JP2022521610A - 二重特異性抗ｅｇｆｒ／ｃ－ｍｅｔ抗体による併用療法及び患者層別化 - Google Patents

二重特異性抗ｅｇｆｒ／ｃ－ｍｅｔ抗体による併用療法及び患者層別化 Download PDF

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Abstract

本発明は、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による併用療法及び患者層別化に関する。

Description

本発明は、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による併用療法及び患者層別化に関する。
（配列表）
本願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年２月１３日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイルは、ＪＢＩ６０５１ＷＯＰＣＴ１ＳＴ２５．ｔｘｔという名前であり、サイズは１９キロバイトである。
がんにおけるＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの両方の個々の役割は十分に確立されているので、これらの標的は併用療法にとって魅力的なものになっている。いずれの受容体も、同じ生存及び抗アポトーシス経路（ＥＲＫ及びＡＫＴ）を通してシグナルを伝達し；このため、この経路対を共に阻害すると、代償経路が活性化される可能性を制限して、それによって全有効性を改善させ得る。
再発又は既存の治療薬に対する抵抗性は一般的である。したがって、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんなどの疾患のより有効な治療を開発するために、改善された治療薬又は治療薬と患者層別化バイオマーカーとの組み合わせが必要とされている。
本開示は、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象を治療する方法であって、対象におけるマクロファージ活性を強化する薬剤と組み合わせて、治療的に有効な量の単離二重特異性抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）／肝細胞成長因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）抗体を対象に投与することを含む方法を提供する。
本開示はまた、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答するＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象を診断及び治療する方法であって、対象からの生体試料を提供することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルを測定することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルが閾値よりも高いとき、対象が、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答するＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有すると診断することと、抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答すると診断された対象に、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体を投与するか又は投与するために提供することと、を含む方法も提供する。
本開示はまた、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有すると疑われるか又は有する対象を二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体で治療する方法であって、対象が、閾値よりも高いマクロファージ又は単球レベルを有すると判定することと、閾値よりも高いマクロファージ又は単球レベルを有すると判定された対象に、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体を投与するか又は投与するために提供することと、を含む方法も提供する。
本開示はまた、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に対するＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象の応答を予測する方法であって、対象からの生体試料を提供することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルを測定することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルが閾値よりも高いとき、対象が応答者であると予測することと、を含む方法を提供する。
本開示はまた、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答するＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象を治療する方法であって、対象からの生体試料を提供することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルを測定することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルが閾値よりも高いとき、対象を二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体で治療することと、を含む方法も提供する。
本開示はまた、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象が二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答するかどうかを判定し、対象を治療するかどうかを判断する方法であって、対象からの生体試料を提供することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルを測定することと、生体試料からのマクロファージ若しくは単球レベルが閾値よりも高いとき、ＥＧＦＲ若しくはｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象が二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答すると診断するか、又は生体試料からのマクロファージ若しくは単球レベルが閾値よりも低いとき、ＥＧＦＲ若しくはｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象が二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答しないと診断することと、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答すると診断された二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体対象を投与するか、又は二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答しないと診断された対象に二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体を投与することを控えることと、を含む方法も提供する。
ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞数／ｍｍ２を使用して測定したときの、最長１２０時間の培養下、指定のＪＮＪ－３７２濃度で、ＰＢＭＣの存在下における、ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄで標識されたＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞の増殖のＪＮＪ－３７２の媒介による阻害を示す。 ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞数／ｍｍ２を使用して測定したときの、最長１２０時間の培養下、指定のＪＮＪ－３７２濃度で、ＰＢＭＣの非存在下における、ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄで標識されたＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞の増殖に対するＪＮＪ－３７２の媒介による効果を示す。 ＰＢＭＣの存在下における、ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄで標識されたＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞の増殖の、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、ＪＮＪ－３７２．ＮＦ、又はアイソタイプ対照の媒介による阻害を示す。増殖は、ＰＢＭＣの非存在下においても、アイソタイプ対照によっても、ＦｃエフェクタサイレントＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマによっても阻害されなかった。ＰＢＭＣの存在下で培養したＪＮＪ－３７２．ＮＦは、増殖を部分的に阻害した。アイソ：アイソタイプ対照；ＩｇＧ２ｓ：ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ；ＥＧＦＲｘＭｅｔ ＮＦ：ＪＮＪ－３７２．ＮＦ。 ４８時間の培養後の、ＰＢＭＣの存在下における、ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄで標識されたＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞の、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、ＪＮＪ－３７２．ＮＦ、又はアイソタイプ対照の媒介によるアポトーシスを示す。アポトーシスは、ＰＢＭＣの非存在下においても、アイソタイプ対照によっても、ＦｃエフェクタサイレントＪＮＪ３７２．ＩｇＧ２シグマによっても誘導されなかった。ＰＢＭＣの存在下で培養したＪＮＪ－３７２．ＮＦは、アポトーシスを部分的に媒介した。アイソ：アイソタイプ対照；ＩｇＧ２ｓ：ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ；ＥＧＦＲｘＭｅｔ ＮＦ：ＪＮＪ－３７２．ＮＦ。 図に示す通り、アイソタイプ対照又はＪＮＪ－３７２で処理し、４、２４、４８、又は７２時間、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５試料中のＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐＥＧＦＲタンパク質を示す、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。ＰＢＭＣの存在は、ＪＮＪ－３７２の媒介によるＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔタンパク質のダウンレギュレーション並びにｐＥＧＦＲの阻害を増強した。 図に示す通り、アイソタイプ対照又はＪＮＪ－３７２で処理し、４、２４、４８、又は７２時間、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５試料中のＥＧＦＲの相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。ＰＢＭＣの存在は、ＪＮＪ－３７２の媒介によるＥＧＦＲのダウンレギュレーションを増強した。 図に示す通り、アイソタイプ対照又はＪＮＪ－３７２で処理し、４、２４、４８、又は７２時間、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５試料中のｐＥＧＦＲ（ｐＹ１１７３）の相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。ＰＢＭＣの存在は、ＪＮＪ－３７２の媒介によるｐＥＧＦＲのダウンレギュレーションを増強した。 図に示す通り、アイソタイプ対照又はＪＮＪ－３７２で処理し、４、２４、４８、又は７２時間、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５試料中のｃ－Ｍｅｔの相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。ＰＢＭＣの存在は、ＪＮＪ－３７２の媒介によるｃ－Ｍｅｔのダウンレギュレーションを増強した。 図に示す通り、アイソタイプ対照又はＪＮＪ－３７２で処理し、７人の異なるドナーからのＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５試料中のＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐＥＧＦＲタンパク質を示す、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。 図に示す通り、アイソタイプ対照又はＪＮＪ－３７２で処理し、７人の異なるドナーからのＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５試料中のＥＧＦＲの相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。 図に示す通り、アイソタイプ対照又はＪＮＪ－３７２で処理し、７人の異なるドナーからのＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５試料中のｐＥＧＦＲ（ｐＹ１１７３）の相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。 図に示す通り、アイソタイプ対照又はＪＮＪ－３７２で処理し、７人の異なるドナーからのＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５試料中のｃ－Ｍｅｔの相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。 各ドナーのＰＢＭＣ試料中の単球率（％）と、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のＥＧＦＲタンパク質の量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）によって測定したときの、ＰＢＭＣの存在下におけるＪＮＪ－３７２によるＥＧＦＲ阻害の変化率（％）（ＰＢＭＣなしに対する相対倍数変化）との間の相関を示す。 各ドナーのＰＢＭＣ試料中の単球率（％）と、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のｐＥＧＦＲタンパク質の量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）によって測定したときの、ＰＢＭＣの存在下におけるＪＮＪ－３７２によるｐＥＧＦＲ Ｙ１１７３阻害の変化率（％）（ＰＢＭＣなしに対する相対倍数変化）との間の相関を示す。 各ドナーのＰＢＭＣ試料中の単球率（％）と、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のｃ－Ｍｅｔタンパク質の量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）によって測定したときの、ＰＢＭＣの存在下におけるＪＮＪ－３７２によるｃ－Ｍｅｔ阻害の変化率（％）（ＰＢＭＣなしに対する相対倍数変化）との間の相関を示す。 図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、１人のドナーからのＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣ又は単球（モノ）枯渇ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐＥＧＦＲタンパク質レベルを検出する、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。 図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、１人のドナーからのＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣ又は単球（モノ）枯渇ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のＥＧＦＲの相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。 図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、１人のドナーからのＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣ又は単球（モノ）枯渇ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５中のｐＥＧＦＲ（ｐＹ１１７３）の相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。 図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、１人のドナーからのＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣ又は単球（モノ）枯渇ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５中のｃ－Ｍｅｔの相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。 図に示す通り、同じドナーからのＰＢＭＣ、単離ＮＫ細胞、単離単球、ＭＣＳＦ分化Ｍ１マクロファージ、又はＧＭＣＳＦ分化Ｍ１マクロファージの存在下又は非存在下で４８時間、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はアイソタイプ対照で処理したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐＥＧＦＲタンパク質レベルを検出する、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。 図に示す通り、同じドナーから単離したＰＢＭＣ、単球、ＭＣＳＦ分化Ｍ１マクロファージ、又はＧＭＣＳＦ分化Ｍ１マクロファージの存在下又は非存在下で４８時間、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はアイソタイプ対照で処理したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のＥＧＦＲの相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。 図に示す通り、同じドナーから単離したＰＢＭＣ、単球、ＭＣＳＦ分化Ｍ１マクロファージ、又はＧＭＣＳＦ分化Ｍ１マクロファージの存在下又は非存在下で４８時間、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はアイソタイプ対照で処理したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のｐＥＧＦＲ（ｐＹ１１７３）の相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。 図に示す通り、同じドナーから単離したＰＢＭＣ、単球、ＭＣＳＦ分化Ｍ１マクロファージ、又はＧＭＣＳＦ分化Ｍ１マクロファージの存在下又は非存在下で４８時間、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はアイソタイプ対照で処理したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のｃ－Ｍｅｔの相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。 図に示す通り、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はアイソタイプ対照で処理し、Ｍ１マクロファージ（Ｍ１）又はＭ２ａマクロファージ（Ｍ２ａ）の存在下で培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐＥＧＦＲタンパク質レベルを検出する、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。アイソ：アイソタイプ対照、３７２：ＪＮＪ－３７２、ＩｇＧ２シグマ：ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ。 図に示す通り、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はアイソタイプ対照で処理し、Ｍ２ｃマクロファージ（Ｍ２ｃ）の存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐＥＧＦＲタンパク質レベルを検出する、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。アイソ：アイソタイプ対照、３７２：ＪＮＪ－３７２、ＩｇＧ２シグマ：ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ。 図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で培養したＳＮＵ－５細胞中のＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ｐＥＧＦＲ、及びｐＭｅｔタンパク質レベルを検出する、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。 図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＳＮＵ－５細胞中のＥＧＦＲの相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。 図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＳＮＵ－５細胞中のｐＥＧＦＲ（ｐＹ１１７３）の相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。 図に示す通り、ＪＮＪ－３７２、アイソタイプ対照、又はＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＳＮＵ－５細胞培養試料中のｃ－Ｍｅｔの相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。 図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＳＮＵ－５細胞中のｐＭｅｔ（ｐＹ１２３４／１２３５）の相対量（ローディング対照であるアクチンに対して正規化）を示す。 ＢＩＷで３週間、１０ｍｇ／ｋｇアイソタイプ対照（ｎ＝８）、ＪＮＪ－３７２（ｎ＝８）、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ（図中ＩｇＧ２σ）（ｎ＝８）で処理した、皮下注射されたＨ１９７５細胞株異種移植腫瘍の腫瘍体積を示す。２４日目に、ＴＧＩ％を計算した。 ＢＩＷで３週間、ビヒクル（ＰＢＳ）（ｎ＝８）、５ｍｇ／ｋｇ ＪＮＪ－３７２（ｎ＝８）、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ（図中ＩｇＧ２σ）（ｎ＝８）で処理した、皮下注射されたＳＮＵ５細胞株異種移植腫瘍の腫瘍体積を示す。３４日目に、ＴＧＩ％を計算した。全てのデータを各処理群内の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表した。 それぞれ２５：１、５：１、及び５：１のＥ：Ｔ比で、同じドナーから単離されたＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、又は単球の存在下において、ＪＮＪ－３７２で２時間処理したＢＡＴＤＡがロードされたＨ１９７５細胞、並びにユーロピウム放出によって測定したＡＤＣＣ溶解を示す。 抗マウスＣＳＦ１Ｒ抗体による枯渇後の腫瘍内のマクロファージ（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃ－Ｆ４／８０＋）率（％）を調べるための、１０ｍｇ／ｋｇアイソタイプ、ＪＮＪ－３７２、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ処理（ｎ＝５マウス／処理）の２回投与の２４時間後に単離されたＨ１９７５腫瘍試料のマルチカラーフローサイトメトリー分析を使用した腫瘍関連マクロファージの数を示す。 マクロファージを枯渇させるために週３回抗マウスＣＳＦ１Ｒ又はそのアイソタイプ対照と組み合わせて、ＢＩＷで３週間、１０ｍｇ／ｋｇ ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はアイソタイプ（処理群当たりｎ＝８マウス）で処理した、皮下注射されたＨ１９７５細胞株異種移植腫瘍の腫瘍体積を示す。２１日目にＴＧＩ％を計算し、＊＊＊＊、ｐ値＜０．０００１は、１７日目に２元配置分散分析により計算した（研究において全ての群が全てのマウスを有していた場合）。 ＰＢＭＣの存在下における、アイソタイプに対する、ＪＮＪ－３７２又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマで４時間処理した後のＨ１９７５細胞によって産生された指定のケモカイン及びサイトカインの相対倍数変化を表す棒グラフを示す。 ＰＢＭＣの存在下における、アイソタイプに対する、ＪＮＪ－３７２又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマで７２時間処理した後のＨ１９７５細胞によって産生された指定のケモカイン及びサイトカインの相対倍数変化を表す棒グラフを示す。 ５：１のエフェクタ：標的比（Ｅ：Ｔ＝５：１）における、ＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝１０：１）（左から最初の５本の棒）、ＮＫ細胞（左から６～１０番目の棒）、又は単球（右から最初の５本の棒）の存在下で４時間、指定の用量範囲のＪＮＪ－３７２で処理したＨ１９７５細胞における、未処理に対するＭＣＰ－１産生の相対的倍率変化を示す。 ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、又は単球の存在下においてＪＮＪ－３７２でＨ１９７５細胞を処理した際のＭＣＰ－３レベルにおける（未処理対照と比較した）倍数変化を測定するＭＳＤベースのサイトカイン分析からの用量反応曲線を示す。灰色の点線は、未処理対照の値を示す。 ５：１のエフェクタ：標的比（Ｅ：Ｔ＝５：１）における、ＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝１０：１）（左から最初の５本の棒）、ＮＫ細胞（左から６～１０番目の棒）、又は単球（右から最初の５本の棒）の存在下で４時間、指定の用量範囲のＪＮＪ－３７２で処理したＨ１９７５細胞における、未処理に対するＩＬ１－ＲＡ（図中に示すＩＬＲＡ）産生の相対的倍数変化を示す。 ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、又は単球の存在下においてＪＮＪ－３７２でＨ１９７５細胞を処理した際のＭＩＰ－１βレベルにおける（未処理対照と比較した）倍数変化を測定するＭＳＤベースのサイトカイン分析からの用量反応曲線を示す。灰色の点線は、未処理対照の値を示す。 Ｍ１マクロファージ（Ｍ１ ｍａｃｓ）の存在下においてＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ（図中ＩｇＧ２σ）、又はアイソタイプ対照でＨ１９７５細胞を処理した際のＭＩＰ－１βレベルにおける（未処理対照と比較した）倍数変化を測定するＭＳＤベースのサイトカイン分析からの用量反応曲線を示す。灰色の点線は、未処理対照の値を示す。 Ｍ２マクロファージ（Ｍ２ ｍａｃｓ）の存在下においてＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ（図中ＩｇＧ２σ）、又はアイソタイプ対照でＨ１９７５細胞を処理した際のＭＩＰ－１βレベルにおける（未処理対照と比較した）倍数変化を測定するＭＳＤベースのサイトカイン分析からの用量反応曲線を示す。灰色の点線は、未処理対照の値を示す。 Ｍ１マクロファージ（Ｍ１ ｍａｃｓ）の存在下においてＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ（図中ＩｇＧ２σ）、又はアイソタイプ対照でＨ１９７５細胞を処理した際のＭＩＰ－１αレベルにおける（未処理対照と比較した）倍数変化を測定するＭＳＤベースのサイトカイン分析からの用量反応曲線を示す。灰色の点線は、未処理対照の値を示す。 Ｍ２マクロファージ（Ｍ２ ｍａｃｓ）の存在下においてＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ（図中ＩｇＧ２σ）、又はアイソタイプ対照でＨ１９７５細胞を処理した際のＭＩＰ－１αレベルにおける（未処理対照と比較した）倍数変化を測定するＭＳＤベースのサイトカイン分析からの用量反応曲線を示す。灰色の点線は、未処理対照の値を示す。 標識されたアイソタイプ、ＪＮＪ－３７２、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ（図中ＩｇＧ２σ）で３時間Ｈ１９７５細胞をオプソニン化した際の、ＣＤ１１ｂ陽性Ｍ１マクロファージ内のＡＦ４８８標識率（％）を測定するフローサイトメトリーベースのトロゴサイトーシスアッセイからの用量反応曲線を示す。ＪＮＪ－３７２による処理は、Ｍ１マクロファージによる用量依存的トロゴサイトーシスを誘導したが、アイソタイプ又はＩｇＧ２は誘導しなかった。 標識されたアイソタイプ、ＪＮＪ－３７２、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ（図中ＩｇＧ２σ）で３時間Ｈ１９７５細胞をオプソニン化した際の、ＣＤ１１ｂ陽性Ｍ２マクロファージ内のＡＦ４８８標識率（％）を測定するフローサイトメトリーベースのトロゴサイトーシスアッセイからの用量反応曲線を示す。ＪＮＪ－３７２による処理は、Ｍ２マクロファージによる用量依存的トロゴサイトーシスを誘導したが、アイソタイプ又はＩｇＧ２は誘導しなかった。 オプソニン化の１１分（ｍｉｎ）又は４４分後の、ＡＦ６４７標識ＪＮＪ－３７２（上部パネル）又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ（底部パネル）でオプソニン化されたＨ１９７５ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞との共培養下（Ｅ：Ｔ比＝５：１）における、ＦＩＴＣ－ＣＤ１１ｂ（マクロファージ原形質膜を標識）及びヘキスト（核を標識）で標識されたＭ２マクロファージのトロゴサイトーシスを示すハイコンテンツ共焦点顕微鏡からの代表的な画像を表す。白矢印は、標的細胞からＭ２マクロファージへのＡＦ６４７標識ＪＮＪ－３７２抗体の移動によって測定されるトロゴサイトーシス事象を示す。ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２ではトロゴサイトーシスは明白ではなかった。スケールバー＝２０μｍ。Ｍ：マクロファージ；Ｔ：Ｈ１９７５細胞。 （ＷＯＰＣＴ１グレースケールのためのレジェンド）オプソニン化の７７分又は１１０分後の、ＡＦ６４７標識ＪＮＪ－３７２（上部パネル）又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ（底部パネル）でオプソニン化されたＨ１９７５ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞との共培養下（Ｅ：Ｔ比＝５：１）における、ＦＩＴＣ－ＣＤ１１ｂ（マクロファージ原形質膜を標識）及びヘキスト（核を標識）で標識されたＭ２マクロファージのトロゴサイトーシスを示すハイコンテンツ共焦点顕微鏡からの代表的な画像を表す。白矢印は、標的細胞からＭ２マクロファージへのＡＦ６４７標識ＪＮＪ－３７２抗体の移動によって測定されるトロゴサイトーシス事象を示す。ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２ではトロゴサイトーシスは明白ではなかった。スケールバー＝２０μｍ。Ｍ：マクロファージ；Ｔ：Ｈ１９７５細胞。
