KR20140029465A - 친화성 크로마토그래피를 위한 세척 용액 및 방법 - Google Patents

친화성 크로마토그래피를 위한 세척 용액 및 방법 Download PDF

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KR20140029465A
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Abstract

본 발명은, 8.0 초과의 pH에서 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 용액이, 용리액 중 생성물 농도를 증가시키고 회수된 생성물의 높은 %수율을 유지하면서 동시에 비-완충염의 부재하에 불순물을 제거하는데 효과적인, 친화성 크로마토그래피를 위한 세척 방법을 제공한다.

Description

친화성 크로마토그래피를 위한 세척 용액 및 방법 {WASH SOLUTION AND METHOD FOR AFFINITY CHROMATOGRAPHY}
친화성 크로마토그래피 진행중에 숙주 세포 단백질(HCP) 및 생성물-관련 불순물, 예컨대 고-분자량 종(HMWs) 및 저-분자량 종(LMWs)을 비롯한 불순물의 효율적인 제거는 단백질의 하류 처리 진행중에 결정적인 인자이다. 제1 정제 단계("포획 단계") 후의 단백질 순도는 정제 생성물의 생성에 요구되는 후속 단계의 유형과 개수에 현저하게 영향을 미친다. 포획 단계 역시 중요한데, 그 이유는 생성물을 농축시키고 이는 후속 정제 단계에서 비례적으로 좀더 소형이고 좀더 덜 고가인 칼럼을 사용하게 해주기 때문이다. 따라서, 제1 크로마토그래피 단계 진행중에 불순물의 제거를 최적화하는 것이 중요하다. 항체 정제의 경우에, 당해 제1 단계는 전형적으로 단백질 A 또는 유도체에 대한 친화도에 기반한다.
저-pH 조건(예를 들어, pH 3 내지 4)은 친화성 칼럼으로부터 결합된 표적 단백질을 용리시키는데 요구되지만, 잠재적으로 응집을 유발하는 단점이 있다. 역사적으로, 5 내지 5.5의 pH와 같은 보다 덜한 엄중 조건이 표적-단백질 A 상호작용은 보존하면서 동시에 칼럼으로부터 비-특이적 결합 불순물을 세척하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이들 조건하에서, 특히 고-로딩 밀도로 작업시 표적 단백질의 부분적인 용리에 기인하여 회수율이 종종 감소한다.
아미노산 아르기닌은 특정 침전 단백질을 가용화시키고(문헌 [M, Tsumoto K, Nitta S, Adschiri T, Ejima D, Arakawa T, and Kumagai I. Biochem. Biophys. Res. Commun. 328, 189-197 (2005)]; [Umetsu M, Tsumoto K, Hara M, Ashish K, Goda S, Adschiri T, Kumagai I. J Biol Chem. 2003 Mar 14;278(11):8979-87]), 응집체의 형성을 감소시키며(문헌 [Arakawa T, Tsumoto K. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Apr 25;304(1):148-52] 및 [Arakawa T, Biophys . Chem . 127 (2007), pp. 1-8 (Review)]), 표면에의 단백질의 비-특이적 흡착을 감소시키는(문헌 [Ejima D, J Chromato A, 05 and Schneider CP, J. Phys . Chem . B 113 (2009), pp. 2050-2058]) 것으로 나타났다. 또한, 구아니듐 히드로클로리드와는 대조적으로, 아르기닌은 단백질을 언폴딩하지(unfold) 않는 것으로 나타나지는 않았다(문헌 [Arakawa T, Biochem . Biophys . Res . Commun . 304 (2003), pp. 148-152] 및 [Nakakido M, Biophys. Chem . 137 (2008), pp. 105-109]).
그에 따라, 아르기닌은 친화성 크로마토그래피 칼럼 및 그 밖의 유형의 정제 칼럼으로부터 단백질을 용리시키는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, 아라카와(Arakawa) 등은 pH 4.1 내지 5.0에서 0.5 내지 2.0 M 아르기닌을 함유하는 용리 완충제를 사용하여 단백질 A 칼럼으로부터 항체를 용리시키는 방법을 기재하고 있다(문헌 [Arakawa et al . (2004) Protein Expression and Purification 36:244-248]; [Tsumoto, K. et al. (2004) Biotechnol . Prog. 20:1301-1308]; 및 미국 특허 공개 번호 20050176109). 부가적으로, 에지마(Ejima) 등의 미국 특허 번호 7,501,495에서는 아르기닌 히드로클로리드를 함유하는 전개 용액으로 겔 여과 칼럼으로부터 단백질을 용리시키는 방법을 기재하고 있다. 고우즈(Ghose) 등은 아르기닌 구배를 용리제로서 사용하여 비-유도체화 실리카로부터 관심 단백질을 용리시키는 방법을 기재하고 있다(문헌 [Ghose, S. et al . (2004) Biotech . Bioeng. 87:413-423]). 코프먼(Coffman) 등의 미국 특허 공개 번호 20030050450에서는 Fc-함유 분자와 단백질 A의 복합체로부터 Fc-함유 분자를 해리하는 방법을 기재하고 있으며, 여기서 Fc/단백질 A 복합체는 소수성 상호작용 칼럼(HIC)에 적용되며 칼럼은 아르기닌을 함유하는 완충제로 세척된다.
배런(Barron) 등은 pH 5.0 내지 7.5에서 포스페이트/아세테이트 완충제에 0.5 내지 2.0 M 아르기닌을 함유하는(최적으로는 1 M 아르기닌, 0.1 M 포스페이트/아세테이트 완충제, pH 5.0) 단백질 A 크로마토그래피용 중간 세척 용액을 기재하고 있다. 당해 아르기닌 세척 단계는 HCP 오염물을 제거하는 것으로 보고하고 있다. 원저자들은 또한 pH 5.0 내지 7.5에서 염화나트륨을 0.5 내지 2.0 M로 함유한 중간 세척 용액을 시험하였으며, NaCl 세척제는 HCP의 유의미한 감소를 보이지 않았음을 보고하였다(문헌 [Barron et al., "Improving Purity on Protein A Affinity Media Through Use of an Arginine Intermediate Wash Step", http://www.priorartdatabase.com/IPCOM/000127319]). 더욱이, 배런 등은 세척 완충제의 pH를 낮추는 것이 실험에 사용된 조건하에서 유익한 효과가 있었음을 보고하였다.
정제 과정을 강화시키고 생성물 회수를 증가시키기 위한 개량 기술에 대한 오랜 필요성이 존재한다. 본원 개시는 이러한 필요성을 심도있게 다루며 부가 이익을 제공한다.
본 발명은 친화성 크로마토그래피를 위한 효율적이고 강건한 세척 용액, 및 당해 용액을 사용하는 세척 방법을 제공한다. 당해 세척 용액은 용리 단계에 앞서 세척 단계에 적용되며, 그의 사용은 친화성 매트릭스로부터 용리된 관심 단백질의 고-수율을 도출하면서, 매트릭스에 적용된 출발물질로부터 저-분자량 종(LMWs), 고-분자량 종(HMWs), 및 숙주 세포 단백질(HCP)을 효과적으로 제거한다. 당해 세척 용액은 비-완충염의 부재하에, 고-pH, 즉, 8.0을 상회하는 pH에서 아르기닌의 존재를 특징으로 한다. 고-pH에서 아르기닌 (또는 아르기닌 유도체)의 이러한 조합은 좀더 낮은 pH에서 아르기닌을 함유하는 세척 용액보다 현저히 더 많은 불순물을 제거하고, 회수된 관심 단백질의 고-농도와 상관관계가 있는 더 예리한 용리 피크를 도출한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 비-완충염의 부재하에, 8.0 초과의 pH에서 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 용액으로 친화성 크로마토그래피(AC) 매트릭스를 세척하는 단계를 포함하는, 관심 단백질이 결합되는 AC 매트릭스를 사용하여 정제된 관심 단백질(예를 들어, 항체, 항체 단편, 또는 단백질)을 생산하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 세척 용액의 pH는 적어도 8.1, 더 바람직하게는 적어도 8.5, 한층 더 바람직하게는 적어도 8.9 또는 9.0이다. 한 실시양태에서, 세척 용액의 pH는 약 8.5 내지 9.5이다. 또 다른 실시양태에서, 세척 용액의 pH는 약 8.9 내지 9.0이다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 (a) 관심 단백질을 포함하는 혼합물을 AC 매트릭스 상에 로딩하는 단계, (b) 8.0 초과의 pH에서 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 용액으로 AC 매트릭스를 세척하는 단계; 및 (c) AC 매트릭스로부터 관심 단백질을 용리시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 세척은 비-완충염의 부재하에 수행한다.
