KR20180083313A - Hiv 항체 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

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프랑소와 비그놀트
아드리안 랭엄 브릭스
스티븐 제이콥 골드플레스
소니아 팀버레이크
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에이비비트로, 엘엘씨
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Abstract

발명은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)의 치료 및 검출에 사용될 수 있는 신규한 항-HIV 항체에 관한 것이다. 이 항체들은 고도의 민감성을 나타내고 광범위한 특이성을 제공할 수 있다.

Description

HIV 항체 조성물 및 사용 방법
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2015년 9월 24일에 출원된 미국 가특허출원 번호 62/232,279에 관한 것이고, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
정부 이해관계
본원에 개시된 발명은, 적어도 부분적으로는, 미국립보건원으로부터 승인 번호 P01 AI081677 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 따라서, 미국 정부는 본 발명에 특정 권한을 가진다.
발명의 분야
본 발명은 인간 면역결핍증 바이러스 ("HIV")에 대한 항체 및 그것들의 사용 방법에 관한 것이다.
HIV는 생명을 위협하는 감염 및 악성 종양을 초래하는 소모성 증후군, 중추신경계 퇴행 및 면역억제를 특징으로 하는 인간의 질환인 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)을 유발한다. HIV 제1 유형 (HIV-1)은 그것이 발견된 이래 2천5백만명 이상의 사망을 초래하였고 2천만 내지 6천만명이 차후 20년에 걸쳐 감염될 것으로 예측된다. 그러므로, HIV 감염을 치료 또는 억제하기 위한 치료제 및 방법이 필요하다.
일부 HIV 감염된 개체의 혈청은 IgG 아이소타입의 광범위한 중화 항체 (bNAb)를 나타낸다. 그러나, 이 항체들의 특이성 및 활성은 대부분 미지인 채로 남아 있다. 중화 항체의 수동 전달은 동물 모델에서 바이러스 도전에 대한 보호에 기여할 수 있다.
대부분의 백신의 성공은 항체에 따라 달라지고, HIV 항체는 최근의 항-HIV 백신 실험에서 보호와 상관이 있었다. 비록 일부 환자들이 감염 후에 수년 동안 gp160에 대한 광범위한 중화 항체를 발생시켰지만, 자가유래 바이러스의 돌연변이 유발 능력은 HIV 감염에 대한 보호를 방지하였다. 아직은, 광범위한 중화 활성이 바이러스에 대해 선택적 압력으로 적용되지는 못하지만; SHIV 감염에 대한 보호를 위해 마카크 원숭이로의 (bNAb)의 수동 전달은 가능하다. 그러므로, 그러한 항체를 이끌어내는 백신은 HIV 감염에 대해 인간을 보호할 수 있다.
본 발명은 일부 측면으로는 광범위한-중화 항-HIV 항체에 관한 것이다.
한 측면으로 항-HIV 항체, 예컨대 분리된 항-HIV 항체가 제공되며, 항-HIV 항체는 1 nM 이하의 친화성으로 HIV의 N-글리칸 에피토프에 결합하거나 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 HIV를 중화하거나 HIV를 중화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 광범위한 중화 항체이다. 다른 구체예에서, HIV는 HIV-1이다. 추가의 구체예에서, HIV는 HIV-1 그룹 M이다. HIV는 HIV-1 클레이드 A (A1 및/또는 A2를 포함함), B, C, D, E, F (F1 및/또는 F2를 포함함), G, H, I, J, K 또는 임의의 조합, 아형, 또는 그것들의 재조합 유도체 (순환하는 재조합 형태 (CRF)를 포함함)일 수 있다. 일부 구체예에서, 재조합 HIV-1 클레이드 (일부 구체예에서는 순환하는 재조합 형태 (CRF)로 언급됨)는 그것들이 유래되는 두 클레이드의 조합으로 표시된다. 일부 구체예에서, 예시 CRF는 AB, AC, AG, DF, BC 등을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 Fc 영역에서 올리고당을 변형시키기 위하여 글리코엔지니어링되었고 (glycoengineered) 항체는 글리코엔지니어링되지 않은 항체에 비교하여 증가된 ADCC 이펙터 기능을 가진다. 일부 구체예에서, 항체는 단클론성 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 인간, 인간화된 또는 키메라 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 전-길이 IgG 클래스 항체이다. 다른 구체예에서, 항체는 항체 단편이다. 추가의 구체예에서, 항체는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)이다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 추가로 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 추가로 SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 추가로 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 추가로 SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; SEQ ID NO:43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 가지는 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 가지는 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 추가로 SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 추가로 SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 추가로 SEQ ID NO:66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; SEQ ID NO:67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO:68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열; 또는 (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; SEQ ID NO:4의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열; 또는 (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; SEQ ID NO:6의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열; 또는 (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; SEQ ID NO:8의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열; 또는 (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; 및 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 가지는 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; 및 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 가지는 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; SEQ ID NO:14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열; 또는 (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; 또는 (a)에서와 같은 VH 서열 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; 또는 (a)에서와 같은 VH 서열 및 SEQ ID NO:65의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 표 4의 CDR-H1, 표 4의 CDR-H2, 표 4의 CDR-H3 또는 그것들의 임의의 조합; 표 5의 CDR-L1, 표 5의 CDR-L2, 표 5의 CDR-L3 또는 그것들의 임의의 조합; 표 4의 VH 서열, 표 5의 VL 서열 또는 둘 다; 또는 (a), (b) 또는 (c)의 임의의 조합을 포함하지 않는다.
한 측면으로, 본원에 기술된 항체들 중 어떠한 것을 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다. 한 측면으로, 그 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 한 측면으로, 그 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
한 측면으로, 본원에 기술된 항체들 중 임의의 것을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하여서 항체를 생성시키는 단계를 포함하는 항체의 제조 방법이 제공된다.
한 측면으로, 본원에 기술된 항체들 중 임의의 것과 세포독성제를 포함하는 면역컨쥬게이트가 제공된다.
한 측면으로, 본원에 기술된 항체와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형이 제공된다.
한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 항체 또는 면역컨쥬게이트들 중 임의의 것이 의약으로서 사용하기 위해 제공된다.
한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 항체 또는 면역컨쥬게이트들 중 임의의 것이 HIV 감염 또는 AIDS를 치료하기 위해 제공된다.
한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 항체 또는 면역컨쥬게이트 중 임의의 것이 의약의 제조에 사용하기 위해 제공된다. 일부 구체예에서, 의약은 HIV 감염 또는 AIDS의 치료를 위한 것이다. 다른 구체예에서, 의약은 HIV를 중화하기 위한 것이다. 일부 구체예에서, 항체는 광범위한 중화 항체이다. 일부 구체예에서, HIV는 HIV-1이다. 추가의 구체예에서, HIV는 HIV-1 그룹 M이다. HIV는 HIV-1 클레이드 A (A1 및/또는 A2를 포함함), B, C, D, E, F (F1 및/또는 F2를 포함함), G, H, I, J, K 또는 임의의 조합, 아형, 또는 그것들의 재조합 유도체 (순환하는 재조합 형태 (CRF)를 포함함)일 수 있다. 일부 구체예에서, 재조합 HIV-1 클레이드 (일부 구체예에서는 순환하는 재조합 형태 (CRF)로 언급됨)는 그것들이 유래되는 두 클레이드의 조합으로 표시된다. 일부 구체예에서, 예시 CRF는 AB, AC, AG, DF, BC 등을 포함한다.
한 측면으로, 본원에는 유효량의 본원에 기술된 항체 또는 면역컨쥬게이트 중 임의의 것을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, HIV 감염 또는 AIDS를 가진 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 추가로 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 치료제는 항바이러스제이다.
한 측면으로, 본원에는 샘플에 존재하는 항체와 HIV 사이에서의 항체-HIV 복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 본원에 기술된 항체 또는 면역컨쥬게이트 중 임의의 것과 샘플을 접촉시키는 단계, 및 면역검출 방법에 의해 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, HIV 면여조직화학적 분석이 제공된다. 일부 구체예에서, 샘플은 혈액 샘플 또는 조직 샘플이다.
한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 항체들 중 임의의 것을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 벡터에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 허용하고 항체 또는 그것의 단편을 조립하는 조건하에서 배양하는 단계; 및 숙주 세포 또는 숙주 세포의 배지로부터 항체 또는 단편을 정제하는 단계를 포함하는, 항-HIV 항체 또는 그것의 단편의 제조 방법이 제공된다.
한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 적어도 하나의 분리된 항-HIV 항체 또는 면역컨쥬게이트의 약학적으로 유효한 향의 약학적으로 허용되는 투여 단위를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 구체예에서, 키트는 추가로 약학적으로 유효향의 항-HIV제의 약학적으로 허용되는 투여 단위를 포함한다. 일부 구체예에서, 항-HIV제는 비-뉴클레오사이드 역전사효소 억제제, 프로테아제 억제제, 유입 또는 융합 억제제 및 인테그라아제 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 적어도 하나의 분리된 항-HIV 항체 또는 면역컨쥬게이트, 및 항-HIV 항체에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 검출 시약을 포함하는, 대상체에서 HIV 감염 또는 AIDS의 치료를 진단, 예측 또는 모니터링하기 위한 키트가 제공된다. 일부 구체예에서, 키트는 추가로 PCR을 수행하기 위한 시약을 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 추가로 질량 분광분석을 수행하기 위한 시약을 포함한다.
한 측면으로, 융합 단백질 또는 컨쥬게이트는 본원에 기술된 임의의 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 융합 단백질 또는 컨쥬게이트는 키메라 수용체이거나 키메라 수용체를 포함하고, 그것은 선택적으로 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체 (CAR)는 본원에 기술된 임의의 항체를 포함한다. 키메라 항원 수용체는 추가로 ITAM 모티프를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이다. 다른 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 추가로 CD3ζ로부터의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 추가로 CD28, CD137, ICOS 및 OX40으로 구성된 군으로부터 선택된 공동자극 분자로부터의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이다.
참조에 의한 포함
본원에서 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 그 전문이 참조에 의해 포함된다. 본원의 용어와 포함된 참조의 용어 사이에서 대립되는 경우에, 본원의 용어가 우선시된다.
본원에 기술된 신규한 특징들은 첨부된 청구범위에서 특히 진술된다. 본원에 기술된 특징들의 특징 및 장점들의 더 나은 이해는 예시적인 실례들을 진술하는 다음의 상세한 설명을 참조로 얻어질 것이고, 여기서 본원에 기술된 특징들의 원리가 활용되며; 첨부되는 도면은 다음과 같다:
도 1은 중쇄 CD3 유사성에 의한 스크리닝으로부터의 결과를 포함한 그래프를 도시한다. 건강한 지원자에서 볼 수 있는 매치 유사성은 "유의미한 한계값" (도너로부터의 중쇄에서 항체 후보들에 대한 초기 허용되는 컷오프)을 시사한다.
도 2는 발견된 항체가 공지된 Pt17 BNAb와 계통발생적으로 분리되는 것을 보이는 차트를 도시한다. 도너 17로부터의 BNAb의 서열이 수집되었다. 이 BNAb와 계통발생적으로 산재된 신규한 항체들이 측정되었고 동일한 계통으로부터 발생하는 것으로 보인다. BNAb에 대한 계통발생적 관계는 새로운 광범위 중화 항체를 확인하기 위해 사용되었다.
도 3은 도너 17로부터 유래된 공지 및 신규한 Ab의 차트를 도시한다. 새로운 항체 쌍에는 공지의 BNAb (중쇄 및 경쇄 둘 다)가 산재되어 있다.
도 4는 공지의 및 발견된 항체 중쇄 및 경쇄 쌍을 보여주는 차트를 도시한다.
도 5는 생식선 항체의 가변 영역 서열과 비교한 AbV1-9 항체 가변 영역 서열들의 배열을 도시한다.
도 6A는 생식선 및 AbV1-9 클론 변종들의 서열 배열을 도시한다. (A) AbV1-9 항체들의 중쇄 (IgH) 및 클론 변종들에 대한 생식선 (GL) VH의 아미노산 배열. Kabat에 의해 정의된 것과 같이 (J Exp Med 132(2):21 1-250) 결정 구조, 프레임워크 (FWR) 및 상보성 결정 영역 (CDR)을 기반으로 한 아미노산 넘버링이 도시된다.
도 6B는 생식선 및 AbV1-9 클론 변종들의 서열 배열을 도시한다. AbV1-9 항체들의 경쇄 (IgL) 및 클론 변종들에 대한 생식선 (GL) VL의 아미노산 배열. Kabat에 의해 정의된 것과 같이 (J Exp Med 132(2):21 1-250) 결정 구조, 프레임워크 (FWR) 및 상보성 결정 영역 (CDR)을 기반으로 한 아미노산 넘버링이 도시된다.
도 7은 HIV bNAb 발견의 방법으로부터의 결과를 도시한다. HIV 엘리트 콘트롤러(elite controller)로부터의 B-세포들은 에멀션으로 들어갔고 BCR 쌍은 회수되었다. (도 7A) 38,620개의 회수된 쌍의 중쇄 아이소타입 분포, 여기서 IgG 사슬의 아주 적은 비율이 이전에 공지된 bNAb와 잘 배열되었다 ("PGT-유사"). (도 7B) 공지된 bNAB 플러스 새롭게 회수된 bNAB의 완전한 VDJ 아미노산 서열의 계통발생 나무 (선으로 연결되고, 비말 바코드로 표지됨), 여기서 중쇄 (좌측) 및 경쇄 (우측)가 별도로 도표화됨. 잠재적으로 미스매치된 항체들은 PGT122.heavy 및 PGT123.light, 및 PCT123.heavy 및 PGT122.light이다. (도 7C) PGT121의 대조표준 스톡과 비교한, HIV의 10개의 스트레인에 대한 8개의 새롭게 회수된 PGT-유사 변종의 중화 활성 (IC50, μg/mL).
일부 측면으로, 발명은 적어도 부분적으로는, 일부 측면으로 예컨대 gp120 상의 탄수화물-의존성 에피토프, 예컨대 복합체형 N-글리칸을 인식할 수 있는 HIV에 대한 광범위 중화 항체 (bNAb)의 새로운 카테고리의 예상치 못한 발견을 기반으로 한다.
제공된 항체들 중에는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면 이중특이적 항체 및 다반응성 항체) 및 항체 단편들이 있다. 항체는 항체-컨쥬게이트 및 항체를 포함하는 분자, 예컨대 키메라 분자; 하나 이상의 자극성, 신호전달 및/또는 공동자극 도메인을 포함하는 키메라 수용체; 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함한다. 그러므로, 항체는, 한정하는 것은 아니지만, 전-길이 및 천연 항체, 뿐만 아니라 그것들의 결합 특이성을 보유하고 있는 그것들의 단편 및 부분, 예컨대 많은 면역글로불린 부류 및/또는 아이소타입 (예컨대 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, IgE 및 IgM)을 가지는 것들을 포함하여, 그것들의 임의의 특이적 결합 부분; 및 한정하는 것은 아니지만, Fab, F(ab')2, Fv 및 scFv (단일 사슬 또는 관련된 실체)를 포함하여, 그것들의 생물학적으로 관련된 (항원-결합) 단편 또는 특이적 결합 부분을 포함한다. 단클론성 항체는 일반적으로 실질적으로 균일한 항체의 조성 내에 있는 것이다; 그러므로, 단클론성 항체 조성물 내에 포함된 임의의 개별적인 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 다클론성 항체는 일반적으로 둘 이상의 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 다른 서열들의 상이한 항체들을 포함하는 제제이다.
또한 구체예들 중 임의의 구체예의 항체 (예컨대 세포외재성 도메인에 또는 그것의 일부에 함유된) 및 추가 도메인, 예컨대 세포내 신호전달 도메인, 스페이서, 링커 및/또는 경막 도메인을 포함하는, 수용체, 예컨대 재조합 수용체를 포함하여, 키메라 및/또는 융합 분자와 같은 분자들이 제공된다. 일부 구체예에서, 수용체는 구체예들 중 임의의 구체예의 항체 또는 단편을 포함하는 세포외 부분 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체이다.
그러므로 본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고 무상 항체 및 그것들의 기능성 (항원-결합) 항체 단편, 이를테면 단편 항원 결합 (Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 단일 사슬 항체 단편, 이를테면 단일 사슬 가변 단편 (sFv 또는 scFv) 및 단일 도메인 항체 (예컨대 sdAb, sdFv, 나노바디) 단편을 포함하여, 다클론성 및 단클론성 항체를 포함한다. 용어는 유전자 엔지니어링된 및/또는 그렇지 않으면 변형된 형태의 면역글로불린, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 전체 인간 항체, 인간화된 항체, 및 헤테로컨쥬게이트 항체, 다중특이적, 예컨대 이중특이적 항체, 디아바디, 트라이아바디 및 테트라바디, 탠덤 다이-scFv, 탠덤 트라이-scFv를 다 포함한다. 다르게 진술되지 않는 한, 용어 "항체"는 그것들의 기능성 항체 단편들을 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 용어는 또한 임의의 부류 또는 하위-부류의 항체, 이를테면 IgG 및 그것들의 하위-부류, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하여, 무상 또는 전체-길이 항체를 다 포함한다.
"초가변성 영역" 또는 HVR"과 동의어인 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항원 특이성 및/또는 결합 친화성을 부여하는, 항체 가변 영역 내의 아미노산의 비-연속성 서열들을 나타내는 것으로 기술분야에서 알려져 있다. 일반적으로, 각 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR이 있고 (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) 각 경괘 가변 영역에 3개의 CDR이 있다 (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). "프레임워크 영역" 및 "FR"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들의 비-CDR 부분을 나타내는 것으로 기술분야에서 알려져 있다. 일반적으로, 각 전체-길이 중쇄 가변 영역에 4개의 FR이 있고 (FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4), 각 전체-길이 경쇄 가변 영역에 4개의 FR이 있다 (FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4).
주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 다음의 문헌들에 기술되어 있는 것들을 포함하여, 잘 알려져 있는 많은 계획도 중 임의의 것을 사용하여 쉽게 측정될 수 있다: Kabat et al. (1991), "Sequences of 단백질 of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" numbering scheme), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745." ("Contact" numbering scheme), Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 ("IMGT" numbering scheme) 및 Honegger A and Pluckthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, ("Aho" numbering scheme).
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 확인을 위해 사용된 계획에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, Kabat 계획은 구조적 배열을 기반으로 하는 한편, Chothia 계획은 구조적 정보를 기반으로 한다. Kabat 및 Chothia 계획 둘 다에 대한 넘버링은 가장 공통적인 항체 영역 서열 길이를 기반으로 하고, 삽입은 문자를 삽입함으로써, 예를 들면 "30a"로 제공되고, 일부 항체에서는 결실이 표시된다. 두 계획은 상이한 위치에 특정 삽입 및 결실 ("indel")을 두어 상이한 넘버링을 유발한다. Contact 계획은 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 하고 Chothia 넘버링 계획과 많은 관점에서 유사하다.
하기의 표 A는 Kabat, Chothia 및 Contact 계획에 의해 각각 확인된 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3의 예시 위치 경계를 열거한다. CDR-H1의 경우, 잔기 넘버링은 Kabat 및 Chothia 넘버링 계획 둘 다를 사용하여 열거된다. FR은 CDR 사이에 위치하는데, 예를 들면 FR-L1은 CDR-L1과 CDR-L2 사이에 위치하는 식이다. 도시된 Kabat 넘버링 계획이 H35A 및 H35B에 삽입을 두기 때문에, Chothia CDR-H1 루프의 단부는 도시된 Kabat 넘버링 관례를 사용하여 넘버링될 때 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 달라진다.
Figure pct00001
1 - Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.
2 - Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948.
그러므로, 다르게 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 그것의 영역, 예컨대 그것의 가변 영역의 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역" 또는 개별적인 명시된 CDR (예컨대 "CDR-H1, CDR-H2)은 전술된 계획들 중 임의의 것에 의해 규정된 (또는 특이적) 상보성 결정 영역을 다 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 CDR (예컨대 CDR-H3)이 주어진 VH 또는 VL 아미노산 서열의 상응하는 CDR의 아미노산 서열을 함유하는 것으로 진술된 경우에, 그러한 CDR은 전술된 계획들 중 임의의 것에 의해 규정된 바와 같이, 가변 영역 내의 상응하는 CDR (예컨대 CDR-H3)의 서열을 가지는 것으로 이해된다. 일부 구체예에서, 명시된 CDR 서열이 명시된다.
마찬가지로, 다르게 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 그것의 영역, 예컨대 그것의 가변 영역의 FR 또는 개별적인 명시된 FR(들) (예컨대 FR-H1, FR-H2)는 임의의 공지된 계획에 의해 규정된 (또는 특이적) 프레임워크 영역을 다 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 경우에, 특별한 CDR, FR, 또는 FR들 또는 CDR들의 확인을 위한 계획이 명시되는데, 예컨대 CDR은 Kabat, Chothia 또는 Contact 방법에 의해 규정된다. 다른 경우에, CDR 또는 FR의 특별한 아미노산 서열이 제시된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 포함된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 나타낸다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 CDR을 포함한다 (예컨대 Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 나아가, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보하는 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 각각 스크린하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다. 예컨대 Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 참조.
제공된 항체들 중에는 항체 단편이 있다. "항체 단편"은 무상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무상 항체의 일부를 포함하는 무상 항체 이외의 분자를 나타낸다. 항체 단편의 예시는, 한정하는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예컨대 scFv 또는 sFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 항체는 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는 단일-사슬 항체 단편, 예컨대 scFv이다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구체예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다.
항체 단편은 한정하는 것은 아니지만 재조합 숙주 세포에 의한 생성뿐 아니라 무상 항체의 단백질 가수분해성 소화를 포함하여, 다양한 기법에 의해 만들어질 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 재조합에 의해 제조된 단편, 예컨대 자연적으로 발생하지 않는 배열을 포함하는 단편, 예컨대 합성 링커, 예컨대 펩타이드 링커에 의해 연결된 둘 이상의 항체 영역 또는 사슬을 가지는 것들, 및/또는 자연적으로 발생하는 무상 항체의 효소적 소화에 의해 생성되지 않는 것들이다. 일부 측면으로, 항체 단편은 scFv이다.
"인간화된" 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비-인간 CDR로부터 유래되고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래되는 항체이다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 전형적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화가 진행된 한편 모 (parental) 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 보유한 비-인간 항체의 변종을 나타낸다. 일부 구체예에서, 인간화된 항체의 일부 FR 잔기는 예컨대 항체 특이성 또는 친화성을 복원 또는 개선하기 위하여 비-인간 항체 (예컨대CDR 잔기들이 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
제공된 항체들 중에는 인간 항체가 있다. "인간 항체"는 인간 또는 인간 세포, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열, 이를테면 인간 항체 라이브러리를 활용하는 비-인간 공급원에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가지는 항체이다. 용어는 비-인간 항원-결합 영역을 포함하는 비-인간 항체의 인간화된 형태, 예컨대 모든 또는 실질적으로 모든 CDR이 비-인간인 것들을 배제한다.
인간 항체는 항원성 도전에 대한 반응으로 인간 가변 영역을 가지는 무상 인간 항체 또는 무상 항체를 생성하도록 변형된 형질전환 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 그러한 동물들은 전형적으로 모든 또는 일부의 인간 면역글로불린 유전자좌를 함유하고, 그것은 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나, 또는 염색체 외적으로 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합된다. 그러한 형질전환 동물에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 비활성화되었다. 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 및 세포-유리(free) 라이브러리를 포함하여, 인간 레퍼토리로부터 유래된 항체-암호화 서열을 함유하는, 인간 항체 라이브러리로부터 유래될 수 있다.
제공된 항체 중에는 단클론성 항체 단편을 포함하여, 단클론성 항체가 있다. 본원에서 사용되는 용어 "단클론성 항체"는 자연적으로 발생하는 돌연변이를 함유하거나 또는 단클론성 항체 제제의 제조 중에 발생하는 가능한 변종 (그러한 변종은 일반적으로 미량으로 존재한다)을 제외하고, 실질적으로 동종성 항체 집단, 즉 그 집단을 구성하는 개별적인 항체들이 동일한 집단으로부터 또는 집단 내에서 얻어진 항체를 나타낸다. 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 지시된 상이한 항체들을 포함하는 다클론성 항체 제제와 대조적으로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해 지시된다. 용어는 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로서 해석되지 않는다. 단클론성 항체는 한정하는 것은 아니지만, 하이브리도마로부터의 생성, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 및 다른 항체 디스플레이 방법을 포함하여, 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"와 "단백질"은 아미노산 잔기들의 폴리머를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용되며, 최소 길이에 제한되지 않는다. 제공된 항체 및 항체 사슬 및 다른 펩타이드, 예컨대 링커 및 결합 펩타이드를 포함하여 폴리펩타이드는 천연 및/또는 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 용어는 또한 폴리펩타이드의 발현-후 변형, 예를 들면 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 일부 측면으로, 폴리펩타이드는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 천연 또는 자연 서열과 관련하여 변형을 함유할 수 있다. 이런 변형들은 부위-특정 돌연변이생성을 통해서와 같이 의도적이거나, 또는 예컨대 단백질 또는 PCR 증폭으로 인해 오류를 생성하는 숙주들의 돌연변이를 통해 우연일 수 있다.
