KR20190032394A

KR20190032394A - 친화성 크로마토그래피 세정 완충액

Info

Publication number: KR20190032394A
Application number: KR1020197002710A
Authority: KR
Inventors: 루 왕; 티아니 조우; 자오칭 장; 미 진
Original assignee: 세파론, 인코포레이티드
Priority date: 2016-07-25
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2019-03-27
Also published as: JP7187436B2; EP3487868A4; KR102359192B1; CA3031028C; MX2019000898A; EP3487868A1; CA3031028A1; US10688412B2; JP2019525925A; IL264123B; US20180021696A1; WO2018022628A1; IL264123A

Abstract

0 mM 초과 및 약 500 mM 미만의 아르기닌, 0 mM 초과 및 약 250 mM 미만의 구아니딘, 0 mM 초과 및 약 250 mM 미만의 염화나트륨, 0 mM 초과 및 약 50 mM 미만의 음이온성 계면활성제, 또는 0% 초과 및 약 0.25% w/v 미만의 비이온성 계면활성제를 포함하는 세정 완충액. 관심 단백질, 예컨대 항체의 친화성 크로마토그래피 정제 동안 사용될 때, 상기 세정 완충액은 제제로부터 숙주 세포 단백질의 수준을 상당히 낮춘다. 상기 세정 완충액에 의한 친화성 크로마토그래피 이후, 관심 단백질은 막 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제될 수 있다.

Description

친화성 크로마토그래피 세정 완충액

관련된 출원에 대한 교차 참조

본원은 하기에 관한 것이다: 미국 가출원 번호 62/366,302 (2016년 7월 25일 출원), 미국 가출원 번호 62/366,309 (2016년 7월 25일 출원), 및 미국 가출원 번호 62/523,032 (2017년 6월 21일 출원), (이들 각각의 내용은 본 명세서에서, 전체적으로 및 모든 목적을 위해 참고로 편입됨).

EFS -웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조

전자적으로 제출된 서열 목록의 내용 (파일 명칭: 2873_274PC03_ SeqListing.txt, 크기: 8,311 바이트, 및 작성일: 2017년 7월 25일)은 이의 전체가 참고로 본 명세서에서 편입된다.

본 발명의 분야

본 발명은 전반적으로 단백질 생화학의 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 숙주 세포 단백질로부터 표적 단백질을 정제하기 위해 친화성 크로마토그래피에서 사용된 중간 세정 완충액에 관한 것이다. 친화성 크로마토그래피 컬럼을 염기성 아미노산, 염, 음이온성 또는 비-이온성 계면활성제 또는 유기 인산염, 및 구아니딘으로 세정하는 것은, 숙주 세포 단백질 불순물을 단백질 제제로부터 실질적으로 감소시킨다.

재조합 단백질은 숙주 세포에서 발현되고, 일련의 크로마토그래피 및 여과 단계에 의해 정제된다 (Liu 등, MAbs 2: 5 480-499 (2010)). 단백질 A 친화성 크로마토그래피는 이의 고 특이성으로 인해 단클론성 항체 정제에 대하여 가장 빈번하게 사용된 접근법이다 (Shukla 등, J of Chrom . B 848: 1 28-39 (2007)). 표적 단백질과 공동-발현되는 숙주 세포 단백질 (HCP)가 주요 도전 불순물인 것은, HCP가 표적 단백질과 함께 공동-정제될 수 있기 때문이다. 따라서, 치료-등급 단클론성 항체 (mAbs)는 보통 단백질 A 크로마토그래피, 및 이어서 2 이상의 폴리싱 크로마토그래피 단계에 의해 정제되어 관심 단백질의 원하는 순도를 달성한다. 불행하게도, 각각의 추가 크로마토그래피 단계는 단백질이 컬럼에서 잔류함에 따라 단백질 수율을 불가피하게 감소시킨다. 추가적인 컬럼의 사용은 공정의 비용 및 운영 복잡성을 증가시킨다.

다운스트림 캐스케이드로서도 또한 알려진, 전형적인 정제 방식은 친화성 크로마토그래피, 및 이어서 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 및 이어서 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX)를 이용한다. 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환은 보통 폴리싱 단계로서 고려된다 (참고, 예를 들면, GE Healthcare. (2006). Process-scale purification of monoclonal antibodies-polishing using Capto™ Q. www.gelifesciences.com/ gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1314750913712/litdoc28903716_20130507212449.PDF를 참고하라).

단백질 A 컬럼 성능 개선에 의한 폴리싱 크로마토그래피 단계를 감소 또는 제거하는 것은, 개발 노력 및 제조 비용을 상당히 감소시킬 수 있고, 표적 생성물 회수를 개선시킬 수 있을 뿐만 아니라 제조 작업을 간소화시킬 수 있다.

본 발명은 포착 컬럼 성능을 증진시키기 위해 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용된 포괄적인 중간 세정 전략을 제공하여, 필요한 폴리싱 단계의 수가 감소하게 된다. 이들 데이터는 mAb 정제 공정이 본 발명의 세정 용액으로 잠재적으로 상당히 간소화될 수 있다는 것을 입증한다.

발명의 개요

제1 양태에서, 본 발명은, 물, 염기성 아미노산, 염, 및 음이온성 계면활성제 또는 비-이온성 계면활성제 또는 유기 인산염을 포함하는, 친화성 크로마토그래피 세정 용액을 특색으로 한다. 일부 바람직한 구현예에서, 염기성 아미노산은 아르기닌이고, 염은 염화나트륨이고, 음이온성 계면활성제는 옥탄산나트륨이다. 일부 바람직한 구현예에서, 염기성 아미노산은 아르기닌이고, 염은 염화나트륨이고, 음이온성 계면활성제는 옥탄산나트륨이고, 세정 용액은 또한 구아니딘을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 염기성 아미노산은 아르기닌이고, 염은 염화나트륨이고, 비-이온성 계면활성제는 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜 (트리톤^® X-100)이다. 일부 바람직한 구현예에서, 염기성 아미노산은 아르기닌이고, 염은 염화나트륨이고, 유기 인산염는 트리부틸 포스페이트이다. 세정 용액은 바람직하게는 7-9의 pH 범위를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 7.0의 pH, 약 7.5의 pH, 약 8.0의 pH, 약 8.5의 pH, 또는 약 9.0의 pH를 갖는다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 0 mM 초과 및 약 500 mM 미만 아르기닌, 0 mM 초과 및 약 300 mM 미만 염화나트륨, 및 5 mM 초과 및 약 45 mM 미만의 음이온성 계면활성제를 포함한다. 세정 용액은 약 50 mM 내지 약 150 mM 아르기닌, 약 75 mM 내지 약 125 mM 아르기닌, 약 85 mM 내지 약 115 mM 아르기닌, 약 90 mM 내지 약 110 mM 아르기닌, 약 95 mM 내지 약 105 mM 아르기닌, 약 100 mM 내지 약 400 mM 아르기닌, 약 150 mM 내지 약 350 mM 아르기닌, 약 200 mM 내지 약 300 mM 아르기닌, 약 300 mM 내지 약 350 mM 아르기닌, 또는 약 250 mM 내지 약 300 mM 아르기닌을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 300 mM 아르기닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 250 mM 아르기닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 200 mM 아르기닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 50 mM 아르기닌, 약 75 mM 아르기닌, 약 90 mM 아르기닌, 약 100 mM 아르기닌, 약 105 mM 아르기닌, 약 110 mM 아르기닌, 약 125 mM 아르기닌, 약 150 mM 아르기닌, 약 200 mM 아르기닌, 약 250 mM 아르기닌, 약 300 mM 아르기닌, 350 mM 아르기닌, 약 400 mM 아르기닌, 약 450 mM 아르기닌, 또는 약 500 mM 아르기닌을 포함한다.

일부 구현예에서, 세정은 약 50 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 약 150 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 또는 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 150 mM 염화나트륨을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 200 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 50 mM 염화나트륨, 약 100 mM 염화나트륨, 또는 약 150 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 100 mM 염화나트륨을 포함한다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 약 5 mM 내지 약 45 mM의 음이온성 계면활성제, 약 10 mM 내지 약 40 mM의 음이온성 계면활성제, 약 20 mM 내지 약 30 mM의 음이온성 계면활성제, 또는 22.5 mM 내지 약 27.5 mM의 음이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 22.5 mM 내지 약 27.5 mM의 음이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 5 mM의 음이온성 계면활성제, 약 20 mM의 음이온성 계면활성제, 약 22.5 mM의 음이온성 계면활성제, 약 25 mM의 음이온성 계면활성제, 약 30 mM의 음이온성 계면활성제, 약 40 mM의 음이온성 계면활성제 또는 약 45 mM의 음이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 음이온성 계면활성제는 옥탄산나트륨을 포함한다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 약 300 mM 아르기닌, 약 250 mM 아르기닌, 또는 약 200 mM 아르기닌, 및 약 150 mM 염화나트륨 또는 약 100 mM 염화나트륨, 및 약 25 mM의 음이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 250 mM 아르기닌, 약 150 mM 염화나트륨, 및 약 25 mM의 음이온성 계면활성제, 예컨대 옥탄산나트륨을 포함하고, 약 7.5의 pH를 갖는다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 약 50 mM 초과 및 약 150 mM 미만 아르기닌, 약 50 mM 초과 및 약 250 mM 미만 구아니딘, 0 mM 초과 및 약 300 mM 미만 염화나트륨, 및 약 5 mM 초과 및 약 45 mM 미만의 음이온성 계면활성제를 포함한다. 세정 용액은 약 50 mM 내지 약 150 mM 아르기닌, 약 75 mM 내지 약 125 mM 아르기닌, 약 85 mM 내지 약 115 mM 아르기닌, 약 90 mM 내지 약 110 mM 아르기닌, 약 95 mM 내지 약 105 mM 아르기닌, 또는 약 98 mM 내지 약 102 mM 아르기닌을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 100 mM 아르기닌을 포함한다. 세정 용액은 약 50 mM 구아니딘 내지 약 200 mM 구아니딘, 약 50 mM 구아니딘 내지 약 250 mM 구아니딘, 약 100 mM 구아니딘 내지 약 200 mM 구아니딘, 약 150 mM 구아니딘 내지 약 200 mM 구아니딘, 약 100 mM 구아니딘 내지 약 150 mM 구아니딘, 약 125 mM 구아니딘 내지 약 175 mM 구아니딘, 약 135 mM 구아니딘 내지 약 165 mM 구아니딘, 또는 약 145 mM 구아니딘 내지 약 155 mM 구아니딘을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 150 mM 구아니딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 100 mM 아르기닌 및 약 150 mM 구아니딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 50 mM 구아니딘, 약 125 mM 구아니딘, 약 135 mM 구아니딘, 약 145 mM 구아니딘, 약 150 mM 구아니딘, 약 155 mM 구아니딘, 약 160 mM 구아니딘, 약 165 mM 구아니딘, 약 170 mM 구아니딘, 약 175 mM 구아니딘, 약 180 mM 구아니딘, 약 185 mM 구아니딘, 약 190 mM 구아니딘, 약 195 mM 구아니딘, 약 200 mM 구아니딘을 포함한다. 그와 같은 세정 용액은 음이온성 계면활성제를 추가로 포함할 수 있거나, 염화나트륨을 추가로 포함할 수 있거나, 또는 음이온성 계면활성제 및 염화나트륨을 추가로 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 아르기닌 및 구아니딘을 포함하는 세정 용액은 약 5 mM 내지 약 45 mM의 음이온성 계면활성제, 약 20 mM 내지 약 30 mM의 음이온성 계면활성제, 약 22.5 mM 내지 약 27.5 mM의 음이온성 계면활성제, 약 22 mM 내지 약 28 mM의 음이온성 계면활성제, 또는 약 23 mM 내지 약 29 mM의 음이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 25 mM의 음이온성 계면활성제를 포함한다. 음이온성 계면활성제는 바람직하게는 옥탄산나트륨이다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 100 mM 아르기닌, 약 150 mM 구아니딘, 및 바람직하게는 옥탄산나트륨인 약 25 mM의 음이온성 계면활성제를 포함하고, 약 7.5의 pH를 갖는다.

일부 구현예에서, 아르기닌 및 구아니딘을 포함하거나, 또는 아르기닌, 구아니딘 및 음이온성 계면활성제를 포함하는 세정 용액은, 약 50 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 약 150 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 150 mM 염화나트륨, 약 125 mM 염화나트륨 내지 약 175 mM 염화나트륨, 약 135 mM 염화나트륨 내지 약 165 mM 염화나트륨, 또는 약 145 mM 염화나트륨 내지 약 155 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 150 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 100 mM 아르기닌, 약 150 mM 구아니딘, 바람직하게는 옥탄산나트륨인 약 25 mM의 음이온성 계면활성제, 및 약 150 mM 염화나트륨을 포함하고, 약 7.5의 pH를 갖는다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 0 mM 초과 및 약 500 mM 미만 아르기닌, 0 mM 초과 및 약 250 mM 미만 염화나트륨, 및 0 부피% 초과 및 약 0.25 부피% 미만의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 세정 용액은 약 100 mM 내지 약 400 mM 아르기닌, 약 150 mM 내지 약 350 mM 아르기닌, 약 200 mM 내지 약 300 mM 아르기닌, 약 300 mM 내지 약 350 mM 아르기닌, 또는 약 250 mM 내지 약 300 mM 아르기닌을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 300 mM 아르기닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 250 mM 아르기닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 200 mM 아르기닌을 포함한다. 세정은 약 50 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 약 150 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 또는 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 150 mM 염화나트륨을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 200 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 150 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 100 mM 염화나트륨을 포함한다. 세정 용액은 약 0.01% (w/v) 내지 약 0.2% (w/v)의 비-이온성 계면활성제, 약 0.05% (w/v) 내지 약 0.15% (w/v)의 비-이온성 계면활성제, 약 0.1% (w/v) 내지 약 0.15% (w/v)의 비-이온성 계면활성제, 또는 약 0.05% (w/v) 내지 약 0.1% (w/v)의 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 0.01% (w/v), 약 0.05% (w/v), 약 0.1% (w/v), 약 0.15% (w/v) 또는 약 0.2% (w/v)의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 트리톤^® X-100을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 약 300 mM 아르기닌, 약 250 mM 아르기닌, 또는 약 200 mM 아르기닌, 및 약 200 mM 염화나트륨, 약 150 mM 염화나트륨, 또는 약 100 mM 염화나트륨, 및 약 0.0%의 유기 용매를 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 250 mM 아르기닌, 약 150 mM 염화나트륨, 및 약 0.1% (w/v)의 비-이온성 계면활성제를 포함하고, 약 7.5의 pH를 갖는다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 0 mM 초과 및 약 500 mM 미만 아르기닌, 0 mM 초과 및 약 250 mM 미만 염화나트륨, 및 0 부피% 초과 및 약 0.1 부피% 미만의 유기 인산염을 포함한다. 세정 용액은 약 100 mM 내지 약 400 mM 아르기닌, 약 150 mM 내지 약 350 mM 아르기닌, 약 200 mM 내지 약 300 mM 아르기닌, 약 300 mM 내지 약 350 mM 아르기닌, 또는 약 250 mM 내지 약 300 mM 아르기닌을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 200 mM 아르기닌을 포함한다. 세정은 약 50 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 약 150 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 또는 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 150 mM 염화나트륨을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 200 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 150 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 100 mM 염화나트륨을 포함한다. 세정 용액은 약 0.03% (w/v) 내지 약 0.07% (w/v)의 유기 인산염을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유기 인산염는 트리부틸 포스페이트를 포함한다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 바이러스 제거를 증가시키거나, 관심 단백질을 함유하는 혼합물로부터 바이러스를 불활성화시킨다. 바이러스 제거는 log₁₀ 감소값 (LRV)으로 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 바이러스 제거를 증가시키고, 여기서 LRV는 약 1.0 내지 약 10.0 log₁₀이다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 바이러스 제거를 증가시키고, 여기서 LRV는 약 1.0 log₁₀ 내지 약 5.0 log₁₀이거나, LRV는 약 1.0 log₁₀ 내지 약 3.0 log₁₀이거나, LRV는 약 2.0 log₁₀ 내지 약 4.0 log₁₀이거나, LRV는 약 3.0 log₁₀ 내지 약 5.0 log₁₀이거나, LRV는 약 3.0 log₁₀ 내지 약 8.0 log₁₀이거나, LRV는 약 4.0 log₁₀ 내지 약 8.0 log₁₀이거나, 또는 LRV는 약 5.0 log₁₀ 및 6.0 log₁₀이다. 일부 구현예에서, LRV는 약 1.0 log₁₀이거나,LRV는 약 2.0 log₁₀ 이거나, LRV는 약 3.0 log₁₀ 이거나, LRV는 약 4.0 log₁₀ 이거나, LRV는 약 5.0 log₁₀ 이거나, LRV는 약 6.0 log₁₀ 이거나, LRV는 약 7.0 log₁₀ 이거나, LRV는 약 8.0 log₁₀ 이거나, LRV는 약 9.0 log₁₀ 이거나, 또는 LRV는 약 10.0 log₁₀이다.