특정 실시양태에서, AC 매트릭스는 단백질 A 칼럼이다. 다양한 그 밖의 실시양태에서, AC 매트릭스는 단백질 G 칼럼, 단백질 A/G 칼럼, 단백질 L 칼럼, 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC) 칼럼, 캘모둘린 수지 칼럼, 멥 하이퍼셀(MEP HyperCel)TM 칼럼, 말토스 결합 단백질(MBP)과 결합하는 칼럼, 글루타치온-S-트랜스페라제(GST)와 결합하는 칼럼, 스트렙-태그(Strep-Tag) II와 결합하는 칼럼, 및 염료-친화성 칼럼으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, AC 매트릭스는 캡처실렉트(CaptureSelect) IgG-CH1, 캡처실렉트 IgG-Fc (Hu), 캡처실렉트 LC-카파 (Hu), 캡처실렉트 LC-람다 (Hu), 캡처실렉트 IgG4 (Hu), 캡처실렉트 IgG1 (Hu), 캡처실렉트 IgG3 (Hu), 캡처실렉트 IgM 및 캡처실렉트 IgA으로 이루어진 군으로부터 선택된 수지를 포함한다. 다른 실시양태에서, AC 매트릭스는 아이지실렉트(IgSelect), 카파실렉트(KappaSelect), 람다에프에이비실렉트(LamdaFabSelect) 및 캡토 엘(Capto L)로 이루어진 군으로부터 선택된 수지를 포함한다.
적합한 관심 단백질은 항체 (및 Fc 영역을 포함하는 그 밖의 단백질, 예컨대 Fc 융합 단백질) 및 항체 단편을 포함하며 그들에 한정되지 않지만, 본원 기재의 친화성 매트릭스에 결합하는 다른 단백질 역시도 본 발명의 방법에 따른 정제에 적합하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 항체, 항체 단편, 또는 단백질을 포함하는 혼합물을 단백질 A 칼럼 상에 로딩하는 단계; (b) 8.0 초과의 pH(예를 들어, 약 8.5 내지 9.5 또는 약 8.9 내지 9.0)에서, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체(i)를 포함하는 세척 용액으로 단백질 A 칼럼을 세척하는 단계; 및 (c) 단백질 A 칼럼으로부터 항체, 항체 단편, 또는 단백질을 용리시키는 단계를 포함하며, 여기서 세척은 비-완충염의 부재하에 수행하는 것인, 단백질 A 칼럼을 사용하여 정제된 항체, 항체 단편, 또는 Fc 영역을 포함하는 단백질(예를 들어, Fc 융합 단백질)을 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 방법은 관심 단백질(예를 들어, 항체, 항체 단편, 또는 Fc 영역을 포함하는 단백질(예를 들어, Fc 융합 단백질))의 단백질 A 칼럼에의 로딩 및/또는 단백질 A 칼럼으로부터의 용리에 앞서 단백질 A 칼럼을 평형화시키는 단계를 임의로 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 (a) 단백질 A 칼럼을 (예를 들어, pH를 조정하고 임의의 잔류 저장 완충제를 제거하기 위하여 평형 완충제를 사용하여) 평형화시키는 단계; (b) 항체, 항체 단편, 또는 단백질을 포함하는 혼합물을 단백질 A 칼럼 상에 로딩하는 단계; (c) 8.0 초과의 pH(예를 들어, 약 8.5 내지 9.5 또는 약 8.9 내지 9.0)에서 아르기닌 또는 아르기닌 유도체(i)를 포함하는 세척 용액으로 단백질 A 칼럼을 세척하는 단계; 및 (d) 단백질 A 칼럼으로부터 항체, 항체 단편, 또는 단백질을 용리시키는 단계를 포함하며, 여기서 세척은 비-완충염의 부재하에 수행하는 것인, 단백질 A 칼럼을 사용하여 정제된 항체, 항체 단편, 또는 Fc 영역을 포함하는 단백질(예를 들어, Fc 융합 단백질)을 생산하는 방법을 제공한다. 방법은 항체, 항체 단편, 또는 단백질의 용리에 앞서 단백질 A 칼럼을 평형화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 세척 용액은 아르기닌 또는 아르기닌-HCl을 바람직하게는 약 0.1 내지 0.5 M 범위의 농도로 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 아르기닌 또는 아르기닌-HCl은 0.25 M 또는 약 0.25 M의 농도로 존재한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 세척 용액은 아르기닌 유도체, 예컨대 아세틸 아르기닌, N-알파-부티로일-아르기닌, 아그마틴, 아르긴산 및 N-알파-피발로일 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 유도체를 포함한다.
본 발명의 방법은 고- 및 저-분자량(각각 HMW 및 LMW) 종과 숙주 세포 단백질(HCP)을 비롯한 다종다양한 불순물의 제거에 효과적이다. 특정 실시양태에서, 세척 용액은 1종 이상의 완충염(예를 들어, 나트륨 아세테이트, 인산나트륨 또는 트리스)을 추가로 포함한다.
본 발명은 불순물 제거를 위하여 관심 단백질의 용리에 앞서 칼럼에 적용되는, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 친화성 크로마토그래피를 위한 개량 세척 용액을 제공한다. 개량 세척 용액은, 비-완충염의 부재하에, 8.0 초과의 pH(예를 들어, 8.1 초과의 pH, 바람직하게는 8.5 초과의 pH, 예를 들어 약 8.5 내지 9.5 또는 약 8.9 내지 9.0)에서, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함한다. 전형적으로, 세척 용액은 수용액이다.
고-pH에서, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 이러한 독특한 조합은 회수율에 영향을 주지 않으면서 통용되는 절차보다 현저히 더 많은 불순물을 제거한다. 또한, 이러한 세척 조건은 용리액 중 관심 단백질의 좀더 높은 농도와 상관관계가 있는 좀더 예리한 용리 피크를 가져오며, 이는 부가적인 하류 정제 과정의 성능을 증대시키는 데 유리하다.
숙주 세포 단백질(HCP) 및 생성물-관련 불순물, 예컨대 고-분자량(HMW) 종과 저-분자량(LMW) 종을 비롯한 불순물의 효율적인 제거는 관심 단백질의 하류 처리 진행중에 결정적인 인자이다. 친화성 크로마토그래피는 종종 관심 단백질(예를 들어, 항체)에 대한 다단계 정제 과정의 제1 단계로서 이용되고, 친화성 크로마토그래피 후 관심 단백질의 순도는 후속 정제 단계의 종류와 개수에 현저하게 영향을 미친다. 친화성 크로마토그래피에 대한 또 다른 중요한 역할은 생성물을 농축하는 것이며, 이는 후속 정제 단계에서 비례적으로 좀더 소형이고 좀더 덜 고가인 칼럼 및 저장소(백 또는 철제 탱크)의 사용을 가능하게 해준다. 따라서, 높은 중간체 농도를 유지하면서 및 수율의 훼손 없이 친화성 크로마토그래피 단계 진행중에 불순물의 제거를 최적화하는 것이 특히 중요하다.
