KR20170125948A - 불순물을 제거하기 위한 크로마토그래피 동안의 알칼리성 세척의 용도 - Google Patents

불순물을 제거하기 위한 크로마토그래피 동안의 알칼리성 세척의 용도 Download PDF

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Abstract

특정 실시양태에서, 본 발명은 a) 관심 단백질 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 혼합물을 제1 크로마토그래피 매트릭스에 적용하는 단계이며, 여기서 관심 단백질은 제1 크로마토그래피 매트릭스에 결합하는 것인 단계; b) 적어도 9.0의 pH를 갖고 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하지 않는 제1 세척 용액과 제1 크로마토그래피 매트릭스를 접촉시키는 단계; 및 c) 제1 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리 용액으로 관심 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는, 상기 혼합물로부터 관심 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.

Description

불순물을 제거하기 위한 크로마토그래피 동안의 알칼리성 세척의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 3월 13일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/132,974에 대한 우선권을 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
단백질의 대규모의 경제적인 정제는 생물제약 산업에서 점점 중요한 문제이다. 치료 단백질은 전형적으로 관심 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드로부터 관심 단백질을 발현하도록 조작된 원핵 또는 진핵 세포주를 사용하여 생산된다. 세포에 공급된 성분 및 세포 부산물의 혼합물로부터 목적하는 단백질을, 예를 들어 인간 치료제로서 사용하기에 충분한, 적당한 순도로 분리하는 것은 생물제제 제조업체에게 엄청난 도전과제를 제기한다.
따라서, 세포 배양물로부터 단백질-기반 치료제, 예컨대 항체의 대규모 가공을 진척시키는데 사용될 수 있는 대안적 단백질 정제 방법에 대한 필요가 관련 기술분야에 존재한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 a) 관심 단백질 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 혼합물을 제1 크로마토그래피 매트릭스에 적용하는 단계이며, 여기서 관심 단백질은 제1 크로마토그래피 매트릭스에 결합하는 것인 단계; b) 적어도 9.0의 pH를 갖고 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하지 않는 제1 세척 용액과 제1 크로마토그래피 매트릭스를 접촉시키는 단계; 및 c) 제1 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리 용액으로 관심 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는, 상기 혼합물로부터 관심 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 예시를 위해, 오염물은 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 대사물, 숙주 세포 구성 단백질, 핵산, 내독소, 바이러스, 생성물 관련 오염물, 지질, 배지 첨가제 및 배지 유도체로부터 선택된다. 임의로, 제1 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피)이다. 바람직하게는, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 친화성 크로마토그래피이다. 예시를 위해, 관심 단백질은 항체, 항체 단편, 및 Fc 융합 단백질로부터 선택된다. 예시적인 관심 단백질은 항체, 예컨대 모노클로날 항체 (인간, 인간화 및 키메라 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않음)이다.
특정의 구체적 실시양태에서, 제1 세척 용액의 pH는 약 9 내지 약 11이다. 임의로, 제1 세척 용액의 pH는 약 9.5 내지 약 10.5 (예를 들어, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4 또는 10.5)이다. 제1 세척 용액의 예시적인 pH는 약 9.6이다. 제1 세척 용액의 또 다른 예시적인 pH는 약 10.4이다.
특정의 구체적 실시양태에서, 방법은, 제1 세척 용액 후, 적어도 9.0의 pH를 갖고 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하지 않는 제2 세척 용액과 제1 크로마토그래피 매트릭스를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 제1 세척 용액은 탄산나트륨을 약 0.01-1.0 M의 범위의 농도로 및 염화나트륨을 약 0.5-2 M의 범위의 농도로 포함한다. 예를 들어, 제2 세척 용액은 탄산나트륨을 약 0.01-1.0 M의 범위의 농도로 포함한다.
특정의 구체적 실시양태에서, 혼합물은 1종 이상의 추가의 크로마토그래피 매트릭스에 적용된다. 예시를 위해, 제1 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피이고, 1종 이상의 추가의 크로마토그래피 매트릭스는 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 혼합-방식 크로마토그래피로부터 선택된다. 임의로, 혼합물은 수거된 세포 배양물 유체, 세포 배양물 상청액, 및 조건화 세포 배양물 상청액, 세포 용해물, 및 정화된 벌크로부터 선택된다. 예를 들어, 세포 배양물은 포유동물 세포 배양물, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양물이다.
도 1은 표준 정제 공정 및 신규 공정의 개관을 제시한다.
도 2는 CHO-HCP의 감소에 대한 다양한 pH 세척의 효과를 제시한다.
도 3은 CHO-HCP의 감소에 대한 높은 pH 세척의 효과를 제시한다.
도 4는 CHO-DNA 수준의 클리어런스에 대한 높은 pH 세척의 효과를 제시한다.
도 5는 잔류 단백질 A 수준에 대한 높은 pH 세척의 효과를 제시한다.
도 6은 CHO-HCP 수준을 감소시키는데 있어서 대안적 공정의 효율의 비교를 제시한다.
본 발명은 친화성 크로마토그래피를 사용한 단백질 정제 동안 불순물을 제거하기 위한 고도로 효과적인, 고유한 접근법을 제공한다. 특히, 접근법은 매우 높은 pH (예를 들어, 9-11)의 알칼리성 세척 용액을 사용한다. 알칼리성 세척 용액의 또 다른 특색은 그것이 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 존재를 필요로 하지 않는다는 것이다. 알칼리성 세척 용액은 친화성 크로마토그래피 매트릭스에 적용된 공급 물질로부터 숙주 세포 단백질 (HCP)을 제거하는데 극도로 효과적이다. 하기 작업 실시예에 제시된 바와 같이, 이러한 접근법은 강건하고, 상이한 mAb 하위부류를 위해 효과적으로 사용될 수 있다. 친화성 크로마토그래피에서 이러한 세척 용액의 사용은 높은 공정 수율 및 생성물의 완전성을 유지시킨다. 또한, 접근법은 공정 효율을 증가시키고, 개발 일정을 단축시킨다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 a) 관심 단백질 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 혼합물을 제1 크로마토그래피 매트릭스에 적용하는 단계이며, 여기서 관심 단백질은 제1 크로마토그래피 매트릭스에 결합하는 것인 단계; b) 적어도 9.0의 pH를 갖고 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하지 않는 제1 세척 용액과 제1 크로마토그래피 매트릭스를 접촉시키는 단계; 및 c) 제1 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리 용액으로 관심 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는, 상기 혼합물로부터 관심 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 예시를 위해, 오염물은 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 대사물, 숙주 세포 구성 단백질, 핵산, 내독소, 바이러스, 생성물 관련 오염물, 지질, 배지 첨가제 및 배지 유도체로부터 선택된다. 임의로, 제1 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피)이다. 바람직하게는, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 친화성 크로마토그래피이다. 예시를 위해, 관심 단백질은 항체, 항체 단편, 및 Fc 융합 단백질로부터 선택된다. 예시적인 관심 단백질은 항체, 예컨대 모노클로날 항체 (인간, 인간화 및 키메라 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않음)이다.
특정의 구체적 실시양태에서, 제1 세척 용액의 pH는 약 9 내지 약 11이다. 임의로, 제1 세척 용액의 pH는 약 9.5 내지 약 10.5 (예를 들어, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4 또는 10.5)이다. 제1 세척 용액의 예시적인 pH는 약 9.6이다. 제1 세척 용액의 또 다른 예시적인 pH는 약 10.4이다.
특정의 구체적 실시양태에서, 방법은, 제1 세척 용액 후, 적어도 9.0의 pH를 갖고 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하지 않는 제2 세척 용액과 제1 크로마토그래피 매트릭스를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 임의로, 방법은, 제2 세척 용액 후, pH 약 6 내지 약 7을 갖고 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하지 않는 제3 세척 용액과 제1 크로마토그래피 매트릭스를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 제1 세척 용액은 탄산나트륨을 약 0.01-1.0 M의 범위의 농도로 및 염화나트륨을 약 0.5-2 M의 범위의 농도로 포함한다. 예를 들어, 제2 세척 용액은 탄산나트륨을 약 0.01-1.0 M의 범위의 농도로 포함한다.
특정의 구체적 실시양태에서, 혼합물은 1종 이상의 추가의 크로마토그래피 매트릭스에 적용된다. 예시를 위해, 제1 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피이고, 1종 이상의 추가의 크로마토그래피 매트릭스는 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 혼합-방식 크로마토그래피로부터 선택된다. 임의로, 혼합물은 수거된 세포 배양물 유체, 세포 배양물 상청액, 및 조건화 세포 배양물 상청액, 세포 용해물, 및 정화된 벌크로부터 선택된다. 예를 들어, 세포 배양물은 포유동물 세포 배양물, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양물이다.
I. 정의
본 개시내용을 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 본원에 달리 명확하게 제공된 경우를 제외하고는, 각각의 하기 용어는 하기 제시된 의미를 가질 것이다. 추가의 정의가 출원 전반에 걸쳐 제시된다.
본원에 사용된 용어 "관심 단백질"은 그의 가장 넓은 의미로 정제를 목적으로 하는, 혼합물 중에 존재하는, 임의의 단백질 (천연 또는 재조합)을 포함하는 것으로 사용된다. 이러한 관심 단백질은, 비제한적으로, 호르몬, 성장 인자, 시토카인, 이뮤노글로불린 (예를 들어, 항체), 및 이뮤노글로불린-유사 도메인-함유 분자 (예를 들어, 안키린 또는 피브로넥틴 도메인-함유 분자)를 포함한다.