임의의 상기 세정 용액은 크로마토그래피 컬럼, 예컨대 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 관심 단백질을 정제시키는데 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A 크로마토그래피 컬럼이다. 바람직한 구현예에서, 크로마토그래피 컬럼은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼이다. 일부 구현예에서, 단백질이 본 명세서에서 기재된 또는 예시된 방법에 따라 정제되는, 정제된 관심 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 조성물을 특색으로 한다. 그와 같은 조성물은 관심 단백질 및 최소량의 숙주 세포 단백질을 포함하고, 후자는 관심 단백질과 함께 공동-발현되지만 기재된 세정 용액을 사용하는 친화성 크로마토그래피를 통해 관심 단백질로부터 주로 분리된다. 관심 단백질은 바람직하게는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 단백질은 TNF-유사 리간드 1A (TL1a)에 특이적으로 결합하는 항체이다. TL1a에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 단백질은 칼시토닌 유전자-관련된 펩타이드 (CGRP)에 특이적으로 결합하는 항체이다. CGRP에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 단백질은 CD38에 특이적으로 결합하는 항체이다. CD38에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함할 수 있다. CD38에 특이적으로 결합하는 항체는, 인터페론 분자에 융합물을 추가로 포함할 수 있는데, 이는 인터페론 알파 분자를 포함하고, 약화된 인터페론 알파 분자를 포함한다.

일부 구현예에서, 조성물은 수성 담체, TL1a에 특이적으로 결합하는 재조합 발현되거나 또는 하이브리도마-발현된 항체, 및 조성물 중 약 500 ppm 미만의 숙주 세포 단백질의 수준을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 450 ppm 미만이다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 300 ppm 미만이다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 200 ppm 미만이다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 150 ppm 미만이다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 100 ppm 미만이다. ELISA는 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준(ppm)을 결정하는데 사용될 수 있다. 항체는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 조성물은 수성 담체, CGRP에 특이적으로 결합하는 재조합 발현되거나 또는 하이브리도마-발현된 항체, 및 조성물의 약 800 ppm 미만의 숙주 세포 단백질의 수준을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 700 ppm 미만이다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 500 ppm 미만이다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 200 ppm 미만이다. 일부 바람직한 양태에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 150 ppm 미만이다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 100 ppm 미만이다. ELISA는 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준(ppm)을 결정하는데 사용될 수 있다. 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 조성물은 수성 담체, 항체에 융합된 인터페론 분자를 포함하는 CD38 또는 이의 작제물에 특이적으로 결합하는 재조합 발현되거나 또는 하이브리도마-발현된 항체, 및 조성물의 약 500 ppm 미만의 숙주 세포 단백질의 수준을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 400 ppm 미만이다. 일부 바람직한 양태에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 300 ppm 미만이다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 200 ppm 미만이다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 150 ppm 미만이다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준은 조성물의 약 100 ppm 미만이다. ELISA는 조성물 중 숙주 세포 단백질의 수준(ppm)을 결정하는데 사용될 수 있다. 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함할 수 있다.

세정 용액은 단백질 정제 방법에서 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은, 재조합적 발현 또는 하이브리도마 발현을 포함하는, 세포로부터 발현되는 관심 단백질의 정제 방법을 특색으로 한다. 보통, 본 방법은 관심 단백질 및 하나 이상의 오염 숙주 세포 단백질의 혼합물을 친화성 크로마토그래피 리간드에 로딩시키는 단계; 염기성 아미노산, 염, 및 비-이온성 계면활성제 또는 음이온성 계면활성제를 포함하는 수성 세정 용액으로 리간드를 세정시켜, 리간드로부터 하나 이상의 오염 단백질을 용출시키는 단계; 및 그 다음 리간드로부터 관심 단백질을 용출시키고, 이에 의해 관심 단백질의 정제된 용출물을 형성하는 단계;를 포함한다. 수성 세정 용액은, 이전의 단락에서 기재된 세정 용액을 포함하여, 본 명세서에서 기재된 또는 예시된 임의의 상기 용액일 수 있다. 리간드는 당해 분야의 숙련가에 알려진 임의의 적합한 친화성 리간드, 예를 들어 단백질 A일 수 있는데, 여기에서 관심 단백질은 항체를 포함한다. 본 방법은 생물반응기에서 관심 단백질 및 하나 이상의 오염 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 방법은 관심 단백질의 정제된 용출물을 산성화하여(예를 들면, 용출물의 pH를 저하하여) 용출물 중의 바이러스를 불활성화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. pH 저하는 용출물 중의 바이러스를 불활성화시키는데 충분한 일정한 시간의 기간동안 실시되고, 그 후 pH는 더욱 중성 pH로 상승된다. 본 방법은, 불활성화된 바이러스를 포함하는 관심 단백질의 정제된 용출물을 여과시켜, 바이러스를 제거하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 관심 단백질의 정제된 용출물을 투석여과, 한외여과, 또는 투석여과 및 한외여과 모두로 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물로서 관심 단백질의 정제된 용출물을 제형화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 막 크로마토그래피 지지체, 예를 들어, 음이온 교환 막 크로마토그래피 지지체에 관심 단백질의 정제된 용출물을 로딩시키는 단계; 및 막 크로마토그래피 지지체로부터 추가-정제된 용출물을 포함하는 통과액(flow through)을 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물로서 관심 단백질의 추가-정제된 용출물을 제형화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 본 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 본 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는다.

도 1은 수지 플레이트에서 단일 성분 세정 완충액에 의한 HCP 제거를 도시한다.
도 2는 수지 플레이트에서 아미노산 및 계면활성제의 조합, 또는 구아니딘 및 계면활성제의 조합을 포함하는 세정 완충액에 의한 HCP 제거를 도시한다.
도 3은 수지 플레이트에서 계면활성제와 아르기닌 및 구아니딘의 조합을 포함하는 세정 완충액에 의한 HCP 제거를 도시한다.
도 4는 Atoll 컬럼에서 NaCl, 트리부틸 포스페이트, 트리톤® X-100, 아르기닌, 옥탄산나트륨 및 구아니딘의 조합에 의한 HCP 제거를 도시한다.
도 5는 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제/NaCl/아르기닌 세정 완충액을 사용하는 숙주 세포 단백질 제거에 대한 pH의 영향을 도시한다.
도 6은 아르기닌, 구아니딘, 계면활성제 및 옥탄산나트륨의 다양한 조합에 의한 세정을 사용하는, 상이한 항체들 (항-TL1a, 항-CD-38 및 항-CGRP)로부터의 HCP 제거를 도시한다.
도 7은 단백질 A 크로마토그래피 이후 막 크로마토그래피 및 본 발명의 단백질 A 세정 완충액을 사용하는 신규한 정제 방식 (우측 컬럼)에 비교된, 전통적 항체 정제 방식 (좌측 컬럼)의 흐름도를 도시한다.

발명의 상세한 설명

친화성 크로마토그래피 세정 조성물, 상기 조성물을 이용하는 폴리펩타이드 정제 방식, 및 고도의 순도를 갖는, 예를 들어, 상기 조성물 또는 정제 방식의 사용으로 정제된 폴리펩타이드 제제가 본 명세서에서 제공된다.

본 발명의 양태에 관한 다양한 용어들은 명세서 및 청구항 내내 사용된다. 그와 같은 용어들은, 달리 나타내지 않는 한, 기술 분야에서 그것의 통상적인 의미로 주어지는 것이다. 다른 특이적으로 정의된 용어들은 본 명세서에서 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석되는 것이다.

본 명세서에서 사용된 단수 형태, "한(a)", "하나(an)", 및 "그(the)"는 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.

용어 "물을 포함하는 용액"은 용어 "수용액"과 교환가능하게 사용된다.

용어 "숙주 세포 단백질", "HCP", "숙주 세포 단백질 오염물질", 및 "숙주 세포 단백질 불순물"은 본 명세서에서 교환가능하게 사용된다.

용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", "관심 폴리펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 지칭하기 위해 본 명세서에서 교환가능하게 사용된다. 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그리고 비-아미노산에 의해 차단될 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 라벨링 성분과 콘주게이션되어 변형된 아미노산 폴리머를 포괄한다. 예를 들어, (예를 들어, 비천연 아미노산, 등을 포함하는) 아미노산의 하나 이상의 유사체를 함유하는 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 기술 분야에서 공지된 다른 변형은 정의 내에 또한 포함된다. 본 개시내용의 폴리펩타이드가 항체에 기반되기 때문에, 특정 구현예에서, 폴리펩타이드가 단일 쇄 또는 관련된 쇄로서 발생할 수 있다는 것이 이해된다. 바람직하게는, 관심 단백질은 폴리펩타이드, 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 작제물이다.

용어 "항-TNF-유사 리간드 1A (TL1a)"는 TL1a에 결합할 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다. 항-TL1a 단백질은 예를 들어 항-TL1a 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.

용어 "항-칼시토닌 유전자-관련된 펩타이드 (CGRP)"는 CGRP에 결합할 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다. 항-GCRP 단백질은 예를 들어 항-CGRP 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.

용어 "항-CD38"은 CD38에 결합할 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다. 항-CD38 단백질은 예를 들어 항-CD38 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 및 "항체들"은 기술 용어들이고 본 명세서에서 교환가능하게 사용될 수 있고 항원을 특이적으로 결합시키는 항원-결합 부위를 가진 분자를 지칭할 수 있다.

용어 "항체"는 표적을 인식하고 표적에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 또는 면역글로불린 분자의 가변 영역 이내 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통한 전술한 것의 조합을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 다클론성 항체, 온전한 단클론성 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체를 포함하는 융합 단백질, 그리고 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 지칭되는 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기초하여, 이하의 5가지 주요 부류의 면역글로불린 중 어느 것일 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 하위 부류 (아이소타입) (예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2). 면역글로불린의 상이한 부류들은 상이하지만 잘 알려진 하위단위 구조들 및 3차원 배치형태를 갖는다. 항체는 다른 분자, 예컨대 독소, 방사선동위원소 등에 노출될 수 있거나, 또는 이와 콘주게이션될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 이중특이적 및 다중특이적 항체를 포괄한다.

용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 한 부분을 지칭한다. "항원-결합 단편"은 항원에 결합하는 온전한 항체의 한 부분을 지칭한다. 항원-결합 단편은 온전한 항체의 항원성 결정 가변 영역을 함유할 수 있다. 항체 단편의 예는, 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, 및 단일 쇄 항체를 포함한다. "항원-결합 단편"은 이중특이적 또는 다중특이적 항원-결합 단편일 수 있다.

"단클론성" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일 항원성 결정자, 또는 에피토프의 고도로 특이적 인식 및 결합에 관여된 균질한 항체 또는 항원-결합 단편 모집단을 지칭한다. 이것은 상이한 항원성 결정자에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론성 항체에 대조적이다. 용어 "단클론성" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 양쪽 온전한 및 전장 단클론성 항체 뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 게다가, "단클론성" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비제한적으로 하이브리도마, 파아지 선택, 재조합 발현, 및 유전자도입 동물을 포함하는 임의의 수의 방식으로 제조된 그와 같은 항체 및 이의 항원-결합 단편을 지칭한다.

용어 "인간화된" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 최소 비-인간 (예를 들면, 쥣과) 서열을 함유하는 특이적 면역글로불린 쇄, 키메라 면역글로불린, 또는 이의 단편인 비-인간 (예를 들면 쥣과) 항체 또는 항원-결합 단편의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 상보성 결정 영역 (CDR)유래의 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및 능력을 갖는 비-인간 종 (예를 들면 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터)의 CDR 유래의 잔기로 대체된 ("이식된 CDR") 인간 면역글로불린이다 (Jones 등, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science 239: 1534-1536 (1988)). 일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 원하는 특이성, 친화성, 및 능력을 갖는 비-인간 종 유래의 항체 또는 단편의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 어느 한쪽 Fv 프레임워크 영역에서 및/또는 대체된 비-인간 잔기 이내 추가의 잔기의 치환에 의해 추가로 변형되어 항체 또는 이의 항원-결합 단편 특이성, 친화성 및/또는 능력을 개선 및 최적화할 수 있다. 보통, 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-인간 면역글로불린에 상응하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역을 함유하는 적어도 하나, 전형적으로 2개 또는 3개의 가변성 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이고 반면에 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다. 인간화된 항체를 생성하는데 사용된 방법의 예는 하기에서 기재된다: 미국특허 5,225,539; Roguska 등, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 91(3): 969-973 (1994), 및 Roguska 등, Protein Eng . 9(10): 895-904 (1996). 일부 구현예에서, "인간화된 항체"는 재표면화된 항체이다.