定義
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む（但しそれらに限定されない）全ての刊行物は、完全に記載されているかのように、参照により本明細書に援用される。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけに使用され、限定することを意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用することができるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が使用される。
リストが提示される場合、特に指定しない限り、そのリストの各個々の要素及びそのリストの全ての組み合わせは別個の実施形態であることを、理解されたい。例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣ」として提示される実施形態のリストは、実施形態「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ又はＣ」、「Ｂ又はＣ」、又は「Ａ、Ｂ、又はＣ」を含むと解釈されるべきである。
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特にその内容が明確に指示していない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ又は３つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。
複数の列挙された要素間を接続する用語「及び／又は」は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用されるとき、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。
移行句「備える／含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」、及び「からなる（consisting）」は、特許用語において一般的に受け入れられている意味を含意することを意図しており、すなわち、（ｉ）「備える／含む（comprising）」は、「含む」、「含有する」、又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非制限的なものであり、その他の列挙されていない要素又は方法工程を除外するものではなく、（ｉｉ）「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲において特定されていない、あらゆる要素、工程、又は成分を除外し、並びに（ｉｉｉ）「から本質的になる」は、特定される材料又は工程、並びに、特許請求される発明の「基本的かつ新しい特徴（複数可）に実質的に影響しないもの」に、特許請求の範囲の範囲を制限する。句「備える／含む（comprising）」（又はその同等語）に関して記載される実施形態はまた、実施形態として、「からなる」及び「から本質的になる」に関して独立して記載されるものを提供する。
「同時投与」、「と共に投与」、「と組み合わせて投与」、「と組み合わせて」などは、選択された治療薬又は薬物の単一の患者への投与を包含し、治療薬又は薬物が同じ若しくは異なる投与経路によって又は同じ若しくは異なる時間に投与される治療レジメンを含むことを意図する。
「単離された」は、組み換え細胞などの、ある分子が産生される系の他の成分から実質的に分離及び／又は精製された分子の均質な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、又はウイルス）に加えて、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「単離された」とは、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない分子を指し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離された分子を包含する。
がんなどの疾患又は障害の「治療する」、「治療している」、又は「治療」は、以下のうちの１つ又は２つ以上を達成することを指す：障害の重篤度及び／若しくは期間を低減する、治療される障害に特徴的な症状の悪化を阻害する、以前に障害を有していた対象における障害の再発を制限若しくは予防する、又は以前に障害について症候性であった対象における症状の再発を制限若しくは予防する。
疾患又は障害を「予防する」、「予防している」、「予防」、又は「予防処置」は、対象における障害の発生を防ぐことを意味する。
「診断する」又は「診断」は、対象が所与の疾患若しくは病態に罹患しているかどうか、又は将来的に所与の疾患若しくは病態を発症し得るかどうか、又は予め診断された疾患若しくは病態に対する治療に応答する可能性が高いかどうかを判定する、すなわち、治療に応答する可能性について患者集団を層別化する方法を指す。診断は、典型的には、診断される疾患についての一般的な指針、又は対象が特定の治療に応答する可能性が高いことを示す他の基準に基づいて医師によって行われる。
「応答する」、「応答性」、又は「応答する可能性が高い」は、検出可能か又は検出不可能であるかにかかわらず、任意の種類の改善又は陽性応答、例えば、１つ又は２つ以上の症状の緩和又は回復、疾患の程度の減少、安定化した（すなわち悪化しない）疾患状態、疾患の蔓延の防止、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解（部分的であっても全体的であっても）を指す。
「新たに診断された」とは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんと診断されているが、多発性骨髄腫の治療を未だ受けていない対象を指す。
「治療有効量」は、必要な投与量及び期間で所望の治療結果を達成するための有効量を指す。治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体において所望の応答を引き出す１つの治療薬又は治療薬の組み合わせの能力によって様々であってよい。有効な１つの治療薬、又は治療薬の組み合わせの例示的な指標としては、例えば、患者の改善された健康が挙げられる。
「難治性」とは、治療に応答しない疾患を指す。難治性疾患は、治療前又は治療開始時に治療に抵抗性であり得るか、又は難治性疾患は、治療中に耐性疾患となり得る。
「再発性」とは、治療薬による前治療後の改善期間後に疾患又は疾患の徴候及び症状が再開することを指す。
「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。用語「対象」及び「患者」は、本明細書では互換的に使用される。
「約」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において実施例又は明細書のその他の箇所に別途明示的に記載のない限り、「約」は、当該技術分野の実施に従う１つの標準偏差又は５％までの範囲のいずれか大きい方の範囲内であることを意味する。
「がん」は、無制御なかたちで増殖し、場合によっては、患者の身体の他の領域へに転移（拡散）する傾向がある細胞の異常な成長を指す。
「ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がん」は、ＥＧＦＲ若しくはｃ－Ｍｅｔの検出可能な発現を有するか、又はＥＧＦＲ若しくはｃ－Ｍｅｔの変異若しくは増幅を有するがんを指す。ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔの発現、増幅、及び変異状態は、配列決定、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、免疫組織化学的検査、フローサイトメトリー、又はウェスタンブロッティングなどの既知の方法を使用して検出することができる。
「上皮成長因子受容体」又は「ＥＧＦＲ」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５２１９に示されているアミノ酸配列を有するヒトＥＧＦＲ（ＨＥＲ１又はＥｒｂＢ１としても知られている（Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０９：４１８－４２５，１９８４）に加えて、その天然に存在するバリアントを指す。
「肝細胞成長因子受容体」又は「ｃ－Ｍｅｔ」は、本明細書で使用するとき、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１２０９７２に示されているアミノ酸配列を有するヒトｃ－Ｍｅｔに加えて、その天然のバリアントを指す。
「二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体」又は「二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体」は、ＥＧＦＲに特異的に結合する第１のドメイン及びｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する第２のドメインを有する二重特異性抗体を指す。ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔに特異的に結合するドメインは、典型的には、ＶＨ／ＶＬ対であり、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔに対する結合に関して一価である。
「特異的結合」、又は「特異的に結合する」、又は「特異的な結合」、又は「結合する」とは、抗体が、抗原又は抗原内のエピトープに、他の抗原に対するよりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、抗体は、約５×１０－８Ｍ以下、例えば、約１×１０－９Ｍ以下、約１×１０－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、又は約１×１０－１２Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で、典型的には、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するそのＫＤよりも少なくとも１００倍低いＫＤで抗原又は抗原内のエピトープに結合する。解離定数は、既知のプロトコルを用いて測定することができる。しかしながら、抗原又は抗原内のエピトープに結合する抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、又はＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合がある。単一特異性抗体は、１つの抗原又は１つのエピトープに結合するが、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原又は２つの異なるエピトープに結合する。
「抗体」は、広義が意図され、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性、三重特異性、四重特異性などの多重特異性抗体、二量体の、四量体の、若しくは多量体の抗体、一本鎖抗体、抗体ドメイン、及び必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構造を含む、免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された、２本の重鎖（heavy chain、ＨＣ）及び２本の軽鎖（light chain、ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えばＩｇＭ）からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）、並びに重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）及び軽鎖定常領域（constant region、ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、抗原に結合する抗体領域である。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９７０） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－５０） （Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ （Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７），ＩＭＧＴ （Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７）、及びＡｂＭ （Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ （１９９６） Ｊ Ｂｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３：８００－１５）などの、様々な記述を使用して定義することができる。様々な記述と、可変領域の付番との対応が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（２００１） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０９：６５７－７０、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース；ウェブリソース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇを参照のこと）。ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを描写することができる。本明細書で使用する場合、「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、本明細書に別途明示的に記載のない限り、上述したＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、又はＡｂＭの方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
「抗原結合断片」とは、抗原に結合する免疫グロブリン分子の一部を指す。抗原結合断片は合成ポリペプチド、酵素により入手可能なポリペプチド、又は遺伝子組換えされたポリペプチドであってよく、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）、サメ可変性ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの、抗体のＣＤＲを再現したアミノ酸残基からなる最小の認識単位、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３が挙げられる。ＶＨ及びＶＬドメインは互いに、合成リンカーを介して結合し、様々なタイプの一本鎖抗体設計を形成することができ、ＶＨ及びＶＬドメインが、個別の一本鎖抗体構築物により発現される場合では、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内、又は分子間で対形成し、一価の抗原結合部位、例えば一本鎖Ｆｖ（single chain Fv、ｓｃＦｖ）又は二重特異性抗体を形成することができ、これらは、例えば国際公開第１９９８／４４００１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号、及び同第１９９２／０１０４７号に記載されている。
「モノクローナル抗体」は、抗体分子の実質的に均質な母集団（すなわち、母集団を構成する個別の抗体が、抗体重鎖からのＣ末端リジンの除去などの可能な周知の変更、あるいはアミノ酸異性化若しくはアミド分解、メチオニン酸化、又はアスパラギン若しくはグルタミンアミド分解などの翻訳後修飾を除いて同一である）から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は、典型的には、１つの抗原性エピトープに結合する。二重特異性モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原性エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性であってよく、又は、二重特異性などの多重特異性であってよく、一価、二価、又は多価であってよい。
「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
「ヒト抗体」とは、ヒト対象に投与されるときに、最小の免疫応答を有するように最適化された抗体を指す。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、当該定常領域もヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。このような例示的な系は、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばマウス又はラットを含む。「ヒト抗体」は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために使用した系の違い、フレームワーク若しくはＣＤＲへの体細胞変異の導入若しくは置換の意図的な導入、又はこれらの両方により、ヒトで発現した免疫グロブリンと比較したときにアミノ酸の違いを含有する。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７－８６に記載されるヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ ＭｏｌＢｉｏｌ ３９７：３８５－９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有し得る。少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
「組み換え」は、異なる供給源のセグメントを接合して、組み換えＤＮＡ、抗体、又はタンパク質を生成するときに、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離されたＤＮＡ、抗体、及び他のタンパク質を指す。
「二重特異性」は、２つの異なる抗原、又は同じ抗原中の２つの異なるエピトープに特異的に結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）又はＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓなどの、他の種（ホモログ）の同じ抗原に対して交差反応性を有し得るか、あるいは２つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合し得る。
「多重特異性」とは、同じ抗原内の２つ以上の異なる抗原又は２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する抗体を指す。多重特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト若しくはサル、例えば、Ｍａｃａｃａ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、若しくはＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓなどの他の種からの、同じ抗原（ホモログ）に対する交差反応性を有し得るか、又は２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合し得る。
「マクロファージ」は、骨髄起源の細胞を意味する。マクロファージは、主に結合組織及び血流中に存在するか又は組織若しくは腫瘍微小環境に常在する、大きな白血球である。これは、食作用によって異物及び感染性微生物を摂取し、抗原提示能力を有する。前駆体由来の非活性化マクロファージは、局所組織環境に応じて特定の分化を受ける。非活性化マクロファージは、損傷した細胞、活性化リンパ球、又は微生物産物などの組織内の環境要因に応答して、異なる機能性表現型に分化する。例えば、血液中の単球は、炎症又は侵襲中に組織に入ることができ、局所微小環境に依存して、Ｍ１又はＭ２表現型に極性化する。Ｍ１マクロファージ表現型は、高レベルの炎症促進性サイトカインの産生、病原体に対する抵抗性を媒介する能力、強力な殺微生物特性、反応性窒素及び酸素中間体の高い産生量、Ｔｈ１応答の促進、並びに病原体及び腫瘍細胞の殺傷を特徴とする。対照的に、Ｍ２マクロファージは、寄生体の制御、組織のリモデリング、免疫調節、腫瘍促進、及び効率的食作用活性への関与を特徴とする。Ｍ２マクロファージは、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ、及びＭ２ｄと呼ばれる４つの異なるサブタイプに更に細かく分類される。「マクロファージ」は、全てのマクロファージサブタイプを含む。
「単球」は、第一線防御機構に関与する白血球の種類に属するＣＤ１４＋ＣＤ３４－単核白血球を指し、樹状細胞又はマクロファージ前駆体に分化することが可能であると認識されている。単球は、通常、血液系内を移動する。外部刺激シグナルに応答して、単球は多くの免疫調節物質であるサイトカインを分泌し、組織における感染部位又は腫瘍部位に移動し、マクロファージに分化する。具体的には、単球は、上昇したレベルのＣＤ１４表面抗原マーカーを発現し、ＣＤ６４、ＣＤ９３、ＣＤ１８０、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、又はピーナッツ凝集素タンパク質（ＰＮＡ）から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを発現し得る。
「強化する」又は「誘導する」とは、対照（例えば、マクロファージ活性を強化する薬剤の存在下又は非存在下における増強）と比較したときに、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％を超えて、又は統計的に有意に、マクロファージの１つ又は２つ以上の機能又は活性を増強することを指す。
「マクロファージ活性を強化する」とは、単球の表現型変化及び／若しくは単球のマクロファージへのマクロファージ分化を誘導するか、又は非活性化マクロファージを活性化する、１つ又は２つ以上のマクロファージ活性の増強を指す。
「マクロファージ活性」とは、食作用、抗原提示、ＩＬ－１２、ＩＬ－１、ＴＮＦαの産生、又はＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２などの炎症性ケモカインの産生などの、任意のマクロファージ機能を指す。
「マクロファージ活性を強化する薬剤」は、低分子、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、合成結合分子、アプタマー、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、オリゴマー、ポリマー、脂質、又はリポソームであり得る。例示的なマクロファージ機能を強化する薬剤としては、サイトカイン、ケモカイン、パターン認識受容体リガンド、ホルモン、アドレナリン作動性及びコリン作動性アゴニスト、脂肪酸、リン脂質、免疫グロブリン又はその一部、免疫グロブリンのＦｃドメイン、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ヒスタミン、並びにペルオキシソーム増殖因子活性化受容体リガンドが挙げられる。
「トロゴサイトーシス」は、細胞膜の一部がドナー細胞からアクセプタ細胞に移動することを特徴とするプロセスを指す。典型的なアクセプタ細胞としては、マクロファージ及び単球が挙げられる。更なるアクセプタ細胞としては、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び好中球が挙げられる。細胞膜の一部のトロゴサイトーシスの媒介による移動は、例えばＥＧＦＲ若しくはｃ－Ｍｅｔなどの膜タンパク質、又は抗体が細胞表面分子に結合している抗体－抗原複合体の移動を含み得る。抗体の媒介によるトロゴサイトーシスは、アクセプタ細胞上で発現しているＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に抗体のＦｃ部分が結合することによって生じ得る。
「抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体の媒介によるトロゴサイトーシス」とは、ドナー細胞膜のＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔに結合している抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体によって媒介されるドナー細胞からアクセプタ細胞への細胞膜のＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔ含有部分のトロゴサイトーシスを指す。
「閾値」とは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象の集団からの生体試料中で観察されたマクロファージ又は単球の約３０パーセンタイル値以上である、マクロファージ又は単球のレベルを指す。
「アゴニスト」とは、細胞タンパク質に結合したとき、タンパク質の天然のリガンドによって誘導される少なくとも１つの反応又は活性を誘導する分子を指す。少なくとも１つの反応若しくは活性が、アゴニストの非存在下（例えば、陰性対照）において誘導される少なくとも１つの反応若しくは活性よりも少なくとも約２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％多く誘導されたとき、又はアゴニストの非存在下における誘導と比較して誘導が統計学的に有意であるとき、その分子はアゴニストである。
「アンタゴニスト」又は「阻害剤」とは、細胞タンパク質に結合したときに、タンパク質の天然のリガンドによって誘導される少なくとも１つの反応又は活性を抑制する分子を指す。少なくとも１つの反応若しくは活性が、アンタゴニストの非存在下（例えば、陰性対照）で抑制される少なくとも１つの反応若しくは活性よりも少なくとも約２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％多く抑制されたとき、又はアンタゴニストの非存在下における抑制と比較して抑制が統計的に有意であるとき、その分子はアンタゴニストである。
「ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤」は、ＰＤ－１下流シグナル伝達を阻害する分子を指す。ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２に結合する分子であってよい。
「生体試料」は、対象から単離された類似の流体、細胞、又は組織並びに、対象の体内に存在する流体、細胞、又は組織の集合体を指す。例示的な試料は、生物学的流体、例えば、血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ液、尿、唾液、嚢胞液、涙液、糞便、喀痰、分泌組織及び器官の粘膜分泌液、膣分泌液、腹水、胸膜腔、心膜腔、腹膜腔、腹腔、及び他の体腔の流体、気管支洗浄によって回収された流体、滑液、対象又は生物学的起源、例えば、細胞又は器官の馴化培地を含む細胞及び器官の培養培地、洗浄液などと接触した液体溶液、組織生検材料、腫瘍組織生検材料、腫瘍組織試料、穿刺吸引、外科的に切除された組織、器官培養液又は細胞培養液である。
「低フコース」又は「低フコース含量」とは、本願で使用するとき、約１％～１５％のフコース含量を有する抗体を指す。
「正常なフコース」又は「正常なフコース含量」とは、本明細書で使用するとき、約５０％を超える、典型的には約８０％を超える、又は８５％を超えるフコース含量を有する抗体を指す。
本開示の方法
ＪＮＪ－６１１８６３７２（ＪＮＪ－３７２）は、米国特許第９，５９３，１６４号に記載されているＩｇＧ１抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ二重特異性抗体である。以前の研究によって、ＪＮＪ－３７２は、３つの異なる機序：各受容体へのリガンドの結合を遮断することを介したリガンド誘導活性化の阻害、分解を介した受容体の不活化、並びにＡＤＣＣ及びＡＤＣＰによるＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現腫瘍のＦｃエフェクタの媒介による殺傷によって腫瘍の成長及び進行を阻害することが示された（Ｍｏｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７６（１３），２０１６．；２０１６年５月２３日にオンラインで公開；ＤＯＩ：１０．１１５８／０００８－５４７２）。