참조 폴리펩타이드 서열과 관련하여 퍼센트 (%) 서열 동일성은, 필요하다면, 최대 퍼센트 서열 동일성을 이루기 위해 서열을 배열하고 갭을 도입한 후에, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존성 치환을 고려하지 않은, 참조 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기들의 백분율이다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 측정할 목적의 배열은 알려져 있는, 예를 들면 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 대중적으로 활용할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 다양한 방법으로 이루어질 수 있다. 서열들을 배열하기에 적절한 변수들은, 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 배열을 이루기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 측정될 수 있다. 그러나, 본원의 목적에 대해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었고, 공급원 코드는 미국 저작권청 (Washington D.C., 20559)에 사용자 문서로 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, Calif.)로부터 대중적으로 입수하거나, 또는 공급원 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 사용을 위해 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 작동 시스템상에 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 변수들은 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 달라지지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 그것과의, 또는 그것에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (다르게는 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 그것과의, 또는 그것에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지는 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 다음과 같이 계산된다: 100 x 분수 X/Y, 여기서 X는 A와 B의 프로그램상의 배열에서 서열 배열 프로그램, ALIGN-2에 의한 동일한 매치로서 점수가 매겨진 아미노산 잔기들의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이는 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않고, A의 B에 대한 % 아미노산 서열 동일성은 B의 A에 대한 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것임이 인지될 것이다. 구체적으로 다르게 진술되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 직전의 문단에서 기술된 것과 같이 얻어진다.
조성물 및 방법
일부 구체예에서 발명은 항-HIV　항체를 제공한다 (한정하는 것은 아니지만 항체 및 컨쥬게이트의 항원-결합 단편, 및/또는 항체의 융합 단백질, 예컨대 단편, 예컨대 키메라 단백질, 또는 하나 이상의 항체를 함유하는 키메라 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함한다). 그러한 항체, 융합 단백질 및/또는 컨쥬게이트는 일부 구체예에서 HIV의 치료, 진단 및/또는 예후에 사용될 수 있다. 제공된 항체 (및 그것의 융합 단백질 및 컨쥬게이트) 중에는 HIV를 중화시킬 수 있는 항체가 있다. 항체는 광범위 중화 항체일 수 있다. 일부 구체예에서, 발명의 항체는 HIV-1 또는 HIV-2를 중화시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 발명의 항체는 HIV-1 그룹 M, HIV-1 그룹 N, HIV-1 그룹 O 및/또는 HIV-1 그룹 P를 중화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 발명의 항체는 HIV-1 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, 또는 그것들의 임의의 조합, 아형 또는 재조합 유도체 (순환 재조합 형태 (CRF)를 포함함)를 중화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, HIV의 당단백질에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 구체예에서, HIV에 결합하는 증강된 이펙터 기능을 가진 항체가 제공된다. 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 키메라 수용체를 포함하여, 제공된 융합 단백질 및 컨쥬게이트 중에서, 임의의 하나 이상의 제공된 항체를 단독으로 또는 조합하여 포함하는 단백질 및 컨쥬게이트가 있다.
예시 항-HIV 항체
한 측면으로, 발명은 HIV에 결합하는 항체, 예컨대 분리된 항체를 제공한다. HIV는 HIV-1일 수 있다. HIV는 HIV-2일 수 있다. HIV는 HIV-1 그룹 M일 수 있다. HIV는 HIV-1 그룹 N, HIV-1 그룹 O 및/또는 HIV-1 그룹 P일 수 있다. HIV는 HIV-1 클레이드 A (A1 및/또는 A2를 포함함), B, C, D, E, F (F1 및/또는 F2를 포함함), G, H, I, J, K, 또는 그것들의 임의의 조합, 아형 또는 재조합 유도체 (순환 재조합 형태 (CRF)를 포함함)일 수 있다. 일부 구체예에서, 재조합 HIV-1 클레이드 (일부 구체예에서는 순환 재조합 형태 (CRF)로도 언급된)는 그것들이 유래되는 두 글레이드의 조합에 의해 표시된다. 일부 구체예에서, 예시 CRF는 AB, AC, AG, DF, BC, 등을 포함한다. 특히, 제공된 항-HIV　항체는 HIV의 엔벨로프 당단백질에 결합한다. 분리된 항체는 그것의 자연적 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 구체예에서, 항체는 예를 들면 전기영동적으로 (예컨대 SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피에 의해 (예컨대 이온 교환 또는역상 HPLC) 측정되는 바 95% 또는 99% 순도 이상으로 정제된다. (예컨대 Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) 참조).
특히, 제공된 항-HIV　항체는 인간 HIV의 복합체형 N-글리칸 에피토프에 결합한다. 특히, 제공된 항-HIV　항체는 인간 HIV의 gp120에 결합한다. 발명의 항-HIV　항체는 타입 N-글리칸을 포함하는 인간 HIV의 gp120 도메인상에 존재하는 에피토프에 결합한다.
일부 구체예에서, 발명은 HIV를 중화시킬 수 있는 분리된 항체를 제공한다. 중화 항체는 바이러스의 감염성을 억제하는 항체일 수 있다. 다른 구체예에서, 발명은 HIV를 광범위하게 중화시킬 수 있는 분리된 항체를 제공한다. 광범위한 중화 항체는 바이러스의 둘 이상의 스트레인 또는 아형의 감염성을 억제하는 항체일 수 있다. HIV는 HIV-1일 수 있다. HIV는 HIV-2일 수 있다. HIV는 HIV-1 그룹 M일 수 있다. HIV는 HIV-1 그룹 N, HIV-1 그룹 O 및/또는 HIV-1 그룹 P일 수 있다. HIV는 HIV-1 클레이드 A (A1 및/또는 A2를 포함함), B, C, D, E, F (F1 및/또는 F2를 포함함), G, H, I, J, K, 또는 그것들의 임의의 조합, 아형 또는 재조합 유도체 (순환 재조합 형태 (CRF)를 포함함)일 수 있다.
일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 HIV를 발현하는 세포의 용해를 유도한다. 용해는 임의의 메커니즘에 의해, 예컨대 이펙터 기능, 예컨대 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예컨대 B 세포 수용체)의 하향조절; B 세포 활성화 또는 세포 자멸의 직접적인 유도를 매개함으로써 유도될 수 있다.
일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 엔지니어링되지 않은 모 항-HIV 항체와 비교하여 이펙터 기능에서 적어도 한 가지가 증가되도록 엔지니어링된다. 이펙터 기능들은 항체 아이소타입이 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성들이다. 항체 이펙터 기능들의 예시는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예컨대 B 세포 수용체)의 하향조절; 및 B 세포 활성화. 예를 들어, 항-HIV　항체는 글리코엔지니어링되지 않은 모 항-HIV 항체와 비교하여 이펙터 기능에서 적어도 한 가지가 증가되도록 글리코엔지니어링될 수 있다. 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)은 세포 표면상의 바이러스 단백질을 가지는 항체의 IgG Fab 부분과 이펙터 세포 상의 Fc 수용체 (FcγR)에 대한 Fc 부분의 결합 사이의 복합체 형성의 결과이다. 이펙터 기능의 증가는 Fc 수용체에 대한 증가된 결합 친화성, 증가된 ADCC; 증가된 식세포작용; 증가된 세포 매개 면역력; 세포독성 CD8 T 세포에 대한 증가된 결합; NK 세포에 대한 증가된 결합; 대식세포에 대한 증가된 결합; 다형핵 세포에 대한 증가된 결합; 단핵세포에 대한 증가된 결합; 대식세포에 대한 증가된 결합; 큰 과립형 림프구에 대한 증가된 결합; 과립구에 대한 증가된 결합; 세포자멸을 유도하는 직접 신호전달; 증가된 수지상 세포 성숙; 또는 증가된 T 세포 프라이밍일 수 있다. 글리코엔지니어링된 항-HIV　항체는 HIV의 동일한 에피토프에 지시된 글리코엔지니어링되지 않은 항체에 비교하여 HIV를 발현하는 암으로 고생하는 대상체에서 생존 유익을 제공한다.
AbV 1-9
한 측면으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 및 16의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 항-HIV 항체는 HIV-1에 대한 결합 능력을 보유할 수 있다. 항-HIV 항체는 HIV-2에 대한 결합 능력을 보유할 수 있다. 항-HIV 항체는 HIV-1 그룹 M에 대한 결합 능력을 보유할 수 있다. 항-HIV 항체는 HIV-1 그룹 N, HIV-1 그룹 O 및/또는 HIV-1 그룹 P에 대한 결합 능력을 보유할 수 있다. 항-HIV 항체는 HIV-1 클레이드 A (A1 및/또는 A2를 포함함), B, C, D, E, F (F1 및/또는 F2를 포함함), G, H, I, J, K, 또는 그것들의 임의의 조합, 아형 또는 재조합 유도체 (순환 재조합 형태 (CRF)를 포함함)에 대한 결합 능력을 보유할 수 있다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 및 16의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 및 16의 아미노산 서열의 VH 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VH는 (a) SEQ ID NO:17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59 및 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) SEQ ID NO:18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60 및 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) SEQ ID NO:19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61 및 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14의 아미노산 서열 중 임의의 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14의 VL 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VL은 (a) SEQ ID NO:20, 26, 32, 38, 44, 50 및 56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) SEQ ID NO:21, 27, 33, 39, 45, 51 및 57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (c) SEQ ID NO:22, 28, 34, 40, 46, 52 및 58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항-HIV　항체가 제공되는데, 여기서 항체는 상기 제공된 구체예들 중 임의의 것에서와 같은 VH 및 상기 제공된 구체예들 중 임의의 것에서와 같은 VL을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 및 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14의 VL 서열을, 그 서열들의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다.
한 측면으로, 항체가 표 1의 임의의 VH로부터 선택된 VH를 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 한 측면으로, 항체가 표 2의 임의의 VL로부터 선택된 VL을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 한 측면으로, 항체가 표 1의 임의의 VH로부터 선택된 VH 및 표 2의 임의의 VL로부터 선택된 VL을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 한 측면으로, 항체가 표 1의 임의의 VH로부터 선택된 VH 및 표 2의 임의의 VL로부터 선택된 VL을 포함하는 항-HIV　항체가 제공되며, 여기서 선택된 VH 및 VL은 표 3에 따라 쌍을 이룬다.
AbV-1
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 VL로부터 선택된 적어도 하나 또는 두 가변 영역을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VH CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VH CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VL CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VL CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 CDR: (a) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 VH 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열의 VH 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VH는 (a) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:2의 VL 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VL은 (a) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VL을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO:2의 VL 서열을, 그 서열들의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다.
AbV-2
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 (b) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 VL로부터 선택된 적어도 하나 또는 두 가변 영역을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VH CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VH CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VL CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VL CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 CDR: (a) SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 VH 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 VH 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VH는 (a) SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:4의 VL 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VL은 (a) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VL을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO:4의 VL 서열을, 그 서열들의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다.
AbV-3
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 (b) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 VL로부터 선택된 적어도 하나 또는 두 가변 영역을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VH CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VH CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VL CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VL CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 CDR: (a) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:33 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 VH 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열의 VH 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VH는 (a) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:6의 VL 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VL은 (a) SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VL을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO:6의 VL 서열을, 그 서열들의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다.
AbV-4
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 (b) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL로부터 선택된 적어도 하나 또는 두 가변 영역을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VH CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VH CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VL CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VL CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 CDR: (a) SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 VH 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열의 VH 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VH는 (a) SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:8의 VL 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VL은 (a) SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VL을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO:8의 VL 서열을, 그 서열들의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다.
AbV-5
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 (b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL로부터 선택된 적어도 하나 또는 두 가변 영역을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 전부 세 개의 VH CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 전부 세 개의 VL CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 CDR: (a) SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 VH 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열의 VH 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VH는 (a) SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) SEQ ID NO:43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:10의 VL 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VL은 (a) SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) SEQ ID NO:45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VL을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO:10의 VL 서열을, 그 서열들의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다.
AbV-6
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 (b) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 VL로부터 선택된 적어도 하나 또는 두 가변 영역을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 전부 세 개의 VH CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 전부 세 개의 VL CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 CDR: (a) SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 VH 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열의 VH 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VH는 (a) SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) SEQ ID NO:49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:12의 VL 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VL은 (a) SEQ ID NO:50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VL을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO:12의 VL 서열을, 그 서열들의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다.
AbV-7
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 (b) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 VL로부터 선택된 적어도 하나 또는 두 가변 영역을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VH CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VH CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VL CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 전부 3개의 VL CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 CDR: (a) SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 VH 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열의 VH 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VH는 (a) SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:14의 VL 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VL은 (a) SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VL을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO:14의 VL 서열을, 그 서열들의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다.
AbV-8
한 측면으로, 발명은 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VH를 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VH; 및 쌍을 이룬 VL 영역을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 전부 세 개의 VH CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 전부 세 개의 VH CDR 서열; 및 (b) 쌍을 이룬 VL 영역을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 전부 세 개의 VH CDR 서열; 및 쌍을 이룬 VL 영역으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 전부 세 개의 VL CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 CDR: (a) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및 쌍을 이룬 VL 영역으로부터 선택된 전부 세 개의 VL CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 VH 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열의 VH 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VH는 (a) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VL을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 쌍을 이룬 VL 서열을, 그 서열들의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다.
AbV-9
한 측면으로, 발명은 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VH를 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 (b) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 VL로부터 선택된 가변 영역을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다. 한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 (b) SEQ ID NO:65의 아미노산 서열을 포함하는 VL로부터 선택된 가변 영역을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 전부 세 개의 VH CDR 서열을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 전부 세 개의 VH CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 전부 세 개의 VH CDR 서열; 및 (d) SEQ ID NO:65의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 CDR: (a) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 (a) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
한 측면으로, 발명은 CDR: (a) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) SEQ ID NO:66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) SEQ ID NO:67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) SEQ ID NO:68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항-HIV　항체를 제공한다.
AbV-9a
한 측면으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 VH 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열의 VH 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VH는 (a) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:4의 VL 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VL은 (a) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VL을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO:4의 VL 서열을, 그 서열들의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다.
AbV-9b
한 측면으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 VH 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열의 VH 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VH는 (a) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 SEQ ID NO:65의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HIV　항체는 HIV에 대한 결합 능력을 보유한다. 일부 구체예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:65의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 CDR 외의 영역에서 (예컨대 FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-HIV　항체는 SEQ ID NO:65의 VL 서열을, 그 서열의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다. 특정 구체예에서, VL은 (a) SEQ ID NO:66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) SEQ ID NO:67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
한 측면으로, 항체가 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 구체예에서와 같은 VL을 포함하는 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO:68의 VL 서열을, 그 서열들의 번역-후 변형을 포함하여, 포함한다.
일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 인간 단클론성 항체 AbV-1이다. 이 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:1 및 2에 나타낸다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 인간 단클론성 항체 AbV-2이다. 이 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:3 및 4에 나타낸다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 인간 단클론성 항체 AbV-3이다. 이 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:5 및 6에 나타낸다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 인간 단클론성 항체 AbV-4이다. 이 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:7 및 8에 나타낸다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 인간 단클론성 항체 AbV-5이다. 이 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:9 및 10에 나타낸다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 인간 단클론성 항체 AbV-6이다. 이 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:11 및 12에 나타낸다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 인간 단클론성 항체 AbV-7이다. 이 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:13 및 14에 나타낸다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 인간 단클론성 항체 AbV-8이다. 이 항체의 중쇄에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO:15에 나타낸다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 인간 단클론성 항체 AbV-9a이다. 이 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:16 및 4에 나타낸다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 인간 단클론성 항체 AbV-9b이다. 이 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:16 및 65에 나타낸다.
일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 상기 언급된 인간 항체 중 임의의 것으로부터 유래된 키메라 항체이다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 인간화된 항체이다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 인간 항체이다.
추가의 측면으로, 상기 구체예들 중 임의의 것에 따르는 항-HIV　항체는 하기 기술되는 바와 같이, 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
항체 특성
돌연변이 빈도
발명의 항체는 생식선 서열로부터 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%, 또는 그 이상의 돌연변이 빈도를 가지는 중쇄 서열을 포함할 수 있다. 발명의 항체는 생식선 서열로부터 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%, 또는 그 이상의 돌연변이 빈도를 가지는 경쇄 서열인 CDR3 영역을 포함할 수 있다. 발명의 항체는 생식선 서열로부터 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%, 또는 그 이상의 돌연변이 빈도를 가지는 중쇄 및 경쇄 서열을 포함할 수 있다. 발명의 항체는 VH 패밀리 4 내지 59 중 임의의 하나로 구성되는 군으로부터 선택된 VH 패밀리로부터의 VH 영역을 포함할 수 있다.
중쇄 및 경쇄 길이
발명의 항체는 길이가 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산의 길이인 CDR3 영역을 포함할 수 있다. 발명의 항체는 길이가 적어도 약 18개의 아미노산인 CDR3 영역을 포함할 수 있다.
발명의 항체는 경쇄의 한 단부에 결실을 포함할 수 있다. 발명의 항체는 경쇄의 한 단부에 3개 이상의 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 발명의 항체는 경쇄의 한 단부에 7개 이하의 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 발명의 항체는 경쇄의 한 단부에 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산의 결실을 포함할 수 있다.
발명의 항체는 경쇄에 삽입을 포함할 수 있다. 발명의 항체는 경쇄에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 또는 그 이상의 아미노산의 삽입을 포함할 수 있다. 발명의 항체는 경쇄에 3개의 아미노산의 삽입을 포함할 수 있다.
친화성
친화성은 분자 (예컨대 항체)의 단일 결합 부위와 그것의 결합 파트너 (예컨대 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도(strength)이다. 다르게 표시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원들 (예컨대 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화성을 나타낸다. 분자 X의 그것의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (kd)에 의해 표시될 수 있다. 친화성은 통상적으로 사용되는 및/또는 본원에 기술된 것들을 포함하여, 많은 공지의 방법 중 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 구체적인 예시하는 및 예시의 구체예들이 다음에 기술된다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 항체는 항체 표적에 대해 약 1 μM, 100 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, 0.05 nM, 0.01 nM 또는 0.001 nM 이하 (예컨대 10-8M 이하, 예컨대 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대 10-9 M 내지 10-13　M)의 해리 상수 (KD)를 가진다. 항체 표적은 HIV 표적일 수 있다. 항체 표적은 HIV-1 표적일 수 있다. 항체 표적은 HIV-2 표적일 수 있다. 항체 표적은 HIV-1 그룹 M 표적일 수 있다. 항체 표적은 HIV-1 그룹 N 표적, HIV-1 그룹 O 표적 및/또는 HIV-1 그룹 P 표적일 수 있다. 항체 표적은 HIV-1 클레이드 A (A1 및/또는 A2를 포함함), B, C, D, E, F (F1 및/또는 F2를 포함함), G, H, I, J, K, 또는 그것들의 임의의 조합, 아형 또는 재조합 유도체 (순환 재조합 형태 (CRF)를 포함함)일 수 있다. 발명의 또 다른 측면은 그것의 HIV 표적에 대한 증가된 친화성을 가지는 항-HIV　항체, 예를 들면 친화성 성숙된 항-HIV　항체를 제공한다. 친화성 성숙된 항체는 항원에 대한 항체의 친화성의 개선을 초래하는 그런 변경을 갖지 않은 모 항체와 비교하여, 하나 이상의 변경을 하나 이상의 초가변성 영역 (HVR)에 가지는 항체이다. 이런 항체들은 약 5Х10-9 M, 2Х10-9 M, 1Х10-9 M, 5Х10-10 M, 2Х10-9 M, 1Х10-10　M, 5Х10-11 M, 1Х10-11 M, 5Х10-12　M, 1Х10-12　M 또는 그 미만의 KD로 HIV에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 발명은 SEQ ID NO:69의 중쇄 서열, SEQ ID NO:70의 경쇄 서열, 또는 둘 다를 함유하는 생식선 항-HIV　항체와 비교하여 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배 또는 그 이상의 증가된 친화성을 가지는 항-HIV　항체를 제공한다. 다른 구체예에서, 본원에 기술된 항-HIV 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 항-HIV 항체와 동일한 에피토프에 결합하는, 및/또는 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체는 이펙터 기능 활성, 예컨대, ADCC 활성을 포함하여 Fc-매개된 세포의 세포독성을 나타낸다.
KD는 임의의 적합한 분석에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, KD는 방사성 표지된 항원 결합 분석 (RIA)에 의해 측정될 수 있다 (예컨대 Chen et al.,　J. Mol. Biol.　293:865-881 (1999); Presta et al.,　Cancer Res.　57:4593-4599 (1997) 참조). 예를 들어 KD는 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 (예컨대 BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000을 사용하여) 측정될 수 있다.
항체 단편
항체 단편은 무상 항체의 일부, 예컨대 무상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 발명의 추가의 측면으로, 상기 구체예들 중 임의의 구체예를 따르는 항-HIV　항체는 키메라, 인간화된 또는 인간 항체를 포함하여, 단클론성 항체이다. 항체 단편은, 한정하는 것은 아니지만, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 디아바디, 선형 항체, 항체 단편 항체 및 scFv 단편으로부터 형성된 다중특이적, 및 하기 기술되는 다른 단편을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 전체 길이 항체, 예컨대 무상 IgG1 항체 또는 본원에 기술된 다른 항체 부류 또는 아이소타입이다 (예컨대 Hudson et al.　Nat. Med.　9:129-134 (2003); Pluckthiin,　The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, pp. 269-315 (1994); Hollinger et al.,　Proc. Natl. Acad. Sci. USA　90: 6444-6448 (1993); WO93/01161; 및 미국 특허 제 5,571,894호, 5,869,046호, 6,248,516호 및 5,587,458호 참조). 전체 길이 항체, 무상 항체 또는 전(whole) 항체는 천연 항체 구조에 실질적으로 유사한 구조를 가지는 또는 본원에서 규정된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 가지는 항체이다. 항체 단편은, 한정하는 것은 아니지만 본원에 기술되는 것과 같이, 재조합 숙주 세포 (예컨대 대장균 또는 파지)에 의한 생성뿐 아니라 무상 항체의 단백질 가수분해성 소화를 포함한 다양한 기법에 의하여 제조될 수 있다.
Fv는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유한 최소 항체 단편이다. 이 단편은 밀착된, 비-공유 회합되어 있는 한 중쇄 및 한 경쇄 가변 영역 도메인의 다이머를 함유한다. 이 두 도메인으로부터 항원 결합에 대한 아미노산 잔기를 기증하고 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변성 루프 (H 및 L 사슬로부터 각각 3개씩의 루프)가 나온다. 그러나, 단지 단일 가변 영역 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR을 포함하는 Fc의 절반)이어도 전체 결합 부위보다는 낮은 친화성으로지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다.
단일 사슬 Fv (sFv 또는 scFv)는 단일 폴리펩타이드 사슬 안으로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. sFv 폴리펩타이드는 추가로 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 포함할 수 있다. (예컨대 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antivodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, 상기 동일 참조). 일부 구체예에서, sFv는 키메라 항원 수용체 (CAR)에 존재할 수 있다.
디아바디는 V 도메인들의 사슬-간 쌍형성이 아닌 사슬-내 쌍형성이 이루어져서 이가 단편을 유발하도록 VH 및 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5 내지 10개의 잔기)를 가지는 sFv 단편을 구성함으로써 제조된 작은 항체 단편이다. 이중특이적 디아바디는 두 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩타이드사슬에 존재하는 두 크로스오버 sFv 단편들의 헤테로다이머이다 (예컨대 EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 참조).
전체 인간 형태로 제조될 수 있는 도메인 항체 (dAb)는 항체의 가장 작은 공지의 항원-결합 단편으로, 약 11 kDa 내지 약 15 kDa의 범위이다. DAb는 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 왕성한 가변 영역들이다 (각각 VH 및 VL ). 그것들은 미생물 세포 배양에서 고도로 발현되고, 예를 들면 한정하는 것은 아니지만, 용해도 및 온도 안정성을 포함하여 유리한 생물물리적 특성을 나타내며, 예를 들어 파지 디스플레이와 같은 시험관내 선택 시스템에 의한 선택 및 친화성 성숙에 잘 맞는다. DAb는 모노머로서 생리활성을 보이고, 그것들의 작은 크기 및 고유한 안정성으로 인해, 연장된 혈청 반감기 또는 다른 약물학적 활성을 가지는 약물을 생성하기 위해 더 큰 분자로 포맷팅될 수 있다 (예컨대 W09425591 및 US20030130496 참조).
Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 무상 조합 부위들을 가지는 종이다. 그러므로, 그것들은 생체내 사용 중에 감소된 비특이적 결합에 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단 중 어느 하나에서 이펙터 단백질의 융합을 이루기 위해 구성될 수 있다. 항체 단편은 또한 "선형" 항체일 수 있다 (예컨대 미국 특허 제 5,641,870호 참조). 그러한 선형 항체 단편은 단일특이적이거나 이중특이적일 수 있다.
키메라 항원 수용체 (CAR)
CAR을 포함하여, 예시 항원 수용체, 및 그러한 수용체를 엔지니어링하고 세포로 도입하는 방법은 예를 들면 국제 특허 출원 공개 번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 번호: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, , 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353 및 8,479,118, 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416에 기술된 것들 및/또는 Sadelain 등에 의해 것들 (Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75)을 포함한다. 일부 측면으로, 항원 수용체는 미국 특허 번호 제 7,446,190호에 기술된 CAR 및 국제 특허 출원 공개 번호: WO/2014055668 A1에 기술된 것들을 포함한다. CAR의 예는 상기 언습된 공보들, 예컨대 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 번호: 7,446,190, 미국 특허 번호: 8,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177) 중 임의의 것에 개시된 CAR을 포함한다. 또한 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 번호: 7,446,190 및 미국 특허 번호: 8,389,282 참조. 키메라 수용체, 예컨대 CAR은 일반적으로 세포외 항원 결합 도메인, 예컨대 항체 분자의 일부, 일반적으로 항체의 가변 중쇄 (VH) 영역 및/또는 가변 경쇄 (VL) 영역, 예컨대 scFv 항체 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체 (CAR)는 T 세포 수용체의 세포내 도메인을 포함하는 세포내 도메인, 및 항체의 항원 결합 부분을 포함하는 세포외 부분, 예컨대 항체의 sFv를 포함할 수 있다. 일반적으로, 키메라 수용체 (예컨대 CAR)는 항원 결합 도메인과 경막 도메인 사이의 링커 또는 스페이서 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커 또는 스페이서는 면역글로불린 힌지 영역으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, CAR 구성물, 일부 구체예에서 T 세포 수용체의 세포내 도메인을 포함하는 세포내 도메인 및 항체의 항원 결합 부분, 예컨대 항체의 sFv를 포함하는 세포외 부분을 암호화하는 것에 더불어, CAR 벡터를 암호화하는 핵산은 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서를 가진 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터일 수 있다. 다른 구체예에서, 프로모터는 EF1a 프로모터 또는 EF1 프로모터일 수 있다. 일부 구체예에서, CAR은 T 세포 수용체의 공동-자극 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 세포내 도메인 및 항체, 예컨대 단일-사슬 항체 또는 그것의 단편일 수 있는, 본원에 제공된 하나 이상의 항체를 포함하는 세포외 부분을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 sFv 또는 scFv이거나 그것을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 추가로 추가적인 세포외 부분(들), 예컨대 스페이서 및/또는 힌지 영역을 포함할 수 있다.
