KR20180093078A - 단백질 제제를 위한 트립토판 유도체의 용도 - Google Patents

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KR20180093078A
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비카스 샤르마
다니엘 라이스케
리디아 함부르크
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 산화에 민감한 용매 접근가능한 아미노산 잔기를 포함하는 단백질을 포함하는 방법 및 제형을 제공하고, 여기서, N-아세틸 트립토판 (NAT)은 단백질의 산화를 방지하기 위해 사용된다. 본 발명은 또한 상기 제형을 제조하는 방법 및 상기 제형을 사용하는 방법을 제공한다.단백질 제형 중 NAT의 분해를 측정하기 위한 방법이 또한 제공된다.

Description

단백질 제제를 위한 트립토판 유도체의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 하기의 우선권을 주장하며: 미국 가출원 제62/273,273호 (2015년 12월 30일 출원) 및 미국 가출원 제62/321,636호 (2016년 4월 12일 출원), 이들 각각의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
발명의 분야
본 발명은 단백질을 포함하고 N-아세틸-트립토판을 추가로 포함하는 액체 제제, 및 상기 액체 제제를 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
아미노산 잔기의 산화적 분해는 단백질 의약품에서 흔히 관찰되는 현상이다. 많은 아미노산 잔기, 특히 메티오닌 (Met), 시스테인 (Cys), 히스티딘 (His), 트립토판 (Trp), 및 티로신 (Tyr)은 산화에 민감하다 (Li 등, Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)). 산화는 전형적으로 단백질이 다양한 가공 단계에서 과산화수소, 빛, 금속 이온 또는 이들의 조합에 노출될 때 관찰된다 (Li 등, Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)). 특히, 빛 (Wei, 등, Analytical Chemistry 79(7): 2797-2805 (2007)), AAPH 또는 펜톤 시약 (Ji 등, J Pharm Sci 98(12): 4485-500 (2009))에 노출된 단백질은 트립토판 잔기에서 증가된 산화 수준을 나타낸 반면, 과산화수소에 노출된 단백질은 전형적으로 메티오닌 산화만을 나타내었다 (Ji 등, J Pharm Sci 98(12): 4485-500 (2009)). 빛 노출은 일중항 산소, 과산화수소 및 수퍼옥사이드를 포함하는 반응성 산소 종 (ROS)의 형성을 통해 단백질 산화를 야기할 수 있는 반면 (Li 등, Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995); Wei, 등, Analytical Chemistry 79(7): 2797-2805 (2007); Ji 등, J Pharm Sci 98(12): 4485-500 (2009); Frokjaer 등, Nat Rev Drug Discov 4(4): 298-306 (2005)), 단백질 산화는 전형적으로 펜톤 매개 반응에서 하이드록실 라디칼을 통해 (Prousek 등, Pure and Applied Chemistry 79(12): 2325-2338 (2007)) 그리고 AAPH 매개 반응에서 알콕실 과산화수소를 통해 발생한다 (Werber 등, J Pharm Sci 100(8): 3307-15 (2011)). 트립토판의 산화는 하이드록시트립토판, 카이누레닌 (Kyn), 및 N-포르밀카이누레닌을 포함하는 무수한 산화 생성물을 유발하며, 제제 안정성 및 효력에 영향을 미칠 가능성이 있다 (Li 등, Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995); Ji 등, J Pharm Sci 98(12): 4485-500 (2009); Frokjaer 등, Nat Rev Drug Discov 4(4): 298-306 (2005)). 생물학적 기능의 손실과 관련된 단클론 항체의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR)에서 특정 트립토판 잔기의 산화가 보고되었다 (Wei, 등, Analytical Chemistry 79(7): 2797-2805 (2007)). 히스티딘 배위 금속 이온에 의해 매개되는 Trp 산화가 Fab 분자에 대해 보고되었다 (Lam 등, Pharm Res 28(10): 2543-55 (2011)). 다양한 과산화수소의 생성을 야기하는 Fab 제제에서 폴리소르베이트 20의 자동산화가 또한 동일한 연구에서 보고되었다. 이러한 과산화수소의 자동산화-유도 생성은 또한 장기 보관 동안 단백질에서 메티오닌 산화를 야기할 수 있는데, 단백질 내의 Met 잔기가 내부 항산화제로서 작용하는 것으로 제시되었고 (Levine 등, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(26): 15036-15040 (1996)) 과산화수소에 의해 쉽게 산화되기 때문이다. 단백질의 아미노산 잔기의 산화는 그의 생물학적 활성에 영향을 미칠 가능성이 있다. 이것은 단클론 항체 (mAb)의 경우 특히 그럴 수 있다. IgG1 mAb에서 Met254 및 Met430에서의 메티오닌 산화는 형질전환 마우스에서 혈청 반감기에 잠재적으로 영향을 미치고 (Wang 등, Molecular Immunology 48(6-7): 860-866 (2011)), 또한 FcRn 및 Fc-감마 수용체에 대한 인간 IgG1의 결합에 영향을 미친다 (Bertolotti-Ciarlet 등, Molecular Immunology 46(8-9)1878-82 (2009)).
특히 액체 상태의 단백질의 안정성은 의약품 제조 및 보관 동안 평가될 필요가 있다. 약제학적 제제의 개발은 때때로 활성 성분의 산화를 방지하기 위한 항산화제의 첨가를 포함한다. L-메티오닌을 제제에 첨가하는 것은 단백질 및 펩타이드에서 메티오닌 잔기 산화를 감소시켰다 (Ji 등, J Pharm Sci 98(12): 4485-500 (2009); Lam 등, Journal of Pharmaceutical Sciences 86(11): 1250-1255 (1997)). 마찬가지로, L-트립토판의 첨가는 트립토판 잔기의 산화를 감소시키는 것으로 나타났다 (Ji 등, J Pharm Sci 98(12): 4485-500 (2009); Lam 등, Pharm Res 28(10): 2543-55 (2011)). 그러나, L-Trp는 UV 영역 (260-290nm)에서 강한 흡광도를 가지므로 광산화 동안 주요 표적이 된다(Creed, D., Photochemistry 및 Photobiology 39(4): 537-562 (1984)). Trp는 하기의 산소 의존적 광산화를 향상시키는 내인성 광감작제로서 가정되었다: 티로신 (Babu 등, Indian J Biochem Biophys 29(3): 296-8 (1992)) 및 다른 아미노산 (Bent 등, Journal of the American Chemical Society 97(10): 2612-2619 (1975)). L-Trp는 빛에 노출될 때 과산화수소를 생성할 수 있고 UV 빛 하에서 L-Trp는 수퍼옥사이드 음이온을 통해 과산화수소를 생산하는 것으로 입증되었다 (McCormick 등, Science 191(4226): 468-9 (1976); Wentworth 등, Science 293(5536): 1806-11 (2001); McCormick 등, Journal of the American Chemical Society 100:312-313 (1978)). 또한, 트립토판은 빛에 노출시 일중항 산소를 생산하는 것으로 알려져 있다 (Davies, M.J., Biochem Biophys Res Commun 305(3): 761-70 (2003)). 폴리소르베이트 20의 자동산화에 의해 유도된 단백질 산화와 유사하게, 단백질 산화는 정상 처리 조건 하에 하기 내의 다른 부형제에 의해 ROS 생성시에 발생할 수 있다: 단백질 제제 (예컨대 L-Trp).
액체 제제 내의 특정 단백질 잔기의 산화에 대한 민감성은 제제에서 하기에 대한 잔기의 접근성에 좌우될 수 있다 (예컨대 ROS). 용매-접근가능 표면적 (SASA)은 용매에 접근가능한 생물분자 (예컨대 아미노산 잔기)의 표면적의 척도이다. 단백질 내의 아미노산 잔기의 SASA는 산화에 대한 잔기의 이용가능성을 나타낼 수 있다. SASA는 Shrake-Rupley 알고리즘, 쌍별 오버랩의 선형 조합 (LCPO) 방법, 및 파워 다이어그램 방법을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 계산될 수 있다 (Shrake, A & Rupley, JA., J. Mol. Biol.　79(2): 351-371, 1973; Weiser 등, J. Comp. Chem.　20(2): 217-230, 1999; Klenin 등, J. Comp. Chem.　32(12): 2647-2653, 2011). 최근에, 모든-원자 분자 역학 (MD) 시뮬레이션은 아미노산 잔기에 대한 SASA를 계산하는데 사용되었고, % SASA 및 Trp 산화의 책임에 대한 이원성 의존성이 입증되었다 (Sharma, V. 등, PNAS. 111(52): 18601-18606, 2014). 따라서, SASA는 주어진 단백질 제제에서 항산화제를 포함하는 것의 적합성을 결정하기 위한 유용한 매개변수일 수 있다.
최근 연구로부터, 단백질을 안정화시키기 위한 L-Trp 및 폴리소르베이트와 같은 표준 부형제를 단백질 조성물에 첨가하는 것은 단백질의 ROS-유도 산화와 같은 예기치 않고 원치 않은 결과를 초래할 수 있음이 명백하다. 이것은 산화되기 쉬운 잔기를 갖는 단백질 조성물과 특히 관련된다. 따라서, 단백질 조성물에서 사용하기 위한 대안적인 부형제의 확인 및 이러한 조성물의 개발이 필요하다. 단백질 제제에서 트립토판 유도체의 예는 하기에 제공되어 있다: 미국특허 공개 제 2014/0322203호 및 제2014/0314778호.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원의 개시내용은그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
본 발명은 폴리펩타이드의 산화를 방지하는 N-아세틸트립토판의 양을 제제에 첨가하는 것을 포함하는 수성 제제에서 폴리펩타이드의 산화를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 폴리펩타이드는 약 80Å2를 초과하는 용매-접근가능 표면적 (SASA)을 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 본 발명은 또한 폴리펩타이드의 산화를 방지하는 N-아세틸트립토판의 양을 제제에 첨가하는 것을 포함하는 수성 제제에서 폴리펩타이드의 산화를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 폴리펩타이드는 약 30%를 초과하는 용매-접근가능 표면적 (SASA)을 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 트립토판 잔기가 약 80Å2를 초과하는 용매-접근가능 표면적 (SASA)을 갖는 경우, 폴리펩타이드의 산화를 방지하는 N-아세틸트립토판의 양을 제제에 첨가하는 것을 포함하는 수성 제제에서 폴리펩타이드의 산화를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA 값은 분자 동역학 시뮬레이션에 의해 계산된다.
일부 구현예에서, N-아세틸트립토판은 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판은 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판은 약 0.3 mM의 농도로 제제에 첨가된다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 산화는 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%까지 감소된다. 일부 구현예에서, 제제는 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃에서 약 1095일 동안 안정하다.
일부 구현예에서, 제제 내의 단백질 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제형은 대상체에 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다.
일부 양태에서, 본 발명은 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드의 산화를 방지하기 위한 N-아세틸트립토판의 양을 포함하는 액체 제제를 제공하며, 상기 폴리펩타이드는 약 80Å2를 초과하는 SASA를 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 갖는다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판은 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판은 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판은 약 0.3 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 산화는 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%까지 감소된다. 일부 구현예에서, 제제는 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃에서 약 1065일 동안 안정하다.
일부 구현예에서, 제제 내의 단백질 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제형은 대상체에 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다.
일부 양태에서, 본 발명은 폴리펩타이드의 감소된 산화를 위한 제제를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 상기 폴리펩타이드는 약 80Å2를 초과하는 SASA를 갖는 적어도 하나의 트립토판을 포함하고, 상기 방법은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 수성 조성물에 N-아세틸트립토판의 양을 첨가하는 단계, 상기 조성물에 2,2’-아조비스 (2-아미노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH)를 첨가하는 단계, 폴리펩타이드, N-아세틸트립토판 및 AAPH를 포함하는 조성물을 약 40 ℃에서 약 14시간 동안 배양하는 단계, 폴리펩타이드 내의 트립토판 잔기의 산화에 대해 폴리펩타이드를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩타이드의 트립토판 잔기의 약 20% 이하의 산화를 야기하는 N-아세틸트립토판의 양을 포함하는 제제가 폴리펩타이드의 감소된 산화를 위한 적합한 제제이다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판 및 AAPH는 약 10시간, 11시간, 12시간, 14시간, 16시간, 20시간, 또는 24시간 중 어느 것 미만 동안 배양된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 트립토판 잔기의 약 15%, 20% 25%, 30%, 또는 35% 중 어느 것 이하의 산화가 폴리펩타이드의 감소된 산화를 위한 적합한 제제이다.
일부 양태에서, 본 발명은 폴리펩타이드 내의 트립토판 잔기의 SASA 값을 결정하는 단계로서, 약 80Å2를 초과하는 SASA를 갖는 트립토판 잔기가 산화되고, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 수성 조성물에 N-아세틸트립토판의 양을 첨가하는 단계, 상기 조성물에 2,2’-아조비스 (2-아미노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH)를 첨가하는 단계, 폴리펩타이드, N-아세틸트립토판 및 AAPH를 포함하는 조성물을 약 40 ℃에서 약 14시간 동안 배양하는 단계, 폴리펩타이드 내의 트립토판 잔기의 산화에 대해 폴리펩타이드를 측정하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 감소된 산화를 위한 제제를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 여기서 폴리펩타이드의 트립토판 잔기의 약 20% 이하 산화를 야기하는 N-아세틸트립토판의 양을 포함하는 제제가 폴리펩타이드의 감소된 산화에 적합한 제제이다. .
상기 측면의 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA 값은 분자 동역학 시뮬레이션에 의해 계산된다.
일부 양태에서 본 발명은 본원에 기재된 구현예 중 어느 하나의 액체 제제를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 구현예 중 어느 하나의 액체 제제를 포함하는 제조 물품을 제공한다.
단백질 및 N-아세틸-트립토판 (NAT)을 포함하는 제제, 및 상기 제제를 제조 및 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 액체 제제는 대상체에게 투여하는데 적합한 약제학적 제제이다. 일부 구현예에서, 제형은 수성이다.
일부 구현예에서, NAT는 단백질 내의 트립토판의 산화를 방지한다.
일부 구현예에서, 제제 내의 단백질은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 단백질 내 트립토판은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체 (예컨대, 다클론 항체, 단클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 또는 항체 단편)이다. 일부 구현예에서, 제제 내의 단백질 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다.
일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다.
본 발명은 또한 액체 제제 내의 폴리펩타이드가 산화에 민감한 트립토판 잔기를 포함하는지 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 폴리펩타이드 내의 각 트립토판 잔기에 대해 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 기초하여 하나 이상의 분자 표현자를 계산하는 단계 및 하나 이상의 분자 표현자에 대해 훈련된 기계 학습 알고리즘에 상기 하나 이상의 분자 표현자를 적용하여 트립토판 산화를 예측하는 단계를 포함하고, 상기 분자 표현자는 하기 중 하나 이상을 포함한다: a) 트립토판 델타 탄소의 7Å 내의 아스파트산 측쇄 산소의 수, b) 측쇄 용매 접근가능 표면적 (SASA), c) 델타 탄소 SASA, d) 트립토판 델타 탄소의 7Å 내의 총 양전하, e) 백본 SASA, f) 트립토판 측쇄 각, g) 트립토판 델타 탄소의 7Å내이 패킹 밀도, h) 트립토판 백본 각, i) 유사-파이 오비탈의 SASA, j) 백본 가요성, 또는 k) 트립토판 델타 탄소의 7Å 내의 총 음전하. 일부 구현예에서, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개 분자 표현자가 사용된다. 일부 구현예에서, 분자 표현자는 하기를 포함한다: a) 트립토판 델타 탄소의 7Å 내의 아스파트산 측쇄 산소의 수, b) 측쇄 용매 접근가능 표면적 (SASA), c) 델타 탄소 SASA, d) 트립토판 델타 탄소의 7Å 내의 총 양전하, e) 백본 SASA, f) 트립토판 측쇄 각, 및 g) 트립토판 델타 탄소의 7Å 내의 패킹 밀도. 일부 구현예에서, 특정 부위에서 트립토판 잔기의 35% 초과의 산화는 산화에 대한 민감성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 기계 학습 알고리즘은 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 기초한 폴리펩타이드의 분자 동역학 시뮬레이션로부터의 분자 표현자를 폴리펩타이드 내의 각 트립토판 잔기에 대한 실험 데이터와 일치시킴으로써 훈련되었다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자 표현자는 컴퓨터를 사용하여 계산된다.
본 발명은 또한 기계 학습 알고리즘을 포함하는 상기 기재된 구현예 중 어느 하나에 따라 산화에 민감한 트립토판 잔기를 확인하는 단계, 및 폴리펩타이드 내에 아미노산 치환을 도입하여 산화에 민감한 하나 이상의 트립토판 잔기를 산화되지 않는 아미노산 잔기로 대체하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드의 산화를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 내에 아미노산 치환을 도입하여 산화에 민감한 하나 이상의 트립토판 잔기를 대체하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드의 산화를 감소시키는 방법이 제공되며, 산화에 민감한 하나 이상의 트립토판 잔기는 기계 학습 알고리즘을 포함하는 상기 기재된 구현예 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 확인되었다. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기는 티로신, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 알라닌, 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 의해 대체된다.
본 발명은 또한 컴퓨터 학습 알고리즘을 포함하는 상기 기재된 구현예 중 어느 하나의 방법에 따라 산화에 민감한 폴리펩타이드 내의 하나 이상의 트립토판 잔기의 존재를 결정하는 단계, 및 산화에 민감한 하나 이상의 트립토판 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 수성 제제에 항산화제의 유효량을 첨가하는 단계를 포함하는, 수성 제제에서 폴리펩타이드의 산화를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 산화를 방지하기 위해 수성 제제에 항산화제의 양을 첨가하는 단계를 포함하는, 수성 제제에서 폴리펩타이드의 산화를 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 폴리펩타이드는 기계 학습 알고리즘을 포함하는 상기 기재된 구현예 중 어느 하나의 방법에 의해 확인된 산화에 민감한 하나 이상의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 항산화제는 N-아세틸트립토판이다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판은 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판은 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판은 약 0.3 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 산화는 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%까지 감소된다. 일부 구현예에서, 제제는 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃에서 약 1095일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 제제 내의 단백질 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 대상체에 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다.
본 발명은 또한 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드의 산화를 방지하기 위한 N-아세틸트립토판의 양을 포함하는 액체 제제를 제공하며, 상기 폴리펩타이드는 기계 학습 알고리즘을 포함하는 상기 기재된 구현예 중 어느 하나의 방법에 의해 측정된 바와 같이 산화에 민감한 적어도 하나의 트립토판 잔기를 갖는다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판은 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판은 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판은 약 0.3 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 산화는 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%까지 감소된다. 일부 구현예에서, 제제는 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃에서 약 1065일 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 제제 내의 단백질 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 대상체에 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 액체 제제를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 액체 제제를 포함하는 제조 물품이 제공된다.
본 발명은 또한 폴리펩타이드의 감소된 산화를 위한 제제를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 상기 폴리펩타이드는 기계 학습 알고리즘을 포함하는 상기 기재된 구현예 중 어느 하나의 방법에 의해 확인된 산화에 민감한 적어도 하나의 트립토판을 포함하고, 상기 방법은 폴리펩타이드를 포함하는 수성 조성물에 N-아세틸트립토판의 양을 첨가하는 단계, 조성물에 2,2’-아조비스 (2-아미노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH)를 첨가하는 단계, 폴리펩타이드, N-아세틸트립토판 및 AAPH를 포함하는 조성물을 약 40 ℃에서 약 14시간 동안 배양하는 단계, 폴리펩타이드 내의 트립토판 잔기의 산화에 대해 폴리펩타이드를 측정하는 단계를 포함하며, 폴리펩타이드의 트립토판 잔기의 약 20% 이하의 산화를 야기하는 N-아세틸트립토판의 양을 포함하는 제제가 폴리펩타이드의 감소된 산화를 위한 적합한 제제이다. 일부 구현예에서, a) 기계 학습 알고리즘을 포함하는 상기 기재된 구현예 중 어느 하나의 방법에 의해 산화에 민감한 하나 이상의 트립토판 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 확인하는 단계, b) 단계 a)에서 확인된 폴리펩타이드를 포함하는 수성 조성물에 N-아세틸트립토판의 양을 첨가하는 단계, c) 조성물에 2,2’-아조비스 (2-아미노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH)를 첨가하는 단계, d) 폴리펩타이드, N-아세틸트립토판 및 AAPH를 포함하는 조성물을 약 40 ℃에서 약 14시간 동안 배양하는 단계, e) 폴리펩타이드 내의 트립토판 잔기의 산화에 대해 폴리펩타이드를 측정하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 감소된 산화를 위한 제제를 스크리닝하는 방법이 제공되며, 폴리펩타이드의 트립토판 잔기의 약 20% 이하의 산화를 야기하는 N-아세틸트립토판의 양을 포함하는 제제가 폴리펩타이드의 감소된 산화를 위한 적합한 제제이다.