매트릭스에 따라서는, 전형적으로 pH 3 내지 4의 저-pH 조건이 친화성 매트릭스로부터 결합된 관심 단백질을 용리시키는 데 필수 조건이지만 잠재적으로 응집을 유발하는 단점이 있다. 역사적으로, pH 5 내지 5.5와 같은 보다 덜한 엄중 조건이 관심 단백질과 친화성 매트릭스간의 상호작용은 보존하면서 칼럼으로부터 비-특이적 결합 불순물을 세척하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이들 조건에서, 특히 고-로딩 밀도로 작업시 관심 단백질의 부분적인 용리에 기인하여 관심 단백질의 회수율이 종종 감소한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 의하여 제공되는 세척 용액은, 불순물의 제거를 허용하면서 친화성 매트릭스에의 관심 단백질의 결합을 보전하는, 8.0 초과의 pH(예를 들어, 바람직하게는 8.1 초과의 pH, 더 바람직하게는 8.5 초과의 pH, 예를 들어 약 8.5 내지 9.5 또는 약 8.9 내지 9.0)에서 유리하게 수행된다.
전형적으로, 아르기닌 세척제는 비-완충염을 포함한다. 그러나, 본 발명의 한가지 장점은 본 발명에 채용되는 세척 단계가 비-완충염의 존재를 요하지 않는다는 점이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비-완충염"이란 산 또는 염기의 첨가시 적용된 조건(예컨대 고-pH)하에서 세척 용액의 pH 존속에 실질적으로 기여하지 않도록 하는 유형이고 그런 농도로 존재하는 염을 말한다. 비-완충염으로는 이온성 염, 할로겐 염(Cl 또는 Br을 포함하는 것들 포함), 및 특히, 나트륨(Na), 칼륨(K), 칼슘(Ca) 또는 마그네슘(Mg), 나트륨(Na) 또는 칼륨(K)을 비롯한 알칼리 금속 또는 알칼리 토 금속을 포함하는 할로겐 염(즉, NaCl, KCl, CaCl2 및 MgCl2)이 포함된다. 특정 실시양태에서, 세척은 NaCl의 부재하에 수행된다.
용어 "비-완충염"에는 적용된 조건하에서 세척 용액(들)의 pH 존속에 실질적으로 기여하는 완충염, 예컨대 나트륨 아세테이트, 인산나트륨 및 트리스는 포함시키지 않는다. 따라서, 그러한 완충염은 본 발명의 세척 용액에 포함될 수 있다.
통상의 수확물 또는 세포 추출물에 존재하는 불순물의 광범한 생물물리학적 다양성은 크로마토그래피 매질의 고체상 및/또는 결합된 관심 단백질과의 매우 다양한 방식의 상호작용을 초래한다. 불순물의 다소 강한 테더링(tethering)은 두 분자간의 비-공유 분자간 상호작용, 예컨대 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 및 반데르발스 힘 또는 이들 유형의 상호작용의 조합의 결과일 수 있다. 따라서, 몇몇 상이한 메커니즘의 조합(즉, 8.0 초과의 pH와 조합한 아르기닌 또는 아르기닌 유도체)은 전통적인 기술보다 불순물 제거에 좀더 효과적인 것으로 발견되었다.
세척 용액에 아르기닌을 사용하는 것과 관련하여, 아르기닌은 특정 침전 단백질을 가용화시키고(문헌 [Umetsu, M. et al . (2005) Biochem . Biophys . Res . Commun. 328:189-197]; [Tsumoto, K. et al. (2003) Biochem . Biophys . Res . Commun. 312:1383-1386]), 응집체의 형성을 감소시키며(문헌 [Arakawa, T. et al. (2003) Biochem . Biophys . Res . Commun . 304:148-152]), 표면에의 단백질의 비-특이적 흡착을 감소시키는(문헌 [Ejima, D. et al . (2005) J. Chromatogr . A. 1094:49-55]) 능력이 있다고 보고되었다. 메커니즘에 의해 제한되는 것을 의도하는 것은 아니지만, 단백질 응집의 감소는 아르기닌과 상호작용하는 단백질상 소수성 패치의 은폐가 원인일 수 있다. 이러한 상호작용은 아르기닌상의 구아니듐기와 단백질상의 트립토판기 사이에, 또는 아르기닌의 집단화(clustering)에 의한 소수성 패치의 형성을 통해 일어날 수 있거나, 또는 그러한 영향의 조합일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "고-pH"는 이전의 세척 방법에서 채용되는 것처럼 낮은 또는 중성 pH(예를 들어, 약 5.0 내지 7.0의 pH)에서 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 함유하는 세척제와 비교하여 불순물의 현저한 감소를 가져오는, 8.0 초과의 pH를 언급한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 낮은 또는 7.0의 중성 pH에서의 아르기닌-함유 세척 용액과 비교하여 "고-pH" 세척은 HCP의 적어도 약 2 내지 3배 감소, 및/또는 LMW 수준의 적어도 약 3 내지 4배 감소, 및/또는 적어도 약 30 내지 50% 이상의 응집의 총체적 감소를 가져온다.
특정 실시양태에서, 세척 용액의 "고-"pH는 적어도 약 8.1, 바람직하게는 적어도 약 8.5, 더 바람직하게는 약 8.5 내지 9.5 또는 약 8.9 내지 9.0이다. 세척의 예시적인 "고-"pH 조건은 예를 들어, 8.1 또는 약 8.1, 8.2 또는 약 8.2, 8.3 또는 약 8.3, 8.4 또는 약 8.4, 8.5 또는 약 8.5, 8.6 또는 약 8.6, 8.7 또는 약 8.7, 8.8 또는 약 8.8, 8.9 또는 약 8.9, 9.0 또는 약 9.0, 9.1 또는 약 9.1, 9.2 또는 약 9.2, 9.3 또는 약 9.3, 9.4 또는 약 9.4, 9.5 또는 약 9.5, 10.0 또는 약 10.0, 10.1 또는 약 10.1, 10.2 또는 약 10.2, 10.3 또는 약 10.3, 10.4 또는 약 10.4 및 10.5 또는 약 10.5의 pH 값을 포함한다. 세척 용액은 또한 pH의 조정 및/또는 유지를 위해 1종 이상의 완충제(즉, 완충염)를 함유할 수 있다. 세척 용액(들)에 포함될 수 있는 전형적인 완충제의 비-제한적인 예로는 트리스 (트리스(히드록시메틸)메틸아민), 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 히스티딘, 트리에탄올아민, 디에탄올아민, 포르메이트, 아세테이트, MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산), 포스페이트, HEPES (4-2-히드록시에틸-1-피페라진에탄술폰산), 시트레이트, MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판술폰산), TAPS (3-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}프로판술폰산), Bicine (N,N-비스(2-히드록시에틸)글라이신), Tricine (N-트리스(히드록시메틸)메틸글라이신), TES (2-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}에탄술폰산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산), 카코딜레이트 (디메틸비산) 및 SSC (염수 나트륨 시트레이트)가 포함된다.
본 발명의 정제 방법은 고- 및 저-분자량(각각 HMW 및 LMW) 종과 숙주 세포 단백질(HCP)을 비롯한 각종 불순물의 제거에 효과적이다. 실시예 섹션에 상세히 기재된 바와 같이, 방법은 관심 단백질의 높은 %수율 및 관심 단백질의 고농도를 달성하면서 세척 용리액 중 HMW 종, LMW 종 및 HCP을 감소시키는 데에 효과적이다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 본원 기재의 방법은 97% 초과, 더 바람직하게는 98% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과의 관심 단백질의 %수율을 도출한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 적어도 약 2배 감소, 더 바람직하게는 적어도 약 3배 감소, 더 바람직하게는 적어도 약 4배 감소, 더 바람직하게는 적어도 약 5배 감소, 한층 더 바람직하게는 적어도 약 6배 감소인, 용리액 중 HMW 또는 LMW 오염물의 %감소를 도출한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 적어도 약 1.1, 또는 적어도 약 1.2, 또는 적어도 약 1.3, 또는 적어도 약 1.4, 또는 적어도 약 1.5, 또는 적어도 약 1.6, 또는 적어도 약 1.7, 또는 적어도 약 1.8, 또는 적어도 약 1.9, 또는 적어도 약 2.0, 또는 적어도 약 2.1, 또는 적어도 약 2.2, 또는 적어도 약 2.3, 또는 적어도 약 2.4, 또는 적어도 약 2.5, 또는 적어도 약 2.6, 또는 적어도 약 2.7, 또는 적어도 약 2.8, 또는 적어도 약 2.9, 또는 적어도 약 3.0인 용리액 중 HCP의 로그 감소치(LRV)를 도출한다.