본원에 사용된, "세포 배양물"은 액체 배지 중의 세포를 지칭한다. 임의로, 세포 배양물은 생물반응기 내에 함유된다. 세포 배양물 중 세포는 예를 들어 박테리아, 진균, 곤충, 포유동물 또는 식물을 포함한 임의의 유기체로부터의 것일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세포 배양물 중 세포는 관심 단백질 (예를 들어, 항체)을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 구축물로 형질감염된 세포를 포함한다. 적합한 액체 배지는 예를 들어 영양 배지 및 비-영양 배지를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 세포 배양물은 예를 들어 여과 또는 원심분리에 의한 정제에 적용되지 않은, 영양 배지 중의 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "정화된 벌크"는 미립자 물질이 실질적으로 제거된 혼합물을 지칭한다. 정화된 벌크는 세포 또는 세포 파편이 예를 들어 여과 또는 원심분리에 의해 실질적으로 제거된 세포 배양물, 또는 세포 용해물을 포함한다.
본원에 사용된 "생물반응기"는 그의 관련 기술분야에서 인식되는 의미를 갖고, 세포 배양물의 제어된 성장을 위해 설계된 챔버를 지칭한다. 생물반응기는 그것이 세포, 예를 들어 포유동물 세포의 배양을 위해 유용한 한 임의의 크기일 수 있다. 전형적으로, 생물반응기는 적어도 30 ml일 것이고, 적어도 1, 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,0000 리터 또는 그 초과, 또는 임의의 중간 부피일 수 있다. pH 및 온도를 포함하나 이에 제한되지는 않는 생물반응기의 내부 조건은 전형적으로 배양 기간 동안 제어된다. 적합한 생물반응기는 배양 조건 하에 배지 중에 현탁된 세포 배양물을 수용하는데 적합하고, 유리, 플라스틱 또는 금속을 포함하여, 세포 성장 및 생존율에 도움이 되는 임의의 물질로 구성 (즉, 그로 구축)될 수 있고; 물질(들)은 관심 단백질의 발현 또는 안정성을 방해해서는 안된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명을 실행하는데 사용하기에 적합한 생물반응기를 인식할 것이고, 선택할 수 있을 것이다.
본원에 사용된, "혼합물"은 관심 단백질 (정제를 목적으로 하는 것) 및 1종 이상의 오염물, 즉 불순물을 포함한다. 한 실시양태에서, 혼합물은 관심 단백질을 (자연적으로 또는 재조합적으로) 발현하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 생산된다. 이러한 혼합물은 예를 들어 세포 배양물, 세포 용해물, 및 정화된 벌크 (예를 들어, 정화된 세포 배양물 상청액)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "분리하는" 및 "정제하는"은 상호교환가능하게 사용되고, 관심 단백질 (예를 들어, 항체)을 함유하는 혼합물로부터의 오염물의 선택적 제거를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "오염물"은 그의 가장 넓은 의미로 혼합물 내의 임의의 바람직하지 않은 성분 또는 화합물을 포괄하는 것으로 사용된다. 세포 배양물, 세포 용해물 또는 정화된 벌크 (예를 들어, 정화된 세포 배양물 상청액)에서, 오염물은 예를 들어 세포 배양물 배지 중에 존재하는 숙주 세포 핵산 (예를 들어, DNA) 및 숙주 세포 단백질을 포함한다. 숙주 세포 오염물 단백질은, 비제한적으로, 숙주 세포에 의해 자연적으로 또는 재조합적으로 생산된 것, 뿐만 아니라 관심 단백질과 관련되거나 그로부터 유래된 단백질 (예를 들어, 단백질분해 단편) 및 다른 공정 관련 오염물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 오염물 침전물은 관련 기술분야-인식 수단, 예컨대 원심분리, 멸균 여과, 심층 여과 및 접선 흐름 여과를 사용하여 세포 배양물로부터 분리된다.
본원에 사용된 "원심분리"는 산업 및 실험실 세팅에서 사용되는, 원심분리에 의한 불균질 혼합물의 침강을 위해 원심력의 사용을 수반하는 공정이다. 이러한 공정은 2종의 불혼화성 액체를 분리하는데 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서, 원심분리는 비제한적으로, 세포 배양물 또는 정화된 세포 배양물 상청액 또는 포획-칼럼 포획된 용리 풀을 포함한 혼합물로부터 오염물 침전물을 제거하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "멸균 여과"는, 전형적으로 미생물 또는 작은 입자를 효과적으로 제거하기 위한 세공 크기 0.2 μm를 갖는 필터인 막 필터를 사용한 여과 방법이다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서, 멸균 여과는 비제한적으로, 세포 배양물 또는 정화된 세포 배양물 상청액 또는 포획-칼럼 포획된 용리 풀을 포함한 혼합물로부터 오염물 침전물을 제거하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "심층 여과"는 전형적으로 필터 매트릭스 내의 세공 크기의 범위로 인해 입자를 보유하도록 한 그의 설계를 특징으로 하는, 심층 필터를 사용한 여과 방법이다. 심층 필터의 용량은 전형적으로 매트릭스의 깊이, 예를 들어 10 인치 또는 20 인치, 및 이에 따른 고체 수용 용량에 의해 정해진다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서, 심층 여과는 비제한적으로, 세포 배양물 또는 정화된 세포 배양물 상청액 또는 포획-칼럼 포획된 용리 풀을 포함한 혼합물로부터 오염물 침전물을 제거하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "접선 흐름 여과"는 샘플 혼합물이 막의 상단을 가로질러 순환하는 한편 적용된 압력이 특정 용질 및 소분자가 막을 통과하도록 하는 여과 공정을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서, 접선 흐름 여과는 비제한적으로, 세포 배양물 또는 정화된 세포 배양물 상청액 또는 포획-칼럼 포획된 용리 풀을 포함한 혼합물로부터 오염물 침전물을 제거하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "크로마토그래피"는 공정의 특정한 완충 조건 하에, 용질의 특성, 예컨대 pI, 소수성, 크기 및 구조로 인해 용질을 보다 더 또는 보다 덜 강하게 흡착하거나 보유하는 흡착제를 통한 혼합물의 퍼콜레이션에 의해, 혼합물 중 관심 용질, 예를 들어 관심 단백질을 혼합물 중 다른 용질로부터 분리하는 공정을 지칭한다. 본 발명의 방법에서, 크로마토그래피는, 침전물을 비제한적으로 세포 배양물 또는 정화된 세포 배양물 상청액 또는 포획-칼럼 포획된 용리 풀을 포함한 혼합물로부터 제거한 후, 오염물을 제거하는데 사용될 수 있다.
용어 "이온-교환" 및 "이온-교환 크로마토그래피"는 관심 이온화성 용질 (예를 들어, 혼합물 중 관심 단백질)이 혼합물 중의 용질 불순물 또는 오염물보다 하전된 화합물과 더 또는 덜 비-특이적으로 상호작용하도록, pH 및 전도성의 적절한 조건 하에, 관심 용질이 고체 상 이온 교환 물질에 (예를 들어, 공유 부착에 의해) 연결된 반대로 하전된 리간드와 상호작용하는 크로마토그래피 공정을 지칭한다. 혼합물 중 오염 용질은 이온 교환 물질의 칼럼으로부터 세척될 수 있거나, 또는 관심 용질보다 더 빠르게 또는 더 느리게 수지에 결합하거나 수지로부터 배제된다. "이온-교환 크로마토그래피"는 특히 양이온 교환, 음이온 교환, 및 혼합 방식 크로마토그래피를 포함한다.
어구 "이온 교환 물질"은 음으로 하전된 (즉, 양이온 교환 수지 또는 막) 또는 양으로 하전된 (즉, 음이온 교환 수지 또는 막) 고체 상을 지칭한다. 한 실시양태에서, 전하는 하나 이상의 하전된 리간드 (또는 흡착제)를 고체 상에 부착시킴으로써, 예를 들어 공유 연결시킴으로써 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 전하는 (예를 들어, 전체 음전하를 갖는 실리카의 경우에서와 같이) 고체 상의 고유의 특성일 수 있다.