일부 양태에서, 본 발명은 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물에서 N-아세틸 트립토판 (NAT) 분해를 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 조성물을 역상 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 조성물은 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액에서 평형화된 크로마토그래피 물질 상에 로딩되고, 이동상 A는 물 중의 산을 포함하며 이동상 B는 아세토니트릴 중의 산을 포함하고, b) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액으로 역상 크로마토그래피 물질로부터 조성물을 용리시키는 단계를 포함하고, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 a)와 비교하여 증가되고, NAT 분해물은 온전한 NAT와 별개로 크로마토그래피로부터 용리되며, c) NAT 분해물 및 온전한 NAT를 정량하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 a)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 2:98이다. 일부 구현예에서, 단계 b)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 선형으로 증가한다. 일부 구현예에서, 단계 b)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계적으로 증가한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 1.0 mL/분이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 30:70으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 16분 이내에 약 30:70으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 90:70으로 추가로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 18.1분 이내에 약 90:70으로 추가로 증가된다일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 26:74로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 14분 이내에 약 26:74로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 90:70으로 추가로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 16.5분 이내에 약 90:70으로 추가로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 물 중 약 0.1%의 산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 아세토니트릴 중 약 0.1%의 산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 물질은 C18 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 물질은 고체 지지체를 포함한다. 일부 구현에에서, 고체 지지체는 실리카를 포함한다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 물질은 칼럼에 함유된다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질 또는 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, NAT 및 NAT 분해제 생성물은 240 nm에서의 흡광도에 의해 검출된다. 일부 구현예에서, NAT 분해 생성물은 질량 크로마토그래피에 의해 동정된다. 일부 구현예에서, 조성물 중 NAT 농도는 약 10 nM 내지 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, NAT 분해 생성물은 N-Ac-(H, 1,2,3,3a,8,8a-헥사하이드로- 3a-하이드록시피롤로 [2,3-b]-인돌 2-카복실산) (N-Ac-PIC), N-Ac- 옥시인돌릴알라닌 (N-Ac-Oia), N-Ac- N-포르밀-카이누레닌 (N-Ac-NFK), N-Ac- 카이누레닌 (N-Ac-Kyn) 및 N-Ac-2a,8a-디하이드록시-PIC 중 하나 이상을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 N-아세틸 트립토판 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에서 N-아세틸 트립토판 (NAT) 분해를 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 조성물을 약 8 M 구아니딘으로 희석하는 단계, b) 상기 조성물로부터 폴리펩타이드를 제거하는 단계, c) 상기 조성물을 역상 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물은 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액에서 평형화된 크로마토그래피 물질로 로딩되고, 이동상 A는 물 중의 산을 포함하고, 이동상 B는 아세토니트릴 중의 산을 포함하며, d) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액으로 역상 크로마토그래피 물질로부터 조성물을 용리시키는 단계로서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 a)와 비교하여 증가되고, NAT 분해물은 온전한 NAT와 별개로 크로마토그래피로부터 용리되며, e) NAT 분해물 및 온전한 NAT를 정량하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 조성물 내의 NAT의 최종 농도가 약 0.05 mM 내지 약 0.2 mM의 범위가 되도록 약 8M 구아니딘에서 희석된다. 일부 구현예에서, 조성물은 조성물 내의 폴리펩타이드의 최종 농도가 약 25 mg/mL이하가 되도록 약 8M 구아니딘에서 희석된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 여과에 의해 조성물로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 여과는 약 30 kDal의 분자량 컷오프를 갖는 여과 막을 사용한다. 일부 구현예에서, 단계 a)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 2:98이다. 일부 구현예에서, 단계 b)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 선형으로 증가한다. 일부 구현예에서, 단계 b)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계적으로 증가한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 1.0 mL/분이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 30:70으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 16분 이내에 약 30:70으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 90:70으로 추가로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 18.1분 이내에 약 90:70으로 추가로 증가된다일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 26:74로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 14분 이내에 약 26:74로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 90:70으로 추가로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 16.5분 이내에 약 90:70으로 추가로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 물 중 약 0.1%의 산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 아세토니트릴 중 약 0.1%의 산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 물질은 C18 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 물질은 고체 지지체를 포함한다. 일부 구현에에서, 고체 지지체는 실리카를 포함한다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 물질은 칼럼에 함유된다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질 또는 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, NAT 및 NAT 분해제 생성물은 240 nm에서의 흡광도에 의해 검출된다. 일부 구현예에서, NAT 분해 생성물은 질량 크로마토그래피에 의해 동정된다. 일부 구현예에서, 조성물 내의 NAT의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 5 mM이다. 일부 구현예에서, 조성물 내의 NAT의 농도는 약 0.3 mM이다. 일부 구현예에서, NAT 분해 생성물은 N-Ac-PIC, N-Ac-Oia, N-Ac-NFK, N-Ac-Kyn 및 N-Ac-2a,8a-디하이드록시-PIC 중 하나 이상을 포함한다.
상기 측면의 일부 구현예에서, 제제 내의 단백질 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 대상체에 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다.
일부 양태에서, 본 발명은 제74항-제134항 중 어느 한 항의 방법에 따라 조성물의 샘플 내 NAT의 분해를 측정하는 단계를 포함하는, 조성물에서 NAT의 분해를 모니터링하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 횟수로 반복된다. 일부 구현예에서, 방법은 1개월마다, 2개월마다, 4개월마다 또는 6개월마다 반복된다.
일부 양태에서, 본 발명은 약제학적 조성물에 대한 품질 분석을 제공하며, 상기 품질 분석은 제74항-제134항 중 어느 한 항의 방법에 따라 약제학적 조성물에서 샘플의 NAT의 분해를 측정하는 단계를 포함하고, 조성물에서 측정된 NAT 분해물의 양은 약제학적 조성물이 동물에게 투여하는데 적합한지 결정한다. 일부 구현예에서, 약 10ppm 미만의 약제학적 조성물 중 NAT 분해물의 양은 약제학적 조성물이 동물 투여용으로 적합하다는 것을 지적한다.
본원에 기재된 다양한 구현예의 특성 중 하나, 일부, 또는 모두는 본 발명의 다른 구현예를 형성하기 위해 조합될 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명의 이들 및 다른 측면은 당업자에게 자명하게 될 것이다. 본 발명의 이들 및 다른 구현예는 하기 상세한 설명에 의해 추가로 설명된다.
도1은 단백질 Mab2, Mab4, Mab1, 및 Mab6 내의 NAT에 의한 다양한 트립토판 잔기의 AAPH 스트레스 유도 산화로부터의 보호를 나타낸다. 2개의 그래프는 x-축 규모가 상이한 동일한 패턴을 제시한다. 범례는 시험된 각 잔기에 대한 인실리코로 계산된 용매-접근가능 표면적을 포함한다.
도2A 및 2B는 AAPH 및 % 측쇄 SASA에 의한 트립토판 산화 사이의 관계를 나타낸다. 도2A는 38 IgG1 mAb를 포함하는 데이터 세트로부터의 결과를 나타낸다. 도2B는 IgG1, IgG2, IgG4, 및 쥣과를 포함하는 다양한 프레임워크에 대한 121 mAb를 포함하는 데이터 세트로부터의 결과를 나타낸다.
도3은 훈련 동안 사용된 추정량의 수의 함수로서 무작위 결정 포레스트 정확도를 나타낸다.
도4는 훈련 동안 고려된 특징의 수의 함수로서 무작위 결정 포레스트 정확도를 나타낸다.
도5는 훈련 동안 사용된 트리 깊이의 함수로서 무작위 결정 포레스트 정확도를 나타낸다.
도6은 최적화된 무작위 결정 포레스트에 대한 14개의 가장 관련된 시뮬레이션 기반 분자 표현자의 특징 중요성 (지니 (gini) 중요성)을 나타낸다. 포함된 훈련 매개변수: 5000 평가기, 결절 당 고려되는 3 특성, 및 10의 트리 깊이.
도7은 상응하는 Trp 분해물 (시리즈)과 함께, NAT의 잠재적이 분해물 (b 시리즈)를 나타낸다.
도8A는 상이한 스트레스 조건에 적용 후 역상 크로마토그램 0.2 mM NAT를 나타낸다. 별표가 있는 피크는 ICH 빛 스트레스 하에서만 관찰된 피크를 나타낸다. 도8B는 AAPH 스트레스 받은 샘플에서 NAT 및 NAT 분해물에 대한 파장에서의 형광 및 흡광도의 비교를 나타낸다. 프로파일은 NAT 피크가 1AU로 설정되도록 정규화되었다. 측정가능한 형광 (여기 파장 = 240 nm, 방출 파장 = 342 nm)을 갖는 NAT 분해물만이 피크 4임에 유의한다 (이 데이터 및 하기에서 MS 단편화 데이터에 기초하여, N-Ac-PIC로서 할당됨: 도15E).
도9는 합성 NAT 표준과 AAPH 유도 NAT 분해물의 정체 시간 정렬을 나타낸다.
도10은 총 NAT 산화에 대한 5 mM Met의 공동제제의 효과를 나타낸다 (히스티딘 및 비-히스티딘 함유 제제 모두에서). 2반복 주사의 표준 편차가 나타나 있다.
도11은 AAPH-유도 NAT 분해에 대한 단백질의 영향을 나타낸다. 1 mg/ml (0.0067 mM) 단백질을 갖거나 갖지 않는 0.3 mM NAT를 함유하는 히스티딘계 완충제가 AAPH 스트레스에 적용되었다. NAT 분해물의 분포 및 수준은 주로 단백질의 존재에 비의존적이다. 2반복 주사의 표준 편차가 나타나 있다.
도12는 단백질1 안정성 샘플 및 AAPH 스트레스 모델에서 NAT 분해의 비교를 나타낸다. 삽입도는 표시된 영역의 확대도를 나타낸다.
도13은 NAT UV-HPLC 반응의 선형성을 나타낸다 (240 nm에서).
도14는 NAT 분해물이 His 완충제 샘플에서 AAPH 스트레스된 NAT의 1-20× 배 희석 시리즈에서 선형 반응을 나타낸다는 것을 도시한다. 모든 피크는 240 nm에서 검출되었다.
도15A-15F는 질량 분석 단편화 분석을 나타낸다 (단편화에 대한 문헌 보고: Todorovski, T., M. Fedorova, 및 R.Hoffmann, Mass spectrometric characterization of peptides containing different oxidized tryptophan residues. J Mass Spectrom, 2011.46(10): p. 1030-8 및 내부의 참고문헌). 도15A는 피크 2 및 3 MS 데이터가 N-Ac-Oia 부분입체이성질체로서의 확인을 뒷받침한다는 것을 나타낸다. 별표가 있는 단편은 Oia의 특징이다. 도15B는 피크 6 MS 데이터가 N-Ac-Kyn으로서의 확인을 뒷받침한다는 것을 나타낸다. 카이누레닌-함유 분자의 별표가 있는 단편 특징. 도15C는 피크 5 MS 데이터가 N-Ac-NFK로서의 확인을 뒷받침한다는 것을 나타낸다. 카이누레닌-함유 분자의 별표가 있는 단편 특징. 도15D는 피크 그룹 1 및 피크 4에서 263.1 이온이 유사한 MS 단편화를 가지며, 어느 것도 N-Ac-HTP가 이님을 나타낸다. 5-HTP의 별표가 있는 단편 특징. 도15E는 피크 4에서 단편화 패턴이 잠재적인 N-Ac-PIC 단편화와 일치하고 문헌에 보고되어 있음을 나타낸다 (Fang, L., R.Parti, and P.Hu, Characterization of N-acetyltryptophan degradation products in concentrated human serum albumin solutions and development of an automated high performance liquid chromatography-mass spectrometry method for their quantitation.J Chromatogr A, 2011. 1218(41): p. 7316-24). 잠정적인 할당은 도8B에 나타난 형광 데이터에 기초하여 강화된다. 도15F는 피크 그룹 1에서 이중 산화된 종이 N-Ac-DiOia 또는 N-Ac-3a, 8a-디하이드록시-PIC일 가능성이 있음을 나타낸다.
일부 양태에서, 본 발명은 폴리펩타이드의 산화를 방지하는 N-아세틸트립토판의 양을 제제에 첨가하는 단계를 포함하는 수성 제제에서 폴리펩타이드의 산화를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 폴리펩타이드는 약 80Å2를 초과하는 용매-접근가능 표면적 (SASA)을 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 폴리펩타이드의 산화를 방지하는 N-아세틸트립토판의 양을 제제에 첨가하는 단계를 포함하는 수성 제제에서 폴리펩타이드의 산화를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 폴리펩타이드는 약 30%를 초과하는 용매-접근가능 표면적 (SASA)을 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 트립토판 잔기가 약 80Å2를 초과하는 용매-접근가능 표면적 (SASA)을 갖는 경우, 폴리펩타이드 내의 트립토판 잔기의 SASA 값을 결정하는 단계 및 폴리펩타이드의 산화를 방지하는 N-아세틸트립토판의 양을 제제에 첨가하는 단계를 포함하는 수성 제제에서 폴리펩타이드의 산화를 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 폴리펩타이드의 감소된 산화를 위한 제제를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 상기 폴리펩타이드는 약 80Å2를 초과하는 SASA를 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함하고, 폴리펩타이드의 트립토판 잔기의 약 20% 이하의 산화를 야기하는 N-아세틸트립토판의 양을 포함하는 제제가 폴리펩타이드의 감소된 산화에 적합한 제제이다. 일부 양태에서 본 발명은 폴리펩타이드 내의 트립토판 잔기의 SASA 값을 결정하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 감소된 산화를 위한 제제를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 약 80Å2를 초과하는 SASA를 갖는 트립토판 잔기가 산화되고, 폴리펩타이드의 트립토판 잔기의 약 20% 이하의 산화를 야기하는 N-아세틸트립토판의 양을 포함하는 제제가 폴리펩타이드의 감소된 산화에 적합한 제제이다.
I. 정의.
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 특정 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않으며, 이는 물론 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
용어 “약제학적 제제”는 활성 성분의 생물학적 활성을 효과적으로 만드는 형태이고, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않을 정도로 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 조제물을 지칭한다. 이러한 제제는 멸균이다.
“멸균” 제제는 무균이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 이들의 포자가 없거나 본질적으로 없다.
“안정한” 제제는 내부의 단백질의 보관시 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 제제이다. 바람직하게는, 제제는 보관시 그의 물리적 및 화학적 안정성, 뿐만 아니라 그의 생물학적 활성을 본질적으로 유지한다. 보관 기간은 일반적으로 제제의 의도된 유효 기간에 기초하여 선택된다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 당업계에서 이용가능하며, 예를 들어 하기에서 논의된다: Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90 (1993). 안정성은 선택된 시간 동안 선택된 양의 빛 노출량 및/또는 온도에서 측정될 수 있다. 안정성은 응집물 형성의 평가 (예를 들어 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 혼탁도 측정에 의해, 및/또는 육안 검사에 의해); ROS 형성의 평가 (예를 들어 빛 스트레스 분석 또는 2,2’-아조비스(2-아미도프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH) 스트레스 분석을 사용하여); 단백질의 특정 아미노산 잔기의 산화 (예를 들어, 단클론 항체의 Trp 잔기 및/또는 Met 잔기); 양이온 교환 크로마토그래피, 영상 모세관 등전점 포커싱 (icIEF) 또는 모세관 구역 전기영동을 사용한 전하 이종성을 평가함으로써; 아미노-말단 또는 카복시-말단 서열 분석; 질량 분광 분석; 감소되고 온전한 항체와 비교하는 SDS-PAGE 분석; 펩타이드 맵 (예를 들어, 트립신 또는 LYS-C) 분석; 단백질의 생물학적 활성 또는 표적 결합 기능을 평가하는 것 (예컨대, 항체의 항원 결합 기능); 등을 포함하는 다양한 상이한 방식으로 정성적으로 및/또는 정량적으로 평가될 수 있다. 불안정성은 하기 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다: 응집, 탈아미드화 (예컨대 Asn 탈아미드화), 산화 (예컨대 Met 산화 및/또는 Trp 산화), 이성질체화 (예컨대 Asp 이성질체화), 클리핑/가수분해/단편화 (예컨대 힌지 영역 단편화), 석신이미드 형성, 쌍을 형성하지 않은 시스테인(들), N-말단 연장, C-말단 가공, 당화 차이 등.
단백질은 색 및/또는 투명도의 육안 검사시, 또는 UV 빛 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같이, 응집, 침전, 단편화, 및/또는 변성의 신호를 나타내지 않거나 이것이 거의 없는 경우 약제학적 제제에서 “그의 물리적 안정성을 유지한다”.
단백질은 주어진 시간에 화학적 안정성이 단백질이 하기에 정의된 바와 같이 그의 생물학적 활성을 여전히 유지하는 것으로 간주되면, 약제학적 제제에서 “그의 화학적 안정성을 유지한다”. 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변형된 형태를 검출하고 정량함으로써 평가될 수 있다. 화학적 변형은 예를 들어 트립신 펩타이드 맵핑, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC/MS)을 사용하여 평가될 수 있는 단백질 산화를 포함할 수 있다. 다른 유형의 화학적 변형은 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 또는 icIEF에 의해 평가될 수 있는 단백질의 전하 변화를 포함한다.
단백질은 주어진 시간에 단백질의 생물학적 활성이, 예를 들어 단클론 항체의 항원 결합 분석에서 결정된 바와 같이, 약제학적 제제가 제조된 시간에 나타낸 생물학적 활성의 약 20% 이내 (예컨대, 약 10% 이내)인 경우, 약제학적 제제에서 “그의 생물학적 활성을 유지한다”.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질의 “생물학적 활성”은 단백질이 그의 표적에 결합하는 능력, 예를 들어 단클론 항체가 항원에 결합하는 능력을 지칭한다. 그것은 시험관내 또는 생체내에서 측정될 수 있는 생물학적 반응을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 활성은 길항적 또는 작용적일 수 있다.
“산화에 민감한” 단백질은 산화되기 쉬운 것으로 밝혀진 하나 이상의 잔기(들), 예컨대, 비제한적으로, 메티오닌 (Met), 시스테인 (Cys), 히스티딘 (His), 트립토판 (Trp), 및 티로신 (Tyr)을 포함하는 것이다. 예를 들어, 단클론 항체의 Fab 부분 내의 트립토판 아미노산 또는 단클론 항체의 Fc 부분 내의 메티오닌 아미노산은 산화에 민감할 수 있다.
단백질의 “산화에 불안정한” 잔기는 산화 분석에서 35% 초과하는 산화를 갖는 잔기이다 (예컨대 AAPH-유도 또는 열-유도 산화). 단백질 내의 잔기의 백분율 산화는 당업계에 알려진 임의의 방법, 예컨대 트립신 소화 후 부위-특이적 Trp 산화에 대한 LC-MS/MS에 의해 결정될 수 있다.
용매에서 생물분자의 “용매-접근가능 표면적” 또는 “SASA”는 용매에 접근가능한 생물분자의 표면적이다. SASA는 측정 단위 (예컨대, 제곱 옴스트롱)로 또는 용매에 접근가능한 표면적의 백분율로 표현될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 내의 아미노산 잔기의 SASA는 80 Å2, 또는 30%일 수 있다. SASA는 Shrake-Rupley 알고리즘, LCPO 방법, 파워 다이어그램 방법, 또는 분자 동역학 시뮬레이션을 포함하는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
“등장성”은 관심 제제가 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는 것을 의미한다. 등장성 제제는 일반적으로 약 250 내지 350 mOsm의 삼투압을 가질 것이다. 등장성은 예를 들어 증기압 또는 얼음 동결식 삼투압계를 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, “완충제”는 그의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해 pH의 변화를 저항하는 완충된 용액을 지칭한다. 본 발명의 완충제는 바람직하게는 약 4.5 내지 약 8.0 범위의 pH를 갖는다. 예를 들어, 히스티딘 아세테이트는 pH를 이 범위로 조절하는 완충제의 예이다.
“보존제”는 내부의 박테리아 작용을 감소시켜, 예를 들어 다용도 제제의 생산을 용이하게 하기 위해 제제에 선택적으로 포함될 수 있는 화합물이다. 잠재적인 보존제의 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬 그룹이 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 유형의 보존제는 방향족 알코올, 예컨대 페놀, 부틸 및 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀 사이클로헥사놀, 3-펩타놀, 및 m-크레졸을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에서 보존제는 벤질 알콜이다.
본원에 사용된 바와 같이, “계면활성제”는 표면활성제, 바람직하게는 비이온성 계면활성제를 지칭한다. 본원에서 계면활성제의 예는 하기를 포함한다: 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 및, 폴리소르베이트 80); 폴록사머 (예컨대 폴록사머 188); 트리톤; 나트륨 도데실 설페이트 (SDS); 나트륨 라우릴 설페이트; 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스타미도 프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아라미도프로필-베타인 (예컨대 라우로아미도프로필); 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아라미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 디나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUATTM 시리즈 (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예컨대 Pluronics, PF68 등); 등. 일 구현예에서, 본원에서 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 계면활성제는 폴록사머 188이다.
본원에 사용된 바와 같이 “약제학적으로 허용가능한” 부형제 또는 담체는 당업계에 공지된 약제학적으로 허용가능한 담체, 안정화제, 완충제, 산, 염기, 당, 보존제, 계면활성제, 등장화제 등을 포함한다 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Pharmaceutical Press, 2012). 약제학적으로 허용가능한 부형제의 예는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, 및 다른 유기산; 아스코브산, L-트립토판 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 금속 착물, 예컨대 Zn-단백질 착물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리소르베이트, 폴록사머, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 PLURONICS™을 포함한다. “약제학적으로 허용가능한” 부형제 또는 담체는 사용된 활성 성분의 유효량을 제공하기 위해 대상체에게 합리적으로 투여될 수 있고 사용된 투여량 및 농도에서 이에 노출되는 대상체에게 비독성인 것이다.
제제화된 단백질은 바람직하게는 본질적으로 순수하고 바람직하게는 본질적으로 균질하다 (예컨대, 오염 단백질 등이 없음). “본질적으로 순수한” 단백질은 조성물의 총량을 기준으로, 적어도 약 90 중량%, 바람직하게는 적어도 약 95 중량%의 단백질 (예컨대, 단클론 항체)을 포함하는 조성물을 의미한다. “본질적으로 균질한” 단백질은 조성물의 총량을 기준으로, 적어도 약 99 중량%의 단백질 (예컨대, 단클론 항체)을 포함하는 조성물을 의미한다.
용어 “단백질” “폴리펩타이드” 및 “펩타이드”는 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 그것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 그것은 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로또는 개입에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함하며; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 라벨링 성분과의 접합을 포함한다. 또한, 예를 들어, 아미노산 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함)의 하나 이상의 유사체, 뿐만 아니라 당업계에 알려진 다른 변형을 함유하는 단백질이 정의 내에 포함된다. 본원의 정의에 포함되는 단백질의 예는 하기를 포함한다: 포유동물 단백질, 예컨대, 레닌; 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 렙틴; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성자, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성자 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 종양 괴사 인자 수용체, 예컨대 사멸 수용체 5 및 CD120; TNF-관련 세포자멸사 유도 리간드 (TRAIL); B-세포 성숙 항원 (BCMA); B-림프구 자극자 (BLyS); 증식 유도 리간드 (APRIL); 엔케팔리나아제; RANTES (regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮬러관 억제 물질; 릴랙신 A-사슬; 릴랙신 B-사슬; 프로릴랙신; 마우스 성선자극호르몬 관련 펩타이드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈소판 유래 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF); 혈관 내피 성장 인자 패밀리 단백질 (예컨대, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 및 P1GF); 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 패밀리 단백질 (예컨대, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, 및 이의 이량체); 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 패밀리, 예컨대 aFGF, bFGF, FGF4, 및 FGF9; 표피 성장 인자 (EGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체, 예컨대 VEGF 수용체(들) (예컨대, VEGFR1, VEGFR2, 및 VEGFR3), 표피 성장 인자 (EGF) 수용체(들) (예컨대, ErbB1, ErbB2, ErbB3, 및 ErbB4 수용체), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 수용체(들) (예컨대, PDGFR-α 및 PDGFR-β), 및 섬유아세포 성장 인자 수용체(들); TIE 리간드 (안지오포이에틴, ANGPT1, ANGPT2); 안지오포이에틴 수용체, 예컨대 TIE1 및 TIE2; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 골 유래 신경영양성 인자 (BDNF), 신경영양인자-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-b; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타, 예컨대 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형성 단백질 (BMP); 케모카인, 예컨대 CXCL12 및 CXCR4; 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSF), 예컨대, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 사이토카인, 예컨대 인터루킨 (IL), 예컨대, IL-1 내지 IL-10; 미드카인; 수퍼옥사이드 디스뮤타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어, AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 아드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 에프린; Bv8; 델타-유사 리간드 4 (DLL4); Del-1; BMP9; BMP10; 폴리스타틴; 간세포 성장 인자 (HGF)/산란 인자 (SF); Alk1; Robo4; ESM1; 퍼레칸; EGF-유사 도메인, 다중 7 (EGFL7); CTGF 및 그의 패밀리의 구성원; 트롬보스폰딘, 예컨대 트롬보스폰딘1 및 트롬보스폰딘2; 콜라겐, 예컨대 콜라겐 IV 및 콜라겐 XVIII; 뉴로필린, 예컨대 NRP1 및 NRP2; 플레이오트로핀 (PTN); 프로그라눌린; 프로리페린; 노치 단백질, 예컨대 Notch1 및 Notch4; 세마포린, 예컨대 Sema3A, Sema3C, 및 Sema3F; 종양 관련 항원, 예컨대 CA125 (난소 암 항원); 면역부착소; 및 상기 열거된 단백질의 단편 및/또는 변이체뿐만 아니라, 예를 들어, 상기 열거된 단백질 중 어느 것을 포함하는, 하나 이상의 단백질에 결합하는 항체 단편을 포함하는 항체.
