KR20090064377A - 친화성 크로마토그래피를 사용하는 단백질 정제에 있어서 아르기닌 세척 - Google Patents

친화성 크로마토그래피를 사용하는 단백질 정제에 있어서 아르기닌 세척 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 매질에 통과시킨 후, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하는 1종 이상의 세척액으로 세척하고, 용리액을 사용하여 상기 생성물을 회수함으로써, 상기 로딩액으로부터 생성물을 단리시키는 방법, 및/또는 탁도 및/또는 불순물을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 제조된 생성물에 관한 것이다.
친화성 크로마토그래피, 단백질 정제, 아르기닌, 세척액, 로딩액

Description

친화성 크로마토그래피를 사용하는 단백질 정제에 있어서 아르기닌 세척{ARGININE WASH IN PROTEIN PURIFICATION USING AFFINITY CHROMATOGRAPHY}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에, 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는, 2006년 9월 8일에 출원된 미국 특허 출원 제60/843,084호에 대한 우선권의 이익을 주장한다.
본 출원은 단백질 정제에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 1종 이상의 아르기닌 또는 아르기닌 유도체 함유 세척액을 매질에 통과시키고, 정제된 단백질을 회수함으로써 매질에 결합된 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.
재조합 단백질 기술의 도래로, 단백질을 발현하도록 조작된, 배양된 진핵 또는 원핵 숙주 세포주를 사용하여 관심 있는 단백질을 제조할 수 있다. 제약적 적용에 있어서 원하는 재조합 단백질의 사용은 일반적으로 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질, 단백질 변이체, 및 배양 배지에서의 화합물로부터 적절한 수준의 단백질을 신뢰성 있게 회수할 수 있다는 것을 조건으로 한다.
통상적인 단백질 정제 방법은 크기, 전하, 용해도, 및 소수성 정도의 차이에 기초하여, 불순물로부터 관심 있는 단백질을 분리하도록 설계된다. 이러한 방법은 크로마토그래피법, 예컨대 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피, 및 수산화인회석 크로마토그래피를 포함한다. 이들 방법은 종종 관심 있는 단백질 또는 불순물 중 어느 것에 선택적으로 부착시키도록 설계될 수 있는 분리 매질을 이용한다. 결합-용출(bind-elute) 방식에서, 원하는 단백질은 분리 매질에 선택적으로 결합하고, 상이한 용매에 의해 매질로부터 차별적으로 용출된다. 유통(flow-through) 방식에서, 불순물은 분리 매질에 특이적으로 결합하는 반면, 관심 있는 단백질은 그렇지 않기 때문에, "유출물"에서 원하는 단백질을 회수하는 것이 가능하다.
단백질, 예컨대 항체의 정제를 위한 현행 방법은 둘 이상의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 예를 들어, 단백질 정제 프로토콜에서 제1 단계는 관심 있는 단백질과 고정화된 포획제(capture agent) 사이의 특이적 상호작용을 이용하는 친화성 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다. 단백질 A 흡착제는 단백질, 예컨대 Fc 영역을 함유하는 항체의 친화성 포획에 특히 유용하다. 그러나, 단백질 정제를 위해 단백질 A 크로마토그래피를 사용하는 것에는 수많은 단점이 있다. 일부 경우에서, 단백질 A 포획제의 누출은 용출된 단백질 생성물의 오염을 초래하는 반면, 다른 경우에서는, 친화성 포획으로 관심 있는 단백질로부터 단백질 변이체, 예컨대 응집된 형태의 단백질을 분리하지 못한다. 또한, pH 중화에 따라 다양한 수준의 혼탁 및/또는 침전물이 단백질 A 용출 풀(elution pool)에서 형성될 수 있다. 이러한 혼탁 및/또는 침전물은 중화된 단백질 A 용출 풀에서 상당한 생성물 손실을 초래할 수 있다. 따라서, 용출 풀에서 생성물의 손실을 줄이고 생성물의 순도를 증대시키는 정제 방법이 요구된다.
발명의 요약
본 발명은, 부분적으로는, 생성물, 예컨대 항체 및 1종 이상의 불순물을 함유하는 로딩액(load fluid)을, 생성물을 결합시키는 매질에 통과시킨 후, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 함유하는 1종 이상의 세척액을 상기 매질에 통과시키고, 용리액을 사용하여 상기 생성물을 회수함으로써 상기 로딩액으로부터 생성물을 단리시키는 방법에 관한 것이다.
하나의 측면에서, 생성물을 단리시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 제공하는 단계, 상기 로딩액을, 생성물을 결합시키기에 적절한 조건 하에 생성물을 결합시킬 수 있는 매질과 접촉시킴으로써 결합된 매질을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 상기 결합된 매질을 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하는 1종 이상의 세척액과 접촉시킴으로써 세척된 매질을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 생성물을 용출시키기에 적절한 조건 하에 상기 세척된 매질을 용리액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 그 다음, 상기 생성물을 포함하는 용출액은 회수될 수 있다. 상기 생성물은 또한 치료 용도를 위해 추가로 정제되고/되거나 제제화될 수 있다.
이러한 측면의 일부 실시태양에서, 생성물은 단백질, 예를 들어, 치료용 단백질(therapeutic protein)이다. 특정 실시태양에서, 생성물은 항체이다. 특정 실시태양에서, 항체는 하기한 것 중 하나에 대하여 유도되거나 상승된다: 성장 및 분화 인자-8 (GDF-8), 인터루킨-13 (IL-13), 인터루킨-22 (IL-22), A-베타, 최종 당화 산물에 대한 수용체(Receptor for Advanced Glycation End Products, RAGE), 및 5T4. 일부 실시태양에서, 생성물은 항원-결합 단편이다. 일부 실시태양에서, 생성물은 융합 단백질이다. 특정 실시태양에서, 생성물은 Ig-융합 단백질이다. 특정 실시태양에서, 생성물은 Fc-단백질, 면역접합체, 사이토킨, 인터루킨, 호르몬 또는 치료용 효소이다.
이러한 측면의 일부 실시태양에서, 매질은 매트릭스, 수지 또는 크로마토그래피 컬럼이다. 특정 실시태양에서, 매질은 단백질 A 크로마토그래피 컬럼, 예를 들어, 재조합 단백질 A 컬럼, 또는 단백질 G 크로마토그래피 컬럼, 예를 들어, 재조합 단백질 G 컬럼이다.
이러한 측면의 일부 실시태양에서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 0.1 M 내지 약 2.0 M이다. 특정 실시태양에서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 0.1 M 내지 약 0.9 M이다. 하나의 실시태양에서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 1 M이다. 다른 특정 실시태양에서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 1.1 M 내지 약 2.0 M이다. 또 다른 실시태양에서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 0.5 M 내지 약 1.0 M이다. 또 다른 실시태양에서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 0.5 M 초과 약 2.0 M 미만이다. 다른 실시태양에서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 0.5 M 초과 약 1.0 M 미만이다. 특정 실시태양에서, 아르기닌 유도체는 아세틸 아르기닌, 아그마틴, 아르긴산(arginic acid), N-알파-부티로일-L-아르기닌, 또는 N-알파-피발로일 아르기닌이다.
이러한 측면의 일부 실시태양에서, 세척액의 pH는 약 4.5 내지 약 8.0이다. 특정 실시태양에서, 세척액의 pH는 약 4.5 초과 약 8.0 미만이다. 일부 실시태양에서, 세척액의 pH는 약 7.5이다.
이러한 측면의 일부 실시태양에서, 용리액은 염화나트륨, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체, 글리신, 헤페스(HEPES), 및 아세트산 중 임의의 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 용리 완충액의 pH는 약 2.0 내지 약 4.0이다. 특정 실시태양에서, 용리 완충액의 pH는 약 3.0이다.
이러한 측면의 특정 실시태양에서, 1종 이상의 불순물은 숙주 세포 단백질, 핵산, 생성물 변이체, 내독소, 단백질 A, 단백질 G, 바이러스 또는 이의 단편, 세포 배양 배지로부터의 성분, 또는 생성물 변이체, 예를 들어, 언더디술피드(underdisulfide)-결합된 생성물, 저분자량 생성물, 고분자량 생성물, 말단이 절단된 생성물 및/또는 잘못 폴딩된 생성물이다. 1종 이상의 불순물이 생성물에 결합되는 일부 실시태양에서, 결합된 매질은 1종 이상의 세척액과, 결합된 매질 전체에 걸쳐 접촉됨으로써, 생성물에 결합된 1종 이상의 불순물이 제거된다.
이러한 측면의 특정 실시태양에서, 용출액은 단리된 생성물을 포함하며, 단리된 생성물의 순도는 아르기닌 또는 아르기닌 유도체 약 0.1 M 미만이 세척액에 사용된 상응하는 방법에 비해 증가된다. 일부 실시태양에서, 용출액은 단리된 생성물을 포함하며, 1종 이상의 불순물에 대한 상기 생성물의 비율은 검출가능한 양의 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에 비해 증가된다. 특정 실시태양에서, 용출액은 생성물을 포함하며, 여기서 숙주 세포 단백질에 대한 상기 생성물의 비율은 아르기닌 또는 아르기닌 유도체 약 0.1 M 미만이 세척액에 사용된 상응하는 방법에 비해 증가된다. 추가의 실시 태양에서, 용출액은 생성물을 포함하며, 여기서 숙주 세포 단백질에 대한 생성물의 비율은 검출가능한 양의 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에 비해 증가된다.
이러한 측면의 다른 실시태양에서, 용출액의 탁도는 아르기닌 또는 아르기닌 유도체 약 0.1 M 미만이 세척액에 사용된 상응하는 방법에 비해 감소된다. 일부 실시태양에서, 용출액의 탁도는 검출가능한 양의 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에 비해 감소된다.
다른 측면에서, 항체의 단리 방법이 제공된다. 상기 방법은 항체 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 제공하는 단계, 및 상기 로딩액을, 생성물을 결합시키기에 적절한 조건 하에 생성물을 결합시킬 수 있는 매질인 단백질 A 매질 또는 단백질 G 매질과 접촉시킴으로써 결합된 매질을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 상기 결합된 매질을, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 0.5 M 초과 약 1.0 M 미만의 농도로 포함하는 1종 이상의 세척액과 접촉시킴으로써 세척된 매질을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 상기 세척된 매질을 항체를 용출시키기에 적절한 조건 하에 용리액과 접촉시키는 단계; 및 항체를 포함하는 용출액을 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 이 방법을 수행한 결과, 용출액 중 숙주 세포 단백질에 대한 항체의 비율은 증가하며, 상기 용출액은 검출가능한 양의 아르기닌이 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에서 회수된 용출액에 비해 감소된 탁도를 갖는다.
이러한 측면의 일부 실시태양에서, 세척액의 pH는 약 5.0 초과 약 8.0 미만이다.
다른 측면에서, 생성물을 포함하는 용출액에서 탁도를 감소시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 제공하는 단계, 상기 로딩액을, 생성물을 결합시키기에 적절한 조건 하에 생성물을 결합시킬 수 있는 매질과 접촉시킴으로써 결합된 매질을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 상기 결합된 매질을, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하는 1종 이상의 세척액과 접촉시킴으로써 세척된 매질을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 상기 세척된 매질을 생성물을 용출시키기에 적절한 조건 하에 용리액과 접촉시킴으로써 생성물을 포함하는 용출액을 생성시키는 단계, 및 상기 용출액의 pH를 중화시키는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 검출가능한 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에 비해 감소된 탁도를 갖는 용출액을 제공한다.
이러한 측면의 일부 실시태양에서, 중화된 용출액의 pH는 약 6.5 내지 약 8.2이다. 특정 실시태양에서, 세척액은 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 0.5 M 초과 약 1.0 M 미만의 농도로 포함한다. 일부 실시태양에서, 세척액의 pH는 5.0 초과 약 8.0 미만이다. 이러한 측면의 일부 실시태양에서, 상기 방법은 음이온성 상류(upstream) 흡착 여과를 포함하지 않는다. 특정 실시태양에서, 용출액 중 생성물은 치료 용도를 위해 추가로 정제되고/되거나 제제화된다.