"양이온 교환 수지" 또는 "양이온 교환 막"은 음으로 하전되고, 고체 상 위로 또는 고체 상을 통해 통과하는 수용액 중 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 고체 상을 지칭한다. 양이온 교환 수지를 형성하는데 적합한 고체 상에 부착된 임의의 음으로 하전된 리간드, 예를 들어 카르복실레이트, 술포네이트 및 하기 기재된 바와 같은 다른 것이 사용될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 양이온 교환 수지는, 예를 들어 술포네이트계 기 (예를 들어, 모노S, 미니S, 공급원 15S 및 30S, SP 세파로스(SP SEPHAROSE)® 패스트 플로우, SP 세파로스® 하이 퍼포먼스 (지이 헬스케어(GE Healthcare)), 토요펄(TOYOPEARL)® SP-650S 및 SP-650M (도소(Tosoh)), 마크로-프렙(MACRO-PREP)® 하이 S (바이오라드(BioRad)), 세라믹 하이퍼D(Ceramic HyperD) S, 트리스아크릴(TRISACRYL)® M 및 LS SP 및 스페로덱스(Spherodex) LS SP (폴 테크놀로지스(Pall Technologies))); 술포에틸계 기 (예를 들어, 프락토겔(FRACTOGEL)® SE (EMD), 포로스(POROS)® S-10 및 S-20 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))); 술포프로필계 기 (예를 들어, TSK 겔 SP 5PW 및 SP-5PW-HR (도소), 포로스® HS-20, HS 50, 및 포로스® XS (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))); 술포이소부틸계 기 (예를 들어, 프락토겔® EMD SO3 - (EMD)); 술포에틸계 기 (예를 들어, SE52, SE53 및 익스프레스-이온 S(Express-Ion S) (와트만(Whatman))), 카르복시메틸계 기 (예를 들어, CM 세파로스® 패스트 플로우 (지이 헬스케어), 히드로셀(Hydrocell) CM (바이오크롬 랩스 인크.(Biochrom Labs Inc.)), 마크로-프렙® CM (바이오라드), 세라믹 하이퍼D CM, 트리스아크릴® M CM, 트리스아크릴® LS CM (폴 테크놀로지스), 매트렉스 셀루파인(Matrex CELLUFINE)® C500 및 C200 (밀리포어(Millipore)), CM52, CM32, CM23 및 익스프레스-이온 C (와트만), 토요펄® CM-650S, CM-650M 및 CM-650C (도소)); 술폰산 및 카르복실산계 기 (예를 들어, 베이커본드(BAKERBOND)® 카르복시-술폰 (제이.티. 베이커(J.T. Baker))); 카르복실산계 기 (예를 들어, WP CBX (제이.티 베이커), 다우엑스(DOWEX)® MAC-3 (다우 리퀴드 세퍼레이션즈(Dow Liquid Separations)), 앰버라이트(AMBERLITE)® 약 양이온 교환체, 다우엑스® 약 양이온 교환체, 및 다이아이온(DIAION)® 약 양이온 교환체 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 및 프락토겔® EMD COO- (EMD)); 술폰산계 기 (예를 들어, 히드로셀 SP (바이오크롬 랩스 인크.), 다우엑스® 미세 메쉬 강산 양이온 수지 (다우 리퀴드 세퍼레이션즈), 우노스피어(UNOsphere) S, WP 술포닉(WP Sulfonic) (제이.티. 베이커), 사르토바인드(SARTOBIND)® S 막 (사르토리우스(Sartorius)), 앰버라이트® 강 양이온 교환체, 다우엑스® 강 양이온 및 다이아이온® 강 양이온 교환체 (시그마-알드리치)); 및 오르토포스페이트계 기 (예를 들어, P11 (와트만))를 갖는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"음이온 교환 수지" 또는 "음이온 교환 막"은 양으로 하전된, 따라서 그에 부착된 하나 이상의 양으로 하전된 리간드를 갖는 고체 상을 지칭한다. 음이온 교환 수지를 형성하는데 적합한 고체 상에 부착된 임의의 양으로 하전된 리간드, 예컨대 4급 아미노 기가 사용될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로스, 포로스® PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 (어플라이드 바이오시스템즈), 사르토바인드® Q (사르토리우스), 모노Q, 미니Q, 공급원 15Q 및 30Q, Q, DEAE 및 ANX 세파로스® 패스트 플로우, Q 세파로스® 하이 퍼포먼스, QAE 세파덱스® 및 패스트 Q 세파로스® (지이 헬스케어), WP PEI, WP DEAM, WP QUAT (제이.티. 베이커), 히드로셀 DEAE 및 히드로셀 QA (바이오크롬 랩스 인크.), 우노스피어 Q, 마크로-프렙® DEAE 및 마크로-프렙® 하이 Q (바이오라드), 세라믹 하이퍼D Q, 세라믹 하이퍼D DEAE, 트리스아크릴® M 및 LS DEAE, 스페로덱스 LS DEAE, QMA 스페로실(SPHEROSIL)® LS, QMA 스페로실® M 및 무스탕(MUSTANG)® Q (폴 테크놀로지스), 다우엑스® 미세 메쉬 강염기 유형 I 및 유형 II 음이온 수지 및 다우엑스® 모노스퍼(MONOSPHER) E 77, 약염기 음이온 (다우 리퀴드 세퍼레이션즈), 인터셉트(INTERCEPT)® Q 막, 매트렉스 셀루파인® A200, A500, Q500, 및 Q800 (밀리포어), 프락토겔® EMD TMAE, 프락토겔® EMD DEAE 및 프락토겔® EMD DMAE (EMD), 앰버라이트® 약 강음이온 교환체 유형 I 및 II, 다우엑스® 약 및 강음이온 교환체 유형 I 및 II, 다이아이온® 약 및 강음이온 교환체 유형 I 및 II, 듀오라이트(DUOLITE)® (시그마-알드리치), TSK 겔 Q 및 DEAE 5PW 및 5PW-HR, 토요펄® 슈퍼Q-650S, 650M 및 650C, QAE-550C 및 650S, DEAE-650M 및 650C (도소), QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, 익스프레스-이온 D 및 익스프레스-이온 Q (와트만), 및 사르토바인드® Q (사르토리우스 코포레이션, 미국 뉴욕)를 포함한다.
"혼합 방식 이온 교환 수지", "혼합 방식 이온 교환 막" 또는 "혼합 방식"은 양이온성, 음이온성 및/또는 소수성 모이어티에 의해 공유 변형된 고체 상을 지칭한다. 혼합 방식 이온 교환 수지의 예는 베이커본드® ABX (제이.티. 베이커; 뉴저지주 필립스버그), 세라믹 히드록시아파타이트 유형 I 및 II 및 플루오라이드 히드록시아파타이트 (바이오라드; 캘리포니아주 허큘레스) 및 MEP 및 MBI 하이퍼셀 (폴 코포레이션; 뉴욕주 이스트 힐스)을 포함한다.
"소수성 상호작용 크로마토그래피 수지" 또는 "소수성 상호작용 크로마토그래피 막"은 페닐, 옥틸 또는 부틸 화학물질에 의해 공유 변형된 고체 상을 지칭한다. 소수성 상호작용 크로마토그래피는 단백질을 서로 분리하기 위해 소수성의 특성을 사용하는 분리 기술이다. 크로마토그래피의 이러한 유형에서, 소수성 기 예컨대, 페닐, 옥틸 또는 부틸은 고정 칼럼에 부착된다. 그의 표면에 소수성 아미노산 측쇄를 갖는 칼럼을 통과한 단백질은 칼럼 상의 소수성 기와 상호작용하고 그에 결합할 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지의 예는 (1) 부틸 FF, 부틸 HP, 옥틸 FF, 페닐 FF, 페닐 HP, 페닐 FF (high sub), 페닐 FF (low sub), 캅토 페닐 임프레스(Capto Phenyl ImpRes), 캅토 페닐 (high sub), 캅토 옥틸, 캅토 부틸임프레스, 캅토 부틸 (지이 헬스케어, 스웨덴 웁살라); (2) 토요펄® 슈퍼 부틸-550C, 토요펄® 헥실-650C, 부틸-650C, 페닐-650C, 부틸 600 M, 페닐-600M, PPG-600M, 부틸-650M, 페닐-650M, 에테르-650M, 부틸-650S, 페닐-650S, 에테르-650S, TSK겔 페닐-5PW, TSK겔 에테르-5PW (도소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience), 일본 도쿄); (3) 마크로-프렙®-부틸, 마크로-프렙®-메틸 (바이오-라드); 및 (4) 사르토바인드® 페닐 (사르토리우스 코포레이션, 미국 뉴욕주)을 포함한다.
II. 관심 단백질
특정 측면에서, 본 발명의 방법은 상업적, 실험적 또는 다른 적용에 유용한 제약상, 진단상, 농업상, 및/또는 임의의 다양한 다른 특성을 갖는 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 임의의 관심 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 또한, 관심 단백질은 치료 단백질일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 정제된 단백질은 가공 또는 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 관심 단백질은 글리코실화될 수 있다.
따라서, 본 발명은 임의의 치료 단백질, 예컨대 제약상 또는 상업상 관련 효소, 수용체, 수용체 융합 단백질, 항체 (예를 들어, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체), 항체의 항원-결합 단편, Fc 융합 단백질, 시토카인, 호르몬, 조절 인자, 성장 인자, 응고/응집 인자, 또는 항원-결합제의 생산을 위한 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 단백질의 상기 목록은 사실상 단지 예시적이고, 제한하는 언급인 것으로 의도되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 단백질이 본 발명에 따라 생산될 수 있다는 것을 알 것이고, 이러한 단백질을 생산하기 위해 본원에 개시된 방법을 사용할 수 있을 것이다.
본 발명의 한 특정한 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 정제되는 단백질은 항체이다. 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 항체 단편, 이뮤노어드헤신 및 항체-이뮤노어드헤신 키메라를 포괄하는 것으로 사용된다.
"항체 단편"은 전장 항체의 적어도 일부 및 전형적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 단일-쇄 항체 분자; 디아바디; 선형 항체; 및 조작된 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
용어 "모노클로날 항체"는 통상적인 의미로 집단을 구성하는 개별 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하도록 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는 것으로 사용된다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 이는 항원의 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시되는 다양한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적이며, 반면에 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 항체를 기재하는데 있어서 용어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되는 것으로서의 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 생산될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]; 및 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 5,571,698; 5,427,908; 5,580,717; 5,969,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 및 6,593,081에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에 기재된 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 및 "인간화" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]). 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)으로부터의 초가변 영역 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA는 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득되고 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 뮤린 가변 영역은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 연결될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762; 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
본원에 기재된 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어 인간 환자의 혈액을 포함한 다양한 공급원으로부터 단리될 수 있거나 또는 트랜스제닉 동물을 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있는 "인간" 항체를 포함한다. 이러한 트랜스제닉 동물의 예는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 갖는 KM-마우스(KM-MOUSE)® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.), 뉴저지주 프린스턴) (WO 02/43478 참조), 제노마우스(XENOMOUSE)® (아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.), 캘리포니아주 프리몬트; 예를 들어, 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584; 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재됨), 및 HUMAB-마우스(HUMAB-MOUSE)® (메다렉스, 인크.; 예를 들어, 문헌 [Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research, 20:6287-6295 (1992); Chen, J. et al., International Immunology, 5:647-656 (1993); Tuaillon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3720-3724 (1993); Choi et al., Nature Genetics, 4:117-123 (1993); Chen, J. et al., EMBO J., 12:821-830 (1993); Tuaillon et al., J. Immunol., 152:2912-2920 (1994); Taylor, L. et al., International Immunology, 6:579-591 (1994); 및 Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)]; 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 5,770,429; 및 5,545,807; 및 PCT 공개 번호 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884, WO 99/45962, 및 WO 01/14424 (Korman et al.)에 기재됨)를 포함한다. 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화 시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.