본원에서 용어 “항체”는 가장 넓은 의미로 사용되며, 특히 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 단클론 항체 (전장 단클론 항체 포함), 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함한다.
“단리된” 단백질 (예컨대, 단리된 항체)은 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리되고/되거나 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 단백질의 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 단리된 단백질은 재조합 세포 내의 그 위치에 있는 단백질을 포함하는데 단백질의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 단백질은 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
“원상태 항체”는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 디설파이드 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 사이에서 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디설파이드 브리지를 갖는다. 각 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (VH) 후 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (VL) 및 그의 다른 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에서 계면을 형성한다고 여겨진다.
용어 “불변 도메인”은 면역글로불린의 다른 부분인 항원 결합 부위를 함유하는 가변 도메인과 비교하여 보다 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인 (종합하여, CH) 및 경쇄의 CHL (또는 CL) 도메인을 함유한다.
항체의 “가변 영역” 또는 “가변 도메인”은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 “VH”로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 “VL”로 지칭될 수 있다. 이러한 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이며 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 “가변”은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 사이에서 서열이 광범위하게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 고르게 분포되어 있지 않다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변 영역 (HVR)으로 불리는 3개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 원상태 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 베타-시트 구조를 연결하고 일부 경우 이의 부분을 형성하는, 3개의 HVR에 의해 연결된 주로 베타-시트 구조를 채택하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각 사슬의 HVR은 FR 영역에 의해 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의HVR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991)). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접 관여하지 않지만, 항체-의존적 세포 독성에서 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
임의의 포유동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 “경쇄”는, 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (“κ”) 및 람다 (“λ”)로 불리는 2개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 IgG “아이소타입” 또는 “서브클래스”는 그들의 불변 영역의 화학적 및 항원성 특징에 의해 정의된 면역글로불린의 임의의 서브클래스를 의미한다. 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린)는 상이한 클래스에 할당될 수 있다. 면역글로불린의 5개의 주요 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 및 이들 중 몇 개는 하기로 추가로 분류될 수 있다: 서브클래스 (아이소타입), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, γ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 하위단위 구조 및 3차원 구조는 널리 알려져 있으며 일반적으로, 예를 들어, 하기에 기재되어 있다: Abbas 등 Cellular and Mol. Immunology, 4th ed., W.B. Saunders, Co., 2000. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와의 공유 또는 비-공유 결합에 의해 형성된 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 “전장 항체,” “온전한 항체” 및 “전체 항체”는 하기에 정의된 바와 같은 항체 단편이 아니라 그의 실질적으로 온전한 형태의 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
“항체 단편”은 온전한 항체의 부분을 포함하며, 바람직하게는 이의 항원 결합 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab’, F(ab’)2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 “Fab” 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 이름이 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 잔류 “Fc” 단편을 생산한다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원과 교차 결합할 수 있는 F(ab’)2 단편을 생성한다. Fab 단편은 중쇄- 및 경쇄 가변 도메인을 함유하며, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab’ 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇 개의 잔기를 부가함으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab’-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 갖는 Fab’에 대한 본원의 명칭이다. F(ab’)2 항체 단편은 본래 그들 사이의 힌지 시스테인을 갖는 Fab’ 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 알려져 있다.
“Fv”는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 일 구현예에서, 2개의 사슬 Fv 종은 단단하게 비공유 결합된 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이합체로 구성된다. 단일-사슬 Fv (scFv) 종에서, 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 가요성 펩타이드 링커에 의해 공유 결합될 수 있어서 경쇄 및 중쇄는 2개의 사슬 Fv 종에서의 것과 유사한 “이량체” 구조로 결합할 수 있다. 이 구조 내에서, 각 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원-결합 부위를 정의한다. 종합적으로, 6개의 HVR이 항체에게 항원-결합 특이성을 부여한다그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 낮은 친화성에도 불구하고 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
“단일-사슬 Fv” 또는 “scFv” 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하며, 이는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 해준다. scFv의 검토를 위해, 하기를 참고한다: 예컨대, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994.
용어 “디아바디”는 동일한 폴리펩타이드 사슬 (VH-VL) 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭한다. 너무 짧아서 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성할 수 없는 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는 하기에 더 상세히 기재되어 있다: 예를 들어, EP 제404,097호; WO 제1993/01161호; Hudson 등, Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). 트리아바디 및 테트라바디는 또한 하기에 기재되어 있다: Hudson 등, Nat. Med. 9:129-134 (2003).
본원에 사용된 바와 같이 용어 “단클론 항체”는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 예컨대, 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 가능한 돌연변이, 예컨대, 소량으로 존재할 수 있는 자연발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 “단클론”은 개별 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다. 특정 구현예에서, 이러한 단클론 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 표적-결합 폴리펩타이드 서열은 복수의 폴리펩타이드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩타이드 서열을 선택하는 것을 포함하는 과정에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선택 과정은 하이브리도마 클론, 파아지 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 풀 (pool)과 같은 복수의 클론으로부터 독특한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은, 예를 들어, 표적에 대한 친화성을 개선하기 위해, 표적 결합 서열을 인간화하기 위해, 세포 배양에서 그의 생산을 개선하기 위해, 생체내에서 그의 면역원성을 감소시키기 위해, 다중특이적 항체를 생성하기 위해, 더 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체는 또한 본 발명의 단클론 항체인 것으로 이해되어야 한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 달리, 단클론 항체 제제의 각 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다. 이들의 특이성 외에도, 단클론 항체 제제는 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
수식어 “단클론”은 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내며 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론 항체는 하기를 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다: 예를 들어, 하이브리도마 방법 (예컨대, Kohler 및 Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo 등, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling 등, in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법 (예컨대, 미국특허 제4,816,567호 참고), 파아지-디스플레이 기술 (예컨대, Clackson 등, Nature, 352:624-628 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu 등, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee 등, J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee 등, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부 또는 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예컨대, WO 제1998/24893호; WO 제1996/34096호; WO 제1996/33735호; WO 제1991/10741호; Jakobovits 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits 등, Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann 등, Year in Immunol. 7:33 (1993); 미국특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호; Marks 등, Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg 등, Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-813 (1994); Fishwild 등, Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996); 및 Lonberg 및 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995).
본원에서 단클론 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 반면, 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 “키메라성” 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (예컨대, 미국특허 제4,816,567호; 및 Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984) 참고). 키메라성 항체는 항체의 항원-결합 영역이, 예컨대, 짧은꼬리 원숭이를 관심 항원으로 면역화시킴으로써 생산된 항체로부터 유래된 PRIMATTZED® 항체를 포함한다.
비-인간 (예컨대, 쥣과) 항체의 “인간화” 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라성 항체이다. 일 구현예에서, 인간화 항체는 수여자의 HVR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및/또는 능력을 갖는 마우스, 랫트, 토끼, 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 HVR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린 (수여자 항체)이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더 향상시키기 위해 이뤄질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이고, 여기서 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 것과 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 세부사항을 위해, 하기를 참고한다: 예컨대, Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). 또한, 하기를 참고한다: 예컨대, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 및 미국특허 제6,982,321호 및 제7,087,409호.
“인간 항체”는 인간에 의해 생산된 항체의 것과 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하는 기술 중 어느 것을 사용하여 제조된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 인간 항체는 파아지-디스플레이 라이브러리를 포함하는 당업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581 (1991). 또한 인간 단클론 항체의 제조에 이용가능한 것은 하기에 기재된 방법이다: Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, p. 77 (1985); Boerner 등, J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991). 또한 하기를 참고한다: van Dijk 및 van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5:368-74 (2001). 인간 항체는 항원 투여에 반응하여 항체를 생산하도록 변형되었지만 내인성 유전자좌가 불능이 된 형질전환 동물, 예컨대, 면역화된 제노마우스에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다 (예컨대, 미국특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호, XENOMOUSETM 기술에 관함). 또한, 하기를 참고한다: 예를 들어, Li 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) (인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관함).
본원에서 사용될 때 용어 “초가변 영역,” “HVR,” 또는 “HV”는 서열이 초가변이고/이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH에서 3개 (H1, H2, H3), 및 VL에서 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 원상태 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR의 다양성을 가장 많이 나타내며, H3은 특히 항체에게 우수한 특이성을 부여하는 독특한 역할을 한다고 여겨진다. 하기를 참고한다: 예컨대, Xu 등, Immunity 13:37-45 (2000); Johnson 및 Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003). 실제로, 중쇄만으로 구성된 자연발생 낙타과 항체는 경쇄의 부재하에 기능적이며 안정하다. 하기를 참고한다: 예컨대, Hamers-Casterman 등, Nature 363:446-448 (1993); Sheriff 등, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996). 일부 구현예에서, HVR은 상보성 결정 영역 (CDR)이다.
많은 HVR 설명이 사용되고 있으며 이는 본원에 포함되어 있다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성에 기초하며 가장 흔하게 사용되는 것이다 (Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)). 초티아는 대신 구조적 루프의 위치를 언급한다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). AbM HVR은 카바트 HVR 및 초티아 구조적 루프 사이의 절충안이며, 옥스포드 분자 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. “접촉” HVR은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석에 기초한다. 이러한 HVR 각각으로부터의 잔기는 하기에 나타나 있다.
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HVR은 하기와 같이 “연장된 HVR”을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3) 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 이들 정의 각각에 대해 상기 카바트 등에 따라 넘버링된다.
“프레임워크” 또는 “FR” 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 HVR 잔기 이외의 가변 도메인이다.
용어 “카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링” 또는 “카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링,” 및 이의 변형은 상기 카바트 등에서 항체의 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 가변 도메인의 FR 또는 HVR 내로의 삽입에 해당하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 이후에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 이후에 삽입된 잔기 (예컨대, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체의 서열의 상동성 영역에서 “표준” 카바트 넘버링된 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기를 지칭할 때 사용된다 (경쇄의 약 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113) (예컨대, Kabat 등, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)). “EU 넘버링 시스템” 또는 “EU 지수”는 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭할 때 사용된다 (예컨대, 상기 카바트 등에서 보고된 EU 지수). “카바트에서와 같은 EU 지수”는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
용어 “다중특이적 항체”는 가장 넓은 의미로 사용되며, 특히 폴리에피토프 특이성을 갖는 (즉 하나의 생물학적 분자 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 2개 이상의 상이한 생물학적 분자 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는) 항원-결합 도메인을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체 (예컨대 이중특이적 항체)의 항원-결합 도메인은 2개의 VH/VL 단위를 포함하며, 제1 VH/VL 단위는 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고 제2 VH/VL 단위는 제2 에피토프에 특이적으로 결합하며, 각 VH/VL 단위는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 이러한 다중특이적 항체는, 비제한적으로, 전장 항체, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디 및 트리아바디, 공유 또는 비-공유 결합된 항체 단편을 포함한다. 중쇄 불변 영역의 적어도 일부 및/또는 경쇄 불변 영역의 적어도 일부를 추가로 포함하는 VH/VL 단위는 “헤미머” 또는 “절반 항체”로 지칭될 수도 있다. 일부 구현예에서, 절반 항체는 단일 중쇄 가변 영역의 적어도 일부 및 단일 경쇄 가변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 2개의 절반 항체를 포함하고 2개의 항원에 결합하는 이중특이적 항체는 제1 항원 또는 제1 에피토프에 결합하지만 제2 항원 또는 제2 에피토프에는 결합하지 않는 제1 절반 항체 및 제2 항원 또는 제2 에피토프에 결합하나 제1 항원 또는 제1 에피토프에 결합하지 않는 제2 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 다중특이적 항체는 5 M 내지 0.001 pM, 3 M 내지 0.001 pM, 1 M 내지 0.001 pM, 0.5 M 내지 0.001 pM, 또는 0.1 M 내지 0.001 pM의 친화성으로 각 항원 또는 에피토프에 결합하는 IgG 항체이다. 일부 구현예에서, 헤미머는 제2 헤미머와 분자내 디설파이드 결합이 형성되게 하는 중쇄 가변 영역의 충분한 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 헤미머는, 예를 들어, 상보적 홀 돌연변이 또는 노브 돌연변이를 포함하는 제2 헤미머 또는 절반 항체와 이종이량체화를 허용하는, 노브 돌연변이 또는 홀 돌연변이를 포함한다. 노브 돌연변이 및 홀 돌연변이는 하기에 추가로 논의된다.
“이중특이적 항체”는 하나의 생물학적 분자 상의 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하거나 또는 2개의 상이한 생물학적 분자 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 또한 “이중 특이성”을 갖거나 “이중 특이적”인 것으로 본원에 지칭될 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 이중특이적 항체 명칭에서 이중특이적 항체에 결합된 항원이 열거되는 순서는 임의적이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 2개의 절반 항체를 포함하며, 각각의 절반 항체는 단일 중쇄 가변 영역 및 선택적으로 중쇄 불변 영역의 적어도 일부, 및 단일 경쇄 가변 영역 및 선택적으로 경쇄 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 2개의 절반 항체를 포함하며, 각각의 절반 항체는 단일 중쇄 가변 영역 및 단일 경쇄 가변 영역을 포함하고 하나를 초과하는 단일 중쇄 가변 영역을 포함하지 않으며 하나를 초과하는 단일 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 2개의 절반 항체를 포함하며, 각각의 절반 항체는 단일 중쇄 가변 영역 및 단일 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제1 절반 항체는 제1 항원에 결합하고 제2 항원에는 결합하지 않으며 제2 절반 항체는 제2 항원에 결합하고 제1 항원에는 결합하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 “노브-인투-홀” 또는 “KnH” 기술은 하나의 폴리펩타이드 내에 돌기 (노브)를 도입하고 이들이 상호작용하는 계면에 있는 다른 폴리펩타이드 내에 공동 (홀)을 도입함으로써 시험관내 또는 생체내에서 2개의 폴리펩타이드가 함께 쌍을 형성하게 하는 기술을 지칭한다. 예를 들어, KnH는 항체의 Fc:Fc 결합 계면, CL:CH1 계면 또는 VH/VL 계면에 도입되었다 (참고: 예컨대, US 제2011/0287009호, US제2007/0178552호, WO 제96/027011호, WO 제98/050431호, 및 Zhu 등, 1997, Protein Science 6:781-788). 일부 구현예에서, KnH는 다중특이적 항체의 제조 동안 2개의 상이한 중쇄의 쌍 형성을 유도한다. 예를 들어, 그들의 Fc 영역 내에 KnH를 갖는 다중특이적 항체는 각 Fc 영역에 연결된 단일 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있거나, 또는 유사한 또는 상이한 경쇄 가변 도메인과 쌍을 형성하는 상이한 중쇄 가변 도메인을 추가로 포함한다. KnH 기술은 또한 2개의 상이한 수용체 세포외 도메인 또는 상이한 표적 인식 서열 (예컨대, 아피바디, 펩티바디 및 다른 Fc 융합 포함)을 포함하는 임의의 다른 폴리펩타이드 서열을 쌍을 형성시키는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 “노브 돌연변이”는 폴리펩타이드가 또 다른 폴리펩타이드와 상호작용하는 계면에 있는 폴리펩타이드 내에 돌기 (노브)를 도입하는 돌연변이를 지칭한다. 일부 구현예에서, 다른 폴리펩타이드는 홀 돌연변이를 갖는다 (참고: 예컨대, US 제5,731,168호, US 제5,807,706호, US 제5,821,333호, US 제7,695,936호, US 제8,216,805호, 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있음).
본원에 사용된 바와 같이 용어 “홀 돌연변이”는 폴리펩타이드가 또 다른 폴리펩타이드와 상호작용하는 계면에 있는 폴리펩타이드 내에 공동 (홀)을 도입하는 돌연변이를 지칭한다. 일부 구현예에서, 다른 폴리펩타이드는 노브 돌연변이를 갖는다 (참고: 예컨대, US 제5,731,168호, US 제5,807,706호, US 제5,821,333호, US 제7,695,936호, US 제8,216,805호, 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있음).
표현 “선형 항체”는 하기에 기재된 항체를 지칭한다: Zapata 등 (1995 Protein Eng, 8(10): 1057-1062). 간략하게, 이들 항체는 상보적 경쇄 폴리펩타이드와 함께, 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 Fd 분절 (VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 “약”은 당업자에 의해 결정된 바와 같이 각각의 값에 대한 허용가능한 오차 범위를 지칭하며, 이는 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 일부 의존할 것이다. 예를 들어, “약”은 당업계의 관행에 따라 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 본원에서 “약” 값 또는 매개변수에 대한 언급은 상기 값 또는 매개변수 자체에 관한 구현예를 포함하고 설명한다. 예를 들어, “약 X”에 관한 설명은 “X”의 설명을 포함한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형 “a”, “an” 및 “the”은 내용이 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, “화합물”에 대한 언급은 선택적으로 2개 이상의 이러한 화합물의 조합 등을 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 구현예는 측면 및 구현예를 “포함하는”, “구성되는,” 및 “본질적으로 구성되는”을 포함하는 것으로 이해된다.
II. 단백질 제제 및 제조
본 발명은 단백질 및 N-아세틸-트립토판 (NAT)을 포함하는 제제 (예컨대, 액체 제제)에 관한 것으로서, NAT는 단백질의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 단백질은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 단백질 중 메티오닌, 시스테인, 히스티딘, 트립토판, 및/또는 티로신은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 단백질 내 트립토판은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 약 50 Å2 내지 약 250 Å2 초과 (예를 들어, 약 임의의 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225 초과, 또는 250 Å2 초과, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)의 용매-접근가능한 표면적 (SASA)을 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, SASA는 약 80 Å2 초과이다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 약 15% 내지 약 45 % 초과 (예를 들어, 약 임의의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45% 초과)의 SASA를 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, SASA는 약 30% 초과이다. SASA는 하기에 기재된 인실리코 모든-원자 분자 역동학 (MD) 시뮬레이션 방법과 같이 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 계산될 수 있다: Sharma, V. 등, PNAS. 111(52): 18601-18606, 2014. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA는 약 4.0 내지 약 8.5의 pH 범위에서 측정된다. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA는 약 5℃ 내지 약 40℃ 범위의 온도에서 측정된다. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA는 약 0 mM 내지 약 500 mM 범위의 염 농도에서 측정된다. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA는 약 5.0 내지 약 7.5의 pH, 약 5℃ 내지 약 25℃의 온도 및 약 0 mM 내지 약 200 mM의 염 농도에서 측정된다. 일부 구현예에서, 단백질은 MD 모의실험을 기준으로 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성의 연합 상에서 트레이닝된 기계 학습 알고리즘에 의해 산화에 민감성인 것으로 예측되는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 임의의 단백질에 따른 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 액체 제제이다. 일부 구현예에서, 제제는 수성 제제이다.
일부 구현예에서, 제제 내의 NAT는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM 중 어느 것 (이들 값 사이의 임의의 범위를 포함)), 또는 NAT가 제제에 용해되는 최고 농도까지이다. 일부 구현예에서, 제제 내의 NAT는 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, NAT는 단백질 내 하나 이상의 트립토판 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 추가의 구현예에서, 반응성 산소 종은 단일선 산소, 슈퍼옥사이드 (O2-), 알콕실 라디칼, 퍼옥실 라디칼, 과산화수소 (H2O2), 삼산화이수소 (H2O3), 하이드로트리옥시 라디칼 (HO3ㆍ), 오존 (O3), 하이드록실 라디칼 및 알킬 퍼옥사이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 단클론 항체의 Fab 부분 내의 트립토판 아미노산 및/또는 단클론 항체의 Fc 부분 내의 메티오닌 아미노산은 산화에 민감할 수 있다.
일부 구현예에서, 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 제제 내의 예시적인 단백질 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL 초과, 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 15 mg/mL 내지 약 225 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 175 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 150 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 30 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 또는 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL를 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 추가의 구현예에서, NAT는 항체의 Fab 부분 내의 하나 이상의 아미노산의 산화를 방지한다. 또 다른 추가의 구현예에서, NAT는 항체의 Fc 부분 내의 하나 이상의 아미노산의 산화를 방지한다.