항체의 "가변 영역"은, 어느 한쪽 단독 또는 조합으로, 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역은 초가변 영역으로도 또한 알려진 3개의 상보성 결정 영역 (CDRs)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)로 구성된다. 각각의 쇄에서 CDRs는 FRs에 의해 매우 근접하여 함께 유지되고, 다른 쇄 유래의 CDRs와 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDRs 결정에 대하여 적어도 2개의 기술이 있다: (1) 교차-종 서열 가변성에 기반된 접근법 (즉, Kabat 등. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed. , 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md. )); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기반된 접근법 (Al-lazikani 등 (1997) J. Molec . Biol . 273: 927-948)). 게다가, 이들 2개의 접근법의 조합은 CDRs를 결정하기 위해 기술 분야에서 때때로 사용된다.

용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체 또는 기술 분야에서 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조된 인간에 의해 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 인간 항체의 본 정의는 온전한 또는 전장 항체, 이의 단편, 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체 예컨대, 예를 들어, 쥣과 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함한다.

용어 "하이브리도마-발현된(hybridoma-expressed)"은 면역적 기원의 불멸 세포주 및 항체 생산 세포의 융합에 의해 생산된 하이브리드 세포주에서 발현되는 관심 단백질을 지칭한다. 용어 "하이브리도마"는, 트리오마(trioma) 세포주로 통상 d알려진, 혈장 세포와 후속적으로 융합된 쥣과 골수종 세포주 및 인간 세포와 융합의 결과인 헤테로하이브리드 골수종 융합의 자손을 포괄한다. 게다가, 용어 "하이브리도마"는 항체 예컨대, 예를 들어, 콰드로마(quadroma)를 생산하는 임의의 불멸화된 하이브리드 세포주를 포함하는 의미이다 (참조, 예를 들어, Milstein 등, 1983, Nature, 537: 3053). 하이브리드 세포주는, 인간 및 마우스를 포함하는, 임의의 종일 수 있다.

용어 "재조합 발현된"은 관심 단백질이, 외인성 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 재조합 플라스미드 또는 벡터의 도입에 의해, 유전적으로 변경된, 또는 유전적으로 변경될 수 있는 "재조합 숙주 세포"에서 발현되는 것을 지칭한다. 그와 같은 용어들이 특정한 대상체 세포, 뿐만 아니라 그와 같은 세포의 자손을 지칭하도록 의도되는 것이 이해되어야 한다. 특정 변형이 어느 한쪽 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 계속되는 생성에서 발생할 수 있기 때문에, 그와 같은 자손은, 사실상, 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "재조합 숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.

용어 "아미노산"은 임의의 천연-발생 및/또는 비-천연 아미노산 잔기를 지칭한다. 용어 "천연-발생 아미노산"은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및 Val을 지칭한다. 용어 "염기성 아미노산"은 아르기닌, 리신, 글리신 및 히스티딘을 지칭한다. 아미노산은 또한 천연 및 비-천연 아미노산의 D-형태를 포함한다. "D-"는, 천연 발생 ("L-") 아미노산에서 배치형태와는 대조적으로, "D" (우회전성) 배치형태를 갖는 아미노산을 지정하다. 천연 및 비-천연 아미노산은 상업적으로 구매될 수 있거나 (Sigma Chemical Co. , Advanced Chemtech) 또는 기술 분야에서 공지된 방법을 사용하여 합성될 수 있다.

용어 "친화성 크로마토그래피" 또는 "친화성 정제"는 고형 지지체에 고정된 또는 커플링된 리간드와 이의 결합 파트너 사이의 특이적 결합 상호작용에 기반한 분리 방법을 지칭한다. 복합 혼합물이 컬럼에 통과되는 경우, 리간드에 특이적 결합 친화성을 갖는 분자들은 결합된다. 다른 샘플 성분이 세정 제거된 후, 결합된 분자는 박리된 형태 지지체로, 최초 혼합물로부터 이의 정제를 초래한다. 각각의 특이적 친화성 시스템은 당해 분야의 숙련가에 공지된 조건의 이의 자체 세트를 요구한다.

용어 "친화성 리간드"는 금속 (예를 들면, Cd⁺², Co⁺², Cu⁺², Ga⁺³, Fe⁺³, Ni⁺², 및 Zn⁺²), 염료 [예를 들면, 시바크론 블루(Cibacron Blue) 및 이의 변이체], 글루타티온, 서브틸리신, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L, 보로네이트, 아비딘, 스트렙타비딘, 바이오틴, 항-c-Myc, 항-HA, 뉴클레오타이드, 조효소, 항체, 헤파린, (특히 공지된 특이성을 가진 항체에 대한) 항원, 및 다른 공지된 친화성 리간드를 지칭한다.

용어 "바이러스 제거"는 용어 "바이러스 불활성화", "바이러스의 불활성화", "바이러스 제거" 및 "바이러스의 제거"와 교환가능하게 사용된다. 용어 "바이러스 불활성화"는 혼합물에서 함유된 바이러스를 비기능성으로 만들거나 혼합물로부터 바이러스를 정제되도록 제거하는 것을 포함한다. 바이러스는 항체 생산, 다운스트림 가공 단계 또는 제조 조건의 공급원으로부터 기원할 수 있다. 바이러스를 비기능성으로 만드는 또는 바이러스를 제거하는 방법은 열 활성화, pH 불활성화, 화학적 불활성화제, 등을 포함한다. 용어 "pH 바이러스 불활성화"는 바이러스를 비기능성으로 만드는데 충분한 pH, 예를 들면 약 2.5 내지 5.0의 pH로 바이러스를 처리하는 것을 포함한다.

용어 "log₁₀ 감소 인자 (LRF)", "log₁₀ 감소값 (LRV)", 및 "log 제거"는 교환가능하고 개시 물질에서 그리고 관련된 생성물 분획에서 바이러스성 역가의 계산된 비를 지칭한다. 감소 인자는 바이러스를 제거 또는 불활성화하기 위해 공정 단계의 포텐셜 또는 용량을 기재하기 위한 적합한 파라미터이다. 임의의 공정 단계의 LRV는 생성물을 오염시킬 수 있는 바이러스를 닮은 임의의 공지된 모델 바이러스, 예를 들면 쥣과 백혈병 바이러스 (MuLV) 및 마우스 미소 바이러스 (MVM)을 사용하여 측정될 수 있다.

바이러스 제거 연구의 목적은 바이러스 불활성화/제거에 효과적인 것으로 고려될 수 있는 공정 단계(들)을 평가하는 것 그리고 공정 단계(들)에 의해 수득된 바이러스 감소의 전체적인 수준을 정량적으로 추정하는 것이다. 바이러스 감소의 수준은, 다양한 공정 단계 후 수득된, 관심 단백질을 함유하는 혼합물에 상당한 양의 바이러스를 첨가하고 ("스파이킹"), 그 후 후속적인 단계 동안 바이러스의 제거 또는 불활성화를 입증함에 의해 수득될 수 있다. 바이러스 전염성의 감소는 바이러스 입자의 제거 또는 바이러스 전염성의 불활성화에 의해 달성될 수 있다. 바이러스 제거 연구는 혼합물에 존재한다고 공지된 바이러스의 제거를 입증하기 위해 수행된다. 감소 인자는 대수 규모 (log10)으로 정상적으로 발현된다. 제거 평가 연구용 모델 바이러스는 관심 단백질을 함유하는 혼합물을 오염시킬 수 있는 바이러스를 닮기 위해 선택된다. 모델 바이러스, 예컨대 친이종성 쥣과 백혈병 바이러스 (X-MulV) 및 마우스의 미소 바이러스 (MVM)은 관심의 세포주-유래된 단백질의 바이러스 제거 검증에 종종 사용된다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 바이러스 제거를 증가시키거나, 또는 관심 단백질을 함유하는 혼합물로부터 바이러스를 불활성화시킨다. 바이러스 제거는 log10 감소값 (LRV)로 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 바이러스 제거를 증가시키고, 여기서 LRV는 약 1.0 log₁₀ 내지 약 10.0 log₁₀이다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 바이러스 제거를 증가시키고, 여기서 LRV는 약 1.0 log₁₀ 내지 약 5.0 log₁₀이거나, LRV는 약 1.0 log₁₀ 내지 약 3.0 log₁₀이거나, LRV는 약 2.0 log₁₀ 내지 약 4.0 log₁₀이거나, LRV는 약 3.0 log₁₀ 내지 약 5.0 log₁₀이거나, LRV는 약 3.0 log₁₀ 내지 약 8.0 log₁₀이거나, LRV는 약 4.0 log₁₀ 내지 약 8.0 log₁₀이거나, 또는 LRV는 약 5.0 log₁₀ 및 6.0 log₁₀이다. 일부 구현예에서, LRV는 약 1.0 log₁₀이거나, LRV는 약 2.0 log₁₀이거나, LRV는 약 3.0 log₁₀이거나, LRV는 약 4.0 log₁₀이거나, LRV는 약 5.0 log₁₀이거나, LRV는 약 6.0 log₁₀이거나, LRV는 약 7.0 log₁₀이거나, LRV는 약 8.0 log₁₀이거나, LRV는 약 9.0 log₁₀이거나, 또는 LRV는 약 10.0 log₁₀이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 방법을 사용하여 바이러스 제거 연구에 의해 측정된 경우 바이러스성 입자가 "실질적으로 없는" 관심 단백질을 포함하는 조성물 및 정제된 용출물을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스성 입자가 실질적으로 없는"은 관심 단백질이 바이러스성 입자로부터 분리된 관심 단백질을 포함하는 조성물 또는 정제된 용출물을 지칭한다. 용어 "실질적으로 없는"은 약 0.0005% 미만 내지 약 0.001% 바이러스성 입자를 갖는 관심 단백질을 포함하는 조성물 또는 용액을 지칭한다. 바람직하게는, 조성물은 조성물이 약 0.0005% 미만 바이러스성 입자를 갖는 경우 "실질적으로 없다".

본 발명은 본 발명의 임의의 방법을 사용하여 바이러스 제거 연구에 의해 측정된 경우 바이러스성 입자가 "없는" 관심 단백질을 포함하는 조성물 및 정제된 용출물을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스성 입자가 없는"은 약 0.0001% 미만을 갖는 조성물을 지칭한다. 조성물은 바이러스성 입자가 최대 감수성의 조건 하에서 바이러스 제거 연구에 의해 검출될 수 없는 경우 바이러스성 입자가 없다.

세정 용액에서 아르기닌과 양쪽 염화나트륨 (NaCl) 및 비-이온성 계면활성제 또는 음이온성 계면활성제 또는 유기 인산염의 포함이 친화성 크로마토그래피 정제 동안 재조합 단백질 제제로부터 숙주 세포 단백질 (HCP)의 제거를 실질적으로 증진시키는 것이 본 개시내용에 따라 관찰되었다. HCP 제거에서 이러한 증진은 그것만으로 또는 다른 성분의 단 하나와 조합으로 각각의 성분에 대해 상당하였다. 3개의 성분 (1. 아르기닌, NaCl 및 트리톤® X-100; 2. 아르기닌, NaCl 및 옥탄산나트륨; 또는 3. 아르기닌 NaCl 및 트리부틸 포스페이트)의 삼중 조합은 HCP 제거의 초과 첨가적 (예를 들면, 상승작용적) 증진을 초래하였다. 구아니딘의 첨가가 아르기닌의 상대적으로 저 농도의 사용을 허용하는 것이 추가로 관찰되었고, 따라서, 잠재적으로 작업의 비용을 감소시켰다. 또한, 세정 완충액에서 각각의 성분의 (기술 분야 이내 보통 사용된 농도에 비교된 경우) 저 농도는 여전히 HCP의 효과적인 제거를 여전히 초래하였다. 이것은 환경적으로 미친화적인 폐기물을 잠재적으로 감소시키기 때문에 유리하다. HCP (ppm)은 제조자의 프로토콜에 따라 CHO 숙주 세포 단백질 3세대 키트 (Immunoenzymetric Assay for the Measurement of CHO Host Cell Proteins, Catalog # F550, Cygnus Technologies, Southport, NC)를 사용하여 결정될 수 있다.

비-이온성 계면활성제와 염의 조합으로부터 고도의 숙주 세포 단백질 제거는 이들 부형제가 반대 효과를 가질 수 있기 때문에 예기치 못하였다, 즉, 그 염이 소수성 상호작용을 증진시키고 비-이온성 계면활성제가 소수성 상호작용을 감소시킨다.

음이온성 계면활성제와 아르기닌의 조합으로부터 고도의 숙주 세포 단백질 제거가 또한 예기치 못하였던 것은 아르기닌이 계면활성제, 예를 들면, (또한 카프릴산나트륨 또는 CA로 불리는) 옥탄산나트륨과 조합된 경우 세정 완충액의 다른 사용이 세정 완충액에서 단독으로 아르기닌 사용에 비교된 경우 남아있는 HCP의 더 높은 수준으로 이어지기 때문이다. 참조, 예를 들면, Nabila 등. (2014) Biotechnol. Progress, 30: 1114-24.

아르기닌 및 구아니딘의 조합은 사용된 각각의 성분의 양을 상당히 감소시킬 수 있다. 미국특허 번호 8,350,013은 효과적인 불순물 제거가 아르기닌의 고 농도, 특히 > 500 mM 아르기닌 또는 >1 M 구아니딘으로 일반적으로 관찰되었다는 것을 개시한다. 본 발명에서, 100 mM 구아니딘 및 100 mM 아르기닌의 조합은 동등한 효과적인 불순물 제거를 달성하였다. 아르기닌은 비싸고, 및 구아니딘의 고 농도 (약 1M 구아니딘)은 부식성이다. 따라서, 본 발명은 효과적인 HCP 제거를 달성하면서 상당한 비용 절감 뿐만 아니라 부식 해결을 초래할 수 있다.

HCP 제거의 수준은 음이온 교환 (AEX) 또는 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피로 후속적인 정제 단계가 단백질 정제 방식으로부터 제거될 수 있도록 매우 실질적인 것으로 관찰되었다. 정제 방식에서 AEX 및 CEX의 이중 단계는 막 크로마토그래피의 정제 방식에서 단일 단계로 대체되어 고도로 정제된 단백질 제제를 제공할 수 있다. 단리의 관점에서, 막 크로마토그래피의 단계는 AEX 및 CEX의 조합 (AEX + CEX)에 비교된 경우 효과적인 정제 단계는 아니다. 그러나, 본 발명의 친화성 크로마토그래피 방법은 정제 공정을 개선시킨다. 본 명세서에서 기재된 또는 예시된 바와 같이 친화성 크로마토그래피 및 막 친화성 크로마토그래피에 의해 달성된 정제의 수준은 선행기술에서 예시된 바와 같이 AEX + CEX의 조합과 친화성 크로마토그래피에 의해 달성된 정제의 수준에 비교할만하다.