III. 관심 단백질을 함유하는 혼합물
본 발명의 방법은 관심 단백질을 함유하는 임의의 혼합물에 적용될 수 있다. 한 실시양태에서, 혼합물은 정제하고자 하는 단백질을 발현하는 살아있는 세포로부터 수득되거나 또는 그에 의해 생산된다 (예를 들어, 자연적으로 또는 유전자 조작에 의해). 임의로, 세포 배양물 중 세포는 관심 단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 구축물로 형질감염된 세포를 포함한다. 단백질을 생산하기 위해 세포를 유전자 조작하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York (1990)] 및 미국 특허 번호 5,534,615 및 4,816,567을 참조하며, 이들 각각은 본원에 구체적으로 참조로 포함된다. 이러한 방법은 단백질을 코딩하고 그의 발현을 가능하게 하는 핵산을 살아 있는 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 이들 숙주 세포는 배양물 중 성장된 박테리아 세포, 진균 세포, 곤충 세포 또는 바람직하게는 동물 세포일 수 있다. 박테리아 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 이. 콜라이 균주의 예는 HB101, DH5α, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, 및 외래 DNA를 절단하는데 실패한 임의의 이. 콜라이 균주를 포함한다. 사용될 수 있는 진균 숙주 세포는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 아스페르길루스(Aspergillus) 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 곤충 세포는 봄빅스 모리(Bombyx mori), 마메스트라 브라시카에(Mamestra brassicae), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
수많은 포유동물 세포주는 관심 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포이다. 포유동물 숙주 세포주는 예를 들어 COS, PER.C6, TM4, VERO076, DXB11, MDCK, BRL-3A, W138, Hep G2, MMT, MRC 5, FS4, CHO, 293T, A431, 3T3, CV-1, C3H10T1/2, Colo205, 293, HeLa, L 세포, BHK, HL-60, FRhL-2, U937, HaK, Jurkat 세포, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, M1x, 뮤린 골수종 (예를 들어, SP2/0 및 NS0) 및 C2C12 세포, 뿐만 아니라 형질전환된 영장류 세포주, 하이브리도마, 정상 이배체 세포, 및 1차 조직 및 1차 외식편의 시험관내 배양물로부터 유래된 세포 균주를 포함한다. 새로운 동물 세포주는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 (예를 들어, 형질전환, 바이러스 감염, 및/또는 선택에 의해) 확립될 수 있다. 관심 단백질을 발현할 수 있는 임의의 진핵 세포가 개시된 세포 배양 방법에 사용될 수 있다. 수많은 세포주가 상업적 공급원 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC®)으로부터 입수가능하다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포 배양물, 예를 들어 대규모 세포 배양물은 하이브리도마 세포를 사용한다. 항체-생산 하이브리도마 세포의 구축은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포 배양물, 예를 들어 대규모 세포 배양물은 관심 단백질 예컨대 항체를 생산하기 위해 CHO 세포를 사용한다 (예를 들어 WO 94/11026 참조). 다양한 유형의 CHO 세포, 예를 들어 CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DXB11, CHO/dhfr- 및 CHO-S가 관련 기술분야에 공지되어 있다.
구체적 실시양태에서, 본 발명의 방법은 고농도의 관심 단백질 (예를 들어, 항체)을 함유하는 혼합물 (예를 들어, 세포 배양물, 세포 용해물 또는 정화된 벌크)로부터 오염물을 효과적으로 제거하는 것을 포함한다. 예를 들어, 관심 단백질의 농도는 약 0.5 내지 약 50 mg/ml (예를 들어, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 mg/ml)의 범위일 수 있다.
혼합물의 제조는 초기에 단백질의 발현 방식에 의존한다. 일부 세포 시스템은 단백질 (예를 들어, 항체)을 세포로부터 주위 성장 배지로 직접 분비하는 한편, 다른 시스템은 항체를 세포내 보유한다. 세포내 생산된 단백질의 경우에, 세포는 임의의 다양한 방법, 예컨대 기계적 전단, 삼투 쇼크, 및 효소 처리를 사용하여 파괴될 수 있다. 파괴는 세포의 전체 내용물을 균질물로 방출하고, 추가로 세포하 단편을 생산하며, 이는 원심분리에 의해 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 더 적은 정도이기는 하지만, 직접 분비되는 단백질의 경우에도 세포의 자연 사멸 및 단백질 생산 실행 과정 동안 세포내 숙주 세포 단백질의 방출로 인해 유사한 문제가 발생한다.
한 실시양태에서, 세포 또는 세포 파편은 예를 들어 정화된 벌크를 제조하기 위해 혼합물로부터 제거된다. 본 발명의 방법은 세포 또는 세포 파편을 제거하기 위해 임의의 적합한 방법론을 사용할 수 있다. 단백질이 세포내 생산되는 경우에, 제1 단계로서, 미립자 파편인, 숙주 세포 또는 용해된 단편이 예를 들어 원심분리 또는 여과 단계에 의해 제거되어 혼합물을 제조할 수 있고, 이는 이어서 본원에 기재된 방법에 따른 정제에 적용된다 (즉 그로부터 관심 단백질이 정제됨). 단백질이 배지로 분비되는 경우에, 재조합 숙주 세포는 예를 들어 원심분리, 접선 흐름 여과 또는 심층 여과에 의해 세포 배양물 배지로부터 분리되어 혼합물을 제조할 수 있고, 이로부터 관심 단백질이 정제된다.
IV. 높은 pH (알칼리성) 세척 용액
본 발명의 방법은 제1 크로마토그래피 매트릭스 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 매트릭스)를 적어도 9.0의 pH를 갖는 알칼리성 세척 용액과 접촉시키는 것을 수반한다. 이러한 알칼리성 세척 용액은 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 존재를 필요로 하지 않는다. 임의로, 이러한 알칼리성 세척 용액은 비-완충 염을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다.
특정 실시양태에서, 알칼리성 세척 용액의 pH는 약 9 내지 약 11이다. 임의로, 제1 세척 용액의 pH는 약 9.5 내지 약 10.5 (예를 들어, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4 또는 10.5)이다. 제1 세척 용액의 예시적인 pH는 약 9.6이다. 제1 세척 용액의 또 다른 예시적인 pH는 약 10.4이다. 임의로, 알칼리성 세척 용액은 탄산나트륨을 포함한다. 임의로, 알칼리성 세척 용액은 염화나트륨을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 알칼리성 세척 용액은 탄산나트륨을 약 0.01-1.0 M의 범위의 농도로 및 염화나트륨을 약 0.5-2 M의 범위의 농도로 포함하고, 약 9.5 내지 약 10.5의 pH를 갖는다.
임의로, 방법은 제1 크로마토그래피 매트릭스 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 매트릭스)를 제2 알칼리성 세척 용액과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 제2 알칼리성 세척 용액은 적어도 9.0의 pH를 갖고, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하지 않는다. 예를 들어, 제2 알칼리성 세척 용액은 탄산나트륨을 약 0.01-1.0 M의 범위의 농도로 포함한다.
특정 실시양태에서, 혼합물은 제1 크로마토그래피 정제 후에, 1종 이상의 추가의 크로마토그래피 매트릭스에 적용된다. 예를 들어, 1종 이상의 추가의 크로마토그래피 매트릭스는 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 혼합-방식 크로마토그래피로부터 선택된다.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원의 전체에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 그 전문이 명백하게 본원에 참조로 포함된다.
실시예 1
서론
임상 요구로 인해, 수많은 모노클로날 항체는 현재 치료제로서의 그의 사용을 위해 개발 중에 있다. 시장 경쟁에서, 생물제약 회사는 전임상 및 임상 제조에서 개발 일정을 가속화하고 보다 효율적인 공정을 생성하는 것을 계속해서 모색하고 있다. 하나의 접근법은 요구되는 생성물 규격을 충족시키기 위해 정제 스킴을 개선시키고 간소화하는 것이다. 이러한 이유로, 각각의 단위 작업으로부터 불순물 클리어런스를 최대화하는 것이 바람직하다 [1,4]. 그러나, 정제 공급 스트림은 숙주 세포 단백질, DNA, 우발적 및 내인성 바이러스, 내독소, 및 응집체를 포함한, 제거하는 것이 중요하고 제거하는 것이 도전과제가 될 수 있는 다양한 불순물을 함유한다. 산업상 정제 발전은 이들 생성물 품질 속성과 밀접하게 이어지고, 생성물 수용 기준에 대한 일반적인 지침 (표 1)이 규정되어 있다 [2,3,4]. 이상적으로는, 불필요한 정제 단계는 종종 단백질 회수를 감소시키고 작업 시간 및 비용을 증가시킬 수 있기 때문에, 다중-스테이지 정제 스킴에서 각각의 단위 작업은 전체 생성물 품질에서 지정된 역할을 가져야 한다. 그럼에도 불구하고, 공정 강건성을 보장하기 위해 불순물 클리어런스를 위한 광범위한 정제 스킴 및 직교 접근법이 종종 요구된다.
친화도 분리는 그것이 mAb와 매트릭스에 공유 커플링된 리간드 사이의 가역적인, 고도로 특이적인 상호작용에 기초하여 분리하기 때문에 가장 선택적인 유형의 크로마토그래피이다 [1,4,16]. 단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피는 그것이 모노클로날 항체 공급 스트림으로부터 불순물의 98% 초과의 제거를 제공할 수 있기 때문에, 종종 하류 정제 스킴을 위한 주요 선택이 된다 [1,5]. 그러나, 단백질 A를 사용하는 공정은 종종 여전히 2 내지 3개의 후속 크로마토그래피 폴리싱 단계를 필요로 한다 [2,3]. 또한, 친화성 크로마토그래피는 하류 가공을 위한 가장 비싼 단위 작업 중 하나이다 [15]. 이러한 이유로, 개발 노력은 종종 단백질 A를 사용하는 친화성 포획 크로마토그래피에 대해 불순물 클리어런스를 최대화하는 것에 집중된다.