다른 측면에서, 생성물을 포함하는 용출액에서 탁도 및 불순물을 감소시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 제공하는 단계, 및 상기 로딩액을, 생성물을 결합시키기에 적절한 조건 하에 생성물을 결합시킬 수 있는 매질과 접촉시킴으로써 결합된 매질을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 상기 결합된 매질을, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하는 1종 이상의 세척액과 접촉시킴으로써 세척된 매질을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 상기 세척된 매질을 생성물을 용출시키기에 적절한 조건 하에 용리액과 접촉시킴으로써 생성물을 포함하는 용출액을 생성시키는 단계, 및 상기 용출액의 pH를 중화시키는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 용출액 중 1종 이상의 불순물에 대한 생성물의 비율이 증가된 용출액을 제공하며, 상기 용출액은 검출가능한 아르기닌 또는 아르기닌 유도체이 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에 비해 감소된 탁도를 갖는다.
이러한 측면의 일부 실시태양에서, 중화된 용출액의 pH는 약 6.5 내지 약 8.2이다. 특정 실시태양에서, 세척액은 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 0.5 M 초과 약 1.0 M 미만의 농도로 포함한다. 일부 실시태양에서, 세척액의 pH는 5.0 초과 약 8.0 미만이다. 이러한 측면의 일부 실시태양에서, 상기 방법은 음이온성 상류 흡착 여과를 포함하지 않는다. 특정 실시태양에서, 용출액 중 생성물은 치료 용도를 위해 추가로 정제되고/되거나 제제화된다. 본 발명은 또한 본 명세서에 첨부된 청구의 범위에 기재된 각종 방법 및 생성물에 관한 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당업계의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명을 실시하거나 시험하는데 있어서 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질을 이하에 기술한다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 그 밖의 참고 자료는 그 전체로서 참고로 포함된다. 또한, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시일 뿐이며, 본 발명을 이에 한정시키고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 잇점은 상세한 설명, 도면 및 청구의 범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 단백질 A 컬럼 단계 후 GDF-8 mAb-1의 회수율(%), 탁도, HCP ("숙주 세포 단백질") 및 LRV ("로그 제거값(log removal value)")를 분석한 실험 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 2는 단백질 A 컬럼 단계 후 GDF-8 mAb-2의 회수율(%), 탁도, HCP 및 LRV를 분석한 실험 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 3은 단백질 A 컬럼 단계 후 IL-13 mAb-1의 회수율(%), 탁도, HCP 및 LRV를 분석한 실험 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 4는 단백질 A 컬럼 단계 후 IL-22 mAb의 회수율(%), 탁도, HCP 및 LRV를 분석한 실험 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 5는 단백질 A 컬럼 단계 후 RAGE mAb의 회수율(%), 탁도, HCP 및 LRV를 분석한 실험 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 6은 단백질 A 컬럼 단계 후 IL-13 mAb-2의 회수율(%), 탁도, HCP 및 LRV를 분석한 실험 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
<본 발명의 상세한 설명>
본 발명은 아르기닌 세척 또는 아르기닌 유도체에 의한 세척을 포함하는 방법을 이용하여, 1종 이상의 불순물을 함유하는 로딩액으로부터 생성물을 회수 및 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 치료 및/또는 진단 목적을 위한 단백질의 대규모 제조에 적용될 수 있다.
A. 정의
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 본 명세서에서 사용되는 특정 용어를 정의한다. 추가적 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 설명된다.
용어 "생성물"은 인간에 의해 또는 자연적 과정에 의해 제조되는 분자를 지칭한다. "생성물"은 단백질, 예를 들어, Fc-함유 단백질을 비롯한 Ig 융합 단백질을 포함하는, 치료용 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다른 단백질은 면역접합체, 사이토킨, 인터루킨, 호르몬, 치료용 효소, 바이러스, 치료용 혈청, 독소, 항독소, 백신, 혈액 성분 또는 유도체, 또는 임의의 유사 생성물을 포함한다. 단백질은 분비 단백질일 수 있다. 단백질은 예를 들어, 항체, 항체의 항원-결합 단편, 가용성 수용체, 수용체 융합, 사이토킨, 성장 인자, 효소, 또는 응 고 인자일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 것으로서, 용어 "생성물" 및 "관심 있는 단백질"은 상호 교환가능하게 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 것으로서, 용어 "단백질"은 유닛으로서 기능할 수 있는 1종 이상의 폴리펩티드를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 것으로서, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산의 연속적 사슬을 지칭한다.
치료용 단백질은 예를 들어 분비 단백질일 수 있다. 치료용 단백질은 항체, 항체의 항원-결합 단편, 가용성 수용체, 수용체 융합, 사이토킨, 성장 인자, 효소, 또는 응고 인자, 이하에 보다 상세히 기재된 것 중 임의의 것을 포함한다. 단백질의 상기 목록은 사실상 예시하기 위한 것일 뿐이지, 상술하는 것을 한정하고자 하는 것이 아니다. 당업자는 임의의 단백질이 본 발명에 따라 사용될 수 있으며, 필요에 따라 특정 단백질을 선택하여 제조할 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에서 사용되는 것으로서, 용어 "조절된(conditioned) 배양 배지"는 관심 있는 원하는 재조합 폴리펩티드(들)을 분비할 수 있는, 숙주 세포에 노출된 세포 배양 배지로부터의 분리 방법, 예컨대 원심분리 및/또는 미세여과에 의해 세포 및 세포 파편을 제거함으로써 생성되는 상등액을 지칭한다. 조절된 배지는 예를 들어, 분비 재조합 폴리펩티드, 또는 관심 있는 생성물; 선택된 영양소 (예를 들어, 비타민, 아미노산, 보조인자, 및 무기질); 추가 성장 인자/인슐린을 포함한 보조제; 및 추가의 외인성, 또는 숙주 세포 단백질 및 불순물을 포함할 수 있다. 용어 "조절된 배양 배지"는 청정화된 조절 배지, 여과된 조절 배지, 및 조절된 세포 배양 배지를 포함 한다.
용어 "로딩액"은 단리시킬 생성물 및 1종 이상의 불순물을 함유하는 액체를 지칭한다. 로딩액은 후술하는 본 발명의 작동 조건 하에 매질과 접촉한다(예를 들어, 매질을 통과함).
용어 "불순물"은 용액, 예컨대 로딩액에 존재하는 임의의 외래 또는 원치않는 분자를 지칭한다. 불순물은 정제될 관심 있는 단백질 이외에, 정제될 관심 있는 단백질의 샘플 중에 존재하는 생물학적 거대분자, 예컨대 DNA, RNA 또는 단백질일 수 있다. 불순물은 예를 들어, 원치않는 단백질 변이체, 예컨대 응집된 단백질, 잘못 폴딩된 단백질, 언더디술피드-결합 단백질, 고분자량 종, 저분자량 종 및 단편, 및 탈아미드화(deamidated) 종; 정제될 단백질을 분비하는 숙주세포로부터의 다른 단백질, 숙주 세포 DNA, 세포 배양 배지로부터의 성분, 정제 단계 이전 동안에 샘플내로 침출되는 친화성 크로마토그래피에 사용되는 흡수제의 일부인 분자, 예를 들어, 단백질 A; 내독소; 핵산; 바이러스, 또는 전술한 임의의 것의 단편을 포함한다.
용어 "매질"은 리간드-생체거대분자가 거대분자 분리 과정 동안에 단리되는 생성물과 상호작용할 수 있는 친화성 매트릭스 또는 수지를 지칭한다. 매질은 단백질 A 크로마토그래피 컬럼 또는 단백질 G 크로마토그래피 컬럼일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "결합된 매질"은 단리될 생성물과 결합하고, 1종 이상의 불순물과도 결합한 매질을 지칭한다. 결합된 매질은 생성물을 결합시키기에 적절한 조건 하에 로딩액을 매질에 통과시킴으로써 생성될 수 있다.
용어 "세척된 매질"은 1종 이상의 세척액에 의해 세척되는 결합된 매질을 지칭하며, 상기 1종 이상의 세척액은 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 함유한다. 세척된 매질은 결합된 매질을 1종 이상의 세척액과 접촉시킴으로써 생성될 수 있으며, 상기 1종 이상의 세척액은 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함한다. 세척된 매질에서, 단리되는 생성물의 순도는 일반적으로 결합된 매질 중 로딩액에 비례하여 증가한다(즉, 1종 이상의 불순물에 대한 생성물의 비율이 증가된다).
용어 "결합-용출 방식"은 로딩액 중에 함유된 1종 이상의 생성물을 매질(예를 들어, 크로마토그래피 수지)에 결합시키는 생성물 제조 기술을 지칭한다.
용어 "항체"는 임의의 면역글로불린 또는 이의 단편을 지칭하고, 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 상기 용어는 폴리클로날, 모노클로날, 단특이성, 다특이성, 비특이성, 인간화, 인간, 단쇄, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 변이된, 그라프트된, 및 시험관내 형성된 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 항체 단편은 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb를 포함하며, 이는 항원-결합 기능을 유지할 수 있다. 전형적으로, 이러한 단편은 항원-결합 도메인을 포함한다.
용어 "IL-13"은 인터루킨-13을 지칭하며, IL-13의 전장 미가공 전구체 형태 및 번역후 절단에 의해 생성된 성숙한 형태를 포함한다. 인터루킨-13 (IL-13)은 T 림프구 및 비만 세포에 의해 분비되는, 미리 특성화된 사이토킨이다[문헌: McKenzie et al. (1993) Proc. Natl. Acad. ScL USA 90:3735-39; Bost et al. (1996) Immunology 87:663-41]. 상기 용어는 또한 변형된 서열을 포함하는, 성숙 IL-13과 관련된 적어도 일부 생물학적 활성을 유지하는 IL-13의 임의의 단편 및 변이체를 지칭한다. 용어 "IL-13"은 인간 IL-13 및 다른 척추동물 종으로부터 유래된 IL-13을 포함한다. 몇몇 계류중인 출원(예를 들어, 미국 출원 공보 제2006/0063228A호 및 제2006/0073148호)은 본 명세서에 개시된 방법에 사용될 수 있는 것과 동일한 것을 생산하는 숙주 세포, 벡터, 및 인간 및 원숭이 IL-13, IL-13 펩티드에 대한 항체를 개시한다. 이들 공보 모두의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참고로 포함된다.
IL-13은 IL-4와 몇몇 생물학적 활성을 공유한다. 예를 들어, IL-4 또는 IL-13 중 어느 하나는 B 세포에서 IgE 이소형 전환을 야기할 수 있다[문헌: Tomkinson et al. (2001) J. Immunol. 166:5792-5800]. 또한, 증가된 수준의 세포 표면 CD23 및 혈청 CD23 (sCD23)은 천식 환자에서 보고되었다[문헌: Sanchez-Guererro et al. (1994) Allergy 49:587-92; DiLorenzo et al. (1999) Allergy Asthma Proc. 20:119-25)]. 또한, IL-4 또는 IL-13 중 어느 하나는 B 세포 및 단핵구에 대한 MHC 클래스 II 및 저-친화성 IgE 수용체 (CD23)의 발현을 상향조절(upregulate)할 수 있으며, 이는 증대된 항원 제시 및 조절된 대식세포 기능을 야기한다[문헌: Tomkinson et al., supra]. 이러한 발견은 IL-13이 기도의 호산구증가증 및 기도의 과반응(AHR)의 발생에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다[문헌:(Tomkinson et al., supra; Wills-Karp et al. (1998) Science 282:2258-61]. 따라서, IL-13의 억제는 호흡기 장애, 예를 들어, 천식; 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD); 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생성, 예를 들어, 낭성 섬유증 및 폐섬유증을 포함하는 그 밖의 상태; 아토피 질환, 예를 들어, 아토피 피부염, 두드러기, 습진, 알레르기성 비염; 피부 (예를 들어, 아토피 피부염), 위장관 기관 (예를 들어, 염증성 장질환 (IBD), 예컨대 궤양성 대장염 및/또는 크론병), 간 (예를 들어, 간경화, 간세포성 암)의 염증성 및/또는 자가면역성 상태; 피부경화증; 종양 또는 암(예를 들어, 연조직 또는 고형 종양), 예컨대 백혈병, 아교모세포종, 및 림프종, 예를 들어, 호지킨 림프종; 바이러스 감염 (예를 들어, HTLV-1 감염); 다른 기관의 섬유증, 예를 들어, 간의 섬유증 (예를 들어, B형 및/또는 C형 간염 바이러스에 의해 유발된 섬유증)을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 특정 염증성 및/또는 알레르기성 상태의 병리를 개선하는데 유용할 수 있다.