일부 구현예에서, 제형은 수성이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 제형은 단클론성 항체, 단백질의 산화를 방지하는 본원에 제공된 NAT 및 제형의 pH를 목적하는 수준으로 유지하는 완충제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 제제는 약 4.5 내지 약 9.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 제제는 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서 pH는 pH 4.0 내지 8.5의 범위, pH 4.0 내지 8.0의 범위, pH 4.0 내지 7.5의 범위, pH 4.0 내지 7.0의 범위, pH 4.0 내지 6.5의 범위, pH 4.0 내지 6.0의 범위, pH 4.0 내지 5.5의 범위, pH 4.0 내지 5.0의 범위, pH 4.0 내지 4.5의 범위, pH 4.5 내지 9.0의 범위, pH 5.0 내지 9.0의 범위, pH 5.5 내지 9.0의 범위, pH 6.0 내지 9.0의 범위, pH 6.5 내지 9.0의 범위, pH 7.0 내지 9.0의 범위, pH 7.5 내지 9.0의 범위, pH 8.0 내지 9.0의 범위, pH 8.5 내지 9.0의 범위, pH 5.7 내지 6.8의 범위, pH 5.8 내지 6.5의 범위, pH 5.9 내지 6.5의 범위, pH 6.0 내지 6.5의 범위, 또는 pH 6.2 내지 6.5의 범위이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 제제는 6.2 또는 약 6.2의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 구현예에서, 제제는 6.0 또는 약 6.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 임의의 단백질에 따른 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 제제는 대상체에게 투여하는데 적합한 약제학적 제제이다. 본원에 사용된 바와 같이 치료 또는 투여 목적을 위한 “대상체” 또는 “개체”는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
제제 내의 단백질 및 항체는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 제제 내의 항체 (예컨대, 전장 항체, 항체 단편 및 다중특이적 항체)는 당업계에서 이용가능한 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 이의 비제한적인 예시적인 방법은 하기 섹션에서 보다 상세히 기재된다. 본원의 방법은 펩타이드 기반 억제제와 같은 다른 단백질을 포함하는 제제의 제조를 위해 당업자에 의해 조정될 수 있다. 참고: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook 등, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, 등 eds., 2003); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds., J. Wiley 및 Sons, 2002); Current Protocols in Protein Science, (Horswill 등, 2006); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I.Freshney, 6th ed., J. Wiley 및 Sons, 2010) (치료 단백질의 생산을 위해 일반적으로 널리 이해되고 흔히 사용되는 기술 및 절차에 대해), 이들은 모두 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있음.
일부 구현예에서, 상기 기재된 임의의 제제 (예컨대, 액체 제제)에 따르면, 제제는 2개 이상의 단백질을 포함한다 (예컨대, 형성은 2개 이상의 단백질의 공동제제임). 예를 들어, 일부 구현예에서, 제제는 2개 이상의 단백질 및 N-아세틸-트립토판 (NAT)을 포함하는 공동제제이며, NAT는 2개 이상의 단백질 중 적어도 하나의 단백질의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, NAT는 복수의 2개 이상의 단백질의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, NAT는 2개 이상의 단백질 각각의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 단백질 중 적어도 하나의 단백질은 a) 약 50 Å2 내지 약 250 Å2를 초과하는 (예컨대 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 또는 250 Å2 중 어느 것을 초과하는 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)) 용매-접근가능 표면적 (SASA)을 갖거나; b) 약 15% 내지 약 45 %를 초과하는 (예컨대, 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45% 중 어느 것을 초과하는) SASA를 갖거나; 또는 c) MD 시뮬레이션에 기초한 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성과의 연관성에 대해 훈련된 기계 학습 알고리즘에 의해 산화에 민감할 것으로 예측된 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 2개 이상의 단백질은 a) 50 Å2 내지 약 250 Å2를 초과하는 (예컨대, 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 또는 250 Å2 중 어느 것을 초과하는 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)) 용매-접근가능 표면적 (SASA)을 갖거나; b) 약 15% 내지 약 45 %를 초과하는 (예컨대, 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45% 중 어느 것을 초과하는) SASA를 갖거나; 또는 c) MD 시뮬레이션에 기초한 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성과의 연관성에 대해 훈련된 기계 학습 알고리즘에 의해 산화에 민감할 것으로 예측된 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 단백질 각각은 a) 약 50 Å2 내지 약 250 Å2를 초과하는 (예컨대, 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 또는 250 Å2 중 어느 것을 초과하는 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함)) 용매-접근가능 표면적 (SASA)을 갖거나; b) 약 15% 내지 약 45 %를 초과하는 (예컨대, 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45% 중 어느 것을 초과하는) SASA를 갖거나; 또는 c) MD 시뮬레이션에 기초한 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성과의 연관성에 대해 훈련된 기계 학습 알고리즘에 의해 산화에 민감할 것으로 예측된 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 단백질 중 적어도 하나의 단백질은 항체, 예컨대 다클론 항체, 단클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 복수의 2개 이상의 단백질은 항체, 예컨대 다클론 항체, 단클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편로부터 독립적으로 선택된 항체이다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 단백질 각각은 항체, 예컨대 다클론 항체, 단클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편으로부터 독립적으로 선택된 항체이다. 일부 구현예에서, 제제의 하나 이상의 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제제는 액체 제제이다. 일부 구현예에서, 제제는 수성 제제이다.
A. 항체 제조
본원에 제공된 액체 제제 내의 항체는 관심 항원에 대한 것이다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩타이드이며, 항체를 장애를 겪고 있는 포유동물에게 투여하는 것은 상기 포유동물에서 치료 이점을 야기할 수 있다. 그러나, 비폴리펩타이드 항원에 대한 항체가 또한 고려된다.
항원이 폴리펩타이드인 경우, 그것은 막투과 분자 (예컨대 수용체) 또는 리간드, 예컨대 성장 인자일 수 있다. 예시적인 항원은 하기를 포함한다: 분자, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); CD20; ox-LDL; ox-ApoB100; 레닌; 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성자, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성자 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자 수용체, 예컨대 사멸 수용체 5 및 CD120; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나아제; RANTES (regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮬러관 억제 물질; 릴랙신 A-사슬; 릴랙신 B-사슬; 프로릴랙신; 마우스 성선자극호르몬 관련 펩타이드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 골-유래 신경영양성 인자 (BDNF), 신경영양인자-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타, 예컨대 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des (1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSF), 예컨대, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예컨대, IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥사이드 디스뮤타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어, AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 아드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 열거된 폴리펩타이드 중 어느 것의 단편.
(i) 항원 제조
선택적으로 다른 분자에 접합된 가용성 항원 또는 이의 단편은 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 막투과 분자, 예컨대 수용체의 경우, 이들의 단편 (예컨대, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로서 사용될 수 있다. 택일적으로, 막투과 분자를 발현하는 세포는 면역원으로서 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원 (예컨대 암 세포주)로부터 유래될 수 있거나 또는 막투과 분자를 발현하기 위한 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체를 제조하는데 유용한 다른 항원 및 이의 형태는 당업자에게 명백할 것이다.
(ii) 특정 항체-기반 방법
다클론 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보조제의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 생성된다. 이관능성 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드 (리신 잔기를 통한), 글루타르알데하이드, 무수 석신산, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬 그룹임)을 사용하여 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예컨대, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합하는 것이 유용할 수 있다.
동물은 하기에 의해 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대해 면역화된다: 예컨대, 100 μg 또는 5 μg의 단백질 또는 접합체 (각각 토끼 또는 마우스의 경우)를 3 부피의 프로인트 완전 보조제와 조합하고 상기 용액을 다수의 부위에 피내 주사함으로써. 1개월 후, 동물은 다수의 부위에서의 피하 주사에 의해 프로인트 완전 보조제 중의 펩타이드 또는 접합체의 원래 양의 1/5 내지 1/10를 사용하여 부스트된다. 7 내지 14일 후, 동물을 출혈시키고 혈청을 항체 역가에 대해 분석하였다. 동물은 역가가 정체될 때까지 부스트된다. 바람직하게는, 동물은 상이한 단백질에 접합되고/되거나 상이한 가교 시약을 통해 접합된 동일한 항원의 접합체로 부스트된다. 접합체는 또한 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양에서 제조될 수 있다. 또한, 명반과 같은 응집제가 면역 반응을 향상시키기 위해 적합하게 사용된다.
관심 단클론 항체는 Kohler 등, Nature, 256:495 (1975)에 최초로 기재되고, 하기에 추가로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다: 예컨대, Hongo 등, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling 등, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마에 관함). 추가의 방법은 하기에 기재된 것을 포함한다: 예를 들어, 미국특허 제7,189,826호 (하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 천연 IgM 항체의 생산에 관함). 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술)은 문헌[Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
다양한 다른 하이브리도마 기술의 경우, 하기를 참고한다: 예컨대, US 제2006/258841호; US 제2006/183887호 (완전 인간 항체), US 제2006/059575호; US 제2005/287149호; US 제2005/100546호; US 제2005/026229호; 및 미국특허 제7,078,492호 및 제7,153,507호. 하이브리도마 방법을 사용하여 단클론 항체를 생산하는 예시적인 프로토콜이 하기와 같이 기재되어 있다. 일 구현예에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터는 면역화를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발하기 위해 면역화된다. 항체는 관심 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 및 보조제, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트 (TDM)의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 생성된다 (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.). 관심 폴리펩타이드 (예컨대, 항원) 또는 이의 단편은 재조합 방법과 같이 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 이들 중 일부는 본원에 추가로 기재되어 있다. 면역화된 동물로부터의 혈청은 항-항원 항체에 대해 분석되고, 부스터 면역화가 선택적으로 투여된다. 항-항원 항체를 생산하는 동물로부터 림프구가 단리된다. 택일적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
이후, 림프구는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다. 하기를 참고한다: 예컨대, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986). 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생산을 지원하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 골수종 세포가 사용될 수 있다. 예시적인 골수종 세포는, 비제한적으로, 쥣과 골수종 주, 예컨대 하기로부터 이용가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것: Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA, 및 하기로부터 이용가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포를 포함한다: American Type Culture Collection, Rockville, Md.USA.인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 단클론 항체의 생산을 위해 기술되었다 (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 적합한 배양 배지, 예컨대, 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 배지에 시딩되고 성장된다. 예를 들어, 모 골수종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이며, 이 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다. 바람직하게는, 무혈청 하이브리도마 세포 배양 방법은, 하기에 기재된 바와 같이 우태아 혈청과 같은 동물 유래 혈청의 사용을 감소시키기 위해 사용된다: 예를 들어, Even 등, Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006).
하이브리도마 세포 배양의 생산성을 개선하기 위한 도구로서 올리고펩타이드는 문헌 [Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)]에 기재되어 있다. 구체적으로, 표준 배양 배지는 특정 아미노산 (알라닌, 세린, 아스파라긴, 프롤린), 또는 단백질 가수분해물 분획으로 농축되고, 세포자멸사는 3개 내지 6개 아미노산 잔기로 구성된 합성 올리고뉴클레오타이드에 의해 유의하게 억제될 수 있다. 펩타이드는 밀리몰 이상의 농도로 존재한다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 본원에 기재된 항체에 결합하는 단클론 항체의 생산에 대해 분석될 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예컨대 방사선면역분석 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 단클론 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 Scatchard 분석에 의해 결정될 수 있다. 하기를 참고한다: 예컨대, Munson 등, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
원하는 특이성, 친화성, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다. 하기를 참고한다: 예컨대, 상기 Goding. 이 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 (ascite) 종양으로서 생체내에서 성장할 수 있다. 아클론에 의해 분비된 단클론 항체는 종래의 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다. 하이브리도마 세포로부터 단백질을 단리하기 위한 하나의 절차는 하기에 기재되어 있다: US 제2005/176122호 및 미국특허 제6,919,436호. 상기 방법은 결합 과정에서 친액성 (lyotropic) 염과 같은 최소 염을 사용하는 것 및 바람직하게는 또한 용출 과정에서 소량의 유기 용매를 사용하는 것을 포함한다.
(iii) 특정 라이브러리 스크리닝 방법
본원에 기재된 제제 및 조성물 내의 항체는 조합 라이브러리를 사용하여 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체를 스크리닝함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 이러한 라이브러리에 대해 원하는 결합 특징을 갖는 항체를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다. 이러한 방법은 일반적으로 하기에 기재되어 있다: Hoogenboom 등, Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien 등, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001). 예를 들어, 관심 항체를 생성하는 한 가지 방법은 하기에 기재된 바와 같이 파아지 항체 라이브러리를 사용하는 것이다: Lee 등, J. Mol. Biol.(2004), 340(5): 1073-93.
원칙적으로, 합성 항체 클론은 파아지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 나타내는 파아지를 함유하는 파아지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 이러한 파아지 라이브러리는 원하는 항원에 대해 친화성 크로마토그래피에 의해 패닝 (panning)된다. 원하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되어 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이후, 결합 클론은 항원으로부터 용리되고, 항원 흡착/용리의 추가의 사이클에 의해 추가로 농축될 수 있다. 임의의 항체는 관심 파아지 클론을 선택하는 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계한 후, 관심 파아지 클론으로부터의 Fv 서열 및 하기에 기재된 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항체 클론을 구축함으로써 수득될 수 있다: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md.(1991), vols. 1-3.
특정 구현예에서, 항체의 항원-결합 도메인은 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)로부터 각각 하나의 약 110개 아미노산의 2개의 가변 (V) 영역으로부터 형성되고, 둘 모두는 3개의 초가변 루프 (HVR) 또는 상보성-결정 영역 (CDR)을 제시한다. 하기에 기재된 바와 같이, 가변 도메인은 VH 및 VL이 짧은 가요성 펩타이드를 통해 공유 결합된 단일-사슬 Fv (scFv) 단편으로서, 또는 이들이 불변 도메인에 각각 융합되어 비공유적으로 상호작용하는 Fab 단편으로서 파아지 상에서 기능적으로 디스플레이될 수 있다: Winter 등, Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994). 본원에 사용된 바와 같이, scFv를 코딩하는 파아지 클론 및 Fab를 코딩하는 파아지 클론은 종합하여 “Fv 파아지 클론” 또는 “Fv 클론”으로 지칭된다
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별개로 클로닝되고 파아지 라이브러리에서 무작위로 재조합된 다음, 하기에 기재된 바와 같이 항원-결합 클론이 탐색될 수 있다: Winter 등, Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994). 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제조할 필요없이 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 택일적으로, 순수한 레퍼토리는 하기에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 다양한 비-자기 및 또한 자기 항원에 인간 항체의 단일 공급원을 제공하도록 클로닝될 수 있다: Griffiths 등, EMBO J, 12:725-734 (1993). 마지막으로, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도의 가변적인 CDR3 영역을 코딩하고 하기에 기재된 바와 같이 시험관내 재배열을 달성함으로써 순수한 라이브러리가 또한 합성적으로 제조될 수 있다: Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992).
특정 구현예에서, 사상 (filamentous) 파아지는 마이너 코트 단백질 pIII에의 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이하는데 사용된다. 상기 항체 단편은, 예컨대 하기에 기재된 바와 같이, VH 및 VL 도메인이 가요성 폴리펩타이드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩타이드 사슬에 연결된 단일 사슬 Fv 단편으로서: Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), 또는 예컨대 하기에 기재된 바와 같이, 하나의 사슬은 pIII에 융합되고 다른 사슬은 박테리아 숙주 세포 주변세포질 내로 분비되는 (여기서, 야생형 코트 단백질의 일부를 대체함으로서 Fab-코트 단백질 구조의 조립이 파아지 표면 상에 디스플레이됨) Fab 단편으로서 디스플레이될 수 있다: Hoogenboom 등, Nucl. Acids Res., 19:4133-4137 (1991).
일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수확된 면역 세포로부터 수득된다. 항-항원 클론에 우호적인 편견을 가진 라이브러리를 원하는 경우, 대상체는 항체 반응을 생성하는 항원으로 면역화되고, 라이브러리 제작을 위해 비장 세포 및/또는 순환하는 B 세포 다른 말초 혈액 림프구 (PBL)가 회수된다. 일 구현예에서, 항-항원 클론에 우호적인 편견을 가진 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 기능적 인간 면역글로불린 유전자 집합체를 갖는 (그리고 기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결여된) 형질전환 마우스에서 항-항원 항체 반응을 생성하여 항원 면역화가 항원에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포를 생성함으로써 수득된다. 인간 항체-생산 형질전환 마우스의 생성은 하기에 기재되어 있다.
항-항원 반응성 세포 집단에 대한 추가 농축은 항원-특이적 막 결합된 항체를 발현하는 B 세포를 단리시키는 적합한 스크리닝 절차를 사용하여 수득될 수 있으며, 예컨대, 항원 친화성 크로마토그래피를 사용한 세포 분리 또는 세포의 형광색소 표지 항원에의 흡착 후 유세포 분리 (FACS)에 의해 수득될 수 있다.
택일적으로, 면역화되지 않은 공여자로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL의 사용은 가능한 항체 레퍼토리를 더 잘 나타내고, 또한 항원이 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 사용한 항체 라이브러리의 구축을 허용한다. 시험관내 항체 유전자 제작을 포함하는 라이브러리의 경우, 재배열되지 않은 항체 유전자 분절을 코딩하는 핵산을 제공하기 위해 줄기 세포가 대상체로부터 수확된다. 관심 면역 세포는 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 랫트, 토끼목, 루프린(luprine), 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 조류 종 등으로부터 얻을 수 있다.
항체 가변 유전자 분절 (VH 및 VL 분절 포함)을 코딩하는 핵산은 관심 세포로부터 회수되고 증폭된다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우, 원하는 DNA는 하기에 기재된 바와 같이 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 단리한 후, 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5’ 및 3’ 말단에 일치하는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행함으로써 얻을 수 있고: Orlandi 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:3833-3837 (1989), 이로써 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리를 만든다. V 유전자는 하기에 기재된 바와 같이 성숙한 V-도메인을 코딩하는 엑손의 5’ 말단에서 역방향 프라이머 및 J-분절 내에 기반한 전방향 프라이머를 사용하여 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다: Orlandi 등 (1989) 및 in Ward 등, Nature, 341:544-546 (1989). 그러나, cDNA로부터의 증폭을 위해, 역방향 프라이머는 하기에 기재된 바와 같이 리더 엑손에 기반할 수 있고: Jones 등, Biotechnol. , 9:88-89 (1991), 전방향 프라이머는 하기에 기재된 바와 같이 불변 영역 내에 기반할 수 있다: Sastry 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:5728-5732 (1989). 상보성을 최대화하기 위해, 하기에 기재된 바와 같이 프라이머 내에 축퇴성이 혼입될 수 있다: Orlandi 등 (1989) 또는 Sastry 등 (1989). 특정 구현예에서, 라이브러리 다양성은, 예컨대 하기의 방법에 기재된 바와 같이, 면역 세포 핵산 샘플에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭하기 위해 각 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함으로써 최대화된다: Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) 또는 Orum 등, Nucleic Acids Res., 21:4491-4498 (1993). 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 하기에 기재된 바와 같이 드문 제한 부위가 하나의 말단에서 태그로서 PCR 프라이머 내에 도입될 수 있거나: Orlandi 등 (1989), 또는 하기에 기재된 바와 같이 태깅된 프라이머를 사용하여 추가의 PCR 증폭에 의해 도입될 수 있다: Clackson 등, Nature, 352:624-628 (1991).
합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리는 시험관내에서 V 유전자 분절로부터 유래될 수 있다. 인간 VH-유전자 분절 대부분은 클로닝되었고 시퀀싱되었으며 (하기에 보고됨: Tomlinson 등, J. Mol. Biol., 227:776-798 (1992)), 맵핑되었고 (하기에 보고됨: Matsuda 등, Nature Genet., 3:88-94 (1993); 이러한 클로닝된 분절 (H1 및 H2 루프의 모든 주요 형태를 포함함)은 하기에 기재된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머를 사용하여 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성하는데 사용될 수 있다: Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992). VH 레퍼토리는 또한, 하기에 기재된 바와 같이, 단일 길이의 긴 H3 루프에 초점을 맞춘 모든 서열 다양성을 이용하여 제조될 수 있다: Barbas 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4457-4461 (1992). 인간 Vκ 및 Vλ 분절은 클로닝 및 시퀀싱되었고 (하기에 보고됨: Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23:1456-1461 (1993)), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하는데 사용될 수 있다. 다양한 VH 및 VL 접힘, 및 L3 및 H3 길이에 기초한 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당한 구조적 다양성의 항체를 코딩할 것이다. V-유전자를 코딩하는 DNA의 증폭 후, 생식계열 V-유전자 분절은 하기의 방법에 따라 시험관내에서 재배열될 수 있다: Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992).
항체 단편의 레퍼토리는 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 몇 가지 방법으로 함께 조합함으로써 제작될 수 있다. 각 레퍼토리는 상이한 벡터에서 생성될 수 있고, 상기 벡터는, 예컨대 하기에 기재된 바와 같이 시험관내에서 재조합되거나: Hogrefe 등, Gene, 128:119-126 (1993), 또는, 조합 감염, 예컨대 하기에 기재된 바와 같은 loxP 시스템에 의해 생체내에서 재조합된다: Waterhouse 등, Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993). 생체내 재조합 접근법은 E. 콜리 형질전환 효율에 의해 정해진 라이브러리 크기 한계를 극복하기 위해 Fab 단편의 2쇄 특성을 이용한다. 순수한 VH 및 VL 레퍼토리는 개별적으로, 하나는 파아지미지 내에 클로닝되고, 다른 하나는 파아지 벡터 내로 클로닝된다. 그후, 2개의 라이브러리는 파아지미드-함유 박테리아의 파아지 감염에 의해 조합되어, 각 세포는 상이한 조합을 함유하고 라이브러리 크기는 존재하는 세포의 수 (약 1012 클론)에 의해서만 제한된다. 두 벡터는 생체내 재조합 신호를 함유하고 있어서, VH 및 VL 유전자는 단일 레플리콘 상에서 재조합되고 파아지 비리온 내로 함께 패키징된다. 이러한 거대 라이브러리는 양호한 친화성 (약 10-8 M의 Kd- 1)의 다수의 다양한 항체를 제공한다.
택일적으로, 레퍼토리는, 예컨대 하기에 기재된 바와 같이, 동일한 벡터 내로 순차적으로 클로닝될 수 있거나: Barbas 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978-7982 (1991), 또는, 예컨대 하기에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 함께 조립된 다음 클로닝될 수 있다: Clackson 등, Nature, 352:624-628 (1991). PCR 조립은 또한 VH 및 VL DNA를 가요성 펩타이드 스페이서를 코딩하는 DNA와 결합시켜 단일 사슬 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성하는데 사용될 수 있다. 또 다른 기술에서, 하기에 기재된 바와 같이 “세포내 PCR 조립”이 PCR에 의해 림프구 내에서 VH 및 VL 유전자를 결합시킨 다음 연결된 유전자의 레퍼토리를 클로닝하는데 사용된다: Embleton 등, Nucl. Acids Res., 20:3831-3837 (1992).