따라서, 불순물 클리어런스의 개선에 의해 유도되는 친화성 크로마토그래피 성능의 최적화가 큰 관심사가 되어 왔다. 20년을 초과하여, 증진된 용리-전 세척의 개발이 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 적용되어 왔다. 여러 계열의 증거는 염, 유기 용매, 비이온성 계면활성제, 카오트로프제, 소수성 조절제, 및 아미노산의 첨가 모두가 용리된 IgG의 HCP 함량 및 응집체 함량을 감소시키는 것으로 제시된다는 것을 제시한 바 있다 [1,6,7,18,19]. 유망한 반면에, 항체에 대한 그의 전체적인 효과의 특징화는 빈약 내지 부재하였다. 본 연구에서, 출원인들은 친화성 크로마토그래피 동안 불순물 클리어런스를 개선시키기 위해 알칼리성 세척을 사용하는 비통상적인 전략을 시험한다. 출원인들은 pH 9.6 및 10.4의 알칼리성 용리-전 세척의 적용을 보고하고, 용리된 항체의 상태 및 품질을 특징화하기 위해 한 패널의 분석 기술을 적용한다. 이들 분석은 SEC-UPLC, IEF, CE-SDS, SEC-MALS, 결합 ELISA, 시차 주사 열량측정, 원형 이색성, CHO-HCP ELISA, DNA, 및 잔류 ProA를 포함한다.
"기준선" ProA 포획 공정 (도 1)은 일반적으로 산업 표준으로 간주되는 조건을 사용하며, 그에 의해 모든 크로마토그래피 완충제는 mAb의 등전점의 1 이상의 단위 아래의 pH를 갖는다. 결합 및 세척 단계는 중성 pH에서 수행되고, 생성물은 산성 pH에서 용리된다 [3,5,6]. 여기서 기준선 포획 단계는 고유한 "알칼리성 pH 세척 전략"의 개발에 의해 보다 효율적이게 되었다 (도 1). 결합 후에, 알칼리성 pH 세척이 적용된다. mAb는 후속해서 중성 pH의 완충제로 세척되고, 기준선 공정에서와 같이 용리된다.
알칼리성 pH 세척 전략의 구현은 정제 스킴을 보다 효율적이게 하였고, 제2 폴리싱 단계의 제거를 가능하게 하였다. 이러한 전략을 구현하는 것과 관련된 우려 중 하나는 알칼리성 pH 조건을 사용하는 것이 생성물 불안정성, 예컨대 탈아미드화, 단백질 언폴딩 및 응집체 형성과 연관될 수 있다는 것이었다 [3,8]. 3종의 상이한 생성물에 대해 기준선 크로마토그래피 공정과 높은 pH 세척을 사용한 포획 공정을 비교한 후에, 이론적 생성물 불안정성은 관찰되지 않았다. 게다가, 알칼리성 pH 세척의 구현은 생성물 관련 불순물을 제거하는 것에서 특히 효과적이다. 여기서 본 발명자들은 공정 단계의 필요성을 제거하여 보다 효율적이고 비용 효과적인 공정을 생성하기 위해, 알칼리성 pH 세척을 사용하는 비통상적인 전략을 기재한다.
표 1
본 연구에 사용된 중요한 품질 속성 및 허용되는 수용 기준
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물질 및 방법
세포 배양물
완전 인간 모노클로날 항체를 함유하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터의 세포 배양물 상청액을 사용하였다. mAb 1은 pI 7.6을 갖는 IgG 유형 4 분자이고, mAb2는 pI 8.4를 갖는 IgG 1 분자이고, mAb 3은 pI 9.2를 갖는 IgG1이다.
크로마토그래피
지이 헬스케어의 맙셀렉트(MabSelect) 수지를 모든 포획 크로마토그래피 실험에 사용하였다. 정제용 규모 칼럼-기반 크로마토그래피 실험을 유니콘 6.3 소프트웨어에 의해 제어되는 악타 아반트(AKTA Avant) 기기 (지이 라이프사이언시스(GE Lifesciences))를 사용하여 수행하였다. 모든 칼럼은 수지 제조업체의 권고에 따라 실험실에서 패킹하였다.
기준선 ProA 포획 및 세척 첨가제 스크린
로드 적용 후, 칼럼을 먼저 PBS, pH 7.4로, 두번째로 5 mM 숙신산, pH 5.8로 세척하였다. 10 mM 인산, pH 3.0 완충제를 사용하여 mAb를 칼럼으로부터 용리시켰다. 세척 첨가제의 첨가에 의한 크로마토그래피 성능을 평가하기 위해, 추가의 가변 세척을 세척 1과 세척 2 사이에 삽입하였다. 시험된 가변 세척은 20 mM 숙신산 500 mM NaCl, 500 mM L-아르기닌 pH 5.8, 20 mM 숙신산 0.1% 트리톤 X-100 pH 5.8, 20 mM 숙신산 5% PEG 400 pH 5.8, 및 17 mM 인산나트륨 4% 카프릴산 pH 7.4를 포함하였다.
높은 pH 세척 전략을 사용한 ProA 포획
로드 적용 후, 칼럼을 먼저 PBS, pH 7.4 완충제로 세척하고, 이어서 200 mM 탄산나트륨, 1M 염화나트륨 완충제, pH 9.6 또는 10.4를 사용하여 제2 세척 단계를 행하였다. 제2 세척 단계에 이어서 100 mM 탄산나트륨 완충제, pH 9.6 또는 10.4를 사용하여 제3 세척 단계를 행하고, 이어서 35 mM 인산나트륨, pH 6.0 완충제를 사용하여 제4 세척 단계를 행하였다. 10 mM 인산, pH 3.0 완충제를 사용하여 mAb를 칼럼으로부터 용리시켰다.
바이러스 불활성화, 중화 및 여과
용리 후, 친화성 크로마토그래피로부터의 생성물 풀을, 0.1 N HCl를 사용하여 생성물을 낮은 pH (3.4 내지 3.6)로 조정한 후 1시간 유지시키는 것에 의해 낮은 pH 바이러스 불활성화에 적용시켰다. 후속해서 2 M 트리스를 사용하여 생성물을 중화시켰다 (7.0 내지 7.4). 중화 후 생성물 풀을 0.2 μM 필터를 사용하여 여과하였다.
ELISA - CHO 숙주 세포 단백질 분석
잔류 CHO 숙주 세포 단백질 (CHO-HCP)의 정량화를 위한 ELISA를 테칸(TECAN)® 액체 취급 시스템을 사용하여 고처리량 방식으로 수행하였다. CHO 숙주 세포 단백질 제3 세대 키트 (Cat# F550, 시그누스 테크놀로지스(Cygnus Technologies), 노스캐롤라이나주 사우스포트)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 샘플 중 숙주 세포 단백질 수준을 정량화하였다. 흡광도는 테칸® 인피니트 M1000 프로 판독기를 사용하여 450/650 nm에서 측정하였다.
잔류 DNA 분석
실시간 정량적 PCR (RT-PCR)을 사용하여 샘플 중 잔류 CHO-DNA 수준을 결정하였다. RT-PCR은 SYBR® 그린 PCR 마스터 믹스 (바이오-라드 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 허큘레스)로 MyiQ 단색 실시간 PCR 검출 시스템 (바이오-라드 랩., 미국 캘리포니아주 허큘레스)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다.
잔류 단백질 A 분석
잔류 단백질 A (rProA)의 정량화를 위한 ELISA를 테칸® 액체 취급 시스템을 사용하여 고처리량 방식으로 수행하였다. 잔류 단백질 A 키트 (Cat # 9333-1, 레플리겐(Repligen))를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 잔류 단백질 A를 정량화하였다. 흡광도는 테칸® 인피니트 M1000 프로 판독기를 사용하여 450/650 nm에서 측정하였다.
원형 이색성
온도조절되는 6개의 셀 교환기가 구비된 자스코(Jasco) J-815 CD 분광광도계를 사용하여 원형 이색성 스펙트럼을 수집하였다. mAb 샘플을 그의 상응하는 완충제 중에서 0.25 mg/mL로 희석하고, 25℃에서 1.0 mm 경로 길이 석영 셀에서 260으로부터 195 nm까지 스펙트럼을 수집하였다. 스펙트라매니저 소프트웨어 (자스코)를 사용하여 데이터를 가공하여, 완충제 교정된 스펙트럼을 각각의 mAb에 대한 실험 펩티드 농도, MW, 및 아미노산의 수에 기초하여 평균 잔기 타원율로 정규화하였다.
시차 주사 열량측정
열적 안정성 프로파일을 확인하기 위해, 각각의 로트로부터의 mAb에 대해 DSC를 수행하였다. 샘플을 그의 상응하는 공정 완충제 중에서 0.75 mg/mL로 정규화하였다. 마이크로칼(MICROCAL)® 모세관 DSC 상에서 90℃/hr 경사율로 10-100℃의 온도 경사를 사용하여 스캐닝을 수행하였다. 완충제 단독의 스캐닝 프로파일을 샘플 신호로부터 차감하고, 데이터를 마이크로칼® 오리진 7.0 분석 소프트웨어를 사용하여 비-2-상태 모델에 피팅시켜 변성 중간점 (Tm) 값을 수득하였다.
SE-UPLC
워터스(Waters)의 액퀴티 H-클래스 바이오 UPLC®를 사용한 각각의 포획 전략에 의한 정제 후 mAb 순도를 평가하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 사용하였다. 액퀴티 UPLC® BEH200 SEC 1.7 μm 칼럼 (4.6 x 150 mm)을 사용하여 본 검정을 수행하였고, 여기서 이동상은 pH 6.8의 PBS로 이루어졌고, 1 mL/분의 유량으로 실행되었다. 칼럼은 실행 내내 25℃로 유지되었다.