상기 구체예들 중 임의의 구체예에서, 키메라 분자, 예컨대 키메라 수용체, 예컨대 CAR 내의 항체, 예컨대 sFv는 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, sFv는 AbV-1, AbV-2, AbV-3, AbV-4, AbV-5, AbV-6, AbV-7, AbV-8, AbV-9, AbV-9a 또는 Abv-9b 중 어느 것으로부터의 VL 도메인과 조합된 AbV-1, AbV-2, AbV-3, AbV-4, AbV-5, AbV-6, AbV-7, AbV-8, AbV-9, AbV-9a 또는 AbV-9b 중 어느 것으로부터의 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, sFv는 많은 링커 중 하나에 의해 분리된 중쇄 및 경쇄에 대한 코돈-최적화 서열들의 합성에 의해 생성될 수 있다.
일부 측면으로, 글리신과 세린 (및/또는 트레오닌)에 풍부한 링커는 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 그런 아미노산(들)을 포함한다. 일부 구체예에서, 그것들은 적어도 또는 약 50%, 55%, 60%, 70% 또는 75%의 글리신, 세린 및/또는 트레오닌을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 실질적으로 또는 전체적으로 글리신, 세린 및/또는 트레오닌으로 구성된다. 링커는 일반적으로 길이가 약 5개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 전형적으로 약 10개 또는 10개의 아미노산 내지 약 30개 또는 30개의 아미노산, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산이고, 일부 구체예에서는 길이가 10개의 아미노산 내지 25개의 아미노산이다. 예시 링커는 다양한 수의 서열 GGGGS (4GS) 또는 GGGS (3GS)의 반복부, 예컨대 그런 서열의 2, 3, 4 내지 5개의 반복부를 가지는 링커를 포함한다. 예시 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS를 가지는 또는 그것으로 구성되는 것들을 포함한다. 예시 링커는 추가로 서열 GSTSGSGKPGSGEGSTKG를 가지는 또는 그것으로 구성되는 것들을 포함한다.
일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD28, CD137 (4-1 BB), OX40 및/또는 ICOS와 같은 공동자극 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절하는 일차 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 자극적인 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려져 있는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 일차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예시는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD8, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR의 세포질 신호전달 분자(들)은 세포질 신호전달 도메인, 그것의 일부 또는 CD3ζ로부터 유래된 서열을 함유한다.
예시의 CAR 벡터 (CAR을 암호화하는 핵산을 포함함)는 T 세포에 트랜스펙션될 수 있다. T 세포는 CD8+ T 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 트랜스펙션되고 CAR을 발현한 CD8+ T 세포는 증식, 사멸 및/또는 바이러스 복제의 억제를 위해 감염된 세포를 인식할 수 있다. 다른 구체예에서, CAR로 트랜스펙션된 T 세포는 CD4+ T 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, CAR 변형된 CD4+ T 세포는 더 이상 CD4를 발현하지 않도록 추가로 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, CAR로 트랜스펙션된 T 세포는 HIV 감염에 포함된 공동수용체, 예컨대 CCR2b, CCR3, CXCR4 및/또는 CCR5를 결핍시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 HIV 감염에 포함된 하나 이상의 공동수용체, 예컨대 CCR2b, CCR3, CXCR4 및/또는 CCR5의 발현을 감소 또는 녹다운시키기 위하여 siRNA와 같은 시약으로 트랜스펙션될 수 있다. 일부 구체예에서, HIV 감염에 포함된 하나 이상의 이런 공동수용체들의 발현은 표적화된 게놈 편집 도구, 예컨대 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), CRISPR/Cas 시스템, RNA 안내되는 엔도 뉴클레아제 및/또는 엔지니어링된 메가뉴클레아제 재-엔지니어링된 호우밍(homing) 엔도뉴클레아제에 의해 감소 또는 녹다운될 수 있다.
키메라 및 인간화된 항체
일부 구체예에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다 (예컨대 미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al.,　Proc. Natl. Acad. Sci. USA,　81:6851-6855 (1984) 참조). 키메라 항체는 일반적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 한편, 그 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 나타낸다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 아류가 모 항체의 부류 또는 아류로부터 변화되어 있는 "부류간 스위치 항체"이다. 키메라 항체는 그것들의 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 인간화된 항체이다 (예컨대 Almagro and Fransson,　Front. Biosci.13:1619-1633 (2008); Riechmann et al.,　Nature　332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA　86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri et al.,　Methods　36:25-34 (2005); Padlan,　Mol. Immunol.28:489-498 (1991); Dall'Acqua et al.,　Methods　36:43-60 (2005); Osbourn et al.,　Methods　36:61-68 (2005); 및 Klimka et al.,　Br. J. Cancer,　83:252-260 (2000) 참조).
비-인간 항체는 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화되는 한편, 모의 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 보유할 수 있다. 인간화된 항체는 비-인간 항체로부터 유래된, 하나 이상의 CDR 또는 그것들의 일부를 포함하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 인간화된 항체는 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 FR 또는 그것들의 일부를 포함하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 인간화된 항체는 인간 불변 영역의 적어도 일부를 선택적으로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화된 항체의 하나 이상의 FR 잔기는 예컨대 항체 특이성 또는 친화성을 복원 또는 개선하기 위하여 비-인간 항체 (예컨대 CDR 잔기들이 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기들로 치환될 수 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역들은 한정하는 것은 아니지만 다음을 포함한다: "최상의 핏(best-fit") 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역; 인간 성숙된 (체세포적으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식선 프레임워크 영역; 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (예컨대 Sims et al.　J. Immunol.　151:2296 (1993); Carter et al.　Proc. Natl. Acad. Sci. USA,　89:4285 (1992); Presta et al.　J. Immunol.,151:2623 (1993); Baca et al.,　J. Biol. Chem.　272:10678-10684 (1997); and Rosok et al.,　J. Biol. Chem.　271:22611-22618 (1996) 참조).
인간 항체
일부 구체예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 다양한 공지 기법들을 사용하여 제조될 수 있다 (예컨대 van Dijk and van de Winkel,　Curr. Opin. Pharmacol.　5: 368-74 (2001); 및 Lonberg,　Curr. Opin. Immunol.　20:450-459 (2008) 참조). 인간 항체는 일부 측면으로 면역원 (예컨대 HIV 면역원)을 항원성 도전에 대한 반응으로 무상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가지는 무상 항체를 생성하도록 변형되어 있는 형질전환 동물에 투여함으로써 제조될 수 있다. (예컨대 Lonberg,　Nat. Biotech.　23:1117-1125 (2005); 미국 특허 번호 6,075,181, 6,150,584, 5,770,429 및 7,041,870; 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 참조). 그러한 동물에 의해 생성된 무상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예컨대 상이한 인간 불변 영역을 조합함으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 일부 측면으로 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 인간 항체는 인간 골수종 및 마우스-인간 이종성골수종 세포주로부터, 인간 B-세포 하이브리도마 기술, 및 다른 방법들 (예컨대 Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al.,　Monoclonai Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (1987); Boerner et al.,　J. Immunol.,　147: 86 (1991); Li et al.,　Proc. Natl. Acad.,　103:3557-3562 (2006); 미국 특허 번호 7,189,826; Ni,　Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006); Vollmers and Brandlein,　Histology and Histopathology,　20(3):927-937 (2005); 및 Vollmers and Brandlein,　Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,　27(3):185-91 (2005)) 참조)을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 또한 인간-유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 분리함으로써 생성될 수 있다. 그러한 가변 도메인 서열은 다음에 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다.
라이브러리-유래
항체는 원하는 활성 또는 활성들을 가지는 항체에 대해 조합된 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리될 수 있다 (예컨대 Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology　178:1-37 (2001); McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al.,Nature　352: 624-628 (1991); Marks et al.,　J. Mol. Biol.　222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology　248:161-175 (2003); Sidhu et al.,　J. Mol. Biol.　338(2): 299-310 (2004); Lee et al.,　J. Mol. Biol.　340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse,　Proc. Natl. Acad. Sci. USA　101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al.,　J. Immunol. Methods　284(1-2): 119-132 (2004) 참조). VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 별도로 클로닝될 수 있고 (예컨대 PCR에 의해) 라이브러리 (예컨대 파지 라이브러리)에서 무작위로 재조합되며, 스크리닝될 수 있다 (예컨대 Winter et al.,　Ann. Rev. Immunol.,　12: 433-455 (1994) 참조). 다르게는, 나이브(naive) 레퍼토리가 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또는 자가-항원에 대한 단일 공급원의 항체를 제공하기 위해 클로닝될 수 있다 (예컨대 인간으로부터) (예컨대 Griffiths et al.,　EMBO J,　12: 725-734 (1993) 참조). 다르게는, 나이브 라이브러리는 줄기세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 무작위 프라이머를 사용하여 또는 V-유전자 분절을 시험관내에서 재배열하기 위해 CDR3 영역을 암호화함으로써 합성에 의해 제조될 수 있다 (예컨대 Hoogenboom and Winter,　J. Mol. Biol.,　227: 381-388 (1992); 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936 및 US 2009/0002360 참조). 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 항체 단편은 본원의 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.
다중특이성
일부 구체예에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예컨대 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 일반적으로 적어도 두 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 가지는 단클론성 항체이다 (에컨대 미국 특허 공개 번호 US 2008/0069820 참조). 일부 구체예에서, 결합 특이성 중 하나는 HIV에 대한 것이고 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 HIV의 두 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 HIV로 감염된 세포에 세포독성제를 국한시키기 위해 사용될 수 이TEK. 이중특이적 항체는 전체 길이 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 예시 기법은 상이한 특이성을 가지는 두 면역글로불린 중쇄-경쇄의 재조합 공동 발현, 항체 Fc-헤테로다이머 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 엔지니어링, 둘 이상의 항체 또는 단편의 교차-결합, 이중-특이적 항체를 제조하기 위한 류신 지퍼의 사용, 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술의 사용, 단일-사슬 Fv (scFv) 다이머의 사용, 삼중특이적 항체의 제조 및 "놉-인-호울" 엔지니어링을 포함한다 (예컨대 Milstein and Cuello,　Nature　305: 537 (1983); WO09/089004A1; WO93/08829; Traunecker et al.,　EMBO J.　10: 3655 (1991); 미국 특허 번호 4,676,980 및 5,731,168; Brennan et al.,　Science,　229: 81 (1985); Kostelny et al.,　J. Immunol.,　148(5):1547-1553 (1992); Hollinger et al.,　Proc. Natl. Acad. Sci. USA,　90:6444-6448 (1993); Gruber et al.,　J. Immunol., 152:5368 (1994)); 및 Tutt et al.　J. Immunol. 147: 60 (1991) 참조). 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 가지는 엔지니어링된 항체 또한 포함된다 (예컨대 US 2006/0025576 참조).
변종
일부 구체예에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변종이 고려된다. 변종은 전형적으로 본원에 구체적으로 개시된 폴리펩타이드와 하나 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입에 있어 상이하다. 그러한 변종들은 자연적으로 발생하거나, 예를 들면 발명의 하나 이상의 상기 폴리펩타이드 서열을 변형시키고 본원에 기술된 것과 같이 및/또는 많은 공지 기법 중 임의의 기법을 사용함으로써 폴리펩타이드의 하나 이상의 생물학적 활성을 평가함으로써 합성에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변종들은 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 변형은, 예를 들면 항체의 아미노산 서열 내의 잔기들로부터의 결실, 및/또는 잔기들의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 구성물에 도달하도록 이루어질 수 있고, 단 최종 구성물은 원하는 특성, 예컨대 항원-결합을 가진다.
치환, 삽입 및 결실 변종
일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 항체 변종들이 제공된다. 치환에 의한 돌연변이생성에 대한 관심의 부위는 CDR 및 FR을 포함한다. 아미노산 치환은 관심의 항체에 도입될 수 있고 생성물들은 원하는 활성, 예컨대 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
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소수성 아미노산은 노르류신, Met, Ala, Val, Leu 및 Ile을 포함한다. 중성 친수성 아미노산은 Cys, Ser, Thr, Asn 및 Gln을 포함한다. 산성 아미노산은 Asp 및 Glu를 포함한다. 염기성 아미노산은 His, Lys 및 Arg을 포함한다. 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기를 가진 아미노산은 Gly 및 Pro을 포함한다. 방향족 아미노산은 Trp, Tyr 및 Phe을 포함한다.
일부 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 하나 이상의 CDR 내에서 일어날 수 있고, 이때 치환, 삽입 또는 결실은 항원에 대한 항체 결합을 실질적으로 감소시키지 않는다. 예를 들어, 실질적으로 결합 친화성을 감소시키지 않는 보존성 치환은 CDR에서 만들어질 수 있다. 그러한 변경은 CDR "핫스팟(hotspot)" 또는 SDR 외부에 있을 수 있다. 변종 VH 및 VL 서열의 일부 구체예에서, 각각의 CDR은 어느 하나가 변경되지 않거나, 또는 하나, 둘 또는 세개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
변경 (예컨대 치환)은 예컨대 항체 친화성을 개선하기 위하여 CDR에서 이루어질 수 있다. 그러한 변경은 체세포성 성숙 중에 높은 돌연변이율로 CDR 암호화 코돈에서 만들어질 수 있고 (예컨대 Chowdhury,　Methods Mol. Biol.　207:179-196 (2008) 참조), 결과적으로 생성되는 변종은 결합 친화성에 대해 시험될 수 있다. 친화성 성숙 (예컨대 오류 발생이 쉬운 PCR, 사슬 셔플링, CDR의 무작위화 또는 올리고뉴클레오타이드-특정 돌연변이생성을 사용함)은 항체 친화성을 개선하기 위해 사용될 수 있다 (예컨대 Hoogenboom et al. in　Methods in Molecular Biology　178:1-37 (2001) 참조). 항원 결합에 관여된 CDR 잔기들은 구체적으로, 예컨대 알라닌 스캐닝 돌연변이생성 또는 모델링을 사용하여 확인될 수 있다 (예컨대 Cunningham and Wells Science,　244:1081-1085 (1989) 참조). 특히 CDR-H3 및 CDR-L3은 자주 표적화된다. 다르게는, 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조로 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 확인할 수 있다. 그러한 접촉 잔기들 및 이웃한 잔기들은 치환에 대한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변종들은 그것들이 원하는 특성을 함유하였는지를 측정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입 및 결실은 한 잔기로부터 수백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드에 이르는 길이의 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합뿐 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기들의 서열내 삽입 및 결실을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 가지는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변종은 효소에 대한 (예컨대 ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합물을 포함한다. 항체 분자의 서열내 삽입 변종의 예는 경쇄에서 3개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 말단 결실의 예는 경쇄의 한 단부에 7개 이하의 아미노산의 결실을 가지는 항체를 포함한다.
글리코실화 변종
일부 구체예에서, 항체는 그것들의 글리코실화를 증가 또는 감소시키기 위하여 변경된다 (예컨대 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써). 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유류 세포로부터의 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-결합에 의해 부착된 분지된, 바이안테나리(biantennary) 올리고당을 포함한다 (예컨대 Wright et al.　TIBTECH　15:26-32 (1997) 참조). 올리고당은 다양한 탄수화물, 예컨대 바이안테나리 올리고당 구조의 줄기에서 GlcNAc에 부착된 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스, 시알산, 푸코오스일 수 있다. 항체에서 올리고당의 변형은 예를 들면 개선된 특정 특성을 가지는 항체 변종들을 생성하기 위해 만들어질 수 있다. 항체 글리코실화 변종은 개선된 ADCC 및/또는 CDC 기능을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, Fc 영역에 부착된 푸코오스가 없는 탄수화물 구조를 가지는 항체 변종들이 제공된다. 예를 들어, 그러한 항체에서 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코오스의 양은 Asn297에 부착된 모든 글리코구조의 합에 비하여, Asn297에서 당 사슬 내의 푸코오스의 평균 양을 계산함으로써 측정된다 (예컨대 WO 08/077546 참조). Asn297은 Fc 영역에서 거의 위치 297에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타낸다 (Fc 영역 잔기들의 Eu 넘버링); 그러나, Asn297은 또한 항체의 소수 서열 변종으로 인해, 위치 297의 상향 또는 하향으로 약 ±3개 아미노산에, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 그러한 푸코실화 변종들은 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다 (예컨대 특허 공개 번호 US 2003/0157108; US 2004/0093621; US 2003/0157108; WO00/61739; WO01/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO03/085119; WO03/084570; WO05/035586; WO05/035778; WO05/053742; WO02/031140; Okazaki et al.　J. Mol. Biol.　336:1239-1249 (2004); 및 Yamane-Ohnuki et al.　Biotech. Bioeng.　87: 614 (2004) 참조). 세포주, 예컨대 녹아웃 세포주 및 그것들의 사용 방법은, 예컨대 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 및 알파-1,6-푸코실트란스페라제 유전자 (FUT8) 녹아웃 CHO 세포에서 탈푸코실화된 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다 (예컨대 Ripka et al.　Arch. Biochem. Biophys.　249:533-545 (1986); Yamane-Ohnuki et al.　Biotech. Bioeng.　87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng.,　94(4):680-688 (2006); WO03/085107; EP 1176195A1, WO04/056312; WO04/057002; WO03/084570; WO03/085119; WO03/05691;4 WO04/024927; 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108; US 2003/0115614, US 2004/093621, US 2004/110282, US 2004/110704 및 US 2004/132140 참조). 다른 항체 글리코실화 변종들 또한 포함된다 (예컨대 미국 특허 번호 6,602,684; 특허 공개 번호 US 2005/0123546; WO03/011878; WO97/30087; WO98/58964; 및 WO99/22764 참조).
따라서, 본 발명의 항-HIV 항체는 하나 이상의 외인성 및/또는 높은 내인성 글리코실트란스페라제 활성을 가지는 숙주 세포에 의해 생성될 수 있다. 글리코실트란스페라제 활성을 가지는 유전자는 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트란스페라제 III (GnTII), α-만노시다제 II (ManII), β(1,4)-갈락토실트란스페라제 (GalT), β(1,2)-N-아세틸글루코사미닐트란스페라제 I (GnTI) 및 β(1,2)-N-아세틸글루코사미닐트란스페라제 II (GnTII)를 포함한다. 글리코실트란스페라제는 골기 국지화 도메인(Golgi localization domain)을 포함하는 융합물을 포함할 수 있다 (예컨대 Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995); Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986); 미국 특허 가출원 번호 60/495,142 및 60/441,307; 특허 공개 번호 US 2003/0175884 및 US 2004/0241817; 및 WO04/065540 참조). 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 파괴된 또는 탈활성화된 글리코실트란스페라제 유전자를 포함하고 있는 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 (a) 글리코실트란스페라제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산; 및 (b) 인간 HIV에 결합하는 본 발명의 항-HIV 항체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 향한 것이다. 특정 구체예에서, 숙주 세포에 의해 생성된 변형된 항-HIV　항체는 IgG 불변 영역 또는 Fc 영역을 포함하는 그것의 단편을 가진다. 또 다른 특정 구체예에서 항-HIV　항체는 인간화된 항체 또는 Fc 영역을 포함하는 그것의 단편이다. 분리된 핵산은 그것의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자이다. 분리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하지만, 핵산 분자는 염색체 외적으로 또는 그것의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
발명의 숙주 세포에 의해 생성된 변경된 글리코실화를 가지는 항-HIV 항체는 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 (예컨대 Fcγ 활성화 수용체, 예컨대 FcγRIIIa 수용체에 대한 증가된 결합) 및/또는 증가된 이펙터 기능을 나타낼 수 있다. 증가된 이펙터 기능은 다음 중 하나 이상의 증가일 수 있다: 증가된 항체-의존성 세포의 세포독성, 증가된 항체-의존성 세포의 식세포작용 (ADCP), 증가된 사이토카인 분비, 항원-제공 세포에 의한 증가된 면역-복합체-매개된 항원 흡수, 증가된 Fc-매개된 세포의 세포독성, NK 세포에 대한 증가된 결합, 대식세포에 대한 증가된 결합, 다형핵 세포 (PMN)에 대한 증가된 결합, 단핵세포에 대한 증가된 결합, 표적-결합된 항체의 증가된 교차결합, 증가된 직접 신호전달 유도 세포자멸, 증가된 수지상 세포 성숙 및 증가된 T 세포 프라이밍. 따라서, 한 측면으로, 본 발명은 글리코엔지니어링되지 않은 항-HIV 항체에 비교하여 증가된 이펙터 기능을 가지는 항-HIV 항체의 글리코형태를 제공한다 (예컨대 Tang et al., J. Immunol. 179:2815-2823 (2007) 참조).
본 발명은 또한 변형된 올리고당을 가지는 본 발명의 항-HIV　항체의 제조 방법에 관련되는데, 방법은 (a) 본 발명에 따르는 항-HIV　항체의 생성을 허용하는 조건하에서 글리코실트란스페라제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 발현하도록 엔지니어링된 숙주 세포를 배양하는 단계, 여기서 글리코실트란스페라제 활성을 가지는 상기 폴리펩타이드는 상기 숙주 세포에 의해 생성된 상기 항-HIV　항체의 Fc 영역의 올리고당을 변형시키기에 충분한 양으로 발현되는 단계; 및 (b) 상기 항-HIV　항체를 분리하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 글리코실트란스페라제 활성을 가지는 두 폴리펩타이드가 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 항-HIV　항체는 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 및/또는 증가된 이펙터 기능을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 항-HIV 항체의 Fc 영역에서 이등분된 N-결합 올리고당의 백분율은 총 올리고당의 적어도 약 10% 내지 약 100%, 구체적으로 적어도 약 50%, 보다 구체적으로 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90 내지 95%이다. 또 다른 구체예에서, 발명의 방법에 의해 생성된 항체는 본 발명의 방법에 의한 올리고당의 변형의 결과로서 Fc 영역에 증가된 비율의 푸코실화되지 않은 올리고당을 가진다. 일부 구체예에서, 푸코실화되지 않은 올리고당의 백분율은 적어도 약 20% 내지 약 100%, 구체적으로 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 내지 약 70%, 보다 구체적으로 적어도 약 75%이다. 푸코실화되지 않은 올리고당은 하이브리드 또는 복합체 유형의 것일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 발명의 방법에 의해 생성된 항체는 본 발명의 방법에 의한 올리고당의 변형의 결과로서 Fc 영역에 증가된 비율의 이등분된 올리고당을 가진다. 일부 구체예에서, 이등분된 올리고당의 백분율은 적어도 약 20% 내지 약 100%, 구체적으로 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 내지 약 70%, 보다 구체적으로 적어도 약 75%이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 발명의 방법에 의해 생성된, 증가된 이펙터 기능 및/또는 증가된 Fc 수용체 결합 친화성을 가지도록 엔지니어링된 항-HIV　항체에 관련된다. 일부 구체예에서, 항체는 무상 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 Fc 영역을 함유하는 항체 단편, 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 동등한 영역을 포함하는 융합 단백질이다.
한 측면으로, 본 발명은 변형된 글리코실화 패턴을 가지는 본 발명의 항체의 생성을 위한 숙주 세포 발현 시스템을 제공한다. 특히, 본 발명은 개선된 치료 가치를 가지는 본 발명의 항체의 글리코형태의 생성을 위한 숙주 세포 시스템을 제공한다. 그러므로, 발명은 글리코실트란스페라제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 발현하도록 선택된 또는 엔지니어링된 숙주 세포 발현 시스템을 제공한다.
일반적으로, 상기 논의된 세포주들을 포함하여, 임의의 유형의 배양된 세포주는 본 발명의 숙주 세포주들을 엔지니어링하기 위한 배경으로서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 다른 포유류 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포가 발명의 엔지니어링된 숙주 세포를 생성하기 휘안 배경 세포주로서 사용된다.
발명의 항체의 코딩 서열을 함유하고 생물학적으로 활성인 유전자 생성물을 발현하는 숙주 세포들은 적어도 4가지의 일반적 접근법에 의해 확인될 수 있다: (a) DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화; (b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재; (c) 숙주 세포에서 각각의 mRNA 전사물의 발현에 의해 측정되는 바 전사 수준의 평가; 및 (d) 면역분석 또는 생물학적 활성에 의해 측정되는 바 유전자 생성물의 검출.