순수한 라이브러리 (천연 또는 합성)에 의해 생산된 항체는 중간 친화성 (약 106 내지 107 M-1의 Kd- 1)일 수 있지만, 친화성 성숙은 하기에 기재된 바와 같이 또한 2차 라이브러리를 제작하고 이로부터 재선택에 의해 시험관내에서 모방될 수 있다: Winter 등 (1994), 상기. 예를 들어, 돌연변이가 하기의 방법에서 오류 유발 중합효소를 사용하여 시험관내에서 무작위로 도입될 수 있다 (Leung 등, Technique 1:11-15 (1989)에 보고됨): Hawkins 등, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992) 또는 Gram 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:3576-3580 (1992). 또한, 친화성 성숙은, 예컨대 선택된 개별 Fv 클론에서 관심있는 CDR에 걸쳐 있는 무작위 서열을 갖는 프라이머를 사용한 PCR을 사용하여 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시키고, 더 높은 친화성 클론을 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. WO 제9607754호 (하기에 공개됨: 1996년 3월 14일)는 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이를 유발하여 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하는 방법을 기술하였다. 또 다른 효과적인 접근법은, 하기에 기재된 바와 같이, 파아지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 면역화되지 않은 공여자로부터 얻은 자연발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리와 재조합하고 몇 회의 사슬 재셔플링에서 더 높은 친화성을 스크리닝하는 것이다: Marks 등, Biotechnol. , 10:779-783 (1992). 이 기술은 약 10-9 M 이하의 친화성을 갖는 항체 및 항체 단편의 생산을 가능하게 한다.
라이브러리의 스크리닝은 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 항원은 흡착 플레이트의 웰을 코딩하는데 사용되거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에서 발현되거나 또는 세포 분류에 사용되거나, 또는 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 바이오틴에 접합되거나, 또는 파아지 디스플레이 라이브러리를 패닝하는 임의의 다른 방법에서 사용될 수 있다.
파아지 라이브러리 샘플은 파아지 입자의 적어도 일부를 흡착제와 결합시키는데 적합한 조건하에 고정화된 항원과 접촉된다. 일반적으로, pH, 이온 강도, 온도 등을 포함하는 조건은 생리학적 조건을 모방하도록 선택된다. 고상에 결합된 파아지는 세척된 다음, 예컨대 하기에 기재된 바와 같이 산에 의해: Barbas 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88:7978-7982 (1991), 또는 하기에 기재된 바와 같이 알칼리에 의해: Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), 또는 항원 경쟁에 의해, 예컨대, 하기의 항원 경쟁 방법과 유사한 절차에서 용출된다: Clackson 등, Nature, 352:624-628 (1991). 파아지는 1회 선택으로 20-1,000배 농축될 수 있다. 또한, 농축된 파아지는 박테리아 배양에서 성장되고 추가 횟수의 선택을 거칠 수 있다.
선택 효율은 세척 동안의 해리 동력학, 및 단일 파아지 상의 다중 항체 단편이 항원과 동시에 결합할 수 있는지 여부를 포함하는 많은 인자에 따라 달라진다. 빠른 해리 동력학 (및 약한 결합 친화성)을 갖는 항체는 짧은 세척, 다가 파아지 디스플레이 및 고상에서 항원의 높은 코팅 밀도의 사용에 의해 유지될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파아지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파아지의 재결합을 촉진한다. 느린 해리 동력학 (및 양호한 결합 친화성)을 갖는 항체의 선택은 하기에 기재된 바와 같이 긴 세척 및 1가 파아지 디스플레이: Bass 등, Proteins, 8:309-314 (1990) 및 WO 제92/09690호, 및 하기에 기재된 바와 같이 항원의 낮은 코팅 밀도의 사용에 의해 촉진될 수 있다: Marks 등, Biotechnol. , 10:779-783 (1992).
항원에 대해, 상이한 친화성의 파아지 항체, 심지어 약간 상이한 친화성을 갖는 파아지 항체 사이에서 선택할 수 있다. 그러나, 선택된 항체의 무작위 돌연변이 (예컨대 일부 친화성 성숙 기술에서 수행된 바와 같음)는, 대부분은 항원에 결합하고 몇 가지는 더 높은 친화성을 갖는, 많은 돌연변이체를 발생시킬 가능성이 높다. 제한 항원을 사용하여, 희귀한 고친화성 파아지가 경쟁될 수 있다. 모든 더 높은 친화성 돌연변이체를 유지시키기 위해, 파아지는 과량의 바이오티닐화된 항체이지만 항원에 대한 목표 몰 친화성 상수보다 낮은 몰 농도의 바이오티닐화된 항원과 인큐베이션될 수 있다. 이후, 고친화성-결합 파아지는 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 이러한 “평형 포획”은 더 낮은 친화성을 가진 과량의 파아지로부터 2배 정도의 더 높은 친화성을 갖는 돌연변이체 클론을 단리하게 해 주는 민감도로 결합하는 친화성에 따라 항체를 선택할 수 있게 해준다. 고상에 결합된 파아지를 세척하는데 사용된 조건은 또한 해리 동력학에 기초하여 구별하도록 조작될 수 있다.
항-항원 클론은 활성에 기초하여 선택될 수 있다특정 구현예에서, 본 발명은 자연적으로 항원을 발현하는 살아있는 세포에 결합하거나 또는 자유 부유 항원 또는 다른 세포 구조에 부착된 항원에 결합하는 항-항원 항체를 제공한다. 이러한 항-항원 항체에 상응하는 Fv 클론은 (1) 상기 기재된 바와 같은 파아지 라이브러리로부터 항-항원 클론을 단리시키고, 선택적으로 상기 단리된 파아지 클론의 집단을 적합한 박테리아 숙주에서 성장시켜 상기 집단을 증폭시키는 단계; (2) 각각 차단 및 비-차단 활성이 요구되는 항원 및 제2 단백질을 선택하는 단계; (3) 항-항원 파아지 클론을 고정화된 항원에 흡착시키는 단계; (4) 과량의 제2 단백질을 사용하여 제2 단백질의 결합 결정기와 중첩되거나 공유되는 항원-결합 결정기를 인식하는 임의의 원하지 않는 클론을 용출시키는 단계; 및 (5) 단계 (4) 후에 흡착된 상태로 있는 클론을 용출시키는 단계에 의해 선택될 수 있다. 선택적으로, 원하는 차단/비-차단 특성을 갖는 클론은 본원에 기재된 선택 절차를 1회 이상 반복함으로써 더 농축될 수 있다.
하이브리도마-유래 단클론 항체 또는 파아지 디스플레이 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 종래의 절차를 사용하여 (예컨대 하이브리도마 또는 파아지 DNA 주형으로부터 관심있는 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여) 쉽게 단리되고 시퀀싱된다. 단리되면, DNA는 발현 벡터에 위치할 수 있고, 이후 상기 벡터는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 E. 콜리 세포, 시미안 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 원하는 단클론 항체를 합성한다. 항체-코딩 DNA의 박테리아 내 재조합 발현에 관한 검토 논문은 하기를 포함한다: Skerra 등, Curr. Opinion in Immunol., 5:256 (1993) 및 Pluckthun, Immunol. Revs, 130:151 (1992).
Fv 클론을 코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지된 DNA 서열 (예컨대 적절한 DNA 서열은 상기 Kabat 등으로부터 수득될 수 있음)과 조합되어 전체 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하는 임의의 아이소타입의 불변 영역이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있으며, 이러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음이 이해될 것이다. 하나의 동물 (예컨대, 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 다음 또 다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합되어 “하이브리드” 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 위한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론은 본원에 사용된 바와 같은 “키메라성” 및 “하이브리드” 항체의 정의에 포함된다. 특정 구현예에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 전체- 또는 부분-길이 인간 중쇄 및/또는 경쇄를 위한 코딩 서열(들)을 형성한다.
하이브리도마로부터 유래된 항-항원 항체를 코딩하는 DNA는 또한, 예를 들어, 하이브리도마 클론으로부터 유래된 상동성 쥣과 서열 대신에 인간 중쇄- 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 변형될 수 있다 (예컨대 하기의 방법에서와 같음: Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). 하이브리도마- 또는 Fv 클론-유래 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA는 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부와 공유결합함으로써 추가로 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래 항체의 결합 특이성을 갖는 “키메라성” 또는 “하이브리드” 항체가 제조된다.
(iv) 인간화 및 인간 항체
비-인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 인간화 항체 내로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 “수입” 잔기로 불리며, 이는 전형적으로 “수입” 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 하기에 의해 하기의 방법에 따라 본질적으로 수행될 수 있다: Winter 및 동료 (Jones 등, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science, 239:1534-1536 (1988)), 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써. 따라서, 이러한 “인간화” 항체는 키메라성 항체이며 (미국특허 제4,816,567호), 여기서 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환되었다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 아마도 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용되는 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 모두)의 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 “최적-적합” 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 알려진 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 이후, 설치류의 것과 가장 가까운 인간 서열은 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 받아들여진다 (Sims 등, J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia 등, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크가 몇 개의 상이한 인간화 항체에 사용될 수 있다 (Carter 등, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta 등, J. Immunol., 151:2623 (1993)).
항체가 항원에 대해 높은 친화성 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 본 방법의 일 구현예에 따르면, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물을 분석하는 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용가능하며, 이는 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 나타내고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 표시의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기들의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기들의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수여자 및 수입 서열로부터 선택되고 조합되어, 원하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성이 달성될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는데 관여한다.
본원에 기재된 제제 및 조성물 내의 인간 항체는 인간-유래 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기 기재된 바와 같이 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 제작될 수 있다. 택일적으로, 인간 단클론 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 하기에 기재되었다: 예를 들어, Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner 등, J. Immunol., 147:86 (1991).
면역화시 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질전환 동물 (예컨대, 마우스)을 생산할 수 있다. 예를 들어, 키메라성 및 생식계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자의 동형접합 결실은 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 초래한다고 기술되었다. 이러한 생식계열 돌연변이체 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 투여시 인간 항체를 생산할 것이다. 하기를 참고한다: 예컨대, Jakobovits 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits 등, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann 등, Year in Immuno., 7:33 (1993); 및 Duchosal 등 Nature 355:258 (1992).
유전자 셔플링은 또한 비-인간, 예컨대 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수 있고, 여기서 인간 항체는 출발하는 비-인간 항체와 유사한 친화성 및 특이성을 갖는다. “에피토프 각인(imprinting)”으로도 불리는 이 방법에 따르면, 본원에 기재된 파아지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어, 비-인간 사슬/인간 사슬 scFv 또는 Fab 키메라의 집단을 생성한다. 항원을 이용한 선택은 비-인간 사슬/인간 사슬 키메라성 scFv 또는 Fab를 단리시키고, 여기서 인간 사슬은 일차 파아지 디스플레이 클론 내의 상응하는 비-인간 사슬의 제거시에 파괴된 항원 결합 부위를 회복시키며, 즉 에피토프는 인간 사슬 파트너의 선택을 지배 (각인)한다. 나머지 비-인간 사슬을 대체하기 위해 상기 과정이 반복되면, 인간 항체가 수득된다 (참고: PCT WO 제93/06213호, 1993년 4월1일에 공개됨). CDR 접목에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와 달리, 이 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는 완전 인간 항체를 제공한다.
(v) 항체 단편
항체 단편은 효소 소화와 같은 전통적인 수단에 의해, 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정한 경우, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 더 작은 크기의 단편은 빠르게 제거되며, 이는 고체 종양에 대한 개선된 접근으로 이어질 수 있다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 하기를 참고한다: Hudson 등 (2003) Nat. Med. 9:129-134.
항체 단편을 생산하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질분해 소화를 통해 유래되었다 (참고: 예컨대, Morimoto 등, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 및 Brennan 등, Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이러한 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 E. 콜리에서 발현되거나 이로부터 분비될 수 있어서, 이러한 단편을 다량으로 쉽게 생산할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 택일적으로, Fab’-SH 단편은 E. 콜리로부터 직접 회수될 수 있고 화학적으로 커플링되어 F(ab’)2 단편을 형성할 수 있다 (Carter 등, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 따르면, F(ab’) 2 단편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접 단리될 수 있다. 구제 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab’) 2 단편이 하기에 기재되어 있다: 미국특허 제5,869,046호. 항체 단편을 생산하기 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 특정 구현예에서, 항체는 단일 사슬 Fv 단편 (scFv)이다. 하기를 참고한다: WO 제93/16185호; 미국특허 제5,571,894호; 및 제5,587,458호. Fv 및 scFv는 불변 영역이 없는 온전한 결합 부위를 갖는 유일한 종이므로; 이들은 생체내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카복시 말단에서 효과기 단백질의 융합을 생성하도록 제작될 수 있다. 하기를 참고한다: Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기. 항체 단편은 또한 하기에 기재된 바와 같은 “선형 항체”일 수 있다: 예컨대, 미국특허 제5,641,870호. 이러한 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
(vi) 다중특이적 항체
다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지며, 여기서 에피토프는 일반적으로 상이한 항원으로부터 유래된다. 이러한 분자는 통상 2개의 상이한 에피토프에만 결합할 것이지만 (즉, 이중특이적 항체, BsAb), 삼중특이적 항체와 같이 추가적인 특이성을 갖는 항체가 본원에 사용될 때 이 표현에 포함된다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다 (예컨대 F(ab’)2 이중특이적 항체).
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기초하며, 여기서 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein 등, Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열 때문에, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이들 중 오직 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 일반적으로 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거로우며, 생성물 수율은 낮다. 유사한 절차가 하기에 기재되어 있다: WO 제93/08829호, 및 Traunecker 등, EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
상이한 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2, 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 함께 이루어진다. 적어도 하나의 융합물에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 전형적이다. 면역글로불린 중쇄 융합 및, 원하는 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 별개의 발현 벡터에 삽입되고, 적합한 숙주 유기체에 공동 형질감염된다. 이것은 제작에 사용된 동일하지 않은 비율의 3개의 폴리펩타이드 사슬이 최적 수율을 제공할 때의 구현에서 3개의 폴리펩타이드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 적어도 2개의 폴리펩타이드 사슬의 발현이 높은 수율을 초래하는 경우 또는 비율이 특별한 의미가 없는 경우, 하나의 발현 벡터에 2개 또는 모든 3개의 폴리펩타이드 사슬에 대한 코딩 서열을 삽입할 수 있다.
이 접근법의 일 구현예에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암 (arm)에서 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 아암에서 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자 중 오직 하나의 절반 내에 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방법을 제공하므로, 이러한 비대칭 구조는 원하지 않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 제94/04690호에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 추가의 세부사항을 위해, 하기를 참고한다: 예를 들어, Suresh 등, Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
WO제96/27011호에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면은 재조합 세포 배양으로부터 회수된 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 하나의 계면은 항체 불변 도메인의 CH 3 도메인 중 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더 큰 측쇄 (예컨대 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄 (예컨대 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면 상에 큰 측쇄(들)와 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 “공동 (cavity)”이 생성된다. 이것은 동종이량체와 같은 다른 원하지 않는 최종 생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 기전을 제공한다.
이중특이적 항체는 교차결합 또는 “이종접합체” 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체 중 하나는 아비딘에 결합될 수 있고, 다른 하나는 바이오틴에 결합될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, 하기를 위해 제안되었다: 표적 면역 시스템 세포를 원하지 않는 세포에 표적화하기 위해 (미국특허 제4,676,980호), 그리고 HIV 감염을 치료하기 위해 (WO 제91/00360호, WO 제92/200373호, 및 EP 제03089호). 이종접합체 항체는 임의의 편리한 교차결합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 교차결합제는 당업계에 널리 알려져 있으며, 많은 교차결합 기술과 함께, 하기에 개시되어 있다: 미국특허 제4,676,980호.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 문헌에 기재되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 사용하여 제조될 수 있다. Brennan 등, Science, 229:81 (1985)은 온전한 항체가 단백질분해로 절단되어 F(ab’)2 단편을 생성하는 절차를 기술한다. 이러한 단편은 디티올 복합제 나트륨 아르세나이트의 존재하에 환원되어 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지한다. 이후, 생성된 Fab’ 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이후, Fab’-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민을 이용한 환원에 의해 Fab’-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab’-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 E. 콜리로부터의 Fab’-SH 단편의 직접적인 회수를 용이하게 하였고, 이는 화학적으로 결합되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. Shalaby 등, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab’)2 분자의 생산을 기술한다. 각 Fab’ 단편은 E. 콜리로부터 개별적으로 분비되고 시험관내에서 유도 화학적 결합되어 이중특이적 항체를 형성하였다.
재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다. Kostelny 등, J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩타이드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab’ 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음 재산화되어 항체 이종이량체를 형성한다. 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. 하기에 기재된 “디아바디” 기술: Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)은 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 기전을 제공하였다. 단편은 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성하게 하기에 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하게 되어, 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일-사슬 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 하기를 참고한다: Gruber 등, J. Immunol, 152:5368 (1994).
2개를 초과하는 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. Tuft 등 J. Immunol. 147:60 (1991).
(vii) 단일-도메인 항체
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; 참고: 예컨대, 미국특허 제6,248,516호 B1). 일 구현예에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 구성된다.
(viii) 항체 변이체
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 내로 적절한 변화를 도입함으로써, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 제작물이 원하는 특징을 갖는 한, 최종 제작물에 도달하기 위해 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이뤄질 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 만들어질 때 대상체 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
(ix) 항체 유도체
본 발명의 제제 및 조성물 내의 항체는 당업계에 알려지고 쉽게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는, 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸레이티드 폴리올 (예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 그의 안정성으로 인해 제조시 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지되거나 비분지될 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나를 초과하는 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용된 중합체의 수 및/또는 유형은, 비제한적으로, 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건하에 요법에서 사용될지 여부 등을 포함한 고려 사항에 기초하여 결정될 수 있다.
(x) 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
항체는 또한 재조합 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 항-항원 항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 코딩하는 핵산이 단리되고 추가 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입된다. 항체를 코딩하는 DNA는 종래의 절차를 사용하여 (예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로, 비제한적으로, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
(a) 신호 서열 성분
본원에 기재된 제제 및 조성물 내의 항체는 직접적으로뿐만 아니라 바람직하게는 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 있는 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드인 이종 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는 (예컨대, 신호 펩티다아제에 의해 절단되는) 것이다. 천연 항체 신호 서열을 인식 및 처리하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은, 예를 들어, 알칼리 포스파타아제, 페니실리나제, lpp, 또는 내열성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 신호에 의해 치환된다. 효모 분비의 경우, 천연 신호 서열은 예컨대, 효모 인버타아제 리더, 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 포함), 또는 산 포스파타아제 리더, C. 알비칸스 글루코아밀라아제 리더, 또는 WO 제90/13646호에 기재된 신호에 의해 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다.
(b) 복제 원점
발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서, 이 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있게 하는 서열이며 복제 원점 또는 자율적으로 복제하는 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대해 널리 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 원점은 대부분의 그램 음성 박테리아에 적합하며, 2μ 플라스미드로부터의 복제 원점은 효모에 적합하고, 및 다양한 바이러스 복제 원점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 원점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (SV40 원점은 전형적으로 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다).
(c) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택 마커로도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예컨대, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보충하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 코딩하며, 예컨대, D-알라닌 라세마아제를 코딩하는 유전자이다.
선택 계획의 한 가지 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하여 선택 요법에서 살아남는다. 이러한 우성 선택은 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신 약물을 사용한다.
포유동물 세포에 대한 적합한 선택 마커의 또 다른 예는 항체-코딩 핵산을 흡수하는 능력이 있는 세포를 확인할 수 있는 것, 예컨대 DHFR, 글루타민 합성효소 (GS), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나아제, 오르니틴 데카복실라제 등이다.
예를 들어, DHFR 유전자로 형질전환된 세포는 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 이러한 조건하에, DHFR 유전자는 임의의 다른 공동-형질전환된 핵산과 함께 증폭된다. 내인성 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예컨대, ATCC CRL-9096)가 사용될 수 있다.
택일적으로, GS 유전자로 형질전환된 세포는 GS의 억제제인 L-메티오닌 설폭시민 (Msx)을 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 이러한 조건 하에, GS 유전자는 임의의 다른 공동-형질전환된 핵산과 함께 증폭된다. GS 선택/증폭 시스템은 상기 기재된 DHFR 선택/증폭 시스템과 조합하여 사용될 수 있다.
택일적으로, 관심 항체를 코딩하는 DNA 서열, 야생형 DHFR 유전자, 및 아미노글리코시드 3’-포스포트랜스퍼라아제 (APH)와 같은 또 다른 선택 마커로 형질전환된 또는 공동-형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR를 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코시드 항생제, 예컨대, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418과 같은 선택 마커에 대한 선택제를 함유하는 배지에서 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 하기를 참고한다: 미국특허 제4,965,199호.
효모에서 사용하는데 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb 등, Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 하기에 대한 선택 마커를 제공한다: ATCC 번호44076 또는 PEP4-1.Jones, Genetics, 85:12 (1977). 이후, 효모 숙주 세포 게놈에서 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
또한, 1.6 μm 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 택일적으로, 재조합 송아지 카이모마이신의 대량 생산을 위한 발현 시스템이 K. lactis에 대해 보고되었다. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). 클루이베로마이세스의 산업 균주에 의해 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민을 분비하기 위한 안정한 다중 복제 발현 벡터가 또한 개시되었다. Fleer 등, Bio/Technology, 9:968-975 (1991).
(d) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리 포스파타아제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터가 적합하다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
프로모터 서열은 진핵생물에 대해 알려져 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 시작되는 부위로부터 약 25 내지 30 염기 상류에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 시작으로부터 70 내지 80 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역이며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드이다. 대부분의 진핵 유전자의 3’ 말단에는 코딩 서열의 3’ 말단에 폴리 A 테일을 첨가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 이러한 모든 서열은 진핵 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주와 함께 사용하기 위한 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라아제, 포스포글루코스 이소머라아제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 탈수소효소 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타아제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 및 말토스 및 갈락토오스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에서 사용하기 위한 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 제73,657호에 더 기재되어 있다. 효모 인핸서는 또한 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 전사는, 이러한 프로모터가 숙주 세포 시스템과 양립가능한 한, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 시미안 바이러스 40 (SV40)와 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터, 또는 이종 포유동물 프로모터, 예컨대, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 열충격 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 원점을 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소 파필로마 바이러스를 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 하기에 개시되어 있다: 미국특허 제4,419,446호. 이 시스템의 변형은 하기에 기재되어 있다: 미국특허 제4,601,978호.또한 하기를 참고한다: Reyes 등, Nature 297:598-601 (1982) (단순 포진 바이러스로부터 티미딘 키나제 프로모터의 제어하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대함). 택일적으로, Rous 육종 바이러스 긴 말단 반복이 프로모터로서 사용될 수 있다.
(e) 인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의한 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 벡터 내로 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자로부터 알려져 있다(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질, 및 인슐린). 그러나, 전형적으로, 진핵 세포 바이러스의 인핸서를 사용할 것이다. 예는 복제 원점의 후기 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 후기 쪽의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한 하기를 참고한다: Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) (진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 관함). 인핸서는 항체-코딩 서열의 5’ 또는 3’ 위치에서 벡터에 접합될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5’ 부위에 위치한다.
