JP2014515389A - アフィニティクロマトグラフィーのための、洗浄溶液および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
アフィニティクロマトグラフィーの間に、宿主細胞タンパク質(HCP)ならびに高分子量種(HMW)および低分子量種(LMW)等の生成物関連不純物を含む不純物を効率的に除去することは、タンパク質の下流処理中の重要な因子である。第一の精製工程(「捕捉工程」)の後のタンパク質の純度は、特に、精製された生成物を生成するために必要な後続の工程の種類および数に影響を与える。捕捉工程もまた、生成物を濃縮し、その後の精製工程における、比例してより小さく、コストがより低くなるコストのカラムの使用を可能にするため、重要である。したがって、第一のクロマトグラフィー工程の間に、不純物の除去を最適化することが重要である。抗体精製の場合において、この第一の工程は、典型的には、プロテインAまたは誘導体に対する親和性に基づいている。
本発明は、アフィニティクロマトグラフィーのための効率的かつロバストな洗浄溶液、および、この溶液を用いる洗浄方法を提供する。この洗浄溶液は、溶出工程の前の洗浄工程において適用され、その使用によって、マトリックスへ適用される出発物質から低分子量種(LMW)、高分子量種(HMW)および宿主細胞タンパク質(HCP)を効果的に除去する一方、アフィニティマトリックスから溶出した目的のタンパク質の高収率をもたらす。この洗浄溶液は、非緩衝塩が存在せず、高いpH、即ち8.0より高いpHでアルギニンが存在することを特徴とする。高いpHでのアルギニン(またはアルギニン誘導体)の組合せは、より低いpHのアルギニン含有洗浄溶液より、顕著に多くの不純物を除去し、目的の回収されたタンパク質の高濃度と相関する、より鋭い溶出ピークをもたらす。
本発明は、プロテインAクロマトグラフィー等のアフィニティクロマトグラフィーのための改良された洗浄溶液を提供し、これを、不純物を除去するために、目的のタンパク質の溶出の前に、カラムに適用する。改良された洗浄溶液は、非緩衝塩の存在なしで、8.0より高いpH(例えば、8.1より高いpH、好ましくは8.5より高いpH、例えば、約8.5〜9.5または約8.9〜9.0の間)でアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む。典型的に、洗浄溶液は水溶液である。
(a)抗体、抗体断片またはタンパク質を含む混合物を、プロテインAカラム上に添加することと、
(b)8.0より高いpH(例えば、8.1より高いpH、好ましくは8.5より高いpH、より好ましくは約8.5〜9.5または約8.9〜9.0の間)のアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む洗浄溶液を用いて、プロテインAカラムを洗浄することと、
(c)プロテインAカラムから、抗体、抗体断片、またはタンパク質を溶出することとを含み、洗浄は、非緩衝塩の存在なしで行われる。必要に応じて、その方法は、プロテインAカラムから抗体、または抗体断片を溶出する前に、平衡化緩衝液を用いて、プロテインAカラムを洗浄することを更に含む。必要に応じて、その方法は、目的のタンパク質を添加する前および/または目的のタンパク質を溶出する前に、プロテインAカラムを平衡化することを更に含む。
本実施例において、アフィニティクロマトグラフィーの間の抗体含有溶液からの不純物の除去に対するpH単独の影響を評価する。具体的には、2つの洗浄溶液を比較する:1つは、pH7.0で1MのNaClを含有し、1つはpH9.0で1MのNaClを含有する。
この実施例において、アフィニティクロマトグラフィーの間に、どの洗浄およびpHが、抗体含有溶液から不純物を除去するのに最も効果的であるかを決定するために、様々な洗浄能力を比較する。具体的には、4つの洗浄溶液を比較する:1つは、pH7.0で1MのNaClを含有、1つはpH7.0で250mMのアルギニンを含有、1つはpH8.9で250mMのアルギニンを含有、1つはpH8.9で500mMのトリスを含有する。トリスは、トリス単独で不純物の除去に影響を有するかどうかを判断するために含める。
本実施例において、3つのモノクローナル抗体の純度への3つの異なる洗浄緩衝液条件の影響を評価する。具体的には、3つの洗浄溶液を比較する:(1)低いpH(W6−Ace5)、(2)高い塩(W1−N7)、(3)および高いpHでのアルギニン(W7−Arg9)。
Claims (16)
- 目的のタンパク質が結合するアフィニティクロマトグラフィー(AC)マトリックスを使用して、精製した目的のタンパク質を生成する方法であって、8.0より高いpHのアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む洗浄溶液を用いて、ACマトリックスを洗浄することを含み、洗浄を非緩衝塩の存在なしで行う、方法。
- a)目的のタンパク質を含む混合物をACマトリックスへ添加することと、
b)8.0より高いpHのアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む洗浄溶液を用いて、ACマトリックスを洗浄することと、
c)ACマトリックスから目的のタンパク質を溶出することと
を含み、洗浄を非緩衝塩の存在なしで行う、請求項1に記載の方法。 - 目的のタンパク質が、抗体、抗体断片、またはFc融合タンパク質である、請求項1または2に記載の方法。
- ACマトリックスがプロテインAカラムである、請求項3に記載の方法。
- プロテインAカラムを用いて、精製した抗体、抗体断片、またはFc融合タンパク質を生成する方法であって、
a.抗体、抗体断片、またはFc融合タンパク質を含む混合物をプロテインAカラム上に添加することと、
b.8.0より高いpHのアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む洗浄溶液を用いて、プロテインAカラムを洗浄することと、
c.プロテインAカラムから、抗体、抗体断片、またはFc融合タンパク質を溶出することと
を含み、洗浄を非緩衝塩の存在なしで行う、方法。 - プロテインAカラムに抗体、抗体断片、またはFc融合タンパク質を添加する前、および/または、プロテインAカラムから抗体、抗体断片、またはFc融合タンパク質を溶出する前に、平衡緩衝液を用いて、プロテインAカラムを平衡化することを更に含む、請求項5に記載の方法。
- pHが8.5より高い、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- pHが約8.5〜9.5である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- pHが約8.9〜9.0である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- pHが9.0または約9.0である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- アルギニン誘導体が、アセチルアルギニン、アグマチン、アルギン酸、N−α−ブチロイル−L−アルギミン、およびN−α−ピバロイルアルギミンから成る群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- アルギニンが、0.1〜0.5Mの範囲の濃度で存在する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- アルギニンが、または約0.25Mの濃度で存在する、請求項12に記載の方法。
- 洗浄溶液が、アルギニン−HClを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 洗浄溶液が、高分子量(HMW)種、宿主細胞タンパク質(HCP)、および低分子量(LMW)種から成る群から選択される不純物を除去する、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 洗浄溶液が、1つまたは複数の緩衝塩を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
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