Fc 영역 변종
일부 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입될 수 있고, 그로써 Fc 영역 변종이 생성된다. 본원에서 Fc 영역은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역이다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및 변종 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역 변종은 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 치환)을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 발명은 전부가 아닌 일부의 이펙터 기능을 가지고 있어서, 생체내에서의 항체의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 유해한 용도에 대해 바람직한 후보로 만들어주는 항체 변종을 포함한다. 시험관 내 및/또는 생체내 세포독성 분석은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석은 항체가 FcγR 결합이 결핍되지만 (그러므로 ADCC 활성이 결핍될 가능성이 있음), FcRn 결합 능력을 보유하고 있는 것을 보증하기 위해 수행될 수 있다. 관심의 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비-제한적 예시들은 미국 특허 번호 5,500,362 및 5,821,337에서 기술된다. 다르게는, 비-방사성 분석 방법이 사용될 수 있다 (예컨대 ACTITM 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 분석). 그러한 분석을 위한 유용한 이펙터 세포들은 말초혈 단핵세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 다르게는, 또는 추가적으로, 관심의 분자의 ADCC 활성은 예컨대 동물 모델에서 생체 내로 평가될 수 있다 (예컨대 Clynes et al.　Proc. Nat'l Acad. Sci. USA　95:652-656 (1998) 참조). C1q 결합 분석이 또한 항체가 C1q에 결합할 수 있는지 또는 결합할 수 없는지 및 그로써 CDC 활성을 함유하고 있는지 결핍되어 있는지를 확인하기 위하여 수행될 수 있다 (예컨대 WO06/029879, WO99/51642 및 WO05/100402; 미국 특허 번호 6,194,551; 및 Idusogie et al.　J. Immunol.　164:4178-4184 (2000) 참조). 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석이 수행될 수 있다 (예컨대 Gazzano-Santoro et al.,　J. Immunol. Methods　202:163 (1996); Cragg, M. S. et al.,　Blood　101:1045-1052 (2003); 및 Cragg et al.,　Blood　103:2738-2743 (2004) 참조). FcRn 결합 및 생체내 정화/반감기 측정이 또한 공지 방법들을 사용하여 수행될 수 있다 (예컨대 Petkova, S. B. et al.,　Int'l. Immunol.　18(12):1759-1769 (2006) 참조). 감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기들 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상; 또는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 둘 이상의 치환을 가지는 것들, 예컨대 잔기 265 및 297의 알라인으로의 치환을 갖는 Fc 돌연변이를 포함한다 (예컨대 미국 특허 번호 6,737,056 및 7,332,581 참조). FcR에 대한 결합이 개선되었거나 감소된 항체 변종들이 또한 포함된다 (예컨대 미국 특허 번호 6,737,056; WO04/056312, 및 Shields et al.,　J. Biol. Chem.　9(2): 6591-6604 (2001) 참조). 일부 구체예에서, 항체 변종은 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334에서의 치환을 가지는 Fc 영역을 포함한다.
항체는 증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 개선된 결합을 가질 수 있다 (예컨대 US 2005/0014934 참조). 그러한 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 그 안에 가지는 Fc 영역을 포함할 수 있고, Fc 영역 잔기들: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환을 가지는 것들을 포함한다 (예컨대 미국 특허 번호 7,371,826 참조). Fc 영역 변종의 다른 예시가 또한 고려된다 (예컨대 Duncan & Winter,　Nature　322:738-40 (1988); 미국 특허 번호 5,648,260 및 5,624,821; 및 WO94/29351 참조).
시스테인 엔지니어링된 항체 변종
일부 구체예에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있는 시스테인 엔지니어링된 항체, 예컨대 "thioMAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, 치환된 잔기들은 항체의 접근가능한 부위들에서 일어난다. 반응성 티올기는 면역컨쥬게이트를 생성하기 위하여, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티와 같은, 다른 모이어티들에 대한 컨쥬게이션을 위한 부위에 위치할 수 있다. 일부 구체예에서, 다음 잔기들의 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 엔지니어링된 항체는 기술된 것과 같이 생성될 수 있다 (예컨대 미국 특허 번호 7,521,541 참조).
항체 유도체
일부 구체예에서, 본원에 제공된 항체는 공지되고 이용할 수 있는 추가의 비단백질성 모이어티들을 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티들은 한정하는 것은 아니지만, 수용성 폴리머를 포함한다. 수용성 폴리머의 비-제한적 예시는, 한정하는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 코폴리머, 폴리아미노산 (호모폴리머 또는 무작위 코폴리머 중 어느 하나), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예컨대 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 그것들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그것의 물에서의 안정성으로 인해 제조에 여러 장점을 가질 수 있다.
폴리머는 임의의 분자량의 것일 수 있고, 분지되었거나 분지되지 않은 것일 수 있다. 항체에 부착된 폴리머들의 수는 다를 수 있고, 만약 둘 이상의 폴리머가 부착되면, 그것들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 항체 및 복사에 대한 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 컨쥬게이트가 제공된다. 일부 구체예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (예컨대 Kam et al.,　Proc. Natl. Acad. Sci. USA　102: 11600-11605 (2005) 참조). 복사는 임의의 파장의 것일 수 있고, 한정하는 것은 아니지만 통상적인 세포에 해를 끼치지는 않지남, 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포들이 죽는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장들을 포함한다.
재조합 방법 및 조성물
항체는 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조될 수 있다 (예컨대 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 일부 구체예에서, 본원에 기술된 항-HIV 항체 또는 그것의 단편을 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다. 그러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 추가의 구체예에서, 그러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터가 제공된다. 벡터는 그것에 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자이다. 용어는 그것이 도입되는 숙주 세포의 게놈으로 통합된 벡터뿐만 아니라 자가-복제하는 핵산 구조물로서의 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그것들이 작동 가능하게 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 항-HIV 항체로부터 유래된 결합 도메인을 포함하는 CAR을 암호화하는 산 및/또는 벡터가 제공된다.
추가의 구체예에서, 그러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 그러한 세포들의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입되는 세포이다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하고, 그것들은 일차 형징전환된 세포 및 계대 횟수와 관계없이 그것들로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있고, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝 및 선택되는 바 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가지는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다. 그러한 한 구체예에서, 숙주 세포는 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예컨대 벡터로 형질전환되었다). 일부 구체예에서, 숙주 세포는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프양 세포 (예컨대 Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일부 구체예에서, 항-HIV 항체의 제조 방법이 제공되는데, 그 방법은 상기에 제공된 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 및 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 항체를 선택적으로 회수하는 단계를 포함한다. 일부 구체에에서 숙주 세포는 환자로부터 얻어진 일차 면역 세포, 예컨대 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 조절 T 세포 또는 NK 세포이다.
항-HIV　항체의 재조합 제조를 위해, 항체, 예컨대 상기에서 기술된 항체를 암호화하는 분리된 핵산이 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 그러한 핵산은 종래 과정을 사용하여 쉽게 분리되고 서열결정될 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 본원에 기술된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 예컨대 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 때, 박테리아에서 제조될 수 있다 (예컨대 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523; Charlton,　Methods in Molecular Biology, Vol.　248, pp. 245-254 (2003) 참조). 발현 후, 항체는 가용성 분획의 박테리아 세포 페이스트로부터 분리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물에 더불어, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다 (예컨대 Gerngross,　Nat. Biotech.　22:1409-1414 (2004) 및 Li et al.,　Nat. Biotech.　24:210-215 (2006) 참조). 글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 무척추동물 및 척추동물을 포함하여, 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다 (예컨대 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 참조). 척추동물 세포의 예는 포유류 세포주, SV40 (COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장주 (예컨대 in Graham et al.,　J. Gen Virol.　36:59 (1977)에서 기술된 293 또는 293 세포); 어린 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 개의 신장 세포 (MDCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); TR1 세포; MRC 5 세포; FS4 세포; DHFR-　CHO 세포를 포함하여 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 와 같은 골수종 세포주를 포함한다 (예컨대 Yazaki 및 Wu,　Methods in Molecular Biology, Vol.　248, pp. 255-268 (2003) 참조).
분석
본원에 제공된 항-HIV　항체는 그것들의 물리/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 다양한 공지 분석에 의해 확인, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다.
한 측면으로, 발명의 항체는 그것의 항원 결합 활성에 대해, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 등에 의해 시험된다. 한 측면으로, 경쟁 분석이 HIV에의 결합에 대해 본원에 기술된 항-HIV와 경쟁하는 항체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 그러한 경쟁 항체는 본원에 기술된 항-HIV　항체에 의해 결합된 동일 에피토프 (예컨대 선형 또는 형태적 에피토프)에 결합한다. 예시의 에피토프 지도화 방법이 알려져 있다 (예컨대 Morris "Epitope Mapping Protocols," in　Methods in Molecular Biology　vol. 66 (1996) 참조).
예시의 경쟁 분석에서, 고정된 HIV는 HIV에 결합하는 제1 표지된 항체 및 HIV에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 시험되는 제2의 미표지 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션된다. 제2 항체는 하이브리도마 상층액에 존재할 수 있다. 대조표준으로서, 고정된 HIV는 제2 미표지 항체가 아니라 제1 표지된 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션된다. HIV에의 제1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 인큐베이션된 후에, 과잉 미결합 항체가 제거되고, 고정된 HIV와 회합된 표지의 양이 측정된다. 만약 고정된 HIV와 회합된 표지의 양이 대조표준 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된다면, 그것은 제2 항체가 HIV에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하고 있음을 나타낸다 (예컨대 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual　ch. 14 (1996) 참조).
한 측면으로, 생물학적 활성을 가지는 항-HIV 항체를 확인하기 위한 분석이 제공된다. 일부 구체예에서, HIV에 대한 중화 활성을 가지는 항-HIV 항체를 확인하기 위한 분석이 제공된다. 생체 내에서 및/또는 시험관 내에서 그러한 생물학적 활성을 가지는 항체가 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 발명의 항체는 그러한 생물학적 활성에 대해 시험된다.
면역컨쥬게이트
발명은 또한 그 안에 항-HIV 항체를 포함하고 있는 면역컨쥬게이트를 제공한다. 면역컨쥬게이트는 하나 이상의 이종성 분자(들)에 컨쥬게이트된 항체이다. 예를 들어, 면역컨쥬게이트는 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 단백질 도메인, 독소 (예컨대 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그것들의 단편) 또는 방사성 동위원소에 컨쥬게이트된 항-HIV 항체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 면역컨쥬게이트는 항-HIV 항체 또는 그것의 단편 (예컨대 scFv)을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 면역컨쥬게이트는 항체가 하나 이상의 약물, 이를테면 한정하는 것은 아니지만 메이탄시노이드 (maytansinoid); 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF)와 같은 아우리스타틴; 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그것의 유도체; 다우노마이신 또는 독소루비신과 같은 안트라사이클린; 메토트렉세이트; 빈데신; 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀과 같은 탁산; 트라이코테센; 및 CC1065에 컨쥬게이트된 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)이다 (예컨대 미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064, 5,635,483, 5,780,588, 7,498,298, 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 6,630,579, 및 5,877,296; EP0425235B1; Hinman et al.,　Cancer Res.　53:3336-3342 (1993); Lode et al.,　Cancer Res.　58:2925-2928 (1998); Kratz et al.,　Current Med. Chem.　13:477-523 (2006); Jeffrey et al.,　Bioorganic　&　Med. Chem. Letters　16:358-362 (2006); Torgov et al.,　Bioconj. Chem.16:717-721 (2005); Nagy et al.,　Proc. Natl. Acad. Sci. USA　97:829-834 (2000); Dubowchik et al.,　Bioorg. &　Med. Chem. Letters　12:1529-1532 (2002); 및 King et al.,　J. Med. Chem.　45:4336-4343 (2002) 참조).
또 다른 구체예에서, 면역컨쥬게이트는 한정하는 것은 아니지만 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴(dianthin) 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S),　모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트라이코테세네스(tricothecenes)를 포함하여, 효소적으로 활성인 독소 또는 그것의 단편에 컨쥬게이트된 본원에 기술된 항체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 면역컨쥬게이트는 방사성컨쥬게이트를 형성하기 위하여 방사성 원자에 컨쥬게이트된 본원에 기술된 항체를 포함한다. 방사성 컨쥬게이트의 제조를 위해 활용할 수 있는 예시의 방사성 동위원소는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212　및 Lu의 방사성 동위원소들을 포함한다. 방사성 컨쥬게이트는 신티그래픽 검출을 위한 방사성 원자 (예컨대 tc99m 또는 1123, 또는 핵자기공명 (NMR) 영상화를 위한 스핀 표지, 예컨대 요오드-123 어게인, 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철)를 포함할 수 있다.
항체와 세포독성제의 컨쥬게이트는 이중기능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트 (SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올레인 (IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체 (예컨대 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일)헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-다이아이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소가 제조될 수 있다 (예컨대 Vitetta et al.,　Science　238:1098 (1987) 참조). 탄소-14-표지된 1-아이소티오시아나토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체의 방사성뉴클레오타이드의 컨쥬게이션을 위한 예시 킬레이트화제이다 (예컨대 WO94/11026 참조). 링커는 절단될 수 있고, 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 할 수 있다. 예시의 절단 가능한 링커는 산-가변성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광가변성 링커, 다이메틸 링커 및 다이설파이드-함유 링커를 포함한다 (예컨대 Chari et al.,　Cancer Res.　52:127-131 (1992); 미국 특허 번호 5,208,020 참조).
면역컨쥬게이트 또는 본원의 ADC는 교차-결합제 시약으로 제조된 컨쥬게이트를 분명하게 고려한다. 예시의 교차-결합제 시약은 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB 및 SVSB (석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함한다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
일부 구체예에서, 본원에 제공된 항-HIV 항체들 중 어떤 것도 생물학적 샘플에서 HIV의 존재를 검출하기 위해 유용하다. 검출은 정량적 또는 정성적 검출을 다 포함한다.
본원에 개시된 항체 및 조성물은 다양한 목적에 대해, 예컨대 대상체에서 HIV 감염을 검출하거나 AIDS를 진단하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법들은 HIV로 또는 AIDS로 진단된 대상체로부터의 샘플을 본원에 기술된 항체와 접촉시키는 단계 및 샘플에 대한 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 대조표준 샘플에 대한 항체의 결합에 비해 샘플에 대한 항체의 결합의 증가는 대상체가 HIV-1 감염 및/또는 AIDS를 가진 것을 확인한다. 일부 구체예에서, 방법은 HIV에 결합하는 제2 항체를 샘플과 접촉시키는 단계 및 제2 항체의 결합을 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 비-제한 실례에서 대조표준 샘플에 비해 샘플에 대한 항체의 결합의 증가는 대상체에서 HIV를 검출한다. 일부 비-제한 실례에서, 항체는 샘플 중의 가용성 gp120에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 방법은 HIV 항체를 특이적으로 인식하는 제2 항체를 샘플과 접촉시키는 단계 및 제2 항체의 결합을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 진단 방법을 제공한다. 진단 방법은 일반적으로 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플, 예컨대 혈액, 혈청, 타액, 뇨, 가래, 면봉으로 채취한 세포 샘플 또는 조직 생검 등의 샘플을 HIV 항체와 접촉시키는 단계 및 대조표준 샘플 또는 사전측정된 컷-오프 값과 비교하여 항체가 샘플에 우선적으로 결합하는 지를 측정하고, 그로써 HIV 바이러스의 존재를 나타내는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 환자로부터의 생물학적 샘플 중의 본 발명의 HIV 항체의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 검출 방법은 일반적으로 환자로부터 생물학적 샘플, 예를 들면, 혈액, 혈청, 타액, 뇨, 가래, 면봉으로 채취한 세포 샘플 또는 조직 생검을 얻는 단계 및 HIV 항체 또는 그것의 단편, 또는 HIV 항체를 암호화하는 핵산을 분리하는 단계 및 생물학적 샘플 중의 HIV 항체의 존재를 분석하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 세포에서 HIV 항체의 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 방법을 제공한다. HIV 항체의 뉴클레오타이드 서열은 또한 본원에 개시된 프라이머들을 사용하여 검출될 수 있다. 환자로부터의 생물학적 샘플 중의 HIV 항체의 존재는 공지된 재조합 기법들을 활용하여 및/또는 질량 분석계를 사용하여 측정될 수 있다.
일부 구체예에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-HIV　항체가 제공된다. 추가의 측면으로, 생물학적 샘플 중의 HIV의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 생물학적 샘플을 본원에 기술된 항-HIV　항체와 HIV에 대한 항-HIV　항체의 결합을 허용하는 조건하에서 접촉시키는 단계 및 항-HIV　항체와 HIV 사이에서 복합체가 형성되는지를 검출하는 단계를 포함한다. 그러한 방법은 시험관 내 또는 생체 내 방법일 수 있다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 항-HIV　항체를 사용한 치료법에 맞는 대상체를 선택하기 위해 사용되는데, 예컨대 여기서 HIV는 환자의 선택을 위한 생체마커이다.
발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 장애의 예로는 AIDS를 포함하여, HIV의 감염을 특징으로 하는 장애들을 포함한다.
일부 구체예에서, 분리된 항-HIV　항체가 제공된다. 표지는, 한정하는 것은 아니지만, 직접 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광, 발색단, 전자-조밀, 화학발광 및 방사능 표지)뿐 아니라, 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통한 것 (예컨대 효소 또는 리간드)을 포함한다. 예시되는 표지는 방사성 동위원소 (예컨대 　32P, 14C,　125I,　3H 및　131I), 플루오로포어 (예컨대 희토 킬레이터 또는 플루오레세인 및 그것의 유도체, 로다민 및 그것의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제 (예컨대 미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 당 산화효소,염료 전구체를 산화시키기 위하여 과산화수소를 사용하는 효소와 커플링된 헤테로고리형 산화효소, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함한다.
약학 조성물
또한 동결건조된 제형 또는 수용액 형태의 본원에 기술된 항-HIV 항체의 약학 제형이 제공되는데, 그것은 원하는 정도의 순도를 가진 그런 항체를 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 제조된다 (예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences　16th edition, Osol, A. Ed. (1980) 참조). 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 투여량 및 사용된 농도에서 수령체에게 비독성이다. 예시의 약학적으로 허용되는 담체는 완충제 (예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산); 항산화제 (예컨대 아스코르브산 및 메티오닌); 보존제 (예컨대 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드); 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 (예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤); 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질 (예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 친수성 폴리머 (예컨대 폴리비닐피롤리돈); 아미노산 (예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신); 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물 (예컨대 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린); 킬레이트화제 (예컨대 EDTA); 당 (예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨); 염-형성 카운터 이온 (예컨대 나트륨); 금속 복합체 (예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 (예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG))를 포함한다. 본원에서 예시의 약학적으로 허용되는 담체는 간질성 약물 분산제 (예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP)) (예컨대 미국 특허 공개 번호 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968 참조). 한 측면으로, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제 (예컨대 콘드로이티나제)와 조합된다.
또한 항-HIV-항체 또는 그것의 단편, 및/또는 융합 단백질, 및/또는 키메라 수용체, 및/또는 분자를 발현하는 엔지니어링된 세포들을 포함하는 약학 제형이 제공된다. 약학 제형 및 제형은 일반적으로 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
용어 "약학 제형"은 그러한 형태로 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과를 나타낼 수 있고, 제형이 투여될 대상체에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가 성분들을 함유하지 않은 제제를 나타낸다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외의, 대상체에게 비독성인 약학 제형 중의 성분을 나타낸다. 약학적으로 허용되는 담체는, 한정하는 것은 아니지만, 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.
일부 측면으로, 담체의 선택은 부분적으로 특정 세포, 결합 분자 및/또는 항체에 의해, 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 있다. 예를 들어, 약학 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는, 예를 들면 메틸파라벤, 프로필파라벤, 나트륨 벤조에이트 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함할 수 있다. 일부 측면으로, 둘 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 그것들의 혼합물은 전형적으로 총 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다.
일부 측면으로 완충제가 조성물에 포함된다. 적합한 완충제는, 예를 들면 시트르산, 나트륨 시트레이트, 인산, 칼륨 포스페이트 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면으로, 둘 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 그것들의 혼합물은 전형적으로 총 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법은 알려져 있다. 예시적인 방법은 예를 들면 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)에 보다 상세하게 기술된다.
항체의 제형은 동결건조된 제형 및 수용액을 포함할 수 있다.
제형 또는 조성물은 또한 항체 또는 그것의 단편, 또는 세포, 바람직하게는 항체 또는 그것의 단편, 또는 세포에 상보하는 활성을 가진 것들로 치료되는 특정 징후, 질환 또는 상태에 유용한 하나 이상의 활성 성분을 함유할 수 있고, 이때 각각의 활성은 서로에게 불리하게 영향을 미치지 않는다. 일부 구체예에서, 제형은 또한 바이러스 버든을 치료, 개선, 관리, 감소시키기 위해, 또는 특정 징후 (예컨대 HIV 감염 또는 AIDS)의 질환 심각성을 줄이기 위해 필요한 대로 성분들을 포함할 수 있다. 그러한 활성 성분들은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다. 그러므로, 일부 구체예에서, 약학 조성물은 추가로 다른 약학적으로 활성인 제제 또는 약물, 예컨대 항바이러스제를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 또는 항체는 염, 예컨대 약학적으로 허용되는 염의 형태로 투여된다. 적합한 약학적으로 허용되는 산 부가 염은 미네랄 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산, 및 유기 산, 예컨대 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 석신산 및 아릴설폰산, 예를 들면 p-톨루엔설폰산으로부터 유도된 것들을 포함한다.
항체 제형은 동결건조될 수 있다 (예컨대 미국 특허 번호 6,267,958 참조). 항체 제형은 수성 항체일 수 있다 (예컨대 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO06/044908 참조).
활성 성분들은 미소캡슐 (예컨대 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-미소캡슐) 및 폴리-(메틸메타크릴레이트)에 포획될 수 있다. 활성 성분들은 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예컨대 리포솜, 알부민 미소스피어, 미소에멀션, 나노-입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀션에 포획될 수 있다. 지속성-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속성-방출 제제의 적합한 실례는 항체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 매트릭스는 형상화된 물품 (예컨대 필름 또는 미소캡슐)의 형태이다.
일부 측면으로 약학 조성물은 치료될 부위가 민감화되기 전에, 및 민감화가 유발되기에 충분한 시간으로 조성물의 전달이 일어나도록 시간-방출, 지연된 방출 및 지속성 방출 전달 시스템을 사용할 수 있다. 많은 유형의 방출 전달 시스템이 활용 가능하고 알려져 있다. 그러한 시스템은 조성물의 반복 투여를 피할 수 있고, 그로써 대상체 및 의사에게 편리함을 증가시킨다.
일부 구체예에서 약학 조성물은 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기에 효과적인 양, 예컨대 치료적으로 유효한 또는 예방적으로 유효한 양으로 항체 또는 그것의 단편 및/또는 세포를 함유한다. 치료적 또는 예방적 효능은 일부 구체예에서 치료된 대상체의 주기적 평가에 의해 모니터링된다. 여러 날 이상에 걸친 반복 투여에 대해, 상태에 따라, 치료는 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 반복된다. 그러나, 다른 투여량 처방도 유용할 수 있고 결정될 수 있다. 원하는 투여량은 조성물의 단일 볼루스 투여에 의해, 조성물의 다중 볼루스 투여에 의해 또는 조성물의 연속적인 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편을 함유하고 있는 유전자 엔지니어링된 세포의 맥락에서, 대상체는 약 1백만 내지 약 천억개 범위의 세포, 예컨대 약 1백만 내지 약 5백억개의 세포 (예컨대 약 5백만개의 세포, 약 2천5백만개의 세포, 약 5억개의 세포, 약 10억개의 세포, 약 50억개의 세포, 약 200억개의 세포, 약 300억개의 세포, 약 400억개의 세포 또는 전술한 임의의 두 값에 의해 규정된 범위), 예컨대 약 천만개 내지 약 천억개의 세포 (예컨대 약 2천만개의 세포, 약 3천만개의 세포, 약 4천만개의 세포, 약 6천만개의 세포, 약 7천만개의 세포, 약 8천만개의 세포, 약 9천만개의 세포, 약 백억개의 세포, 약 250억개의 세포, 약 5백억개의 세포, 약 750억개의 세포, 약 900억개의 세포 또는 전술한 임의의 두 값에 의해 규정된 범위), 및 일부 경우에 약 1억개의 세포 내지 약 5백억개의 세포 (예커대 약 1억 2천만개의 세포, 약 2억 5천만개의 세포, 약 3억 5천만개의 세포, 약 4억 5천만개의 세포, 약 6억 5천만개의 세포, 약 8억개의 세포, 약 9억개의 세포, 약 30억개의 세포, 약 300억개의 세포, 약 450억개의 세포) 또는 이들 범위 사이의 임의의 값, 및/또는 대상체의 체중 kg당 세포의 그러한 수의 세포가 투여된다.
조성물은 표준 투여 기법, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 조성물의 보관 및 투여를 위한 제형 및 장치, 예컨대 주사기 및 바이알이 제공된다. 세포의 투여는 자가유래이거나 이종유래일 수 있다. 예를 들어, 면역반응성 세포 또는 전구세포는 한 대상체로부터 얻어질 수 있고, 동일한 대상체 또는 상이한, 부합하는 대상체에 투여될 수 있다. 말초혈 유래된 면역반응성 세포 또는 그것들의 자손 (예컨대 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래된)은 카테테르 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사 또는 비경구 투여를 포함하여, 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물 (예컨대 유전자 변형된 면역반응성 세포를 함유하는 약학 조성물)을 투여할 때, 그것은 일반적으로 단위 투여 주사가능 형태 (용액, 현탁액, 에멀션)로 제형될 것이다.
제형은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐의, 경피, 근육내, 비강내, 볼의, 혀밑 또는 좌약 투여를 위한 제형을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 집단은 비경구로 투여된다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장의, 질의, 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 집단은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 시스템 전달을 사용하여 대상체에게 투여된다.