메커니즘에 의하여 제한되도록 의도하는 것은 아니지만, 고-pH는 HCP 및 HMWs을 부분적으로 변성시킬 수 있는 반면에, 모노머 항체를 비롯한 안정한 단백질은 이들 조건에서 영향을 받지 않는다. 오염물 단백질의 변성은 구조의 경미한 변화로서 나타날 수 있는데, 비-특이적 결합을 약화시키기에 충분할 수 있다. 따라서, 세척 용액의 고-pH는 불순물이 결합된 관심 단백질 또는 친화성 매트릭스의 고체 지지체와 상호작용하는 것을 불안정화함으로써 불순물의 제거를 증가시키는 데 유익할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 관심 단백질이 결합되는 친화성 크로마토그래피(AC) 매트릭스를 사용하여 정제된 단백질(예를 들어, 항체, 항체 단편, 또는 Fc 영역을 포함하는 단백질(예를 들어, Fc 융합 단백질))을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 AC 매트릭스로부터 관심 단백질의 용리에 앞서, 비-완충염의 부재하에 8.0 초과의 고-pH(예를 들어, 바람직하게는 8.1 초과의 pH, 더 바람직하게는 8.5 초과의 pH, 예를 들어 약 8.5 내지 9.5 또는 약 8.9 내지 9.0)에서 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 용액으로 AC 매트릭스를 세척하는 단계를 포함한다. AC 매트릭스는 임의로는 관심 단백질의 로딩에 앞서 및/또는 관심 단백질의 용리에 앞서 평형화시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친화성 크로마토그래피 매트릭스" 또는 "AC 매트릭스"란, 관심 단백질과 AC 매트릭스간, 예컨대 수용체와 리간드, 효소와 기질 또는 항원과 항체간의 고도로 특이적인 결합 상호작용에 기반하여 생화학적 혼합물의 분리를 가능케 해주는, 고체상 매질, 전형적으로 겔 또는 수지를 언급하는 것으로 의도된다. 따라서, 고체상 매질은 관심 단백질이 완충제 조건에 따라 가역적으로 부착할 수 있는 표적을 포함한다. AC 매트릭스를 포함할 수 있는 고정화 또는 고체상 매질의 비-제한적인 예는 겔 매트릭스, 예컨대 아가로스 비드(예컨대, 시판 세파로스 매트릭스), 및 유리 매트릭스, 예컨대 다공성 유리 비드(예컨대, 시판 프로셉(ProSep) 매트릭스)를 포함한다.
AC 매트릭스에 대한 관심 단백질의 결합은 전형적으로 칼럼 크로마토그래피로 달성된다. 즉, AC 매트릭스를 칼럼으로 성형하고, 관심 단백질을 함유하는 생화학적 혼합물을 칼럼을 통해 유동시키고, 이어서 칼럼을 통해 세척 용액을 유동시킴으로써 칼럼을 세척하고, 이어서 칼럼을 통해 용리 완충제를 유동시킴으로써 칼럼으로부터 관심 단백질을 용리한다.
이와 달리, AC 매트릭스에 대한 관심 단백질의 결합은 배치식 처리로 달성될 수 있는데, 여기서는 관심 단백질을 함유하는 생화학적 혼합물을 용기중에서 AC 매트릭스와 인큐베이션하여 AC 매트릭스에 대한 관심 단백질의 결합을 허용하며, 고체상 매질은 용기로부터 (예를 들어, 원심분리에 의하여 또는 진공 펌프를 사용하는 여과에 의하여) 제거되며, 고체상 매질은 세척하여 불순물을 제거한 다음 다시 회수되며(예를 들어, 원심분리에 의하여 또는 진공 펌프를 사용하는 여과에 의하여), 관심 단백질은 고체상 매질로부터 용리된다.
또 다른 실시양태에서, 배치식 처리와 칼럼 크로마토그래피의 조합이 이용될 수 있다. 예를 들어, AC 매트릭스에 대한 관심 단백질의 초기 결합은 배치식 처리로 달성될 수 있고, 그런 다음 고체상 매질을 칼럼에 충진시킬 수 있으며, 이어서 칼럼의 세척 및 칼럼으로부터 관심 단백질의 용리가 수행된다.
특정 고체상 매트릭스의 성질, 특히 고체상에 부착되는 표적의 결합 특성은 그 고체상 매트릭스를 사용하여 정제될 수 있는 단백질(들)의 유형(들)을 결정한다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, AC 매트릭스는, 고체상에 부착된 표적으로서, 특정 면역글로불린의 Fc 영역내 CH2 및 CH3 도메인에 특이적으로 결합하는 박테리아 세포벽 단백질인 단백질 A를 포함하는 단백질 A 칼럼이다. 단백질 A의 결합 특성은 당기술분야에 확립되어 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, (정제하고자 하는) 관심 단백질은 항체, 항체 단편, 또는 Fc 영역을 포함하는 단백질(예를 들어, Fc 융합 단백질)이다. 또한, 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있는 부가적인 단백질은 Fc-함유 단백질(예를 들어, Fc 융합 단백질)을 포함한다. 임의의 단백질이 단백질 A 매트릭스에 특이적으로 결합할 수 있는 한, 그 단백질은 본 발명의 방법에 따라 정제될 수 있다. 다양한 단백질 A 수지가 당기술분야에 주지되어 있고 본 발명에 사용하기에 적합하다. 시판 단백질 A 수지의 비-제한적인 예로는 다음의 것들이 포함된다: 맵실렉트(MabSelect), 맵실렉트 엑스트라(MabSelect Xtra), 맵실렉트 슈어(MabSelect Sure), 알프로틴 에이(rProtein A) 세파로스 FF, 알엠피프로틴 에이(rmpProtein A) 세파로스 FF, 프로틴 에이 세파로스 CL-4B 및 엔프로틴 에이 세파로스 4 FF(이상, 지이 헬스케어(GE Healthcare)로부터 시판); 프로셉 에이(ProSep A), 프로셉-브이에이 하이 커패시티(ProSep-vA High Capacity), 프로셉-브이에이 울트라(ProSep-vA Ultra) 및 프로셉-브이에이 울트라 플러스(ProSep-Va Ultra Plus)(이상, 밀리포어(Millipore)로부터 시판); 포로스 에이(Poros A) 및 맵캡처 에이(Mabcapture A)(이상, 포로스(Poros)로부터 시판); IPA-300, IPA-400 및 IPA-500(이상, 레플리젠 코포레이션(RepliGen Corp.)으로부터 시판); 애피겔(Affigel) 프로틴 에이 및 애피프렙(Affiprep) 프로틴 에이(이상, 바이오-래드(Bio-Rad)로부터 시판); 프로틴 에이 세라믹 하이퍼 디에프(Protein A Ceramic Hyper D F)(폴 코포레이션(Pall Corporation)으로부터 시판); 울트라링크 임모빌라이즈드 프로틴 에이(Ultralink Immobilized protein A) 및 아가로스 프로틴 에이(Agarose protein A)(이상, 피어스(PIERCE)로부터 시판); 및 프로틴 에이 셀쓰루 300(Protein A Cellthru 300) 및 프로틴 에이 울트라플로우(Protein A Ultraflow)(이상, 스테로젠 바이오세퍼레이션즈(Sterogen Bioseparations)로부터 시판).