용어 "GDF-8"은 성장 및 분화 인자-8, 및 GDF-8과 구조적 또는 기능적으로 관련된 인자, 예를 들어, BMP-11, 및 TGF-β 거대족(superfamily)에 속하는 그 밖의 인자들을 지칭한다. 상기 용어는 GDF-8의 전장 미가공 전구체 형태 및 번역후 절단에 의해 생성된 성숙한 프로펩티드 형태를 지칭한다. 상기 용어는 또한 변형된 서열을 포함하는, 성숙 GDF-8과 관련된 적어도 일부 생물학적 활성을 유지하는 GDF-8의 임의의 단편 및 변이체를 지칭한다. 인간 GDF-8, 및 다른 척추동물 종(뮤린, 개코 원숭이, 소 및 닭을 포함함)의 GDF-8의 아미노산 서열은, 예를 들어, US 2004-0142382, US 2002-0157125, 및 문헌[McPherron et al. (1997) Proc. Nat. Acad.aSci. U.S.A., 94:12457-12461]에 개시되어 있으며, 상기 모든 문헌의 개시 내용은 전체로서 본 명세서에 참고로 포함된다. GDF-8에 대한 항체를 중화시키는 실시예는 예를 들어, US 2004-0142382에 개시되어 있으며, 근육 조직 또는 골밀도의 증가가 바람직한, 질환 상태를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 예시적인 질환 또는 장애는 근육 및 신경근육 장애, 예컨대 근육 퇴행위축 (뒤시엔느 근육 퇴행위축을 포함함); 근위축성 측삭 경화증; 근육 위축증; 기관 위축증; 취약증; 터널 증후군; 울혈성 폐쇄성 폐질환; 근육감소증(sarcopenia), 악액질, 및 기타 근육 소모 증후군; 지방 조직 장애 (예를 들어, 비만증); 제2형 당뇨병; 내당능장애; 대사 증후군 (예를 들어, 신드롬 X); 외상, 예컨대 화상 또는 질소 불균형에 의해 유발된 인슐린 저항성; 및 골 퇴행성 질환 (예를 들어, 골관절염 및 골다공증)을 포함한다.
미오스타틴(myostatin)으로도 알려져 있는 GDF-8는 분비 단백질이며, 모두가 생리학적으로 중요한 성장-조절 및 형태형성 성질을 갖는 구조적으로 관련된 성장 인자의 전환 성장 인자-베타 (TGF-β) 거대족의 구성원이다[문헌:Kingsley et al (1994) Genes Dev., 8: 133-146; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol Immunol, 228: 235-272]. TGF-β와 유사하게, 인간 GDF-8은 375개 아미노산 길이의 전구체 단백질로서 합성된다. 상기 전구체 GDF-8 단백질은 동종이합체를 형성한다. 가공 단계 동안에, 아미노-말단 프로펩티드는 Arg-266에서 절단된다. 절단된 프로펩티드("잠복-관련 펩티드(latency-associated peptide, LAP)"로 알려짐)는 상기 동종이합체에 비공유적으로 결합한 채로 남을 수 있으며, 이로써 복합체를 불활성화시킬 수 있다[문헌: Miyazono et al (1988) J. Biol. Chem. 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 7646-7654; Brown et al (1990) Growth Factors, 3: 35-43; and Thies et al. (2001) Growth Factors, 18: 251-259]. 성숙 GDF-8과 프로펩티드와의 복합체는 통상적으로 "소형 잠복 복합체"로 지칭된다[문헌: Gentry et al (1990) Biochemistry, 29: 6851- 6857; Oexynck et al (1995) Nature, 316: 701-705; and Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol, 12: 597-641)]. 다른 단백질들은 또한 성숙 GDF-8에 결합하여 그의 생물학적 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다. 이러한 저해 단백질은 폴리스타틴(follistatin) 및 폴리스타틴 관련 단백질을 포함한다[문헌: Gamer et al. (1999) Dev. Biol, 208: 222-232].
용어 "RAGE"는 최종 당화 산물에 대한 수용체를 지칭한다. RAGE는 면역글로불린 거대족의 다중-리간드 세포 표면 구성원이다. RAGE는 세포외 도메인, 단일 막-걸침(membrane-spanning) 도메인, 및 시토졸 후부로 이루어져 있다. 상기 수용체의 세포외 도메인은 하나의 V-형 면역글로불린 도메인으로 이루어져 있고, 그에 이어 두 개의 C-형 면역글로불린 도메인이 존재한다. RAGE는 또한 가용성 형태 (sRAGE)로도 존재한다. RAGE는 사이토킨 분비, 증가된 세포 산화제 스트레스, 신경돌기 증식 및 세포 이동을 포함하는, 다양한 세포 반응을 유도하는 몇몇 상이한 부류의 내인성 분자에 결합하는 패턴-인지 수용체이다. RAGE의 리간드는 지속적인 고혈당 상태에서 형성되는 최종 당화 산물 (AGE)을 포함한다. AGE 외에, RAGE의 공지된 리간드는, S100/칼그라눌린(calgranulins) (예를 들어, S100A12, S1OOB, S100A8-A9), 혈청 아밀로이드 (SAA) (원섬유 형태), 베타-아밀로이드 단백질 (A-베 타), 및 고 이동성 군 박스-1 염색체 단백질 1 (high mobility group box-1 chromosomal protein 1, HMGB1, 암포테린으로도 알려져 있음)을 포함하는, 아밀로이드 침착물 및 염증 전 매개체의 특징인 β-시트 피브릴을 갖는 단백질을 포함한다. RAGE는 많은 세포 유형, 예를 들어, 내피 및 평활근 세포, 대식세포 및 림프구에 의해, 폐, 심장, 신장, 골격근 및 뇌를 포함하는 많은 상이한 조직에서 발현된다. 발현은 만성 염증 상태, 예컨대 류마티스 관절염 및 당뇨병성 신증에서 증가한다. 비록 RAGE의 생리학적 기능은 분명하지 않지만, 이는 염증 반응에 관여하며, 근육모세포 분화 및 신경 발생을 포함하는 다양한 발생 과정에서 역할을 할 수 있다. 다수의 심각한 인간의 질환은 RAGE에 대한 리간드의 증가된 생산 또는 RAGE 자체의 증가된 생산과 관계가 있다. 이들 질환에는 예를 들어, 류마티스 및 건선 관절염 및 장 질환, 암, 당뇨병 및 당뇨병성 신증, 아밀로이드증, 심혈관 질환 및 패혈증을 포함하는 많은 만성 염증 질환이 포함된다. 예를 들어, RAGE에 대한 리간드 중 하나인 HMGB-1은 뮤린 패혈증의 두 모델에서 치사율의 후기 매개체인 것으로 나타났으며, RAGE와 리간드, 예컨대 HMGB1 사이의 상호작용은 패혈증 및 기타 염증 질환의 발병기전에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.
용어 "A-베타"는 뇌 내의 아밀로이드 플라크의 주요 구성 성분을 지칭한다. A-베타 펩티드는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)라 불리는 대형 막횡단 당단백질의 39 내지 43개 아미노산의 4-kDa 내부 단편이다. 상이한 세크레타제 효소에 의한 APP의 단백질 분해 가공 결과, A-베타는 주로 단형 (40개 아미노산 길이) 및 장형 (42 내지 43개 아미노산 길이) 둘 다의 형태로 발견된다. APP의 소수성 막횡단 도메인 중 일부는 A-베타의 카르복시 말단에서 발견되며, 이는 특히, 장형의 경우에, 플라크로 응집시키는 A-베타의 능력을 설명할 수 있다. 뇌에 아밀로이드 플라크가 축적되면, 궁극적으로 신경 세포의 사멸을 초래한다. 이러한 종류의 신경 악화와 관련된 신체 증상은 알츠하이머병(AD)의 특징이다. 뇌 내의 아밀로이드 플라크의 축적은 또한 다운증후군 및 기타 인지장애와 관계가 있다.
APP 단백질 내에서의 몇몇 돌연변이는 AD의 존재와 관련되어 왔다[참조 문헌: 예를 들어, Goate et al., Nature 349:704, 1991 (발린717에서 이소류신으로); Chartier Harlan et al. Nature 353:844, 1991 (발린717에서 글리신으로); Murrell et al., Science 254:97,1991 (발린717에서 페닐알라닌으로); Mullan et al., Nature Genet. 1:345,1992 (리신595-메티오닌596에서 아스파라긴595-류신596으로 변형시키는 이중 돌연변이), 상기 각 문헌은 그 전체로서 본 명세서에 참고로 포함됨]. 이러한 돌연변이들은 APP에서 A-베타로의 가공을 증가 또는 변경함으로써, 특히 APP를 가공하여 장형의 A-베타(즉, A-베타 1-42 및 A-베타 1-43)의 양을 증가시킴으로써 AD를 일으키는 것으로 생각된다. 다른 유전자, 예컨대 프레세닐린 유전자, PS1 및 PS2에서의 돌연변이는 APP의 가공에 간접적으로 영향을 미쳐 장형의 A-베타의 양을 증가시키는 것으로 생각된다[참조 문헌: Hardy, TINS 20: 154,1997, 상기 문헌은 그 전체로서 본 명세서에 참고로 포함됨). 특정 실시태양에서, 항-A-베타 항체는 본 발명에 따라 정제된다.
본 명세서에서 사용되는 것으로서, 용어 "IL-22"는 IL-22의 전장 미가공 전구체 형태 및 번역후 절단에 의해 생성된 성숙한 형태를 포함하는, 인터루킨-22를 지칭한다. 상기 용어는 또한 변형된 서열을 포함하는, 성숙 IL-22와 관련된 적어도 일부 생물학적 활성을 유지하는 IL-22의 임의의 단편 및 변이체를 지칭한다. 용어 "IL-22"는 인간 IL-22 및 다른 척추동물 종의 IL-22를 포함한다. 인간 및 설치류 IL-22, 및 IL-22에 대한 항체의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 미국 출원 공보 제2003-0157106호, 제2005-0153400호, 제2005-0042220호 및 제2005-0158760호, 및 미국 특허 제6,939,545호에 개시되어 있다. 이들 모든 공보 의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨-22 (IL-22)는 IL-10과 서열 상동성이 있는, 미리 특성화된 클래스 II 사이토킨이다. 이의 발현은 IL-9 또는 콘카나발린 A (ConA)에 의해 T 세포에서 상향 조절된다[문헌: Dumoutier L. et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(18): 10144-9]. 연구 결과, IL-22 mRNA의 발현은 지질다당류 (LPS) 투여에 응답하여 생체내에서 유도되고, IL-22가 급성기 반응을 나타내는 파라미터를 조정하고[문헌:Dumoutier L. et al. (2000) supra; Pittman D. et al. (2001) Genes and Immunity 2:172], 항 IL-22 중화 항체의 사용에 의한 IL-22 활성의 감소는 마우스 콜라겐-유도 관절염 (CIA) 모델에서 염증 증상을 개선시키는 것으로 나타났다. 따라서, IL-22 길항제, 예를 들어, 항 IL-22 중화 항체 및 이의 단편은, 예를 들어 자가면역 장애 (예를 들어, 관절염 장애, 예컨대 류마티스 관절염); 호흡기 장애 (예를 들어, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD)); 예를 들어, 피부(예를 들어, 건선), 심장혈관계(예를 들어, 죽상동맥경화증), 신경계(예를 들어, 알츠하이머병), 신장(예를 들어, 신장염), 간 (예를 들어, 간염) 및 췌장 (예를 들어, 췌장염)의 염증 상태의 치료를 위해 생체내 면역 억제를 유도하는데 사용될 수 있다.