本発明は、ＪＮＪ－３７２ Ｆｃ相互作用がＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを媒介するだけでなく、ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達のＪＮＪ－３７２の媒介による阻害も増強すること、並びに単球又はマクロファージは、トロゴサイトーシスを通じたＪＮＪ－３７２の媒介による抗腫瘍効果に十分かつ必要であるという驚くべき知見に少なくとも部分的に基づく。
いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本明細書に開示される驚くべき結果に基づいて、患者の血液中の単球のレベルは、患者の腫瘍におけるマクロファージのレベルと正の相関を示し得ると予測することができ、このことからＪＮＪ－３７２に対するより良好な応答を予測することができる。同様に、ＩＨＣ又は免疫遺伝子シグネチャによりマクロファージのレベルが増加しているか又はＦｃγＲＩ若しくはＦｃγＲＩＩＩａのレベルが増加している腫瘍組織試料は、より多くの免疫細胞相互作用を提供することによって、ＪＮＪ－３７２に対してより良好に応答すると予測することができる。また、本明細書に記載の結果に基づいて、ＪＮＪ－３７２と組み合わせて使用されるマクロファージ活性を強化する治療は、ＪＮＪ－３７２の全体的な有効性を増大させると予測することができる。例えば、ＧＭ－ＣＳＦによる治療は、循環単球の腫瘍関連マクロファージへの分化を駆動し、これによってＪＮＪ－３７２の有効性が増加し得る。抗ＣＤ４７療法による治療は、マクロファージの負の阻害を遮断し、それによって、マクロファージを活性化して、ＪＮＪ－３７２活性を強化することができる。同様に、ＰＤ－（Ｌ）１軸の阻害、ＨＤＡＣの阻害、又はＣＤ１１ｂの刺激は、腫瘍関連マクロファージの極性化をシフトさせることができ、その結果、マクロファージの活性がより高くなり、したがって、ＪＮＪ－３７２治療と相乗的に作用して腫瘍の殺傷を強化する。
この新規機序の同定は、血液又は腫瘍試料中の患者の相対的又は絶対的単球及び／又はマクロファージ量に基づく、ＪＮＪ－３７２に対してより応答し得る、治療の患者の選択と、ＪＮＪ－３７２と組み合わせてマクロファージ活性を強化する分子を使用する併用治療法との基準を提供する。
本開示は、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象を治療する方法であって、対象におけるマクロファージ活性を強化する薬剤と組み合わせて、治療的に有効な量の単離二重特異性上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）／肝細胞成長因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）抗体を対象に投与することを含む方法を提供する。
本開示はまた、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答するＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象を診断及び治療する方法であって、対象からの生体試料を提供することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルを測定することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルが閾値よりも高いとき、対象が、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答するＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有すると診断することと、抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答すると診断された対象に、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体を投与するか又は投与するために提供することと、を含む方法も提供する。
本開示はまた、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有すると疑われるかか又は有する対象を二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体で治療する方法であって、対象が、閾値よりも高いマクロファージ又は単球レベルを有すると判定することと、閾値よりも高いマクロファージ又は単球レベルを有すると判定された対象に、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体を投与するか又は投与するために提供することと、を含む方法も提供する。
本開示はまた、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に対するＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象の応答を予測する方法であって、対象からの生体試料を提供することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルを測定することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルが閾値よりも高いとき、対象が応答者であると予測することと、を含む方法も提供する。
本開示はまた、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答するＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象を治療する方法であって、対象からの生体試料を提供することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルを測定することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルが閾値よりも高いとき、対象を二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体で治療することと、を含む方法も提供する。
本開示はまた、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象が二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答するかどうかを判定し、対象を治療するかどうかを判断する方法であって、対象からの生体試料を提供することと、生体試料からのマクロファージ又は単球レベルを測定することと、生体試料からのマクロファージ若しくは単球レベルが閾値よりも高いとき、ＥＧＦＲ若しくはｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象が二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答すると診断するか、又は生体試料からのマクロファージ若しくは単球レベルが閾値よりも低いとき、ＥＧＦＲ若しくはｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象が二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答しないと診断することと、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答すると診断された二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体対象を投与するか、又は二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答しないと診断された対象に二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体を投与することを控えることと、を含む方法も提供する。
マクロファージ又は単球の「レベル」は、定性的（例えば、存在若しくは非存在）又は定量的（例えば、絶対細胞数、相対数、全細胞数からのパーセント（％）、若しくは視野内の陽性細胞％）であり得る。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球は、生体試料中に存在しない。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、健常対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の平均値を上回る。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約３０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約３５パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約４０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約４５パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約５０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約６０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約６５パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約７０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約７５パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約８０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約８５パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約９０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約９５パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、マクロファージ又は単球のレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料において観察されるマクロファージ又は単球の約１００パーセンタイル値である。
ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象におけるマクロファージ又は単球のレベルを、健常対象からの生体試料におけるマクロファージ又は単球のレベルに対して比較してもよい。マクロファージ又は単球の増加したレベルは、例えば、健常対象からの生体試料中のマクロファージ又は単球のレベルと比較したとき、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、又は約１０倍高いものであり得る。
マクロファージは、例えば、ＣＤ６８、ｉＮＯＳ（誘導性一酸化窒素合成酵素）、及びＣＤ１６３を、汎マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、又はＭ２マクロファージのマーカーとしてそれぞれ使用し、陽性染色の領域の割合を評価し、非腫瘍組織と比較して、例えば、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現腫瘍を有する対象から得られた腫瘍組織生検材料から同定することができる（例えば、ＣＤ６８の陽性染色の面積％が、腺がん、扁平上皮、又は大細胞がんでは非腫瘍に対して２倍増加したことが記載されている、Ａｌｍａｔｏｏｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｉｃｒｅｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ９：１－１１，２０１６を参照されたい）。マクロファージは、例えば、免疫遺伝子シグネチャを使用して、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現腫瘍を有する対象から得られた腫瘍組織生検材料から同定することができる。
単球は、単球マーカーＣＤ１４を使用し、蛍光細胞選別を使用して、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現腫瘍を有する対象からの血液試料から同定することができる。
いくつかの実施形態では、生体試料は、血液試料である。
いくつかの実施形態では、生体試料は、腫瘍組織生検材料である。
同様に、より多くの免疫細胞相互作用を提供することによってＪＮＪ－３７２に対する患者の応答を予測するために、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルを使用してもよい。
いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、健常対象からの生体試料において観察されるＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの平均値を上回る。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約３０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約３５パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約４０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約４５パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約５０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約６０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約６５パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約７０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約７５パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約８０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約８５パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約９０パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約９５パーセンタイル値である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象からの生体試料中で観察されたＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルの約１００パーセンタイル値である。
ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、腫瘍組織試料（新鮮凍結又はパラフィン包埋腫瘍組織切片などにおいて免疫組織化学的検査を用いて測定することができる。ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルは、顕微鏡視野内のＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａ細胞率（％）として表すことができる。ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩＩａのレベルはまた、免疫遺伝子シグネチャパネルの一部として又は個々の遺伝子として、腫瘍組織試料から単離されたＲＮＡを使用して、遺伝子発現レベルで測定することもできる。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、
配列番号１の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号４の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５のＬＣＤＲ２、配列番号６のＬＣＤＲ３を含む、ＥＧＦＲに結合する第１のドメインと、配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２、配列番号９のＨＣＤＲ３、配列番号１０のＬＣＤＲ１、配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む、ｃ－Ｍｅｔに結合する第２のドメインと、を含む。
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第１のドメインは、配列番号１３の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号１４の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ｃ－Ｍｅｔに結合する第２のドメインは、配列番号１５のＶＨ及び配列番号１６のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。ＩｇＧ１定常ドメイン内にはいくつかの多様性（例えば、周知のアロタイプ）が存在し、２１４、３５６、３５８、４２２、４３１、４３５、又は４３６位（ＥＵ付番に従った残基の付番）に多様性を有する（例えば、ＩＭＧＴ Ｗｅｂリソース；ＩＭＧＴ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ （ＩＧ ａｎｄ ＴＲ）；Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ａｌｌｅｌｅｓ；ａｌｌｏｔｙｐｅｓを参照されたい）。二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、Ｇ１ｍ１７、Ｇ１ｍ３、Ｇ１ｍ１、Ｇ１ｍ２、Ｇ１ｍ２７、又はＧ１ｍ２８などの任意のＩｇＧ１アロタイプであってよい。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、配列番号１７の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号１８の第１の軽鎖（ＬＣ１）、配列番号１９の第２の重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号２０の第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む。
いくつかの実施形態では、マクロファージ活性を強化する薬剤は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４７アンタゴニスト、抗ＣＤ４７抗体、ＨＤＡＣ阻害剤、ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤、又はＣＤ１１ｂアゴニストである。
いくつかの実施形態では、マクロファージ活性を強化する薬剤は、ＧＭ－ＣＳＦである。
いくつかの実施形態では、マクロファージ活性を強化する薬剤は、抗ＣＤ４７アンタゴニストである。
いくつかの実施形態では、マクロファージ活性を強化する薬剤は、抗ＣＤ４７抗体である。
いくつかの実施形態では、マクロファージ活性を強化する薬剤は、ＨＤＡＣ阻害剤である。
いくつかの実施形態では、マクロファージ活性を強化する薬剤は、ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤である。
いくつかの実施形態では、マクロファージ活性を強化する薬剤は、ＣＤ１１ｂアゴニストである。
いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣ２阻害剤である。
例示的なＣＤ４７アンタゴニストは、ＣＤ４７リガンド－Ｆｃ融合体、例えば、ＴＴＩ６２１及び抗ＣＤ４７抗体などのＳＩＲＰα－Ｆｃ融合体である。
例示的な抗ＣＤ４７抗体は、国際公開第２０１６／０８１４２３号に開示されているＨｕ５Ｆ９－Ｇ４、ＴＩ－０６１、ＴＴＩ－６２２、ＡＯ－１７６、ＩＢＩ－１８８、ＡＬＸ－１４８、ＳＲＦ－２３１、ＣＣ－９０００２、及び抗ＣＤ４７抗体である。
例示的なＨＤＡＣ阻害剤は、ボリノスタット、ロミデプシン、チダミド、パノビノスタット、ベリノスタット、プラシノスタット、アベキシノスタット、エンチノスタット、バフィデムスタット、ＧＳＫ－２８７９５５２、リコリノスタット、イアダデムスタット、ドマチノスタット、レスミノスタット、ＡＺＤ－９４６８、ナナチノスタット、ＣＧ－２００７４５、モセチノスタット、ＩＮＣＢ－５９８７２、ＩＭＧ－７２８９、チノスタムスチン、ＲＤＮ－９２９、ＹＭ－７５３、ＨＧ－１４６、ＮＢＭ－ＢＭＸ、ＴＡＫ－４１８、セクリデムシタット、ＣＫＤ－５０４、ＣＫＤ－５０６、ＣＣ－９００１１、ＫＡ－２５０７、及びシトリノスタットである。
例示的なＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、ペンブロリムマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、シンチリマブ、セミプリマブ（ＬＩＢＴＡＹＯ（登録商標））、トリポリバマブ、チスレリズマブ、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、ドストラリマブ、ゲノリムズマブ、若しくはセトレリマブなどのＰＤ－１に結合する抗体、又はＰＤ－Ｌ１に結合する抗体であり、例えば、ＰＤ－１抗体は、エンバホリマブ、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、デュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））、及びアベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））である。
市販の抗体は、認可された販売業者又は薬局を介して購入することができる。低分子のアミノ酸配列構造は、ＣＡＳ ｒｅｇｉｓｔｒｙからの企業によるＵＳＡＮ及び／又はＩＮＮ寄託から見出すことができる。
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ活性化変異、ＥＧＦＲ遺伝子増幅、循環ＨＧＦのレベルの上昇、野生型ｃ－Ｍｅｔ、ｃ－Ｍｅｔ活性化変異、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅、又は変異体ＫＲＡＳに関連する。
がんに関連し得る例示的なＥＧＦＲ活性化変異としては、チロシンキナーゼ活性の上昇、受容体ホモ二量体及びヘテロ二量体の形成、リガンド結合の強化などのＥＧＦＲの少なくとも１つの生物活性を増加させる点変異、欠失変異、挿入変異、逆位、又は遺伝子増幅が挙げられる。変異は、ＥＧＦＲ遺伝子又はＥＧＦＲ遺伝子に関連する調節領域の任意の部分に位置し得、エキソン１８、１９、２０、若しくは２１における変異又はキナーゼドメインにおける変異が挙げられる。ＥＧＦＲ活性化変異の他の例は、当該技術分野において既知である（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２７２０８３号を参照されたい）。受容体ホモ及びヘテロ二量体、受容体リガンド、自己リン酸化部位、並びにＥｒｂＢの媒介によるシグナル伝達に関与するシグナル伝達分子を含むＥＧＦＲ及び他のＥｒｂＢ受容体に関する情報は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｈｙｎｅｓ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ５：３４１－３５４，２００５を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ活性化変異は、Ｌ７１８Ｑ、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸である）、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸である）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｃ７９７Ｓ、Ｌ８５８Ｐ、若しくはＴ７９０Ｍの置換、Ｅ７４６～Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８～Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６とＡ７６７との間へのＡｌａ（Ａ）の挿入、Ｓ７６８とＶ７６９との間へのＳｅｒ、Ｖａｌ、及びＡｌａ（ＳＶＡ）の挿入、Ｐ７７２とＨ７７３との間へのＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入、Ｄ７６１とＥ７６２、Ａ７６３とＹ７６４、Ｙ７６４とＹ７６５、Ｍ７６６とＡ７６７、Ａ７６７とＶ７６８、Ｓ７６８とＶ７６９、Ｖ７６９とＤ７７０、Ｄ７７０とＮ７７１、Ｎ７７１とＰ７７２、Ｐ７７２とＨ７７３、Ｈ７７３とＶ７７４、Ｖ７７４とＣ７７５との間への１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入、ＥＧＦＲエキソン２０における１つ又は２つ以上の欠失又は１つ又は２つ以上の挿入である。
例示的なｃ－Ｍｅｔ活性化変異としては、チロシンキナーゼ活性の上昇、受容体ホモ二量体及びヘテロ二量体の形成、リガンド結合の強化などのｃ－Ｍｅｔタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増加させる点変異、欠失変異、挿入変異、逆位、又は遺伝子増幅が挙げられる。変異は、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子の任意の部分又はｃ－Ｍｅｔのキナーゼドメインにおける変異などの遺伝子に関連する制御領域に位置し得る。例示的なｃ－Ｍｅｔ活性化変異は、残基位置Ｎ３７５、Ｖ１３、Ｖ９２３、Ｒ１７５、Ｖ１３６、Ｌ２２９、Ｓ３２３、Ｒ９８８、Ｓ１０５８／Ｔ１０１０、及びＥ１６８における変異である。ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの変異又は遺伝子増幅を検出する方法は周知である。
いくつかの実施形態では、変異体ＫＲＡＳは、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、又はＧ１２Ａの置換を有する。
いくつかの実施形態では、対象は、新たに診断されたＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する。
いくつかの実施形態では、新たに診断されたＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象は、１つ又は２つ以上のＥＧＦＲエキソン２０変異を有する。エキソン２０変異（１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に対して一般的に抵抗性である（例えば、国際公開第２０１８／０９４２２５号を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、対象は、以前の抗がん療法による治療に対して抵抗性であるか又は抵抗性を獲得している。
いくつかの実施形態では、以前の抗がん療法は、化学療法、標的抗がん療法、又はキナーゼ阻害剤である。
いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ、又はＡＸＬの阻害剤である。
いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ラゼルチニブ、ポジオチニブ、クリオチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、アキシチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、レゴラフェニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、又はスニチニブである。
いくつかの実施形態では、対象は、ＥＧＦＲ阻害剤に対して抵抗性であるか又は抵抗性を獲得している。がんが抵抗性を獲得し得る例示的なＥＧＦＲ阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、パンチヌムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、マツズマブ、ニモツズマブ、低分子ＥＧＦＲ阻害剤であるエルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、ＥＫＢ－５６９（ペリチニブ、不可逆的ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、汎ＥｒｂＢ及び他の受容体チロシンキナーゼ阻害剤であるラパチニブ（ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤）、ペリチニブ（ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤）、バンデタニブ（ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（商標）、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、及びＲＥＴ ＴＫＩ）、ＰＦ００２９９８０４（ダコミチニブ、不可逆的汎ＥｒｂＢ ＴＫＩ）、ＣＩ－１０３３（不可逆的汎ｅｒｂＢ ＴＫＩ）、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２、不可逆的汎ＥｒｂＢ ＴＫＩ）、ＡＶ－４１２（二重ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ２阻害剤）、ＥＸＥＬ－７６４７（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＧＥＶＧＲ、及びＥｐｈＢ４阻害剤）、ＣＯ－１６８６（不可逆的変異体選択的ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、ＡＺＤ９２９１（不可逆的変異体選択的ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、並びにＨＫＩ－２７２（ネラチニブ、不可逆的ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２阻害剤）である。