SEC-MALS
mAb를 인라인 다중-각도 광 산란 검출기에 커플링된 크기-배제 크로마토그래피 (SEC-MALS)에 의해 검사하였다. 프로미넌스 시마즈(Prominence Shimadzu) UFLC에 연결된 쇼덱스 프로테인(Shodex PROTEIN) KW-803 칼럼 상에서 0.02% 아지드화나트륨 함유하는 200 mM 인산칼륨 150 mM 염화나트륨, pH 6.8을 함유하는 완충제 중 0.5 mL/분의 유량으로 등용매 분리를 수행하였다. 샘플 50 μg을 SIL-20AC 프로미넌스 시마즈 오토-샘플러를 사용하여 칼럼에 주입하고, 직렬 연결된 3개의 온라인 검출기; 프로미넌스 SPD-20AD 다이오드 어레이 UV/vis 분광광도계, 이어서 와이어트 미니다운 트레오스(Wyatt miniDAWN TREOS)® 다중-각도 광 산란 검출기, 이어서 와이어트 옵티랩(Wyatt OPTILAB)® T-REX 굴절률 검출기로부터 데이터를 수득하였다. 데이터를 수집하고, 아스트라 (와이어트) 및 랩솔루션즈 (시마즈) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 비교가능한 것 또는 비교가능하지 않은 것으로서 전문 분석가에 의해 수득되고 요약된 바와 같은 크기 변이체의 분자량 및 백분율을 보고하였다.
iCIEF
mAb 등전점 (pI) 이소형 및 분해물의 상대 존재비의 분포를 이해하기 위해 전체-칼럼 영상화에 의한 모세관 등전 포커싱 (iCIEF)을 수행하였다. 샘플 pI 분포를 각각의 실험에서의 참조 표준물의 pI 분포와 비교하여 3개의 파티션: 산성 군, 주요 피크, 및 염기성 군으로 보고하였다. pI 마커 (6.14 및 9.46)를 포함시켜 각각의 주입에서의 pI 값을 보정하는데 사용하였다. 상대 존재비는 각각의 전기영동도로부터 샘플-유래 피크하 면적을 적분하고 각각의 파티션에서의 피크의 합을 총 면적 적분의 분율 (% 면적)로서 나타내어 계산하였다.
CE-SDS
SDS-함유 겔-충전 모세관에서 모세관 전기영동을 수행하여 mAb-관련 단백질 종 (서브유닛, 오염물 및 분해물) 상대 존재비의 분자량 (MW) 분포를 측정하였다. 단백질을 그의 크기 및 전기영동 이동성에 기초하여 분리하였다. 이 방법은 30 cm (50 μm ID) 총 길이의 모세관, 20 cm의 유효 길이 및 214 nm 흡광도의 고정점 검출을 사용하였다. 주입-내 상대 이동 시간을 모든 샘플 내에 존재하는 내부 표준물 (10 kDa)에 대해 보정하였다. 상대 이동 시간 및 교정된 피크 면적을 계산하고, 브라케팅 참조 표준물 주입과 비교하였다. CE-SDS 분포의 상대 존재비를 환원 및 비-환원 조건 하에 개별적으로 평가하였다.
결합 ELISA
마이크로플레이트를 항원으로 0.5-2.0 μg/mL로 코팅하였다. 플레이트를 0.05% PBST로 세척한 다음 차단시켰다. 후속해서 플레이트를 다시 세척하고, mAb를 12종의 상이한 농도로 첨가하고, 인큐베이션하였다. 세척 후에, HRP-접합된 2차 항체를 첨가하였다. 인큐베이션-후, 플레이트를 세척하고 TMB 기질을 첨가하였다. 신호를 플레이트 판독기 (테칸 인피니트 M1000 프로) 상에서 450 nm 및 650 nm에서 측정하였다. 결합 곡선을 참조 물질과 비교하여 퍼센트 결합 능력을 결정하였다.
용해도 맵핑
각각의 시험된 세척 완충제 중 용해도를 시험하기 위해, 탈염 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), Cat# 89808)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 mAb를 고처리량 방식으로 완충제 교환하였다. 완충제 교환 후, mAb를 19-25℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 상기 기재된 바와 같이 SE-UPLC에 의해 용해도를 평가하였다.
트립신 펩티드 맵핑 LC/MS
항체 샘플을 환원시키고, 알킬화시키고, 트립신에 의해 소화시켰다. 트립신 펩티드를 C-18 칼럼 (워터스 BEH C18, 1.7 u 2.1*100 mm 130A) 상에서 분리하고, 215 nm 및 280 nm에서 UV 검출기에 이어 질량 분광계 (LTQ-오비트랩-엘리트)에 의해 검출하였다. 선택된 이온 크로마토그램에서 무손상 펩티드 뿐만 아니라 변형된 펩티드의 피크 면적을 비교함으로써 상대 정량화를 달성하였다.
결과 및 논의
친화성 크로마토그래피 동안 pH 9.6 및 10.4에서의 알칼리성 세척의 유용성을 평가하기 위해, 공정 및 생성물 품질 속성을 검사하였다. CHO-HCP, CHO-DNA, 및 rProA의 분석에 의해 불순물 클리어런스를 검사하였다. SE-HPLC, iCIEF, CE-SDS, 및 SEC-MALS를 사용하여 순도 프로파일을 검사하였다. 결합 ELISA, CD, DSC, 무손상 질량, N-말단 펩티드 맵핑을 사용하여 분자의 기능적 및 구조적 완전성을 검사하였다. 높은 pH 세척 및 기준선 세척에 의해 정제된 생성물은 대등한 회수를 발생시켰다. mAb 1의 경우에 회수는 90% 내지 99%였고, mAb 2는 84% 내지 90%, mAb 3은 93% 내지 97%였다.
불순물 클리어런스
친화성 크로마토그래피 동안 불순물 클리어런스를 최대화하기 위해, 출원인들은 먼저 CHO-HCP 클리어런스에 대한 세척 pH의 영향에 주목하였다. 전통적으로, 단백질 A 크로마토그래피의 경우에 로드 적용 및 체이스 후, 용리 전에 pH 전이 세척이 적용된다. 전이 세척은 pH를 강하시키고 용리를 위해 수지를 준비하기 위해 의도된다. 여기서, 출원인들은 최적 HCP 클리어런스를 위한 pH 범위를 규정하기 위해 체이스와 동일한 전도성을 사용하여 pH 7.0 내지 10.4 범위에서 추가의 세척을 부가하였다. 도 2는 세척 pH가 증가함에 따라 용리액 중 CHO-HCP 수준이 감소된다는 것을 예시한다. 이들 결과에 기초하여 pH 9.0 초과에서 최상의 불순물 클리어런스가 관찰되었고, 세척은 시험된 최고의 pH (10.4)에서 특히 효과적이었다. 이들 결과를 확인하고 이러한 현상이 모노클로날 항체에 대해 특이적인 것이 아님을 결정하기 위해, 3종의 상이한 mAb의 정제를 세척 pH 9.6 및 10.4에서 수행하였다. 연구는 여기서 친화도 포획 동안 알칼리성 pH 세척 전략을 사용하는 것이 mAb 공급물로부터 CHO 숙주 세포 단백질을 제거하는데 효과적이라는 것을 제시한다. 친화도 포획 크로마토그래피 동안 알칼리성 세척을 사용하는 것은 mAb가 칼럼에 결합되어 있는 동안 mAb, ProA 리간드, 및 CHO-HCP 단백질 표면의 정전기적 특성을 변경함으로써 생성물/불순물 및/또는 불순물/수지 상호작용을 파괴한다. 친화성 크로마토그래피 동안, CHO-HCP는 mAb에 결합할 수 있거나, 베이스 매트릭스에 결합할 수 있거나, 또는 proA 리간드에 결합할 수 있다. mAb와의 HCP 상호작용이 우세한 메카니즘이라는 증거가 존재한다 [6,9,12]. 그러나, HCP의 일부 부분은 베이스 매트릭스 그 자체와 [1,2,6] 또는 proA 리간드 [12,17]와 상호작용할 수 있다는 것이 또한 분명하다. 예를 들어, 2종의 상이한 pH에서의 친화도 수지로부터의 용리는 현저하게 상이한 용리액 HCP 수준을 발생시킬 수 있다 [10,11,12]. HCP가 mAb, 베이스 매트릭스 또는 proA 리간드와 상호작용하는지 여부와 관계없이, 매우 높은 pH에서의 단백질-단백질 상호작용의 파괴는 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 생성물-불순물 상호작용은 우세하게 정전기적이지만, 리간드에의 Mab의 결합이 보다 강하다. 단백질 A는 4개의 안정화 수소 결합에 의한 소수성 상호작용으로부터 유래된 결합 에너지의 대부분에 의해 유도된 피팅에 의해 대부분에 항체에 결합한다 [20,21]. 게다가, 상호작용 예컨대 반 데르 발스 힘, 소수성 상호작용 및 정전기력은 또한 ProA-Mab 결합에 기여한다 [13]. 데이터는 여기서 높은 pH 세척이 수지에 결합되어 있는 동안 불순물과 mAb 및/또는 불순물과 수지 사이의 상호작용을 선택적으로 파괴하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
도 3에 예시된 바와 같이, CHO-HCP 클리어런스는 모든 분자의 경우에 기준선 조건과 비교 시 알칼리성 세척을 사용하여 유의하게 증진되었다. 알칼리성 세척을 사용하면, CHO-HCP 클리어런스는 mAb 1의 경우에 ~2 내지 3배, mAb 2의 경우에 ~6 내지 13배 및 mAb 3의 경우에 ~17 내지 23배 증가되었다. CHO-HCP 클리어런스에서의 증가는 mAb 하위부류에 관계없이 관찰되었다. 이들 결과에 기초하여, 출원인들은 생성물 품질에 대한 세척의 영향을 이해하는 것을 목표로 하는 후속 연구를 위해 pH 9.6 및 10.4에서의 알칼리성 세척을 조사하기로 선택하였다.