또 다른 실시양태에서, 수지는 캡처실렉트 IgG-CH1(인간 IgG 및 모든 Fab 단편의 정제에 적합), 캡처실렉트 IgG-Fc (Hu) (인간 IgG에 특이적, 모든 4종 서브클래스 인식), 캡처실렉트 LC-카파 (Hu) (모든 인간 카파 Ig 경쇄-함유 생성물의 정제에 적합(이전에는 캡처실렉트 Fab 카파로서 알려졌음)), 캡처실렉트 LC-람다 (Hu) (모든 인간 람다 Ig 경쇄-함유 생성물의 정제에 적합(이전에는 캡처실렉트 Fab 람다로서 알려졌음)), 캡처실렉트 IgG4 (Hu) (타 서브클래스 또는 종과의 어떠한 가교결합 없이 인간 IgG4에 고도로 특이적), 캡처실렉트 IgG1 (Hu) (타 서브클래스 또는 종과의 어떠한 가교결합 없이 인간 IgG1에 고도로 특이적), 캡처실렉트 IgG3 (Hu) (타 서브클래스 또는 종과의 어떠한 가교결합 없이 인간 IgG3에 고도로 특이적), 캡처실렉트 IgM (인간, 마우스 및 래트 IgM에 적합한 IgM 수지), 또는 캡처실렉트 IgA (인간 IgA, IgA-다이머 및 분비성 IgA(sIgA)의 정제에 적합)이며, 이들 모두는 BAC로부터 시판되고 있다. 또 다른 실시양태에서, 수지는 아이지실렉트 (인간 IgG의 정제용 친화성 매질), 카파실렉트 (Fab (카파) 단편의 정제용 친화성 매질), 람다에프에이비실렉트 (람다 Fab 단편의 정제용 친화성 매질), 또는 캡토 엘 (항체 및 항체 단편 포획용 수지)이며, 이들 모두는 지이 헬스케어 라이프 사이언시즈(GE Healthcare Life Sciences)로부터 시판되고 있다.
본 발명에 채용될 수 있는 추가의 친화성 크로마토그래피 시스템은 예를 들어, 단백질 G, 단백질 A/G 및 단백질 L 칼럼을 포함하며, 그들 각각은 또한 당기술분야에 확립된 결합 특성을 보유한 면역글로불린-결합 박테리아 단백질이다. 따라서, 단백질 G 매트릭스, 단백질 A/G 매트릭스 또는 단백질 L 매트릭스인 AC 매트릭스는 항체, 항체 단편, 또는 Fc 영역을 포함하는 단백질(예를 들어, Fc 융합 단백질)의 정제에 사용될 수 있다.
AC 매트릭스, 및 그들 AC 매트릭스가 정제에 효과적인 단백질 유형의 그 밖의 비-제한적인 예로는 다음의 것들이 포함된다: 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC) 칼럼(금속 이온에 대한 친화도를 보유한 단백질, 예컨대 히스티딘-태그 단백질의 정제용), 캘모둘린 수지 칼럼(캘모둘린 결합 펩티드(CBP)로 태그된 단백질의 정제용), 멥 하이퍼셀TM 칼럼(면역글로불린에 선택적으로 결합하는 셀룰로스 매트릭스), 말토스 결합 단백질(MBP)에 결합하는 칼럼(예컨대, MBP로 태그된 단백질에 선택적으로 결합하는 덱스트린 세파로스TM 수지), 글루타치온-S-트랜스페라제(GST)에 결합하는 칼럼(예컨대, GST로 태그된 단백질에 선택적으로 결합하는 글루타치온 세파로스TM 수지) 및 스트렙-태그 II에 결합하는 칼럼(예컨대, 스트렙-태그 II로 태그된 단백질에 선택적으로 결합하는 스트렙-택틴(Strep-Tactin)TM 세파로스 수지). 또한, 고체상에 부착되는 표적으로서 항체를 포함하는 면역친화성 매트릭스는 고체상에 부착된 항체에 특이적으로 결합하는 관심 항원의 정제에 사용될 수 있다.
관심 발명은 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 특히 항체의 정제와 관련하여 본원에 기재되지만, 임의의 단백질(융합 단백질 포함)이 당기술분야에서 특정 AC 매트릭스에 선택적으로 결합하는 것으로 알려져 있는 한, 그 단백질은 본원 기재의 세척 방법을 사용하는 정제에 잘 부합한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 완전 항체 및 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 단편"("항원-결합 부분"으로도 알려져 있음)) 또는 그들의 단일쇄를 포함한다. 완전 항체는 디술피드 결합에 의하여 상호연결된 적어도 두 개의 중(H)쇄 및 두 개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 "VH"로 약칭)과 중쇄 불변 영역을 포함하여 이루어져 있다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인 CH1, CH2와 CH3을 포함하여 이루어져 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서는 "VL"로 약칭)과 경쇄 불변 영역을 포함하여 이루어져 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL을 포함하여 이루어져 있다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라 불리는 좀더 많이 보존되어 있는 영역이 점재한, 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 초가변성의 영역으로 좀더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL는, 아미노-말단에서 카르복시-말단 방향으로 다음과 같은 순서로 배열되어 있는, 세 개의 CDR과 네 개의 FR로 이루어져 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포)와 고전적인 보체 시스템의 제1 성분(Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에로의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 용어 "항체"는 또한 항체의 멀티머 형태, 예컨대 미니바디, 비스-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 화학적으로 접합된 Fab' 멀티머도 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항체 단편"("항원-결합 단편" 또는 "항원-결합 부분"으로도 호칭)는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1종 이상의 단편을 언급한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 용어 "항원-결합 단편"내에 포함되는 결합 단편의 예는 다음의 것들을 포함한다: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편, Fab 단편; (ii) 본질적으로 힌지 영역의 부분이 있는 Fab인 2가 단편, F(ab')2 단편(문헌 [FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3rd ed. 1993)] 참조); (iv) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (vi) VH 도메인으로 이루어져 있는 dAb 단편(문헌 [Ward et al ., (1989) Nature 341:544-546]); (vii) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (viii) 단일 가변 도메인과 두 개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역인 나노바디(단일-도메인 항체(sdAb)로도 알려져 있음). 단일-도메인 항체는 VHH 단편(낙타과의 동물에서 발견되는 중쇄 항체로부터 조작된 단일-도메인 항체), 및 VNAR 단편(연골 어류의 중쇄 항체로부터 수득된 단일-도메인 항체(IgNAR, '이뮤노글로불린 뉴 안티젠 리셉터(immunoglobulin new antigen receptor))을 포함한다.
또한, 비록 Fv 단편의 두 개의 도메인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 두 도메인은 그들을 VL 및 VH 영역이 한 쌍이 되어 1가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로 알려져 있음; 예를 들어, 문헌 [Bird et al . (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al . (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883] 참조)를 형성하는 단일 단백질 쇄로 만들어지게 해 주는 합성 링커에 의하여 재조합 방법을 사용하여 결합시킬 수 있다. 그러한 단일쇄 항체 역시도 항체의 용어 "항원-결합 단편"내에 포함시키고자 한다. 이들 항체 단편은 당업자에 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 무손상 항체에서와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 또 다른 폴리펩티드 또는 분자에 융합된, 항원 결합 도메인 또는 등가물을 포함하는 키메라 분자 (또는 융합 분자) 역시도 본 발명에 의해 포함된다.
본 발명의 세척 용액은 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 아르기닌은 천연 아미노산 아르기닌(예를 들어, L-아르기닌), D-아르기닌 또는 아르기닌 유도체일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아르기닌 유도체"란 아르기닌의 양쪽성(zwitterionic, amphiprotic 또는 dipolar) 특성을 보유하는 (예를 들어, 수지 골격, 단백질 A 리간드 또는 결합된 표적 단백질에 결합한 불순물간의 비-특이적 상호작용을 파괴할 수 있는) 화학적 또는 물리적 과정에 의하여 D형 또는 L형의 아미노산 아르기닌으로부터 유래되는 분자를 언급한다.