様々な定性的及び／又は定量的な方法を用いて、対象が抗がん療法による治療に対して抵抗性であるかどうか、抵抗性を発現しているかどうか、又は抵抗性を発現しやすいかどうかを判定することができる。抗がん療法に対する抵抗性に関連し得る症状としては、患者の健康の低下若しくは定常状態、腫瘍サイズの増大、腫瘍の成長の低減の停止若しくは減速、及び／又は１つの位置から他の器官、組織、若しくは細胞への体内におけるがん性細胞の拡散が挙げられる。食欲低下、認知障害、うつ病、呼吸困難、疲労、ホルモン撹乱、好中球減少、疼痛、末梢神経障害、及び性機能不全などのがんに関連する様々な症状の再確立又は悪化も、対象が抗がん療法に対する抵抗性を発現しているか又は発現しやすいことの指標となり得る。がんに関連する症状は、がんの種類に応じて異なり得る。例えば、子宮頸部がんに関連する症状としては、異常出血、異常な激しい膣分泌物、通常の月経周期に関連しない骨盤痛、膀胱痛又は排尿中の疼痛、及び定期的な月経期間の間、性交、膣洗浄、又は内診後の出血を挙げることができる。肺癌に関連する症状としては、しつこい咳、喀血、息切れ、ぜーぜーする胸痛、食欲減退、意図しない体重減少、及び疲労を挙げることができる。肝がんの症状としては、食欲及び体重の減少、特に背部及び肩部に及び得る腹部の右上部分における腹痛、悪心及び嘔吐、全身の衰弱及び疲労、肝肥大、腹部膨潤（腹水）、並びに皮膚及び白眼の黄変（黄疸）を挙げることができる。腫瘍学の当業者であれば、特定の種類のがんに関連する症状を容易に特定することが可能である。
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんは、上皮細胞がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺腺がん、小細胞肺がん、結腸直腸がん、肛門がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頚部がん、咽頭がん、鼻のがん、膵臓がん、皮膚がん、口腔がん、舌のがん、食道がん、膣がん、子宮頚がん、脾臓のがん、精巣がん、胃がん、胸腺のがん、結腸がん、甲状腺がん、肝臓がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、又は散発性若しくは遺伝性の乳頭状腎細胞がん（ＰＲＣＣ）である。
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、上皮細胞がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、乳がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、卵巣がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、肺がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、肺腺がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、小細胞肺がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、結腸直腸がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、肛門がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、前立腺がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、腎臓がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、膀胱がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、頭頸部がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、咽頭がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、鼻のがんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、膵臓がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、皮膚がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、口腔がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、舌のがんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、食道がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、膣がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、子宮頸がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、脾臓のがんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、精巣がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、胃がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、胸腺のがんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、結腸がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、甲状腺がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、肝がんである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、肝細胞がん（ＨＣＣ）である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんは、散発性若しくは遺伝性の乳頭状腎細胞がん（ＰＲＣＣ）である。
いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、扁平上皮がん、腺がん、及び大細胞がんを含む。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣの細胞は、上皮表現型を有する。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、１つ又は２つ以上のＥＧＦＲ阻害剤による治療に対する抵抗性を獲得している。
ＮＳＣＬＣでは、ＥＧＦＲ遺伝子における特定の変異は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ ＴＫＩ）に対する高い応答率（７０～８０％）に関連する。エキソン１９における５つのアミノ酸欠失又はＥＧＦＲにおける点変異Ｌ８５８Ｒは、ＥＧＦＲ ＴＫＩの感度に関連している（Ｎａｋａｔａ ａｎｄ Ｇｏｔｏｈ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ １６：７７１－７８１，２０１２）。これら変異は、ＥＧＦＲキナーゼ活性のリガンド非依存性活性化をもたらす。ＥＧＦＲ変異の活性化は、ＮＳＣＬＣ患者の１０～３０％において発生し、東アジア人、女性、喫煙未経験者、及び腺がんの組織学的所見を有する患者において有意により一般的である（Ｊａｎｎｅ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２（１４ Ｓｕｐｐｌ）：４４１６ｓ－４４２０ｓ，２００６）。ＥＧＦＲ遺伝子増幅は、ＥＧＦＲ ＴＫＩ治療後の応答にも強く相関する（Ｃａｐｐｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９７：６４３－５５，２００５）。ＥＧＦＲエキソン２０挿入は、ＥＧＦＲ ＴＫＩ抵抗性と関連している。
ＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣ患者の大部分は、初期にはＥＧＦＲ ＴＫＩ療法に応答するが、事実上全てが、持続的応答を防止する抵抗性を獲得する。患者の５０～６０％は、ＥＧＦＲのキナーゼドメインにおける第二部位点変異（Ｔ７９０Ｍ）に起因して抵抗を獲得する。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性となった全ての腫瘍のほぼ６０％で、ｃ－Ｍｅｔ発現が増加する、ｃ－Ｍｅｔが増幅する、又はその唯一の公知のリガンドであるＨＧＦが増加する（Ｔｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，１７：７７－８８，２０１０）。
いくつかの実施形態では、対象は、ＣＤ１６の１５８位でフェニルアラニンについてホモ接合型であるか、又はＣＤ１６の１５８位でバリン及びフェニルアラニンについてヘテロ接合型である。
ＣＤ１６の１５８位におけるフェニルアラニンについてホモ接合型である対象は、ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｆ／Ｆ遺伝子型を有する。ＣＤ１６の１５８位におけるバリン及びフェニルアラニンについてヘテロ接合型である対象は、ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｆ／Ｖ遺伝子型を有する。ＣＤ１６は、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）又は低親和性免疫グロブリンガンマＦｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａアイソフォームとしても知られている。ＦｃγＲＩＩＩａタンパク質残基の１５８位におけるバリン／フェニルアラニン（Ｖ／Ｆ）多型性は、ヒトＩｇＧに対するＦｃγＲＩＩＩａ親和性に影響を及ぼすことが示されている。ＦｃγＲＩＩＩａー１５８Ｆ／Ｆ又はＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｆ／Ｖ多型性を有する受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖ／Ｖと比較するとき、Ｆｃ結合の低減を示し、したがってＡＤＣＣの低減を示す。ヒトＮ結合オリゴ糖状のフコースの欠如又は低量のフコースは、抗体のヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）への結合の改善に起因して、抗体のＡＤＣＣを誘発する能力を改善する（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３～４０、２００２年）。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、約１％～約１０％の低フコース含量を有する。低フコース含量を有する二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｆ／Ｆ又はＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｆ／Ｖ遺伝子型を有する患者の治療においてより有効であり得る。日常的方法を用いて、患者をＦｃγＲＩＩＩａ多型性について分析することができる。
低フコース含量を有する抗体は、培養物の浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４（：２４９－６５，２０１２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０，２００２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ；２（４），２０１０；印刷に先立つ電子公開、ＰＭＩＤ：２０５６２５８２）、ラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の宿主細胞株としての適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３，２００３）、α１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１－９０８，２００４）、あるいはβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα－マンノシダーゼＩＩ又は強力なα－マンノシダーゼＩ阻害物質のキフネンシンの共発現（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２８１：５０３２－５０３６，２００６、Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ９３：８５１－８６１，２００６、Ｘｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９９；６５２－６５，２００８）などの、二分岐複合型のＦｃオリゴ糖を有する比較的高度に脱フコシル化された抗体の効果的な発現につながることが報告されている様々な方法を用いて得ることができる。
いくつかの実施形態では、対象には、第３の抗がん療法が更に施される。
いくつかの実施形態では、第３の抗がん療法は、化学療法、標的抗がん療法、又はキナーゼ阻害剤である。
いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ、又はＡＸＬの阻害剤である。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲの阻害剤である。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ｃ－Ｍｅｔの阻害剤である。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＨＥＲ２の阻害剤である。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＨＥＲ３の阻害剤である。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＨＥＲ４の阻害剤である。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＶＥＧＦＲの阻害剤である。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、又はＡＸＬの阻害剤である。
いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ラゼルチニブ、ポジオチニブ、クリオチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、アキシチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、レゴラフェニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、又はスニチニブである。
いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、エルロチニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ゲフィチニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ラパチニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、バンデタニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、アファチニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、オシメルチニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ラゼルチニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ポジオチニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、クリオチニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、カボザンチニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、カプマチニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、アキシチニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、レンバチニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ニンテダニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、レゴラフェニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、パゾパニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ソラフェニブである。いくつかの実施形態では、キナーゼ阻害剤は、スニチニブである。
本開示の方法において二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体と組み合わせて施され得る抗がん療法としては、化学療法薬又は当業者に既知の他の抗がん治療薬のうちの任意の１つ又は２つ以上が挙げられる。化学療法剤は、がんの治療に有用な化学化合物であり、増殖阻害剤又は他の細胞毒性剤を含み、アルキル化剤、抗代謝剤、抗微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、血管新生阻害剤などが挙げられる。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））など；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなど；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパなど；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン（methylamelamine）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど；抗生物質、例えばアクラシノマイシン（aclacinomysin）、アクチノマイシン、アウトラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど；代謝拮抗物質、例えばメトトレキサート及び５－ＦＵなど；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど；プリン類似体、例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；副腎皮質ホルモン合成阻害薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補充剤（folic acid replenisher）、例えばフォリン酸（frolinic acid）など；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン（elfornithine）；エリプチニウムアセテート（elliptinium acetate）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン（triaziquone）；２，２′，２″－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド又はタキサンファミリーのメンバー、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））及びその類似体；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、パゾパニブ（ＶＯＴＲＩＥＮＴ（商標））、トセラニブ（ＰＡＬＬＡＤＩＡ（商標））、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（商標））、セジラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ（登録商標））、レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３－４５０６）、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ－７０１）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標））、アファチニブ（ＢＩＢＷ ２９９２）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標））、ネラチニブ（ＨＫＩ－２７２）などを含む受容体チロシンキナーゼ及び／又は血管新生の阻害剤、並びに上述のいずれかの医薬的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。腫瘍に対するホルモン作用を制御又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン、ＬＹ １１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））を含む抗エストロゲン薬など；並びに抗アンドロゲン薬、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン；並びに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体もまた、この定義に含まれる。Ｗｉｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｃａｌａｂｒｅｓｉ ｅｔ ａＬ，ｅｄｓ．），Ｃｈａｐｔｅｒ １０，ＭｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに記載されているような他の一般的な細胞毒性化合物もまた、本発明の方法に適用可能である。
投与
二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体及びマクロファージ活性化剤は、混合物で一緒に、単剤として同時に、又は任意の順序で単剤として逐次対象に投与され得る。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、マクロファージ活性化剤の投与前に投与される。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、マクロファージ活性化剤の投与後に投与される。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、マクロファージ活性化剤の投与と同時に投与される。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、第３の抗がん剤の投与前に投与される。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、第３の抗がん剤の投与後に投与される。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、第３の抗がん剤の投与と同時に投与される。
二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体及びマクロファージ活性化剤又は第３の抗がん療法の投与間の時間の長さは、数分間、例えば、約１、２、５、１０、３０、若しくは６６０分間、又は数時間、例えば、約２、４、６、１０、１２、２４、若しくは３６時間、又は例えば、約２、４、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６日間以上であり得る。
二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体及びマクロファージ活性化剤又は第３の抗がん剤は、医薬的に許容される担体中で投与され得る。「担体」は、本発明の抗体と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用して、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体を製剤化してもよい。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。散剤カプセル剤、及び錠剤などの経口固形製剤の場合、好適な担体及び添加剤としては、デンプン、糖類、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などが挙げられる。経口固形製剤は、糖などの物質でコーティングしてもよく、又は主要な吸収部位を調節するために腸溶性コーティングしてもよい。非経口投与の場合、担体は、滅菌水を含み得、溶解度の上昇又は保存のために他の賦形剤を添加してもよい。注射用の懸濁液又は溶液はまた、水性担体を適切な添加剤と共に用いて製造してもよい。好適なビヒクル、及び他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ６９１－１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８－９８９を参照されたい。
組成物は、生理学的条件を近似するために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、滑沢剤及び着色剤などを含有し得る。医薬製剤中の二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体及びマクロファージ活性化剤の濃度は、約０．５重量％未満から、通常少なくとも約１重量％まで、最大で１５重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、又は５０重量％まで変動し得、また、選択される具体的な投与モードに従って、必要用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。固体形態を含む医薬組成物は、約０．１ｍｇ～約２０００ｍｇ、例えば、約１ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、又は約１０００ｍｇの活性成分を含有し得る。
投与モードは、錠剤、カプセル剤、液剤、散剤、ゲル剤、粒子の製剤を用いた、宿主に抗体を送達する任意の好適な経路、例えば、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下、肺、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）であってもよく、シリンジ、埋込デバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプに含まれていてもよく、又は当該技術分野において周知の、当業者によって認識される他の手段に含まれ得る製剤を用いた、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下、肺、経粘膜投与（経口、鼻腔内、膣内、直腸）などの、抗体を宿主に送達する任意の好適な経路であり得る。部位特異的投与は、例えば、腫瘍内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸内、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。
本開示の方法で使用される二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体の作製
本開示の方法において使用することができる例示的な抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、ＪＮＪ－３７２である。ＪＮＪ－２７３は、以下のアミノ酸配列を特徴とする：
ＥＧＦＲ結合アーム
＞配列番号１（ＨＣＤＲ１、ＥＧＦＲ結合アーム）
ＴＹＧＭＨ
＞配列番号２（ＨＣＤＲ２、ＥＧＦＲ結合アーム）
ＶＩＷＤＤＧＳＹＫＹＹＧＤＳＶＫＧ
＞配列番号３（ＨＣＤＲ３、ＥＧＦＲ結合アーム）
ＤＧＩＴＭＶＲＧＶＭＫＤＹＦＤＹ
＞配列番号４（ＬＣＤＲ１、ＥＧＦＲ結合アーム）
ＲＡＳＱＤＩＳＳＡＬＶ
＞配列番号５（ＬＣＤＲ２、ＥＧＦＲ結合アーム）
ＤＡＳＳＬＥＳ
＞配列番号６（ＬＣＤＲ３、ＥＧＦＲ結合アーム）
ＱＱＦＮＳＹＰＬＴ
＞配列番号７（ＨＣＤＲ１、ｃ－Ｍｅｔ結合アーム）
ＳＹＧＩＳ
＞配列番号８（ＨＣＤＲ２、ｃ－Ｍｅｔ結合アーム）
ＷＩＳＡＹＮＧＹＴＮＹＡＱＫＬＱＧ
＞配列番号９（ＨＣＤＲ３、ｃ－Ｍｅｔ結合アーム）
ＤＬＲＧＴＮＹＦＤＹ
＞配列番号１０（ＬＣＤＲ１、ｃ－Ｍｅｔ結合アーム）
ＲＡＳＱＧＩＳＮＷＬＡ
＞配列番号１１（ＬＣＤＲ２、ｃ－Ｍｅｔ結合アーム）
ＡＡＳＳＬＬＳ
＞配列番号１２（ＬＣＤＲ３、ｃ－Ｍｅｔ結合アーム）
ＱＱＡＮＳＦＰＩＴ
＞配列番号１３（ＶＨ、ＥＧＦＲ結合アーム）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＤＤＧＳＹＫＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＩＴＭＶＲＧＶＭＫＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
＞配列番号１４（ＶＬ、ＥＧＦＲ結合アーム）
ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＳＡＬＶＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＥＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞配列番号１５（ＶＨ、ｃ－Ｍｅｔ結合アーム）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＥＴＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＨＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＹＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＲＧＴＮＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
＞配列番号１６（ＶＬ、ｃ－Ｍｅｔ結合アーム）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＷＬＡＷＦＱＨＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＬＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＳＦＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