용어 "숙주 세포 단백질 (HCP)"은 세포 배양 또는 발효 동안에 숙주 세포에 의해 생산되는 비-생성물(non-product) 단백질을 지칭한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 생성물을 함유하는 용출액은 100 백만분율 (ppm) 미만의 HCP (예를 들어, 약 50 ppm 미만, 또는 약 20 ppm 미만)로 존재하는 HCP를 갖는다. HCP 조성물은 매우 불균일하며, 사용되는 단백질 생성물 및 정제 방법에 의존한다. 치료 용도를 위한 생물학적 생성물의 임의의 시판 승인에 앞서, 생성물 중 오염 단백질(예컨대, HCP)의 수준이 ICH 및 FDA 지침에 따라 정량적으로 측정되어야 한다.
용어 "컬럼 유출물"은 로딩 사이클(load cycle) 동안에, 또는 로딩이 적용되는 동안에 매질 또는 컬럼에 존재하는 액체를 지칭한다.
B. 본 발명의 상세한 설명
본 발명은 결합된 매질을 아르기닌 또는 아르기닌 유도체로 세척하는 단계를 포함하는 방법을 이용하여, 1종 이상의 불순물을 함유하는 로딩액으로부터 생성물을 회수 및 정제하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 매질은 단백질 A 크로마토그래피 컬럼이다.
하나의 실시태양에서, 생성물은 단백질, 예를 들어, 펩티드 항체를 포함하는, 치료용 단백질이다. 다른 실시태양에서, 생성물은 분비 단백질; 융합 단백질, 예를 들어, 수용체 융합 단백질 또는 Fc-융합 단백질을 비롯한 Ig-융합 단백질; 가용성 수용체; 성장 인자; 효소; 응고 인자; Fc-함유 단백질; 면역접합체; 사이토킨; 인터루킨; 호르몬; 또는 치료용 효소이다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 생성물은 단백질, 예를 들어, CH2/CH3 영역을 갖는 항체이며, 따라서 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제되기 용이하다. 용어 "CH2/CH3 영역"은 단백질 A와 상호작용하는 면역글로불린 분자의 Fc 영역에서의 아미노산 잔기를 지칭한다. 일부 실시태양에서, CH2/CH3 영역은 온전한(intact) CH2 영역에 이어서 온전한 CH3 영역을 함유한다. 다른 실시태양에서, CH2/CH3 영역은 면역글로불린의 Fc 영역을 함유한다. CH2/CH3 영역-함유 단백질의 예는 CH2/CH3 영역과 융합되거나 접합되는 관심 있는 단백질을 포함하는 융합 단백질, 면역어드헤신(immunoadhesin) 및 항체를 포함한다.
특정 실시태양에서, 1종 이상의 불순물은 로딩액이 매질로 로딩될 때 매질 및/또는 생성물에 결합하며, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 함유하는 1종 이상의 세척액은 매질 및/또는 생성물에 결합된 불순물을 제거하는데 사용된다.
단백질은 분비 단백질일 수 있다. 단백질은 항체, 항체의 항원-결합 단편, 가용성 수용체, 수용체 융합, 사이토킨, 성장 인자, 효소, 또는 응고 인자일 수 있다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법을 이용함으로써 정제되는 단백질은 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 본 명세서에서 사용되는 것으로서, 용어 "항체"는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 VH 도메인 또는 그의 부분, 및/또는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 VL 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 단백질을 포 함한다. 특정 실시태양에서, 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄 (여기서, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄는, 예를 들어 디술피드 결합에 의해 서로 연결됨)의 사합체(tetramer)이다. 항체 또는 그의 일부는 설치류, 영장류 (예를 들어, 인간 및 비인간 영장류), 카멜리드(camelid), 상어를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 기관으로부터 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 예를 들어, 당업자에게 공지된 방법에 의해, 재조합 방식(예를 들어, 키메라, 인간화, 및/또는 시험관내 생성)으로 제조될 수 있다.
용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; (vi) 카멜리드 또는 카멜화된(camelized) 가변 도메인, 예를 들어 VHH 도메인; (vii) 단쇄 Fv (scFv); (viii) 이중특이적 항체; 및 (ix) Fc 영역에 융합된 면역글로불린의 1종 이상의 항원 결합 단편을 포함한다. 또한, Fv 단편, VL 및 VH의 두 도메인이 분리 유전자에 의해 코딩되었다고 하더라도, 이들은 재조합 방법을 이용하여, VL과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조되도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 서로 연결될 수 있다(단쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어 문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-26; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83] 참조). 이러한 단쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체에서와 동일한 방식으로 기능에 대해 평가될 수 있다.
일부 실시태양에서, 용어 "항원-결합 단편"은 단일 도메인 항체를 포함한다. 단일 도메인 항체는 상보적인 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩티드의 부분인 항체를 포함할 수 있다. 예로서 중쇄 항체, 자연적으로 경쇄가 결여된 항체, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체로부터 유래된 것 이외의 단일 도메인 골격이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 단일 도메인 항체는 당 분야의 임의의 것, 또는 임의의 장래 단일 도메인 항체일 수 있다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 염소, 토끼, 젖소 및 상어를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 임의의 종에서 유래될 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에 따르면, 본 명세서에서 사용되는 것으로서 단일 도메인 항체는 경쇄가 결여된 중쇄 항체로 공지된 자연 발생 단일 도메인 항체이다. 이러한 단일 도메인 항체는 예를 들어 WO 9404678에 개시되어 있다. 명백한 이유에서, 자연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체로부터 유래된 이들 가변 도메인은 이를 4쇄 면역글로불린의 통상적인 VH와 구별되도록, 본 명세서에서는 VHH 또는 나노바디(nanobody)로서 공지되어 있다. 이러한 VHH 분자는 카멜리드 종, 예를 들어 낙타, 마라, 단봉 낙타, 알파카 및 과나코에서 발생된 항체로부터 유래될 수 있다. 카멜리드 외에 다른 종은 자연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체를 생성할 수 있고; 이러한 VHH는 본 발명 의 범위 내에 있다.
항원-결합 단편은, 임의로는, 예를 들어, 안정성, 이펙터 세포 기능 또는 보체 고정 중 하나 이상을 증진시키는 부분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원-결합 단편은 페길화(pegylated) 부분, 알부민 또는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 소형 모듈 면역제약학적(SMIP™) 의약(Trubion Pharmaceuticals, Seattle, WA)을 정제하는데 사용될 수 있다. SMIP는 동족 구조, 예컨대 항원, 반대수용체(counterreceptor)에 대한 결합 도메인, 하나의 시스테인 잔기를 갖거나 갖지 않는 힌지-영역 폴리펩티드, 및 면역글로불린 CH2 및 CH3 도메인으로 구성된 단일 쇄 폴리펩티드이다 (또한 www.trubion.com 참조). SMIP 및 이들의 용도 및 적용은, 예를 들어 미국 공개 특허 출원 제2003/0118592호, 제2003/0133939호, 제2004/0058445호, 제2005/0136049호, 제2005/0175614호, 제2005/0180970호, 제2005/0186216호, 제2005/0202012호, 제2005/0202023호, 제2005/0202028호, 제2005/0202534호, 및 제2005/0238646호와 이의 관련 특허 패밀리 구성원에 개시되어 있으며, 이들 모두는 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함된다.
"이중특이적" 또는 "이관능성" 항체 외에, 항체는 각각의 그의 결합 부위를 동일하게 갖는 것으로 이해된다. "이중특이적" 또는 "이관능성 항체"는 두 개의 상이한 중/경쇄 쌍 및 두 개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny 등, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)]를 참조하라.
단백질이 항체 또는 그의 단편인 실시태양에서, 이는 하나 이상, 또는 두 개의 전장 중쇄, 및 하나 이상, 또는 두 개의 경쇄를 포함할 수 있다. 별법으로, 항체 또는 이의 단편은 단지 항원-결합 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv 또는 단쇄 Fv 단편)을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 단편은 모노클로날 또는 단일 특이성 항체일 수 있다. 항체 또는 그의 단편은 또한 인간, 인간화, 키메라, CDR-그라프트된, 또는 시험관내에서 형성된 항체일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 항체는 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 갖는다. 다른 실시태양에서, 항체는 예를 들어 카파 또는 람다로부터 선택된 경쇄를 갖는다. 하나의 실시태양에서, 불변 영역은 변경, 예를 들어 변이되어, 항체의 성질을 변경시킨다 (예를 들어, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 이펙터 세포 기능 또는 보체 기능 중 하나 이상의 증가 또는 감소). 전형적으로, 항체 또는 그의 단편은 소정의 항원, 예를 들어 장애(예컨대 신경 변성, 대사 기능, 염증, 자가면역 및/또는 악성 장애)와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 방법에 의해 분리될 수 있는 예시적인 항체는 RAGE, A-베타 펩티드, 인터루킨-13 (IL-13), 인터루킨-22 (IL-22), 5T4, 및 성장 및 분화 인자-8 (GDF-8)에 대한 항체들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 방법에 사용되는 항체 제제는, 면역화된 동물의 혈청, 복수액, 하이브리도마 또는 골수종 상등액, 항체 분자를 발현하는 재조합 세포주를 배양하는 것으로부터 또는 항체-생성 세포의 세포 추출물에서 유래된 조절된 배양 배지를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌, 다수의 출처로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 생성물은 항체-생성 재조합 세포주의 조절된 배양 배지로부터의 항체이다. 세포주로부터 세포주까지 및 각종 항체 생성물 사이에서 일부 변이가 있을 수 있다고 하더라도, 본원의 개시에 기초하여, 본원에서 본 발명을 항체 단백질 및 생성 세포주의 특정 조합에 적용하는 것은 본 기술분야에서의 당업자의 범위 내일 것이다.
특정 실시태양에서, 1종 이상의 불순물은 로딩액이 매질에 로딩될 때 매질 및/또는 생성물에 결합되고, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 함유하는 1종 이상의 세척액은 매질 및/또는 생성물에 결합된 불순물을 제거하는데 사용된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 정제된 생성물은 60% 미만의 불순물 (예를 들어, 숙주 세포 단백질)을, 하나의 실시태양에서는 40% 미만의 불순물을, 하나의 실시태양에서는 20% 미만의 불순물을, 하나의 실시태양에서는 10% 미만의 불순물을, 하나의 실시태양에서는 5% 미만의 불순물을, 하나의 실시태양에서는 3% 미만의 불순물을, 및 다른 실시태양에서는 1% 미만의 불순물을 함유한다. 불순물은 원치않는 단백질 변이체, 예컨대 응집된 단백질, 고분자량 종, 저분자량 종 및 단편, 및 탈아미드화 종; 정제될 단백질을 분비하는 숙주 세포로부터의 다른 단백질; 숙주 세포 DNA; 세포 배양 배지로부터의 성분, 정제 단계 이전 동안에 샘플내로 침출되는 친화성 크 로마토그래피에 사용되는 흡수제의 일부인 분자, 예를 들어, 단백질 A 및 단백질 G; 내독소; 핵산; 바이러스, 또는 전술한 임의의 것의 단편을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다
본 명세서에 기재된 방법에 사용되는 매질은, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 컬럼, 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 컬럼, 크기 배제 크로마토그래피 컬럼, 투석여과, 한외여과, 바이러스 제거 여과, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 단백질 A 크로마토그래피 컬럼 또는 단백질 G 크로마토그래피 컬럼이다. 단백질 A 크로마토그래피 컬럼은 예를 들어, 프로세프-A(PROSEP-A)™ (밀리포어(Millipore), U.K.), 프로테인 A 세파로스 패스트 플로우(Protein A Sepharose FAST FLOW)™ (GE 헬쓰케어(GE Healthcare), Piscataway, N.J.), 토요페알(TOYOPEARL)™ 650M 프로테인 A (도소하스 코포레이션(TosoHass Co.), Philadelphia, Pa.), 또는 마브셀렉트(MabSelect)™ 컬럼 (GE 헬쓰케어, Piscataway, N.J.)일 수 있다.