단백질 A 크로마토그래피는 또한 숙주 세포 DNA를 4-5 로그만큼 소거할 수 있다 [2]. 놀랍지않게도, 높은 pH 세척을 사용한 경우에 용리액 중 훨씬 더 낮은 수준의 DNA가 존재하는 것으로 관찰되었다. 도 4에 제시된 바와 같이, 용리액 중 CHO-DNA 클리어런스 수준은 모든 분자의 경우에 기준선 조건과 비교 시 알칼리성 pH 세척을 사용하여 유의하게 감소되었다. 알칼리성 pH 세척을 사용하면, CHO-DNA 수준은 mAb 1의 경우에 ~5 내지 19배, mAb 2의 경우에 ~209 내지 490배 및 mAb 3의 경우에 ~627 내지 1913배 감소되었다. 친화도 포획 동안 높은 pH 세척을 사용한 증진된 DNA 클리어런스는 개별 DNA 제거 단계, 예컨대 음이온 교환 크로마토그래피의 중요성을 저하시킨다.
추가적으로, 잔류 단백질 A를 모니터링하여 단백질 A 크로마토그래피에 대한 알칼리성 pH 세척의 영향을 평가하였다. 단백질 A 침출의 메카니즘은 결정되어야 할 것으로 남아있다. 친화성 크로마토그래피 동안 pH 순환은 아가로스 베이스 매트릭스에서 글리코시드 연결의 화학적 파괴를 유발하여 ProA와 mAb의 공-용리로 이어질 수 있다. 이는 유리 ProA가 수지 상의 IgG에 비-특이적 및 비-공유적으로 결합된 경우에 현저할 것이다 [4]. 출원인들은 높은 pH 세척 전략을 사용한 경우에 침출된 ProA의 양이 25 내지 450 ppm인 것으로 발견하였다. ProA 침출의 이러한 수준은 일반적으로 낮은 것으로 간주되고, 본 발명자들의 공정에 허용된다. 그러나, 수지 순환에 대한 침출의 영향은 아직 조사되지 않았다. 또한, 잔류 ProA는 후속 바이러스 불활성화 단계 동안 소거되는 것으로 관찰되었다. ProA 침출의 증가된 수준이 여전히 상당히 낮고 제거하는 것이 상대적으로 간단하더라도, ProA 침출을 방지하기 위해 연구할 수 있는 수많은 경로가 존재하고, 제1은 기본 안정한 수지, 예컨대 맙셀렉트 슈어를 사용하는 것이다. 게다가 출원인들은 정제된 생성물을 공급물에 사용한 경우에 침출이 현저하지 않다는 것을 관찰하였다. 따라서, 보다 높은 pH에서 활성인 공급물 중 불순물, 예컨대 프로테아제가 ProA 침출의 증가량의 원인일 가능성이 또한 존재한다. 실제로, 여러 참고문헌은 이러한 개념을 지지한다 [2]. 이러한 경우에, 하나의 해결책은 공급물에 프로테아제 억제제를 첨가하는 것일 것이다. 도 5에 제시된 바와 같이, 후속 바이러스 불활성화 및 여과 단계에 의해 효과적으로 소거된 높은 수준의 rProA 침출이 관찰되었다.
따라서, 친화성 크로마토그래피 동안 알칼리성 pH 세척을 사용하는 것은 표 1에 제시된 바와 같이 모든 분자에 대해 불순물을 허용되는 수준으로 소거할 수 있었다. 단일 단계에서의 이러한 증진된 클리어런스 수준은 공정 강건성을 증가시키고, 이들 불순물을 제거하기 위한 후속 폴리싱 단계의 제거를 잠재적으로 가능하게 할 수 있다.
생성물 순도
순도 프로파일은 SE-UPLC, iCIEF, CE-SDS, 및 SEC-MALS를 사용하여 검사하였다. 표 2에 예시된 바와 같이, SE-UPLC 분석은 알칼리성 pH 세척의 사용이 시험된 모든 3종의 mAb에 대해 1 퍼센트 초과만큼 생성물 순도를 증가시켰다는 것을 입증한다. iCIEF를 사용한 생성물 품질 분석은 알칼리성 pH 세척의 사용으로 인해 산성 또는 염기성 종의 어떠한 증가된 수준도 존재하지 않고 분자의 pI가 변화되지 않는다는 것을 제시하였다. 출원인들은 알칼리성 pH 세척을 사용하여 시험된 mAb 중 어느 것에서도 탈아미드화를 관찰하지 못했다. CE-SDS 환원 및 비-환원에 의해 측정된 바와 같은 전체적인 순도는 기준선 조건과 비교할 때 어떠한 유의차도 제시하지 않았다.
표 2
mAb의 생성물 순도 프로파일
Figure pct00002
mAb의 기능적 및 구조적 완전성은 포획 크로마토그래피 동안 광범위한 알칼리성 pH 세척의 사용 후에 유지된다
mAb는 상대적으로 안정한 단백질이고 이는 약물을 위한 이상적인 후보가 되게 하지만, 이는 약물 물질 및 약물 생성물의 제조 동안 화학적 및 물리적 변화 예컨대 분해 및 손상에 취약할 수 있다. 본 발명자들의 공정 전략이 알칼리성 pH 세척을 포함하기 때문에, 각각의 mAb의 생리화학적 및 구조적 완전성을 평가하기 위해 연구를 수행하였다. 원형 이색성에 의해 2차 구조 동일성 또는 내용에서 어떠한 차이도 검출되지 않았다. mAb 폴딩의 정도의 또 다른 척도인 융점도 또한 영향을 받지 않았다. 게다가 ELISA 결합에 의한 활성 (적절한 폴딩의 척도)은 알칼리성 pH 세척이 mAb의 폴딩, 활성 및 전체 기능성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내었다. 등전 포커싱 또는 트립신 펩티드 맵핑 LC/MS에 의하면, 높은 pH를 사용하여 세척된 mAb에 대해 전하 변이체, 산화 또는 탈아미드화에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다.
다중각도 광 산란
각각의 세트의 mAb 샘플에 대해, 2개의 샘플은 알칼리성 pH 세척을 사용하여 생성하고, 다른 2개의 샘플은 기준선 방법을 사용하여 생성하였다. 대조군으로서, 기준선 샘플을 완충제 교환하여 알칼리성 pH 세척을 사용하여 생성된 2개의 샘플과 동일한 완충제 종 중의 샘플을 생성하였다. 결과는 모든 샘플에서 1% 미만의 응집이 존재한다는 것을 나타내었다. 검출된 응집체의 올리고머 상태에서 단지 약간의 차이만이 존재하였다. 각각의 샘플의 주요 피크에 대한 분자량 값은 장비의 오차 내였다.
표 3
SEC-MALS 분석
Figure pct00003
결합 ELISA
결합 ELISA는 분자가 그의 특이적 수용체에 결합하는 능력을 검사하고, 이는 모노클로날 항체가 적절하게 폴딩된 것과 직접적으로 관련된다. 결합 ELISA 데이터는 세척 전략에 관계없이, 모든 mAb가 참조 표준물에 유사한 결합을 갖는다는 것을 입증하였다. 이는 알칼리성 pH 세척이 분자의 3차 구조에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하였다.
표 4
결합 ELISA
Figure pct00004
DSC
시차 주사 열량측정 (DSC)은, 부분적으로 변성된 mAb가 적절하게 폴딩되었을 때보다 더 낮은 용융 온도를 나타낼 것이기 때문에, mAb의 구조적 속성을 나타낼 수 있는 생물물리학적 기술이다. 항체의 융점에 대한 세척의 영향을 이해하기 위해, 알칼리성 pH 세척 뿐만 아니라 기준선 프로토콜을 사용하여 정제된 다양한 mAb에 대해 DSC를 측정하였다.
각각의 세트의 mAb 샘플에 대해 표 5에 제시된 바와 같이, 처음 2개의 샘플은 알칼리성 pH 세척을 사용하여 생성하였고, 마지막 2개의 샘플은 기준선 방법을 사용하여 생성하였다. 샘플 3,7 및 11은 기준선 프로토콜로부터 완충제 교환하여 알칼리성 pH 세척을 사용하여 생성된 2개의 샘플과 동일한 완충제 종 중의 샘플을 생성하였다. 샘플을 완충제 교환하여 DSC에 대한 완충제 영향을 제어하였다.
결과는 샘플 4 Tm 값이 동일한 mAb 군으로부터의 다른 분자보다 1℃ 아래라는 것을 나타낸다. 도 6에 제시된 바와 같이, T개시도 또한 보다 낮게 이동되는 것으로 보이고, 이는 완충제 또는 공정에 대한 가능한 감수성을 나타낸다. 완충제 교환된 샘플 (샘플 3) Tm 값이 알칼리성 pH 세척 샘플 (샘플 1 및 2)과 유사하기 때문에, 이러한 샘플의 경우에 Tm에서의 변화는 DSC에 대한 샘플 완충제 조성물 영향으로 인한 것으로 추론될 수 있다. 따라서, mAb 1의 경우에 Tm에 대한 알칼리성 pH 세척의 어떠한 유의한 영향도 존재하지 않는다. mAb 2의 경우에, Tm1 또는 Tm2 값에서 어떠한 유의차도 관찰되지 않았고, 이는 상이한 세척 조건이 이러한 샘플의 융점에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. mAb 1과 유사하게, mAb 3은 샘플 12의 경우에 다른 조건보다 어느 정도 더 낮은 Tm을 가졌고, 이는 이러한 완충제 조건 또는 공정에서 약간 덜 안정하다는 것을 나타내는 것일 수 있다. 완충제 교환된 샘플 (샘플 11)에 대한 Tm 값은 알칼리성 pH 세척 샘플 (샘플 9 및 10)과 유사하였고, 따라서 이러한 샘플의 경우에 Tm에서의 변화는 DSC에 대한 샘플 완충제 조성물 영향으로 인한 것이다. 따라서, mAb 3의 경우에 Tm에 대한 알칼리성 pH 세척의 어떠한 유의한 영향도 존재하지 않는다.