아르기닌 유도체의 비-제한적인 예로는 아실화 아르기닌, 예컨대 아세틸 아르기닌과 N-알파-부티로일-아르기닌, 아그마틴, 아르긴산 및 N-알파-피발로일 아르기닌이 포함된다. 아르기닌 또는 아르기닌 유도체는 산 부가염의 형태로 사용될 수 있다. 산 부가염을 형성할 수 있는 산의 예로는 염산 등이 포함된다. 그 밖의 유도체로는 3-구아니디노프로피온산, 4-구아니디노부티르산, L-2-아미노-3-구아니디노프로피온산 히드로클로리드, L-2-아미노-3-구아니디노프로피온산 히드로클로리드, N ω 니트로-L-아르기닌 벤질 에스테르 p-톨루엔술포네이트 염 및 호모아르기닌을 포함하며 그들에 한정되지 않는다.
세척 용액중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 전형적으로 0.05 내지 0.85 M(20℃ 수중 아르기닌의 높은 쪽 용해도임)(예를 들어, 0.05 M, 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3 M, 0.35 M, 0.4 M, 0.45 M, 0.5 M, 0.55 M, 0.6 M, 0.65 M, 0.7 M, 0.75 M, 0.8 M 또는 0.85 M), 가장 바람직하게는 0.1 내지 0.5 M(예를 들어, 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3 M, 0.35 M, 0.4 M, 0.45 M 또는 0.5 M)이다. 다양한 실시양태에서, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 예를 들어, 0.05 M, 0.1 M, 0.2M, 0.25M, 0.3M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7M 또는 0.8M이거나, 또는 0.1 M 내지 0.5 M일 수 있다. 특정 실시양태에서, 세척 용액중 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 0.25 M 이상이다. 특정 실시양태에서, 아르기닌은 0.1 M 또는 약 0.1 M, 0.25 M 또는 약 0.25 M, 또는 0.5 M 또는 약 0.5 M의 농도로 존재한다.
비록 본 발명이 친화성 크로마토그래피 진행중 세척 단계와 관련하여 본원에 기재되고 있지만, 친화성 크로마토그래피 매트릭스로부터 관심 단백질의 정제를 달성하기 위하여 세척 단계 전후 모두 부가적인 단계가 수행됨이 통상적인 기술을 보유한 자에게는 쉽사리 자명해질 것이다. 예를 들어, 세척 및/또는 용리 단계에 앞서서, 본 발명의 방법은 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 평형화시키는 평형 단계, 및/또는 관심 단백질을 함유하는 생화학적 혼합물(예를 들어, 세포 수확물)이 AC 매트릭스에 적용되는 로딩 또는 포획 단계를 포함할 수 있다.
적합한 평형 완충제는 일반적으로 침전 방지를 위하여 로딩 용액(대략 7.0±0.5)과 매치되도록 대략 중성 pH를 갖는다. 보통은 염(NaCl)을 함유할 필요는 없고, 완충제(이러한 pH 범위에 대해 포스페이트)를 완충하기에 꼭 맞는 충분한 고농도(> 약 20 mM)로 함유하면 된다. 평형 완충제에 대한 적합한 조건은 AC 매트릭스의 성질 및 정제하고자 하는 관심 단백질에 따라 변동될 것이며, 통상적인 기술을 보유한 자라면 당기술분야에 확립된 방법 및 정보를 이용하여 그러한 조건을 쉽사리 결정할 수 있다. 단백질 A 칼럼 상에서 항체의 정제를 위한 평형 완충제의 비-제한적인 예는 실시예 섹션에 기재되어 있다.
부가적으로, 전술한 바의 세척 단계 후, 본 발명의 방법은 용리 완충제를 친화성 크로마토그래피 매트릭스에 적용하여 매트릭스로부터 관심 단백질을 용리시키는 용리 단계를 포함할 수 있다. 용리 완충제에 대한 적합한 조건은 AC 매트릭스의 성질 및 정제하고자 하는 관심 단백질에 따라 변동될 것이며, 통상적인 기술을 보유한 자라면 당기술분야에 확립된 방법 및 정보를 이용하여 그러한 조건을 쉽사리 결정할 수 있다. 전형적으로, AC 매트릭스로부터 관심 단백질의 용리는 산성 pH에서 수행된다. 단백질 A 칼럼 상에서 항체의 정제를 위한 용리 완충제의 비-제한적인 예는 실시예 섹션에 기재되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 또는 다른 Fc-함유 단백질의 단백질 A 정제 진행중 항체-함유 혼합물로부터 불순물을 제거하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은:
(a) 항체, 항체 단편 또는 단백질을 포함하는 혼합물을 단백질 A 칼럼 상에 로딩하는 단계;
(b) 8.0 초과의 pH(예를 들어, 8.1 초과의 pH, 바람직하게는 8.5 초과의 pH, 더 바람직하게는 약 8.5 내지 9.5 또는 약 8.9 내지 9.0)에서, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 용액으로 단백질 A 칼럼을 세척하는 단계; 및
(c) 단백질 A 칼럼으로부터 항체, 항체 단편 또는 단백질을 용리시키는 단계를 포함하며, 여기서 세척은 비-완충염의 부재하에 수행하는 것인, 단백질 A 칼럼을 사용하여 정제된 항체, 항체 단편, 또는 Fc 영역을 포함하는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 임의로는, 방법은 단백질 A 칼럼으로부터 항체 또는 항체 단편의 용리에 앞서 평형 완충제로 단백질 A 칼럼을 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 임의로는, 방법은 관심 단백질의 로딩에 앞서 및/또는 관심 단백질의 용리에 앞서 단백질 A 칼럼을 평형화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
아르기닌 (및 아르기닌 유도체)에 대한 바람직한 농도 및 농도 범위는 전술한 바와 같다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 아르기닌은 약 0.25 M의 농도 또는 0.25 M의 농도로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 아르기닌은 0.1 내지 0.5 M 범위의 농도로 존재한다. 바람직한 pH 및 pH 범위 또한 전술한 바와 같다. 예를 들어, pH는 8.0 초과의 pH(예를 들어, 바람직하게는 8.1 초과의 pH, 더 바람직하게는 8.5 초과의 pH, 예를 들어 약 8.5 내지 9.5 또는 약 8.9 내지 9.0)이다.
본 발명은 하기 실시예로 좀더 상세히 설명되며, 추가 제한으로서 해석되어서는 아니된다. 특히, 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 것이다. 본 출원 전역에 걸쳐서 인용되고 있는 모든 참조문헌, 특허 및 공개 특허출원의 내용은 명백히 그 전문이 참고로 본원에 포함된다.
실시예
실시예 1 : 고- pH 단독으로는 생성물 순도를 증가시키지 않는다
당해 실시예에서는, 친화성 크로마토그래피 진행중에 항체-함유 용액으로부터의 불순물 제거에 pH 단독이 미치는 영향이 평가된다. 구체적으로, 두 세척 용액을 비교하였다: pH 7.0에서 1 M NaCl을 함유하는 1종 및 pH 9.0에서 1 M NaCl을 함유하는 1종.
0.2 내지 3.0 g/L 모노클로날 항체 #1을 함유하는 청정화 포유동물 세포 배양 상등액을 심층 여과에 의해 수확하고 ALC 칼럼, 특히 단백질 A 칼럼(지이 헬스케어)을 사용하여 표 1에 후술된 조건에 따라 정제하였다.
Figure pct00001
평형된 칼럼에 청정화 수확물로 로딩하고 하기 표 2에 기재된 바와 같은 W1-N7(1 M NaCl, pH 7.0) 또는 W2-N9(1 M NaCl, pH 9.0)로 1차 세척하였다.
Figure pct00002
칼럼을 이어서 표 1에 기재된 바와 같은 평형 완충제(즉, 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH　7.0)로 세척한 다음, 저-pH에서 용리시켰다. 용리액을 그의 항체 농도에 대하여 분석적 ALC로, HMW/LMW에 대하여 분석적 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 및 HCP 함량에 대하여 효소-결합 면역흡착 검정으로 분석하였으며, 동일한 세포주에 대하여 전개하였다.