막 크로마토그래피로 AEX + CEX의 대체가 특히 초기 단계 임상 물질의 생산에 유리한 것은, 막 크로마토그래피가 AEX 또는 CEX 수지계 정제 공정 방식에 비교된 경우 더 높은 생산 처리량, 완충액 소비의 감소 및 비용 절감으로 이해하는, 더 높은 로딩 용량 및 대류적인 유동 질량 전달을 갖기 때문이다. 게다가, 막 크로마토그래피는 컬럼 크로마토그래피에 비교된 경우 정제 방식에서 더 많은 가요성을 제공하는 일회용 시스템이다.

본 개시내용은 친화성 크로마토그래피 세정 조성물, 그와 같은 조성물을 이용하는 폴리펩타이드 정제 방식, 및 고도의 순도를 갖는, 예를 들어, 그와 같은 조성물 또는 정제 방식의 사용으로 정제된 것으로서 폴리펩타이드 제제를 특색으로 한다. 조성물 및 정제 방식은 하이브리도마- 또는 재조합-발현된 단클론성 항체에 특히 양호하게 맞춤화되지만, 또한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 임의의 재조합으로 발현된 폴리펩타이드의 제조에서 사용될 수 있다.

관심 폴리펩타이드의 발현은, 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자로 형질전환될 수 있는, 임의의 적합한 숙주 세포에서 수행될 수 있다. 숙주 세포는 진핵 또는 원핵일 수 있고, 비제한적으로, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포를 포함한다. 포유류 세포가 바람직하다. 적합한 포유류 세포의 비-제한 예는 항체-발현 하이브리도마 세포, 뿐만 아니라 발현 숙주, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 293 (HEK 293) 세포, 및 쥣과 하이브리도마 NS0 세포를 포함한다. 폴리펩타이드 발현은 세포부터 세포 배양 배지까지 분비될 수 있거나, 또는 세포 이내일 수 있다. 세포 배양은 생물반응기내 (예를 들면, 발효)일 수 있다. 전형적인 생물반응기 세포 배양은, 배양 개시 후 그리고 배양의 완료까지 영양소가 주기적으로 주입되면서, 기초 배지로 개시된다. 이러한 주입은 일반적으로 공급물 배지의 것이고 단백질 발현기 동안 세포 배양을 지속한다. 대개, 공급물 배지 주입은, 농축된 공급물 배지가 세포 배양물 속에 설정 시점에, 보통 1일 1회 빠르게 첨가되면서, 볼러스 주입을 통해 수행된다. 대안적으로 볼러스 공급물에, 생물반응기 세포 배양물은 연장된 또는 연속적 공급물을 사용하여 주입될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 공급물 배지는 생물반응기 영양소 주입에 적합하다.

생물반응기는 적어도 약 250 리터의 용량을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 생물반응기는 적어도 약 500 리터의 용량을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 생물반응기는 적어도 약 2000 리터의 용량을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 생물반응기는 적어도 약 5000 리터, 또는 10,000 리터 또는 15,000 리터의 용량을 가질 수 있다.

발현 이후, 폴리펩타이드를 함유하는 배지 (예를 들면, 세포 배양 배지)는, 예를 들어, 숙주 세포 및 미립자 잔해를 제거하기 위해 정화될 수 있다. 정화는 여과, 원심분리, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 규조토 및 셀룰로스 섬유를 통한 심층 여과는 사용될 수 있다. 임의의 상업적으로 입수가능한 막 필터를 사용하는, 예를 들어 0.2㎛ 필터를 통한 막 여과는 임의의 미생물 오염물질을 제거하기 위해 이용될 수 있다.

발현, 및 이용되면 정화 이후, 관심 폴리펩타이드는 오염 숙주 세포 단백질 (HCP류)를 제거하기 위해 친화성 크로마토그래피를 통해 정제될 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 관심 폴리펩타이드의 정제에 적합한 임의의 친화성 리간드를 포함할 수 있다. 친화성 크로마토그래피 리간드의 비-제한 예는 금속 (예를 들면, Cd⁺², Co⁺², Cu⁺², Ga⁺³, Fe⁺³, Ni⁺², 및 Zn⁺²), 염료 [예를 들면, 시바크론 블루 및 이의 변이체], 글루타티온, 서브틸리신, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L, 보로네이트, 아비딘, 스트렙타비딘, 바이오틴, 항-c-Myc, 항-HA, 뉴클레오타이드, 조효소, 항체, 헤파린, 항원 (특히 공지된 특이성을 가진 항체용), 및 다른 공지된 친화성 리간드를 포함한다. 친화성 리간드는 고형 지지체에 일반적으로 고정되고, 이에 대하여 수많은 공지된 및 흔한 지지체가 있다. 지지체는 바람직하게는 크로마토그래피 컬럼에 팩킹될 수 있는 입자, 예를 들면, 비드를 포함한다.

단백질 A 및/또는 단백질 G가 항체 또는 항체 작제물을 정제시키기 위해 친화성 크로마토그래피 리간드로서 사용되는 경우, 항체 또는 항체 작제물은 Fc 도메인, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 리간드에 결합하는 Fc 도메인의 적어도 그 부분을 포함한다. Fc 도메인 또는 이의 부분은 바람직하게는, 단백질 A 또는 단백질 G에 결합할 수 있는 이의 임의의 하위유형을 포함하는, IgG 아이소타입의 것이다. 단백질 L이 항체 또는 항체 작제물을 정제시키기 위해 친화성 크로마토그래피 리간드로서 사용되는 경우, 항체 또는 항체 작제물은 경 (L) 쇄, 또는 단백질 L 리간드에 결합하는 경쇄의 적어도 그 부분을 포함한다.

폴리펩타이드 제제는 리간드-지지체 상에 로딩되고, 그것에 의하여 관심 단백질은 충분한 친화성으로 리간드와 비-공유적으로 상호작용하여 리간드-지지체에 결합한다. 리간드는 바람직하게는 고 단백질-결합 용량을 갖는다. 예를 들어, 단백질 A 리간드는 바람직하게는 약 10g/ℓ 내지 약 100g/ℓ의 항체 결합 용량을 갖고, 일부 양태에서 약 10g/ℓ 내지 약 60g/ℓ의 항체 결합 용량을 갖고, 일부 양태에서 약 20g/ℓ 내지 약 50g/ℓ의 항체 결합 용량을 갖는다. 지지체는 바람직하게는 폴리펩타이드 제제로 로딩에 앞서 평형화된다. 평형은 바람직하게는 완충액 용액으로 한다.

친화성 크로마토그래피 지지체 상에 폴리펩타이드 제제의 로딩은 리간드에 관심 폴리펩타이드의 흡착을 허용하는데 적합한 온도에서, 용적으로, 그리고 시간 동안 수행된다. 리간드에 흡착하지 않는 원하지 않는 HCP류는 크로마토그래피 동안 지지체를 통해 유동한다.

일부 바람직한 양태에서, 관심 폴리펩타이드는, 단백질 A와 상호작용할 수 있는, 불변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함한다. 따라서, 발현된 항체 제제는 단백질 A를 포함하는 지지체 상에 로딩될 수 있고, 그것에 의하여 항체는 단백질 A 리간드와 상호작용한다. 단백질 A는 약 10g/ℓ 내지 약 100g/ℓ의 항체 결합 용량을 가질 수 있다. 단백질 A 지지체는, 단백질 A 친화성 배지 (MABSELECT SURE®, GE Healthcare Life Sciences, 스웨덴 웁살라 소재), 단백질 A 친화성 배지 (MABSELECT®, GE Healthcare Life Sciences, 스웨덴 웁살라 소재), 단백질 A 친화성 배지 (MABSELECT SURE® LX, GE Healthcare Life Sciences, 스웨덴 웁살라 소재), 단백질 A 수지 (UNOsphere SUPrA™, BioRad, 캘리포니아주 허큘리스 소재), 단백질 A 수지 (ESHMUNO® A, Millipore Sigma, 매사츠세츠주 빌러리카 소재), 단백질 A 수지 (POROS™ MABCAPTURE® A, Life Technologies Corp., 캘리포니아주 칼스배드 소재), 단백질 A 수지 (AMSPHERE^TM A3 support, JSR Life Sciences, 캘리포니아주 써니베일 소재), 단백질 A 수지 (KANEKA KanCap™ A, 일본 오사카 소재), 단백질 A 수지 (PROSEP® Ultra Plus, Millipore Sigma, 매사추세츠주 빌러리카 소재), 실리카계 단백질 A 배지(ABSOLUTE® High Cap, Novasep, Boothwyn, PA)를 포함하며, 상업적으로 입수가능하다. 기술 분야에서 이용가능한 임의의 적합한 단백질 A 지지체가 사용될 수 있다. 단백질 A 지지체로의 항체 제제의 로딩은 단백질 A 리간드에 단클론성 항체의 흡착을 허용하는데 적합한 온도, 용적, 및 시간 동안 수행된다. 단백질 A 리간드에 흡착하지 않는 원하지 않는 HCP류는 크로마토그래피 동안 지지체를 통해 유동한다.

친화성 리간드에 부착하는 또는 관심 폴리펩타이드에 부착하는 HCP류를 추가로 제거하기 위해, 폴리펩타이드-흡착된 지지체는 세정된다. 세정은 염기성 아미노산, 염, 및 비-이온성 계면활성제 또는 음이온성 계면활성제를 포함하는 수성 용액을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 히스티딘, 리신, 또는 글리신이 아르기닌 대신에 사용될 수 있어도, 아미노산은 아르기닌이다. 일부 바람직한 구현예에서, 우레아 또는 구아니딘은 아미노산과 조합하여 또는 그 대신에 (예를 들면, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 또는 글리신과 조합하여 또는 그 대신에) 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 황산나트륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 또는 아세트산나트륨이 염화나트륨 대신에 사용될 수 있어도, 염은 염화나트륨이다. 바람직한 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 비록 NP-40, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴록사머, 트리(n-부틸)포스페이트 (TNBP), 테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMAC), 또는 나트륨 콜레이트가 트리톤® X-100 대신에 사용될 수 있더라도, 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제, 또는 폴리소르베이트 (예를 들면, TWEEN® 브랜드 비-이온성 계면활성제, J.T. 뉴저지주 베어커 소재)이다. 바람직한 구현예에서, 음이온성 계면활성제는, 비-이온성 계면활성제 대신에 사용되는 경우, (카프릴산나트륨으로서 또한 알려진) 옥탄산나트륨이다. 바람직한 세정은 아르기닌, 염화나트륨, 및 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 또 다른 바람직한 세정은 아르기닌, 구아니딘, 염화나트륨, 및 옥탄산나트륨을 포함한다. 또 다른 바람직한 세정은 아르기닌, 염화나트륨, 및 옥탄산나트륨 음이온성 계면활성제를 포함한다. 나트륨 헵탄산, 나트륨 노난산, 나트륨 알킬 설페이트, 나트륨 알킬 설포네이트, 또는 N-라우로일사르코신이, 옥탄산나트륨 대신에 사용될 수 있다. 본 명세서 내내 기재된 및 예시된 바와 같이, 그와 같은 세정 용액은 본 개시내용에 따라 특색으로 된다.

일부 양태에서, 세정 용액은 바람직하게는 물, 아르기닌, 염화나트륨, 및 음이온성 계면활성제로서 옥탄산나트륨을 포함하고, 아르기닌은 바람직하게는 0 mM 초과 및 약 500 mM 미만의 농도이고, 염화나트륨은 바람직하게는 0 mM 초과 및 약 250 mM 미만의 농도이고, 옥탄산나트륨은 바람직하게는 0 mM 초과 및 약 50 mM 미만의 농도이다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 아르기닌, 염화나트륨, 및 옥탄산나트륨을 포함하고, 아르기닌은 0 mM 초과 및 약 400 mM 미만의 농도이고, 염화나트륨은 0 mM 초과 및 약 200 mM 미만의 농도이고, 옥탄산나트륨은 바람직하게는 0 mM 초과 및 약 35 mM 미만의 농도이다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 아르기닌, 염화나트륨, 및 옥탄산나트륨을 포함하고, 아르기닌은 0 mM 초과 및 약 350 mM 미만의 농도이고, 염화나트륨은 0 mM 초과 및 약 200 mM 미만의 농도이고, 옥탄산나트륨은 바람직하게는 0 mM 초과 및 약 30 mM 미만의 농도이다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 아르기닌, 염화나트륨, 및 옥탄산나트륨을 포함하고, 아르기닌은 0 mM 초과 및 약 300 mM 미만의 농도이고, 염화나트륨은 0 mM 초과 및 약 175 mM 이하의 농도이고, 옥탄산나트륨은 바람직하게는 0 mM 초과 및 약 30 mM 이하의 농도이다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 아르기닌, 염화나트륨, 및 옥탄산나트륨을 포함하고, 아르기닌은 0 mM 초과 및 약 300 mM 이하의 농도이고, 염화나트륨은 0 mM 초과 및 약 175 mM 이하의 농도이고, 옥탄산나트륨은 바람직하게는 0 mM 초과 및 약 25 mM 이하의 농도이다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 아르기닌, 염화나트륨, 및 옥탄산나트륨을 포함하고, 아르기닌은 0 mM 초과 및 약 300 mM 이하의 농도이고, 염화나트륨은 0 mM 초과 및 약 150 mM 이하의 농도이고, 옥탄산나트륨은 바람직하게는 0 mM 초과 및 약 25 mM 이하의 농도이다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 아르기닌, 염화나트륨, 및 옥탄산나트륨을 포함하고, 아르기닌은 0 mM 초과 및 약 250 mM 이하의 농도이고, 염화나트륨은 0 mM 초과 및 약 150 mM 이하의 농도이고, 옥탄산나트륨은 바람직하게는 0 mM 초과 및 약 25 mM 이하의 농도이다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 약 100 mM 내지 약 500 mM의 아르기닌, 약 50 mM 내지 약 250 mM의 염화나트륨, 및 약 10 mM 내지 약 50 mM 옥탄산나트륨을 포함한다. 세정 용액은 약 100 mM 내지 약 400 mM의 아르기닌, 약 50 mM 내지 약 300 mM의 염화나트륨, 및 약 10 mM 내지 약 40 mM 옥탄산나트륨을 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 150 mM 내지 약 350 mM의 아르기닌, 약 100 mM 내지 약 300 mM의 염화나트륨, 및 약 15 mM 내지 약 35 mM 옥탄산나트륨을 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 200 mM 내지 약 300 mM의 아르기닌, 약 200 mM 내지 약 300 mM의 염화나트륨, 및 약 15 mM 내지 약 35 mM 옥탄산나트륨을 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 250 mM 내지 약 300 mM의 아르기닌, 약 125 mM 내지 약 175 mM의 염화나트륨, 및 약 20 mM 내지 약 30 mM 옥탄산나트륨을 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 250 mM 내지 약 300 mM의 아르기닌, 약 150 mM 내지 약 200 mM의 염화나트륨, 및 약 25 mM 내지 약 30 mM 옥탄산나트륨을 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 200 mM 내지 약 250 mM의 아르기닌, 약 100 mM 내지 약 150 mM의 염화나트륨, 및 약 20 mM 내지 약 25 mM 옥탄산나트륨을 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 200 mM 내지 약 250 mM의 아르기닌, 약 100 mM 내지 약 150 mM의 염화나트륨, 및 약 25 mM 내지 약 30 mM 옥탄산나트륨을 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 225 mM 내지 약 275 mM의 아르기닌, 약 125 mM 내지 약 175 mM의 염화나트륨, 및 약 20 mM 내지 약 30 mM 옥탄산나트륨을 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 240 mM 내지 약 260 mM의 아르기닌, 약 140 mM 내지 약 160 mM의 염화나트륨, 및 약 22 mM 내지 약 28 mM 옥탄산나트륨을 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 245 mM 내지 약 255 mM의 아르기닌, 약 145 mM 내지 약 155 mM의 염화나트륨, 및 약 24 mM 내지 약 26 mM 옥탄산나트륨을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 250 mM의 아르기닌, 약 150 mM의 염화나트륨, 및 약 25 mM 옥탄산나트륨을 포함한다.