매질과 로딩액을 접촉시키기 전, 파라미터, 예컨대 pH, 이온 강도, 및 온도, 및 일부 경우에 상이한 종류의 물질의 첨가를 조절하는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 생성물의 결합 및 정제를 위해 필수적인 특징을 유도하는 용액(예를 들어, pH, 이온 강도, 등을 조절하기 위한, 또는 세정제의 도입을 위한 완충액)으로 이를 세척함으로써 매질의 평형화를 수행하는 것은 임의 단계이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 단백질 A 컬럼을 평형화하고, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 함유하는 세척액으로 세척함으로써, 생성물의 정제를 위해 필수적인 특징을 제공한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 단백질 A 컬럼은 염, 예를 들어, 약 100 mM 내지 약 150 mM NaPO4, 약 100 mM 내지 약 150 mM 아세트산 나트륨, 및 약 100 mM 내지 약 150 mM NaCl을 함유하는 용액을 사용하여 평형화할 수 있다. 평형 완충액(equilibration buffer)의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0의 범위일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 평형 완충액의 pH는 약 7.5이다. 평형 완충액은 약 10 mM 내지 약 50 mM 트리스를 함유할 수 있다. 다른 실시태양에서, 완충액은 20 mM 트리스를 함유할 수 있다. 매질(예를 들어, 단백질 A 컬럼)을 로딩액과 접촉시킨 후, 결합된 매질을 세척한다. 본 발명에 따라, 본원에 기재된 방법에 사용되는 세척액은 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 함유한다. 아르기닌 유도체는 아세틸 아르기닌, 아그마틴, 아르긴산, N-알파-부티로일-L-아르기닌, 또는 N-알파-피발로일 아르기닌일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 0.1 M 내지 약 2.0 M (예를 들어, 0.1 M, 0.4 M, 0.5 M, 1.0 M, 1.5 M, 또는 2.0 M), 또는 약 0.5 M 내지 약 1.0 M (예를 들어, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, 또는 1.0 M)이다. 특정 실시태양에서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 또는 0.9 M이다. 특정 실시태양에서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M, 또는 2.0 M이다. 특정 실시태양에서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 0.5 M 초과 약 2.0 M 미만 (예를 들어, 0.55 M, 0.75 M, 1.0 M, 1.25 M, 1.5 M, 또는 1.75 M, 또는 2.0 M), 또는 약 0.5 M 초과 약 1.0 M 미만 (예를 들어, 0.55 M, 0.75 M, 또는 1.0 M)이다. 하나의 실시태양에서, 아르기닌의 농도는 1 M이 아니다. 일부 실시태양에서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 1 M 초과이다. 일부 실시태양에서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 1 M 미만이다. 추가 실시태양에서, 세척액은 약 0.1 M 내지 약 0.9 M 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 함유할 수 있다. 특정 실시태양에서, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 0.2 M 내지 약 0.8 M, 약 0.3 M 내지 약 0.7 M, 또는 약 0.4 M 내지 약 0.6 M일 수 있다. 추가 실시태양에서, 세척액은 약 1.1 M 내지 약 3.0 M, 또는 약 1.1 M 내지 약 2.0 M 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 함유할 수 있다. 특정 실시태양에서, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 1.2 M 내지 약 2.8 M, 약 1.3 M 내지 약 2.6 M, 약 1.4 M 내지 약 2.4 M, 약 1.5 M 내지 약 2.2 M, 약 1.6 M 내지 약 2.0 M, 또는 약 1.8 M 내지 약 2.0 M이다. 특정 실시태양에서, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 약 1.2 M 내지 약 1.9 M, 약 1.3 M 내지 약 1.8 M, 약 1.4 M 내지 약 1.7 M, 또는 약 1.5 M 내지 약 1.6 M이다.
세척액의 pH는 일반적으로 약 4.5 내지 약 8.0, 예를 들어, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 및 8.0이다. 일부 경우에서, 세척액의 pH는 5.0 초과 약 8.0 미만, 예를 들어, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 내지 8.0이다. 세척액은 20 mM 내지 50 mM 트리스 (예를 들어, 20 mM, 30 mM, 40 mM 또는 50 mM)을 함유할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 결합된 매질은 세척액의 5 컬럼 부피로 세척되고, 이어서 용 리 단계를 수행된다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 생성물은 세척된 매질 예를 들어, 단백질 A 컬럼으로부터 용출될 수 있다. 단백질 A 컬럼으로부터 생성물을 용출시키기 위해, 세척된 매질을 용리 완충액과 접촉시킨다. 일부 실시태양에서, 용리 완충액은 약 15 mM 내지 약 50 mM NaCl을 함유한다. 다른 실시태양에서, 용리 완충액은 약 50 mM 내지 약 150 mM 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 함유할 수 있다. 추가 실시태양에서, 용리 완충액은 50 mM 내지 150 mM 글리신을 함유할 수 있다. 용리 완충액은 또한 약 20 mM 내지 약 30 mM 헤페스를 함유할 수 있다. 용리 완충액 또한 약 25 mM 내지 약 50 mM 아세트산을 함유할 수 있다. 용리 완충액의 pH는 약 2.0 내지 약 4.0 범위일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 용리 완충액의 pH는 약 3.0이다.
매질은 항체의 용리 후, 임의로는 세정, 즉, 스트립 및 재생될 수 있다. 이러한 절차는 전형적으로 규칙적으로 수행되어, 고체상의 표면 상에 불순물의 축적을 최소화하고/하거나 매트릭스를 살균하여 생성물이 미생물로 오염되는 것을 방지한다.
완충액 성분은 당업자의 지식에 따라 조절될 수 있다. 샘플 완충액 조성 범위는 하기 실시예에 제공된다. 모두 완충액 또는 단계가 필수적인 것은 아니지만, 단지 예시를 위해 제공된다. 실시예에서 기재된 바와 같이, 고속 스크리닝(high throughput screen)이 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 위한 완충 조건을 효율적으로 최적화하는데 사용될 수 있다.
본 방법의 하나의 실시태양에서, 용출액은 단리된 생성물을 포함하고 단리된 생성물의 순도는 아르기닌 또는 아르기닌 유도체 약 0.1 M이 세척액에 사용되는 상응하는 방법에 비해 증가된다.
다른 실시태양에서, 용출액은 단리된 생성물을 포함하고, 1종 이상의 불순물에 대한 상기 생성물의 비율은 검출가능한 양의 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에 비해 증가된다.
일부 경우에서, 용출액은 생성물을 함유하며, 숙주 세포 단백질에 대한 상기 생성물의 비율은 아르기닌 또는 아르기닌 유도체 약 0.1 M 미만이 세척액에 사용된 상응하는 방법에 비해 증가된다.
용출액은 생성물을 포함할 수 있으며, 숙주 세포 단백질에 대한 생성물의 비율은 검출가능한 양의 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에 비해 증가된다.
탁도는 불용성 생성물, 불용성 불순물, 및 생성물과 불순물의 불용성 착물의 척도를 제공한다. 탁도는 또한 세포내 미립자 및 세포 파편에 의해 유발될 수 있다. 일반적으로, 용출액의 낮은 탁도는 생성물의 보다 바람직한 품질과 관련된다. 탁도는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 비탁법(nephelometric method)[문헌: Baker et al., Trends Biotechnol. 2002 Apr; 20(4): 149-56] 또는 광학 밀도가 사용될 수 있다. 광학 밀도는 일반적으로 약 320 nm 내지 약 650 nm의 범위에서 흡광도를 측정함으로써 분석된다.
일부 경우에서, 용출액의 탁도는 아르기닌 또는 아르기닌 유도체 약 0.1 M 미만이 세척액에 사용된 상응하는 방법에서의 용출액의 탁도에 비해 감소된다. 특정 방법에서, 용출액의 탁도는 검출가능한 양의 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에 비해 감소된다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 방법은 생성물을 함유하는 용출액에서 탁도를 감소시킨다. 다른 실시태양에서, 본 방법은 검출가능한 양의 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에 비해, 생성물을 함유하는 용출액에서 탁도를 감소시킬 뿐만 아니라 불순물도 감소시킨다. 특정 실시태양에서, 본 방법은 어떤 추가의 상류 여과, 예를 들어 음이온성 상류 흡착 여과를 포함하지 않는다.
본 발명의 정제 방법은 단독으로 사용될 수 있지만, 다른 정제 기술과 조합하여 사용될 수도 있다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법을 이용하면서, 예를 들어, 로딩액을 제조하여 오염물 또는 불순물의 로딩 챌린지(load challenge)를 감소시키는데 하나 이상의 공정이 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 용출액의 처리, 예를 들어, 용출액에 존재하는 오염물 또는 불순물을 제거하는데 하나 이상의 공정이 사용된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 발명에 따라 제조된 생성물에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명에 따라 단리된 생성물을 추가로 단리하고/하거나 정제하고, 이들을 제약 용도를 위해 표준 방법에 따라 제제화하는 것은 전형적으로 바람직할 것이다. 단백질에 대하여는, 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는, 문헌[Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S.J. and Hames, B.D.(eds.), and Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N.(eds.), Guide to Protein Purification : Method in Enzymology (Method in Enzymology Series, VoI 182), Academic Press, 1997]를 참조하라. 당업자는 사용되는 정확한 기술이 생성물의 특성에 따라 변화될 것이라는 점을 이해할 것이다. 약리 활성을 갖는 본 발명의 생성물은 의약품의 제조에 유용할 것이다. 이들은, 비경구 (예를 들어, 정맥내), 피내, 피하, 경구, 비측, 기관지, 눈, 경피 (국소), 점막, 직장, 질을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 임의의 이용가능한 경로에 의해 대상에 투여되거나 또는 전달을 위해 우선 제제화될 수 있다.
생성물의 제약 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 의도된 투여 경로에 적합하도록 제제화된다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), and "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ. (1998)]를 참조하라. 일부 실시태양에서, 생성물은 멸균수 (예를 들어, SWFI), 완충 염수 (예를 들어, 인산염 완충 염수), 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 또는 이들의 적절한 혼합물을 사용하여 제제화될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 회수될 수 있는 생성물의 비제한적인 예는 단백질 또는 펩티드, 예를 들어 항체, 항체 단편, 재조합 단백질, 자연 분비 단백질, 또는 분비되도록 조작된 펩티드, 세포에 의해 생성되는 비-단백질 생성물, 또는 전술한 생성물의 조합을 포함한다.
본 발명을 하기 실시예를 통해 추가로 설명한다. 본 실시예는 오직 예시적인 목적을 위해 제공되는 것이다. 이는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위 또는 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
단리 공정의 일부로서 친화성 매질을 사용하는 프로토콜에서, 세포 박테리아 또는 조직에 의해 생산되는 생성물의 단리에 유용한 방법을 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 이들 실험에서, 마브셀렉트™ 단백질 A 컬럼을 사용하여 생성물을 결합시켰다.
실시예 1
GDF -8 mAb -1: HCP 및 탁도 감소, 및 생성물 회수율에 있어서 단백질 A 세척 완충액의 비교
먼저, 고속 스크리닝(HTS) 방법을 이용하여 각종 세척액의 평가를 수행하였다. 마브셀렉트™ 단백질 A 컬럼에 먼저 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, "CHO") 세포 배양 공정으로부터의 조절된 배양 배지를 로딩하였다. 그 다음, 마브셀렉트™ 수지를 슬러리로 만들고, 100 ㎕의 수지 슬러리를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 분배하였다. 그 다음, 마이크로타이터 플레이트의 각 웰을 평가 하에 시험 용액으로 세척한 후, 이어서 낮은 pH의 완충액으로 용리시켰다. 각 웰로부터의 용출 풀을 A320에 의해 피크 탁도 및 A280에 의해 생성물 회수율에 대해 분석하였다. HTS 실험으로부터의 결과에 기초하여, 가장 높은 회수율 및 가장 낮은 탁도를 나타낸 시험 용액을 소규모 컬럼 스카우팅 런(scouting run)을 이용한 추가의 시험을 위해 선별하였다. 컬럼 스카우팅 런에서, 마브셀렉트 단백질 A 컬럼을 10 mM 트리스, 100 mM NaCl (pH 7.5)을 함유하는 완충액으로 평형화하고, GDF-8 mAb-1을 함유하는 CHO 조절된 배양 배지를 로딩하였다. 그 후, 컬럼을 5 컬럼 부피(CV)의 평형 완충액으로 플러싱(flush)한 후, 5 CV의 시험 용액으로 평가 하에 세척하였다. 이어서, 결합된 생성물을 낮은 pH의 완충액으로 용리시켰다. 중화된 피크 탁도를 A320 또는 탁도계에 의해 측정하고, 생성물 회수율을 A280에 의해 측정하고, HCP 농도를 엘라이자(ELISA)에 의해 측정하였다. 초기 평가를 위해 사용된 컬럼 치수는 베드 높이 8 내지 25 cm에 직경 0.5 cm 또는 1.1 cm였다. 실시예 1에 기술된 모든 실험에 대한 컬럼 작동 조건을 표 1에 정리하였다.