(f) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용된 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 비번역 영역의 5’ 및 때로는 3’로부터 이용가능하다. 이러한 영역은 mRNA 코딩 항체의 비번역 부분에 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 분절을 함유한다. 한 가지 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 하기를 참고한다: WO제94/11026호 및 그 안에 개시된 발현 벡터.
(g) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터 내의 DNA를 클로닝하거나 발현하기 위한 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 또는 상기 기재된 고등 진핵생물 세포이다. 이 목적을 위한 적합한 원핵생물은 하기를 포함한다: 진정세균, 예컨대 그램 음성 또는 그램 양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세애, 예컨대 에스케리치아, 예컨대, E. 콜리, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테오스, 살모넬라, 예컨대, 살모넬라 티피무리움, 세라티아, 예컨대, 세라티아 마르세스칸스, 및 쉬겔라, 뿐만 아니라 바실러스, 예컨대 B. 서브틸리스 및 B. 리케니포르미스 (예컨대, 하기에 개시된 B. 리케니포르미스 41P: DD 266,710, 1989년 4월 12일에공개됨), 슈도모나스, 예컨대 P. 애루지노사, 및 스트렙토마이세스. 한 가지 바람직한 E. 콜리 클로닝 숙주는 E. 콜리 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예컨대 E. 콜리 B, E. 콜리 X1776 (ATCC 31,537), 및 E. 콜리 W3110 (ATCC 27,325)이 적합하다. 이러한 예는 제한하는 것이 아니라 예시적이다.
전장 항체, 항체 융합 단백질, 및 항체 단편은 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 예컨대 치료 항체가 그 자체로 종양 세포 파괴에서 효과를 나타내는 세포독성제 (예컨대, 독소)에 접합되는 경우, 박테리아에서 생산될 수 있다. 전장 항체는 순환에서 더 큰 반감기를 갖는다. E. 콜리에서의 생산은 더 빠르고 더 비용 효율적이다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현은, 하기를 참고하며: 예컨대, 미국특허 제5,648,237호 (Carter 등), 미국특허 제5,789,199호 (Joly 등), 미국특허 제5,840,523호 (Simmons 등), 이는 번역 개시 영역 (TIR) 및 발현 및 분비를 최적화하기 위한 신호 서열을 기술한다. 또한 하기를 참고한다: Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C.Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254 (E. 콜리에서 항체 단편의 발현을 기술함). 발현 후, 항체는 가용성 분획에서 E. 콜리 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 예컨대, 아이소타입에 따라 단백질 A 또는 G 컬럼을 통해 정제될 수 있다. 최종 정제는 예컨대, CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하는 과정과 유사하게 수행될 수 있다.
원핵생물 이외에도, 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모는 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애, 또는 일반적인 빵 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종, 및 균주, 예컨대 쉬조사카로마이세스 폼베; 클루이베로마이세스 숙주, 예컨대, K. 락티스, K. 프라질리스 (ATCC 12,424), K. 불가리쿠스 (ATCC 16,045), K. 윅케라미 (ATCC 24,178), K. 왈티 (ATCC 56,500), K. 드로소필라룸 (ATCC 36,906), K. 써모톨레란스, 및 K. 마르시아누스; 야로위아 (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (EP 183,070); 칸디다; 트리코더마 레에시아 (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사; 쉬완니오마이세스, 예컨대 쉬완니오마이세스 옥시덴탈리스; 및 사상 진균, 예컨대, 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라디움, 및 아스퍼질러스 숙주, 예컨대 A. 니둘란스 및 A. 니거가 본원에서 일반적으로 이용가능하며 유용하다. 치료 단백질의 생산을 위한 효모 및 사상 진균의 용도를 논의하는 검토를 위해, 하기를 참고한다: 예컨대, Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004).
당화 경로가 “인간화”되어 부분적 또는 완전한 인간 당화 패턴을 갖는 항체를 생산하는 특정 진균 및 효모 균주가 선택될 수 있다. 하기를 참고한다: 예컨대, Li 등, Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006) (피키아 파스토리스에서 당화 경로의 인간화를 기술함); 및 Gerngross 등, 상기.
당화된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 많은 배큘로바이러스 균주 및 변이체 및 스포돕테라 프루지페르다 (애벌레), 애데스 애집티 (모기), 애데스 알보픽투스 (모기), 도로소필라 멜라노가스터 (초파리), 및 봄빅스 모리와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용된 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예컨대, 아우토그라파 칼리포르니카 NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용가능하며, 이러한 바이러스는, 특히 스포돕테라 프루지페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 본원의 바이러스로서 사용될 수 있다.
면화, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토, 좀개구리밥 (Leninaceae), 알팔파 (M. truncatula), 및 담배의 식물 세포 배양이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 하기를 참고한다: 예컨대, 미국특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호 (형질전환 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 기술함).
척추동물 세포는 숙주로서 사용될 수 있고, 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 하기이다: SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 주 (현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham 등, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol.Reprod.23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather 등, Annals N.Y.Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 주 (Hep G2). 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 하기를 포함한다: 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예컨대 DHFR- CHO 세포 (Urlaub 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 NS0 및 Sp2/0. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 하기를 참고한다: 예컨대, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C.Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268.
숙주 세포는 항체 생산을 위한 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하는데 적절하게 변형된 종래의 영양 배지에서 배양된다.
(h) 숙주 세포 배양
항체를 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham’s F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글스 배지 ((DMEM), Sigma)와 같은 상업적으로 이용가능한 배지가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, Ham 등, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes 등, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 미국특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 제90/03430호; WO 제87/00195호; 또는 미국특허Re.30,985호에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 임의의 이러한 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 인산염), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오타이드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, GENTAMYCINTM 약물), 미량 원소 (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 또한 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 이전에 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사용된 것이며, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
(xi) 항체의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포내로, 주변세포질 공간에서 생산되거나, 또는 배지에 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되면, 제1 단계로서, 미립자 파편인 숙주 세포 또는 용균 단편이, 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. Carter 등, Bio/Technology 10:163-167 (1992)은 E. 콜리의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체르 단리하는 절차를 기술한다. 간략하게, 세포 페이스트는 약 30분 동안 아세트산 나트륨 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 해동된다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상층액은 일반적으로 상업적으로 이용가능한 단백질 농도 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 사용하여 먼저 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질분해를 억제하기 위한 임의의 전술한 단계에서 포함될 수 있고, 항생제가 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 친화성 크로마토그래피는 전형적으로 바람직한 정제 단계 중 하나이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 아이소타입에 의존한다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기초하여 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (Lindmark 등, J. Immunol. Meth.62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 아이소타입에 대해 그리고 인간 γ3에 대해 권고된다 (Guss 등, EMBO J. 5:15671575 (1986)). 단백질 L은 카파 경쇄에 기초하여 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (Nilson 등, J. Immunol. Meth.164(1): 33-40, 1993). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스가 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABXTM 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, 폴리아스파트산 컬럼) 상의 헤파린 세파로스TM 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 암모늄 설페이트 침전이 회수될 항체에 따라 또한 이용가능하다.
일반적으로, 연구, 시험, 및 임상에서 사용하기 위한 항체를 제조하는 다양한 방법론은 당업계에 널리 확립되어 있고, 상기 기재된 방법론과 일치하고/하거나, 관심있는 특정 항체에 대해 당업자에게 적절한 것으로 간주된 바와 같다.
B. 생물학적 활성 항체의 선택
상기 기재된 바와 같이 생산된 항체는 치료 관점에서 유익한 특성을 갖는 항체를 선택하기 위한 하나 이상의 “생물학적 활성” 분석에 적용될 수 있다. 항체는 그것이 생육된 항원에 결합하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 항-DR5 항체 (예컨대, 드로지투맙)의 경우, 항체의 항원 결합 특성은 사멸 수용체 5 (DR5)에 결합하는 능력을 검출하는 분석에서 평가될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 항체의 친화성은 하기에 의해 결정될 수 있다: 예를 들어, 포화 결합; ELISA; 및/또는 경쟁 분석 (예컨대 RIA).
또한, 항체는, 예컨대, 치료제로서의 그의 효과를 평가하기 위해, 다른 생물학적 활성 분석에 적용될 수 있다. 이러한 분석은 당업계에 알려져 있으며, 표적 항원 및 항체에 대한 의도된 용도에 좌우된다.
관심 항원 상의 특정 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow 및 David Lane (1988)]에 기재된 것과 같은 일상적인 교차 차단 분석이 수행될 수 있다. 택일적으로, 예컨대 Champe 등, J. Biol.Chem.270:1388-1394 (1995)에 기재된 바와 같은 에피토프 맵핑이 항체가 관심있는 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
C. 제제의 제조
단백질 및 NAT 액체 제제에서 단백질의 산화를 방지하는 NAT를 포함하는 액체 제제를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 액체 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 단백질을 액체 제제에서 단백질의 산화를 방지하는 NAT와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 제제화될 단백질은 사전에 동결건조되지 않았고 본원의 관심 제제는 수성 제제이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 추가 구현예에서, 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 항체는 전장 항체이다. 일 구현예에서, 제제 내의 항체는 항체 단편, 예컨대 F(ab’)2이며, 이 경우 전장 항체에게 발생할 수 있는 문제점 (예컨대, Fab에 대한 항체의 클리핑)이 언급될 필요가 있을 수 있다. 제제에 존재하는 단백질의 치료 유효량은, 예를 들어, 원하는 용량 부피 및 투여 방식(들)을 고려하여 결정된다. 제제 내의 예시적인 단백질 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL 초과, 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 15 mg/mL 내지 약 225 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 175 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 150 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 30 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 또는 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 단백질은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 단백질 내의 메티오닌, 시스테인, 히스티딘, 트립토판, 및 티로신을 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 단백질 내 트립토판은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 단백질은 약 50 Å2 초과 내지 약 250 Å2 (예컨대 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 또는 250 Å2 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것 초과)의 용매-접근가능 표면적 (SASA)을 갖는 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, SASA는 약 80 Å2 초과이다. 일부 구현예에서, 단백질은 약 15% 초과 내지 약 45 % (예컨대, 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45% 중 어느 것 초과)의 SASA를 갖는 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, SASA는 약 30% 초과이다. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA는 약 4.0 내지 약 8.5의 pH 범위에서 측정된다. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA는 약 5℃ 내지 약 40℃ 범위의 온도에서 측정된다. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA는 약 0 mM 내지 약 500 mM 범위의 염 농도에서 측정된다. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA는 약 5.0 내지 약 7.5의 pH, 약 5 ℃ 내지 약 25 ℃의 온도 및 약 0 mM 내지 약 500 mM의 염 농도에서 측정된다. 일부 구현예에서, 단백질은 MD 모의실험을 기준으로 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성의 연합 상에서 트레이닝된 기계 학습 알고리즘에 의해 산화에 민감성인 것으로 예측되는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체의 Fab 부분 및/또는 Fc 부분에서 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체의 Fab 부분 내의 트립토판 아미노산에서 산화에 민감하다. 추가의 구현예에서, 산화에 민감한 트립토판 아미노산은 항체의 CDR 내에 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체의 Fc 부분 내의 메티오닌 아미노산에서 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 액체 제제는 본원에 기재된 임의의 단백질에 따라 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다.
본 발명에 의해 제공된 액체 제제는 단백질 및 액체 제제에서 단백질의 산화를 방지하는 NAT를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 내의 NAT는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 초과, 또는 NAT가 제제에서 용해될 수 있는 최고 농도까지의 농도이다. 특정 구현예에서, 제제 내의 NAT는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.1 mM 내지 약 9 mM, 약 0.1 mM 내지 약 8 mM, 약 0.1 mM 내지 약 7 mM, 약 0.1 mM 내지 약 6 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 4 mM, 약 0.1 mM 내지 약 3 mM, 약 0.1 mM 내지 약 2 mM, 약 0.3 mM 내지 약 2 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.5 mM, 또는 약 0.8 mM 내지 약 1.25 mM의 농도이다. 일부 구현예에서, 제제 내의 NAT는 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, NAT는 단백질 내의 하나 이상의 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, NAT는 트립토판, 메티오닌, 티로신, 히스티딘, 및/또는 시스테인로 구성된 군으로부터 선택된 단백질 내의 하나 이상의 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, NAT는 단백질 내의 트립토판의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 추가의 구현예에서, 반응성 산소 종은 단일선 산소, 슈퍼옥사이드 (O2-), 알콕실 라디칼, 퍼옥실 라디칼, 과산화수소 (H2O2), 삼산화이수소 (H2O3), 하이드로트리옥시 라디칼 (HO3ㆍ), 오존 (O3), 하이드록실 라디칼 및 알킬 퍼옥사이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, NAT는 항체의 Fab 부분 내의 하나 이상의 아미노산의 산화를 방지한다. 또 다른 추가의 구현예에서, NAT는 항체의 Fc 부분 내의 하나 이상의 아미노산의 산화를 방지한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 액체 제제는 단백질 및 액체 제제에서 단백지의 산화를 방지하는 NAT를 포함하고, 단백질의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 감소된다. 일부 구현예에서, 단백질의 산화는 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 중의 어느 것까지 감소된다.
단백질에서 산화의 양은, 예를 들어, RP-HPLC, LC/MS, 또는 트립신 펩타이드 맵핑 중 하나 이상을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질에서의 산화는 RP-HPLC, LC/MS, 또는 트립신 펩타이드 맵핑 중 하나 이상 및 하기 식을 사용한 백분율로서 결정될 수 있다:
Figure pct00002
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 액체 제제는 단백질 및 액체 제제에서 단백질의 산화를 방지하는 NAT를 포함하며, 단백질의 약 40% 이하 내지 약 0%가 산화된다. 일부 구현예에서, 단백질의 약 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0% (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것 이하가 산화된다.
일부 구현예에서, 본원의 본 발명에 의해 제공된 액체 제제는 단백질 및 액체 제제에서 단백질의 산화를 방지하는 NAT를 포함하고, 단백질 내의 적어도 하나의 산화 불안정 트립토판의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 감소된다. 일부 구현예에서, 산화 불안정 트립토판의 산화는 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것까지 감소된다. 일부 구현예에서, 단백질 내의 산화 불안정 트립토판 잔기 각각의 산화는 약 40% 내지 약 100% (예컨대, 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것)까지 감소된다.
일부 구현예에서, 본원의 본 발명에 의해 제공된 액체 제제는 단백질 및 액체 제제에서 단백질의 산화를 방지하는 NAT를 포함하고, 단백질 내의 적어도 하나의 산화 불안정 트립토판의 약 40% 이하 내지 약 0%가 산화된다. 일부 구현예에서, 산화 불안정 트립토판의 약 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0% (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것 이하가 산화된다. 일부 구현예에서, 단백질 내의 산화 불안정 트립토판 잔기 각각의 약 40% 이하 내지 약 0% (예컨대, 약 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0% (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것 이하)가 산화된다.
일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 본 발명의 액체 제제는 pH-완충액에서 제조된다. 본 발명의 완충제는 약 4.0 내지 약 9.0 범위의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서 pH는 pH 4.0 내지 8.5의 범위, pH 4.0 내지 8.0의 범위, pH 4.0 내지 7.5의 범위, pH 4.0 내지 7.0의 범위, pH 4.0 내지 6.5의 범위, pH 4.0 내지 6.0의 범위, pH 4.0 내지 5.5의 범위, pH 4.0 내지 5.0의 범위, pH 4.0 내지 4.5의 범위, pH 4.5 내지 9.0의 범위, pH 5.0 내지 9.0의 범위, pH 5.5 내지 9.0의 범위, pH 6.0 내지 9.0의 범위, pH 6.5 내지 9.0의 범위, pH 7.0 내지 9.0의 범위, pH 7.5 내지 9.0의 범위, pH 8.0 내지 9.0의 범위, pH 8.5 내지 9.0의 범위, pH 5.7 내지 6.8의 범위, pH 5.8 내지 6.5의 범위, pH 5.9 내지 6.5의 범위, pH 6.0 내지 6.5의 범위, 또는 pH 6.2 내지 6.5의 범위이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 액체 제제는 6.2 또는 약 6.2의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 구현예에서, 액체 제제는 6.0 또는 약 6.0 pH를 갖는다. pH를 이 범위 내로 제어할 완충제의 예는 유기 및 무기산 및 이의 염을 포함한다. 예를 들어, 아세테이트 (예컨대, 히스티딘 아세테이트, 아르기닌 아세테이트, 나트륨 아세테이트), 석시네이트 (예컨대, 히스티딘 석시네이트, 아르기닌 석시네이트, 나트륨 석시네이트), 글루코네이트, 포스페이트, 푸마레이트, 옥살레이트, 락테이트, 시트레이트, 및 이의 조합. 완충제 농도는, 예를 들어, 완충제 및 제제의 원하는 등장성에 따라, 약 1 mM 내지 약 600 mM일 수 있다. 특정 구현예에서, 제제는 히스티딘 완충제 (예컨대, 약 5 mM 내지 100 mM의 농도)를 포함한다. 히스티딘 완충제의 예는 히스티딘 클로라이드, 히스티딘 아세테이트, 히스티딘 포스페이트, 히스티딘 설페이트, 히스티딘 석시네이트 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 제제는 히스티딘 및 아르기닌 (예컨대, 히스티딘 클로라이드-아르기닌 클로라이드, 히스티딘 아세테이트-아르기닌 아세테이트, 히스티딘 포스페이트-아르기닌 포스페이트, 히스티딘 설페이트-아르기닌 설페이트, 히스티딘 석시네이트-아르기닌 석시네이트 등)을 포함한다. 특정 구현예에서, 제제는 약 5 mM 내지 100 mM의 농도의 히스티딘 및 50 mM 내지 500 mM의 농도의 아르기닌을 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 히스티딘 아세테이트 (예컨대, 약 20 mM)-아르기닌 아세테이트 (예컨대, 약 150 mM)를 포함한다. 특정 구현예에서, 제제는 히스티딘 석시네이트 (예컨대, 약 20 mM)-아르기닌 석시네이트 (예컨대, 약 150 mM)를 포함한다. 특정 구현예에서, 약 10 mM 내지 약, 35 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 약 10 mM 내지 약 25 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 15 mM 내지 약 35 mM, 약 20 mM 내지 약 35 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM 또는 약 20 mM 내지 약 25 mM의 제제 내의 히스티딘. 추가의 구현예에서, 제제 내의 아르기닌은 약 50 mM 내지 약 500 mM (예컨대, 약 100 mM, 약 150 mM, 또는 약 200 mM)이다.
본 발명의 액체 제제는 사카라이드, 에컨대 이당류 (예컨대, 트레할로스 또는 수크로스)를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 “사카라이드”는 단당류, 이당류, 삼당류, 다당류, 당알콜, 환원당, 비환원당 등을 포함하는, 일반적인 조성물 (CH2O)n 및 이의 유도체를 포함한다. 본원에서 사카라이드의 예는 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 락토오스, 프럭토스, 말토스, 덱스트란, 글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 실리톨, 소르비톨, 만니톨, 멜리비오스, 멜레지토스, 라피노스, 만노트리오스, 스타키오스, 말토스, 락툴로스, 말툴로스, 글루시톨, 말티톨, 락티톨, 이소-말툴로스 등을 포함한다.
계면활성제는 선택적으로 액체 제제에 첨가될 수 있다. 예시적인 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (예컨대 폴리소르베이트 20, 80 등) 또는 폴록사머 (예컨대 폴록사머 188 등)을 포함한다. 첨가되는 계면활성제의 양은 제제화된 항체의 응집을 감소시키고/시키거나 제제 내 미립자의 형성을 최소화하고/하거나 흡착을 감소시키도록 첨가된다. 예를 들어, 계면활성제는 약 0.001% 내지 약 1.0% 중량/부피 초과의 양으로 제제에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 약 0.001% 내지 약 1.0%, 약 0.001% 내지 약 0.5%, 약 0.005% 내지 약 0.2%, 약 0.01% 내지 약 0.1%, 약 0.02% 내지 약 0.06%, 또는 약 0.03% 내지 약 0.05% 중량/부피의 양으로 제제에 존재한다. 특정 구현예에서, 계면활성제는 0.04% 또는 약 0.04% 중량/부피의 양으로 제제에 존재한다. 특정 구현예에서, 계면활성제는 0.02% 또는 약 0.02% 중량/부피의 양으로 제제에 존재한다. 일 구현예에서, 제제는 계면활성제를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 제제는 상기 확인된 제제 (예컨대, 항체, 완충제, 사카라이드, 및/또는 계면활성제)를 함유하며, 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 및 벤즈에토늄 Cl와 같은 하나 이상의 보존제가 본질적으로 없다. 또 다른 구현예에서, 보존제는, 특히 제제가 다중용량 제제인 경우 제제에 포함될 수 있다. 보존제의 농도는 약 0.1% 내지 약 2%, 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 1%의 범위일 수 있다. 하나 이상의 다른 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제, 예컨대 문헌 [Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed.(1980)]에 기재된 것은 제제의 원하는 특징에 부정적으로 영향을 미치지 않는 한 제제에 포함될 수 있다. 본원의 예시적인 약제학적으로 허용가능한 부형제는 세포간 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 하기에 기재되어 있다: 미국 특허 공개 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호. 일 측면에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제와 조합된다.
제제는 금속 이온 킬레이트화제를 추가로 포함할 수 있다. 금속 이온 킬레이트화제는 당업자에게 널리 알려져 있으며, 비제한적으로, 아미노폴리카복실레이트, EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), EGTA (에틸렌 글리콜-비스(베타-아미노에틸 에테르)-N,N,N’,N’-테트라아세트산), NTA (니트릴로트리아세트산), EDDS (에틸렌 디아민 디석시네이트), PDTA (1,3-프로필렌디아민테트라아세트산), DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산), ADA (베타-알라닌디아세트산), MGCA (메틸글리신디아세트산) 등을 포함한다. 또한, 본원의 일부 구현예는 포스포네이트/포스폰산 킬레이트화제를 포함한다.
등장화제는 조성물 내의 액체의 등장성을 조절하거나 유지하게 위해 존재한다. 단백질 및 항체와 같은 큰 전하를 띤 생물분자와 함께 사용될 때, 이들은 또한 “안정화제” 역할을 할 수 있는데, 이들은 아미노산 측쇄의 전하를 띤 그룹과 상호작용하여, 분자간 및 분자내 상호작용에 대한 가능성을 줄일 수 있기 때문이다. 등장화제 는 다른 성분의 상대적인 양을 고려하여, 0.1 중량% 내지 25 중량%, 또는 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 5 중량%의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 바람직한 등장화제 는 다가 당알콜, 바람직하게는 3가 이상의 당알콜, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.