또 다른 양태에서, 세정 용액은 물, 아르기닌, 및 구아니딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 음이온성 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 염화나트륨을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 음이온성 계면활성제 및 염화나트륨을 추가로 포함한다. 음이온성 계면활성제는 옥탄산나트륨일 수 있다. 옥탄산나트륨 대신에, 나트륨 헵탄산, 나트륨 노난산, 나트륨 알킬설페이트, 나트륨 알킬 설포네이트, 또는 N-라우로일사르코신을 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 0 mM 초과 및 약 200 mM 미만 아르기닌, 0 mM 초과 및 약 300 mM 미만 구아니딘, 0 mM 초과 및 약 250 mM 미만 염화나트륨, 및 0 mM 초과 및 약 50 mM 미만의 음이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 50 mM 내지 약 150 mM 아르기닌, 약 75 mM 내지 약 125 mM 아르기닌, 약 85 mM 내지 약 115 mM 아르기닌, 약 90 mM 내지 약 110 mM 아르기닌, 약 95 mM 내지 약 105 mM 아르기닌, 또는 약 98 mM 내지 약 102 mM 아르기닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 100 mM 아르기닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 50 mM 구아니딘 내지 약 200 mM 구아니딘, 약 100 mM 구아니딘 내지 약 200 mM 구아니딘, 약 150 mM 구아니딘 내지 약 200 mM 구아니딘, 약 100 mM 구아니딘 내지 약 150 mM 구아니딘, 약 125 mM 구아니딘 내지 약 175 mM 구아니딘, 약 135 mM 구아니딘 내지 약 165 mM 구아니딘, 또는 약 145 mM 구아니딘 내지 약 155 mM 구아니딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 150 mM 구아니딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 100 mM 아르기닌 및 약 150 mM 구아니딘을 포함한다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 약 10 mM 내지 약 40 mM의 음이온성 계면활성제, 약 20 mM 내지 약 30 mM의 음이온성 계면활성제, 약 22.5 mM 내지 약 27.5 mM의 음이온성 계면활성제, 약 22 mM 내지 약 28 mM의 음이온성 계면활성제, 또는 약 23 mM 내지 약 29 mM의 음이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 25 mM의 음이온성 계면활성제를 포함한다. 음이온성 계면활성제는 바람직하게는 옥탄산나트륨이다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 100 mM 아르기닌, 약 150 mM 구아니딘, 및 바람직하게는 옥탄산나트륨인 약 25 mM의 음이온성 계면활성제를 포함하고, 약 7.5의 pH를 갖는다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 약 50 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 약 150 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨, 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 150 mM 염화나트륨, 약 125 mM 염화나트륨 내지 약 175 mM 염화나트륨, 약 135 mM 염화나트륨 내지 약 165 mM 염화나트륨, 또는 약 145 mM 염화나트륨 내지 약 155 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 약 150 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 100 mM 아르기닌, 약 150 mM 구아니딘, 바람직하게는 옥탄산나트륨인 약 25 mM의 음이온성 계면활성제, 및 약 150 mM 염화나트륨을 포함하고, 약 7.5의 pH를 갖는다.

또 다른 양태에서, 세정 용액은 물, 선택적으로 구아니딘과 조합한 염기성 아미노산, 염 및 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 더 바람직하게는, 세정 용액은 아르기닌, 염화나트륨, 및 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함하고, 아르기닌은 바람직하게는 0 mM 초과 및 약 500 mM 미만의 농도이고, 염화나트륨은 바람직하게는 0 mM 초과 및 약 250 mM 미만의 농도이고, 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제는 바람직하게는 0 부피% 초과 및 약 0.25 부피% 미만의 농도이다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 아르기닌, 염화나트륨, 및 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함하고, 아르기닌은 0 mM 초과 및 약 400 mM 미만의 농도이고, 염화나트륨은 0 mM 초과 및 약 200 mM 미만의 농도이고, 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제는 0 부피% 초과 및 약 0.25 부피% 미만의 농도이다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 아르기닌, 염화나트륨, 및 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함하고, 아르기닌은 0 mM 초과 및 약 350 mM 미만의 농도이고, 염화나트륨은 0 mM 초과 및 약 150 mM 미만의 농도이고, 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제는 약 0.2 부피% 미만의 농도이다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 아르기닌, 염화나트륨, 및 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함하고, 아르기닌은 0 mM 초과 및 약 300 mM 이하의 농도이고, 염화나트륨은 0 mM 초과 및 약 100 mM 이하의 농도이고, 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제는 약 0.15 부피% 이하의 농도이다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 아르기닌, 염화나트륨, 및 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함하고, 아르기닌은 0 mM 초과 및 약 300 mM 이하의 농도이고, 염화나트륨은 0 mM 초과 및 약 200 mM 이하의 농도이고, 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제는 약 0.11 부피% 이하의 농도이다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 아르기닌, 염화나트륨, 및 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함하고, 아르기닌은 0 mM 초과 및 약 300 mM 이하의 농도이고, 염화나트륨은 0 mM 초과 및 약 150 mM 이하의 농도이고, 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제는 약 0.1 부피% 이하의 농도이다. 일부 구현예에서, 세정 용액은 아르기닌, 염화나트륨, 및 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함하고, 아르기닌은 0 mM 초과 및 약 250 mM 이하의 농도이고, 염화나트륨은 0 mM 초과 및 약 150 mM 이하의 농도이고, 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제는 약 0.1 부피% 이하의 농도이다.

일부 구현예에서, 세정 용액은 약 100 mM 내지 약 500 mM의 아르기닌, 약 50 mM 내지 약 250 mM의 염화나트륨, 및 약 0.01% 내지 약 0.25% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 세정 용액은 약 100 mM 내지 약 400 mM의 아르기닌, 약 50 mM 내지 약 200 mM의 염화나트륨, 및 약 0.01% 내지 약 0.2% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 150 mM 내지 약 350 mM의 아르기닌, 약 50 mM 내지 약 200 mM의 염화나트륨, 및 약 0.01% 내지 약 0.2% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 100 mM 내지 약 300 mM의 아르기닌, 약 100 mM 내지 약 200 mM의 염화나트륨, 및 약 0.05% 내지 약 0.15% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 200 mM 내지 약 300 mM의 아르기닌, 약 100 mM 내지 약 200 mM의 염화나트륨, 및 약 0.05% 내지 약 0.15% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 250 mM 내지 약 300 mM의 아르기닌, 약 100 mM 내지 약 150 mM의 염화나트륨, 및 약 0.05% 내지 약 0.15% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 300 mM 내지 약 350 mM의 아르기닌, 약 100 mM 내지 약 150 mM의 염화나트륨, 및 약 0.1% 내지 약 0.2% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 250 mM 내지 약 350 mM의 아르기닌, 약 75 mM 내지 약 125 mM의 염화나트륨, 및 약 0.1% 내지 약 0.2% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 275 mM 내지 약 325 mM의 아르기닌, 약 90 mM 내지 약 110 mM의 염화나트륨, 및 약 0.1% 내지 약 0.2% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 290 mM 내지 약 310 mM의 아르기닌, 약 95 mM 내지 약 105 mM의 염화나트륨, 및 약 0.13% 내지 약 0.17% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 295 mM 내지 약 305 mM의 아르기닌, 약 97 mM 내지 약 103 mM의 염화나트륨, 및 약 0.14% 내지 약 0.16% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 298 mM 내지 약 302 mM의 아르기닌, 약 98 mM 내지 약 102 mM의 염화나트륨, 및 약 0.14% 내지 약 0.16% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 세정 용액은 약 299 mM 내지 약 301 mM의 아르기닌, 약 99 mM 내지 약 101 mM의 염화나트륨, 및 약 0.14% 내지 약 0.16% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.

일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 300 mM의 아르기닌, 약 100 mM의 염화나트륨, 및 약 0.15% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 200 mM의 아르기닌, 약 150 mM의 염화나트륨, 및 약 0.15% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 250 mM의 아르기닌, 약 100 mM의 염화나트륨, 및 약 0.05% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 300 mM의 아르기닌, 약 150 mM의 염화나트륨, 및 약 0.05% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 300 mM의 아르기닌, 약 200 mM의 염화나트륨, 및 약 0.1% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 250 mM의 아르기닌, 약 150 mM의 염화나트륨, 및 약 0.1% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 200 mM의 아르기닌, 약 100 mM의 염화나트륨, 및 약 0.1% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 250 mM의 아르기닌, 약 200 mM의 염화나트륨, 및 약 0.15% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 용액은 약 200 mM의 아르기닌, 약 200 mM의 염화나트륨, 및 약 0.05% (w/v)의 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제를 포함한다.

세정의 전도도 표적은 약 15 mS/cm 내지 약 45 mS/cm의 범위일 수 있다. 세정의 전도도 표적은 약 16 mS/cm 내지 약 42 mS/cm, 또는 약 17 mS/cm 내지 약 40 mS/cm, 또는 약 18 mS/cm 내지 약 38 mS/cm의 범위일 수 있다. 전도도 표적은, 전도도 미터를 포함하여, 임의의 적합한 기술에 따라 측정될 수 있다.

한 구현예에서, 세정 용액은 구아니딘, 아르기닌 및 NP40을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 구아니딘, 아르기닌 및 PS20을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 구아니딘, 아르기닌 및 카프릴산 (CA)를 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 트리부틸 포스페이트 및 아르기닌을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 트리부틸 포스페이트, 아르기닌, 및 염, 예컨대 NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 트리톤® X-100 및 아르기닌을 포함한다. 선택적으로, 세정 용액은 또한 염, 예컨대 NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 200mM 아르기닌, 0.05% 트리부틸 Pi, 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 250 mM 아르기닌, 25 mM CA, 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 100mM 아르기닌, 150 mM 구아니딘, 25 mM CA, 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 100 mM 아르기닌, 150 mM 구아니딘, 25 mM CA, 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 250mM 아르기닌 + 0.1% w/v 트리톤® X-100 (또는 +0.05% w/v 트리부틸 포스페이트)를 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 50-100mM 아르기닌 + 100-250mM 구아니딘 + 25mM CA를, 바람직하게는 >50mM 아르기닌과, 그리고 > 100mM 구아니딘과 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 0.15% w/v 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제, 300 mM 아르기닌 및 100 mM NaCl을 포함한다

한 구현예에서, 세정 용액은 0.05%-0.15% w/v 트리톤® X-100, 200-300mM 아르기닌 및 100-200 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 100mM 아르기닌, 150mM 구아니딘, 25mM CA, 150mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 200mM 아르기닌, 0.05% w/v 트리부틸, 150mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 250 mM 아르기닌, 150 mM NaCl, 0.1% w/v 트리톤을 포함한다

한 구현예에서, 세정 용액은 350mM 구아니딘 + 0.05% w/v 트리부틸을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 0.1% w/v 트리톤® X-100, 250mM 아르기닌, 150 mM NaCl을 포함한다

한 구현예에서, 세정 용액은 25 mM 카프릴산, 100 mM 아르기닌, 150mM 구아니딘 및 150mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 25 mM CA, 250 mM 아르기닌, 및 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 25 mM 카프릴산, 350 mM 구아니딘 및 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 25 mM 카프릴산, 100 mM 아르기닌, 100mM 구아니딘 및 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 25 mM 카프릴산, 100 mM 아르기닌, 250mM 구아니딘 및 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 25 mM 카프릴산, 50 mM 아르기닌, 100mM 구아니딘 및 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 25 mM 카프릴산, 50 mM 아르기닌, 250mM 구아니딘 및 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 0.05% w/v 트리부틸 포스페이트, 250 mM 아르기닌 및 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 0.05% w/v 트리부틸 포스페이트, 350 mM 아르기닌 및 150 mM NaCl을 포함한다.

일 구현예에서, 세정 용액은 0.05% w/v 트리부틸 포스페이트, 200 mM 아르기닌 및 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 350 mM 구아니딘 및 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 0.05% w/v 트리톤® X-100, 200 mM 아르기닌 및 200 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 0.15% w/v 트리톤® X-100, 250 mM 아르기닌 및 200 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 0.1% w/v 트리톤® X-100, 200 mM 아르기닌 및 100 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 0.1% w/v 트리톤® X-100, 250 mM 아르기닌 및 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 0.1% w/v 트리톤® X-100, 300 mM 아르기닌 및 200 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 0.05% w/v 트리톤® X-100, 300 mM 아르기닌 및 150 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 0.05% w/v 트리톤® X-100, 250 mM 아르기닌 및 100 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 0.15% w/v 트리톤® X-100, 300 mM 아르기닌 및 100 mM NaCl을 포함한다.

한 구현예에서, 세정 용액은 0.15% w/v 트리톤® X-100, 200 mM 아르기닌 및 150 mM NaCl을 포함한다.

본 명세서에서 기재된 및 예시된 세정 용액은, HCP를 포함하는, 오염물질의 제거를 위해 친화성 크로마토그래피 컬럼을 세정하는데 사용된다. 세정 이후, 관심 폴리펩타이드는 친화성 리간드로부터 용출된다. 용출 완충액은 친화성 리간드의 유형에 일반적으로 맞추어지고, 따라서, 다양할 수 있다. 용출은 관심 단백질의 최대 용출 수율을 허용하는데 적합한 온도 및 용적, 그리고 시간 동안 수행될 수 있다. 폴리펩타이드의 용출은 폴리펩타이드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 용출물을 생산한다. 폴리펩타이드가 불변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함하고 친화성 리간드가 단백질 A인 양태에서, 용출 완충액은 바람직하게는 산성이다. 항체 또는 항체 작제물의 용출은 항체 또는 항체 작제물을 포함하는 친화성 크로마토그래피 용출물을 생산한다.