일부 구체예에서 조성물은 멸균 액체 제제, 예컨대 등장성 수용액, 현탁액, 에멀션, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공되며, 그것은 일부 측면으로 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 제제는 보통 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조하기 더 쉽다. 추가적으로, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기가 다소 더 편리하다. 다른 한편으로, 점성 조성물은 특이적 조직과의 더 긴 접촉 기간을 제공하기 위해 적절한 점도 범위 내에서 제형될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 예를 들면 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 폴리올 (예를 들면 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 그것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균상태의 주사 가능한 용액은 항체 또는 그것의 단편을 용매에, 예컨대 적합한 담체, 희석제, 또는 멸균수, 생리 식염수, 글루코오스, 덱스트로오스 등과 같은 부형제와의 혼합상태로 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 조성물은 또한 동결건조될 수 있다. 조성물은원하는 투여 경로 및 제제에 따라 습윤제, 분산제 또는 유화제 (예컨대 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 풍미제, 착색제 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 적합한 제제를 제조하기 위해 일부 측면으로 표준 텍스트가 참조될 수 있다.
항미생물 보존제, 항산화제, 킬레이트화제 및 완충제를 포함하여, 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 보장될 수 있다. 주사 가능한 약학 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 이루어질 수 있다.
지속성-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속성-방출 제제의 적합한 예시는 항체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 매트릭스는 형상화된 물품, 예컨대 필름 또는 미소캡슐의 형태이다.
생체내 투여를 위해 사용될 제형은 일반적으로 멸균상태이다 (예컨대 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해).
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-HIV　항체는 치료 방법에 사용될 수 있다. 본 발명은 바이러스 감염 (예컨대 HIV)으로 감염된 포유류를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 방법은 상기 포유류에 본원에 개시된 HIV 항체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 대상체에서 HIV 바이러스 역가, 바이러스 복제, 바이러스 증식 또는 HIV 바이러스 단백질의 양의 증가를 감소시키기 위한 방법이 추가로 제공된다.
한 측면으로, 의약으로서 사용하기 위한 항-HIV　항체가 제공된다. 추가의 구체예에서, HIV 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 항-HIV　항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 HIV를 중화시킨다. 일부 구체예에서, 항-HIV　항체는 광범위한 중화 항체이다. 다른 구체예에서, HIV는 HIV-1이다. 일부 구체예에서, HIV는 HIV-2이다. 다른 구체예에서, HIV는 HIV-1 그룹 M이다. 일부 구체예에서, HIV는 HIV-1 그룹 N, HIV-1 그룹 O 및/또는 HIV-1 그룹 P이다. 다른 구체예에서, HIV는 클레이드 A (A1 및/또는 A2를 포함함), B, C, D, E, F (F1 및/또는 F2를 포함함), G, H, I, J, K, 또는 그것들의 임의의 조합, 아형 또는 CRF이다. 추가의 측면으로, AIDS를 치료하는 데 사용하기 위한 항-HIV 항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-HIV 항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 발명은 유효량의 항-HIV 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, HIV로 감염된 또는 AIDS에 걸린 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-HIV 항체를 제공한다. 제제의 유효량은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 이루기 위해, 필요한 투여량 및 시간 동안의 효과적인 양이다. 그런 한 구체예에서, 방법은 유효량의 적어도 하나의 추가적인 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 개체는 인간일 수 있다.
추가의 측면으로, 발명은 의약의 제조 또는 제제에 항-HIV 항체의 사용을 제공한다. 일부 구체예에서, 의약은 HIV 감염의 치료를 위한 것이다. 일부 구체예에서, 의약은 AIDS의 치료를 위한 것이다. 추가의 구체예에서, 의약은 HIV 감염 또는 AIDS를 가진 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 단계를 포함하는, HIV 감염 또는 AIDS를 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다.
추가의 측면으로, 발명은 HIV 감염 또는 AIDS를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 방법은 그러한 HIV 감염 또는 AIDS를 가진 개체에게 유효량의 항-HIV 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 감염의 HIV 또는 AIDS는 그것의 구성체 바이러스의 표면에 gp120을 발현한다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 HIV 감염을 가진, 또는 HIV 감염의 위험이 있는 인간 또는 비-인간 영장류 환자에게, 인간에서 HIV에 대한 보호 면역 반응, 또는 HIV 바이러스의 감소를 유도하기에 충분한 양으로 및 충분한 스케줄에 따라 투여하기에 적합한 HIV 항체 조성물의 제조 및 투여 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 발명의 적어도 하나의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신을 제공한다. 한 구체예에 따르면, 백신은 본원에 기술된 적어도 하나의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신이다. 백신은 본원에 기술된 특징들을 임의의 조합으로 가지는 복수의 항체를 포함할 수 있고 추가적인 항체, 예컨대 HIV를 중화하는 다른 활용 가능한 항체를 더 포함할 수 있다.
조성물은 백신접종 후에 HIV 감염의 다양한 아형의 진행을 예방적으로 또는 치료적으로 치료하기 위해, 동일하거나 상이할 수 있는 본원에 개시된 항체 또는 항체들의 조합일 수 있는 것이 인지되어야 한다. 그러한 조합은 원하는 면역력에 따라 선택될 수 있다. 항체가 동물 또는 인간에 투여될 때, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 보조제와 조합될 수 있다.
추가로, HIV의 치료를 위해 환자에서 효과적인 수준을 측정하는 것과 관련하여, 특히, 적합한 동물 모델들이 활용 가능하고 다양한 유전자요법 프로토콜의 HIV에 대한 생체내 효능을 평가하는데 광범위하게 실시되어 왔다 (Sarver et al. (1993b), 상기 동일). 이 모델들은 마우스, 원숭이 및 고양이를 포함한다. 이 동물들이 자연적으로는 HIV 질환에 취약하지 않을지라도, 키메라 마우스 모델 (예를 들면 SCID, bg/nu/xid, NOD/SCID, SCID-hu, 면역경쟁성 SCID-hu, 골수-제거된 BALB/c), 림프절, 태아 간/흉선 또는 다른 조직이 렌티바이러스 벡터 또는 HIV로 감염될 수 있고, HIV 발병에 대한 모델로서 사용될 수 있다. 유사하게, 고양이과 면역 결핍 바이러스 (FIV)/고양이 모델처럼 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)/원숭이 모델이 사용될 수 있다. 약학 조성물은 AIDS를 치료적으로 치료하기 위해 사용될 때, 발명에 따르는 벡터와 함께 다른 제약을 함유할 수 있다. 이런 다른 제약들은 그것들의 전통적인 양식으로 (즉 HIV 감염을 치료하기 위한 제제로서) 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 HIV 바이러스의 감염을 감소시키기 위한 예방적 또는 치료적 치료 선택을 제공하는, 유효량의 분리된 HIV 항체 또는 친화성 성숙된 버전을 포함하는 항체-기반 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 항체-기반 약학 조성물은 일반적으로 알려져 있는 많은 전략에 의해 제형될 수 있다 (예컨대 McGoff and Scher, 2000, Solution Formulation of Proteins/Peptides: In McNally, E.J., ed. Protein Formulation and Delivery. New York, NY: Marcel Dekker; pp. 139-158; Akers and Defilippis, 2000, Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Philadelphia, PA: Talyor and Francis; pp. 145-177; Akers, et al., 2002, Pharm. Biotechnol. 14:47-127 참조).
또 다른 구체예에서, 본 발명은 생물학적 샘플 중의 고도로 보존된 공통 서열을 포함하는 중쇄 및 고도로 보존된 공통 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 HIV 항체의 검출 방법을 제공하며, 방법은 포유류 대상체로부터 면역글로불린-함유 생물학적 샘플을 얻는 단계, 상기 샘플로부터 HIV 항체를 분리하는 단계 및 중쇄 및 경쇄의 고도로 보존된 공통 서열을 확인하는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 타액, 뇨, 가래, 면봉으로 채취한 샘플 또는 조직 생검일 수 있다. 아미노산 서열은 예를 들어 PCR 및 질량 분석을 포함하여, 공지의 방법들에 의해 측정될 수 있다.
추가의 측면으로, 발명은 본원에 개시된 임의의 항-HIV 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다 (예컨대 상기 임의의 치료 방법에 사용하기 위하여). 일부 구체예에서, 약학 제형은 본원에 개시된 임의의 항-HIV 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 약학 제형은 본원에 개시된 임의의 항-HIV 항체 및 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다.
본원에 기술된 항체 또는 그것의 단편은 단독으로 또는 다른 제제들과 조합하여 치료법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 발명의 항체는 적어도 하나의 추가 치료제와 공동-투여될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그것의 단편은 단독으로 하나 이상의 한 항체 (예를 들면 복수의 항체 또는 항체 푸울)와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 항체 (예컨대 HIV 중화 항체), 예를 들면 한정하는 것은 아니지만, VRCO1, VRC02, VRC03, VRC-PG-04, VRC-PG-05, bl2, (CD4bs), (PGTs, PG9 및 PG16과 조합하여 사용될 수 있다 (Science 333(6049): 1633-1637; Nature 477(7365):466-470; Science 334(6060): 1289-1293; Science 326(5950):285-289; Science 334(6059): 1097-1103; 및 Nature 480(7377):336-343 참조).
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 바이러스 감염, 예컨대, 예를 들어 HIV로 감염된 포유류를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 개시된 HIV 항체를 포함하는 약학 조성물을 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에 따르면, HIV로 감염된 포유류를 치료하는 방법은 본 발명의 항체 또는 그것의 단편을 포함하는 약학 조성물을 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함한다.
상기 주지된 그러한 조합 치료법은 조합된 투여 (둘 이상의 치료제가 동일하거나 또는 별도의 제형에 포함된다), 및 발명의 항체의 투여가 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 일어날 수 있는 별도의 투여를 포함한다.
또한 양자 세포 요법을 위한 방법 및 사용이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체, 조직 또는 세포, 예컨대 질환 또는 상태 또는 장애를 가지고 있는, 가질 위험이 있는 또는 가진 것으로 추측되는 대상체, 조직 또는 세포에 세포 또는 세포를 함유하는 조성물의 투여를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포, 집단 및 조성물은 예컨대 양자 세포 요법, 예를 들면 양자 T 세포 요법을 통해 치료될 특정 질환 또는 상태를 가진 대상체에 투여된다. 일부 구체예에서 세포 또는 조성물은 대상체, 예컨대 질환 또는 장애를 가진 또는 가질 위험이 있는 대상체에 투여된다. 일부 측면으로, 방법은 그로써 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상을 치료, 예컨대 개선한다.
양자 세포 요법을 위한 세포의 투여 방법은 알려져 있고 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 양자 T 세포 요법 방법은 예컨대 Gruenberg 등의 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0170238; Rosenberg의 미국 특허 번호 4,690,915; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85에 기술된다. 예컨대 Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338 참조.
일부 구체예에서, 세포 요법, 예컨대 양자 세포 요법은 자가 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법을 받게 되는 대상체로부터 또는 그런 대상체로부터 유래된 샘플로부터 분리되거나 및/또는 그렇지 않으면 제조된다. 그러므로, 일부 측면으로, 세포는 치료 및 세포를 필요로 하는 대상체, 예컨대 환자로부터, 분리 및 프로세싱이 동일한 대상체에 투여된 후에 유래된다.
일부 구체예에서, 세포 요법, 예컨대 양자 T 세포 요법과 같은 양자 세포 요법은 동종 이계 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법을 받게 되는 또는 궁극적으로 받는 대상체, 예컨대 제1 대상체 이외의 대상체로부터 분리되거나 및/또는 그렇지 않으면 제조된다. 그러한 구체예에서, 세포는 다음에 동일 종의 상이한 대상체, 예컨대 제2 대상체에 투여된다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구체예에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 부류 또는 수퍼타입(supertype)을 발현한다.
일부 구체예에서, 세포, 세포 집단 또는 조성물이 투여되는 대상체는 영장류, 예컨대 인간이다. 일부 구체예에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 대상체는 유아, 유소년, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하여, 남성 또는 여성일 수 있고 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 비-영장류 포유류, 예컨대 설치류이다. 일부 실례에서, 환자 또는 대상체는 질환, 양자 세포 요법을 위한 및/또는 사이토카인 방출 증후군 (CRS)과 같은 독성 결과를 평가하기 위한 인증된 동물 모델이다.
발명의 항체 (및 임의의 추가적인 치료제)는 임의의 적합한 수단, 이를테면 비경구, 폐내 및 비강내 투여에 의해, 및 국소 처리를 위해 필요하다면 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 경로에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 투약은 주사 (예컨대 정맥내 또는 피하 주사)에 의한 것일 수 있다. 한정하는 것은 아니지만 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주사를 포함한 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
발명의 항체는 양호한 의료 실시와 일치하는 양식으로 제형, 투약 및 투여될 수 있을 것이다. 이 맥락에서 고려되어야 하는 인자로는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 관리 및 의료 전문가에게 알려져 있는 다른 인자들을 포함한다. 항체는 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용된 하나 이상의 제제일 필요는 없지만, 선택적으로 제제로 제형된다. 그러한 다른 제제의 유효량은 제형에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 다른 인자들에 좌우된다. 이것들은 일반적으로 동일한 투여량으로 및 본원에 기술된 투여 경로로, 또는 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 임의의 투여량으로 및 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 측정되는 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량의 발명의 항체 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용될 때)는 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 심각성 및 경과, 항체가 예방용으로 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 이전의 치료법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 좌우될 것이다. 항체는 한번에 또는 연속적인 치료에 걸쳐서 환자에게 적합하게 투여된다. 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예컨대 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체가 환자에 대한 투여를 위한 초기 후보 투여량일 수 있다 (예컨대 하나 이상의 별도의 투여에 의한, 또는 연속 주입에 의한). 매일의 투여량은 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위여야 할 것이다. 여러 날 또는 더 긴 시간에 걸친 반복 투여를 위해 치료는 일반적으로 원하는 감염 또는 질환 증상의 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 항체의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위일 것이다. 그러므로, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그것들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 그러한 용량은 간헐적으로 투여될 수 있다 (예컨대 매주마다 또는 매 3주마다). 초기의 더 높은 로딩 용량, 이어서 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다.
상기 제형 또는 치료 방법 중 어느 것이라도 항-HIV　항체 대신 또는 그것에 더불어 발명의 면역컨쥬게이트를 사용하여 수행될 수 있다는 것이 인지된다.
대상체에서 HIV 바이러스 역가, 바이러스 복제, 바이러스 증식 또는 HIV 바이러스 단백질의 양의 증가를 감소시키는 방법이 추가로 제공된다. 또 다른 측면에 따르면, 방법은 대상체에서 HIV 바이러스 역가, 바이러스 복제 또는 하나 이상의 HIV 스트레인 또는 분리물의 HIV 단백질의 양의 증가를 감소시키기에 효과적인 양의 HIV 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 포유류 세포를 gp120 상의 항원성 에피토프에 결합하는 항체 또는 그것의 부분과 접촉시키는 단계를 포함하는, 바이러스 복제 또는 HIV 감염의 추가의 숙주 세포로의 확산을 감소시키는 방법을 제공한다.
수동 면역화는 바이러스 질환을 효과적으로 및 안전하게 예방하고 치료하기 위해 사용될 수 있다 (예컨대 Keller et al., Clin. Microbiol. Rev. 13:602-14 (2000); Casadevall, Nat. Biotechnol. 20: 114 (2002); Shibata et al, Nat. Med. 5:204-10 (1999); 및 Igarashi et al, Nat. Med. 5:211-16 (1999) 참조). 인간 단클론성 항체를 사용하는 수동 면역화는 HIV의 응급 예방 및 치료를 위한 즉각적인 치료 전략을 제공한다.
HIV-관련 질환 또는 장애의 위험이 있는 대상체들은 감염된 사람과 접촉하게 되는 환자 또는 약간 다른 방법으로 HIV에 노출된 환자들을 포함한다. 예방 제제의 투여는 HIV-관련 질환 또는 장애의 특징적인 증상이 나타나기 전에 일어날 수 있어서, 질환 또는 장애가 방지되거나, 또는 다르게는 진행이 지연된다.
제조 물품
발명의 한 측면으로, 상기 기술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질들을 함유한 제조 물품이 제공도니다. 제조 물품은 용기 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들면 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 자체적으로 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 진단하기에 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하고 멸균 상태의 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하 주사 바늘에 의해 구멍이 뚫릴수 있는 스토퍼를 가지고 있는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 적어도 하나의 활성 제제는 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하기 위해 사용되는 것을 나타낸다. 게다가, 제조 물품은 (a) 그 안에 발명의 항체를 포함하는 조성물이 함유되어 있는 제1 용기; 및 (b) 그 안에 추가로 세포독성 또는 그렇지 않으면 치료제를 포함하는 조성물이 함유되어 있는 제2 용기를 포함할 수 있다. 발명의 이 구체예에서 제조 물품은 조성물이 특정 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 다르게는, 또는 추가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예컨대 주사용 세균 발육 억제수 (BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로오스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 추가로 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질들을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 하기 표 1 및 2에 열거된 HIV 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 서열 SEQ ID NO:1 내지 16 및 65의 중쇄 및 경쇄에 대한 서열을 포함한다.
중쇄 아미노산 서열들
KABAT FWR1 CDR1 FWR2 CDR2 FWR3 CDR3 FWR4
AbV-1H QMQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSVS GNIWS WIRQSPGKGPEWVG FVSGEYIEYNPSLKS RLTISRDTSKNQLSLTLRSVTAADTAMYYCAK TLRARRIYGVIAFGEVYDYHYFDV WGKGTMVTVSS
AbV-2H QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCSVSGDSMN NYYWT WIRQSPGKGLEWIG YVSDRASATYNPSLKS RVVISRDTSKNQLSLKLNSVTLADTAVYYCAT ARRGQRIYGEVAFGEFFYYYSMDV WGKGTAVTVSS
AbV-3H QLQLQESGPGLVKPPETLSLTCSVSGASIN DAYWS WIRQSPGKRPEWVG YVHHSGDTNYNPSLKR RVTFSLDTAKNEVSLKLVALTAADSAVYFCAR ALHGKRIYGTVALGELFVYFHMDV WGKGTAVTVSS
AbV-4H QLQLQESGPGLVKPPETLSLTCSVSGASIN DAYWS WIRQSPGKRPEWVG YVHHSGDTNYNPSLKR RVTFSLDTAKNEVSLKLVALTAADSAVYFCAR ALHGKRIYGTVALGELFVYFYMDV WGKGTAVTVSS
AbV-5H QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCNVSGTLVR DNYWS WIRQPLGKQPEWIG YVHDSGDTNYNPSLKS RVHLSLDKSKNLVSLRLTGVTAADSAIYYCAT TKHGRRIYGVVAFKEWFTYFYMDV WGKGTSVTVSS
AbV-6H QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCNVSGTLVR DNYWS WIRQPLGKQPEWIG YVHDSGDTNYNPSLKS RVHLSLDKSKNLVSLRLTGVTAADSAIYYCAT TKHGRRIYGVVAFKEWFTYFYMDV WGKGTSVTVSS
AbV-7H QMQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIS DSYWS WFRRSPGKGLEWIG YVHKSGDTNYSPSLKS RVNLSLDASKNQVSLSLVAATAADSGKYYCAR TLHGRRIYGIVAFNEWFTYFYMDV WGNGTQVTVSS
AbV-8H QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGASTS GQYWS WIRQSPGKGLEWIG YRSDSGDANYNPSLKS RVIISLDTSRNQLSLNVTSVTTADTAMYFCAR AQRGKRIYGVVSLGEYYHYYIMDV WGTGTPVTVSS
AbV-9H QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCSVSGDSMN NYYWT WIRQSPGKGLEWIG YISDRASATYNPSLNS RVVISRDTSKNQLSLKLNSVTPADTAVYYCAT ARRGQRIYGEVSFGEFFYYYSMDV WGKGTAVTVSS
경쇄 아미노산 서열들
KABAT FWR1 CDR1 FWR2 CDR2 FWR3 CDR3 FWR4
AbV-1L TDSVASDVAMSVAPGDTATISC GEKSNGARAVQ WYQQKPGQAPVLIIY NNQDRPS GIPERFSASPDAGFGTTATLTISRVEAGDEADYYC HIWDSRFPLSWV FAGGTKLTVL
AbV-2L GSVTSFVRPLSVALGETASISC GRQALGSRAVQ WYQHRPGQAPVLLIY NNQDRPS GIPERFSGTPDINFGTRATLTISGVEAGDEADYYC HMWDSRSGFSWS FGGATRLTVL
AbV-3L HCTGAVSSFVSVAPGQTARITC GEESLGSRSVI WYQQRPGQAPSLIIY NNNDRPS GIPERFSGSPGSTFGTTATLTITSVEAGDEADYYC HIWDSRRPTNWV FGEGTTLTVL
AbV-4L HCTGAVSSFVSVAPGQTARITC GEESLGSRSVI WYQQRPGQAPSLIIY NNNDRPS GIPERFSGSPGSTFGTTATLTITSVEAGDEADYYC HIWDSRRPTNWV FGEGTTLTVL
AbV-5L HCTASLASSMSVSPGETAKISC GKESIGSRAVQ WYQQKPGQPPSLIIY NNQDRPA GVPERFSASPDFRPGTTATLTITNVDAEDEADYYC HIYDARGGTNWV FDRGTTLTVL
AbV-6L HCTGSLASSMSVSPGETAKISC GKESIGSRAVQ WYQQKPGQPPSLIIY NNQDRPA GVPERFSASPDFRPGTTATLTITNVDAEDEADYYC HIYDARGGTNWV FDRGTTLTVL
AbV-7L HCTASVTSDISVAPGETARISC GEKSLGSRAVQ WYQHRAGQAPSLIIY NNQDRPS GIPERFSGSPDSAFGTTATLTITSVEAGDEADYYC HIWDSRVPTKWV FGGGTTLTVL
AbV-9L-a (AbV-2L) GSVTSFVRPLSVALGETASISC GRQALGSRAVQ WYQHRPGQAPVLLIY NNQDRPS GIPERFSGTPDINFGTRATLTISGVEAGDEADYYC HMWDSRSGFSWS FGGATRLTVL
AbV-9L-b
(10-847) 		XXXXSYVRPLSVALGETASISC GRQALGSRAVQ WYQHRPGQAPILLIY NNQDRPS GIPERFSGTPDINFGTRATLTISGVEAGDEADYYC HMWDSRSGFSWS FGGATRLTVL
중쇄 및 경쇄 쌍
명칭 SEQ ID NO
가변 영역 CDR 1 내지 3
중쇄 (H) 경쇄 (L) 중쇄 (H) 경쇄 (L)
AbV-1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO: 17 내지 19 SEQ ID NO: 20 내지 22
AbV-2 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO: 23 내지 25 SEQ ID NO: 26 내지 28
AbV-3 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO: 29 내지 31 SEQ ID NO: 32 내지 34