＞配列番号１７ ＨＣ１
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＤＤＧＳＹＫＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＩＴＭＶＲＧＶＭＫＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
＞配列番号１８ ＬＣ１
ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＳＡＬＶＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＥＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
＞配列番号１９ ＨＣ２
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＥＴＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＨＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＹＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＲＧＴＮＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
＞配列番号２０ ＬＣ２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＷＬＡＷＦＱＨＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＬＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＳＦＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
米国特許第９，５９３，１６４号に記載のＪＮＪ－３７２と比較したときに同様の特徴を示す限り、公的に入手可能な他の二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体を本開示の方法において使用してもよい。本開示の方法において使用することができる二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体はまた、公的に入手可能なＥＧＦＲ結合ＶＨ／ＶＬドメイン及びｃ－Ｍｅｔ結合ＶＨ／ＶＬドメインを組み合わせ、得られた二重特異性抗体を、米国特許第９，５９３，１６４号に記載の特徴について試験することによっても作製することができる。
本開示の方法で使用される二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、例えば、無細胞環境においてインビトロで、又は共発現を使用して、異なる特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロ二量体を形成しやすくなるように各半分子における重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することによって、２つの単一特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して作製することができる。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離－会合の結果である。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は減少する。親単一特異性抗体のうちの１つの得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離－会合により解放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体形成よりヘテロ二量体形成を好むように改変されてもよい。得られる生成物は、それぞれ異なるエピトープ、すなわち、ＥＧＦＲにおけるエピトープ及びｃ－Ｍｅｔにおけるエピトープに結合する２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。例えば、本発明の二重特異性抗体は、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載の技術を使用して作製することができる。ＩｇＧ１抗体の場合、一方の重鎖における変異Ｆ４０５Ｌ及び他方の重鎖におけるＫ４０９Ｒを使用することができる。ＩｇＧ２抗体では、Ｆ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ置換を有する野生型ＩｇＧ２及びＩｇＧ２抗体を使用してもよい。ＩｇＧ４抗体では、Ｆ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ置換を有する野生型ＩｇＧ４及びＩｇＧ４抗体を使用してもよい。二重特異性抗体を生成するために、第１の単一特異性二価抗体及び第２の単一特異性二価抗体を、Ｆｃ領域に前述の変異を有するように操作し、ヒンジ領域でシステインがジスルフィド結合異性化を受けることができる十分な還元条件下で、抗体を一緒にインキュベートし、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る例示的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（2-mercaptoethylamine、２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（dithioerythritol、ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（tris(2-carboxyethyl)phosphine、ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びβ－メルカプトエタノールである。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを用いることができる。
本開示の方法で使用される二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体は、ノブ－イン－ホール（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的適合（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ－ｍａｔｃｈｅｄ）（Ｃｈｕｇａｉ，Ａｍｇｅｎ，ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ，Ｏｎｃｏｍｅｄ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｓｔｒａｎｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、及びＢｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）などの設計を使用して作製することもできる。
「ノブ－イン－ホール」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照されたい）において、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインの界面を形成する選択アミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進するために、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置に変異を導入され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換ペアは、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表現）。
Ｆａｂアーム交換のプロモータへの「ノブ－イン－ホール」戦略の利用に加えて、ＣｒｏｓｓＭＡｂ技術は、半アームのうちの１つにＣＨ１／ＣＬドメイン交換を利用して、得られる二重特異性抗体の正しい軽鎖の対合を保証する（例えば、米国特許第８，２４２，２４７号を参照されたい）。
他の交差法を使用して、二重特異性抗体の重鎖と軽鎖の間又は重鎖内で、一方又は両方のアームにおいて、可変又は定常、又は両ドメインを交換することによって、本発明の完全長二重特異性抗体を作製してもよい。これらの交換としては、例えば、国際特許公開第２００９／０８０２５４号、同第２００９／０８０２５１号、同第２００９／０１８３８６号、及び同第２００９／０８０２５２号に記載されるＶＨ－ＣＨ１とＶＬ－ＣＬ、ＶＨとＶＬ、ＣＨ３とＣＬ、及びＣＨ３とＣＨ１が挙げられる。
他の戦略、例えば、あるＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体化の促進が、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、同第２００９／０１８２１２７号、同第２０１０／０２８６３７号、又は同第２０１１／０１２３５３２号に記載されるように使用されてもよい。他の手法では、ヘテロ二量体化は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されているように、以下の置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表す）により促進することができる。
ＳＥＥＤｂｏｄｙ技術を利用して、本発明の二重特異性抗体を作製してもよい。ＳＥＥＤｂｏｄｙは、それらの定常ドメインにおいて、米国特許出願公開第２００７／０２８７１７０号に記載されるように、ヘテロダイマー化を促進するためにＩｇＡ残基で置換された選択ＩｇＧ残基を有する。
変異は、通常、標準的な方法を使用して、抗体の定常ドメインなどの分子に対してＤＮＡレベルで行われる。
次に、本発明を以下の特定の非限定的な実施例を参照して説明する。
材料及び方法
ＰＢＭＣ、並びにＰＢＭＣからのＮＫ細胞及び単球の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び単離免疫細胞（ＮＫ細胞及び単球）は、Ｈｅｍａｃａｒｅから購入した。ＰＢＭＣは、ＩＲＢに同意した健常ヒトドナーからｃＧＭＰ及びｃＧＴＰ収集指針に従ってＨｅｍａＣａｒｅのＦＤＡ登録コレクションセンターで収集されたｌｅｕｋｏｐａｋから単離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、密度勾配遠心分離により精製し、凍結保存フォーマットでＨｅｍａＣａｒｅから購入し、使用するまで液体窒素中で保管した。
ドナーの一部については、同じドナーのｌｅｕｋｏｐａｋからＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、及び単球を単離するためにｌｅｕｋｏｐａｋを３つに分けた。ＣＤ５６陰性選択を使用してＮＫ細胞を単離し、ＣＤ１４陰性選択を用いて単離した。単離されたＮＫ細胞及び単球は、凍結保存フォーマットでＨｅｍａＣａｒｅから購入し、使用するまで液体窒素中で保管した。
単球のＭ１、Ｍ２ａ、及びＭ２ｃマクロファージへの分化
単球（Ｈｅｍａｃａｒｅから購入）を、１０％ ＦＢＳを補給したＸＶＩＶＯ １５培地で解凍し、組織培養処理されたＴ７５フラスコにプレーティングした。０日目に、単球を５０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ（カタログ番号２１６－ＭＣ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入）を含む培地にプレーティングして、Ｍｏマクロファージを得た。Ｍ０マクロファージをＭ２ａマクロファージに極性化させるために、５日目に、培地を５０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４（カタログ番号２０４－ＩＬ－０２０／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入）及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１３（カタログ番号２１３－ＩＬＢ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入）と交換し、４８時間インキュベートした。Ｍ０マクロファージをＭ２ｃマクロファージに極性化させるために、５日目に、培地を５０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１０（カタログ番号２１７－ＩＬ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入）と交換し、４８時間インキュベートした。Ｍ１マクロファージを得るために、６日目に、培地を５０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ及び１００ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－ｇ（カタログ番号２８５－ＩＦ－１００／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入）と交換し、２４時間インキュベートした。次いで、極性化したＭ１、Ｍ２ａ、及びＭ２ｃマクロファージをＡｃｃｕｔａｓｅを使用してフラスコから取り出し、アッセイに利用した。
ＰＢＭＣからのＮＫ細胞及び単球の枯渇
ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ５６ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ ＩＩ（カタログ番号１７８５５）を使用してＮＫ細胞の枯渇を実施し、ＳＴＥＭＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ ＩＩ（カタログ番号１７８５８）を使用して、単球の枯渇を実施した。ＰＢＭＣ（Ｈｅｍａｃａｒｅから購入）を、１０％ ＦＢＳを含むＸ－ＶＩＶＯ－１５培地で解凍し、計数した。ＰＢＭＣ（枯渇当たり１０００万個の細胞）を、１億細胞／ｍＬの所望の濃度でＥａｓｙＳｅｐバッファに再懸濁させた。ＮＫ細胞及び単球の枯渇は、製造業者のプロトコルに従って行った。簡潔に述べると、それぞれの抗体選択カクテル５０μｌを添加し、室温で１０分間インキュベートした。磁性粒子を３０秒間ボルテックスし、５０μｌをＰＢＭＣ＋抗体カクテルに添加した。これを室温で３分間インキュベートし、ＥａｓｙＳｅｐバッファを用いて２．５ｍＬにした。次いで、チューブをＥａｓｙＳｅｐ Ｍａｇｎｅｔ（カタログ番号１８０００、ＳＴＥＭＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）に入れ、３分間インキュベートした。次いで、上清を新しいチューブに注意深く移した。磁気分離工程を２回繰り返して、ＮＫ細胞が枯渇したＰＢＭＣ及び単球が枯渇したＰＢＭＣを得た。フローサイトメトリー（以下に記載の通り）を使用して枯渇を確認し、次いで、これらのＰＢＭＣをＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイに利用して、ＥＧＦＲ及びＭｅｔタンパク質レベルを検出した。
ＰＢＭＣ内の免疫細胞組成の決定
ＰＢＭＣ（Ｈｅｍａｃａｒｅから購入）を、１０％ ＦＢＳを含むＸ－ＶＩＶＯ－１５培地で解凍し、計数した。計数後、約３００，０００～４００，０００細胞／ウェルをプレーティングし（トリプリケート）、プレートを４℃において１５００ｒｐｍで３分間スピンした。上清を廃棄し、細胞を１５０μｌ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄した。プレートを上記の通り再度スピンして、ペレット化した。１５０μｌのＤＭＳＯを生死染色の内容物に添加することによって、Ｎｅａｒ ＩＲ－Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ１０１１９）の原液を作製した。次いで、５０μｌのストックを１０ｍＬのＤＰＢＳに添加することによって、作業液（working solution）を作製した。次に、５０μＬの作業液をプレートの各ウェルに添加し、再懸濁させた。プレートを暗所で（ホイルで被覆）室温で３０分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、プレートを４℃及び１５００ｒｐｍで５分間スピンした。次いで、１５０μｌ／ウェルを添加することによって、細胞をＦＡＣＳ／Ｓｔａｉｎバッファ（ＢＤ番号５５４６５７）バッファで洗浄した。マルチカラーフローサイトメトリーパネル用の抗体を、計算に従ってカクテルに調製し、２５μｌ／ウェルを添加した。パネルで使用した抗体は、ＣＤ１９（ＦＩＴＣ）、ＣＤ５６（ＢＶ７１１）、Ｃｄ１１ｂ（ＢＵＶ３９５）、ＣＤ１４（ＰＥ－ｃｙ７）、ＣＤ３（ＢＶ６０５）、ＣＤ４（ＢＶ７８５）、ＣＤ８（ＰｅｒＣＰ－ｃｙ５．５）、ＣＤ２５（ＰＥ）、及びＰＤ－１（ＡＰＣ）を含んでいた。プレートを暗所で室温で３０分間インキュベートした。計算に従ってコンペンセーションビーズ及び上記パネルからの単一チャネル抗体を使用してコンペンセーションプレートを調製し、暗所で室温で３０分間インキュベートした。全てのプレートを４℃において１５００ｒｐｍで５分間スピンし、１５０μｌのＦＡＣＳバッファで２回洗浄した。アッセイプレートを、１５０μｌのＦＡＣＳバッファに、コンペンセーションプレートを２００ｕＬのＦＡＣＳバッファに再懸濁させた。プレートをＦｏｒｔｅｓｓａ上で実行し、コンペンセーションビーズプレートからの単一チャネル制御値を使用して補正を設定した。次いで、アッセイプレートを、補正を適用して１．５μｌ／秒の流速で実行した。次いで、データをエクスポートし、ＦＬＯＷＪｏで分析し、適切なゲーティングを行って、ＰＢＭＣ内の個々の免疫細胞集団のそれぞれの割合を得た。
増殖及びアポトーシスアッセイ
ＨＣＩ－Ｈ１９７５細胞（本明細書ではＨ１９７５細胞とも呼ばれる）をＡＴＣＣから入手し、１０％ Ｈｉ ＦＢＳ、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウムを補給したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号７２４００－０４７）中で培養した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅを使用した増殖及びアポトーシスアッセイでは、Ｈ１９７５細胞をＩｎｃｕｃｙｔｅ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄレンチウイルス試薬（カタログ番号４４７６、Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）に感染させ、１μｇ／ｍｌピューロマイシンで選択して、Ｈ１９７５ ＮｕｃＲｅｄ細胞を作製した。これらの細胞を、実験のために、１０％ ＨＩ ＦＢＳ、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウムを補給したＲＰＭＩ－フェノールレッド不含培地にプレーティングした。
Ｈ１９７５－ＮｕｃＲｅｄ細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（トリプシンが細胞表面受容体／分子を分解するため）を用いて解離させ、計数した。細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。次いで、ペレットを、適切な体積のフェノールレッド不含培地に再懸濁させた。ＮｕｃＲｅｄ細胞（標的細胞）を、組織培養処理した黒色平底プレートの１００μｌのフェノールレッド培地中に１２，５００細胞／ウェルでプレーティングし、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、１０％ ＦＢＳを含むＸ－ＶＩＶＯ－１０培地でＰＢＭＣ（ＨｅｍａＣａｒｅから購入）を解凍し、計数した。ＰＢＭＣを５０μｌ中１２５，０００細胞／ウェルの濃度に希釈し、１０：１のエフェクタ：標的（Ｅ：Ｔ）比を得た。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｇｒｅｅｎ試薬（カタログ番号４６４２、Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）を１００μｌの培地に再懸濁させ、１００ウェル又は１枚の９６ウェルプレートを染色するために使用した。希釈したアネキシン試薬をＰＢＭＣ又は培地に添加した。５０ｕｌのＰＢＭＣ／培地（アネキシンを含む）をアッセイプレートの適切なウェルに添加した。次いで、治療抗体を１：５で連続希釈し、計算に従って４×濃度で調製し、５０μｌＬの所望の抗体をアッセイプレートの適切なウェルに添加した。次いで、アッセイプレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３内の適切なスロットに入れ、スキャンする前に２０分間Ｉｎｃｕｃｙｔｅ内で平衡化した。プレートを４枚の画像／ウェル／スキャンで４時間毎に１２０時間までスキャンして、標的細胞増殖及びアポトーシスを経時的に判定した。標的細胞（ＮｕｃＲｅｄ）の蛍光及びアネキシン（Ｇｒｅｅｎ）の蛍光を、プロセス定義を使用して定量し、標的細胞の増殖を示す総ＮｕｃＲｅｄ Ｈ１９７５面積（μｍ２／ウェル）を計算した。標的細胞のアポトーシスを示す、総Ｇｒｅｅｎ ＮｕｃＲｅｄ Ｈ１９７５面積（ｕｍ２／ウェル）も計算した。この分析から、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、非線形用量応答曲線を作成した。
ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ｐＥＧＦＲ、及びｐＭｅｔタンパク質レベルを検出するためのＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ
Ｈ１９７５細胞及びＳＮＵ－５細胞をＡＴＣＣから入手し、１０％ Ｈｉ ＦＢＳ、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウムを補給したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号７２４００－０４７）中で培養した。Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを用いてＨ１９７５細胞を解離させ、各細胞懸濁液を５０ｍＬのコニカルチューブに入れ、計数した。ＳＮＵ－５（懸濁細胞株）を用いたアッセイでは、細胞懸濁液を５０ｍＬのコニカルチューブに移し、計数した。細胞を４℃において１３００ｒｐｍで５分間ペレット化し、適切な体積のＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。標的細胞を、１００，０００細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートにプレーティングし、一晩インキュベートした。翌日、１０％ ＦＢＳを含むＸ－ＶＩＶＯ－１５培地でＰＢＭＣ（ＨｅｍｅＣａｒｅから購入）を解凍し、計数した。ＰＢＭＣを希釈し、１，０００，０００細胞／ウェルの濃度でプレーティングして、１０：１のＥ：Ｔ比を得た。ＮＫ細胞、単球、又はマクロファージなどの個々の免疫細胞を使用した場合、これらを希釈し、５００，０００細胞／ウェルの濃度でプレーティングして、５：１のＥ：Ｔ比を得た。次いで、計算に従って２×濃度で治療抗体を調製し、１．５ｍＬの所望の抗体をアッセイプレートの適切なウェルに添加した。プレートを４８時間（大部分のアッセイに関して）又は様々な時点インキュベートした。
インキュベーション期間の最後に、１００μｌの新たに調製した溶解バッファを各ウェルに添加し、氷上で５分間インキュベートした。１０ｍＬのＲＩＰＡバッファ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号８９９０１）を、１錠のホスファターゼ阻害剤ＰｈｏｓＳＴＯＰ（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号４９０６８３７００１）及び１錠のプロテアーゼ阻害剤ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号０４６９３１５９００１）と共に使用して、溶解バッファを調製した。プレートスクレーパを使用して、溶解物を２ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、時折ボルテックスしながら氷上で３０分間インキュベートした。溶解物を、４℃において１３，２００ｒｐｍで２５分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。製造業者のプロトコルに従って、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイキット（カタログ番号２３２２７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手）を使用して、溶解物のタンパク質濃度を求めた。Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｒｅ－Ｄｉｌｕｔｅｄ標準（カタログ番号２３２０８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手）を使用して、アッセイの標準曲線を得た。簡潔に述べると、２５μｌの予め希釈した標準をトリプリケートで添加し、２５μｌの試料（１：５希釈）を９６ウェル平底プレート上にデュープリケートで添加した。調製したＢＣＡ作業試薬を１ウェル当たり２００ｕｌ添加した。プレートをプレートシェーカー上で１分間穏やかに混合し、ホイルで被覆して３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを室温で５分間冷ました後、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ分光光度計を用いて５６２ｎｍでタンパク質定量を測定した。
ＰｅｇｇｙＳｕｅを使用してキャピラリーベースの電気泳動を実施するために、いずれもＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅから購入した抗ウサギ検出モジュール（カタログ番号ＤＭ－００１）及び抗マウス二次抗体（カタログ番号０４２－２０５）と共に、１２～２３０ｋＤａ Ｐｅｇｇｙ Ｓｕｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎモジュール（カタログ番号ＳＭ－Ｓ００１、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅから購入）を単独で利用した。試料、抗体、及び試薬を調製し、製造業者のプロトコルに従ってキャピラリーベースの電気泳動を実施した。簡潔に述べると、２つの標準的なパックの構成要素を使用して、ビオチン化ラダー及び５×マスターミックスを調製した。タンパク質溶解物を、ＢＣＡタンパク質アッセイからの値を用いた計算に従って、０．１×試料バッファを用いて０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。調製した溶解物４部を、１部の５×Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと合わせて、最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬを得た。試料及びビオチン化アダー（ａｄｄｅｒ）を、９５℃で５分間ＰＣＲサーモサイクラーを用いて変性させた。アッセイに利用した一次抗体を、抗体希釈剤を用いて以下の通り希釈した：ＥＧＦＲ（カタログ番号２６４６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、１：５０；ｐＥＧＦＲ（カタログ番号ＡＦ１０９５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）、１：５０；ｃ－Ｍｅｔ（カタログ番号３１４８、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、１：５０；ｐＭｅｔ（カタログ番号３０７７、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、１：５０、及びローディング対照アクチン（カタログ番号４９７０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、１：２００又は（カタログ番号４９４７、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、１：１００。ラダー、試料、一次及び二次抗体、分離及びスタッキングマトリックスを、プレートレイアウトに従って３８４ウェルのＰｅｇｇｙ Ｓｕｅプレートに添加した。プレートをＲＴにおいて２５００ｒｐｍで５分間スピンした後、機械にロードした。このデータを、ＳＷソフトウェアのためのＣｏｍｐａｓｓを用いて分析した。目的のタンパク質の分子量に基づいてピークを決定し、試料のそれぞれにおける各タンパク質について曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。次いで、目的のタンパク質の密度測定値を、試料のそれぞれについてローディング対照アクチンに対して正規化し、次いで、未処理対照に対して正規化して、処理による相対変化を得た。
共焦点イメージングトロゴサイトーシスアッセイ
分化したマクロファージを収集し、一晩１，００，０００細胞／ウェル（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ；カタログ番号６０５５３０２）でＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ９６ウルトラプレートにプレーティングした。接着及び非接着の標的細胞を両方使用して、アッセイを実施した。接着標的細胞を用いたアッセイでは、Ｈ１９７５ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞を２０，０００／ウェルでプレーティングし、４時間接着させ、次いで、４℃で１時間、標識Ａｂカクテルで処理した。非接着標的細胞を用いたアッセイでは、標的細胞のみをＡＦ６４７標識ＪＮＪ－３７２又は対照Ａｂで染色した。全てのライブイメージング研究を５：１のＥ：Ｔ比で実施した。標識抗体カクテルは、抗ＣＤ１１ｂ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；カタログ番号５５７７０１）、抗ＣＤ１４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；カタログ番号５６２６８９）、及び１：８０００ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｂｉｏｔｉｕｍ；カタログ番号４００４６）で構成されていた。６０×水浸漬対物レンズを使用して、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ Ｐｈｅｎｉｘ Ｏｐｅｒａにおいて１１分間隔で画像を得、Ｃｏｌｕｍｂｕｓを使用して分析した。
