０個であったのに比べ、本物質投与群は３０個と転移
が抑制されていた。
肝転移型のＲＬ♂１を２×１０6細胞を静脈内に移植す
る前１日１回、３日間、本物質１００μｇを腹腔内に投
与し、腫瘍移植１４日後における肝臓の腫瘍結節数で転
移を判定した。本物質を投与しない対象群の結節数は１
４０個であったのに比べ、本物質投与群は３０個と転移
が抑制されていた。
【００２９】
【発明の効果】本発明により、リンパ球増殖、細菌およ
びウイルス感染防御、腫瘍転移抑制等の作用の解明に有
用な純化された生理活性物質及びその製造法が提供され
た。
びウイルス感染防御、腫瘍転移抑制等の作用の解明に有
用な純化された生理活性物質及びその製造法が提供され
た。
【図１】本発明による精製品のセファデックスＧ−５０
における溶出曲線と生理活性を示すグラフである。
における溶出曲線と生理活性を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ６１Ｋ 35/74 Ｇ // Ａ６１Ｋ 35/74 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 岡本 成史 宮城県仙台市青葉区八幡２丁目７−40− 201 (72)発明者 恩田 時男 東京都調布市上石原２丁目29−６ (56)参考文献 特開 昭51−44617（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/315 A61K 31/00 A61K 38/00 C12P 21/00 - 21/06 A61K 35/74 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】 溶血性連鎖球菌がStreptococcus pyogen
es Su, Streptococcus pyogenes Sv, Streptococcus py
ogenes T-12, Streptococcus pyogenes C-203株の中か
ら選ばれる１種であり、この溶血性連鎖球菌の培養上澄
より得られる分子量が２万−３万のタンパク質を精製し
て得たリンパ球増殖、感染防御、抗腫瘍活性を有する生
理活性物質。 - 【請求項２】 リンパ球増殖刺激活性を有する請求項１
記載の生理活性物質。 - 【請求項３】 感染防御活性を有する請求項１記載の生
理活性物質。 - 【請求項４】 抗腫瘍活性を有する請求項１記載の生理
活性物質。 - 【請求項５】 Streptococcus pyogenes Su, Streptoco
ccus pyogenes Sv,Streptococcus pyogenes T-12, Stre
ptococcus pyogenes C-203株の中から選ばれる１種の溶
血性連鎖球菌の培養上澄より得られるタンパク質の分子
量２万−３万の画分を集めて濃縮し、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過、凍結乾燥等により精製してリ
ンパ球増殖、感染防御、抗腫瘍活性を有する生理活性物
質を得ることを特徴とする溶血性連鎖球菌の産生する生
理活性物質の製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5140893A JP2971293B2 (ja) | 1993-06-11 | 1993-06-11 | 溶血性連鎖球菌の産生する生理活性物質及びその製造法 |
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