표 5
시차 주사 열량측정
Figure pct00005
원형 이색성
원-UV 원형 이색성 (CD) 분광분석법은 둘 다의 접근법을 사용하여 정제된 3종의 mAb의 2차 구조를 특징화하는데 사용하였다. 다양한 조건 하의 CD 스펙트럼 참조 표준물 및 mAb를 260 nm 및 195 nm의 파장 사이에서 평가하였다. 각각의 mAb의 아미노산 서열에 기초하여 계산된 분자량 및 아미노산 잔기의 수를 사용하여 CD 신호를 밀리도로부터 평균 잔기 타원율로 전환시켰다. 원 UV CD 스펙트럼은 mAb 1의 경우에 217 및 229 nm에서, mAb 2의 경우에 217-218 nm에서, 및 mAb3의 경우에 217-218 nm에서 최소값을 입증하였다. mAb1의 경우에 평균값 평균 잔기 타원율은 217 nm에서 -3128 ± 358 deg cm2dmol-1잔기-1 (4종의 조건에 대한 평균값 ± 표준 편차) 및 229 nm에서 -1738 ± 204 deg cm2dmol-1잔기-1이었다. mAb2의 경우에 평균값 평균 잔기 타원율은 217 nm에서 -3477 ± 454 deg cm2dmol-1잔기-1이었다. mAb3의 경우에 평균값 평균 잔기 타원율은 217 nm에서 -3392 ± 83 deg cm2dmol-1잔기-1이었다. 최소값 및 스펙트럼 형상은 mAb를 정제하는데 사용된 프로토콜과 관계없이 각각의 mAb에 대해 유지되었다. CD 스펙트럼의 형상 및 강도의 면에서의 정성적 유사성은 알칼리성 pH 세척 전략이 조사 하의 mAb의 2차 구조에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하였다. mAb 사이에 차이가 존재하더라도, 각각의 개별 mAb의 경우에 CD 스펙트럼은 시험된 모든 세척 조건 하에서 정성적으로 유사하였다. 모든 샘플의 스펙트럼은 β-시트 내용과 일치하였다.
트립신 펩티드 맵핑 LC/MS
3종의 공정으로부터의 약물 물질을 환원시키고, 알킬화시키고, 트립신으로 소화시켰다. 트립신 펩티드를 C-18 칼럼 상에서 분리하고, 215 및 280 nm에서 UV 검출기에 이어 질량 분광계 (LTQ-오비트랩-엘리트)에 의해 검출하였다. 선택된 이온 크로마토그램에서 무손상 펩티드 뿐만 아니라 변형된 펩티드의 피크 면적을 비교함으로써 상대 정량화를 달성하였다. 산화는 중쇄에서 지표 펩티드로부터의 산화 생성물의 피크 면적 백분율에 의해 모니터링하고, 탈아미드화는 중쇄에서 또 다른 지표 펩티드로부터의 4종의 탈아미드화 생성물의 피크 면적 백분율에 의해 모니터링하였다. 산화 및 탈아미드화 수준은 모든 3종의 mAb에서 기준선 샘플 및 알칼리성 pH 샘플에서 대등하였다.
표 6
트립신 펩티드 맵핑 LC/MS
Figure pct00006
pH 9.6 내지 10.4에서의 알칼리성 세척을 사용하는 전략은, 리간드-수용체 결합이 mAb를 그의 적절한 입체형태로 유지시키고 그것을 변성 및 다른 손상으로부터 보호할 수 있는 강한 상호작용이기 때문에, 부분적으로 가능하다. 항체/항원 결합에 대해 측정된 친화도 상수의 범위는 105 M-1 미만으로부터 1012 M-1 초과로 확장되고 [13], 단백질 A 리간드 및 Fcγ의 경우에 중성 pH 및 실온에서 107 - 108이다 [14]. 리간드의 수용체에의 결합은 mAb의 구조를 그것이 결합되지 않은 때의 mAb의 구조보다 낮은 에너지 상태로 둔다. 따라서, 결합되었을 때, mAb는 변성의 전이 상태로부터 추가로 떨어져서 보호된다. mAb가 리간드에 결합되었을 때 보다 안정한 상태에 있더라도, 출원인들은 또한 어떠한 리간드도 존재하지 않을 때 알칼리성 pH 완충제에 노출된 경우의 mAb의 응집 잠재력을 관찰하였다 (표 7). 실온에서 24시간 인큐베이션 후, 단량체 함량에서 어떠한 변화도 없었고, 이는 미결합 mAb가 이들 조건에서 안정하다는 것을 나타낸다.
표 7
mAb에 대한 완충제 용해도
Figure pct00007
불순물 클리어런스를 증진시키기 위한 대안적 전략은 포획 동안 세척 중 첨가제, 예컨대 염, 유기 용매, 비이온성 계면활성제, 카오트로프제, 소수성 조절제, 및 아미노산의 사용을 포함한다 [6,7]. 도 6은 알칼리성 pH 세척 전략이 세척 단계를 사용하여 CHO-HCP를 감소시키기 위한 가장 효과적인 방법 중 하나라는 것을 제시한다. 또한, 알칼리성 pH 세척 전략은 후속 클리어런스 및 모니터링을 필요로 할 수 있는 첨가제를 사용하지 않는다. 불순물 클리어런스를 추가로 증진시키기 위해 알칼리성 pH 세척 완충제 중 첨가제를 포함하는 것에 대한 잠재력은 또한 존재한다.
슈크라(Shukla) 등은 포획 동안 세척 중 아르기닌의 첨가가 용리액 중 불순물을 감소시키기 위한 효과적인 방법이라는 것을 제시한 바 있다 [6]. 아르기닌의 존재 및 부재 하에 알칼리성 pH 세척을 사용하는 경우의 불순물 제거를 비교하기 위해 연구를 수행하였다 (표 8). 결과는 알칼리성 세척 중 아르기닌의 첨가에 의해 어떠한 추가의 클리어런스도 달성되지 않는다는 것을 나타낸다.
표 8
알칼리성 pH 전략 및 아르기닌 세척 전략 둘 다를 사용하여 정제한 mAb에 대한 생성물 및 공정 품질의 비교
Figure pct00008
알칼리성 pH 세척 전략의 구현은 mAb 정제 스킴에서 추가의 폴리싱 단계에 대한 필요를 제거할 수 있다
대부분의 정제 공정은 산업상 품질 표준을 충족시키기 위해 2-3회의 폴리싱 크로마토그래피 단계를 사용한다. 불순물 클리어런스의 직교 방법은 공정 강건성을 증가시킬 수 있지만, 제조 경제는 간소화된 공정을 생성하도록 공정 개발을 유도한다. 여기서, 출원인들은 친화성 크로마토그래피 동안, 세척 단계는 점점 효과적이게 될 수 있고, 이는 1회 이상의 폴리싱 단계의 제거를 가능하게 할 수 있다는 것을 입증한다. 표 9는 포획 크로마토그래피 동안 높은 pH 세척의 사용이 CEX 폴리싱 단계가 필요하지 않은 정도까지 불순물 클리어런스를 개선시킨다는 것을 예시한다. 친화성 크로마토그래피 동안 결합의 광범위한 속성을 사용함으로써, 출원인들은 공격적 pH 세척이 불순물 클리어런스를 증진시키기 위해 사용될 수 있다는 것을 제시한다.
표 9
2-단계 vs. 3-단계 정제
Figure pct00009
참고문헌
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 상용 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
참조로 포함
본원에 인용된 모든 특허, 계류 특허 출원, 및 다른 공개는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

Claims (20)

  1. a) 관심 단백질 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 혼합물을 제1 크로마토그래피 매트릭스에 적용하는 단계이며, 여기서 관심 단백질은 제1 크로마토그래피 매트릭스에 결합하는 것인 단계;
    b) 적어도 9.0의 pH를 갖고 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하지 않는 제1 세척 용액과 제1 크로마토그래피 매트릭스를 접촉시키는 단계; 및
    c) 제1 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리 용액으로 관심 단백질을 용리시키는 단계
    를 포함하는, 상기 혼합물로부터 관심 단백질을 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 오염물이 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 대사물, 숙주 세포 구성 단백질, 핵산, 내독소, 바이러스, 생성물 관련 오염물, 지질, 배지 첨가제 및 배지 유도체로부터 선택된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제1 크로마토그래피가 친화성 크로마토그래피인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 단백질 G 친화성 크로마토그래피로부터 선택된 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 친화성 크로마토그래피인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 관심 단백질이 항체, 항체 단편, 및 Fc 융합 단백질로부터 선택된 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 모노클로날 항체가 인간, 인간화 및 키메라 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 제1 세척 용액의 pH가 약 9 내지 약 11인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 제1 세척 용액의 pH가 약 9.5 내지 약 10.5인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 제1 세척 용액의 pH가 약 9.6인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 제1 세척 용액의 pH가 약 10.4인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 제1 세척 용액 후, 적어도 9.0의 pH를 갖고 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하지 않는 제2 세척 용액과 제1 크로마토그래피 매트릭스를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제2 세척 용액 후, pH 약 6 내지 약 7을 갖고 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하지 않는 제3 세척 용액과 제1 크로마토그래피 매트릭스를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 제1 세척 용액이 탄산나트륨을 약 0.01-1.0 M의 범위의 농도로 및 염화나트륨을 약 0.5-2 M의 범위의 농도로 포함하는 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 제2 세척 용액이 탄산나트륨을 약 0.01-1.0 M의 범위의 농도로 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 혼합물이 1종 이상의 추가의 크로마토그래피 매트릭스에 적용되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 1종 이상의 추가의 크로마토그래피 매트릭스가 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 혼합-방식 크로마토그래피로부터 선택된 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 혼합물이 수거된 세포 배양물 유체, 세포 배양물 상청액, 및 조건화 세포 배양물 상청액, 세포 용해물, 및 정화된 벌크로부터 선택된 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 세포 배양물이 포유동물 세포 배양물인 방법.
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