Figure 112009013953543-PCT00001
각각의 런(run)에서, 마브셀렉트™ 단백질 A 컬럼을 5 컬럼 부피의 10 mM 트리스, 100 mM NaCl(pH 7.5)로 평형화하고, 이어서 대략 35 mg 생성물/mL 수지를 로딩하였다. 그 후, 1 컬럼 부피의 평형 완충액 및 5 컬럼 부피(CV)의 시험 세척액으로 평가 하에 컬럼을 플러싱하였다 (표 2 참조). 세척 단계 후 5 CV의 10 mM 트리스, 100 mM NaCl(pH 7.5)로 플러싱하였다. 그 다음, 결합된 생성물을 100 mM L-아르기닌, 50 mM NaCl(pH 3.0)로 컬럼으로부터 용리시켰다. 이어서, 생성물 풀을 2 M 헤페스(pH 8.0)를 사용하여 pH 7.5로 중화시켰다. 컬럼을 2 CV의 6 M 구아니딘 HCl으로 스트립(strip)하였다. 구아니딘을 4 CV의 10 mM 트리스, 100 mM NaCl(pH 7.5)을 사용하여 컬럼으로부터 분리하여 16% 에탄올 (4 CV)에 저장하였다. 모든 컬럼 작동은 실온에서 수행하였다.
HCP 및 피크 풀 탁도 감소에 대해 평가한 각종 세척액을 표 2에 열거하였다. 대조군 1M NaCl 세척액을 사용한 경우, 과도한 침전 및 생성물 손실이 단백질 A 용출 풀에서 관찰되었다 (도 1). 또한, 단백질 A 컬럼 단계에 걸쳐 HCP 제거율은 1 log10보다 작았다. 교체되는 세척액, 예컨대 10% 이소프로판올(IPA), 0.5 M 구아니딘-HCl(GuHCl), 또는 2 M 트리스-HCl과 비교하여, 아르기닌 세척은 양호한 생성물 회수율을 유지하면서 HCP 및 용출 풀 탁도의 감소에 보다 효과적이었다 (도 1).
Figure 112009013953543-PCT00002
실시예 2
GDF -8 mAb -2: HCP 및 탁도 감소, 및 생성물 회수율에 있어서 단백질 A 세척 완충액의 비교
GDF-8 mAb-2를 함유하는 CHO 세포 배양 공정으로부터의 조절된 배양 배지를 마브셀렉트™ 단백질 A 컬럼을 이용하여 소규모로 정제하였다. 초기 평가를 위해 사용된 컬럼 치수는 베드 높이 8 내지 25 cm에 직경 0.5 cm 또는 1.1 cm였다. GDF-8 mAb-2 정제에 사용된 단백질 A 작동 조건은, 및 HCP 및 피크 풀 탁도 감소에 대해 평가한 세척액은 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 것이었다 (평가한 시험 용액에 대해서는 표 2 참조).
대조군 1M NaCl 세척액을 사용한 경우, 과도한 침전 및 생성물 손실이 단백질 A 용출 풀에서 관찰되었다 (도 2). 또한, 단백질 A 컬럼 단계에 걸쳐 HCP 제거율은 1 log10보다 작았다. 교체되는 세척액, 예컨대 10% 이소프로판올(IPA), 0.5 M 구아니딘-HCl(GuHCl), 또는 2 M 트리스-HCl과 비교하여, 아르기닌 세척액은 > 75%의 생성물 회수율을 유지하면서 HCP 제거 및 용출 풀 탁도의 감소에 보다 효과적이었다 (도 2).
실시예 3
IL -13 mAb -1: HCP 및 탁도 감소, 및 생성물 회수율에 있어서 단백질 A 세척 완충액의 비교
먼저, 고속 스크리닝(HTS) 방법을 이용하여 단백질 A 컬럼 단계에 걸쳐 탁도 및 HCP 감소에 대하여 여러 세척액의 평가를 수행하였다. 25 mL 컬럼을 마브셀렉트™ 수지로 패킹하고, 수지의 1 mL 당 IL-13 mAb-1 25 mg의 최종 로딩 챌린지로 CHO 세포 조절된 배양 배지를 로딩하였다. 수지를 슬러리로 만든 후, 100 ㎕의 수지 슬러리를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 분배하였다. 마이크로타이터 플레이트의 각 웰을 평가 하에 시험 용액으로 세척한 후, 결합된 생성물을 50 mM 글리신, 35 mM NaCl(pH 3.0)로 용리시켰다. 본 연구에서 평가된 모든 세척액을 표 3에 열거하였다. 각 웰로부터의 용출 풀을 A320에 의해 피크 탁도 및 A280에 의해 생성물 회수율에 대해 측정하였다.
Figure 112009013953543-PCT00003
평가 하에 세척액의 효능을 중화된 용출 풀의 표준화된 A320 수치를 비교하여 평가하였다. 5개의 시험 용액, 아르기닌, CaCl2, 구아니딘 HCl, IPA 및 트리스는 중화된 피크 풀 탁도 수치의 감소에 있어서 1 M NaCl 대조군 세척액보다 더욱 효과적이었다. 아르기닌, CaCl2, 트리스 및 IPA를 소규모 컬럼 스카우팅 런을 이용하여 추가로 시험하였다. 1.1 cm (직경) x 8 cm (베드 높이) 컬럼을 상기 평가에 사용하였다. 모노클로날 항체를 함유하는 CHO 세포 배양으로부터의 조절된 배양 배지를 실온에서 작동하는 마브셀렉트™ 단백질 A 컬럼을 이용하여 소규모로 정제하였다. 이들 런에 대한 로딩 챌린지는 수지 30 mg/mL로 고정하였다. 스카우팅 런에 사용된 작동 조건을 표 4에 정리하였다. 간단히 말해서, 마브셀렉트™ 단백질 A 컬럼을 평형화하고, IL-13 mAb-1을 함유하는 CHO 세포 조절된 배양 배지를 로딩하였다. 그 후, 평가 하에 컬럼을 5 컬럼 부피의 고 염(high salt) 완충액으로, 이어서 5 컬럼 부피의 세척액으로 세척하였다. 그 다음, 컬럼을 용리 단계를 위한 제제 중 일련의 저 염(low salt) 용액으로 세척하였다. 그 후, 결합된 생성물을 50 mM 글리신, 15 mM NaCl(pH 3.0)으로 용리시켰다. 중화된 피크 탁도를 탁도계에 의해 측정하고, 생성물 회수율을 A280에 의해 측정하고, HCP 농도를 엘라이자에 의해 측정하였다. 본 실험에서의 결과를 도 3에 정리하였다.
Figure 112009013953543-PCT00004
1 M NaCl 대조군 세척액을 사용한 경우, 중화된 피크 풀 탁도 수치는 ~20 NTU였고, 실시예 1 및 2에서 보고된 것보다 현저하게 낮았다. 아르기닌, CaCl2, 및 트리스는 1 M NaCl 대조군과 비교하여 중화된 피크 풀 탁도의 감소에 보다 효과적이었다. 그러나, 중화된 피크 풀 탁도의 감소에 효과적이었던 3가지의 세척액 중, 아르기닌이 생성물 회수율에 영향을 미치지 않으면서도 HCP 감소에 보다 효과적이었다. 0.4 M 아르기닌(pH 5.0) 세척액을 사용한 마브셀렉트™ 단백질 A 단계에 걸쳐 HCP 감소는 1 M NaCl 대조군 세척액의 상응하는 수치보다 3.5배 더 높았다 (도 3).
실시예 4
IL -22 mAb : HCP 및 탁도 감소, 및 생성물 회수율에 있어서 단백질 A 세척 완충액의 비교
먼저, HTS 방법을 이용하여 단백질 A 컬럼 단계에 걸쳐 탁도 및 HCP 감소에 대하여 여러 세척액의 평가를 수행하였다. 25 mL 컬럼을 마브셀렉트™ 수지로 패킹하고, 수지 1 mL 당 IL-22 mAb 25 mg의 최종 로딩 챌린지로 CHO 세포 조절된 배양 배지를 로딩하였다. 그 다음, 수지를 슬러리로 만들고, 100 ㎕의 수지 슬러리를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 분배하였다. 마이크로타이터 플레이트의 각 웰을 평가 하에 시험 용액으로 세척한 후, 결합된 생성물을 낮은 pH의 완충액으로 용리시켰다. 용출 풀을 높은 pH의 완충액으로 중화시킨 후, A320에 의해 피크 탁도 및 A280에 의해 생성물 회수율에 대해 분석하였다. HTS 실험으로부터의 결과에 기초하여, 가장 높은 회수율 및 가장 낮은 탁도를 나타낸 시험 용액을 소규모 컬럼 스카우팅 런을 이용한 추가의 시험을 위해 선별하였고, 이를 위한 조건을 표 5에 정리하였다.
Figure 112009013953543-PCT00005
각각의 런에 대하여, 0.5 cm (d) x 20 cm (h) 마브셀렉트™ 단백질 A 컬럼을 5 컬럼 부피(CV)의 20 mM 트리스, 150 mM NaCl(pH 7.5)으로 평형화하고, 이어서 대략 35 mg 생성물/mL 수지를 로딩하였다. 그 후, 컬럼을 5 CV의 시험 용액으로 세척하였다. 세척 단계 후, 3 CV의 5 mM 트리스, 20 내지 30 mM NaCl(pH 7.5)로 용리 전 플러싱하였다. 그 후, 결합된 생성물을 낮은 pH의 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용리시키고, 시험 용액을 사용하여 pH 7.5로 중화시켰다. 컬럼을 5 CV의 50 mM NaOH, 500 mM 황산나트륨으로 스트립하고, 5 CV의 16% (v/v) 에탄올, 50 mM 트리스(pH 7.5)에 저장하였다. 모든 컬럼 작동은 실온에서 수행하였으며, 이를 표 6에 정리하였다.
Figure 112009013953543-PCT00006
도 4에 나타난 바와 같이, 모든 시험 조건에서 필적할만한 생성물 회수율이 발생하였다. 런 2에서 사용된 아르기닌 세척액 및 런 5에서 사용된 트리스 세척액이 가장 큰 HCP 감소를 제공하였다. 그러나, 런 2에서 사용된 아르기닌 세척액은 런 5에서 사용된 트리스 세척액보다 거의 2배 더 낮은 탁도 수준을 나타내었다.
실시예 5
RAGE mAb : HCP 및 탁도 감소, 및 생성물 회수율에 있어서 단백질 A 세척 완충액의 비교
먼저, HTS 방법을 이용하여 단백질 A 컬럼 단계에 걸쳐 탁도 및 HCP 감소에 대하여 여러 세척액의 평가를 수행하였다. 25 mL 컬럼을 마브셀렉트™ 수지로 패킹하고, 수지 1 mL 당 RAGE mAb 25 mg의 최종 로딩 챌린지로 CHO 세포 조절된 배양 배지를 로딩하였다. 그 다음, 수지를 슬러리로 만들고, 100 ㎕의 수지 슬러리를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 분배하였다. 마이크로타이터 플레이트의 각 웰을 평가 하에 시험 용액으로 세척한 후, 결합된 생성물을 낮은 pH의 완충액으로 용리시켰다. 용출 풀을 높은 pH의 완충액으로 중화시킨 후, A320에 의해 피크 탁도 및 A280에 의해 생성물 회수율에 대해 분석하였다. 상기 HTS 실험에서 대부분의 시험 용액에 있어서 만족스러운 회수율 및 탁도를 나타내었다. 이러한 결과 및 이전의 경험에 기초하여, 아르기닌을 이들 생성물을 위한 세척 조건으로 평가하고 선택하였다.