표 2에 나타낸 두 상이한 세척 용액을 사용한 모노클로날 항체 #1의 단백질 A 정제에 대한 %수율을 하기 표 3에 나타내었다.
Figure pct00003
표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 중성(pH 7.0)에서 염기성(pH 9.0)으로의 pH 변화는 수율, 용리액 풀(pool) 농도, HMW 또는 LMW 종 수준 또는 HCP 농도에 영향을 미치지 않았다. 그에 따라, 이들 결과는 고-pH 단독으로는 증가된 생성물 순도를 도출하지 않음을 증명해 보인다. 그러나, 하기 실시예에서 증명해 보이는 것처럼, 아르기닌과 조합한 고-pH는 생성물 순도에 현저한 영향을 미친다.
실시예 2 : 아르기닌(고- pH 와의 조합)은 핵심 부형제이다
당해 실시예에서는, 다양한 세척제의 능력을 비교하여 어떤 세척제 및 pH가 친화성 크로마토그래피 진행중 항체-함유 용액으로부터의 불순물 제거에 가장 효과적인지를 측정하였다. 구체적으로, 4종 세척 용액을 비교하였다: pH 7.0에서 1 M NaCl을 함유하는 1종, pH 7.0에서 250 mM 아르기닌을 함유하는 1종, pH 8.9에서 250 mM 아르기닌을 함유하는 1종, 및 pH 8.9에서 500 mM 트리스를 함유하는 1종. 트리스를 포함시켜 트리스 단독으로 불순물 제거에 영향을 미치는지를 측정하였다.
0.2 내지 2.5 g/L 모노클로날 항체 #3을 함유하는 청정화 포유동물 세포 배양 상등액을 심층 여과에 의하여 수확하고 ALC 칼럼, 특히 단백질 A 칼럼(지이 헬스케어)을 사용하여 표 4에 후술된 조건에 따라 정제하였다.
Figure pct00004
평형된 칼럼에 청정화 수확물로 로딩하고, 하기 표 5에 기재된 바와 같은 W1-N7, W3-Arg7, W4-Arg9 또는 W5-T9로 1차 세척하였다.
Figure pct00005
칼럼을 이어서 표 4에 기재된 바와 같은 평형 완충제(즉, 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH　7.0)로 세척한 다음, 저-pH에서 용리시켰다. 용리액을 그의 항체 농도에 대하여 분석적 ALC로, HMW/LMW에 대하여 분석적 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 및 HCP 함량에 대하여 효소-결합 면역흡착 검정으로 분석하였으며, 동일한 세포주에 대하여 전개하였다.
표 5에 나타낸 4종의 상이한 세척 용액을 사용한 모노클로날 항체 #3의 단백질 A 정제에 대한 %수율을 하기 표 6에 나타내었다.
Figure pct00006
표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 아르기닌-기재 완충제가 고염(high salt)-기재 세척제보다 HMWs, LMWs 및 HCP의 제거에 좀더 효율적임이 분명하다. 또한, 이러한 효과는 고-pH 조건에서 증폭되었다. 구체적으로, 7.0의 pH에서의 아르기닌-함유 세척 완충제(W3-Arg7)와 비교하여, 비-완충염의 부재하에 8.9의 고-pH에서의 아르기닌-함유 세척 완충제(W4-Arg9)의 사용은 HCP의 3배 감소, LMW 수준의 4배 감소, 및 2.3%에서 1.5%로 응집체 수준의 감소를 가져왔다. 필적하는 수율에도 불구하고, 좀더 높은 pH는 또한 풀 농도를 증가시켰다.
트리스를 사용하여 아르기닌-함유 완충제중의 pH를 조정하고 8.9의 pH를 달성하기 위해서는 300 mM에 가까운 트리스가 요구되므로, 고-pH에서 500 mM 트리스를 함유하는 세척제(즉, W5-T9)를 포함시켰다. 그러나, 표 6에서 알 수 있듯이, W5-T9은 HMWs 또는 LMWs의 제거에 효과가 없었다. 사실, HCP 수준은 NaCl-함유 세척제에 대해서보다는 W5-T9에 대해서 한층 더 높았다. 당해 세척이 트리스에 대한 최고의 조건에서 수행된다고 가정하면(예를 들어, 타 완충제에 사용된 최고 농도와 비교하여 거의 2배에 달하는 트리스 농도 및 세척 시간의 2배 증가를 의미함), 결과는 트리스 단독으로는 세척 효과가 없음을 시사한다. 또한, 고-pH 단독으로는 목적하는 불순물 제거를 도출하지 못한다는 것이 분명하다.
실시예 3: 고- pH 와 조합한 아르기닌 세척은 불순물을 현저히 감소시킨다
당해 실시예에서는, 3가지 상이한 세척 완충제 조건이 3종 모노클로날 항체의 순도에 미치는 영향을 평가한다. 구체적으로, 3종 세척 용액을 비교하였다: (1) 저-pH(W6-Ace5), (2) 고염(W1-N7), 및 (3) 고-pH에서의 아르기닌(W7-Arg9).
3종 모노클로날 항체(#1, #2, 및 #4)를 심층 여과에 의하여 수확하고 ALC 칼럼, 특히 단백질 A 칼럼(지이 헬스케어)을 사용하여 표 7에 후술된 조건에 따라 정제하였다.
Figure pct00007
평형된 칼럼에 청정화 수확물로 로딩하고 하기 표 8에 기재된 바와 같이 1차 세척하였다.
Figure pct00008
칼럼을 이어서 표 7에 기재된 바와 같은 평형 완충제(즉, 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH　7.0)로 세척한 다음, 저-pH에서 용리시켰다. 용리액을 그의 항체 농도에 대하여 분석적 ALC로, HMW/LMW에 대하여 분석적 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 및 HCP 함량에 대하여 효소-결합 면역흡착 검정으로 분석하였으며, 동일한 세포주에 대하여 전개하였다.
항체 수율, 용리액 풀 농도, HCP 수준 및 HMW 수준으로 평가한, 상이한 ALC 세척 완충제 조건이 용리액 중 3종 모노클로날 항체의 순도에 미치는 영향을 표 9에 요약하였다.
Figure pct00009
표 9에서 알 수 있듯이, 저-pH(W6-Ace5)로의 세척은 84.5 내지 94.8%의 수율(평균: 90.7%)을 도출하였고, 고염(W1-N7)으로의 세척은 98.7%의 평균 수율(97.6 내지 100%)을 도출하였다. 고-pH에서의 아르기닌(W7-Arg9)으로의 세척은 모든 3가지 세척제중 최고 수율을 도출하였으며, 평균 97.2% 수율을 보였다(94.1 내지 98.8%).
용리액 농도는 상이한 항체를 가지고 행한 ALC 동안 적용된 상이한 세척 완충제 비교시 뚜렷한 경향을 보이지 않았다. 전반적으로, 필적하는 범위가 발견되었으며, 어떠한 세척제도 일관되게 최저 또는 최고 농도를 도출하지 않았다.
불순물 제거와 관련하여, 3종 세척 완충제간에는 일반적인 순위가 확립될 수 있다. 최저 HCP 감소는 저-pH 세척제(W6-Ace5)로 일관되게 수득되었고, 고염 세척제(W1-N7)가 그 뒤를 이었다. 최고 불순물 제거는 아르기닌, 고-pH 9.0 세척제(W7-Arg9)로 수득되었다. 구체적으로, 제거의 로그 차수(logarithmic order)로 환산하여, 저-pH 세척제(W6-Ace5)로의 세척 후 1.3 로그의 평균이 수득되었고, 고염 세척제(W1-N7)로의 세척 후 1.6 로그가 수득되었으며, 아르기닌, 고-pH 9.0 세척제(W7-Arg9)로의 세척 후 1.9 로그의 최고 제거가 달성되었다.