한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다: (i) 관심의 펩타이드 (예를 들면 항체) 및 불순물 (예를 들면 HCP)를 함유하는 혼합물을 단백질 A 크로마토그래피 컬럼상에 로딩시키는 단계; (ⅱ) 컬럼을 본 발명의 세정 용액으로 세정시켜 혼합물에서 HCP의 수준을 감소시키고 항체의 순도를 증가 (예컨대 정제된 항체를 창출)시키는 단계 및 (ⅲ) 용출 완충액을 컬럼에 적용시켜 크로마토그래피 용출물을 방출시키는 단계. 친화성 크로마토그래피 용출물은 단계 (i)에서 단백질 A 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩된 혼합물에 비교할 때 감소된 수준의 HCP과 정제된 항체의 혼합물을 포함한다.

항체 또는 항체 작제물을 포함하는 용출물을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 용출물은, 실질적으로 감소된 수준의 숙주 세포 단백질 (HCP)을 포함하고, 이러한 단백질은 친화성 크로마토그래피 동안 그와 같은 세정 용액을 통해 폴리펩타이드의 제제로부터 제거되었다. 항체 또는 항체 작제물을 포함하는 용출물을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 용출물은, 바람직하게는 약 1000 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 백만분율 (ppm)로 HCP 값은, 또한 생성물의 mg당 HCP의 ng으로도 표현될 수 있다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 용출물은 약 900 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 용출물은 약 800 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 용출물은 약 700 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 용출물은 약 600 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 용출물은 약 500 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 용출물은 약 400 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 용출물은 약 350 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 용출물은 약 300 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 용출물은 약 250 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 용출물은 약 200 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 용출물은 약 150 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 용출물은 약 100 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 숙주 세포 단백질의 양은 (예를 들면, ppm으로), ELISA 예컨대 정량적 숙주 세포 단백질 ELISA를 포함하는, 임의의 적합한 검정에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, HCP의 ppm은 ELISA 검정에 의해 측정된 바와 같다. 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법 (LC-MS)는 또한 HCP를 측정할, 뿐만 아니라 특성화하는데 사용될 수 있다. HCP ELISA 키트는 상업적으로 입수가능하고 (예를 들면, CHO HCP ELISA 키트 (Cygnus Technologies, Southport, NC 28461, USA, cat# F550)), 그와 같은 임의의 키트는 HCP 함량 측정에 적합하다.

본 발명의 친화성 크로마토그래피 세정 용액은, HCP 함량을 감소시킬 뿐만 아니라, 관심 단백질을 함유하는 조성물에서 바이러스의 수준을 감소시키거나 또는 바이러스를 불활성화시키는데 사용될 수 있다. 전형적인 선행기술 정제 공정은 음이온 교환 및 이어서 추가로 산성화 처리를 사용하여, 단백질 (예를 들면 항체) 정제 방법 동안 바이러스의 수준을 감소시키거나 바이러스를 불활성화시킨다. 놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명의 친화성 크로마토그래피 세정 용액의 사용이 음이온 교환 크로마토그래피의 단계를 생략하기에 충분할만큼 바이러스의 수준을 감소시킨다는 것을 알아내었다.

(예를 들면, 폴리펩타이드를 포함하거나, 또는 항체 또는 항체 작제물을 포함하는) 친화성 크로마토그래피 용출물은 용출물에 존재하는 임의의 잔존 바이러스를 불활성화시키기 위해 양이온 교환 방법 및/또는 처리로 추가 가공될 수 있다. 바이러스 불활성화는 용출물에 존재하는 임의의 바이러스를 불활성화시키는데 충분한 온도 및 일정한 기간 동안, 용출물 산성화를 포함할 수 있다. 산성화는, 예를 들어, 원하는 pH가 달성되는 때까지 용출물에 아세트산, 시트르산, 염산, 포름산, 또는 이들의 조합의 첨가를 포함할 수 있다. 낮은 pH 바이러스 불활성화 후, 용출물은 (공정 필요에 따라) pH 5.0 내지 7.5로 중화될 수 있다. 중화 단계 동안, 탁도는 불순물 (또는 생성물)의 침전으로 인해 생성물 풀에서 나타날 수 있다. 심층 여과는 탁도 뿐만 아니라 불순물을 제거하기 위해 pH-조정된 제제를 여과하는데 사용될 수 있다.

바이러스 불활성화 이후, 또는 바이러스 불활성화가 포함되지 않는 경우 친화성 크로마토그래피로부터 용출 이후, 또는 포함되는 경우 양이온 교환 단계 이후, 관심 폴리펩타이드는 막 크로마토그래피로 추가 정제될 수 있다. 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있는 정제된 관심 폴리펩타이드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 용출물은, 전형적으로 pH 조정되고 막 크로마토그래피 지지체에 로딩되고 막을 통과하여 유동하게 되고, 이에 의해 잔여 숙주 세포 단백질 오염물질은 막에 결합하고 관심 단백질은 통과액에서 남아있다. (여전히 정제된 관심 폴리펩타이드를 함유하는 친화성 크로마토그래피 용출물인) 막 크로마토그래피 통과액은, 관심 폴리펩타이드를 포함하고 크로마토그래피 막에 로딩되기 전 친화성 크로마토그래피 용출물에서보다 숙주 세포 단백질이 더 적었다. 막 크로마토그래피 지지체는 음이온 교환 막, 예컨대 SARTOBIND® Q (Sartorius AG, 독일 괴팅엔 소재), MUSTANG® Q (Pall Corp., 매사추세츠주 웨스트버러 소재), NATRIX® HDQ (Natrix, Burlington, 캐나다 온타리오 소재), 또는 염-용인 다중-모듈 음이온-교환 막, 예컨대 SARTOBIND® STIC 막 (Sartorius AG, 독일 괴팅엔 소재), 또는 CHROMASORB 막 (Millipore Sigma, 매사츠세츠주 빌러리카 소재)를 포함할 수 있다. 따라서, 막 크로마토그래피는 음이온성 교환 막 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 막 크로마토그래피 단계는 전형적으로 잔여 불순물의 약 50% 내지 약 99% 이상을 제거할 수 있다.

친화성 크로마토그래피 용출물은, 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있는 정제된 관심 폴리펩타이드를 함유한다. 상기에서 나타낸 바와 같이, 친화성 크로마토그래피 용출물은 임의의 잔존하는 바이러스를 불활성화시키기 위해 추가 가공될 수 있고, 및/또는 제2 크로마토그래피 단계, 예컨대 막 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 추가 정제될 수 있다. 임의의 경우에서, 친화성 크로마토그래피 용출물이 바이러스 불활성화를 위하여 처리되거나 추가 정제되든, 항체 또는 항체 작제물을 포함하는 관심 폴리펩타이드의 수득한 조성물은, 예를 들어, 비-인간 동물 또는 인간에 대한 치료적 투여에 적합한 형태로 추가 가공될 수 있다. 그와 같은 추가 가공은 관심의 폴리펩타이드의 정제된 제제의 한외여과, 나노여과, 농축, 및 투석여과의 임의의 조합을 포함할 수 있다 (도 7).

한외여과(ultrafiltration)는 관심 폴리펩타이드의 제제의 농축 공정이다. 단백질은 막 기공 크기 또는 분자량 컷오프에 기반하여 용액내 다른 분자로부터 여과된다. 투석여과(diafiltration)는 원하는 완충액으로 (예를 들면, 용출 완충액으로부터 안정한 제형 완충액으로) 관심 폴리펩타이드를 교환하는데 사용된다. 한외여과 및 투석여과는 전형적으로 접선 유동 여과를 이용한다.

본 발명의 친화성 크로마토그래피 세정 완충액의 사용을 포함하고, 그리고 방식이 선택적으로 하나 이상의 제2 크로마토그래피 정제 단계를 (예를 들면, 막 크로마토그래피 및/또는 양이온 교환 임의의 순서로) 추가로 포함하고, 그리고 방식이 선택적으로 추가로 바이러스 불활성화, 나노여과, 한외여과, 및/또는 투석여과를 포함하는 정제 방식 이후, 관심 폴리펩타이드는 바람직하게는 조성물에 존재한다. 조성물은 바람직하게는 담체 및 관심 폴리펩타이드를 포함한다. 담체는 바람직하게는 수성이고, 약제학적으로 허용가능한 담체일 수 있다. 담체는 완충액을 포함할 수 있고, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 조성물은 약제학적 조성물로서 지칭될 수 있다. 용어 "조성물" 및 "정제된 조성물"은 본 명세서에서 교환가능하게 사용된다.

항체 또는 항체 작제물을 포함하는, 관심 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 바람직하게는 약 1000 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 조성물은 바람직하게는 약 900 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 800 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 700 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 600 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 500 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 450 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 400 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 350 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 300 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 200 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 250 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 150 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 또는 약 100 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 숙주 세포 단백질의 양은 (예를 들면, ppm으로), ELISA, 예컨대 정량적 숙주 세포 단백질 ELISA를 포함하는 임의의 적합한 검정에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, HCP의 ppm은 ELISA 검정에 의해 측정된 바와 같다.

일부 양태에서, 조성물에서 관심 폴리펩타이드는 항체 또는 항체 작제물이다. 항체 또는 항체 작제물은 형질 전환된 숙주 세포 (예를 들면, 항체 또는 항체 작제물을 암호화하는 유전자를 포함하는 숙주 세포)에 의해 재조합 발현되었을 수 있거나, 하이브리도마 세포를 통해 발현되었을 수 있다. 항체 또는 항체 작제물은 TNF-유사 리간드 1A (TL1a) 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체 또는 항체 작제물은 칼시토닌 유전자-관련된 펩타이드 (CGRP) 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체 또는 항체 작제물은 CD38 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.

일부 양태에서, 조성물은 CGRP에 특이적으로 결합하는 정제된 항체 또는 항체 작제물을 포함하고, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 CGRP에 특이적으로 결합한다. 조성물은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 VH를 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 CGRP에 특이적으로 결합한다. 조성물은 을 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 CGRP에 특이적으로 결합한다. 항체는 하기에서 기재된 임의의 항체일 수 있다: 미국공개번호 2009/0220489 또는 PCT 공개번호 WO 2007/054809.

일부 양태에서, 조성물은 TL1a에 특이적으로 결합하는 정제된 항체 또는 항체 작제물을 포함하고, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 항체는 하기에서 기재된 임의의 항체일 수 있다: 미국공개번호 2014/0255302 (본 명세서에서 참고로 편입됨). 항체는 하기에서 기재된 임의의 항체일 수 있다: 미국가출원. 번호 62/220,442.

일부 양태에서, 조성물은 CD38에 특이적으로 결합하는 정제된 항체 또는 항체 작제물을 포함하고, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 항-CD38 항체는 추가로 제2 폴리펩타이드 분자, 예를 들어, 폴리펩타이드 독소에 융합될 수 있거나, 또는 인터페론 폴리펩타이드, 예컨대 인터페론 알파에 융합될 수 있다. 중쇄 가변 영역 (VH)는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: . 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 조성물은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL를 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 CD38에 특이적으로 결합한다. 조성물은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 VH를 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 CD38에 특이적으로 결합한다. 조성물은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 CD38에 특이적으로 결합한다. 항체는 하기에서 기재된 임의의 항체일 수 있다: 미국공개번호 2016/0068612 또는 미국공개번호 2015/0313965 (이들 각각은 본 명세서에서 참고로 편입됨, 이들 공보에서 기재된 바와 같이 약화된 인터페론 분자에 추가로 융합되는 항체를 포함함).

일부 양태에서, 조성물은 TL1a에 특이적으로 결합하는 정제된 항체 또는 항체 작제물을 포함하고, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. VH는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VH는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VL은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, VH는 서열번호 5를 포함하고 VL은 서열번호 7을 포함할 수 있거나, 또는 VH는 서열번호 6을 포함하고 VL은 서열번호 7을 포함할 수 있다. 조성물은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 TL1a에 특이적으로 결합한다. 조성물은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 VH를 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 TL1a에 특이적으로 결합한다. 조성물은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 항체 작제물을 포함할 수 있고, 상기 항체 또는 항체 작제물은 TL1a에 특이적으로 결합한다. 항체는 하기에서 기재된 임의의 항체일 수 있다: 미국출원번호 15/267,213 또는 미국공개번호 2014/0255302 (이들 각각은 본 명세서에서 참고로 편입됨).

일부 바람직한 양태에서, 항체 (예를 들면, 항-TL1a, 항-CGRP, 및 항-CD38)은 인간 IgG 불변 영역을 포함한다. 인간 IgG 불변 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 불변 영역일 수 있다. 항체 (예를 들면, 항-TL1a, 항-CGRP, 및 항-CD38)은 인간화된 항체 또는 완전한 인간 항체일 수 있다.

본 명세서에서 기재된 바와 같이 아르기닌-, 염화나트륨-, 및 비-이온성 또는 음이온성 계면활성제-함유 세정 완충액에 의한 세정을 포함하는 적어도 친화성 크로마토그래피를 포함하는 정제 방식에 따라 생산되고, 그리고 상기 방식이 선택적으로 제2 크로마토그래피 정제 단계 (예를 들면, AEX, AEX/HIC, CEX, 또는 막 크로마토그래피), 바이러스 불활성화, 나노여과, 농도, 및 투석여과 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 항체 또는 항체 작제물을 포함하는 관심 단백질의 숙주 세포 단백질-감소된 제제도 또한 제공된다. 그와 같은 숙주 세포 단백질-감소된 제제는 약 900 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 800 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 700 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 600 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 500 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 450 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 400 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 350 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 300 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 200 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 250 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 약 150 ppm 미만의 숙주 세포 단백질, 또는 약 100 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 숙주 세포 단백질의 양(예를 들면, ppm)은, ELISA, 예컨대 정량적 숙주 세포 단백질 ELISA를 포함하는 임의의 적합한 검정에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, HCP의 ppm은 ELISA 검정에 의해 측정된 바와 같다.

본 개시내용의 구현예는, 본 개시내용의 세정 용액의 상세한 제조 그리고 관심 단백질의 정제를 위한 본 개시내용의 세정 용액의 사용 방법을 기재하는, 하기 비-제한 실시예를 참고로 추가로 정의될 수 있다. 양쪽 물질 및 방법에 대한 많은 변형이 본 개시내용의 범위에서 벗어나지 않고 실시될 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이다.

실시예

본 명세서에서 기재된 실시예 및 구현예가 단지 설명하기 위한 것이고 이러한 점에서 다양한 변형 또는 변화가 당해 분야의 숙련가에 제안될 것이고 본원의 사상 및 범위 이내 포함되는 것이 이해된다.