ＡＤＣＣアッセイ
１０％加熱不活性化ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１６１４０）を補給した）ＶＩＶＯ １０培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－３８０Ｑ）でアッセイの１日前にＰＢＭＣを解凍し、標準的なインキュベーション条件（３７℃、５％ＣＯ２、湿度９５％）下で一晩静置した。アッセイ日に、ＮＣＩ－Ｈ１９７５標的細胞にＤＥＬＦＩＡ ＢＡＴＤＡ試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｃ１３６－１００）を３０分間ロードし、３回洗浄し、ＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。ＰＢＭＣ及びＢＡＴＤＡをロードした標的細胞を、漸増濃度の試験抗体と共に、エフェクタの標的細胞比に対する比２５：１で９６ウェルＵ底プレートに添加した。ＲＰＭＩ培地又は２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号６４８４６３）を含有するＲＰＭＩ培地を、それぞれ自然及び最大ＴＤＡ放出の測定のために対照ウェルに添加した。プレートを２時間インキュベートした後、２０ｕＬの上清を取り出し、２００μｌのＤＥＬＰＨＩＡ Ｅｕｒｏｐｉｕｍ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号Ｃ１３５－１００）と合わせた。ＲＴで１５分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０４ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号２１０４－００１０）を使用して、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定した。溶解率を、（実験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）×１００として計算した。
単球のＭ１、Ｍ２ａ、及びＭ２ｃマクロファージへの分化
単球（Ｈｅｍａｃａｒｅ）をＸＶＩＶＯ－１５培地で解凍し、５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２１６－ＭＣ－０２５／ＣＦ）で６日間分化させて、Ｍ０マクロファージを得た。Ｍ１マクロファージを得るために、５日目に、Ｍ０マクロファージを５０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ及び１００ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２８５－ＩＦ－１００／ＣＦ）で４８時間極性化させた。Ｍ２マクロファージを得るために、５日目に、Ｍ０マクロファージを、Ｍ２ａについては２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２０４－ＩＬ－０２０／ＣＦ）及びＩＬ－１３（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２１３－ＩＬＢ－０２５／ＣＦ）又はＭ２ｃマクロファージについては、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１０（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２１７－ＩＬ－０２５／ＣＦ）で４８時間極性化させた。
インビボ試験
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｃｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ））にＨ１９７５細胞株を皮下移植した。腫瘍が平均７２±８．７ｍｍ３になったとき、マクロファージの枯渇を促進するために化合物投与開始の５日前に開始して、研究期間にわたって週３回抗ｍＣＳＦ－１Ｒ抗体（４００μｇ／マウス）を腹腔内投与した。５日目（平均腫瘍体積＝１０２±３６．６ｍｍ３）に、１０ｍｇ／ｋｇアイソタイプ対照Ａｂ、ＪＮＪ－３７２、又はＥＧＦＲ／ｃＭｅｔ ＩｇＧ２σ Ａｂの腹腔内投与によって週２回処理した。腫瘍をサンプリングして、化合物の２回投与後にマクロファージ浸潤をモニタリングした。ＳＮＵ５腫瘍モデル試験では、７～８週齢の雌ＣＢ１７／ＳＣＩＤマウス（ＨＦＫ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ））にＳＮＵ５細胞を皮下移植した。腫瘍が平均１５５±２１．４ｍｍ３になったとき、マウスを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＪＮＪ－３７２（５ｍｇ／ｋｇ）、又はＥＧＦＲ－ｃＭｅｔ ＩｇＧ２σ抗体（５ｍｇ／ｋｇ）で３週間にわたって週２回腹腔内処理した。両研究について、腫瘍測定値及び体重を週２回記録した。計算［１－（Ｔ／Ｃ）］×１００を使用して、＞８０％の対照マウスが研究にとどまっている最後の日に腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を計算した。全てのインビボ実験は、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ及びｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従って行われた。
腫瘍関連マクロファージのフローサイトメトリーベースの判定
腫瘍をマウスから摘出し、計量し、２～４ｍｍの切片を作製し、２．５ｍＬのＲＰＭＩを含有するＣ－チューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９３－２３７）に入れ、氷上で維持した。製造業者の指示に従って、Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９５－９２９）に含まれている凍結乾燥酵素を再構成し、２×酵素カクテルを調製し、製造プロトコル「ｈ＿ｔｕｍｏｒ＿０１」を用いてＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９５－９３７）で腫瘍を解離させ、続いて、３７℃で３０分間のインキュベートを２ラウンド行った。解離した細胞をＦＡＣＳ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５４６５７）で２回洗浄し、Ｆａｌｃｏｎ ４０μｍセルストレイナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５２３４０）に通した。細胞を、ＦＡＣＳバッファで１：１０００に希釈したＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ、カタログ番号５５５０２９）中でインキュベートし、３７℃で３時間インキュベートし、２回洗浄し、１００μＬの抗体染色カクテルに再懸濁させた。抗体カクテルは、抗ＣＤ４５（カタログ番号１０３１３８）、抗Ｆ４／８０（カタログ番号１２３１３７）、抗Ｌｙ６Ｇ（カタログ番号１２７６３９）、抗ＭＨＣＩＩ（カタログ番号１０７６１２）、抗ＥｐＣＡＭ（カタログ番号３２４２１４）、抗ＰＤ１（カタログ番号１３５２３１）、抗ＰＤ－Ｌ１（カタログ番号３９３６０６）、抗ＣＤ２０６（カタログ番号１４１７２９）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製）、抗ＣＤ１１ｂ（カタログ番号５６３５５３）及び抗Ｌｙ６Ｃ（カタログ番号５６１２３７）（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）、抗ｉＮＯＳ（カタログ番号２５－５９２０－８２）及びＦｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｓｔａｉｎ（カタログ番号Ｌ１０１１９）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）からなっていた。細胞を、光から保護して、外部細胞表面マーカー抗体と共に４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｓｔａｉｎを含有するＰＢＳに再懸濁させ、４℃で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；カタログ番号５５４６５７）で２回洗浄した。製造業者の指示に従って細胞を固定／透過処理し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号８８－８８２４－００）、内部標的抗体と共に４℃で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファで２回洗浄し、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析するために２００μＬに再懸濁させた。ＵｌｔｒａＣｏｍｐ Ｂｅａｄｓ（抗体の場合；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号０１－２２２２－４２）及びＡｒＣ Ａｍｉｎｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅビーズ（Ｆｉｘａｂｌｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄの場合；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０３４６）を用いて補正を実施した。ＦＭＯ対照を全てのマーカーについて行った。腫瘍関連マクロファージ枯渇を判定するために、マクロファージをＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ－Ｌｙ６Ｇ－Ｆ４／８０＋として定義した。
ＭＳＤマルチプレックスアッセイ及び統計分析
ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、及び単球実験については、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、ＰＢＭＣ、単球、又はＮＫ細胞を、それぞれ１０：１、５：１、及び５：１の比で添加した。マクロファージ実験については、単球を前述のように分化させ、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｕｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１１０５－０１）を使用して解離させ、９６ウェルプレートにプレーティングし、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞を５：１のＥ：Ｔ比で添加した。様々な濃度のアイソタイプ対照、ＪＮＪ－６１１８６３７２、又はＩｇＧ２シグマで細胞を処理し、３７℃及び５％ＣＯ２で４時間、２４時間、４８時間、及び／又は７２時間インキュベートした。指定の時間で、プレートを室温で１２００ｒｐｍで１０分間スピンした。上清を除去し、製造業者の指示書に従って、それぞれのサイトカインアッセイについてＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｕ－ｐｌｅｘ及びＶ－ｐｌｅｘフォーマットを使用して評価した。簡潔に述べると、Ｕ－ｐｌｅｘプレートについては、アッセイの前日に、製造業者のプロトコルに従って抗体及びリンカーでプレートをコーティングし、４℃で一晩オービタルシェイカー上でインキュベートした。実験日、Ｕ－ｐｌｅｘ又はＶ－ｐｌｅｘプレートをＭＳＤ洗浄バッファ及び上清で３回洗浄し、標準及び較正物質をプレートに加え、製造業者のプロトコルに従って実行した。プレートをＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ機器で読み取り、ＧＴＳ Ｓｐｏｔｆｉｒｅを使用して分析して、標準曲線を使用して各サイトカインについての計算レベル（ｐｇ／ｍｌ）を得た。
計算された濃度から、応答の大きさを比較するために、各処理、細胞型、及びインキュベーション時間ごとに台形法によって曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。観察された値が検出下限未満である場合、応答データを除外し、８つの投与濃度の少なくとも６つの有効な観察結果が存在していた場合のみ、ＡＵＣを計算した。次いで、全てのサイトカイン及び条件にわたって、データの有効性（データなし、十分なデータではない、又は計算可能なＡＵＣデータ）を示すために使用して、ヒートマップを作成した。次いで、インキュベーション時間によって使用して、対数変換したＡＵＣのヒートマップを作成し、Ｈ１９７５＋ＰＢＭＣ細胞型において少なくとも１つの測定可能なＡＵＣを有するサイトカインに限定した。全てのヒートマップは、統計ソフトウェアＲバージョン３．５．０におけるパッケージハートマップ．２を使用して作成した（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２０１８；Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）。最後に、アイソタイプと比較したＪＮＪ－３７２及びＩｇＧ２σ処理の相対変化を各条件で計算し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して棒グラフ又は用量曲線を作成した。
実施例１．腫瘍細胞に対するＪＮＪ－３７２の媒介による抗増殖及びアポトーシス効果は、免疫細胞とのＦｃ相互作用によって駆動される
ＪＮＪ－３７２の３つの抗腫瘍機序に対するＦｃ相互作用の効果を評価するために、標準的なクローニング方法を使用して、ＦｃエフェクタサイレントＩｇＧ２シグマ（野生型ＩｇＧ２と比較してＶ２３４Ａ Ｇ２３７Ａ Ｐ２３８Ｓ Ｈ２６８Ａ Ｖ３０９Ｌ Ａ３３０Ｓ Ｐ３３１Ｓ変異を含むＩｇＧ２シグマ）でＪＮＪ－３７２野生型ＩｇＧ１を置換することによって、ＪＮＪ－３７２を遺伝子操作してＦｃエフェクタサイレント分子にした（ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ）。遺伝子操作を受けたエフェクタサイレント抗体は、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ（又はいくつかの図ではＩｇＧ２ｓ）と呼ばれる。ＪＮＪ－３７２は、ＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６及びＡＤＣＣへの結合を強化するために、低濃度（＜９％）のフコースを組み込んだ細胞株で産生される。したがって、別の対照として、ＪＮＪ－３７２は、正常なフコースレベルを組み込んだＣＨＯ細胞においても発現し、この分子は、ＪＮＪ－３７２．ＮＦ（ＮＦ：正常フコース）と呼ばれる。ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－５９０８）を用いて腫瘍細胞殺傷を評価し；細胞株は、変異体Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ及び野生型ｃ－Ｍｅｔを発現する。
ＮＣＩ－Ｈ１９７５ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ発現細胞をアイソタイプ対照、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２ｓ、又はＪＮＪ－３７２．ＮＦで処理し、１０：１のエフェクタ：標的比においてＰＢＭＣの存在下又は非存在下で培養し、共培養の開始後５日間にわたってＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞の増殖を評価した。ＰＢＭＣの存在は、用量依存的に経時的に腫瘍細胞増殖を阻害するＪＮＪ－３７２の能力を強化したが（図１）、ＪＮＪ－３７２は、試験した濃度ではＰＢＭＣの非存在下において増殖を阻害しなかった（図２）。
ＰＢＭＣに対するＦｃ係合が効果に関与していることを確認するために、Ｈ１９７５ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ発現細胞をＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、及びＪＮＪ－３７２．ＮＦで処理し、１０：１のＥ：Ｔ比でＰＢＭＣの存在下又は非存在下において４、２４、４８、７２、又は９６時間培養し、その後、Ｈ１９７５細胞の増殖及びアポトーシスを評価した。ＰＢＭＣの存在は、２４、４８、７２、及び９６時間でＪＮＪ－３７２により誘導される用量依存的抗増殖効果及び用量依存的アポトーシス（アネキシン陽性により測定）を強化した。アイソタイプ又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマでは効果が全く又は最小限しかみられなかった。図３は、７２時間培養した後のＰＢＭＣの存在下又は非存在下における、アイソタイプ対照、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はＪＮＪ－３７２．ＮＦの媒介によるＨ１９７５細胞増殖の阻害の用量応答を示す。図４は、４８時間培養した後のＰＢＭＣの存在下又は非存在下における、アイソタイプ対照、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はＪＮＪ－３７２．ＮＦの媒介によるアポトーシスの用量応答を示す。ＪＮＪ－３７２．ＮＦは、ＪＮＪ－３７２と比較したときに増殖（図３）及びアポトーシス（図４）に対して部分的な効果を有しており、これは、ＦｃγＲＩＩＩが役割を果たしているが、Ｆｃ相互作用の媒介による効果を完全に説明するものではないことを示唆している。
アッセイでは、１０：１のエフェクタ：標的比で７人の異なるドナーからのＰＢＭＣを使用した。６人のドナーについての、ＮＣＩ－Ｈ１９７５増殖アッセイにおけるＩＣ５０値及び最大殺傷％を表１に示す。１人のドナーからのＰＢＭＣは効果を有していなかった。異なるドナーから得られたＰＢＭＣ全体にわたって、ＩＣ５０及び最大殺傷％のばらつきが観察された。
Figure 2022521610000002
実施例２．ＥＧＦＲ変異体腫瘍細胞株におけるＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔタンパク質並びにこれらの下流シグナル伝達のＪＮＪ－３７２の媒介によるダウンレギュレーションは、免疫細胞とのＦｃ相互作用によって媒介される
免疫細胞（ＰＢＭＣ）の存在は、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔタンパク質のＪＮＪ－３７２の媒介によるダウンレギュレーション並びにこれらのリン酸化の阻害を増強した。
ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞を１０μｇ／ｍＬアイソタイプ又はＪＮＪ－３７２で処理し、１人のドナーからのＰＢＭＣの存在下又は非存在下において１０：１のＥ：Ｔ比で４、２４、４８、又は７２時間培養し、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐＥＧＦＲ（ｐＹ１１７３）の量を測定した。アクチンをローディングコントロールとして用いた。ＰＢＭＣの存在は、試験した全ての時点において、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐＥＧＦＲ（ｐＹ１１７３）のＪＮＪ－３７２の媒介によるダウンレギュレーションを増強した。図５は、図に示す通り、アイソタイプ対照又はＪＮＪ－３７２で処理し、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で培養した試料中のＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔタンパク質並びにｐＥＧＦＲを示す、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。図６は、各試料中のＥＧＦＲの相対量を示す。図７は、各試料中のｐＥＧＦＲ ｐＹ１１７３の相対量を示す。図８は、各試料におけるｃ－Ｍｅｔの相対量を示す。試料を、各試料中に存在するローディング対照アクチンの量に対して正規化し、次いで、対照（未処理）試料に対して正規化した。
７人のドナーからのＰＢＭＣを、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔタンパク質レベル並びにｐＥＧＦＲのＪＮＪ－３７２の媒介による阻害を増強する能力について試験した。ドナーＰＢＭＣ間でばらつきが観察された。ドナー１、３、４、及び６からのＰＢＭＣは、ＪＮＪ－３７２の媒介による効果を増強するのに最も強力であった。図９は、図に示す通り、７人の異なるドナーからのＰＢＭＣの存在下又は非存在下で培養した、アイソタイプ対照又はＪＮＪ－３７２で処理した試料中のＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔタンパク質並びにｐＥＧＦＲを示す、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。図１０は、各試料中のＥＧＦＲの相対量を示す。図１１は、各試料中のｐＥＧＦＲ ｐＹ１１７３の相対量を示す。図１２は、各試料におけるｃ－Ｍｅｔの相対量を示す。試料を、各試料中に存在するローディング対照アクチンの量に対して正規化し、次いで、対照（未処理）試料に対して正規化した。
実施例３．単球又はマクロファージの存在は、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔシグナル伝達に対するＪＮＪ－３７２の阻害効果のＦｃの媒介による増強に十分かつ必要である
ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔシグナル伝達をダウンレギュレーションするＪＮＪ－３７２の能力を増強する様々なＰＢＭＣ試料の能力のばらつきを理解するために、マルチカラーフローサイトメトリーを使用して、実施例２で使用した７人の異なるドナーからのＰＢＭＣ内の免疫細胞の組成を評価した。個々の免疫細胞の割合において、ドナー間でばらつきが検出された（データは図示せず）。７人のドナーのそれぞれにおける個々の免疫細胞の割合と、ＥＧＦＲ／ｐＥＧＦＲ／Ｍｅｔのダウンレギュレーションを媒介する各ドナーＰＢＭＣの能力との相関を行った。ＮＫ細胞、Ｂ細胞、又はＴ細胞と、ＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ、又はｃ－Ｍｅｔのダウンモジュレーションを増強するＰＢＭＣの能力との間に相関は観察されなかった（データは示さず）。しかしながら、ＰＢＭＣ中の単球％とＥＧＦＲタンパク質レベルのダウンモジュレーションを増強するＰＢＭＣの能力との間（図１３）、ＰＢＭＣ中の単球％とｐＥＧＦＲのダウンモジュレーションを増強するＰＢＭＣの能力との間（図１４）、及びＰＢＭＣ中の単球％とｃ－Ｍｅｔタンパク質レベルのダウンモジュレーションを増強するＰＢＭＣの能力との間（図１５）には、正の相関が同定された。これは、ＪＮＪ－３７２の媒介によるシグナルダウンレギュレーションには、ＰＢＭＣにおける単球率がより高い必要があることを示唆した。
１人のドナーからのＰＢＭＣからＮＫ細胞又は単球を枯渇させ、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ経路のＪＮＪ－３７２の媒介によるダウンモジュレーションに対するＮＫ又は単球枯渇ＰＢＭＣの効果を評価した。Ｈ１９７５細胞を１０μｇ／ｍＬアイソタイプ対照又はＪＮＪ－３７２で処理し、１人のドナーから得られたＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣ又は単球枯渇ＰＢＭＣの存在下又は非存在下において、１０：１のＥ：Ｔ比で４８時間培養した。以前の結果と一致して、ＰＢＭＣの存在は、Ｈ１９７５細胞株におけるＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ、及びｃ－ＭｅｔのＪＮＪ－３７２の媒介によるダウンレギュレーションを強化した。ＮＫ細胞のみを枯渇させてもわずかな影響しかなかったが、ＰＢＭＣから単球を枯渇させると、ＪＮＪ－３７２の媒介によるシグナルのダウンモジュレーションを増強するＰＢＭＣの能力が有意に回復した。図１６は、図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、１人のドナーからのＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣ又は単球（モノ）枯渇ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐＥＧＦＲタンパク質レベルを検出する、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。図１７は、図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、１人のドナーからのＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣ又は単球（モノ）枯渇ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５中のＥＧＦＲの相対量を示す。図１８は、図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、１人のドナーからのＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣ又は単球（モノ）枯渇ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５中のｐＥＧＦＲ（ｐＹ１１７３）の相対量を示す。図１９は、図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、１人のドナーからのＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣ又は単球（モノ）枯渇ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５中のｃ－Ｍｅｔの相対量を示す。試料を、各試料中に存在するローディング対照アクチンの量に対して正規化し、次いで、対照（未処理）試料に対して正規化した。
骨髄コンパートメントの役割を更に評価するために、ＪＮＪ－３７２ Ｆｃ相互作用によって駆動されるＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔダウンレギュレーションに対する、１人のＰＢＭＣドナーから単離された単球又はＭ１マクロファージの効果を評価した。任意の潜在的な差動効果を評価するために、Ｍ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦを用いて２つの方法で単球を分化させることによって、Ｍ１マクロファージを得た。Ｈ１９７５細胞を１０μｇ／ｍＬアイソタイプ、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマで処理し、１０：１（ＰＢＭＣの場合）又は５：１（個々の免疫細胞（単球、ＮＫ細胞、ＭＣＳＦ Ｍ１、又はＧＭＣＳＦ Ｍ１マクロファージの場合）のＥ：Ｔ比で、１人のドナーからのＰＢＭＣの存在下又は非存在下において４８時間培養した。ＰＢＭＣの存在は、ＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ、及びｃ－Ｍｅｔタンパク質のＪＮＪ－３７２の媒介によるダウンレギュレーションを強化した。ＮＫ細胞は有意な効果を有していなかったが、同じＰＢＭＣドナーから単離された単球又はＭ１マクロファージ（Ｍ－ＣＳＦ又はＧＭ－ＣＳＦによって分化）は、ＪＮＪ－３７２の媒介によるシグナルダウンモジュレーションの能力を著しく強化した。これは、骨髄細胞系列が、Ｆｃ相互作用、及びＪＮＪ－３７２シグナルダウンレギュレーションにおけるＰＢＭＣの媒介による強化にとって十分であることを示唆した。図２０は、図に示す通り、同じドナーからのＰＢＭＣ、単離単球、単離ＮＫ細胞、ＭＣＳＦ分化Ｍ１マクロファージ、又はＧＭＣＳＦ分化Ｍ１マクロファージの存在下又は非存在下で４８時間、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐＥＧＦＲタンパク質レベルを検出する、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。図２１は、図に示す通り同じドナーから単離したＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球、ＭＣＳＦ Ｍ１マクロファージ、又はＧＭＣＳＦ Ｍ１マクロファージの存在下又は非存在下で４８時間、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はアイソタイプ対照で処理したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のＥＧＦＲの相対量を示す。図２２は、図に示す通り、同じドナーから単離したＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球、ＭＣＳＦ Ｍ１マクロファージ、又はＧＭＣＳＦ Ｍ１マクロファージの存在下又は非存在下で４８時間、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はアイソタイプ対照で処理したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のｐＥＧＦＲ（ｐＹ１１７３）の相対量を示す。図２３は、図に示す通り、同じドナーから単離したＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球、ＭＣＳＦ Ｍ１マクロファージ、又はＧＭＣＳＦ Ｍ１マクロファージの存在下又は非存在下で４８時間、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はアイソタイプ対照で処理したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のｃ－Ｍｅｔの相対量を示す。試料を、各試料中に存在するローディング対照アクチンの量に対して正規化し、次いで、対照（未処理）試料に対して正規化した。