AbV-4 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO: 35 내지 37 SEQ ID NO: 38 내지 40
AbV-5 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO: 41 내지 43 SEQ ID NO: 44 내지 46
AbV-6 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO: 47 내지 49 SEQ ID NO: 50 내지 52
AbV-7 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO: 53 내지 55 SEQ ID NO: 56 내지 58
AbV-8 SEQ ID NO:15 N/A SEQ ID NO: 59 내지 61 N/A
AbV-9 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO: 62 내지 64 SEQ ID NO: 26 내지 28
SEQ ID NO:65 SEQ ID NO: 62 내지 64 SEQ ID NO: 66 내지 68
배제된 중쇄 아미노산 서열들
KABAT FWR1 CDR1 FWR2 CDR2 FWR3 CDR3 FWR4
GL QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS SYYWS WIRQPPGKGLEWIG YIYYSGSTNYNPSLKS RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR TQQGKRIYGVVSFGDYYYYYYMDV WGKGTTVTVSS
공통 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGX1SX2X3 DX4YWS WIRQSPGKGLEWIG YVHDSGDTNYNPSLKS X5X6SLDTSKNQVSLKLX7X8VTAADSAX9YYCAR AX10HGX11RIYGIVAFGEX12FTYFYMDV WGKGTTVTVSS
10-1369 QVQLQESGPGLVKPLETLSLTCNVSGAFIA DHYWS WIRLPLGKGPEWIG YVHDSGDINYNPSLKN RVHLSLDKSTNQVSLKLMAVTAGDSALYYCAT TKHGRRIYGVVAFGEWFTYFYMDV WGRGTTVTVSS
10-259 QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCNVSGTLVR DNYWS WMRQPLGKQPEWIG YVHDSGDTNYNPSLKS RVHLSLDKSNNLVSLRLTAVTAADSATYYCAT TKHGRRIYGIVAFNEWFTYFYMDV WGKGTTVTVSS
10-303 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIS DSYWS WIRRSPGKGLEWIG YVHKSGDTNYSPSLKS RVNLSLDTSKNQVSLSLVAATAADSGKYYCAR TLHGRRIYGIVAFNEWFTYFYMDV WGNGTQVTVSS
10-410 QVQLQESGPGLVKPPETLSLTCSVSGASVN DAYWS WIRQSPGKRPEWVG YVHHSGDTNYNPSLKR RVTFSLDTAKNEVSLKLVALTAADSAVYFCAR ALHGKRIYGIVALGELFTYFYMDV WGKGTTVTVSS
10-1130 QVQLQESGPGLVKPPETLSLTCSVSGASIN DAYWS WIRQSPGKRPEWVG YVHHSGDTNYNPSLKR RVTFSLDTAKNEVSLKLVDLTAADSAVYFCAR ALHGKRIYGIVALGELFTYFYMDV WGKGTTVTVSS
10-1121 QVQLQESGPGLVKPPETLSLTCSVSGASIN DAYWS WIRQSPGKRPEWVG YVHHSGDTNYNPSLKR RVSFSLDTAKNEVSLKLVDLTAADSAIYFCAR ALHGKRIYGIVALGELFTYFYMDV WGKGTTVTVSS
10-1146 QVQLVESGPGLVTPSETLSLTCTVSNGSVS GRFWS WIRQSPGRGLEWIG YFSDTDRSEYSPSLRS RLTLSLDASRNQLSLKLKSVTAADSATYYCAR AQQGKRIYGIVSFGEFFYYYYMDA WGKGTAVTVSS
10-996 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSNGSVS GRFWS WIRQSPGRGLEWIG YFSDTEKSNYNPSLRS RLTLSVDASKNQLSLKLNSVTAADSATYYCAR TQQGKRIYGVVSFGEFFHYYYMDA WGKGTAVTVSS
10-1341 QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCSVSGDSMN NYYWT WIRQSPGKGLEWIG YISDRESATYNPSLNS RVVISRDTSTNQLSLKLNSVTPADTAVYYCAT ARRGQRIYGVVSFGEFFYYYSMDV WGRGTTVTVSS
10-847 QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCSVSGDSMN NYYWT WIRQSPGKGLEWIG YISDRASATYNPSLNS RVVISRDTSKNQLSLKLNSVTPADTAVYYCAT ARRGQRIYGVVSFGEFFYYYSMDV WGKGTTVTVSS
10-1074 QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCSVSGDSMN NYYWT WIRQSPGKGLEWIG YISDRESATYNPSLNS RVVISRDTSKNQLSLKLNSVTPADTAVYYCAT ARRGQRIYGVVSFGEFFYYYSMDV WGKGTTVTVSS
10-1074GM QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCSVSGDSMN NSYWT WIRQSPGKGLEWIG YISKSESANYNPSLNS RVVISRDTSKNQLSLKLNSVTPADTAVYYCAT ARHGQRIYGVVSFGEFFTYYSMDV WGKGTTVTVSS
배제된 경쇄 아미노산 서열들
KABAT FWR1 CDR1 FWR2 CDR2 FWR3 CDR3 FWR4
GL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITC GGNNIGSKSVH WYQQKPGQAPVLVVY DDSDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC QVWDSSSDHPWV FGGGTKLTVL
Consensus SX1VRPQPPSLSVAPGETARIX2C GEX3SLGSRAVQ WYQQRPGQAPSLIIY NNQDRPS GIPERFSGSPDX4X5FGTTATLTITX6VEAGDEADYYC HIWDSRX7PTX8WV FGGGTTLTVL
10-1369 SSMSVSPGETAKITC GEKSIGSRAVQ WYQKKPGQPPSLIIY NNQDRPS GVPERFSASPDIEFGTTATLTITNVEAGDEADYYC HIYDARRPTNWV FDRGTTLTVL
10-259 SSMSVSPGETAKISC GKESIGSRAVQ WYQQKSGQPPSLIIY NNQDRPS GVPERFSATPDFGAGTTATLTITNVEADDEADYYC HIYDARGGTNWV FDRGATLTVL
10-303 SDISVAPGETARISC GEKSLGSRAVQ WYQHRAGQAPSLIIY NNQDRPS GIPERFSGSPDSPFGTTATLTITSVEAGDEADYYC HIWDSRVPTKWV FGGGTTLTVL
10-1121 SFVSVAPGQTARITC GEESLGSRSVI WYQQRPGQAPSLIMY NNHDRPS GIPERFSGSPGSTFGTTATLTITSVEAGDEADYYC HIWDSRRPTNWV FGEGTTLTVL
10-410 SFVSVAPGQTARITC GEESLGSRSVI WYQQRPGQAPSLIIY NNNDRPS GIPERFSGSPGSTFGTTATLTITSVEAGDEADYYC HIWDSRRPTNWV FGEGTTLTVL
10-1130 SFVSVAPGQTARITC GEESLGSRSVI WYQQRPGQAPSLIIY NNNDRPS GIPERFSGSPGSTFGTTATLTITSVEAGDEADYYC HIWDSRRPTNWV FGEGTTLTVL
10-847 SYVRPLSVALGETASISC GRQALGSRAVQ WYQHRPGQAPILLIY NNQDRPS GIPERFSGTPDINFGTRATLTISGVEAGDEADYYC HMWDSRSGFSWS FGGATRLTVL
10-1074 SYVRPLSVALGETARISC GRQALGSRAVQ WYQHRPGQAPILLIY NNQDRPS GIPERFSGTPDINFGTRATLTISGVEAGDEADYYC HMWDSRSGFSWS FGGATRLTVL
10-1341 SYVRPLSVALGETARISC GRQALGSRAVQ WYQHRPGQAPILLIY NNQDRPS GIPERFSGTPDINFGTRATLTISGVEAGDEADYYC HMWDSRSGFSWS FGGATRLTVL
10-996 SSLPLSVAPGATAKIAC GEKSFASRAVQ WYQQKPGQAPVLIIY NNQDRPA GVSERFSGTPDVGFGSTATLTISRVEAGDEADYYC HKWDSRSPLSWV FGGGTQLTVL
10-1146 SSLPLSLAPGATAKIPC GEKSRGSRAVQ WYQQKPGQAPTLIIY NNQDRPA GVSERYSGNPDVAIGVTATLTISRVEAGDEAEYYC HYWDSRSPISWV FGGWTQLTVL
서열 목록
SEQ ID NO:1 내지 16 - 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열들:
SEQ ID NO:1 -
QMQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSVSGNIWSWIRQSPGKGPEWVGFVSGEYIEYNPSLKSRLTISRD
TSKNQLSLTLRSVTAADTAMYYCAKTLRARRIYGVIAFGEVYDYHYFDVWGKGTMVTVSS
SEQ ID NO:2 -
TDSVASDVAMSVAPGDTATISCGEKSNGARAVQWYQQKPGQAPVLIIYNNQDRPSGIPERFSASPDAGFGT
TATLTISRVEAGDEADYYCHIWDSRFPLSWVFAGGTKLTVL
SEQ ID NO:3 -
QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCSVSGDSMNNYYWTWIRQSPGKGLEWIGYVSDRASATYNPSLKSRVVISR
DTSKNQLSLKLNSVTLADTAVYYCATARRGQRIYGEVAFGEFFYYYSMDVWGKGTAVTVSS
SEQ ID NO:4 -
GSVTSFVRPLSVALGETASISCGRQALGSRAVQWYQHRPGQAPVLLIYNNQDRPSGIPERFSGTPDINFG
RATLTISGVEAGDEADYYCHMWDSRSGFSWSFGGATRLTVL
SEQ ID NO:5 -
QLQLQESGPGLVKPPETLSLTCSVSGASINDAYWSWIRQSPGKRPEWVGYVHHSGDTNYNPSLKRRVTFSL
DTAKNEVSLKLVALTAADSAVYFCARALHGKRIYGTVALGELFVYFHMDVWGKGTAVTVSS
SEQ ID NO:6 -
HCTGAVSSFVSVAPGQTARITCGEESLGSRSVIWYQQRPGQAPSLIIYNNNDRPSGIPERFSGSPGSTFGT
TATLTITSVEAGDEADYYCHIWDSRRPTNWVFGEGTTLTVL
SEQ ID NO:7 -
QLQLQESGPGLVKPPETLSLTCSVSGASINDAYWSWIRQSPGKRPEWVGYVHHSGDTNYNPSLKRRVTFSL
DTAKNEVSLKLVALTAADSAVYFCARALHGKRIYGTVALGELFVYFYMDVWGKGTAVTVSS
SEQ ID NO:8 -
HCTGAVSSFVSVAPGQTARITCGEESLGSRSVIWYQQRPGQAPSLIIYNNNDRPSGIPERFSGSPGSTFGT
TATLTITSVEAGDEADYYCHIWDSRRPTNWVFGEGTTLTVL
SEQ ID NO:9 -
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCNVSGTLVRDNYWSWIRQPLGKQPEWIGYVHDSGDTNYNPSLKSRVHLSL
DKSKNLVSLRLTGVTAADSAIYYCATTKHGRRIYGVVAFKEWFTYFYMDVWGKGTSVTVSS
SEQ ID NO:10 -
HCTASLASSMSVSPGETAKISCGKESIGSRAVQWYQQKPGQPPSLIIYNNQDRPAGVPERFSASPDFRPGT
TATLTITNVDAEDEADYYCHIYDARGGTNWVFDRGTTLTVL
SEQ ID NO:11 -
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCNVSGTLVRDNYWSWIRQPLGKQPEWIGYVHDSGDTNYNPSLKSRVHLSL
DKSKNLVSLRLTGVTAADSAIYYCATTKHGRRIYGVVAFKEWFTYFYMDVWGKGTSVTVSS
SEQ ID NO:12 -
HCTGSLASSMSVSPGETAKISCGKESIGSRAVQWYQQKPGQPPSLIIYNNQDRPAGVPERFSASPDFRPGT
TATLTITNVDAEDEADYYCHIYDARGGTNWVFDRGTTLTVL
SEQ ID NO:13 -
QMQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASISDSYWSWFRRSPGKGLEWIGYVHKSGDTNYSPSLKSRVNLSL
DASKNQVSLSLVAATAADSGKYYCARTLHGRRIYGIVAFNEWFTYFYMDVWGNGTQVTVSS
SEQ ID NO:14 -
HCTASVTSDISVAPGETARISCGEKSLGSRAVQWYQHRAGQAPSLIIYNNQDRPSGIPERFSGSPDSAFGT
TATLTITSVEAGDEADYYCHIWDSRVPTKWVFGGGTTLTVL
SEQ ID NO:15 -
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGASTSGQYWSWIRQSPGKGLEWIGYRSDSGDANYNPSLKSRVIISL
DTSRNQLSLNVTSVTTADTAMYFCARAQRGKRIYGVVSLGEYYHYYIMDVWGTGTPVTVSS
SEQ ID NO:16 -
QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCSVSGDSMNNYYWTWIRQSPGKGLEWIGYISDRASATYNPSLNSRVVISR
DTSKNQLSLKLNSVTPADTAVYYCATARRGQRIYGEVSFGEFFYYYSMDVWGKGTAVTVSS
SEQ ID NO 17 내지 64 - 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열:
SEQ ID NO:17 - GNIWS
SEQ ID NO:18 - FVSGEYIEYNPSLKS
SEQ ID NO:19 - TLRARRIYGVIAFGEVYDYHYFDV
SEQ ID NO:20 - GEKSNGARAVQ
SEQ ID NO:21 - NNQDRPS
SEQ ID NO:22 - HIWDSRFPLSWV
SEQ ID NO:23 - NYYWT
SEQ ID NO:24 - YVSDRASATYNPSLKS
SEQ ID NO:25 - ARRGQRIYGEVAFGEFFYYYSMDV
SEQ ID NO:26 - GRQALGSRAVQ
SEQ ID NO:27 - NNQDRPS
SEQ ID NO:28 - HMWDSRSGFSWS
SEQ ID NO:29 - GRQALGSRAVQ
SEQ ID NO:30 - NNQDRPS
SEQ ID NO:31 - HMWDSRSGFSWS
SEQ ID NO:32 - GEESLGSRSVI
SEQ ID NO:33 - NNNDRPS
SEQ ID NO:34 - HIWDSRRPTNWV
SEQ ID NO:35 - DAYWS
SEQ ID NO:36 - YVHHSGDTNYNPSLKR
SEQ ID NO:37 - ALHGKRIYGTVALGELFVYFYMDV
SEQ ID NO:38 - GEESLGSRSVI
SEQ ID NO:39 - NNNDRPS
SEQ ID NO:40 - HIWDSRRPTNWV
SEQ ID NO:41 - DNYWS
SEQ ID NO:42 - YVHDSGDTNYNPSLKSV
SEQ ID NO:43 - TKHGRRIYGVVAFKEWFTYFYMDV
SEQ ID NO:44 - GKESIGSRAVQ
SEQ ID NO:45 - NNQDRPA
SEQ ID NO:46 - HIYDARGGTNWV
SEQ ID NO:47 - DNYW
SEQ ID NO:48 - YVHDSGDTNYNPSLKS
SEQ ID NO:49 - TKHGRRIYGVVAFKEWFTYFYMDV
SEQ ID NO:50 - GKESIGSRA
SEQ ID NO:51 - NNQDRPA
SEQ ID NO:52 - HIYDARGGTNWV
SEQ ID NO:53 - DSYWS
SEQ ID NO:54 - YVHKSGDTNYSPSLKS
SEQ ID NO:55 - TLHGRRIYGIVAFNEWFTYFYMDV
SEQ ID NO:56 - GEKSLGSRAVQ
SEQ ID NO:57 - NNQDRPS
SEQ ID NO:58 - HIWDSRVPTKWV
SEQ ID NO:59 - GQYWS
SEQ ID NO:60 - YRSDSGDANYNPSLKS
SEQ ID NO:61 - AQRGKRIYGVVSLGEYYHYYIMDV
SEQ ID NO:62 - NYYWT
SEQ ID NO:63 - YISDRASATYNPSLNS
SEQ ID NO:64 - ARRGQRIYGEVSFGEFFYYYSMDV
SEQ ID NO:65 - 경쇄 가변 영역 서열:
SEQ ID NO:65 -
XXXXSYVRPLSVALGETASISCGRQALGSRAVQWYQHRPGQAPILLIYNNQDRPSGIPERFSGTPDINFGT
RATLTISGVEAGDEADYYCHMWDSRSGFSWSFGGATRLTVL
SEQ ID NO 66 내지 68 - 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열:
SEQ ID NO:66 - GRQALGSRAVQ
SEQ ID NO:67 - NNQDRPS
SEQ ID NO:68 - HMWDSRSGFSWS
SEQ ID NO 69 및 70 - 생식선 가변 영역 서열:
SEQ ID NO:69 -
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISV
DTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARTQQGKRIYGVVSFGDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS
SEQ ID NO:70 -
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTAT
LTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPWVFGGGTKLTVL
실시예
실시예 1 - AbV-1-9 항체의 특성화
HIV-1에 대한 중화 항체 반응 및 AbV1-9 항체에 의해 표적화된 에피토프를 더 잘 이해하기 위하여, 클레이드 A-감염된 환자로부터의 gp160-특이적 IgG 기억 반응을 지배하는 큰 클론 패밀리의 구성원들을 분리하였다. V3 루프의 서열, 결합 친화성, 중화 활성 및 탄수화물 인식을 AbV-1-9 항체에 대해 측정하였다. AbV-1-9를 암호화하는 B-세포 클론들을 분리하기 위해 분석을 수행하였다. AbV-1-9 클론들을 서열, 탄수화물 인식 및 중화 활성에 의해 구별되는 두 상이한 그룹으로 분리한다. 제1 그룹은 단백질-유리 글리칸에 검출 가능하게 결합하지 않음에도 불구하고 현저한 효능 및 폭을 나타낸다.
실시예 2 - k d 값의 측정
Kd를 다음의 분석에 의해 기술된 것과 같이 관심의 항체의 Fab 버전 및 그것의 항원으로 수행된 방사성 표지된 항원 결합 분석 (RIA)에 의해 측정한다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성을 Fab를 적정 시리즈의 미표지 항원의 존재하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 평형화한 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다 (예컨대 Chen et al.,　J. Mol. Biol.　293:865-881 (1999) 참조). 분석을 위한 조건을 수립하기 위하여, MICROTITER® 다중-웰 플레이트 (Thermo Scientific)를 50 mM의 나트륨 카보네이트 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체로 밤새 코팅하고, 계속해서 PBS 중의 2% (w/v) 우혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 연속 희석의 관심의 Fab와 혼합한다 (예컨대 Presta et al.,　Cancer Res.　57:4593-4599 (1997)에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치하게). 관심의 Fab를 그런 다음 밤새 인큐베이션한다; 그러나, 인큐베이션은 평형에 도달한 것을 보장하기 위하여 더 긴 시간 동안 계속할 수 있다 (예컨대 약 65시간). 그런 후에, 혼합물을 실온에서의 인큐베이션을 위해 (예컨대 1시간 동안) 포획 플레이트로 옮긴다. 그런 다음 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척한다. 플레이트를 건조시켰을 때, 150 μl/웰의 신틸런트(scintillant) (MICROSCINT-20TM; Packard)를 첨가하고, 플레이트를 TOPCOUNTTM 감마 카운터 (Packard) 상에서 10분 동안 카운팅한다. 최대 결합을 20% 이하를 나타내는 각 Fab의 농도를 경쟁 결합 분석에서의 사용을 위해 선택한다.
실시예 3 - k d 값의 측정
kd를 ~10 반응 유닛 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩이 있는 BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 25℃에서 사용하여 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 측정한다. 간단히 설명하면, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)을 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카르보다이이미드 염산염 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS)로 공급자의 설명서에 따라 활성화한다. 항원을 10 mM 아세트산 나트륨, pH 4.8을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후 5 μl/분의 유량으로 주사하여 커플링된 단백질의 대략 10 반응 유닛 (RU)을 이룬다. 항원을 주사한 후, 1 M 에탄올 아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제를 포함한 PBS (PBST) 중의 Fab의 2배 연속 희석 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 주사한다. 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 간단한 원-투-원 랭뮤어 결합 모델 (BIACORE® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 회합 및 해리 센소그램을 동시에 피팅시킴으로써 계산한다. 평형 해리 상수 (kd)를 koff/kon 비율로서 계산한다. 예컨대 Chen et al.,　J. Mol. Biol.　293:865-881 (1999) 참조. 만약 on-속도가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 106 M-1 s-1을 초과하면, on-속도는 분광계, 예컨대 정지-흐름 장착 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳이 달린 8000-시리즈 SLM-AMINCOTM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 측정되는 것과 같이 증가하는 농도의 항원의 존재하에, PBS, pH 7.2 중의 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 세기의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 퀀칭 기법을 사용함으로써 측정할 수 있다.
실시예 4 - HIV 도너 서열분석
각각 약 90,000개의 세포를 함유하고 있는, 환자로부터의 생물학적 샘플로부의 7개의 부분표본을 분획으로 분리하고 쌍형성 충실도를 분석하였다. 분석 결과 PCT/US2014/028925에 개시된 AbPair 기법을 사용하여 약 100,000개의 가능한 중쇄 - 경쇄 쌍 및 약 37,000개의 고신뢰도 천연 중쇄-경쇄 쌍이 유발되었다. 부분표본을 WO2012048341 및 WO2012048340에 개시된 AbSeq 기법으로 서열을 분석하였다.
실시예 5 - 신규한 bNAb 생물정보 발견 (도너내 유사성)
AbV1-9의 CDE3 아미노산 유사성을 환자 17 (Pt17)로부터 유래된 공지의 bNAb에 대해 측정하였다. 건강한 환자의 서열을 사용하여 허위양성(false positives)의 한계값을 보정하였고 유사성 컷오프 또는 한계값을 개발하였다. AbV1-9 항체들의 계통발생적 관련성을 전체 아미노산 서열을 사용하여 공지의 bNAb와 관련하여 분석하였다. 선택된 항체들의 다른 특징을 생식선 패밀리, 돌연변이 수준 등을 포함하여, 다른 공지의 bNAb 서열 특징들의 그런 특징들과 비교하였다. 결과: 7개의 고신뢰도 중쇄 및 경쇄 쌍 및 추론된 경쇄를 가지는 2개의 중쇄쌍을 찾았다 (AbV1-9).
실시예 6 - 실시예 2 내지 5에서 사용한 물질 및 방법
HIV 항체를 gp140-특이적 B-세포 포획 후에 클론하고 제조한다. 글리코엔지니어링된 항체를 다양한 중쇄 위치에서 잔기들을 치환함으로써 생성한다. 항-gpl40 항체의 HIV Env 단백질에 대한 결합 특성을 ELISA, SPR 및 글리칸 마이크로어레이 분석에 의해 분석한다. 중화는 (i) TZM.bl 세포에서의 루시페라제-기반 분석 및 (ii) 일차 HIV-1 변종으로의 감염을 사용한 PBMC-기반 분석을 사용하여 평가한다. 리간드 및 GL Fab 단편에 결합된 및 미결합된 AbV1-9의 구조를 고해상도로의 분자 대체에 의해 해결한다.
단일 B 세포 RT-PCR 및 Ig 유전자 분석
환자로부터 gpl40+CD19+IgG+　B 세포의 단일-세포 분류를 수행한다. PBMC, cDNA 합성 및 Ig 유전자의 네스티드 PCR 증폭을 수행한다. AbV1-9 클론성 변종에 의해 발현된 Igk 유전자를 PCR 증폭시킨다. 모든 PCR 생성물을 서열분석하고 Ig 유전자 용법, CDR3 분석 및 VH/VK 체세포성 과돌연변이에 대해 분석한다. 다중 서열 배열을 ClustalW 분석 기능이 포함된 MacVector 프로그램을 사용하여 수행하고, 네이버 연합(Neighbor Joining) 방법에 의해 계통수를 생성하는데 사용한다.
AbV1-9 항체의 생식선 (GL) 전구체 유전자 분절을 IgBLAST 및 IMGTdVV-QUEST를 사용하여 확인한다. 대표적인 GL 조상 서열을 구성하기 위하여, 가장 적은 수의 체세포성 과돌연변이를 함유한 항체의 IgH 및 IgL 서열을 IgBLAST의 GL 서열에 대해 배열한다. GL IgH 서열을 성숙한 VH 및 JH　유전자 분절을 그것들의 GL 대응물로 대체하고 N-영역 뉴클레오타이드 및 DH 유전자 분절을 포함하는 CDRH3 영역에 대해 10 내지 996개의 서열을 사용함으로써 구성한다. GL IgL 서열을 VL 3-21 *02 및 JL3*02 유전자 분절 서열로부터 조립한다.
항체의 클로닝 및 제조
정제된 소화된 PCR 생성물을 Igγ1- 또는 Igλ-발현 벡터에 클로닝하였다. IgH 및 Igλ 유전자를 함유하는 벡터를 그런 다음 서열을 분석하고 원래의 PCR 생성물 서열과 비교한다. 부위-지정 돌연변이생성 (QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit; Stratagene)을 사용하여 변종 항체를 제조한다. His-태그된 Fab를 생성하기 위하여, IgGl CH1 도메인과 이어서 6x-His 태그를 암호화하기 위해 VH　유전자를 6xHis-IgCyl 발현 벡터 g에 하위클로닝하였다. 돌연변이 항체를 암호화하는 IgH DNA 단편을 합성 미니유전자 (IDT)로서 얻어서 Igγ1- 발현 벡터에 하위클로닝한다.
항체 및 Fab 단편을 폴리에틸렌이민 (PEI)-침전 방법을 사용하여 기하급수적으로 성장하는 HEK 293T 세포 (ATCC, CRL-11268)로의 IgH 및 IgL 발현 플라스미드의 순간 트랜스펙션에 의해 제조한다. IgG 항체를 단백질 G 세파로오스 비드 (GE Healthcare)를 제조자의 설명을 따라 사용하여 친화성 정제한다. Fab 단편을 HisPurTM 코발트 수지 (Thermo scientific)를 사용하여 하기에 기술하는 바와 같이 친화성 정제한다.
HIV-1 Env 단백질
알라닌 돌연변이를 QuikChange S부위-지정 돌연변이생성 키트 (Stratagene)를 제조자의 설명을 따라 사용하여 pYU-2 gpl20 벡터에 도입한다. 동일한 과정을 사용하여 단일 알라닌 돌연변이를 pYU-2 gp120mutant　벡터에 도입시킴으로써 이중 글리칸 돌연변이를 생성한다. 부위-지정 돌연변이들을 DNA 서열분석에 의해 확인한다.
YU-2 gpl40, YU-2 gp120, HXB2c gp120core, HXB2c 2CCcore 단백질 및 YU-2 gp120 돌연변이 단백질을 암호화하는 발현 벡터들을 사용하여 HEK 293T 세포를 트랜스펙션한다. 고-만노오스-유일 YU-2 gp120 단백질을 생성하기 위하여, 25 μl의 키푸넨신 (Enzo Life Sciences)을 트랜스펙션시 첨가한다. 배양 상층액을 수득하고 10 mM 이미다졸, 50 mM 나트륨 포스페이트, 300 mM 염화나트륨; pH 7.4로 샘플의 완충제 교환을 허용하는 원심분리-기반 여과 장치를 사용하여 농축한다. 단백질을 친화성 크로마토그래피에 의하여 HisPurTM 코발트 수지 (Thermo scientific)를 제조자의 설명을 따라 사용하여 정제한다.
탈글리코실화 반응을 위해, PBS 중의 50 μg의 HEK 293T 세포-생성된 YU-2 gp120을 밤새 37℃에서 200 U의 PNGase F (New England Biolabs) 또는 10,000 U의 Endo Hf　(New England Biolabs)로, 변성제가 없는 그것들의 각각의 반응 완충액에서 소화시킨다. 원심분리 필터 (Amicon® Ultra, Millipore)를 사용한 PBS로의 완충제 교환 후에, 글리코시다제-처리된 g 120 (200 ng)을 SDS-PAGE에 의해 4 내지 12%의 NuPAGE 겔 (Invitrogen)과 이어서 은 염색 (Pierce 은 염색 키트, Thermo Scientific)을 사용하여 조사한다.
ELISA
고결합 96-웰 ELISA 플레이트 (Costar)를 밤새 100 ng/웰의 PBS 중의 정제된 gp120으로 코팅한다. 세척 후, 플레이트를 2시간 동안 2% BSA, 1 μl EDTA, 0.05% Tween-PBS (차단 완충액)로 차단한 후 26.7 nM 및 PBS 중의 7개의 연속적인 1:4 희석 농도에서의 IgG와 함께 2시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 플레이트를 염소 HRP-컨쥬게이션된 항-인간 IgG 항체 (Jackson ImmunoReseach)(차단 완충액 중의 0.8 μg/ml)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, HRP 발색 기질 (ABTS 용액, Invitrogen)을 첨가함으로써 전개시킨다. 선택된 gp120 중복 펩타이드에 대한 항체 결합을 앞서 기술한 펩타이드-ELISA 방법을 사용하여 시험한다.