실시예 1

물질 및 방법

물질 및 설비. 이들 실시예에서 사용된 단클론성 항체는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 사용하여 인하우스 발현되었다. MABSELECT SURE® 단백질 A 수지는 GE Healthcare 사(스웨덴 웁살라 소재)로부터 구매되었다. 모든 완충액 용액은 Millipore 물 정제 시스템으로부터 수득된 초순수를 사용하여 제조되었다. 완충액 및 용액 제조에 사용된 화학물질은 JT Baker 사(뉴저지주, 필스버그 소재)로부터 수득되었다. 고처리량 크로마토그래피 실험은 Tecan Freedom EVO® 200 액체 취급 시스템 (Tecan Group AG, 스위스 마네돌프 소재)으로 수행하였다. 이러한 기기는 병행 연구될 최대 96개 크로마토그래피를 허용하는 빌트-인 수지 플레이트 및 Atoll 컬럼 스테이션을 갖는다. FREEDOM EVOWARE® 소프트웨어 (Tecan Group AG, 스위스 마네돌프 소재)는 시스템 제어 및 샘플 수집에 사용되었다. 고처리량 연구부터 선택된 세정 용액은 Akta Avant 액체 크로마토그래피 시스템 (GE Healthcare Life Sciences, 스웨덴 웁살라 소재)을 사용하여 추가로 검증되었다. 이러한 기기는 1회 실시당 연구될 1회 세정 조건을 허용하는 컬럼의 유출구를 모니터링하기 위해 빌트-인 UV 및 전도도 검출기를 갖는다.

단백질 A 크로마토그래피. MABSELECT SURE® 크로마토그래피 컬럼은 5 C.V (컬럼 용적)에 대하여 1XPBS로 평형화되었다. 평형화한 후, 수확된 세포 배양액 (HCCF)는 1 리터의 수지당 40 그램의 mAb의 로딩 용량으로 컬럼에 로딩되었다. 로딩 적용 이후, 컬럼은 먼저 3 컬럼 용적 (CV) 1X PBS 완충액으로 세정된 후, 5 CV의 후보 세정 완충액으로 제2 세정되었다. 컬럼은 이후 5 CV의 5 mM 석신산 pH 5.8 완충액을 사용하여 제3 세정되었다. mAb는 5 CV의 25 mM 글리신, 10 mM 석신산, pH 3. 7 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용출되었다. 원위치 세척(cleaning in place)은 생산 후 적용되었다.

정량적 ELISA―숙주 세포 단백질 (HCP). 숙주 세포 단백질 (HCP)는, 제조자의 프로토콜에 따라, CHO 숙주 세포 단백질 3세대 키트 (CHO 숙주 세포 단백질 측정용 면역효소 검정, Catalog # F550, Cygnus Technologies, 노스캐롤라이나주 사우스포트 소재)에 의해 결정되었다. 450/650 nm에서 흡광도 데이터는 SPECTRAMAX® 플러스 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, 캘리포니아주 써니베일 소재)에서 획득되었고, SOFTMAX® Pro 6.4.2 소프트웨어 (Molecular Devices, 캘리포니아주 써니베일 소재)로 분석되었다. HCP 값은 CHO 숙주 세포 단백질 3세대 키트에서 포함된 표준으로부터 생성된 표준 곡선의 4개 파라미터 로지스틱 맞춤화로부터 계산되었다.

실시예 2

플레이트 기반 연구로부터 실험적 결과

총 28개의 단일 성분 조건은 MabSelect SuRe 수지 플레이트에서 TL1a 항체를 사용하여 HCP 제거에 대하여 연구되었다. 결과는 도 1에서 제시되고, 아래와 같이 요약될 수 있다.

- 옥탄산나트륨 (CA) 및 계면활성제와 비교하여, 아미노산 및 테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMAC)는 HCP 제거에서 더 효과적이다.

- 증가된 농도의 아미노산 또는 TMAC에 의한 HCP 제거 증가의 추세가 있고; 시험된 농도 범위에서 CA에 대해서도 동일하다.

- 아르기닌 및 구아니딘은 시험된 모든 화학물질 중에서 가장 효과적이었다.

이중 성분 HCP 제거 결과는 도 2에서 제시된다. 이중 성분 실험에서, 아르기닌, 구아니딘, 히스티딘, TMAC 또는 글리신을 포함하는 계면활성제 및 충전된 부형제는, HCP 제거의 유효성을 평가하기 위해 조합되었다. 결과는 아래와 같이 요약될 수 있다.

- 저농도의 충전된 부형제 (50 mM 아르기닌 또는 50 mM 구아니딘 또는 100 mM 히스티딘 중 어느 하나)에 25 mM CA를 첨가하는 것은, 0.05% w/v NP 40 또는 0.05% w/v PS 20 첨가와 비교하여 HCP 제거를 상당히 향상시킬 수 있다.

- 아르기닌 또는 구아니딘 농도가 175 mM 초과인 경우, 특히 아르기닌이 175 mM 내지 300 mM의 범위에서 시험되는 경우, 그리고 구아니딘이 175 mM 내지 1 M의 범위에서 시험되는 경우, 500ppm 미만으로 HCP 제거는 시험된 모든 이중 성분 조합에 대하여 달성된다.

3-성분 스크린에서, 아르기닌, 구아니딘 및 계면활성제의 조합된 효과가 시험되었고, HCP 제거 결과는 도 3에서 제시된다. 결과는 아래와 같이 요약될 수 있다.

- 각각 <100 mM의 저농도의 구아니딘 및 아르기닌은, 계면활성제와 조합하여, HCP 제거를 < 500 ppm까지 달성할 수 있다.

- 저농도의 아르기닌 및 구아니딘 조합 (각각 <100 mM의 아르기닌 및 구아니딘 )에 25 mM CA를 첨가하는 것은, 0.05% w/v NP 40 또는 0.05% w/v PS 20 첨가와 비교하여 HCP 제거를 개선시킨다.

- 조합된 구아니딘 및 아르기닌 농도가 > 175 mM인 경우, HCP 제거는 일관되게 < 500 ppm이다.

실시예 3

Atoll 컬럼으로부터 실험적 결과

14개의 세정 용액은 MABSELECT SURE® 크로마토그래피 (GE Healthcare Life Sciences, 스웨덴 웁살라 소재)에서 항-Tl1a (mAb)에 대한 이의 HCP 제거에 대하여 조사되었다. 용출 풀에서 HCP 수준은 도 4에서 도시된다. 결과는 아래와 같이 요약될 수 있다.

- 세정 용액을 함유하는 7개의 비-아르기닌 또는 비-구아니딘은 10,000ppm 초과의 HCP 수준을 가졌다.

- 250 mM 아르기닌 단독을 사용하는 경우, HCP 제거는 약 400-500 ppm이고; 0.05% w/v 트리부틸 포스페이트 및 150mM NaCl이 도입되는 경우, 아르기닌 농도는 200 mM까지 감소되고, HCP 제거를 300-400 ppm까지 향상시킬 수 있다. 이러한 전략은 아르기닌이 비싸기 때문에, 비용 이점을 갖는다.

- 0.1% w/v 트리톤® X-100이 250 mM 아르기닌 및 150 mM NaCl과 조합되는 경우, HCP는 200-300 ppm까지 감소된다.

- 150 mM NaCl과 구아니딘의 적용으로, HCP 제거는 500-600 ppm까지 감소될 수 있다.

- 250 mM 아르기닌이 25 mM CA 및 150 mM NaCl과 조합되는 경우, HCP는 약 300 ppm까지 감소된다. 150 mM 아르기닌이 150 mM 구아니딘으로 대체되는 경우, HCP 제거는 약 300ppm로 유지된다. 아르기닌이 구아니딘보다 더욱 비싸기 때문에, 이러한 전략은 비용 이점을 갖는다.

요약하면, 4개의 조합된 용액은 단일 성분 또는 이중-성분 용액과 비교하여 더 나은 HCP 제거를 입증하였다.

- 200mM 아르기닌, 0.05% w/v 트리부틸 Pi, 150 mM NaCl

- 250 mM 아르기닌, 25 mM CA, 150 mM NaCl

- 100mM 아르기닌, 150 mM 구아니딘, 25 mM CA, 150 mM NaCl

- 0.1% w/v 트리톤® X-100, 250mM 아르기닌, 150 mM NaCl

250 mM 아르기닌, 25 mM CA, 150 mM NaCl의 조건을 위하여, 150 mM 아르기닌을 구아니딘으로 대체하는 것은 HCP 제거에서 동일하게 효과적이며, 더 낮은 비용이 든다.

250 mM 아르기닌, 0.1% w/v 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제 및 150 mM NaCl을 함유하는 세정 용액은, 모델로서 항-Tl1a 항체를 사용하여 다중 pH 값 하에서 이의 HCP 제거에 대하여서도 추가로 조사되었다. 결과는 도 5에서 제시되었다. 6.5 내지 pH 10.5의 pH 범위에서, 용출 풀에서 HCP 수준은 100ppm 내지 200ppm 범위였고, 상당한 pH 영향은 관찰되지 않았다. 150 mM NaCl이 단백질에서 모든 전하기를 차폐하는데 충분하다고 믿어진다. 따라서, pH는 임의의 상당한 효과를 갖는 것으로 관찰되지 않았다. 모든 조합된 용액은 150 mM NaCl을 함유하고, pH 효과는 추가로 시험되지 않는다.

0.1% w/v 트리톤® X-100과 아르기닌과의 조합, 구아니딘 및 옥탄산나트륨과 아르기닌과의 조합, 및 트리부틸 포스페이트의 조합은, 항-TL1a 항체, 항-칼시토닌 유전자-관련된 펩타이드 (CGRP) 항체 및, 이의 C-말단이 인터페론 분자에 융합된 단클론성 항-CD38 항체인 융합 단백질에 의해 연구되었다. HCP 제거 결과는 도 6에서 제시된다. 모든 3개 분자에 대하여 효과적인 조합은 이하와 같다:

- 250mM 아르기닌 + 0.1% w/v 트리톤® X-100 (또는 + 0.05% w/v 트리부틸 포스페이트)

- 50-100 mM 아르기닌 + 100-250 mM Gu + 25mM CA (바람직하게는 >50mM 아르기닌, 및 > 100mM 구아니딘 포함)

- 350mM 구아니딘 + 0.05% w/v 트리부틸 포스페이트

이러한 데이터는 이들 세정 용액이 플랫폼 공정에서 사용될 수 있다는 것, 즉 이들이 임의의 항체의 정제에서 효과적인 것으로 기대될 것을 시사한다.

실시예 4

농도 효과

트리톤® X-100 비이온성 계면활성제, 아르기닌 및 NaCl 농도의 HCP 제거에 대한 효과는, 또한 항-TL1a, 항-CGRP, 및 항-CD38-IFN 융합 분자에서도 연구되었다. 8종의 세정 용액이 연구되었고, HCP 결과는 표 1에 요약되었다. 이들 데이터는 HCP 제거의 관점에서 모든 3개의 분자에 대해 유사한 경향을 나타내었다. 데이터는 0.15% w/v 트리톤® X-100 비이온성 계면활성제, 300 mM 아르기닌 및 100 mM NaCl의 세정이 HCP 제거의 관점에서 상당한 개선을 제공한다는 것을 나타내었다. 트리톤® X-100에 대한 효과적인 HCP 제거 유효 범위는 0.05%-0.15% w/v이고, 아르기닌에 대해서는 200-300mM이고, NaCl에 대해서는 100-200 mM이다. 데이터는 이들 세정 용액이 어느 관심 펩티드(예를 들어, 항체)의 정제에 효과적일 것이라고 암시한다.

실시예 5

선택된 조건들의 공정 평가

4개의 공정 조건들이 MabSelect SuRe 및 Sartobind Q 공정에 의해 5-cm 크로마토그래피 컬럼 상에서, 3개의 분자 (TL1a, CGRP 및 CD-38)에 대해 추가로 연구되었다. HCP 제거 결과는 표 3에 요약되었다. 모든 3개의 조합된 세정 조건들은, 대조군 조건 1M NaCl에 비해, HCP 제거의 상당한 개선을 나타내었다. 단백질 A 및 Sartobind Q 단계 이후의 잔여 HCP류는 적었고, 이는 임상적 사용 요구 조건을 만족하였다 (HCP < 100ppm).

실시예 6

바이러스 제거 결과

7종의 선택된 세정 용액은 시험관내 바이러스-유사 입자 제거를 위해 바이러스 제거에 대해 연구되었고, 결과는 표 4a에 요약되었다. 트리톤® X-100은 시험관내 VLP 제거에서 매우 효과적인 것으로 관찰되었다.

추가적인 세정 용액을 사용한 연구 (표 4b에 요약됨)는, 트리톤이 레트로바이러스-유사 입자 제거를 상당히 개선시킬 수 있다고 나타났다.

나아가, 선택된 세정 용액으로부터의 바이러스 제거가 스파이크-인(spike-in) 연구에서, 이하의 2가지 모델 바이러스를 사용하여 평가되었다: 친이종 쥐백혈병관련 바이러스 (xenotropic murine leukemia virus, X-MulV) 및 미세생쥐바이러스 (minute virus of mouse, MVM). 조성물 및 결과는 표 5 및 6에 요약되었다. 결과는 pH 5. 8에서의 5 mM 숙신산의 대조군 세정 용액에 비해, X-MulV 제거에서는 1.7-log (아르기닌) 또는 0.8-log (아르기닌 + 구아니딘) 개선되었고, MVM 제거에서는 1.0-log (아르기닌 + 트리부틸포스페이트) 또는 1.3-log (아르기닌) 또는 (아르기닌 + 구아니딘) 개선된 것으로 나타났다.

본 발명은 상기 기재되고 예시로 든 구현예에 제한되지 않으나, 계류된 청구항의 범주 내에서 변형 및 개질이 가능하다.

특허, 특허 출원, 수탁 번호, 기술 논문 및 학술 논문을 포함하는, 다양한 간행물은 본 명세서 전체에서 인용된다. 이들 인용된 간행물은 각각 본원에서 모든 목적을 위해 전체로서 통합된다.

서열 목록

항-CGRP VH (서열번호 1)

1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYWISWVRQA PGKGLEWVAE 50

51 IRSESDASAT HYAEAVKGRF TISRDNAKNS LYLQMNSLRA EDTAVYYCLA 100

101 YFDYGLAIQN YWGQGTLVTV SS

항-CGRP VL (서열번호 2)

1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCKASKRVT TYVSWYQQKP GQAPRLLIYG 50

51 ASNRYLGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCSQ SYNYPYTFGQ 100

101 GTKLEIK

항-CD38 VH (서열번호 3)

1 EVQLVQSGAE VKKPGATVKI SCKVSGYTFT DSVMNWVQQA PGKGLEWMGW 50

51 IDPEYGRTDV AEKFQGRVTI TADTSTDTAY MELSSLRSED TAVYYCARTK 100

101 YNSGYGFPYW GQGTTVTVSS

항-CD38 VL (서열번호 4)

1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQNVD SDVDWYQQKP GKAPKLLIYK 50

51 ASNDYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCMQ SNTHPRTFGG 100

101 GTKVEIKR

항-TL1a VH1 (서열번호 5)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGWLNPNSGNTGY

AQKFQGRVTMTADRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREVPETAAFEYWGQGTLVTVSS

항-TL1a VH2 (서열번호 6)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGWLNPNSGYTGY

AQKFQGRVTMTADRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREVPETAAFEYWGQGTLVTVSS

항-TL1a VL (서열번호 7)

QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTSSSSDIGAXXGVXWYQQLPGTAPKLLIEGYYNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLTITGLLPEDEGDYYCQSXDGTLSALFGGGTKLTVLG

Xaa 32는 G 또는 A이다.