5 cm (d) x 23 cm (h) 마브셀렉트™ 단백질 A 컬럼을 5 컬럼 부피(CV)의 20 mM 트리스, 150 mM NaCl(pH 7.5)로 평형화한 후, 대략 35 mg 생성물/mL 수지를 로딩하였다. 그 다음, 컬럼을 5 CV의 0.5 M 아르기닌, 50 mM 트리스(pH 7.5)로 세척하였다. 세척 단계 후, 3 CV의 39 mM NaCl, 5 mM 트리스(pH 7.5)로 용리 전 플러싱하였다. 그 다음, 22 mM NaCl, 50 mM 글리신(pH 3.0)을 사용하여 컬럼으로부터 결합된 생성물을 용리시키고, 2.0 M 트리스(pH 8.2)를 사용하여 pH 7.5로 중화시켰다. 컬럼을 5 CV의 50 mM NaOH, 500 mM 황산나트륨으로 스트립하고, 5 CV의 16% (v/v) 에탄올, 50 mM 트리스(pH 7.5)에 저장하였다. 모든 컬럼 작동은 실온에서 수행하였으며, 이를 표 7에 정리하였다.
Figure 112009013953543-PCT00007
도 5에 나타난 바와 같이, 아르기닌 세척액은 바람직한 HCP 제거 수준 및 중화된 피크 탁도에서의 감소를 제공하면서, 만족스러운 생성물 회수율을 제공하였다.
실시예 6
A-베타 mAb : HCP 및 탁도 감소, 및 생성물 회수율에 있어서 단백질 A 세척 완충액의 비교
먼저, 고속 스크리닝(HTS) 방법을 이용하여 각종 세척액의 평가를 수행하였다. 마브셀렉트 단백질 A 컬럼에 먼저 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 배양 공정으로부터의 조절된 배지를 로딩하였다. 그 다음, 마브셀렉트 수지를 슬러리로 만들고, 100 ㎕의 수지 슬러리를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 분배하였다. 마이크로타이터 플레이트의 각 웰을 평가 하에 시험 용액으로 세척한 후(표 8 참조), 이어서 낮은 pH의 완충액으로 용리시켰다. 각 웰로부터의 용출 풀을 A320에 의해 피크 탁도 및 A280에 의해 생성물 회수율에 대해 분석하였다. HTS 실험으로부터의 결과에 기초하여, 가장 높은 회수율 및 가장 높은 HCP 제거율을 나타낸 시험 용액을 소규모 컬럼 런을 이용한 추가의 시험을 위해 선별하였다. 이들 세척액은 아르기닌 및 CaCl2였다.
Figure 112009013953543-PCT00008
컬럼 런에서, 1.6 cm (직경) x 15 cm (베드 높이) 컬럼을 상기 평가에 사용하였다. 마브셀렉트 단백질 A 컬럼을 5O mM 트리스, 0.15 M NaCl(pH 7.5)을 함유하는 완충액으로 평형화하고, A-베타 mAb를 함유하는 CHO 세포 조절된 배지를 40 mg/mL까지 로딩하였다. 그 다음, 컬럼을 2 컬럼 부피(CV)의 평형 완충액으로 플러싱하고, 이어서 아르기닌 또는 CaCl2 5 CV로 세척하였다. 그 후, 컬럼을 용리 단계를 위한 제제 중 1O mM 트리스, 1O mM NaCl(pH 7.5)로 세척하였다. 그 다음, 결합된 생성물을 5O mM 글리신, 1O mM NaCl(pH 3.0)로 용리시켰다. 중화된 피크 탁도를 A320 또는 탁도계에 의해 측정하고, 생성물 회수율을 A280에 의해 측정하고, HCP 농도를 엘라이자에 의해 측정하였다. 표 9에 본 실시예에서 기술된 모든 실험에 대한 컬럼 작동 조건을 정리하였다.
Figure 112009013953543-PCT00009
Figure 112009013953543-PCT00010
표 10은 A-베타 mAb에서의 세척 실험에 대한 회수율 및 HCP 수치에 관한 결과를 보여준다. 아르기닌 및 CaC12는 숙주 세포 단백질 및 최종 피크 풀 탁도의 감소에 있어서 필적할만한 세척액이었다. 세척하는 동안의 보다 낮은 생성물 손실을 기초로 하여, 0.5 M 아르기닌을 A-베타 mAb 공정에서의 세척액으로 선택하였다.
실시예 7
IL -13 mAb -2: HCP 및 탁도 감소, 및 생성물 회수율에 있어서 단백질 A 세척 완충액의 비교
먼저, 고속 스크리닝(HTS) 방법을 이용하여 단백질 A 컬럼 단계에 걸쳐 탁도 감소에 대하여 여러 세척액의 평가를 수행하였다. 25 mL 컬럼을 마브셀렉트™ 수지로 패킹하고, 수지 1 mL 당 IL-13 mAb-2 50 mg의 최종 로딩 챌린지로 CHO 조절된 배지를 로딩하였다. 그 다음, 수지를 슬러리로 만들고, 100 ㎕의 수지 슬러리를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 분배하였다. 마이크로타이터 플레이트의 각 웰을 평가 하에 시험 용액으로 세척한 후, 결합된 생성물을 용리시키고, 산성 용출 풀을 중화시켰다.
HTS에 있어서, 각종 첨가 세척액, 용리 완충액 및 적정제가 조합되어 다양한 농도로 이용되었다. HTS에서 이용된 첨가 세척액은 염화칼슘, 염화나트륨, 트리스 및 아르기닌이었다. HTS에서 이용된 용리 완충액은 다양한 농도의 NaCl과 함께 글리신, 헤페스 및 아세트산이었다. HTS에서 이용된 적정제는 트리스, 헤페스 및 이미다졸이었다.
침강에 대한 대용물로 A320을 사용하여, 세척액의 효능을 중화된 용출 풀의 표준화된 A320 수치를 비교하여 평가하였다. 아르기닌이 용출 피크의 A320 기록의 감소에 있어서 가장 효과적인 것으로 판명되었다. HTS 실험으로부터의 결과에 기초하여, 가장 높은 회수율 및 가장 낮은 탁도를 나타낸 시험 용액을 소규모 컬럼 스카우팅 런을 이용한 추가의 시험을 위해 선별하였다. 이는 소규모 컬럼 실험에서의 세척 완충액으로서 염화칼슘, 아르기닌, 및 염화나트륨(대조군)의 추가 시험으로 이어졌다.
IL-13 mAb-2를 함유하는 CHO 배양 공정으로부터의 조절된 배양 배지를 실온에서 작동되는 마브셀렉트™ 단백질 A 컬럼을 사용하여 소규모로 정제하였다. 초기 평가를 위해 사용된 컬럼 치수는 베드 높이 20 내지 25 cm에 직경 1.1 cm였다. 본 런에서의 로딩 챌린지는 수지 35 mg/mL로 고정하였다. 스카우팅 런을 위해 사용된 조건을 표 11에 정리하였다.
Figure 112009013953543-PCT00011
Figure 112009013953543-PCT00012
Figure 112009013953543-PCT00013
간단히 말해서, 마브셀렉트™ 단백질 A 컬럼을 평형화하고, IL-13 mAb-2를 함유하는 CHO 조절된 배지를 로딩하였다. 그 다음, 컬럼을 5 CV의 중간 염(moderate salt) 완충액으로, 다음으로 평가 하에 5 CV의 세척액으로 세척하였다. 그 후, 컬럼을 용리 단계를 위한 제제 중 3 CV의 저 염 용액으로 세척하였다. 그 다음, 결합된 생성물을 pH 3.1의 완충제로서 글리신 또는 아세트산 중 어느 하나를 함유하는 용액으로 용리시켰다. 그 후, 이 피크 풀을 3가지 상이한 적정제로 독립적으로 중화시켰다. 중화된 피크 탁도를 탁도계로 측정하고, 생성물 회수율을 A280에 의해 측정하고, HCP 농도를 엘라이자로 정량화하였다. 본 실험으로부터의 결과를 도 6에 정리하였다.
각종 용리 완충액을 사용하여 실험한 모든 농도에서(표 13 참조), 아르기닌이 산성 및 중화된 피크 풀 탁도의 감소에 염화칼슘 또는 염화나트륨보다 더욱 효과적이라는 것이 확인되었다. 이러한 발견은 산성 풀이 트리스, 헤페스, 또는 이미다졸 적정제로 중화되든지 아니든지 일관된다(표 13 참조).
또한, 이는 아르기닌 세척의 효과가 중화된 풀의 최종, 개별 pH에 제한되지 않는다는 것을 증명한다. 7.5 내지 8.2의 pH 범위에 걸쳐서(예를 들어, 7.5, 7.7, 7.9, 8.0, 8.1, 및 8.2), pH가 증가함에 따라 중화된 피크 탁도 수치는 감소한다. 그러나, 상기 동일한 범위에 걸쳐서, 염화칼슘이 사용되는 경우에, 아르기닌 세척의 사용은 항상 더 낮은 NTU를 나타내었다.
각각의 시험된 첨가 세척액에 있어서 로딩된 생성물의 회수율은 > 95%였다. HTS 데이터는 1.5 M 초과의 염화칼슘을 사용한 세척에 의해 어느 정도 더 낮은 회수율이 얻어질 수 있음을 나타내며, 이것이 상기 농도를 실험하지 않은 이유이다.
실험된 세척액 종류는 피크 풀에서의 HCP, HMW, 및 단백질 A의 최종 농도를 기준으로 구별될 수 없을 것이다. 그러나, 1.0 M 아르기닌 세척으로 용리된 세척 분획의 분석은 일관되게 상당한 수준의 HCP를 보여준다. 세척 분획 중 HCP 수준은 피크에서만 ~22000 ppm일뿐, ~49000 ppm이었다. 이는 아르기닌 세척액이 HCP를 선택적으로 제거한다는 것을 증명한다.
본 명세서에서 인용된 모든 참고 문헌은, 각각의 개별 공보 또는 특허 또는 특허 출원 전문이 모든 목적을 위해 그 전체로서 참고로 포함된다고 구체적이고 개별적으로 명시된 것과 같은 정도로, 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전체로서 참고로 포함된다. 참고 문헌으로 포함되는 공보 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 포함된 기재 내용을 부정한다는 점에 있어서는, 본 명세서가 이러한 모순되는 자료를 대체하고/하거나 이에 우선하는 것으로 의도된다.
본 명세서와 청구의 범위에서 사용되는 성분의 양, 반응 조건 등을 나타내는 모든 수는 모든 경우 용어 "약"에 의해 변경될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 다른 언급되지 않는 한, 명세서 및 첨부된 청구의 범위에 표시된 수적인 파라미터는 본 발명에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 변화될 수 있는 근사값이다. 정확히 말하면, 각각의 수적인 파라미터는 청구의 범위에 대한 균등론의 적용을 제한하려는 의도로서가 아니라, 유효 숫자의 수와 통상의 근사 접근법(rounding approach)에 비추어 이해되어야 한다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어남 없이, 본 발명의 변경 및 변형이 이루어질 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 실시태양은 오직 예로서 제공된 것이며, 어떠한 방식으로든 제한하고자 하는 것이 아니다. 명세서 및 실시예는 단지 예시로서 간주되어야 하며, 본 발명의 진정한 범위 및 사상은 하기 청구의 범위에 의해 나타낸다.

Claims (60)

  1. (a) 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 제공하는 단계;
    (b) 상기 로딩액을, 생성물을 결합시키기에 적절한 조건 하에 생성물을 결합시킬 수 있는 매질과 접촉시킴으로써 결합된 매질을 제공하는 단계;
    (c) 상기 결합된 매질을, 아르기닌을 포함하며 이때 아르기닌의 농도는 1 M이 아닌 1종 이상의 세척액과, 결합된 매질 전체에 걸쳐 접촉시킴으로써 세척된 매질을 제공하는 단계;
    (d) 상기 세척된 매질을, 생성물을 용출시키기에 적절한 조건 하에 용리액과 접촉시키는 단계; 및
    (e) 상기 생성물을 포함하는 용출액을 회수하는 단계
    를 포함하는, 생성물의 단리 방법.