경쟁 ELISA에 대해, gp120-코팅된 플레이트를 2시간 동안 차단 완충액으로 차단한 후 2시간 동안 PBS 중의 항체 경쟁자의 1:2 연속 희석된 용액 중의 비오티닐화된 항체와 함께 인큐베이션한다 (IgG 농도 범위는 5.2 내지 667 nM임). 플레이트를 상기 기술한 것과 같이 HRP-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘 (Jackson ImmunoReseach) (차단 완충액 중의 0.8 μg/ml)을 사용하여 전개시킨다. 모든 실험을 적어도 이중으로 수행한다.
글리칸 마이크로어레이 분석
마이크로어레이를 2가지 수준 (2 및 5 fmol/스팟)에서 이중으로 니트로셀룰로오스-코팅된 유리 슬라이드 상에서 지질에 결합된 글리칸 프로브를 로봇에 의해 인쇄함으로써 생성한다. 결합 분석을 고-만노오스 및 복합체-유형의 N-글리칸으로부터 유래된 15개의 네오 당지질을 함유하는 마이크로어레이를 사용하여 수행한다. 간단히 설명하면, 항체를 50 μg/ml에서 시험하고, 결합을 비오티닐화된 항-인간 IgG (Vector)와 이어서 AlexaFluor 647-표지된 스트렙트아비딘 (Molecular Probes)을 사용하여 검출한다.
표면 플라즈몬 공명
실험들을 Biacore T100 (Biacore, Inc.)을 사용하여 수행한다. 간단히 설명하면, YU-2 gpl40 및 gp120 단백질을 CM5 칩 (Biacore, Inc.) 상에 300 RU의 결합 밀도로 일차 아민-결합시킨다. 항-gp120 IgG 및 생식선 전구체 (GL)를 각각 1 μl 및 10 μl로, 35 μl /분의 유량으로 유동 세포 위에 주입하고, 이때 3분 회합 및 5분 해리 단계를 포함한다. 센서 표면을 50 μl /분의 유량으로 10 mM 글리신-HCl pH 2.5의 30초 주입에 의해 재생한다. 해리 (kd　(s-1)), 회합 (k&　(M-1　s-1)) 및 결합 상수 (KD, (M) 또는 KA (M-1))를 벌크 반사 지수 (RI) 교정 (Biacore T100 평가 소프트웨어)없이 1:1 결합 모델을 사용하여 바탕값을 뺀 후에 동역학 분석으로부터 계산한다.
중화 분석
바이러스 중화를 TZM.bl에서의 루시페라제-기반 분석을 사용하여 평가한다. 시험하기 위한 HIV-1 위바이러스(pseudovirus)는 대부분 등급-2 및 등급-3 바이러스를 함유한다. 고-만노오스-유일 위바이러스들을 25 μl의 키푸넨신 (Enzo Life Sciences)으로 처리된 야생형 세포에서 또는 HEK 293 S GnTI-/- 세포에서 생성한다. 비-선형 회귀 분석을 사용하여 절반-최대 억제가 관찰되는 농도 (IC50　값)를 계산한다. 중화 활성을 또한 1985와 1989 사이 (기존 n=14) 또는 2003과 2006 사이 (현대, n=21) 중 어느 하나의 공지의 혈청변환 날짜가 있는 클레이드 B-감염 도너로부터 분리된 일차 HIV-1 변종 (N=95)으로의 감염을 사용하여 앞서 특성화된 PBMC-기반 분석으로 평가한다.
각 항체에 대한 중화 활성을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여, 0.001 내지 50 μg/ml 범위의 IC50 값에 걸쳐 중화된 바이러스들의 비율에 맞는, 최상-피트 곡선 아래의 면적으로서 계산한다. 곡선 아래의 상대 면적 (RAUC) 값을 최고값에 의해 모든 AUC 값을 정상화함으로써 유도한다.
통계학적 분석
통계학적 분석을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행한다. 바이러스 스트레인들의 선택된 패널에 대한 TZM-bl 분석 대비 gp120 및 gp140에 대한 항체의 외관 결합 친화성에서 중화 효능들을 Spearman 상관 시험을 사용하여 분석한다. Mann Whitney 시험을 사용하여 (i) 항체의 gp120/gpl40에 대한 친화성 및 (ii) 기존의 및 현대의 혈청변환자로부터 분리된 바이러스들에 대한 중화 활성을 비교하였다.
결정화 및 구조 측정
결정화를 위해 6x-His 태그된 AbV1-9 Fab를 발현시킨다. Fab를 순간-트랜스펙션된 HEK 293-6E 세포의 상층액으로부터 순차적인 Ni-NTA 친화성 (Qiagen) 및 Superdex200 10/300 (GE Healthcare) 크기 축출 크로마토그래피에 의해 정제한다. 비-리간드 결합된 PGT121 Fab의 결정을 위해, PGT121 IgG를 순간-트랜스펙션된 HEK 293-6E 세포의 상층액으로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (Pierce)에 의해 분리하고, Fab 단편을 IgG의 파파인 절단 및 추가로 Superdex200 10/300 (GE Healthcare) 크기 축출 크로마토그래피를 사용한 정제에 의해 얻는다.
정제된 Fab를 PBS 완충액에서 8 내지 20 mg/mL로 농축한다. "리간드 결합된" AbV1-9 Fab 결정을 3배 몰 과잉의 NA2 글리칸과 혼합하여 20℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 단백질 샘플 (최종 농도: 15 mg/mL)로부터 제조한다. 결정화 조건을 20℃에서 Mosquito® 결정화 로봇 (TTP labs)을 사용하여 400 nL 드롭에서 1:1 단백질 대 저장소 비율을 사용하여 스크리닝한다. 비-리간드 결합된 AbV1-9 Fab의 결정을 24% PEG 4,000, 0.1 M Tris-HCl pH 8.5, 10 mM CuCl2에서 얻고 리간드 결합된 AbV1-9 Fab의 결정을 17% PEG 10,000, 0.1M Bis-Tris pH 5.5, 0.1M CH3COOHNH4에서 성장시킨다. AbV1-9 Fab의 결정을 25% PEG 3,350, 0.1 M Bis-Tris pH 5.5, 0.2 M NaCl에서 얻고, GL Fab의 결정을 20% PEG 3,350, 0.24 M 소디움 말로네이트 pH 7.0, 10 mM MnCl2에서 성장시킨다. 결정들은 20%의 글리세롤 또는 20%의 에틸렌 글리콜을 함유한 모액에 담금으로써 저온보호하고 계속해서 액체 질소에서 순간-냉각시킨다.
회절 데이터를 Pilatus 6M 픽셀 검출기 (Dectris)에서 빔라인(beamline) 12-2에서 수집한다. 데이터를 색인화하고, 통합하고 XDS를 사용하여 축척한다. 비-리간드 결합된 AbV1-9 Fab 결정들로부터 얻어진 데이터를 사용하여, Phenix를 사용하여 CDRH3 및 CDRL3 루프에서 잔기들을 생략한 후에 두 개의 탐색 모델, PGT128 Fab의 CH-CL　도메인 (PDB 암호 3PV3) 및 2F5의 VH-VL　도메인 (PDB 암호 3 ID J)을 사용하여 비대칭 유닛당 한 Fab에 대한 분자 대체 용액(molecular replacement solution)을 찾는다. 계속해서, 비-리간드 결합된 AbV1-9 구조를 탐색 모델로서 사용하여 리간드 결합된 AbV1-9 Fab (비대칭 유닛당 하나의 Fab) 및 GL (비대칭 유닛당 4개의 Fab)에 대한 분자 대체 용액을 찾는다.
반복적 보정 (GL에 대한 비-결정학적 대칭 규제를 포함함)을 Phenix 및 Coot를 사용한 전자 밀도 지도로의 모델의 수동 맞춤을 사용하여 수행한다. PyMOL을 분자 시각화를 위해 및 Fab 구조의 도형을 생성하기 위해 사용한다. 묻혀있는 표면적 계산을 Areaimol (CCP4 Suite)로 1.4 A 프로브를 사용하여 수행한다. Fab 구조를 PyMOL에서 슈퍼 스크립트(Super script)를 사용하여 배열한다. 쌍방식 Ca 배열을 PDBeFold를 사용하여 수행한다.
실시예 7 - 새로운 독특한 변종의 확인
AbV1-9 클론형 gp140-특이적 IgG 기억 B 세포의 우위성 및 다양성을 미끼로서 YU-2 gp140 트라이머를 사용하여 클레이드 A-감염된 아프리카 도너로부터 분리한다. 독특한 클론 패밀리에 상응하는 매칭용 면역글로불린 중쇄 (IgH) 및 경쇄 (IgL) 유전자들이 확인된다. IgH 유전자에서 과돌연변이의 고수준과 일치하게, 증폭된 Ig 유전자들은 고도로 돌연변이되고 뉴클레오타이드 변경을 포함한다.
새로운 독특한 변종이 발현되고 ELISA 및 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 YU-2 gp120 및 gp140에 결합하는 것이 증명될 수 있다. 다르게 표시되지 않는 한, 이것들 및 다른 실험들을 위해 gp120 및 gp140 단백질을, PNGS에 복합체-형 또는 고-만노오스 N-글리칸 중 어느 하나를 부착시킬 수 있는 포유류 세포에서 발현시킨다.
실시예 8 - 항원 인식에서 V3 루프의 역할
AbV1-9 항체에 의한 항원 인식에서 V3의 역할을 조사한다. ELISA를 VI-V3 루프가 결핍되거나 (gp120core) 또는 V3의 부분을 보유한 (2CC-core) HXB2 gp120 코어 단백질을 사용하여, 및 V3 줄디에 이중 알라닌 치환을 포함하고 있는 (gp120GD324_5AA) YU-2 gp120 돌연변이 단백질을 사용하여 수행한다. 항체는 무상 YU-2 gp120에 비교하여 V3 루프 및 gp120GD324 5AA가 결핍된 변종에 대해 감소된 반응성을 나타낼 수 있고 AbV1-9에 의한 인식이 V3 루프와 근접한 곳에 있는 단백질 결정기를 포함하는 것을 시사할 수 있다. 항체들 중 어느 것도 V3에 걸쳐 있는 중복 펩타이드에 결합할 수 없고, 이것은 표적화된 에피토프들이 불연속적이거나 및/또는 분리된 펩타이드에 의해 이루어지지 않은 특정 형태를 필요로 하는 것을 시사할 수 있다.
AbV1-9 항체에 의한 전체 글리칸 인식을 비교하기 위하여, 복합체-형 및 고-만노오스 N-글리칸을 둘 다 절단하는 PNGase F로 처리된 YU-2 gp120에 대한 그것들의 결합을 조사한다. gp120이 변성되지 않는 한 전체적으로 효소에 의해 탈글리코실화될 수 없기 때문에, PNGase F 처리는 천연적으로 접혀진 gp120의 부분적인 탈글리코실화를 초래한다. 그럼에도 불구하고, 항체의 각 기의 반응성은 PNGase F에 의한 gp120의 부분적인 탈글리코실화가 AbV1-9 항체의 결합 활성을 감소시킬 수 있다는 점에서 상이할 수 있다. 유사한 실험을 고-만노오스 N-글리칸을 절단하지만 복합체-형 N-글리칸을 절단하지 않는 Endo H로 처리된 YU-2 gp120로 수행하고, AbV1-9 항체보다는 다른 항체들의 결합에 영향을 미칠 수 있다.
N-글리칸 마이크로어레이는 많은 AbV1-9 항체가 다양한 복합체-형 모노- 또는 바이-안테나리 N-글리칸에 대해 검출 가능한 결합을 보이는 것을 나타낼 수 있다. 에피토프 지도화 실험을 각 그룹의 두 대표적인 구성원을 사용하여 경쟁 ELISA에 의해 수행한다. 항체는 교차-경쟁을 보일 수 있다. 표적화된 에피토프들을 추가로 지도화하기 위하여, V3 루프의 크라운, CD4b, 공동-수용체 결합 부위, 고-만노오스 N-글리칸의 무리 (2G12) 또는 위치 301 및 332에서 V3 루프 및 N-결합된 글리칸을 인식하는 항-gp120 항체를 사용한다. 항-V3 크라운 항체는 다른 것이 아니라, 이 항체들의 일부의 결합을 억제할 수 있다.
실시예 9 - 넓고 강력한 HIV 중화
AbV1-9 변종들의 중화 활성을 평가하기 위하여, TZM-bl 세포의 HIV 감염을 억제하는 능력을 gp120 위치 332에서 PNGS가 결핍된 R1166.cl을 포함하는 바이러스 스트레인들을 사용하여 시험한다. AbV1-9 변종들은 위바이러스들을 중화시키고 대조표준은 전혀 중화시키지 않는다. 중화 활성은 g 120/g 140에 결합하지 못하거나 패널의 임의의 바이러스를 중화시키지 못하는 PGT 121/10-1074 항체 클론형의 대표적인 생식선 버전 (GL) HIV 스파이크 A에 대한 친화성과 상관이 있고, 그것은 체세포성 돌연변이가 결합 및 중화에 필요한 것을 함축한다. GL 경쇄와 돌연변이된 중쇄의 쌍을 이루는 것은 결합 또는 중화를 보장하지 못하며, 이것은 항체 파라토프의 적절한 조립에 두 돌연변이된 사슬이 모두 기여하는 것을 시사한다.
다음 분석을 위바이러스를 중화시키기 어려운 연장 패널에 대한 AbV1-9의 중화 활성을 비교하기 위해 수행한다. 예상과 같이, gp120 위치 332 및/또는 334에 (Asn332-X-Ser334/Thr334 PNGS에 걸쳐있는) 아미노산 변화를 가지고 있는 대부분의 바이러스는 중화에 대해 내성이다. 이 PNGS에서의 돌연변이는 중화에 대해 내성인 대부분의 바이러스를 설명해준다. 비교할만한 중화 활성을 의 IgG 및 Fab 형태에 대해 관찰하는데, 이것은 이가성(bivalency)이 그것들의 활성에 중요하지 않은 것을 시사한다.
AbV1-9에 의한 중화에서 HIV 엔벨로프에 미치는 복합체-형 N-글리칸의 잠재적 역할을 평가하기 위하여, 고-만노오스-유일 비리온을 두 가지 상이한 방법: Man9GlcNAc2　N-결합 글리칸을 초래하는, 키푸넨신으로 처리된 세포에서 위바이러스들을 조립함으로써, 또는 Man5GlcNAc2　N-결합 글리칸을 초래하는 HEK 293 S GnTI-/- 세포에서 조립함으로써 제조한다. AbV1-9는 야생형에서 생성된 대응물과 동등하게 3개의 키푸넨신-유래된 스트레인 중 2개를 중화시킨다. GnTI-/- 세포에서 생성된 두 바이러스 스트레인은 야생형 세포에서 생성된 대응물과 동등하게 AbV1-9에 대해 민감하다. 항체 결합으로부터 CD4 결합 부위를 부분적으로 보호하는 이전의 보고와 일치하게, GnTI-/- 세포에서 생성된 바이러스들은 CD4-결합 부위 항체들에 더 민감하다.
실시예 10 - 새롭게 전파된 HIV-1
전파된 시초 바이러스들에 대한 AbV1-9의 활성을 말초혈 단핵세포 (PBMC)-기반 분석에서 1985년도와 1989년도 사이 (기존, n=14) 또는 2003년도와 2006년도 사이 (현대, n=25)에 혈청변환된 개체들의 집단으로부터 분리된 클레이드 B 바이러스들을 사용하여 평가함으로써 시험한다. AbV1-9를 항-CD4b bNAb 및 VRCO1, PG9/PG16, bl2, 2G12, 4E10 및 2F5를 포함하는 다른 bNAb와 비교한다. 중화 활성의 클러스터링 분석은 두 그룹으로의 분리를 나타냈다: 한 그룹은 항-CD4bs 및 PG9 항체를 포함하여 대부분의 활성 HIV 중화제를 함유한다. AbV1-9는 이 클레이드 B 바이러스 패널에 대해 예외적인 중화 효능을 보인다.
실시예 11 - AbV1-9 및 GL의 결정 구조
AbV1-9 항체들 사이의 구조적 결정기 차이를 조사하기 위하여, AbV1-9 및 대표적인 생식선 전구체 (GL)의 Fab 단편의 결정 구조를 측정한다. 3개의 Fab 중에서 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (VR　및 VL)의 중첩은 백본 구조의 보존을 나타내며, 차이는 GL에 비하여 친화성-성숙된 Fab의 CDRH3 및 CDRL3 루프의 적은 대체에 제한되는 것이다.
Asn332gp120- 및 Asn301gp120-결합된 글리칸 및 V3을 인식하고 복합체-형 N-글리칸-변형된 단백질을 생성할 수 없는 세포에서 발현된 외부 도메인/미니-V3 루프 gp120과의 복합체로서 해결되는 항체들의 구조를 비교한다.
실시예 12 - AbV1-9-글리칸 복합체의 결정 구조
복합체-형 시알릴화된 바이-안테나리 글리칸과 회합된 AbV1-9의 구조를 NA2를 포함하는 조건하에서 얻어진 결정들을 사용하여 해결한다.
실시예 13 - 글리칸-접촉 항체 잔기들의 치환은 중화에 영향을 미친다
리간드 결합된 AbV1-9 구조들로부터 확인된 복합체-형 N-글리칸 접촉 잔기들의 기여도를 평가하기 위하여, 복합체-형 글리칸-접촉 잔기들을 교환하기 위해 디자인된 돌연변이 항체들을 생성한다. 글리코엔지니어링된 항체들은 SPR에 의해 측정되는 바 YU-2 gp120/gp140에 대하여 거의 야생형 외관 친화성을 나타내며, 이것은 치환이 두 AbV1-9에 의해 중화된 바이러스 스트레인으로부터 유래된 엔벨로프 스파이크에 대한 결합을 파괴하지 않는 것을 증명한다. 야생형 AbV1-9와 달리, AbV1-9GM은 마이크로어레이 실험에서 글리칸 결합을 나타내지 않는다. 다음에, TZM-bl-기반 분석을 사용하여 야생형 및 글리코엔지니어링된 항체의 중화를 비교한다. 바이러스 스트레인들을 시험한다.
실시예 14 - 생체내에서 항-HIV-1 중화 mAb의 수동 전달
AbV1-9 항-HIV 중화 단클론성 항체를 히말라야 원숭이(rhesus macaque)에게 투여하고 그것을 두 상이한 SHIV 중 어느 하나로 24시간 후에 직장내로 도전시켰다. 60마리의 도전 동물로부터 얻어진 결과들을 조합함으로써, 노출된 원숭이들의 50%에서 바이러스 획득을 방지하는 혈장의 보호 중화 역가는 대략 1:100이다.
동물 실험
이 연구에서 사용한 원숭이(macaque)는 MHC 부류 I Mamu-A*01 대립유전자에 대해 네거티브이다. SHIVAD8EO의 5' 및 3' 절반에 상응하는 프라이머들을 사용한 R5-향성(tropic) SHIVDH12- V3AD8 PCR 돌연변이생성의 구성을 사용하여, pSHIVDH12_CL7 분자 클론의 유전자 배경에 이 V3 서열들을 백금 PFX DNA 중합효소 (Invitrogen)를 사용하여 도입한다. 겔 정제 후에, PCR 생성물을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제 (GibcoBRL)로 처리하고 블런트-단부를 결찰시켜서 경쟁 세포들을 형질전환하는 데 사용한다.
바이러스
바이러스 스톡을 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 SHIVAD8EO 또는 SHIVDH12-V3AD8 분자 클론으로 293T 세포를 첫 번째 트랜스펙션함으로써 제조한다. 배양 상층액을 48시간 후에 수집하고 부분표본들을 사용할 때가지 -80℃에서 보관한다. 콘카나발린 A-자극된 붉은털 원숭이 PBMC (500 μl 중의 2 x 106　세포)를 1시간 동안 회전 접종(spinoculation)에 의해 트랜스펙션된 세포 상층액으로 감염시키고, 동일한 수/부피의 활성화된 PBMC와 혼합하고, 매일 배양 배지를 대체하면서 배양을 적어도 12일 동안 유지한다. 상층액 배지의 샘플을 대략 피크 RT 생성 시점에 모아서 개별적인 바이러스 스톡을 제조한다.
항체
11개의 단클론성 항체 (VRCOl, NIH45-46, 45-46G54W, 45-46m2, 3BNC117, 12A12, 1NC9, and 8ANC195, 10-1074, PGT121 및 PGT126)를 분리 및 제조한다. DEN3, 뎅기열 바이러스 NS1-특이적 인간 IgGl 단클론성 항체 또는 대조표준 인간 IgG를 이 연구에서 네거티브 대조표준 항체로서 사용한다. 사전-노출 수동 전달을 위한 선택을 위한 단클론성 항체를 바이러스 도전 24시간 전에 정맥내로 투여한다.
혈장 바이러스 RNA 수준의 정량
혈장의 바이러스 RNA 수준을 실시간 역전사-PCR (ABI Prism 7900HT 서열 검출 시스템: Applied Biosystems)에 의해 측정한다.
혈장의 항체 농도
원숭이 혈장에서 투여된 단클론성 항체의 농도를 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의하여 재조합 HIV-1JRFL gp120 (Progenies Pharmaceuticals) 또는 HIVIIIB (Advanced Biotechnology Inc.)를 사용하여 측정한다. 간단히 설명하면, 미소적정 플레이트를 HIV-1 gp120 (2 μg/ml)로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/0.05% Tween-20으로 세척하고 1% (부피/부피) BSA로 차단한다. 차단 후에, 항체 또는 혈장 샘플의 연속 희석을 플레이트에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 결합을 알칼리성 포스파타제 (Pierce)에 커플링된 염소 항-인간 IgG F(ab)2 단편으로 검출하고 SIGMAFAST OPD (Sigma-Aldrich)로 가시화한다. 중화 단클론성 항체의 감쇠 반감기를 항체 투여 후 5일 또는 7일에 시작하여 혈장 농도를 기반으로 단일 지수 감쇠 식에 의해 계산한다.
중화 분석
히말라야 원숭이로부터 수집한 혈장 샘플에 존재하는 각 mAb의 시험관내 효능 및 중화 활성을 두 가지 유형의 중화 분석에 의해 평가한다: 1) 슈도타입의 도전 바이러스를 사용한 TZM-bl 유입 분석 또는 복제 경쟁 바이러스를 사용한 14일 PBMC 복제 분석. TZM-bl 분석을 위해, 연속적으로 희석된 mAb 또는 혈장 샘플을 SHIVAD8EO 또는 SHIVDH12_V3AD8로부터 유래되고 293T 세포를 각각의 엔벨로프 단백질을 발현하는 pNLenvl 및 pCMV 벡터로 공트랜스펙션함으로써 제조된 env 유전자를 발현하는, 슈도타입의 바이러스들과 인큐베이션한다. 50%> 중화 억제 용량 (IC50) 역가를 세포 대조표준 상대 발광 유닛 (RLU)을 뺀 후에 바이러스 대조표준 웰의 수준과 비교하여 RLU의 50%> 감소를 유발하는 희석으로서 계산한다. SHIVDH12_ V3AD8 분자 클론의 중화 표현형 (등급 수준)을 TZM-bl 세포 분석에 의해, 아형 B HIV-1에 대해 광범위한 중화 활성을 나타내는, 집단 연구로부터의 혈장 샘플을 사용하여 측정한다.
동물 보호 역가의 측정 및 통계학적 분석
바이러스-도전된 동물의 50 또는 80%의 바이러스 획득의 방지를 초래하는, 각 R5 SHIV에 대한 혈장의 중화 역가의 계산을 수행한다. 프로빗 회귀를 사용하여 수동 면역화된 모든 원숭이를 사용하여 생체내에서 멸균력이 있는 면역성을 부여하기 위해 필요한 혈장의 역가와, 가능성 비율 시험을 기반으로 한 이 모델로부터의 p-값 사이의 관계를 모델화한다. 상이한 수준 (33%, 50%, 80%, 90% 및 95%>)의 생체내 보호에 필요한 혈장 역가를 프로빗 모델 산정값으로부터 측정하고 부트스트랩 방법을 사용하여 90%를 넘는 신뢰도 간격을 세운다.
수동 전달 실험들에 대한 프로토콜은 감소하는 양의 중화 mAb를 정맥내로 투여하고 24시간 후에 동물들을 직장내로 도전하기 위한 것이다. 목표는 개별적인 원숭이들에 대한 인간화된 항-HIV mAb의 반복되는 투여가 그것들의 효능 및/또는 아마도 과민성 반응, 단일 접종이 선택된 후에 생체내 감염을 수립하기 위해 충분한 크기의 SHIV 도전 용량을 감소시킬 수 있을 것이라는 지식과 결부되어, 바이러스 획득을 차단하는 것이다.
첫 번째 수동 전달 실험을 위한 대조표준으로서, 항-뎅기열 바이러스 NS1 IgG1 mAb를 동물에게 정맥내로 투여하고, 그 동물을 24시간 후에 SHIVAD8EO로 도전한다. VRCO1이 바이러스 획득에 대한 보호에 대해 시험된 첫 번째 항-HIV-1 중화 mAb인데, 50 mg/kg의 용량으로 두 마리의 원숭이에게 투여한다. 두 마리의 접종된 원숭이 중 한 마리 (DEGF)는 SHIVAD8EO 도전으로부터 완전히 보호된다. 50 mg/kg VRCO1의 다른 수령체 (DEH3)는 감염되지만, 피크 플라스마 바이러스혈증을 보인다. 두 마리의 추가 원숭이에게 더 적은 양 (20 mg/kg)의 VRCO1을 투여하고 SHIVAD8EO 도전으로부터 보호되지 않는다. VRCO1 및 AbV1-9 mAb가 SHIVDH12-V3AD8 획득을 차단하는 능력은 유사하게 평가된다.