본원의 제제는 또한 치료되는 특정 징후에 필요한 하나를 초과하는 단백질 또는 소분자 약물, 바람직하게는 다른 단백질에 부정적으로 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항체가 항-DR5 (예컨대, 드로지투맙)인 경우, 이것은 또 다른 제제 (예컨대, 화학치료제, 및 항신생물제)와 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 생체내 투여를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 제제는 멸균이다. 제제는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다. 본원의 치료 제제는 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 놓여진다. 투여 경로는 공지되고 허용된 방법에 따르며, 예컨대 적합한 방식으로 장시간 동안 단일 또는 다중 볼루스 또는 주입, 예컨대, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병변내, 관절내, 또는 유리체내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 흡입에 의해 또는 지속적인 방출 또는 연장된 방출 방식에 의한다.
본 발명의 액체 제제는 보관시 안정할 수 있다. 일부 구현예에서, 액체 제제 내의 단백질은 적어도 약 12개월 (예컨대 적어도 약 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36개월 이상 중 어느 것) 동안 약 0 내지 약 5ºC (예컨대, 약 1, 2, 3, 또는 4ºC 중 어느 것)에서 보관시 안정하다일부 구현예에서, 액체 제제 내의 단백질의 물리적 안정성, 화학적 안정성, 또는 생물학적 활성은 평가되거나 측정된다. 당업계에 공지된 임의의 방법이 안정성 및 생물학적 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 안정성은 보관 후 액체 제제에서 단백질의 산화에 의해 측정된다. 안정성은 제제화 시간 부근뿐만 아니라 보관 후에 항체의 물리적 안정성, 화학적 안정성, 및/또는 생물학적 활성을 평가함으로써 시험될 수 있다. 물리적 및/또는 안정성은 응집물 형성 평가 (예를 들어 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 혼탁도를 측정함으로써, 및/또는 육안 검사에 의해); 양이온 교환 크로마토그래피 또는 모세관 구역 전기영동을 사용하여 전하 이종성을 평가함으로써; 아미노-말단 또는 카복시-말단 서열 분석; 질량 분광 분석; 감소되고 온전한 항체를 비교하는 SDS-PAGE 분석; 펩타이드 맵 (예를 들어, 트립신 또는 LYS-C) 분석; 항체의 생물학적 활성 또는 항원 결합 기능을 평가하는 것; 등을 포함하는, 다양한 상이한 방식으로 정성적으로 및/또는 정량적으로 평가될 수 있다. 불안정성은 응집, 탈아미드화 (예컨대 Asn 탈아미드화), 산화 (예컨대 Trp 산화), 이성질체화 (예컨대 Asp 이성질체화), 클리핑/가수분해/단편화 (예컨대 힌지 영역 단편화), 석신이미드 형성, 쌍을 형성하지 않은 시스테인(들), N-말단 연장, C-말단 가공, 당화 차이 등. 일부 구현예에서, 단백질 내의 산화는 RP-HPLC, LC/MS, 또는 트립신 펩타이드 맵핑 중 하나 이상을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 항체 내의 산화는 RP-HPLC, LC/MS, 또는 트립신 펩타이드 맵핑 중 하나 이상 및 하기 식을 사용한 백분율로서 결정된다:
Figure pct00003
생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균이어야 한다. 이것은 제제의 제조 전 또는 후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
또한 단백질의 산화를 방지하는 NAT의 양을 액체 제제에 첨가하는 단계를 포함하는, 액체 제제를 제조하거나 액체 제제에서 단백질의 산화를 방지하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 액체 제제는 항체를 포함한다. 본원에 제공된 바와 같은 단백질의 산화를 방지하는 NAT의 양은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 또는 본원에 개시된 임의의 양이다. 일부 구현예에서, 액체 제제는 본원에 기재된 임의의 단백질에 따라 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다.
III. 트립토판 산화를 예측하는 방법
본원 발명은 또한 액체 제형에서 단백질의 잔기 (예를 들어, 트립토판)의 산화에 대한 민감성을 예측하는 방법을 제공한다. 단백질 서열 정보를 사용하는 분자 동력학 (MD) 모의실험 (예를 들어, 모든-원자 MD 모의실험)에 의해 인실리코 결정된 분자 표현자를 사용하여 액체 제형 중에 단백질이 산화에 민감성인 잔기 (예를 들어, 트립토판 잔기)를 갖는 것으로서 분류할 수 있다. 액체 제형 중에 다양한 어레이의 분자 표현자에 걸친 산화에 민감한 잔기를 갖는 것으로 단백질을 정확하게 예측하거나 분류할 수 있는 컴퓨터 학습 알고리즘과 같은 모델을 갖는 것이 바람직할 수 있다.
액체 제형에서 단백질의 잔기 (예를 들어, 트립토판)의 산화에 대한 민감성을 예측하는 컴퓨터 학습 알고리즘을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 a) 산화 핫스팟 잔기의 i) 복수의 분자 표현자 (예를 들어, 인근 아스파르트산 측쇄 산소, 측쇄 SASA, 델타 탄소 SASA, 인근 양전하, 골격 SASA 등)에 값 및 ii) 상기 산화 핫스팟 잔기가 산화에 민감할 수 있는지와 연관된 산화 핫스팟 잔기를 포함하는 트레이닝 세트를 제공하는 단계; 및 b) 상기 트레이닝 세트를 기계 학습 알고리즘 (예를 들어, 무작위 결정 포레스트)에 적용함으로써 기계 학습 알고리즘을 산화 민감성을 예측하도록 트레이닝시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 복수의 분자 표현자에 대한 값을 갖는 하나 이상의 시험 잔기들의 산화에 대한 민감성을 예측하기 위한 기계 학습 알고리즘 (예를 들어, 무작위 결정 포레스트)를 제공함을 추가로 포함하고, 이는 하나 이상의 시험 잔기들 각각에 대한 상기 복수의 분자 표현자를 기계 학습 알고리즘 (예를 들어, 무작위 결정 포레스트)에 적용하고 기계 학습 알고리즘의 다수결을 사용하여 산화 민감성을 갖는지의 여부로서 하나 이상의 시험 잔기들을 분류함을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분자 표현자는 MD 모의실험에 의해 인실리코로 결정된다. 일부 구현예에서, 산화 검정에서 잔기의 적어도 약 임의의 30% (예를 들어, 적어도 약 임의의 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 이상)의 산화는 산화에 대한 민감성을 지적한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다.
일부 구현예에서, 상기 기계 학습 알고리즘은 무작위 결정 포레스트 알고리즘이고, 여기서, 부트스트랩 기술은 다중 결정 트리를 확장시키기 위해 무작위 가변 선택과 조합된다(문헌참조: Ho, T. K.Proceedings of the 3rd International Conference on Document Analysis and Recognition, Montreal, QC, 14-16 August 1995. pp. 278-282; Ho, T. K.IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence.　20(8) 832-844, 1998). 이들 다중 결정 트리는 때로는 본원에서 트리의 앙상블 또는 무작위 결정 포레스트로서 언급된다. 일부 구현예에서, 무작위 결정 포레스트는 적어도 약 20 (상기 적어도 약 임의의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000 이상) 결정 트리(본원에서 "평가기"로도 언급됨)를 포함한다. 일부 구현예에서, 무작위 결정 포레스트에서 각각의 트리의 각각의 브랜치에서 고려를 위해 무작위로 선택된 변수의 숫자 (본원에서 "피쳐"로도 언급됨)는 적어도 약 1 (예를 들어, 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상)이다. 일부 구현예에서, 무작위 결정 포레스트에서 각각의 트리의 각각의 브랜치에서 고려를 위해 무작위로 선택된 변수의 숫자 (본원에서 "트리 깊이"로도 언급됨)는 약 1 내지 약 20 (예를 들어, 약 임의의 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 20, 5, 15, 또는 5 내지 10이고 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)이다. 상기 변수는 폴리펩타이드 쇄에서 아미노산 잔기의 분자 표현자를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분자 표현자는 MD 모의실험에 의해 인실리코로 결정된다. 일부 구현예에서, 분자 표현자는 시험 잔기 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 시험 잔기 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 시험 잔기 측쇄 각도, 시험 잔기 델타 탄소의 7Å이내 팩킹 밀도, 시험 잔기 골격 각도 (stdev), 슈도-파이 오비탈의 SASA, 골격 유연성, 및 시험 잔기 델타 탄소의 7Å이내 총 음전하를 포함한다. 일부 구현예에서, 관찰 풀이 각각의 트리에 대해 서브-브랜치로 나누어지는 최대 횟수는 적어도 약 2 (예를 들어, 적어도 약 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 이상)이다. 일부 구현예에서, 관찰 풀이 각각의 트리에 대해 서브-브랜치로 나누어지는 최대 횟수는 약 2 내지 약 30 (예를 들어, 약 임의의 2 내지 20, 2 내지 15, 2 내지 10, 2 내지 5, 5 내지 30, 5 내지 25, 5 내지 20, 5 내지 15, 또는 5 내지 10, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)이다. 시험 잔기의 분자 표현자에 대한 정보는 시험 잔기가 산화에 민감할 수 있는지에 대한 예측을 수득하기 위해 트리의 앙상블에 적용될 수 있다. 앙상블 내 모든 트리의 예측의 다수결을 취함에 의해 예측된다.
일부 구현예에서, MD 모의실험을 사용하는 시험 잔기 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수를 결정하기 위해, 각각의 분자 모의실험의 각각의 프레임에 대해, 시험 잔기의 델타 탄소의 7Å이내 모든 원자를 추적하고, 이들 원자 중에, 임의의 아스파르트산 잔기의 측쇄 상의 산소 원자인 것들을 계수하고 최종 값은 모의실험 지속기간 동안의 상기 계수의 시간 평균으로서 계산한다.
일부 구현예에서, MD 모의실험을 사용한 측쇄 SASA를 결정하기 위해, 각각의 분자 모의실험의 각각의 프레임에 대해, 모의실험에서 각각의 원자 상에 집중된 구형 포인트는 물 분자의 반경과 함께 각각의 원자 반경을 함께 부가함에 의해 생성하고 모든 이웃하는 구형 반경 내에 있는 모든 포인트를 제거하고 모든 잔여 포인트들 사이의 면적을 합하여 SASA에 대한 값을 생성하고 상기 표현자의 최종 값은 모의실험의 지속기간 동안의 시험 잔기 측쇄 원자의 평균 SASA로서 또는 상기 계산의 표준 편차로서 계산된다.
일부 구현예에서, MD 모의실험을 사용한 델타 탄소 SASA를 결정하기 위해, 각각의 모의실험의 각각의 프레임에 대해, 시험 잔기 델타 탄소의 SASA는 상기된 바와 같이 계산하고 상기 표현자의 최종 값은 모의실험의 지속기간 동안의 시험 잔기 델타 탄소의 평균 SASA로서 또는 상기 계산의 표준 편차로서 계산된다.
일부 구현예에서, MD 모의실험을 사용한 시험 잔기 델타 탄소의 7Å내에 총 양전하를 결정하기 위해, 각각의 모의실험의 각각의 프레임에 대해, 시험 잔기의 델타 탄소의 7Å내에 하전된 아미노산 측쇄와 연관된 모든 원자들을 추적하고 이들 원자들의 총 양전하를 함께 부가하고 최종 값은 모의실험의 지속기간 동안의 상기 양의 평균으로서 또는 상기 계산의 표준 편차로서 계산된다.
일부 구현예에서, MD 모의실험을 사용한 골격 SASA를 결정하기 위해, 각각의 분자 모의실험의 각각의 프레임에 대해, 시험 잔기의 골격 질소 원자의 SASA는 상기된 바와 같이 계산하고 상기 표현자의 최종 값은 모의실험의 지속기간 동안의 골격 질소 원자의 평균 SASA로서 또는 상기 계산의 표준 편차로서 계산된다.
일부 구현예에서, MD 모의실험을 사용한 시험 잔기 측쇄 각도를 결정하기 위해, 시험 잔기 측쇄의 chi1 및 chi2 각도는 모의실험을 통해 추적하고 상기 표현자는 시험 잔기가 가장 산화를 예측하는 각도 영역에서 소비하는 시간의 %로서 계산되고, 여기서, 상기 각도 영역은 시험 잔기와 동일한 아미노산의 많은 상이한 잔기에 대해 많은 상이한 모의실험을 수행함에 의해 결정하고 이들 모의실험에 대해 Chi1 및 chi2 각도 모두를 그래픽으로 나타내고 통상적으로 존재하는 각도 조합을 클러스터링한다.
일부 구현예에서, 시험 잔기 델타 탄소의 7Å이내 팩킹 밀도는 MD 모의실험을 사용하여 시험 잔기 델타 탄소 상의 집중된 반경 7Å의 구형 내에 단백질 원자의 시간-평균 수로서 계산된다.
일부 구현예에서, 시험 잔기 골격 각도는 MD 모의실험을 사용하여 모의실험 지속기간 동안의 시험 잔기의 골격과 연관된 평균 psi 각도로서 또는 상기 계산의 표준 편차로서 계산된다.
일부 구현예에서, MD 모의실험을 사용한 슈도-파이 오비탈의 점령된 용적을 결정하기 위해, 시험 잔기의 측쇄는 시험 잔기 파이-오비탈에 의해 점령된 공간을 가늠하기에 적당한 높이를 갖는 실린더의 기저로서 취급되고, 상기 모의실험 동안에 실린더의 용적 내에 속하는 모든 원자들이 추적되고, 실린더의 용적 내에 속하는 모든 단백질 원자들의 총 용적은 모의실험의 각각의 프레임에 대해 계산되고 최종 값은 다른 단백질 원자들에 의해 점령된 시험 잔기 파이-오비탈의 시간-평균 용적으로서 계산된다.
일부 구현예에서, MD 모의실험을 사용한 골격 유연성을 결정하기 위해, 시험 잔기의 골격 질소의 평균 제곱근 변동은 각각의 모의실험에 대해 계산된다. 상기 모의실험에서 각각의 프레임은 정렬되고, 각각의 질소 원자에 의해 이동된 거리는 각각의 프레임에 대해 계산되고, 각각의 프레임에 대한 상기 거리는 제곱되고, 모듬 프레임에 걸친 상기 제곱 거리의 평균은 결정되고, 상기 표현자의 최종 값은 제곱 거리의 상기 평균의 제곱근으로서 계산된다.
일부 구현예에서, MD 모의실험을 사용한 시험 잔기 델타 탄소의 7Å내에 총 음전하를 결정하기 위해, 각각의 모의실험의 각각의 프레임에 대해, 시험 잔기의 델타 탄소의 7Å내에 하전된 아미노산 측쇄와 연관된 모든 원자들을 추적하고 이들 원자들의 총 음전하는 함께 부가하고 최종 값은 모의실험의 지속기간 동안의 상기 양의 시간-평균으로서 계산된다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질의 시험 잔기가 산화에 민감한지를 예측하기 위한 무작위 결정 포레스트를 생성하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 a) 각각의 잔기가 i) 잔기의 복수의 분자 표현자에 대한 값 및 ii) 잔기가 산화에 민감한 것과 연관된, 산화 핫스팟 잔기를 포함하는 트레이닝 세트를 제공하고; b) 상기 트레이닝 세트를 무작위 결정 포레스트에 적용함으로써 상기 무작위 결정 포레스트를, 산화 민감성을 예측하도록 트레이닝함을 포함하고, 여기서, 상기 무작위 결정 포레스트 내 개별 결정 트리의 수는 적어도 약 20 (예를 들어, 적어도 약 임의의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000 이상)이고, 무작위 결정 포레스트 내 각각의 결정 트리의 각각의 브랜치에서 고려를 위해 무작위로 선택된 변수의 최대 수는 적어도 약 1 (예를 들어, 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 이상)이고, 관찰 풀이 각각의 트리에 대해 서브-브랜치로 나누어지는 시간의 최대 수는 적어도 약 2 (예를 들어, 적어도 약 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 이상)이다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 시험 잔기 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 시험 잔기 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 시험 잔기 측쇄 각도, 시험 잔기 델타 탄소의 7Å이내 팩킹 밀도, 시험 잔기 골격 각도 (stdev), 슈도-파이 오비탈의 SASA, 골격 유연성, 및 시험 잔기 델타 탄소의 7Å이내 총 음전하를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 시험 잔기 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 시험 잔기 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 및 시험 잔기 측쇄 각도를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 2 내지 11 (예를 들어, 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11)의 분자 표현자를 포함한다. 일부 구현예에서, 분자 표현자는 단백질이 항체인 경우 Fv 영역과 같이, 시험 잔기를 포함하는 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 결정한다. 일부 구현예에서, 분자 표현자는 액체 제형 중 단백질에 대한 파라미터를 사용하는 MD 모의실험에 의해 인실리코로 결정한다. 일부 구현예에서, 시험 잔기 및 산화 핫스팟 잔기는 동일한 아미노산의 잔기이다(예를 들어, 이들은 모두 트립토판 잔기이다). 일부 구현예에서, 시험 잔기 및 산화 핫스팟 잔기는 트립토판 잔기이다. 일부 구현예에서, 산화 검정에서 잔기의 적어도 약 임의의 30% (예를 들어, 적어도 약 임의의 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 이상)의 산화는 산화에 대한 민감성을 지적한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다.
일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질의 시험 잔기가 산화에 민감할 수 있는지를 예측하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 a) 시험 잔기의 복수의 분자 표현자에 대한 값을 결정하고; b) 시험 잔기의 복수의 분자 표현자를 복수의 분자 표현자 상에서 트레이닝된 무작위 결정 포레스트에 적용하여 산화 민감성을 예측함을 포함하고, 여기서, 무작위 결정 포레스트의 다수결은 시험 잔기가 산화에 민감할 수 있는지의 여부를 분류한다. 일부 구현예에서, 무작위 결정 포레스트는 각각의 잔기가 i) 잔기의 복수의 분자 표현자에 대한 값 및 ii) 잔기가 산화에 민감한 것과 연관된, 산화 핫스팟 잔기를 포함하는 트레이닝 세트를 제공하고; 상기 트레이닝 세트를 무작위 결정 포레스트에 적용함으로써 상기 무작위 결정 포레스트를, 산화 민감성을 예측하도록 트레이닝함에 의해 트레이닝되고, 여기서, 상기 무작위 결정 포레스트 내 개별 결정 트리의 수는 적어도 약 20 (예를 들어, 적어도 약 임의의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000 이상)이고, 무작위 결정 포레스트 내 각각의 결정 트리의 각각의 브랜치에서 고려를 위해 무작위로 선택된 변수의 최대 수는 적어도 약 1 (예를 들어, 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 이상)이고, 관찰 풀이 각각의 트리에 대해 서브-브랜치로 나누어지는 시간의 최대 수는 적어도 약 2 (예를 들어, 적어도 약 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 이상)이다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 시험 잔기 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 시험 잔기 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 시험 잔기 측쇄 각도, 시험 잔기 델타 탄소의 7Å이내 팩킹 밀도, 시험 잔기 골격 각도 (stdev), 슈도-파이 오비탈의 SASA, 골격 유연성, 및 시험 잔기 델타 탄소의 7Å이내 총 음전하를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 시험 잔기 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 시험 잔기 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 및 시험 잔기 측쇄 각도를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 2 내지 11 (예를 들어, 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11)의 분자 표현자를 포함한다. 일부 구현예에서, 분자 표현자는 단백질이 항체인 경우 Fv 영역과 같이, 시험 잔기를 포함하는 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 결정한다. 일부 구현예에서, 분자 표현자에 대한 값은 액체 제형 중 단백질에 대한 파라미터를 사용하는 MD 모의실험에 의해 인실리코로 결정한다. 일부 구현예에서, 시험 잔기 및 산화 핫스팟 잔기는 동일한 아미노산의 잔기이다(예를 들어, 이들은 모두 트립토판 잔기이다). 일부 구현예에서, 시험 잔기 및 산화 핫스팟 잔기는 트립토판 잔기이다. 일부 구현예에서, 산화 검정에서 잔기의 적어도 약 임의의 30% (예를 들어, 적어도 약 임의의 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 이상)의 산화는 산화에 대한 민감성을 지적한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다.
일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질의 시험 트립토판 잔기가 산화에 민감할 수 있는지를 예측하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 a) 시험 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자에 대한 값을 결정하고; b) 시험 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자를 복수의 분자 표현자 상에서 트레이닝된 무작위 결정 포레스트에 적용하여 산화 민감성을 예측함을 포함하고, 여기서, 무작위 결정 포레스트의 다수결은 시험 트립토판 잔기가 산화에 민감할 수 있는지의 여부를 분류한다. 일부 구현예에서, 무작위 결정 포레스트는 각각의 잔기가 i) 잔기에 대한 복수의 분자 표현자에 대한 값 및 ii) 잔기가 산화에 민감한 것과 연관된, 트립토판 산화 핫스팟 잔기를 포함하는 트레이닝 세트를 제공하고; 상기 트레이닝 세트를 무작위 결정 포레스트에 적용함으로써 상기 무작위 결정 포레스트를, 트립토판 산화 민감성을 예측하도록 트레이닝함에 의해 트레이닝되고, 여기서, 상기 무작위 결정 포레스트 내 개별 결정 트리의 수는 적어도 약 20 (예를 들어, 적어도 약 임의의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000 이상)이고, 무작위 결정 포레스트 내 각각의 결정 트리의 각각의 브랜치에서 고려를 위해 무작위로 선택된 변수의 최대 수는 적어도 약 1 (예를 들어, 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 이상)이고, 관찰 풀이 각각의 트리에 대해 서브-브랜치로 나누어지는 시간의 최대 수는 적어도 약 2 (예를 들어, 적어도 약 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 이상)이다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 트립토판 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 트립토판 측쇄 각도, 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 팩킹 밀도, 트립토판 골격 각도 (stdev), 슈도-파이 오비탈의 SASA, 골격 유연성, 및 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 총 음전하를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 트립토판 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 및 트립토판 측쇄 각도를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 2 내지 11 (예를 들어, 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11)의 분자 표현자를 포함한다. 일부 구현예에서, 분자 표현자는 단백질이 항체인 경우 Fv 영역과 같이, 시험 트립토판을 포함하는 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 결정한다. 일부 구현예에서, 분자 표현자에 대한 값은 액체 제형 중 단백질에 대한 파라미터를 사용하는 MD 모의실험에 의해 인실리코로 결정한다. 일부 구현예에서, 산화 검정에서 잔기의 적어도 약 임의의 30% (예를 들어, 적어도 약 임의의 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 이상)의 산화는 산화에 대한 민감성을 지적한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다.