  2. (a) 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 제공하는 단계;
    (b) 상기 로딩액을, 생성물을 결합시키기에 적절한 조건 하에 생성물을 결합시킬 수 있는 매질과 접촉시킴으로써 결합된 매질을 제공하는 단계;
    (c) 상기 결합된 매질을, 아르기닌을 포함하며 이때 아르기닌의 농도는 약 0.1 M 내지 약 0.9 M인 1종 이상의 세척액과, 결합된 매질 전체에 걸쳐 접촉시킴으로써 세척된 매질을 제공하는 단계;
    (d) 상기 세척된 매질을, 생성물을 용출시키기에 적절한 조건 하에 용리액과 접촉시키는 단계; 및
    (e) 상기 생성물을 포함하는 용출액을 회수하는 단계
    를 포함하는, 생성물의 단리 방법.
  3. (a) 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 제공하는 단계;
    (b) 상기 로딩액을, 생성물을 결합시키기에 적절한 조건 하에 생성물을 결합시킬 수 있는 매질과 접촉시킴으로써 결합된 매질을 제공하는 단계;
    (c) 상기 결합된 매질을, 아르기닌을 포함하며 이때 아르기닌의 농도는 약 1.1 M 내지 약 2.0 M인 1종 이상의 세척액과, 결합된 매질 전체에 걸쳐 접촉시킴으로써 세척된 매질을 제공하는 단계;
    (d) 상기 세척된 매질을, 생성물을 용출시키기에 적절한 조건 하에 용리액과 접촉시키는 단계; 및
    (e) 상기 생성물을 포함하는 용출액을 회수하는 단계
    를 포함하는, 생성물의 단리 방법.
  4. (a) 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 제공하는 단계;
    (b) 상기 로딩액을, 생성물을 결합시키기에 적절한 조건 하에 생성물을 결합시킬 수 있는 매질과 접촉시킴으로써 결합된 매질을 제공하는 단계;
    (c) 상기 결합된 매질을, 아르기닌 유도체를 포함하는 1종 이상의 세척액과, 결합된 매질 전체에 걸쳐 접촉시킴으로써 세척된 매질을 제공하는 단계;
    (d) 상기 세척된 매질을, 생성물을 용출시키기에 적절한 조건 하에 용리액과 접촉시키는 단계; 및
    (e) 상기 생성물을 포함하는 용출액을 회수하는 단계
    를 포함하는, 생성물의 단리 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물이 단백질인 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물이 항체인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 항체가 GDF-8에 특이적인 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 항체가 IL-13에 특이적인 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 항체가 IL-22에 특이적인 것인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 항체가 최종 당화 산물에 대한 수용체(RAGE)에 특이적인 것인 방법.
  11. 제6항에 있어서, 항체가 A-베타에 특이적인 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물이 항원-결합 단편인 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물이 Ig-융합 단백질인 방법.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물이 융합 단백질, Fc-함유 단백질, 면역접합체, 사이토킨, 인터루킨, 호르몬, 또는 치료용 효소인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 매질이 단백질 A 크로마토그래피 컬럼인 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 매질이 단백질 G 크로마토그래피 컬럼인 방법.
  17. 제4항에 있어서, 세척액 중 아르기닌 유도체의 농도가 약 0.1 M 내지 약 2.0 M인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 세척액 중 아르기닌의 농도가 약 0.1 M 내지 약 0.9 M인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 세척액 중 아르기닌의 농도가 약 1.1 M 내지 약 2.0 M인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 세척액 중 아르기닌의 농도가 약 0.5 M인 방법.
  21. 제4항에 있어서, 아르기닌 유도체가 아세틸 아르기닌, 아그마틴, 아르긴산, N-알파-부티로일-L-아르기닌, 또는 N-알파-피발로일 아르기닌인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세척액의 pH가 약 4.5 내지 약 8.0인 방법.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세척액의 pH가 4.5 초과 약 8.0 미만인 방법.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세척액의 pH가 약 7.5인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 불순물 중 1종 이상이 숙주 세포 단백질, 핵산, 생성물 변이체, 내독소, 단백질 A, 또는 단백질 G인 방법.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 불순물 중 1종 이상이 바이러스 또는 이의 단편인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 용리액이 염화나트륨, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체, 글리신, 헤페스, 및 아세트산 중 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 용리액의 pH가 약 2 내지 약 4인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 용출액이 단리된 생성물을 포함하고, 상기 단리된 생성물의 순도가 아르기닌 또는 아르기닌 유도체 약 0.1 M 미만이 세척액에 사용된 상응하는 방법에 비해 증가되는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 용출액이 단리된 생성물을 포함하고, 1종 이상의 불순물에 대한 상기 생성물의 비율이 검출가능한 양의 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에 비해 증가되는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 용출액이 생성물을 포함하고, 숙주 세포 단백질에 대한 생성물의 비율이 아르기닌 또는 아르기닌 유도체 약 0.1 M 미만이 세척액에 사용된 상응하는 방법에 비해 증가되는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 용출액이 생성물을 포함하고, 숙주 세포 단백질에 대한 생성물의 비율이 검출가능한 양의 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에 비해 증가되는 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 용출액의 탁도가 아르기닌 또는 아르기닌 유도체 약 0.1 M 미만이 세척액에 사용된 상응하는 방법에 비해 감소되는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 용출액의 탁도가 검출가능한 양의 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에 비해 감소되는 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 용출액 중 생성물을 치료 용도를 위해 추가로 정제하고/하거나 제제화하는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 생성물.
  37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 1종 이상의 불순물을 생성물에 결합시키고, 단계 (c)에서 결합된 매질을 1종 이상의 세척액과, 결합된 매질 전체에 걸쳐 접촉시킴으로써 생성물에 결합된 상기 1종 이상의 불순물을 제거하는 방법.
  38. (a) 항체 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 제공하는 단계;
    (b) 상기 로딩액을, 항체를 결합시키기에 적절한 조건 하에 항체를 결합시킬 수 있는 매질인 단백질 A 매질 또는 단백질 G 매질과 접촉시킴으로써 결합된 매질을 제공하는 단계;
    (c) 상기 결합된 매질을, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하며 이때 아르기닌의 농도는 1 M이 아닌 1종 이상의 세척액과 접촉시킴으로써 세척된 매질을 제공하는 단계;
    (d) 상기 세척된 매질을, 항체를 용출시키기에 적절한 조건 하에 용리액과 접촉시키는 단계; 및
    (e) 상기 항체를 포함하는 용출액을 회수하는 단계
    를 포함하며, 검출가능한 양의 아르기닌이 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에서 회수된 용출액에 비해, 상기 용출액 중 숙주 세포 단백질에 대한 항체의 비율이 증가되고, 용출액의 탁도가 감소되는 것인 생성물의 단리 방법.
  39. 제38항에 있어서, 단계 (c)에서 세척액의 pH가 약 4.5 내지 약 8.0인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도가 약 0.1 M 내지 약 0.9 M인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도가 약 1.1 M 내지 약 2.0 M인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도가 약 0.5 M인 방법.
  43. (a) 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 제공하는 단계;
    (b) 상기 로딩액을, 생성물을 결합시키기에 적절한 조건 하에 생성물을 결합시킬 수 있는 매질과 접촉시킴으로써 결합된 매질을 제공하는 단계;
    (c) 상기 결합된 매질을, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하며 이때 아르기닌의 농도는 1 M이 아닌 1종 이상의 세척액과 접촉시킴으로써 세척된 매질을 제공하는 단계;
    (d) 상기 세척된 매질을, 생성물을 용출시키기에 적절한 조건 하에 용리액과 접촉시킴으로써 생성물을 포함하는 용출액을 생성시키는 단계; 및
    (e) 상기 용출액을 중화시키는 단계
    를 포함하며, 검출가능한 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 세척액에 사용되지 않 은 상응하는 방법에 비해, 상기 용출액의 탁도가 감소되는 것인, 생성물을 포함하는 용출액에서 탁도를 감소시키는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 중화된 용출액의 pH가 약 6.5 내지 약 8.2인 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 단계 (c)에서 세척액이 아르기닌 유도체를 약 0.1 M 내지 약 2.0 M의 농도로 포함하는 것인 방법.
  46. 제43항 또는 제44항에 있어서, 단계 (c)에서 세척액이 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 약 0.1 M 내지 약 0.9 M의 농도로 포함하는 것인 방법.
  47. 제43항 또는 제44항에 있어서, 단계 (c)에서 세척액이 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 약 1.1 M 내지 약 2.0 M의 농도로 포함하는 것인 방법.
  48. 제43항 또는 제44항에 있어서, 단계 (c)에서 세척액이 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 약 0.5 M의 농도로 포함하는 것인 방법.
  49. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 세척액의 pH가 약 4.5 내지 약 8.0인 방법.
  50. 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 음이온성 상류 흡착 여과 단계를 포함하지 않는 것인 방법.
  51. (a) 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 제공하는 단계;
    (b) 상기 로딩액을, 생성물을 결합시키기에 적절한 조건 하에 생성물을 결합시킬 수 있는 매질과 접촉시킴으로써 결합된 매질을 제공하는 단계;
    (c) 상기 결합된 매질을, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하며 이때 아르기닌의 농도는 1 M이 아닌 1종 이상의 세척액과 접촉시킴으로써 세척된 매질을 제공하는 단계;
    (d) 상기 세척된 매질을, 생성물을 용출시키기에 적절한 조건 하에 용리액과 접촉시킴으로써 생성물을 포함하는 용출액을 생성시키는 단계; 및
    (e) 상기 용출액을 중화시키는 단계
    를 포함하며, 검출가능한 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 세척액에 사용되지 않은 상응하는 방법에 비해, 용출액 중 1종 이상의 불순물에 대한 상기 생성물의 비율이 증가되고, 상기 용출액의 탁도가 감소되는 것인, 생성물을 포함하는 용출액에서 탁도 및 불순물을 감소시키는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 단계 (c)에서 세척액 중 아르기닌 유도체의 농도가 약 0.1 M 내지 약 2.0 M인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 단계 (c)에서 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도가 약 0.1 M 내지 약 0.9 M인 방법.
  54. 제51항에 있어서, 단계 (c)에서 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도가 약 1.1 M 내지 약 2.0 M인 방법.
  55. 제51항에 있어서, 단계 (c)에서 세척액 중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도가 약 0.5 M인 방법.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 세척액의 pH가 약 4.5 내지 약 8.0인 방법.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 음이온성 상류 흡착 여과 단계를 포함하지 않는 것인 방법.
  58. (a) 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 제공하는 단계;
    (b) 상기 로딩액을, 생성물을 결합시키기에 적절한 조건 하에 생성물을 결합시킬 수 있는 매질과 접촉시킴으로써 결합된 매질을 제공하는 단계;
    (c) 상기 결합된 매질을, 아르기닌을 포함하며 이때 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 1.0 M 초과인 1종 이상의 세척액과, 결합된 매질 전체에 걸쳐 접 촉시킴으로써 세척된 매질을 제공하는 단계;
    (d) 상기 세척된 매질을, 생성물을 용출시키기에 적절한 조건 하에 용리액과 접촉시키는 단계; 및
    (e) 상기 생성물을 포함하는 용출액을 회수하는 단계
    를 포함하는, 생성물의 단리 방법.
  59. (a) 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 로딩액을 제공하는 단계;
    (b) 상기 로딩액을, 생성물을 결합시키기에 적절한 조건 하에 생성물을 결합시킬 수 있는 매질과 접촉시킴으로써 결합된 매질을 제공하는 단계;
    (c) 상기 결합된 매질을, 아르기닌을 포함하며 이때 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 1.0 M 미만인 1종 이상의 세척액과, 결합된 매질 전체에 걸쳐 접촉시킴으로써 세척된 매질을 제공하는 단계;
    (d) 상기 세척된 매질을, 생성물을 용출시키기에 적절한 조건 하에 용리액과 접촉시키는 단계; 및
    (e) 상기 생성물을 포함하는 용출액을 회수하는 단계
    를 포함하는, 생성물의 단리 방법.
  60. 제37항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 용출액 중 생성물을 치료 용도를 위해 추가로 정제하고/하거나 제제화하는 것인 방법.
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