수동으로 전달된 원숭이들로부터 다양산 시간에 수집한 혈장 샘플들을 HIV-1 gp120 ELISA에 의해 분석하여 중화 mAb 농도를 측정한다. 일반적으로, 도전 시간 (항체 투여 후 24시간 후) 각 mAb의 혈장 농도는 투여된 항체의 용량과 상관된다.
중화 역가를 원숭이들을 SHIVAD8EO 또는 SHIVDH12-V3AD8로 도전했을 때 mAb 투여 후 24시간 후에 수집한 혈장 샘플들에 대해 측정한다. 그런 다음 도전된 원숭이들의 50%에서 바이러스 획득을 방지하기 위해 필요한 혈장에서 측정된 중화 역가를 계산한다.
실시예 15 - 생체내 모델에서 만성 감염된 HIV에 대한 중화 mAb의 투여
SHIVAD8EO에 대하여 광범위하게 작용하는 중화 mAb의 중화 활성을 SHIVAD8EO에 대한 TZM-bl 세포 시스템에서 초기에 측정한다. R5-향성 SHIVAD8EO로 도전된 만성 감염된 동물에서 바이러스 획득을 차단하거나 플라스마 바이러스혈증을 제어하는 능력을 혈장 바이러스 로드 및 세포-회합된 바이러스 핵산을 모니터링함으로써 평가하고; CD4+ T 세포 하위세트의 수준을 유동 세포분석에 의해 측정한다. 순환하는 바이러스 변종의 SGA 분석 및 혈장의 항체 수준의 측정. NAb의 혈장 농도를 10-1074 또는 3BNC117 중 어느 하나에만 민감한 HIV-1 위바이러스 제제에 대한 중화 활성을 측정함으로써 측정한다.
실시예 16 - 454 서열분석 라이브러리 제제
역전사를 10 μL의 총 RNA 및 2 μL의 RT 프라이머 믹스(mix) (50 μM 올리고-dT 및 25 μM 무작위 헥사머)을 사용하여 수행한다. 혼합물을 95℃에서 1분 동안, 65℃에서 5분 동안 가열한 후, 얼음에서 1분 동안 냉각시킨다. 각 반응에 대해, 믹스를 4 μL의 5x FS 완충제, 1 μL의 10 mM dNTP 믹스, 1 μL의 0.1 M DTT, 1 μL의 RNase 억제제 (Enzymatics) 및 1 μL의 SuperScript III RT (Invitrogen)로 제조한다. 이 믹스를 반응에 첨가하고 25℃에서 10분 동안, 35℃에서 5분 동안, 55℃에서 45분 동안, 및 85℃에서 5분 동안 인큐베이션한다. 4 μL의 대장균 RNase H (Enzymatics)를 첨가함으로써 RNA/DNA 하이브리드를 제거한다. PCR 반응을 13.75 μL의 물, 5 μL의 cDNA, 5 μL의 5x HF 완충제, 0.5 μL의 10 mM dNTP, 0.25 μL의 각 100 μM 프라이머 스톡 및 0.25 μL의 Phusion Hot Start를 사용하여 어셈블링한다. 반응을 98℃ (60초), 98℃ (10초) 24 사이클, 62℃ (20초) 및 72℃ (20초)로 순환시키고, 최종 연장은 72℃ (5분)이다. 샘플을 QIAquick 칼럼상에서 정제하고 2% 아가로오스 E-겔상에서 이동하게 한다. 원하는 밴드를 Qiagen MinElute 겔 추출 키트를 사용하여 정제하고, 10 μL의 EB 완충제로 2회 용출한 후, 2100 Bioanalyzer에서 정량한다. 샘플을 454개의 서열분석을 위해 SeqWright에 이송하고, 제조자의 설명대로 서열분석을 수행한다.
실시예 17 - 위바이러스 제조 및 중화 분석
위바이러스를 제조하기 위하여, Env를 암호화하는 플라스미드를 Env-결핍 게놈 백본 플라스미드 (pSG3Env)로, 트랜스펙션 시약 Fugene 6 (Promega)과의 1:2 비율로 공동-트랜스펙션한다. 위바이러스를 중화 분석에 사용하기 위하여 트랜스펙션 후 72시간 후에 수득한다. 중화 활성을 단일 라운드의 복제 위바이러스 분석 및 앞서 기술된 것과 같은 TZM-bl 표적 세포를 사용하여 평가한다.
실시예 18 - 인간 표본
말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 집단으로부터의 HIV-1 감염 도너인 도너 17로부터 얻는다. 모든 인간 샘플을 적절한 기관감사위원회에 의해 승인된 임상 프로토콜하에 고지에 입각한 동의로 수집한다.
실시예 19 - 세포 분류 및 RNA 추출
10x106 PBMC의 냉동 바이알을 해동하고 세척한 후에 Pacific Blue 표지된 항-CD3 (UCHT1), Pacific Blue 표지된 항-CD14 (M5E2), FITC 표지된 항-CD19 (HIB19), PE-Cy5 표지된 항-CD10 (HI10a), PE 표지된 항-CD27 (M-T271) 및 APC 표지된 항-CD21 (B-ly4) (모두 BD Biosciences 제품)로 염색한다. 분류는 miRVana 용해 완충액 (Ambion)으로의 고속 BD FACSAria에서 수행한다. 미성숙 B 세포, 소모된 조직-유사 기억, 활성화된 성숙 B 세포, 휴지기 기억 B 세포 및 단기-생존 말초 형질모세포를 앞서 기술한 markers31을 사용하여 염색한다. 그런 다음 세포로부터의 총 RNA를 miRVana RNA 추출 키트 (Ambion)를 제조자의 설명을 따라 사용하여 추출하고 2100 Bioanalyzer (Agilent)에서 정량한다.
실시예 20 - 항체 및 단백질 발현 및 정제
항체 서열을 합성하여 앞서 기술된 중쇄 및 경쇄 벡터에 클로닝한다. 플라스미드를 HEK 293T 또는 293 프리스타일(FreeStyle) 세포 중 어느 하나에서 각각 Fugene 6 (Promega) 또는 293fectin (Invitrogen)을 사용하여 공동-트랜스펙션한다 (1:1 비율). 트랜스펙션을 제조자의 프로토콜을 따라 수행하고 항체 상층액을 트랜스펙션 후 4일 후에 수득한다. 293T 세포에서 생성된 항체를 ELISA에 의해 정량하고 직접 중화 분석에서 사용한다. 293 프리스타일 세포에 생성된 항체를 추가로 단백질 A 칼럼상에서 정제한다. 돌연변이를 부위-지정 돌연변이생성에 의해 QuikChange 부위-지정 돌연변이생성 키트 (Stratagene)를 사용하여 도입한다. 재조합 gp120 단백질을 293 프리스타일 세포에 293fection (Invitrogen)을 사용하여 트랜스펙션시키고 갈란투스 니발리스(Galanthus nivalis) 렉틴 칼럼과 이어서 Superdex 300 26/60 (GE Healthcare)을 사용한 크기 축출에 의해 정제한다.
실시예 21 - 세포 표면 결합 분석
적정량(titrating amount)의 mAb를 HIV-1 Env-트랜스펙션된 293T 세포에 첨가하고 1시간 동안 4℃에서 1x PBS에서 인큐베이션한다. 세척 후에, 세포를 2% PFA (PolySciences)로 20분 동안 실온에서 고정시킨다. 그런 다음 세포를 세척하고 파이코에리트린-컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG F(ab')2 (Jackson)의 1:200 희석으로 1시간 동안 실온에서 염색한다. 결합을 유동 세포분석을 사용하여 분석한다. 결합 경쟁을 IC70을 얻기 위해 비오티닐화된 항체를 필요한 농도로 첨가하기 전에 경쟁자 단클론성 항체의 양을 적정한 후 파이코에리트린-표지된 스트렙트아비딘 (Invitrogen)과의 결합을 측정함으로써 수행한다. 데이터 해석을 위해 FlowJo 소프트웨어를 사용한다.
실시예 22 - ELISA 분석
ELISA에 의한 결합을 수행한다. 간단하게 설명하면, 플레이트를 염소 항-인간 IgG Fc (Pierce)로 또는 gp120으로 코팅하고 결합을 알칼리성 포스파타제 (Pierce)에 컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG F(ab')2를 사용하여 검출한다. 용해된 비리온으로부터 추출된 gp120에의 결합을 위해, 플레이트를 5 ng/μL의 양 D7324 항-gp120 항체 (Aalto Bio 시약)로 코팅한다. 바이러스 상층액을 1% NP-40의 최종 농도를 사용하여 용해시키고 코팅된 플레이트에서 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 검출을 알칼리성 포스파타제 (Pierce)에 컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG F(ab')2를 사용하여 수행한다. 항체 농도를 선형 회귀에 의해 정제된 IgG 단백질의 표준 농도 곡선을 사용하여 계산한다.
실시예 23 - AbV1-9 생식선 Fab 발현, 정제, 결정화 및 X-선 회절 분석
AbV1-9 생식선 FaB를 HEK 293T 세포에서 제조하고 정제한다. 간단히 설명하며, 중쇄 및 경쇄 유전자로 트랜스펙션한 후 3일 후에, 발현 배지를 수득하고 분비된 Fab를 항-인간 λ 경쇄 친화성 매트릭스 (CaptureSelect Fab λ; BAC)와, 이어서 양이온 교환 크로마토그래피 및 크기-축출 크로마토그래피를 통해 정제한다. X-선 회절 품질 결정을 0.2 M 마그네슘 아세테이트, 20% w/v PEG 8000, 0.1 M 소디움 카코딜레이트, pH 6.5를 함유하고 있는 조건에서 얻는다. 액체 질소 중에 결정을 넣고 및 순간 냉동하기 전에, 저온-보호를 위해 모액을 20% 글리세롤로 보충한다. 완전한 데이터세트를 수집한다. 데이터 프로세싱을 XDS를 사용하여 수행한다. PGT121생식선 구조를 PHASER를 사용하여 탐색 모델로서 PGT123 Fab 구조를 가지는 스페이스 그룹 P212121에서 해결한다. PHENIX와 COOT의 조합을 사용하여 정제를 수행한다.
실시예 24 - 미가공 데이터 처리: VDJ 배열 및 클론 정의
미가공 서열분석 데이터를 python에 쓰인 인-하우스 도구를 사용하여 처리한다. 판독을 바코드로 나누고, 크기-여과하고, IMGT 생식선 VDJ 참조 데이터베이스에 대해 배열한다. 득점을 매우 고도로 돌연변이된 서열들에 대해 낮게 유지한다. V 영역을 먼저 배열한 후 제거하고, 이어서 J를 배열한 후 제거하고, 이어서 D를 배열하고 제거한다. 각 판독의 IMGT-정의된 CDR3 서열을 그런 다음 추출한다. CDR3 서열을 풍부함에 의해 분류하고 USEARCH5.1과 클러스터를 형성한다. 마지막으로, 각 CDR3 서열을 AbV1-9의 표적 항체 서열에 대해 배열하여 이 항체들로부터의 분기값(divergence value)을 측정한다.
실시예 25 - 항체 변종 확인 및 분석
분기-돌연변이 플롯을 공지된 항체에 유사한 판독들을 확인하기 위한 도구로서 사용한다. 상기 배경인 서열 및 클러스터의 고-동일성 클러스터를 수동으로 확인하고 면역나무(Immunitree)와의 계통발생적 추론에 대한 입력으로서 사용한다. 면역나무는 SHM 및 서열분석 오류의 확률론적 모델을 포함하여, 클론의 체세포성 과돌연변이의 베이지안 모델을 시행하고 나무 구조, 하위클론들이 탄생/사망 시간, 탄생/사망, 돌연변이, 및 서열분석 오류율, 하위클론 공통 서열 및 판독의 노드(node)에 대한 배열에 걸쳐 Markov 사슬 Monte Carlo를 수행한다. 나무 구조는 또한 다중 계산을 위해 및 상이한 정보를 덮어씌우기 위해 사용한다. 선택은 경험된 주어진 노드가 BASELINe 알고리즘을 사용하여 산정되도록 압박한다. 그것은 노드 공통 서열의 CDR/FWR에서 대체/침묵 돌연변이의 관찰된 수를 비교함으로써 선택 압력의 베이지안 산정을 수행한다.
실시예 26 - HIV 엘리트 콘트롤러로부터 공지의 저빈도 V H V L 쌍의 회수
쌍형성 민감도 및 분석의 정확성을 추가로 증명하는 것으로서, 여러 개의 드문 (10,000개 중 <1 세포) 천연 VHVL 쌍이 기존에 있고 대중적으로 알려져 있는 샘플을 처리하였다. 기억 B 세포가 최근 몇년 동안에 HIV 중화 활성을 나타내는 항체에 대해 중쇄가 발굴되어 있는 HIV 엘리트 콘트롤러 환자로부터 말초 B-세포를 얻었다. 350,000개의 B-세포를 처리하여 총 38,620개의 여과된 VHVL 쌍을 얻었다. 흥미롭게도, 개체는 이전의 건강한 샘플 (도 3A) 또는 전형적인 건강한 말초 B-세포 레퍼토리보다 더 큰 비율의 IgG를 나타냈다. 이 데이터세트로부터의 VH 서열을 PGT121을 포함한 이 개체로부터의 모든 보고된 광범위 중화 항체 (bNAb)와 비교하였고 8개의 밀접한 또는 동일한 VH 서열을 찾았는데, 이것은 이 bNAb의 패밀리가 순환하는 B-세포의 0.03% 미만을 대표하는 것을 나타낸다. 결정적으로, 이 중쇄들에 쌍을 이룬 모든 경쇄는 예상했던 유사하게 드문 bNAb 계통의 것이었고, 이것은 앞서 보고된 것과 같이 동일한 Igλ-V3-21/J3 재배열 및 홀마크 트리플 코돈 삽입(hallmark triple codon insertion)을 나타낸 것이며, 본 발명자들의 방법의 고정확성 및 민감성을 지지하는 것이다. 나아가, 이 개체로부터의 모든 공지된 및 새롭게 생성된 PGT121-유사 VHVL 쌍의 계통발생 나무에서 (도 3B), VH 및 VL 나무는 거울같은 위치를 차지하는 VH 및 VL 쌍의 서열과 현저하게 유사한 위상을 나타내며, 이것은 공유된 계통발생적 이력을 반영하는 것일 가능성이 있다. 여기서 발견된 변종 쌍은 이 규칙과 잘 맞는다. 흥미롭게도, 두 개의 공개된 항체 PGT122 및 PGT123은 예외로 나타난다; 이 두 쌍에 대한 지지는 발견되지 않지만, 대신 원래의 보고서에서 확인되지 않은 쌍형성을 나타낸 PGT122VH:PGT123VL-유사 및 PGT123VH:PGT122VL-유사 쌍이 발견되었다. 8개의 신규한 PGT-유사 VHVL 쌍의 완전한 영역을 암호화하는 DNA를 합성하였고, 항체를 정체 IgG로서 발현시키고 그것들이 HIV의 다중 위스트레인을 중화시키는 능력을 시험하였다 (도 6C). 항체는 잘 발현되었고 모두 바이러스에 대해 강한 중화 활성을 나타냈는데, 이것은 관련된 생물학적 샘플로부터 천연적으로 쌍을 이룬 기능성 항체 변종을 신속하게 생성하는 데 본 발명자들의 접근법이 활용될 수 있음을 증명한다.
실시예 27 - 인간 샘플
건강한 레퍼토리 확인을 위한 혈액 샘플을 개인 게놈 프로젝트의 승인하에 수집하였다. HIV bNAb 실험을 위한 PBMC를 IAVI 프로토콜 G 집단으로부터의 HIV-1 감염된 도너인 도너 17로부터 얻었다. 모든 인간 HIV 샘플을 르완다 공화국 국가 윤리 위원회, 에모리 대학 생명윤리 위원회, 잠비아 대학 연구윤리 위원회, 채링 크로스 연구윤리 위원회, UVRI 과학 및 윤리 위원회, 뉴사우스웨일즈 연구윤리 위원회, 세인트 빈센트 병원 및 동부 시드니 지역 헬스 서비스, 케냐타 국립병원 윤리 및 연구 위원회, 케이프타운 대학 연구윤리 위원회, 국제 임상시험심사위원회, 태국 마히돌대학 윤리위원회, 월터리드 미육군 연구소 (WRAIR) 임상시험심사위원회, 및 코트디부아르 "국가 윤리자문위원회" (CNESVS)에 의해 승인된 임상 프로토콜하에 고지에 입각한 서면 동의로 수집하였다. 단일 도너로부터의 저온보존된, 분리된 절제된 난소 선암종을 IRB 승인 프로토콜하에 컨버전트 바이올로직스(Conversant Biologics)로부터 고지에 입각한 서면 동의로 얻었다.
실시예 28 - 항-HIV 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포
AbV-1-9의 항-HIV 단일 사슬 가변 단편 (sFv 또는 scFv) 버전에 대한 유전자를 링커, 예컨대 (GGGGS)3 링커에 의해 분리된 중쇄 및 경쇄에 대한 코돈-최적화 서열들의 합성에 의해 생성한다. 각 항-HIV 항체에 대하여, 항-HIV CAR-암호화 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터를 생성하기 위하여 scFv 유전자를 CAR을 암호화하는 벡터, 예컨대 CD3 ζ 신호전달 도메인에 융합된 4-1BB-유래 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 암호화하는 벡터에 포함시킨다. 일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 항-HIV CAR-암호화 벡터로 변환시킨다.
항-HIV CAR을 발현하는 T 세포의 특성화
풍부해진 항-HIV CAR-형질도입된 T 세포를 HIV-1 감염 세포에 대한 반응으로 증식하는 능력에 대해 시험한다. 항-HIV CAR-형질도입된 T 세포를 셀트레이스 바이올렛(CellTrace Violet)으로 표지한 후 HIV-1NL4-3-감염 세포 (예컨대 Jurkat, SupT1, HEK293T 또는 HeLa 세포)와 공동 배양한다. 항-HIV CAR-형질도입된 T 세포의 증식을 유동 세포분석에 의해 측정하고, 비-형질도입된 T 세포 위에서 증가하는 것으로 나타난다.
풍부해진 항-HIV CAR-형질도입된 T 세포를 HIV-1 감염 세포의 특이적 사멸을 매개하는 능력에 대해 시험한다. 항-HIV CAR-형질도입된 T 세포를 HIV-1-감염된 표적 세포와 공동 배양할 때 크로뮴 방출 분석으로 분석한다. HIV-1 감염 세포의 특이적 용해를 측정하고, 특이적 용해는 항-HIV CAR-형질도입된 T 세포로 인해 발생하는 것으로 나타난다.
CAR을 발현하는 T 세포로의 처리
HIV로 감염된 대상체로부터의 T 세포를 항-HIV CAR을 발현하기 위해 항-HIV CAR 벡터로 형질도입한다. 항-HIV CAR-형질도입된 T 세포를 대상체에게 투여한다. 항-HIV CAR의 표적 항원을 발현하는 세포는 대상체에서 HIV 감염을 감소시키거나 정화시키고, 및/또는 그것들의 증상을 감소시키는, 항-HIV CAR-형질도입된 T 세포에 의해 사멸된다.

Claims (80)

1 nM 이하의 친화성으로 HIV의 N-글리칸 에피토프에 결합하거나 결합할 수 있는 항-HIV 항체.
제1 항에 있어서, 항체는 HIV를 중화하거나 중화할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 항체는 광범위 중화 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, HIV는 HIV-1인 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, HIV는 그룹 M HIV-1인 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, HIV는 HIV-1 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, 또는 그것들의 임의의 조합, 아형 또는 순환 재조합 형태 (CRF)인 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 Fc 영역의 올리고당을 변형시키기 위해 글리코엔지니어링되고, 항체는 글리코엔지니어링되지 않은 항체와 비교하여 증가된 ADCC 이펙터 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간화된 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제9 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 전체-길이 IgG 부류 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)인 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(b) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및
(c) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제15 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(b) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및
(c) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제18 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(b) SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및
(c) SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제21 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(b) SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및
(c) SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제24 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(b) SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2;
(c) SEQ ID NO:43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및
(d) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(b) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2;
(c) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및
(d) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(b) SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및
(c) SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제29 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(b) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및
(c) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1;
(b) SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및
(c) SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제33 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제33 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) SEQ ID NO:67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) SEQ ID NO:68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열;
(b) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열; 또는
(c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열;
(b) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열; 또는
(c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열;
(b) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열; 또는
(c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:7의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열;
(b) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열; 또는
(c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; 및
(b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 가지는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:11의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; 및
(b) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 가지는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열;
(b) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열; 또는
(c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:15의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; 또는
(b) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; 또는
(b) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; 또는
(b) (a)에서와 같은 VH 서열 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VH 서열; 또는
(b) (a)에서와 같은 VH 서열 및 SEQ ID NO:65의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제47 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
(a) 표 4의 CDR-H1, 표 4의 CDR-H2, 표 4의 CDR-H3 또는 그것들의 임의의 조합;
(b) 표 5의 CDR-L1, 표 5의 CDR-L2, 표 5의 CDR-L3 또는 그것들의 임의의 조합;
(c) 표 4의 VH 서열, 표 5의 VL 서열 또는 둘 다; 또는
(d) (a), (b) 또는 (c)의 임의의 조합을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
제1 항 내지 제47 항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 분리된 핵산.
제48 항의 핵산을 포함하는 벡터.
제49항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제50 항의 숙주 세포를 포함하는 항체를 배양함으로써 항체를 생성하는 단계를 포함하는 항체의 제조 방법.
제1 항 내지 제47 항 중 어느 한 항의 항체 및 치료제를 포함하는 면역컨쥬게이트.
제1 항 내지 제47 항 중 어느 한 항의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형.
의약으로서 사용하기 위한 제1 항 내지 제47 항 중 어느 한 항의 항체 또는 제52 항의 면역컨쥬게이트.
HIV 감염 또는 AIDS를 치료하기 위한 제1 항 내지 제47 항 중 어느 한 항의 항체 또는 제52 항의 면역컨쥬게이트의 사용.
의약의 제조에서 제1 항 내지 제47 항 중 어느 한 항의 항체 또는 제52 항의 면역컨쥬게이트의 사용.
제56 항에 있어서, 의약은 HIV 감염 또는 AIDS의 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 사용.
제56 항 또는 제57 항에 있어서, 의약은 HIV를 중화하기 위한 것임을 특징으로 하는 사용.
제56 항 내지 제58 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 광범위 중화 항체인 것을 특징으로 하는 사용.
제56 항 내지 제59 항 중 어느 한 항에 있어서, HIV는 HIV-1인 것을 특징으로 하는 사용.
제56 항 내지 제60 항 중 어느 한 항에 있어서, HIV는 그룹 M HIV-1인 것을 특징으로 하는 사용.
제56 항 내지 제61 항 중 어느 한 항에 있어서, HIV는 HIV-1 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, 또는 그것들의 임의의 조합, 아형 또는 CRF인 것을 특징으로 하는 사용.
HIV 감염 또는 AIDS를 가지는 개체를 치료하는 방법으로서, 유효량의 제1 항 내지 제47 항 중 어느 한 항의 항체 또는 제52 항의 면역컨쥬게이트를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제63 항에 있어서, 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제63 항에 있어서, 치료제는 항바이러스제인 것을 특징으로 하는 방법.
HIV 면역조직화학 분석으로서,
(a) 항체와 샘플에 존재하는 HIV 사이의 항체-HIV 복합체 형성을 허용하는 조건하에서 샘플을 제1 항 내지 제47 항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계, 및
(b) 면역검출 방법에 의해 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 분석.
제66 항에 있어서, 샘플은 혈액 샘플 또는 조직 샘플인 것을 특징으로 하는 분석.
항-HIV 항체 또는 그것의 단편의 제조 방법으로서,
(a) 제50 항의 세포를 벡터에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현 및 항체 또는 그것의 단편의 조립을 허용하는 조건하에서 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 세포 또는 세포의 배지로부터 항체 또는 단편을 정제하는 단계를 포함하는 방법.
(a) 제1 항 내지 제47 항 중 어느 한 항에 따르는 적어도 하나의 분리된 항-HIV 항체의 약학적으로 유효한 양의 약학적으로 허용되는 투여 단위를 포함하는 키트.
제69 항에 있어서, 항-HIV 제제의 약학적으로 유효한 양의 약학적으로 허용되는 투여 단위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제69 항에 있어서, 항-HIV 제제는 비-뉴클레오사이드 역전사효소 억제제, 프로테아제 억제제, 유입 또는 융합 억제제 및 인티그라아제 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 키트.
대상체에서 HIV 감염 또는 AIDS의 진단, 예측 또는 치료의 모니터링을 위한 키트로서, 제1 항 내지 제47 항 중 어느 한 항에 따르는 적어도 하나의 분리된 항-HIV 항체 및 항-HIV 항체에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 검출 시약을 포함하는 키트.
제72 항에 있어서, PCR을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제72 항에 있어서, 질량 분석을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제1 항 내지 제47 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 융합 단백질 또는 컨쥬게이트.
제75 항에 있어서, 키메라 수용체이거나 키메라 수용체를 포함하고, 선택적으로 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것을 특징으로 하는 융합 단백질 또는 컨쥬게이트.
제1 항 내지 제47 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR).
제77 항에 있어서, CAR은 ITAM 모티프를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
제77 항 또는 제78 항에 있어서, CAR은 CD3 ζ로부터의 세포내 신호전달 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
제77 항 내지 제79 항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD28, CD137, ICOS 및 OX40으로 구성되는 군으로부터 선택된 공동자극 분자로부터의 세포내 신호전달 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
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