その後、ＪＮＪ－３７２ Ｆｃ相互作用によって駆動されるＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔダウンレギュレーションにおける様々なマクロファージサブタイプの効果を評価した。１人のドナー由来の単球をＭ１、Ｍ２ａ、及びＭ２ｃマクロファージに分化させ、ＪＮＪ－３７２の媒介によるＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔダウンモジュレーションを増強する能力を評価した。Ｈ１９７５細胞を１０μｇ／ｍＬアイソタイプ対照、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマで処理し、１人のドナーからの単球を分化させることによって得られたＭ１、Ｍ２ａ、及びＭ２ｃマクロファージの存在下又は非存在下において、５：１のＥ：Ｔ比で４８時間培養した。Ｍ１、Ｍ２ａ、及びＭ２ｃの存在は全て、ＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ、及びｃ－Ｍｅｔタンパク質のＪＮＪ－３７２の媒介によるダウンレギュレーションを著しく強化した。図２４は、図に示す通り、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はアイソタイプ対照で処理し、Ｍ１マクロファージ（Ｍ１）又はＭ２ａマクロファージ（Ｍ２ａ）の存在下で培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐＥＧＦＲタンパク質レベルを検出する、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。図２５は、図に示す通り、ＪＮＪ－３７２、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ、又はアイソタイプ対照で処理し、Ｍ２ｃマクロファージ（Ｍ２ｃ）の存在下又は非存在下で４８時間培養したＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞中のＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐＥＧＦＲレベルを検出する、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。
実施例４．ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔタンパク質並びにこれらの下流シグナル伝達のＪＮＪ－３７２の媒介によるダウンレギュレーションは、ｃ－Ｍｅｔ増幅腫瘍細胞株におけるＦｃ相互作用によって媒介される
ＳＮＵ－５細胞（ｃ－Ｍｅｔ増幅細胞株）を、１０μｇ／ｍＬ ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、１人のドナーからのＰＢＭＣの存在下又は非存在下において、１０：１のＥ：Ｔ比で４８時間培養した。ＰＢＭＣの添加は、ＪＮＪ－３７２がＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐ－Ｍｅｔをダウンレギュレーションする能力を増強した。図２６は、図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で培養したＳＮＵ－５細胞中のＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、及びｐＥＧＦＲタンパク質レベルを検出する、キャピラリーベースの電気泳動（ＰｅｇｇｙＳｕｅを用いたＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ）からの画像を示す。図２７は、図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で培養したＳＮＵ－５細胞中のＥＧＦＲの相対量を示す。図２８は、図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で培養したＳＮＵ－５細胞中のｐＥＧＦＲ（ｐＹ１１７３）の相対量を示す。図２９は、図に示す通り、ＪＮＪ－３７２、アイソタイプ対照、又はＰＢＭＣの存在下又は非存在下で４８時間培養したＳＮＵ－５細胞培養試料中のｃ－Ｍｅｔの相対量を示す。図３０は、図に示す通り、ＪＮＪ－３７２又はアイソタイプ対照で処理し、ＰＢＭＣの存在下又は非存在下で培養したＳＮＵ－５細胞中のｐＭｅｔ（ｐＹ１２３４／１２３５）の相対量を示す。試料を、各試料中に存在するローディング対照アクチンの量に対して正規化し、次いで、対照（未処理）試料に対して正規化した。
実施例５．インビボにおけるＦｃγＲの媒介による腫瘍増殖阻害とのＪＮＪ－３７２ Ｆｃ相互作用
次いで、Ｈ１９７５及びＳＮＵ５細胞株異種移植モデルを使用して、Ｆｃ／ＦｃγＲ相互作用の役割及び関連性をインビボで評価した。
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｃｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ））にＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞株を皮下移植した。腫瘍が平均７２±８．７ｍｍ３になったとき、マクロファージの枯渇を促進するために化合物投与開始の５日前に開始して、研究期間にわたって週３回抗ｍＣＳＦ－１Ｒ抗体（４００μｇ／マウス）を腹腔内投与した。５日目、腫瘍が平均１０２±３６．６ｍｍ３になったとき、アイソタイプ対照Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＪＮＪ－３７２（１０ｍｇ／ｋｇ）、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与によって週２回処理した。マウスのコホートから腫瘍をサンプリングして、化合物の２回投与後にマクロファージ浸潤をモニタリングした。７～８週齢の雌ＣＢ１７／ＳＣＩＤマウス（ＨＦＫ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ））にＳＮＵ５細胞株を皮下移植した。腫瘍が平均１５５±２１．４ｍｍ３になったとき、マウスを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＪＮＪ－３７２（５ｍｇ／ｋｇ）、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ（５ｍｇ／ｋｇ）で３週間にわたって週２回腹腔内処理した。各研究の期間にわたって、両研究について、腫瘍測定値及び体重を週２回記録した。計算［１－（Ｔ／Ｃ）］×１００を使用して、＞８０％の対照マウスが研究にとどまっている最後の日に腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を計算した。全てのインビボ実験は、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ及びｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従って行われた。
Ｈ１９７５モデルでは、ＪＮＪ－３７２処理の結果、アイソタイプ対照と比較してが７５％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）がもたらされた（図３１）。しかしながら、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマはかなり効果が低く、ＴＧＩはわずか３０％であった（図３１）。同様に、ＪＮＪ－３７２処理は、ＭＥＴ増幅ＳＮＵ５モデルにおける腫瘍成長の低減に非常に有効であり、ＴＧＩは９６％であったが、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ処理は無効であった（ＴＧＩは－１７％）（図３２）。これらの腫瘍モデルのいずれにおいても抗体処理によるマウス体重に対する効果はみられなかった（図３２）。
実施例６．Ｆｃ相互作用は、ＮＫ細胞の媒介によるＡＤＣＣを誘導したが、ＣＤＣは誘導しなかった
様々なＦｃエフェクタ機能を誘導するＪＮＪ－３７２の能力について調べた。７人の異なるドナーからのＰＢＭＣの存在下でユーロピウム放出アッセイを使用して、ＪＮＪ－３７２の誘導によるＡＤＣＣを測定した。抗体の媒介によるＨ１９７５細胞溶解は、ドナー間でばらついており、一部のドナーは約６０～７０％のＡＤＣＣ活性を示したが、他のドナーは測定可能なＡＤＣＣ活性を有していなかった（データは示さず）。Ｆｃ／ＦｃγＲ係合の寄与を評価するために、２人のドナーからのＰＢＭＣの存在下で、アイソタイプ対照、ＪＮＪ－３７２、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマでＨ１９７５細胞を処理した。ＪＮＪ－３７２は用量依存性ＡＤＣＣを誘導したが、アイソタイプ対照でもＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ処理でも細胞死は観察されなかった（データは示さず）。ＪＮＪ－３７２の誘導によるＡＤＣＣに関与するＰＢＭＣ内の免疫細胞サブタイプを決定するために、同じドナーからの単離ＮＫ細胞又は単離単球に対する、ＰＢＭＣの存在下で惹起されたＡＤＣＣ溶解を評価した。ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞はいずれもＪＮＪ－３７２依存性ＡＤＣＣ溶解を誘導したが、単離単球は誘導せず（図３３）、これは、ＮＫ細胞がＪＮＪ－３７２の誘導によるＡＤＣＣ活性に関与していることを示す。ＪＮＪ－３７２又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマでは、Ｈ１９７５及びＨ２９２ ＮＳＣＬＣ細胞株に向かう測定可能なＣＤＣ活性は観察されず（データは示さず）、これは、ＪＮＪ－３７２がこれらのＮＳＣＬＣ細胞株に対してＣＤＣを誘導しないことを示唆している。
実施例７．インビボにおけるＪＮＪ－３７２の媒介による腫瘍細胞殺傷に対するマクロファージの効果
インビボでのマクロファージの役割を調べるために、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体を用いてＨ１９７５異種移植腫瘍を保有しているマウスにおいて腫瘍関連マクロファージを枯渇させ、ＪＮＪ－３７２の有効性を測定した。抗ＣＳＦ１Ｒ抗体による処理は、未処理と比較してＴＡＭの有意な減少を示し（＊＊、ｐ＜０．００２）、マクロファージは１１～１５％から約２％に枯渇した（図３４）。次いで、３週間にわたってアイソタイプ対照、ＪＮＪ－３７２、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマで動物を処理したが、いずれの群においてもマウスの体重減少は観察されなかった（データは示さず）。既に示した通り、ＪＮＪ－３７２による処理は、非ＣＳＦ１Ｒ抗体で処理された腫瘍におけるアイソタイプ対照（＊＊＊、ｐ＜０．０００１）又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ処理（＊＊、ｐ＝０．００４）と比較して有意に高い抗腫瘍有効性を示した（図３５）。際立ったことに、腫瘍関連マクロファージ（抗ＣＳ１Ｒ処理）の枯渇は、ＴＧＩを７２．８％から３８．５％に有意に減少させ（＊＊＊、ｐ＜０．０００１）（図３５）、これは、インビボでのＪＮＪ－３７２の抗腫瘍有効性の媒介においてマクロファージが重要な役割を果たすことを示唆している。
これらの結果は、マクロファージがインビボでの抗腫瘍有効性に不可欠であることを実証した。
実施例８．免疫細胞とのＪＮＪ－３７２ Ｆｃ相互作用は、抗体依存性サイトカイン及びケモカイン放出（ＡＤＣＲ）を誘導する
治療抗体のＦｃ領域と免疫細胞上のＦｃγＲとの相互作用は、ケモカイン及びサイトカイン（ＡＤＣＲ）の分泌を誘導することが知られている（Ｋｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ７：４９４－５０４，２０１５）。７１－ｐｌｅｘ ＭＳＤサイトカインパネルを利用して、ＰＢＭＣの非存在の存在下において４又は７２時間、アイソタイプ対照、ＪＮＪ－３７２、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマで処理した際に分泌されたケモカイン及びサイトカインを評価した。処理及び時点依存的に、いくつかの分泌されたサイトカインにおいて特徴的な違いが観察され；試験した７１種のサイトカインのうちの３２種及び７１種サイトカインのうちの４２種が、それぞれ４及び７２時間で確実に測定可能な応答（ＡＵＣ）を有していた。処理間で＞１．５倍の差を有するサイトカインに着目した更なる分析は、処理後４時間（図３６）及び７２時間（図３７）に、それぞれ１３種及び７種のサイトカインが、Ｈ１９７５＋ＰＢＭＣの共培養におけるアイソタイプ対照又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマと比較して、ＪＮＪ－３７２で処理した際にアップレギュレーションされたことを示した。変化したサイトカインの多くは、走化性サイトカインのファミリー（ＣＣケモカイン）に属しており（図６Ｂ－ＭＩＰ１β、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－３、エオタキシン、エオタキシン－２）、これらは、自然免疫細胞、単球、及びマクロファージの走化性因子として機能することが知られている（Ｇｒａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ６：１０９－１８，１９９５；Ｕｇｕｃｃｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：６４－８，１９９５；Ｂａｌｋｗｉｌｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４：５４０－５０，２００４）。
これらのサイトカインを更に評価し、その分泌における個々の免疫細胞の役割を調べるために、２３種のサイトカインを選択し（その機能及びＪＮＪ－３７２で処理した際の変化に基づいて）、同じドナーから単離された個々の免疫細胞に対して、ＰＢＭＣの存在下においてアイソタイプ、ＪＮＪ－３７２、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ抗体で処理した際に評価した。ヒートマップ分析により、個々の免疫細胞によるサイトカイン発現パターンの特徴的な変化が明らかになり、ＣＣケモカインが、全ての免疫細胞にわたってＪＮＪ－３７２で処理した際に最も頻繁にアップレギュレーションされたファミリーであった。ＰＢＭＣの存在において＞１．５倍の差を有するサイトカインをより集中的に分析したことにより、ＰＢＭＣ、単球、及びマクロファージには特異的であるがＮＫ細胞には特異的でない、ＪＮＪ－３７２で処理した際のアップレギュレーションのパターンが明らかになった。例えば、ＪＮＪ－３７２による処理の結果、ＰＢＭＣ又は単球の存在下ではＭＣＰ－１（図３８）及びＭＣＰ－３（図３９）のレベルは用量依存的に増加したが、アイソタイプ又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマでも、ＮＫ細胞の存在下でも増加しなかった。刺激の活性化に応答して単球及びマクロファージによって分泌されることが知られている（Ｊａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：４２１８－２３，１９９１；Ａｒｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ５９ Ｓｕｐｐｌ １：ｉ６０－４，２０００）ＩＬ１－ＲＡは、ＰＢＭＣ及び単球の存在下ではＪＮＪ－３７２で処理した際に用量依存的に増加したが、ＮＫ細胞では増加しなかった（図４０）。更に、免疫細胞の存在下において、ＪＮＪ－３７２で処理した際にはＭＩＰ１βレベルの用量依存的増加が観察されたが、アイソタイプ対照又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマでは観察されなかった（図４１）。また、ＭＩＰファミリータンパク質であるＭＩＰ１α及びＭＩＰ１βはいずれも、Ｍ１及びＭ２マクロファージとの共培養下でＪＮＪ－３７２で処理した際にアップレギュレーションされ、Ｍ２ｃマクロファージではＭＩＰ１βのより大きな規模の倍数変化がみられる。図４２は、Ｍ１マクロファージの存在下で培養したＨ１９７５細胞中のＭＩＰ－１βのレベルの用量応答曲線を示す。図４３は、Ｍ２マクロファージの存在下で培養したＨ１９７５細胞中のＭＩＰ－１βのレベルの用量応答曲線を示す。図４４は、Ｍ１マクロファージの存在下で培養したＨ１９７５細胞中のＭＩＰ－１αのレベルの用量応答曲線を示す。図４５は、Ｍ２マクロファージの存在下で培養したＨ１９７５細胞中のＭＩＰ－１αのレベルの用量応答曲線を示す。
分泌されたケモカインのＥＧＦＲ／ｃＭｅｔのダウンレギュレーションに対する効果を評価するために、４時間又は７２時間ＰＢＭＣの存在下又は非存在下でアイソタイプ対照、ＪＮＪ－３７２、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマで処理したＨ１９７５細胞からの馴化培地を、未処理のＨ１９７５細胞に移し、ＥＧＦＲ及びｃＭｅｔ経路の変化を評価した。ＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ、及びｃＭｅｔタンパク質レベルの測定可能なダウンレギュレーションは、いずれの時点においても馴化培地の存在下で観察された（データは示さず）。これは、分泌されたサイトカイン及びケモカインが、ＥＧＦＲ／ｃＭｅｔのダウンレギュレーションの強化を誘導するのに十分ではなかったことを示唆しているが、その理由は、これが、腫瘍細胞と免疫細胞との間に抗体の媒介による直接接触を必要とするためである。
実施例９．単球及びマクロファージとのＪＮＪ－３７２ Ｆｃ相互作用は、トロゴサイトーシス（ＡＤＣＴ）を誘導する
別の重要なＦｃエフェクタ機能であるトロゴサイトーシス（ＡＤＣＴ）を、標的細胞に結合している標識された抗体のエフェクタ細胞（マクロファージ）への移動を測定するフローサイトメトリーベースのアッセイを用いて評価した。Ｈ１９７５ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞を、Ｍ１又はＭ２ｃマクロファージと共培養したＡＦ４８８標識アイソタイプ、ＪＮＪ－３７２、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマでオプソニン化し、ＡＦ４８８＋マクロファージの割合を評価した。標識されたＪＮＪ－３７２は、Ｍ１（図４６）及びＭ２ｃ（図４７）マクロファージの両方に用量依存的に移動したが、アイソタイプ対照もＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ標識抗体も、ＣＤ１１ｂ＋マクロファージでは検出されなかった（データは示さず）。認識可能なＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ＋マクロファージは検出されず、これは食作用の欠如を示す。これは、トロゴサイトーシスがこのアッセイにおける主要な機序であることを示唆する。
ＪＮＪ－３７２の誘導によるマクロファージのトロゴサイトーシスを視覚的に確認するために、タイムラプス顕微鏡観察を実施し、マクロファージをＣＤ１１ｂ／ＣＤ１４抗体カクテルで、核についてはヘキスト染色で可視化し、そのＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ＋核によってＨ１９７５標的細胞を同定した。Ｈ１９７５標的細胞を、ＡＦ６４７標識アイソタイプ、ＪＮＪ－３７２、又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ抗体でオプソニン化し、Ｍ１又はＭ２ｃマクロファージと共培養し、ハイコンテンツ共焦点画像を得た。標識されたＪＮＪ－３７２でオプソニン化された標的細胞と共培養すると、ＡＦ６４７＋斑点（ＪＮＪ－３７２）の別個の蓄積が、Ｍ１及びＭ２マクロファージ内で観察されたが、標識されたアイソタイプ又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ処理では蓄積は見られなかった。前のアッセイと同様に、これらのアッセイでも最小限の食作用しか観察されず、これは、ＪＮＪ－３７２による受容体のダウンレギュレーションの主要な機序がトロゴサイトーシスであることを示す。図４８は、４４分間の培養の１１分におけるハイコンテンツ共焦点顕微鏡検査からの代表的な画像を示す。図４９は、１１０分間の培養の７７分におけるハイコンテンツ共焦点顕微鏡検査からの代表的な画像を示す。
次に、単球がトロゴサイトーシスを行う能力について調べた。マクロファージと同様に、ＪＮＪ－３７２（ＡＦ６４７標識）と共培養された単球は標的細胞をオプソニン化し、これは、標識されたＪＮＪ－３７２抗体の単球への特異的な移動を実証した（データは示さず）。最後に、腫瘍微小環境内の抗体相互作用をシミュレートするために、Ｍ１又はＭ２ｃマクロファージ及びＨ１９７５標的細胞のＡＦ６４７標識アイソタイプとの共培養物を、ＪＮＪ－３７２又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ抗体で処理した。これらの条件下では、アイソタイプ対照はＭ１及びＭ２ｃマクロファージにのみに結合し、ＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマは標的細胞にのみ結合するが、ＪＮＪ－３７２は、標的細胞及びマクロファージの両方に結合し（データは示さず）、したがって、各抗体の結合特異性が確認される。ＪＮＪ－３７２の媒介によるトロゴサイトーシスは、標識されたＪＮＪ－３７２抗体のマクロファージへの明確な移動によって測定された通り、同様に共培養条件においても容易に観察されたが、アイソタイプ又はＪＮＪ－３７２．ＩｇＧ２シグマ抗体では観察されなかった。
まとめると、これらの所見は、ＪＮＪ－３７２がマクロファージ及び単球上のＦｃγ受容体との相互作用を通じてトロゴサイトーシスを誘導することを実証する。
考察
本明細書に記載の実験は、ＥＧＦＲ／ｃＭｅｔ二重特異性抗体であるＪＮＪ－３７２が、その抗腫瘍有効性に寄与する複数のＦｃ依存性機序を有していることを実証した。ＮＫ細胞の媒介によるＡＤＣＣを誘導することに加えて、ＪＮＪ－３７２と免疫細胞上のＦｃγ受容体との相互作用は、トロゴサイトーシスを介して受容体チロシンキナーゼＥＧＦＲ及びｃＭｅｔ並びにそのリン酸化形態のダウンモジュレーションも媒介する。この新規のＦｃ機能は、単球及びマクロファージによって促進され、これはインビボでの抗腫瘍有効性にも必要とされる。
免疫細胞とのＪＮＪ－３７２のＦｃ相互作用は、インビトロにおける抗増殖及びアポトーシス効果、並びにインビボにおける抗腫瘍有効性に必要であることが実証された。インビトロでは４８時間以降に最大抗増殖効果が観察され、ＡＤＣＣが早期に発生する（約２～４時間（２９））ことに鑑みて、ＡＤＣＣの全腫瘍細胞殺傷への寄与が最小であり得ると仮定した。評価した細胞株においてＣＤＣ活性は観察されなかったが、ＮＳＣＬＣ細胞株は、補体阻害タンパク質、ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９を発現することが知られている（Ｖａｒｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１３：１７３－８２，１９９８）。これは、試験した細胞においてＪＮＪ－３７２はＣＤＣを誘導しなかったが、二重特異性抗体は、他の細胞株又は腫瘍の種類においてＣＤＣ活性を誘導することができる可能性があることが示唆していた。最後に、ＪＮＪ－３７２がインビトロでＡＤＣＰを誘導したことは既に報告されている（Ｍｏｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７６：３９４２－５３，２０１６）が、この研究におけるフロー及び共焦点顕微鏡ベースのトロゴサイトーシスアッセイで使用した条件下では、ＡＤＣＰが最小限～全く観察されなかった。これらの結果は、ＪＮＪ－３７２が複数の作用機序を介して機能すること、及びこれらのＦｃエフェクタ機能のそれぞれの寄与が患者間で異なり得ることを示唆していた。
ＪＮＪ－３７２がＡＤＣＲを誘導したことも実証され、ＪＮＪ－３７２によってアップレギュレーションされたサイトカインの機能の探索から、大部分がケモカインと呼ばれる走化性サイトカインのファミリー、具体的にはＣＣケモカインに属していることが明らかになった（Ｇｒａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ ６：１０９－１８，１９９５；Ｂａｌｋｗｉｌｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４：５４０－５０，２００４）。ＣＣケモカインは、単球及びマクロファージのような自然免疫細胞の走化性因子として機能することが知られている、２つの主要なサブファミリー、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）及びマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）で構成されている（Ｕｇｕｃｃｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：６４－８，１９９５；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ ８：１０５５－６０，１９９４）。ＭＣＰファミリーメンバー、ＭＣＰ－１（ＣＣＬ２）及びＭＣＰ－３（ＣＣＬ７）は、炎症性単球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の動員を増加させることが示されている（Ｕｇｕｃｃｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：６４－８，１９９５；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ ８：１０５５－６０，１９９４；Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８０：６８４６－５３，２００８）。ＭＣＰ－１及びＭＩＰ１β（ＣＣＬ４）はまた、ＮＳＣＬＣの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）への単球及びマクロファージの動員を誘導することも報告されている（Ｕｇｕｃｃｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：６４－８，１９９５；Ａｒｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ４９：６３－７０，２０００）。
これらのサイトカインは、免疫細胞をＴＭＥに誘引し、それを活性化させることができるが、抗体の媒介による細胞間接触の必要性及びトロゴサイトーシスの誘導は、ＪＮＪ－３７２ Ｆｃ相互作用がＥＧＦＲ及びｃＭｅｔシグナル伝達のダウンモジュレーションを媒介する機序が、単球又はマクロファージの媒介によるトロゴサイトーシスを介していることを示唆していた。いくつかの最近の報告は、トロゴサイトーシスによるマクロファージ及び好中球のような免疫細胞へのＨｅｒ２受容体の同様の移動によって、治療抗体オプソニン化腫瘍細胞が死に至ることを示している（Ｖｅｌｍｕｒｕｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５：１８７９－８９，２０１６；Ｍａｔｌｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２３：３９４６－５９，２０１８）。これは、以前は、トロゴサイトーシスがリツキシマブなどの抗体の抵抗性の機序であると考えられていたが、Ｆｃエフェクタ機能として抗腫瘍効果を媒介する機能も有し得ることを示唆していた（Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｌｉｎｄｏｆｅｒ，Ｂｌｏｏｄ １２５：７６２－６，２０１５；Ｐｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６：ｅ１４４９８，２０１１）。
結論として、ＪＮＪ－３７２は、その抗腫瘍活性に寄与するいくつかのＦｃ依存性及びＦｃ非依存性機能を備える複数の異なる作用機序を提示することが実証された。インビトロ及びインビボモデルは、単球及びマクロファージ上のＦｃγＲｓとのＪＮＪ－３７２相互作用が、ＥＧＦＲ／Ｍｅｔのダウンモジュレーション及び抗腫瘍有効性に必要であり、これは、これらの免疫細胞のレベルから、臨床状況におけるＪＮＪ－３７２有効性を予測し得ることを示唆している。

Claims (70)

  1. ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象を治療する方法であって、前記対象におけるマクロファージ活性を強化する薬剤と組み合わせて、治療的に有効な量の単離二重特異性抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）／肝細胞成長因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）抗体を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  2. 前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体が、
    ａ）ＥＧＦＲに結合する第１のドメインであって、配列番号１の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号４の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む、第１のドメインと、
    ｂ）ｃ－Ｍｅｔに結合する第２のドメインであって、配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２、配列番号９のＨＣＤＲ３、配列番号１０のＬＣＤＲ１、配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む、第２のドメインと
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. ａ）前記ＥＧＦＲに結合する第１のドメインが、配列番号１３の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号１４の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
    ｂ）前記ｃ－Ｍｅｔに結合する第２のドメインが、配列番号１５のＶＨ及び配列番号１６のＶＬを含む、
    請求項２に記載の方法。