Xaa 33은 L 또는 S 또는 Q이다.

Xaa 36은 H 또는 L이다.

Xaa 93은 Y 또는 F 또는 W이다.

SEQUENCE LISTING <110> CEPHALON, INC. WANG, LU KAO, ALBERT ZHANG, ZHAOQING JIN, MI <120> AFFINITY CHROMATOGRAPHY WASH BUFFER <130> 2873.274PC03/TJS/CLD/KM <150> US 62/523,032 <151> 2017-06-21 <150> US 62/366,309 <151> 2016-07-25 <150> US 62/366,302 <151> 2016-07-25 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CGRP VH <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Glu Ser Asp Ala Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Leu Ala Tyr Phe Asp Tyr Gly Leu Ala Ile Gln Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CGRP VL <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Lys Arg Val Thr Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD38 VH <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Lys Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD38 VL <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ser Asp 20 25 30 Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Asp Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Asn Thr His Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-TL1a VH1 <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Leu Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Pro Glu Thr Ala Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-TL1a VH2 <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Leu Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Pro Glu Thr Ala Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-TL1a VL <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is G or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is L, S or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa is H or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa is Y, F or W <400> 7 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Ser Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ala Xaa 20 25 30 Xaa Gly Val Xaa Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Glu Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Leu Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Xaa Asp Gly Thr 85 90 95 Leu Ser Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110

Claims

물, 염기성 아미노산 및 구아니딘을 포함하는, 친화성 크로마토그래피 세정 용액.
제1항에 있어서, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌인, 세정 용액.
제2항에 있어서, 상기 용액은 0 mM 초과 및 약 200 mM 미만의 아르기닌 및 약 50 mM 내지 약 250 mM 구아니딘을 포함하는, 세정 용액.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 용액은 약 50 mM 내지 약 150 mM 아르기닌을 포함하는, 세정 용액.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 75 mM 내지 약 125 mM 아르기닌을 포함하는, 세정 용액.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 85 mM 내지 약 115 mM 아르기닌을 포함하는, 세정 용액.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 90 mM 내지 약 110 mM 아르기닌을 포함하는, 세정 용액.
제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 95 mM 내지 약 105 mM 아르기닌을 포함하는, 세정 용액.
제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 100 mM 아르기닌을 포함하는, 세정 용액.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 50 mM 구아니딘 내지 약 200 mM 구아니딘을 포함하는, 세정 용액.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 100 mM 구아니딘 내지 약 200 mM 구아니딘을 포함하는, 세정 용액.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 150 mM 구아니딘 내지 약 200 mM 구아니딘을 포함하는, 세정 용액.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 100 mM 구아니딘 내지 약 150 mM 구아니딘을 포함하는, 세정 용액.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 150 mM 구아니딘을 포함하는, 세정 용액.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 음이온성 계면활성제를 추가로 포함하는, 세정 용액.
제15항에 있어서, 상기 용액은 약 10 mM 내지 약 40 mM의 음이온성 계면활성제를 포함하는, 세정 용액.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 용액은 약 20 mM 내지 약 30 mM의 음이온성 계면활성제를 포함하는, 세정 용액.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 22.5 mM 내지 약 27.5 mM의 음이온성 계면활성제를 포함하는, 세정 용액.
제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 25 mM의 음이온성 계면활성제를 포함하는, 세정 용액.
제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온성 계면활성제는 옥탄산나트륨을 포함하는, 세정 용액.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 염화나트륨을 추가로 포함하는, 세정 용액.
제21항에 있어서, 상기 용액은 약 50 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는, 세정 용액.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 용액은 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는, 세정 용액.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 150 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는, 세정 용액.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 150 mM 염화나트륨을 포함하는, 세정 용액.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 150 mM 염화나트륨을 포함하는, 세정 용액.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 7.5의 pH를 포함하는, 세정 용액.
수성 담체, TNF-유사 리간드 1A (TL1a)에 특이적으로 결합하는 재조합-발현되거나 또는 하이브리도마-발현된 항체, 및 조성물 중 약 50 ppm 내지 약 500 ppm의 숙주 세포 단백질 수준을 포함하는, 조성물.
제28항에 있어서, 상기 조성물은 내지 TL1a에 특이적으로 결합하는 재조합-발현된 항체를 포함하는, 조성물.
제28항에 있어서, 상기 조성물은 TL1a에 특이적으로 결합하는 하이브리도마-발현된 항체를 포함하는, 조성물.
제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 조성물 중 약 200 내지 약 500 ppm의 숙주 세포 단백질 수준을 포함하는, 조성물.
제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 조성물 중 약 300 내지 약 500 ppm의 숙주 세포 단백질 수준을 포함하는, 조성물.
제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 조성물 중 약 400 내지 약 500 ppm의 숙주 세포 단백질 수준을 포함하는, 조성물.
제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하는, 제제.
제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하는, 제제.
수성 담체, 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 (CGRP)에 특이적으로 결합하는 재조합-발현되거나 또는 하이브리도마-발현된 항체, 및 조성물 중 약 400ppm 내지 약 800ppm의 숙주 세포 단백질의 수준을 포함하는, 조성물.
제36항에 있어서, 상기 조성물은 CGRP에 특이적으로 결합하는 재조합-발현된 항체를 포함하는, 조성물.
제36항에 있어서, 상기 조성물은 CGRP에 특이적으로 결합하는 하이브리도마-발현된 항체를 포함하는, 조성물.
제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 조성물 중에 약 500 내지 약 800 ppm의 숙주 세포 단백질 수준을 포함하는, 조성물.
제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 조성물 중에 약 600 내지 약 800 ppm의 숙주 세포 단백질 수준을 포함하는, 조성물.
제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 조성물 중에 약 700 내지 약 800 ppm의 숙주 세포 단백질 수준을 포함하는, 조성물.
제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 조성물 중에 약 600 내지 약 700 ppm의 숙주 세포 단백질 수준을 포함하는, 조성물.
제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하는, 제제.
수성 담체, CD38에 특이적으로 결합하는 재조합-발현되거나 또는 하이브리도마-발현된 항체, 및 조성물 중 약 50 ppm 내지 약 500 ppm의 숙주 세포 단백질 수준을 포함하는, 조성물.
제44항에 있어서, 상기 조성물은 CD38에 특이적으로 결합하는 재조합-발현된 항체를 포함하는, 조성물.
제44항에 있어서, 상기 조성물은 CD38에 특이적으로 결합하는 하이브리도마-발현된 항체를 포함하는, 조성물.
제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 조성물 중 약 200 내지 약 500 ppm의 숙주 세포 단백질 수준을 포함하는, 조성물.
제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 조성물 중 약 300 내지 약 500 ppm의 숙주 세포 단백질 수준을 포함하는, 조성물.
제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중 약 400 내지 약 500 ppm의 숙주 세포 단백질 수준을 포함하는, 조성물.
제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하는, 제제.
정제된 관심 단백질의 제조 방법으로서, 관심 단백질 및 하나 이상의 오염 단백질을 포함하는 혼합물을 친화성 크로마토그래피 리간드로 로딩하는 단계; 상기 리간드를 염기성 아미노산 및 구아니딘을 포함하는 수성 세정 용액으로 세정하여, 상기 리간드로부터 상기 하나 이상의 오염 단백질을 용출하는 단계; 및 그 후 상기 리간드로부터 상기 관심 단백질을 용출함으로써 상기 관심 단백질의 정제된 용출물을 형성하는 단계;를 포함하는 방법.
제51항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 리간드는 단백질 A를 포함하는, 방법.
제52항에 있어서, 상기 관심 단백질은 항체 또는 이의 융합 단백질 작제물을 포함하는, 방법.
제53항에 있어서, 상기 항체는 TNF-유사 리간드 1A (TL1a)에 특이적으로 결합하는, 방법.
제54항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하는, 제제.
제54항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하는, 제제.
제53항에 있어서, 상기 항체는 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 (CGRP)에 특이적으로 결합하는, 방법.
제57항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하는, 제제.
제53항에 있어서, 상기 항체는 CD38에 특이적으로 결합하는, 방법.
제59항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하는, 제제.
제51항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌인, 방법.
제61항에 있어서, 상기 용액은 0 mM 초과 및 약 200 mM 미만의 아르기닌 및 약 50 mM 내지 약 250 mM 구아니딘을 포함하는, 방법.
제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 용액은 약 50 mM 내지 약 150 mM 아르기닌을 포함하는, 방법.
제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 75 mM 내지 약 125 mM 아르기닌을 포함하는, 방법.
제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 85 mM 내지 약 115 mM 아르기닌을 포함하는, 방법.
제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 90 mM 내지 약 110 mM 아르기닌을 포함하는, 방법.
제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 95 mM 내지 약 105 mM 아르기닌을 포함하는, 방법.
제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 100 mM 아르기닌을 포함하는, 방법.
제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 50 mM 구아니딘 내지 약 200 mM 구아니딘을 포함하는, 방법.
제61항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 100 mM 구아니딘 내지 약 200 mM 구아니딘을 포함하는, 방법.
제61항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 150 mM 구아니딘 내지 약 200 mM 구아니딘을 포함하는, 방법.
제61항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 100 mM 구아니딘 내지 약 150 mM 구아니딘을 포함하는, 방법.
제61항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 150 mM 구아니딘을 포함하는, 방법.
제61항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 음이온성 계면활성제를 추가로 포함하는, 방법.
제74항에 있어서, 상기 용액은 약 10 mM 내지 약 40 mM의 음이온성 계면활성제를 포함하는, 방법.
제74항 또는 제75항에 있어서, 상기 용액은 약 20 mM 내지 약 30 mM의 음이온성 계면활성제를 포함하는, 방법.
제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 22.5 mM 내지 약 27.5 mM의 음이온성 계면활성제를 포함하는, 방법.
제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 25 mM의 음이온성 계면활성제를 포함하는, 방법.
제74항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온성 계면활성제는 옥탄산나트륨을 포함하는, 방법.
제61항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 염화나트륨을 추가로 포함하는, 방법.
제80항에 있어서, 상기 용액은 약 50 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 용액은 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 150 mM 염화나트륨 내지 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 100 mM 염화나트륨 내지 약 150 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 150 mM 염화나트륨을 포함하는, 방법.
제61항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 7.5의 pH를 포함하는, 방법.
제51항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스를 불활성화하기에 충분한 시간의 기간 동안 관심 단백질의 정제된 용출물의 pH를 낮추는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제51항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH를 약 2. 5에서 약 5.0로 낮추는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제51항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질의 정제된 용출물을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제51항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질의 정제된 용출물을 투석 여과, 한외여과, 또는 투석 여과 및 한외여과 둘 다에 의해 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제51항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질의 정제된 용출물을 막 크로마토그래피 지지체로 로딩하는 단계, 및 상기 막 크로마토그래피 지지체로부터 추가-정제된 용출물을 포함하는 통과물(flow through)을 수집하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제91항에 있어서, 상기 막 크로마토그래피 지지체는 음이온 교환 막 크로마토그래피 지지체를 포함하는, 방법.
제51항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는, 방법.
제51항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는, 방법.
제51항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 단백질 및 하나 이상의 오염 단백질은 적어도 약 250 리터의 용량을 갖는 생물반응기에서 발현되는, 방법.
제95항에 있어서, 상기 생물반응기는 적어도 약 500 리터, 적어도 약 2000 리터, 또는 적어도 약 5000 리터의 용량을 갖는, 방법.
제51항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질의 상기 정제된 용출물을, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물로서 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제91항 또는 제92항에 있어서, 관심 단백질의 상기 추가-정제된 용출물을, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물로서 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제51항 내지 제96항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된, 관심 단백질의 숙주 세포 단백질-감소된 제제.
제99항에 있어서, 상기 관심 단백질은 항체인, 제제.
제100항에 있어서, 상기 항체는 TNF-유사 리간드 1A (TL1a)에 특이적으로 결합하는, 제제.
제101항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하는, 제제.
제101항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하는, 제제.
제100항에 있어서, 상기 항체는 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 (CGRP)에 특이적으로 결합하는, 제제.
제102항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하는, 제제.
제100항에 있어서, 상기 항체는 CD38에 특이적으로 결합하는, 제제.
제106항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL를 포함하는, 제제.
제97항의 방법에 의해 생산된, 관심 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 부형제의 숙주 세포 단백질-감소된 조성물.
제98항의 방법에 의해 생산된, 관심 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 부형제의 숙주 세포 단백질-감소된 조성물.
제51항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 단백질은 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현되는, 방법.
제1항, 제2항, 또는 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 200 mM 아르기닌, 0.05% w/v 트리부틸포스페이트, 및 150 mM NaCl을 포함하는, 세정 용액.
제1항, 제2항, 또는 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 250 mM 아르기닌, 25 mM 카프릴산, 및 150 mM 염화나트륨을 포함하는, 세정 용액.
제1항, 제2항 내지 제14항, 또는 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 100 mM 아르기닌, 150 mM 구아니딘, 25 mM CA, 및 150 mM 염화나트륨을 포함하는, 세정 용액.
제1항, 제2항, 제15항 내지 제19항, 또는 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 0.1% w/v 트리톤® X-100, 250 mM 아르기닌, 및 150 mM 염화나트륨을 포함하는, 세정 용액.
제1항, 제2항, 제15항 내지 제19항, 또는 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 250 mM 아르기닌 및 0.1% w/v 트리톤® X-100을 포함하는, 세정 용액.
제1항, 제2항, 제15항 내지 제19항, 또는 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 250 mM 아르기닌 및 0.05% w/v 트리부틸포스페이트를 포함하는, 세정 용액.
제1항, 제2항 내지 제14항, 또는 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 약 50 mM 내지 약 100 mM 아르기닌, 약 100 mM 내지 250 mM 구아니딘, 25 mM 카프릴산을 포함하는, 세정 용액.
제1항 또는 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 350 mM 구아니딘 및 0.05% w/v 트리부틸포스페이트를 포함하는, 세정 용액.
제51항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 A 세정 용액은 바이러스 로그 바이러스 감소값 (LRV)에 의해 측정할 때, 혼합물로부터의 바이러스 제거(viral clearance)을 증가시키는, 방법.
제119항에 있어서, 상기 LRV이 약 4.0 log10 내지 약 8.0 log10 또는 약 3.0 log10 내지 약 8.0 log10인, 방법.
제28항 내지 제50항, 제97항, 제98항, 제108항 또는 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 바이러스 입자가 실질적으로 없는, 조성물.
제121항에 있어서, 상기 조성물은 바이러스 입자가 없는, 조성물.
제99항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 바이러스 입자가 실질적으로 없는, 제제.
제123항에 있어서, 상기 제제는 바이러스 입자가 없는, 제제.