HMW 수준과 관련하여, 이들 수준은 3종의 상이한 모노클로날 항체에 대하여 이질적이었고, HMWs의 제거는 모노클로날 항체-의존성이었다. 종합적으로, 저-pH 세척제(W6-Ace5)는 HMW 수준 감소에 있어서 최소 유효 세척 용액이었다. 고염 세척제(W1-N7)로는 좀더 양호한 결과가 수득되었다. 그러나, ALC 용리액에서의 최저 HMW 값은 아르기닌, 고-pH 9.0 세척제(W7-Arg9)로 일관되게 발견되었다. 두 모노클로날 항체가 고-pH 9.0 세척제(W7-Arg9)와 비교하여 저-pH 세척제(W6-Ace5)로부터 HMWs에 있어서 각각 3.1 또는 3.9배 감소하는 반응을 나타낸 반면에, 모노클로날 항체 #2은 미미한 감소를 보였을 뿐이다.
요약하면, 당해 실시예는 아르기닌과 고-pH의 신규 조합이, 수율, 풀 농도, HCP 풀 함량 및 HMW 풀 수준으로 측정시, 표준 세척 완충제에 비하여 항체 순도와 농도를 현저히 향상시킴을 입증해 보인다. 아르기닌과 고-pH의 특이적 조합으로의 세척은 생성물 손실을 최소화하면서 동시에 좀더 높은 생성물 순도와 좀더 높은 용리액 농도를 도출하였다. 또한, HCP 및 HMW 수준의 감소는 후속 하류 처리 단계에 과해지는 부담을 덜어주고, 품질과 채산성의 견지에서 전과정 성능을 증대시킨다. 부가적으로, HCP 또는 HMW 종과 같은 임의의 오염물은 추가적인 생성물 응집을 위한 핵으로 작용할 수 있으므로, 포획 단계 진행중에 그들의 감소는 불순물-관련 응집 과정을 둔화시킬 것이다.

Claims (16)

  1. 8.0 초과의 pH에서 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 용액으로 친화성 크로마토그래피(AC) 매트릭스를 세척하는 단계를 포함하며, 여기서 세척은 비-완충염의 부재하에 수행하는 것인,
    관심 단백질이 결합되는 AC 매트릭스를 사용하여 정제된 관심 단백질을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 관심 단백질을 포함하는 혼합물을 AC 매트릭스 상에 로딩하는 단계;
    (b) 8.0 초과의 pH에서 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 용액으로 AC 매트릭스를 세척하는 단계; 및
    (c) AC 매트릭스로부터 관심 단백질을 용리시키는 단계
    를 포함하며, 여기서 세척은 비-완충염의 부재하에 수행하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 관심 단백질이 항체, 항체 단편, 또는 Fc 융합 단백질인 방법.
  4. 제3항에 있어서, AC 매트릭스가 단백질 A 칼럼인 방법.
  5. (a) 항체, 항체 단편, 또는 Fc 융합 단백질을 포함하는 혼합물을 단백질 A 칼럼 상에 로딩하는 단계;
    (b) 8.0 초과의 pH에서 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 용액으로 단백질 A 칼럼을 세척하는 단계; 및
    (c) 단백질 A 칼럼으로부터 항체, 항체 단편, 또는 Fc 융합 단백질을 용리시키는 단계
    를 포함하며, 여기서 세척은 비-완충염의 부재하에 수행하는 것인,
    단백질 A 칼럼을 사용하여 정제된 항체, 항체 단편, 또는 Fc 융합 단백질을 생산하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 항체, 항체 단편, 또는 Fc 융합 단백질을 단백질 A 칼럼에 로딩하고/하거나 단백질 A 칼럼으로부터 용리시키기에 앞서 평형 완충제로 단백질 A 칼럼을 평형화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 8.5 초과인 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 약 8.5 내지 9.5인 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 약 8.9 내지 9.0인 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 9.0 또는 약 9.0인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌 유도체가 아세틸 아르기닌, 아그마틴, 아르긴산, N-알파-부티로일-L-아르기닌 및 N-알파-피발로일 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌이 0.1 내지 0.5 M 범위의 농도로 존재하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 아르기닌이 0.25 M 또는 약 0.25 M의 농도로 존재하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액이 아르기닌-HCl을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액이 고-분자량(HMW) 종, 숙주 세포 단백질(HCP), 및 저-분자량(LMW) 종으로 이루어진 군으로부터 선택된 불순물을 제거하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 용액이 1종 이상의 완충염을 포함하는 것인 방법.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2784278C (en) * 2009-12-18 2019-02-26 Novartis Ag Wash solution and method for affinity chromatography
WO2015103545A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 Bio-Rad Laboratories, Inc. Removal of impurities from protein a eluates
WO2016031932A1 (ja) * 2014-08-27 2016-03-03 田辺三菱製薬株式会社 アルカリ洗浄によるＦｃ領域を有するタンパク質の製造方法
CN105566442A (zh) * 2014-10-11 2016-05-11 江苏泰康生物医药有限公司 一种降低单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化工艺
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
BR112017018365A2 (pt) 2015-03-13 2018-04-10 Bristol-Myers Squibb Company uso de lavagens alcalinas durante cromatografia para remoção de impurezas
PL3337817T3 (pl) * 2015-08-21 2022-01-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposób zmniejszania zawartości białek komórek gospodarza w chromatografii powinowactwa
EP3353547A1 (en) 2015-09-22 2018-08-01 Delta TM Technologies Designing customized protein-specific buffer systems
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
JP7106187B2 (ja) 2016-05-11 2022-07-26 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックスを保存する方法
CN109311948B (zh) 2016-05-11 2022-09-16 思拓凡生物工艺研发有限公司 清洁和/或消毒分离基质的方法
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
ES2874974T3 (es) 2016-05-11 2021-11-05 Cytiva Bioprocess R & D Ab Matriz de separación
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
WO2018212556A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Cj Healthcare Corporation A method for purifying an antibody or an antibody fragment thereof using affinity chromatography
EP3769083A1 (en) 2018-03-21 2021-01-27 Waters Technologies Corporation Non-antibody high-affinity-based sample preparation, sorbents, devices and methods

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090064377A (ko) * 2006-09-08 2009-06-18 와이어쓰 친화성 크로마토그래피를 사용하는 단백질 정제에 있어서 아르기닌 세척

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01238534A (ja) * 1988-03-17 1989-09-22 Mitsui Toatsu Chem Inc エンドトキシンの除去方法
ATE421536T1 (de) 2001-06-05 2009-02-15 Genetics Inst Llc Verfahren zur reinigung stark anionischer proteine
WO2004037203A2 (en) * 2002-10-24 2004-05-06 Enos Pharmaceuticals, Inc. Sustained release l-arginine formulations and methods of manufacture and use
US8084032B2 (en) * 2004-01-21 2011-12-27 Ajinomoto Co., Inc. Purification method which prevents denaturation of an antibody
DE602006003108D1 (de) 2005-03-03 2008-11-27 Ajinomoto Kk Methode zur Verbesserung der Ausbeute bei der Proteinreinigung mittels Gelfiltrationschromatographie und Arginin
CA2784278C (en) * 2009-12-18 2019-02-26 Novartis Ag Wash solution and method for affinity chromatography
DK2526114T3 (da) * 2010-01-22 2014-09-29 Boehringer Ingelheim Int Kromatografisk fremgangsmåde til oprensning af FC-indeholdende proteiner

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090064377A (ko) * 2006-09-08 2009-06-18 와이어쓰 친화성 크로마토그래피를 사용하는 단백질 정제에 있어서 아르기닌 세척
JP2010502737A (ja) * 2006-09-08 2010-01-28 ワイス エルエルシー アフィニティークロマトグラフィーを使用するタンパク質精製におけるアルギニン洗浄

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anal Biochem.,345(2):250-257(2005.10.15.) *
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.,856(1-2):343-347(2007.6.29.) *
Protein Expression and Purification.,63(2):158-163(2009.2.) *

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WO2012164046A1 (en) 2012-12-06

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