  4. 前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体が、配列番号１７の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号１８の第１の軽鎖（ＬＣ１）、配列番号１９の第２の重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号２０の第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. マクロファージ活性を強化する前記薬剤が、ＧＭ－ＣＳＦ、抗ＣＤ４７抗体、ＨＤＡＣ２阻害剤、ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤、又はＣＤ１１ｂアゴニストである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ発現がんが、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ活性化変異、ＥＧＦＲ遺伝子増幅、循環ＨＧＦのレベルの上昇、野生型ｃ－Ｍｅｔ、ｃ－Ｍｅｔ活性化変異、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅、又は変異体ＫＲＡＳに関連する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ＥＧＦＲ活性化変異が、Ｌ７１８Ｑ、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸である）、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸である）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｃ７９７Ｓ、Ｌ８５８Ｐ、若しくはＴ７９０Ｍの置換、Ｅ７４６～Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８～Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６とＡ７６７との間へのＡｌａ（Ａ）の挿入、Ｓ７６８とＶ７６９との間へのＳｅｒ、Ｖａｌ、及びＡｌａ（ＳＶＡ）の挿入、Ｐ７７２とＨ７７３との間へのＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入、Ｄ７６１とＥ７６２、Ａ７６３とＹ７６４、Ｙ７６４とＹ７６５、Ｍ７６６とＡ７６７、Ａ７６７とＶ７６８、Ｓ７６８とＶ７６９、Ｖ７６９とＤ７７０、Ｄ７７０とＮ７７１、Ｎ７７１とＰ７７２、Ｐ７７２とＨ７７３、Ｈ７７３とＶ７７４、Ｖ７７４とＣ７７５との間への１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入、ＥＧＦＲエキソン２０における１つ又は２つ以上の欠失、又はＥＧＦＲエキソン２０における１つ又は２つ以上の挿入、あるいはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記変異体ＫＲＡＳが、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、若しくはＧ１２Ｄの置換、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
  10. 前記対象が、新たに診断されたＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記対象が、以前の抗がん療法による治療に対して抵抗性であるか又は抵抗性を獲得している、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記以前の抗がん療法が、化学療法、標的抗がん療法、又はキナーゼ阻害剤である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記キナーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ、又はＡＸＬの阻害剤である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記キナーゼ阻害剤が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ラゼルチニブ、ポジオチニブ、クリオチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、アキシチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、レゴラフェニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、又はスニチニブである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんが、上皮細胞がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺腺がん、小細胞肺がん、結腸直腸がん、肛門がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頚部がん、咽頭がん、鼻のがん、膵臓がん、皮膚がん、口腔がん、舌のがん、食道がん、膣がん、子宮頚がん、脾臓のがん、精巣がん、胃がん、胸腺のがん、結腸がん、甲状腺がん、肝臓がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、又は散発性若しくは遺伝性の乳頭状腎細胞がん（ＰＲＣＣ）である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記対象に１つ又は２つ以上の抗がん療法を更に施すことを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記１つ又は２つ以上の抗がん療法が、化学療法、標的抗がん療法、又はキナーゼ阻害剤を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記キナーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ、又はＡＸＬの阻害剤である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記キナーゼ阻害剤が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ラゼルチニブ、ポジオチニブ、クリオチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、アキシチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、レゴラフェニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、又はスニチニブである、請求項１８に記載の方法。
  20. 二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答するＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象を診断及び治療する方法であって、
    ａ）前記対象からの生体試料を提供することと、
    ｂ）前記生体試料からのマクロファージ又は単球レベルを測定することと、
    ｃ）前記生体試料からの前記マクロファージ又は単球レベルが閾値よりも高いとき、前記対象が、前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答する前記ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんを有すると診断することと、
    ｄ）前記抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答すると診断された前記対象に、前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体を投与するか又は投与するために提供することと
    を含む、前記方法。
  21. ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんを有すると疑われるか又は有する対象を二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体で治療する方法であって、
    ａ）前記対象が、閾値よりも高いマクロファージ又は単球レベルを有すると判定することと、
    ｂ）前記閾値よりも高いマクロファージ又は単球レベルを有すると判定された前記対象に、前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体を投与するか又は投与するために提供することと
    を含む、前記方法。
  22. 二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に対する、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象の応答を予測する方法であって、
    ａ）前記対象からの生体試料を提供することと、
    ｂ）前記生体試料からのマクロファージ又は単球レベルを測定することと、
    ｃ）前記生体試料からの前記マクロファージ又は単球レベルが閾値よりも高いとき、前記対象が応答者であると予測することと
    を含む、前記方法。
  23. 二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答するＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象を治療する方法であって、
    ａ）前記対象からの生体試料を提供することと、
    ｂ）前記生体試料からのマクロファージ又は単球レベルを測定することと、
    ｃ）前記生体試料からの前記マクロファージ又は単球レベルが閾値よりも高いとき、前記対象を前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体で治療することと
    を含む、前記方法。
  24. ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する対象が二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答するかどうかを判定し、前記対象を治療するかどうかを判断する方法であって、
    ａ）前記対象からの生体試料を提供することと、
    ｂ）前記生体試料からのマクロファージ又は単球レベルを測定することと、
    ｃ）前記生体試料からのマクロファージ若しくは単球レベルが閾値よりも高いとき、前記ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、若しくはＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する前記対象が前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答すると診断するか、又は前記生体試料からのマクロファージ若しくは単球レベルが前記閾値よりも低いとき、前記ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、若しくはＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する前記対象が前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答しないと診断することと、
    ｄ）前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答すると診断された前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体前記対象を投与するか、又は前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体による治療に応答しないと診断された前記対象に前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体を投与することを控えることと
    を含む、前記方法。
  25. 前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体が、
    ａ）ＥＧＦＲに結合する第１のドメインであって、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む、第１のドメインと、
    ｂ）ｃ－Ｍｅｔに結合する第２のドメインであって、配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２、配列番号９のＨＣＤＲ３、配列番号１０のＬＣＤＲ１、配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む、第２のドメインと
    を含む、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. ａ）前記ＥＧＦＲに結合する第１のドメインが、配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含み、
    ｂ）前記ｃ－Ｍｅｔに結合する第２のドメインが、配列番号１５のＶＨ及び配列番号１６のＶＬを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体が、配列番号１７のＨＣ１、配列番号１８のＬＣ１、配列番号１９のＨＣ２、及び配列番号２０のＬＣ２を含む、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記閾値が、前記ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ陽性がんを有する対象の集団からの前記生体試料中で観察されたマクロファージ又は単球の３０パーセンタイル値以上である、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記生体試料が、血液試料である、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記生体試料が、腫瘍組織生検材料である、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の方法。
  32. ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんが、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ活性化変異、ＥＧＦＲ遺伝子増幅、循環ＨＧＦのレベルの上昇、野生型ｃ－Ｍｅｔ、ｃ－Ｍｅｔ活性化変異、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅、若しくは変異体ＫＲＡＳ、又はこれらの任意の組み合わせに関連する、請求項２０～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ＥＧＦＲ活性化変異が、Ｌ７１８Ｑ、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸である）、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸である）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｃ７９７Ｓ、Ｌ８５８Ｐ、若しくはＴ７９０Ｍの置換、Ｅ７４６～Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８～Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６とＡ７６７との間へのＡｌａ（Ａ）の挿入、Ｓ７６８とＶ７６９との間へのＳｅｒ、Ｖａｌ、及びＡｌａ（ＳＶＡ）の挿入、Ｐ７７２とＨ７７３との間へのＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入、Ｄ７６１とＥ７６２、Ａ７６３とＹ７６４、Ｙ７６４とＹ７６５、Ｍ７６６とＡ７６７、Ａ７６７とＶ７６８、Ｓ７６８とＶ７６９、Ｖ７６９とＤ７７０、Ｄ７７０とＮ７７１、Ｎ７７１とＰ７７２、Ｐ７７２とＨ７７３、Ｈ７７３とＶ７７４、Ｖ７７４とＣ７７５との間への１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入、ＥＧＦＲエキソン２０における１つ又は２つ以上の欠失、又はＥＧＦＲエキソン２０における１つ又は２つ以上の挿入、あるいはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記変異体ＫＲＡＳが、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、又はＧ１２Ａの置換を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記対象が、新たに診断されたＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんを有すると疑われるか又は有する、請求項２０～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記対象が、以前の抗がん療法による治療に対して抵抗性であるか又は抵抗性を獲得している、請求項２０～３４のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記以前の抗がん療法が、化学療法、標的抗がん療法、又はキナーゼ阻害剤である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記キナーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ、又はＡＸＬの阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記キナーゼ阻害剤が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ラゼルチニブ、ポジオチニブ、クリオチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、アキシチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、レゴラフェニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、又はスニチニブを伴う、請求項３８に記載の方法。
  40. ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんが、上皮細胞がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺腺がん、小細胞肺がん、結腸直腸がん、肛門がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頚部がん、咽頭がん、鼻のがん、膵臓がん、皮膚がん、口腔がん、舌のがん、食道がん、膣がん、子宮頚がん、脾臓のがん、精巣がん、胃がん、胸腺のがん、結腸がん、甲状腺がん、肝臓がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、又は散発性若しくは遺伝性の乳頭状腎細胞がん（ＰＲＣＣ）である、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体が、前記対象におけるマクロファージ活性を強化する薬剤と組み合わせて投与される、請求項２０～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記対象におけるマクロファージ活性を強化する前記薬剤が、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４７アンタゴニスト、抗ＣＤ４７抗体、ＨＤＡＣ２阻害剤、ＰＤ－（Ｌ）１軸阻害剤、又はＣＤ１１ｂアゴニストである、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記対象に１つ又は２つ以上の抗がん療法を施すことを更に含む、請求項２０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記１つ又は２つ以上の抗がん療法が、化学療法、標的抗がん療法、又はキナーゼ阻害剤を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記キナーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ、又はＡＸＬの阻害剤である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記キナーゼ阻害剤が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ラゼルチニブ、ポジオチニブ、クリオチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、アキシチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、レゴラフェニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、又はスニチニブである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体が、約１５％以下のフコース含量を有する、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. ドナー細胞からアクセプタ細胞へのＥＧＦＲ、若しくはｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔのトロゴサイトーシスを誘導する方法であって、前記ドナー細胞から前記アクセプタ細胞へのトロゴサイトーシスを誘導するのに十分な時間、前記ドナー細胞を二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体と接触させることを含む、前記方法。
  49. 前記ドナー細胞が、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔを発現しているがん細胞である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記アクセプタ細胞が、マクロファージ又は単球である、請求項４８又は４９に記載の方法。
  51. 前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体が、
    ａ）ＥＧＦＲに結合する第１のドメインであって、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３、配列番号４の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む、第１のドメインと、
    ｂ）ｃ－Ｍｅｔに結合する第２のドメインであって、配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２、配列番号９のＨＣＤＲ３、配列番号１０のＬＣＤＲ１、配列番号１１のＬＣＤＲ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ３を含む、第２のドメインと
    を含む、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. ａ）前記ＥＧＦＲに結合する第１のドメインが、配列番号１３のＶＨ及び配列番号１４のＶＬを含み、
    ｂ）前記ｃ－Ｍｅｔに結合する第２のドメインが、配列番号１５のＶＨ及び配列番号１６のＶＬを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体が、配列番号１７のＨＣ１、配列番号１８のＬＣ１、配列番号１９のＨＣ２、及び配列番号２０のＬＣ２を含む、請求項４８～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔを発現している前記がん細胞が、野生型ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ活性化変異、ＥＧＦＲ遺伝子増幅、循環ＨＧＦのレベルの上昇、野生型ｃ－Ｍｅｔ、ｃ－Ｍｅｔ活性化変異、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅、又は変異体ＫＲＡＳに関連する、請求項４９～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記ＥＧＦＲ活性化変異が、Ｌ７１８Ｑ、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸である）、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸である）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｃ７９７Ｓ、Ｌ８５８Ｐ、若しくはＴ７９０Ｍの置換、Ｅ７４６～Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８～Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６とＡ７６７との間へのＡｌａ（Ａ）の挿入、Ｓ７６８とＶ７６９との間へのＳｅｒ、Ｖａｌ、及びＡｌａ（ＳＶＡ）の挿入、Ｐ７７２とＨ７７３との間へのＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入、Ｄ７６１とＥ７６２、Ａ７６３とＹ７６４、Ｙ７６４とＹ７６５、Ｍ７６６とＡ７６７、Ａ７６７とＶ７６８、Ｓ７６８とＶ７６９、Ｖ７６９とＤ７７０、Ｄ７７０とＮ７７１、Ｎ７７１とＰ７７２、Ｐ７７２とＨ７７３、Ｈ７７３とＶ７７４、Ｖ７７４とＣ７７５との間への１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入、ＥＧＦＲエキソン２０における１つ又は２つ以上の欠失、又はＥＧＦＲエキソン２０における１つ又は２つ以上の挿入、あるいはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記変異体ＫＲＡＳが、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、又はＧ１２Ａの置換を含む、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記接触工程が、インビトロで行われる、請求項４８～５６のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記接触工程が、前記二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体を対象に投与することを含む、請求項４８～５６のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記対象が、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記対象が、新たに診断されたＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ発現がんを有する、請求項５９又は６０に記載の方法。
  62. 前記対象が、以前の抗がん療法による治療に対して抵抗性であるか又は抵抗性を獲得している、請求項５９又は６０に記載の方法。
  63. 前記以前の抗がん療法が、化学療法、標的抗がん療法、又はキナーゼ阻害剤である、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記キナーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ、又はＡＸＬの阻害剤である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記キナーゼ阻害剤が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ラゼルチニブ、ポジオチニブ、クリオチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、アキシチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、レゴラフェニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、又はスニチニブである、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、又はＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔを発現しているがんが、上皮細胞がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、ＮＳＣＬＣ、肺腺がん、小細胞肺がん、結腸直腸がん、肛門がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頚部がん、咽頭がん、鼻のがん、膵臓がん、皮膚がん、口腔がん、舌のがん、食道がん、膣がん、子宮頚がん、脾臓のがん、精巣がん、胃がん、胸腺のがん、結腸がん、甲状腺がん、肝臓がん、ＨＣＣ、又は散発性若しくは遺伝性の乳頭状腎細胞がんＰＲＣＣに由来する、請求項４９～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記対象に１つ又は２つ以上の抗がん療法を更に施すことを含む、請求項５９～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記１つ又は２つ以上の抗がん療法が、化学療法、標的抗がん療法、又はキナーゼ阻害剤を含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記キナーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ、又はＡＸＬの阻害剤である、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記キナーゼ阻害剤が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ラゼルチニブ、ポジオチニブ、クリオチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、アキシチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、レゴラフェニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、又はスニチニブである、請求項６９に記載の方法。
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