일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질이 산화에 민감할 수 있는 트립토판 잔기를 포함하는지의 여부를 결정하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 a) 단백질 내 각각의 트립토판 잔기에 대한 복수의 분자 표현자 값을 결정하고; b) 복수의 분자 표현자 상에 트레이닝된 무작위 결정 포레스트에 적용함으로써 산화 민감성을 예측함을 포함하고, 여기서, 각각의 트립토판 잔기에 대한 무작위 결정 포레스트의 다수결이 잔기가 산화에 민감할 수 있는지의 여부를 분류하고 상기 단백질은 무작위 결정 포레스트가 적어도 하나의 트립토판 잔기를 산화에 만감한 것으로서 분류하는 경우 산화에 민감한 트립토판 잔기를 포함하는 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 무작위 결정 포레스트는 각각의 잔기가 i) 잔기에 대한 복수의 분자 표현자에 대한 값 및 ii) 잔기가 산화에 민감한 것과 연관된, 트립토판 산화 핫스팟 잔기를 포함하는 트레이닝 세트를 제공하고; 상기 트레이닝 세트를 무작위 결정 포레스트에 적용함으로써 상기 무작위 결정 포레스트를, 트립토판 산화 민감성을 예측하도록 트레이닝함에 의해 트레이닝되고, 여기서, 상기 무작위 결정 포레스트 내 개별 결정 트리의 수는 적어도 약 20 (예를 들어, 적어도 약 임의의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000 이상)이고, 무작위 결정 포레스트 내 각각의 결정 트리의 각각의 브랜치에서 고려를 위해 무작위로 선택된 변수의 최대 수는 적어도 약 1 (예를 들어, 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 이상)이고, 관찰 풀이 각각의 트리에 대해 서브-브랜치로 나누어지는 시간의 최대 수는 적어도 약 2 (예를 들어, 적어도 약 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 이상)이다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 트립토판 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 트립토판 측쇄 각도, 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 팩킹 밀도, 트립토판 골격 각도 (stdev), 슈도-파이 오비탈의 SASA, 골격 유연성, 및 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 총 음전하를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 트립토판 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 및 트립토판 측쇄 각도를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 2 내지 11 (예를 들어, 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11)의 분자 표현자를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 트립토판 잔기의 분자 표현자는 단백질이 항체인 경우 Fv 영역과 같이, 트립토판 잔기를 포함하는 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 결정한다. 일부 구현예에서, 분자 표현자에 대한 값은 액체 제형 중 단백질에 대한 파라미터를 사용하는 MD 모의실험에 의해 인실리코로 결정한다. 일부 구현예에서, 산화 검정에서 잔기의 적어도 약 임의의 30% (예를 들어, 적어도 약 임의의 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 이상)의 산화는 산화에 대한 민감성을 지적한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다.
IV. 산화를 감소시키는 방법
본 발명은 또한 액체 제형 중 단백질의 산화를 차단하는 NAT의 양을 부가함을 포함하는 액체 제형 중 단백질의 산화를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 단백질은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 단백질 중 메티오닌, 시스테인, 히스티딘, 트립토판, 및/또는 티로신은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 단백질 내 트립토판은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 약 50 Å2 내지 약 250 Å2 초과 (예를 들어, 약 임의의 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225 초과, 또는 250 Å2 초과, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)의 용매-접근가능한 표면적 (SASA)을 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, SASA는 약 80 Å2 초과이다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 약 15% 내지 약 45 % 초과 (예를 들어, 약 임의의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45% 초과)의 SASA를 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, SASA는 약 30% 초과이다. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA는 약 4.0 내지 약 8.5의 pH 범위에서 측정된다. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA는 약 5℃ 내지 약 40℃ 범위의 온도에서 측정된다. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA는 약 0 mM 내지 약 500 mM 범위의 염 농도에서 측정된다. 일부 구현예에서, 트립토판 잔기의 SASA는 약 5.0 내지 약 7.5의 pH, 약 5℃ 내지 약 25℃의 온도 및 약 0 mM 내지 약 200 mM의 염 농도에서 측정된다. 일부 구현예에서, SASA는 모든-원자 분자 동력학 모의실험에 의해 인실리코로 측정된다. 일부 구현예에서, 단백질은 MD 모의실험을 기준으로 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성의 연합 상에서 트레이닝된 기계 학습 알고리즘에 의해 산화에 민감성인 것으로 예측되는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형에 첨가되는 NAT의 양은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다), 또는 NAT가 제형에 가용성인 최고 농도까지다. 일부 구현예에서, 제형에 부가되는 NAT의 양은 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, NAT는 단백질 내 하나 이상의 트립토판 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 단백질의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 (예를 들어, 약 임의의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%까지, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 감소한다. 일부 구현예에서, 단백질의 약 40% 이하 내지 약 0% (예를 들어, 약 임의의 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 0%, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)가 산화된다. 일부 구현예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 추가의 구현예에서, 반응성 산소 종은 단일선 산소, 슈퍼옥사이드 (O2-), 알콕실 라디칼, 퍼옥실 라디칼, 과산화수소 (H2O2), 삼산화이수소 (H2O3), 하이드로트리옥시 라디칼 (HO3ㆍ), 오존 (O3), 하이드록실 라디칼 및 알킬 퍼옥사이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 제형은 단클론성 항체, 단백질의 산화를 방지하는 본원에 제공된 NAT 및 제형의 pH를 목적하는 수준으로 유지하는 완충제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제형은 수성이다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 임의의 단백질에 따른 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다 (예를 들어, 제형은 2개 이상의 단백질을 포함하는 공동-제형이다).
일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질의 산화를 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 NAT의 특정 양을 단백질의 산화를 방지하는 제형에 부가함을 포함하고, 상기 단백질은 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함하고 SASA는 약 50 Å2 내지 약 250 Å2 초과 (예를 들어, 약 임의의 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 또는 250 Å2 초과, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)이다. 일부 구현예에서, 단백질은 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함하고 SASA는 약 80 Å2 초과이다. 일부 구현예에서, SASA는 모든-원자 분자 동력학 모의실험에 의해 인실리코로 측정된다. 일부 구현예에서, 제형에 첨가되는 NAT의 양은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다), 또는 NAT가 제형에 가용성인 최고 농도까지다. 일부 구현예에서, 제형에 부가되는 NAT의 양은 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, NAT는 단백질 내 하나 이상의 트립토판 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 단백질의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 (예를 들어, 약 임의의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%까지, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 감소한다. 일부 구현예에서, 단백질의 약 40% 이하 내지 약 0% (예를 들어, 약 임의의 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 0%, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)가 산화된다. 일부 구현예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 임의의 단백질에 따른 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질의 산화를 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 단백질 내 트립토판 잔기의 SASA 값을 결정하고 NAT의 특정 양을, 적어도 하나의 트립토판 잔기가 약 50 Å2 내지 약 250 Å2 초과 (예를 들어, 약 임의의 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 또는 250 Å2 초과, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)의 SASA를 갖는 경우 단백질의 산화를 방지하는 제형에 부가함을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함하고 SASA는 약 80 Å2 초과이다. 일부 구현예에서, SASA는 모든-원자 분자 동력학 모의실험에 의해 인실리코로 측정된다. 일부 구현예에서, 제형에 첨가되는 NAT의 양은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다), 또는 NAT가 제형에 가용성인 최고 농도까지다. 일부 구현예에서, 제형에 부가되는 NAT의 양은 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, NAT는 단백질 내 하나 이상의 트립토판 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 단백질의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 (예를 들어, 약 임의의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%까지, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 감소한다. 일부 구현예에서, 단백질의 약 40% 이하 내지 약 0% (예를 들어, 약 임의의 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 0%, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)가 산화된다. 일부 구현예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 임의의 단백질에 따른 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질의 산화를 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 단백질 내 트립토판 잔기의 SASA 값을 결정하고 NAT의 특정 양을, 약 50 Å2 내지 약 250 Å2 초과 (예를 들어, 약 임의의 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 또는 250 Å2 초과, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)의 SASA를 갖는 트립토판 잔기의 수를 기준으로 제형에 부가함을 포함한다. 일부 구현예에서, SASA는 모든-원자 분자 동력학 모의실험에 의해 인실리코로 측정된다. 일부 구현예에서, 제형에 첨가되는 NAT의 양은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)이다. 일부 구현예에서, 제형에 부가되는 NAT의 양은 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, NAT는 단백질 내 하나 이상의 트립토판 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 단백질은 하나 초과의 트립토판 잔기를 갖고 SASA는 85 Å2 초과 (또는 30% 초과)이고 충분한 양의 NAT는 각각의 트립토판 잔기의 산화를 방지하기 위해 부가된다. 일부 구현예에서, 단백질의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 (예를 들어, 약 임의의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%까지, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 감소한다. 일부 구현예에서, 단백질의 약 40% 이하 내지 약 0% (예를 들어, 약 임의의 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 0%, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)가 산화된다. 일부 구현예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 임의의 단백질에 따른 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질의 산화를 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 NAT의 특정 양을 단백질의 산화를 방지하는 제형에 부가함을 포함하고, 상기 단백질은 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함하고 SASA는 약 15% 내지 약 45% (예를 들어, 약 임의의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45%)이다. 일부 구현예에서, 단백질은 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함하고 SASA는 약 30% 초과이다. 일부 구현예에서, SASA는 모든-원자 분자 동력학 모의실험에 의해 인실리코로 측정된다. 일부 구현예에서, 제형에 첨가되는 NAT의 양은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다), 또는 NAT가 제형에 가용성인 최고 농도까지다. 일부 구현예에서, 제형에 부가되는 NAT의 양은 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, NAT는 단백질 내 하나 이상의 트립토판 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 단백질의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 (예를 들어, 약 임의의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%까지, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 감소한다. 일부 구현예에서, 단백질의 약 40% 이하 내지 약 0% (예를 들어, 약 임의의 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 0%, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)가 산화된다. 일부 구현예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 임의의 단백질에 따른 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질의 산화를 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 단백질 내 트립토판 잔기의 SASA 값을 결정하고 NAT의 특정 양을, 적어도 하나의 트립토판 잔기가 약 15% 내지 약 45% 초과 (예를 들어, 약 임의의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45% 초과)의 SASA를 갖는 경우 단백질의 산화를 방지하는 제형에 부가함을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함하고 SASA는 약 30% 초과이다. 일부 구현예에서, SASA는 모든-원자 분자 동력학 모의실험에 의해 인실리코로 측정된다. 일부 구현예에서, 제형에 첨가되는 NAT의 양은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다), 또는 NAT가 제형에 가용성인 최고 농도까지다. 일부 구현예에서, 제형에 부가되는 NAT의 양은 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, NAT는 단백질 내 하나 이상의 트립토판 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 단백질의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 (예를 들어, 약 임의의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%까지, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 감소한다. 일부 구현예에서, 단백질의 약 40% 이하 내지 약 0% (예를 들어, 약 임의의 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 0%, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)가 산화된다. 일부 구현예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 임의의 단백질에 따른 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질의 산화를 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 단백질 내 트립토판 잔기의 SASA 값을 결정하고 NAT의 특정 양을, 약 15% 내지 약 45% 초과 (예를 들어, 약 임의의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45% 초과)의 SASA를 갖는 트립토판 잔기의 수를 기준으로 제형에 부가함을 포함하고 상기 제형에 부가된 NAT의 양은 단백질의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, SASA는 모든-원자 분자 동력학 모의실험에 의해 인실리코로 측정된다. 일부 구현예에서, 제형에 첨가되는 NAT의 양은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)이다. 일부 구현예에서, 제형에 부가되는 NAT의 양은 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, NAT는 단백질 내 하나 이상의 트립토판 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 단백질의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 (예를 들어, 약 임의의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%까지, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 감소한다. 일부 구현예에서, 단백질의 약 40% 이하 내지 약 0% (예를 들어, 약 임의의 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 0%, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)가 산화된다. 일부 구현예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 임의의 단백질에 따른 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다.
SASA는 하기 문헌에 기재된 인실리코 모든-원자 분자 동력학 모의실험 방법을 사용하여 계산될 수 있고 (Sharma, V. 등 (상기 참조)), 이는 보다 상세하게는 하기의 실시예에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 액체 제형 내 단백질의 산화를 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 항산화제의 특정 양을 단백질의 산화를 방지하는 제형으로 부가함을 포함하고, 상기 단백질은 MD 모의실험을 기준으로 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성의 연합 상에 트레이닝된 기계 학습 알고리즘에 의해 산화에 민감한 것으로 예측되는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 항산화제는 N-아세틸트립토판 (NAT)이다. 일부 구현예에서, 제형에 첨가되는 NAT의 양은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다), 또는 NAT가 제형에 가용성인 최고 농도까지다. 일부 구현예에서, 제형에 부가되는 NAT의 양은 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, NAT는 단백질 내 하나 이상의 트립토판 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 단백질의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 (예를 들어, 약 임의의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%까지, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 감소한다. 일부 구현예에서, 단백질의 약 40% 이하 내지 약 0% (예를 들어, 약 임의의 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 0%, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)가 산화된다. 일부 구현예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 임의의 단백질에 따른 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 기계 학습 알고리즘은 상기된 임의의 무작위 결정 포레스트에 따른 무작위 결정 포레스트이다. 일부 구현예에서, 무작위 결정 포레스트는 적어도 약 20 (예를 들어, 적어도 약 임의의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000 이상) 평가기, 적어도 약 1 (예를 들어, 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상) 특성, 및 적어도 약 2 (예를 들어, 적어도 약 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 이상)의 트리 깊이로 트레이닝되었다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 트립토판 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 트립토판 측쇄 각도, 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 팩킹 밀도, 트립토판 골격 각도 (stdev), 슈도-파이 오비탈의 SASA, 골격 유연성, 및 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 총 음전하를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 2 내지 11 (예를 들어, 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11)의 분자 표현자를 포함한다. 일부 구현예에서, 트립토판 분자 표현자에 대한 값은 액체 제형 중 단백질에 대한 파라미터를 사용하는 MD 모의실험에 의해 인실리코로 결정한다. 일부 구현예에서, 산화 검정에서 잔기의 적어도 약 임의의 30% (예를 들어, 적어도 약 임의의 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 이상)의 산화는 산화에 대한 민감성을 지적한다.
일부 구현예에서, 액체 제형 내 단백질의 산화를 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 NAT의 특정 양을 단백질의 산화를 방지하는 제형으로 부가함을 포함하고, 상기 단백질은 MD 모의실험을 기준으로 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성의 연합 상에 트레이닝된 기계 학습 알고리즘에 의해 산화에 민감한 것으로 예측되는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형에 첨가되는 NAT의 양은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다), 또는 NAT가 제형에 가용성인 최고 농도까지다. 일부 구현예에서, 제형에 부가되는 NAT의 양은 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, NAT는 단백질 내 하나 이상의 트립토판 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 단백질의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 (예를 들어, 약 임의의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%까지, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 감소한다. 일부 구현예에서, 단백질의 약 40% 이하 내지 약 0% (예를 들어, 약 임의의 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 0%, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)가 산화된다. 일부 구현예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 임의의 단백질에 따른 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 기계 학습 알고리즘은 상기된 임의의 무작위 결정 포레스트에 따른 무작위 결정 포레스트이다. 일부 구현예에서, 무작위 결정 포레스트는 적어도 약 20 (예를 들어, 적어도 약 임의의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000 이상) 평가기, 적어도 약 1 (예를 들어, 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상) 특성, 및 적어도 약 2 (예를 들어, 적어도 약 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 이상)의 트리 깊이로 트레이닝되었다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 트립토판 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 트립토판 측쇄 각도, 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 팩킹 밀도, 트립토판 골격 각도 (stdev), 슈도-파이 오비탈의 SASA, 골격 유연성, 및 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 총 음전하를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 2 내지 11 (예를 들어, 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11)의 분자 표현자를 포함한다. 일부 구현예에서, 트립토판 분자 표현자에 대한 값은 액체 제형 중 단백질에 대한 파라미터를 사용하는 MD 모의실험에 의해 인실리코로 결정한다. 일부 구현예에서, 산화 검정에서 잔기의 적어도 약 임의의 30% (예를 들어, 적어도 약 임의의 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 이상)의 산화는 산화에 대한 민감성을 지적한다.
일부 구현예에서, 액체 제형 내 단백질의 산화를 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 NAT의 특정 양을 MD 모의실험을 기준으로 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성의 연합 상에 트레이닝된 기계 학습 알고리즘에 의해 산화에 민감한 것으로 예측되는 트립토판 잔기의 수를 기준으로 제형에 부가함을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형에 첨가되는 NAT의 양은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다), 또는 NAT가 제형에 가용성인 최고 농도까지다. 일부 구현예에서, 제형에 부가되는 NAT의 양은 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, NAT는 단백질 내 하나 이상의 트립토판 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 단백질의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 (예를 들어, 약 임의의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%까지, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 감소한다. 일부 구현예에서, 단백질의 약 40% 이하 내지 약 0% (예를 들어, 약 임의의 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 0%, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)가 산화된다. 일부 구현예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 임의의 단백질에 따른 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 기계 학습 알고리즘은 상기된 임의의 무작위 결정 포레스트에 따른 무작위 결정 포레스트이다. 일부 구현예에서, 무작위 결정 포레스트는 적어도 약 20 (예를 들어, 적어도 약 임의의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000 이상) 평가기, 적어도 약 1 (예를 들어, 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상) 특성, 및 적어도 약 2 (예를 들어, 적어도 약 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 이상)의 트리 깊이로 트레이닝되었다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 트립토판 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 트립토판 측쇄 각도, 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 팩킹 밀도, 트립토판 골격 각도 (stdev), 슈도-파이 오비탈의 SASA, 골격 유연성, 및 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 총 음전하를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 2 내지 11 (예를 들어, 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11)의 분자 표현자를 포함한다. 일부 구현예에서, 트립토판 분자 표현자에 대한 값은 액체 제형 중 단백질에 대한 파라미터를 사용하는 MD 모의실험에 의해 인실리코로 결정한다. 일부 구현예에서, 산화 검정에서 잔기의 적어도 약 임의의 30% (예를 들어, 적어도 약 임의의 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 이상)의 산화는 산화에 대한 민감성을 지적한다.
일부 구현예에서, 액체 제형 내 단백질의 산화를 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 산화에 적용되지 않는 아미노산 잔기와 함께 산화에 민감한 것으로 예측된 하나 이상의 트립토판 잔기를 대체하기 위해 단백질 내 아미노산 치환을 도입함을 포함하고, 상기 예측이 MD 모의실험을 기준으로 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성의 연합 상에 트레이닝된 기계 학습 알고리즘에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 트립토판 잔기는 각각 티로신, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 알라닌, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 잔기에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 임의의 단백질에 따른 적어도 하나의 추가의 단백질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 기계 학습 알고리즘은 상기된 임의의 무작위 결정 포레스트에 따른 무작위 결정 포레스트이다. 일부 구현예에서, 무작위 결정 포레스트는 적어도 약 20 (예를 들어, 적어도 약 임의의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000 이상) 평가기, 적어도 약 1 (예를 들어, 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상) 특성, 및 적어도 약 2 (예를 들어, 적어도 약 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 이상)의 트리 깊이로 트레이닝되었다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 트립토판 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 트립토판 측쇄 각도, 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 팩킹 밀도, 트립토판 골격 각도 (stdev), 슈도-파이 오비탈의 SASA, 골격 유연성, 및 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 총 음전하를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 2 내지 11 (예를 들어, 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11)의 분자 표현자를 포함한다. 일부 구현예에서, 트립토판 분자 표현자에 대한 값은 액체 제형 중 단백질에 대한 파라미터를 사용하는 MD 모의실험에 의해 인실리코로 결정한다. 일부 구현예에서, 산화 검정에서 잔기의 적어도 약 임의의 30% (예를 들어, 적어도 약 임의의 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 이상)의 산화는 산화에 대한 민감성을 지적한다.
V. 스크리닝 방법
본원 발명은 또한 단백질의 감소된 산화에 대한 액체 제형을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 단백질은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 단백질 중 메티오닌, 시스테인, 히스티딘, 트립토판, 및/또는 티로신은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 단백질 내 트립토판은 산화에 민감하다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 약 50 Å2 내지 약 250 Å2 초과 (예를 들어, 약 임의의 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225 초과, 또는 250 Å2 초과, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)의 용매-접근가능한 표면적 (SASA)을 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, SASA는 약 80 Å2 초과이다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 약 15% 내지 약 45 % 초과 (예를 들어, 약 임의의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45% 초과)의 SASA를 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, SASA는 약 30% 초과이다. 일부 구현예에서, 단백질 내 트립토판은 MD 모의실험을 기준으로 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성의 연합 상에서 트레이닝된 기계 학습 알고리즘에 의해 산화에 민감성인 것으로 예측된다. 일부 구현예에서, 단백질의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 (예를 들어, 약 임의의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%까지, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 감소한다. 일부 구현예에서, 단백질의 약 40% 이하 내지 약 0% (예를 들어, 약 임의의 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 0%, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)가 산화된다. 일부 구현예에서, 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다.
일부 구현예에서, 단백질의 감소된 산화를 위한 액체 제형을 스크리닝하는 방법이 제공되고, 상기 단백질은 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함하고 i) SASA는 약 50 Å2 내지 약 250 Å2 초과 (예를 들어, 약 임의의 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 또는 250 Å2 초과, 이들 값 사이의 임의의 영역을 포함한다)이거나; ii) SASA는 약 15% 내지 약 45 % 초과 (예를 들어, 약 임의의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45% 초과)이고, 상기 방법은 a) 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 영역을 포함한다)의 N-아세틸-트립토판 (NAT)을, 단백질을 포함하는 액체 제형에 부가하고, b) 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)의 2,2’-아조비스 (2-아미노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH)를 액체 제형에 부가하고, c) 단백질, NAT 및 AAPH를 포함하는 액체 제형을 약 10시간 내지 약 20시간 (예를 들어, 약 임의의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20시간, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 동안 약 35℃ 내지 약 45℃ (예를 들어, 약 임의의 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45℃, 이들 값 사이의 임의의 영역을 포함한다)에서 항온처리하고, d) 단백질 내 트립토판 잔기의 산화를 위해 단백질을 측정함을 포함하고, 여기서, 단백질 내 트립토판 잔기의 약 20% 이하 (예를 들어, 약 임의의 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 이하, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 산화를 유도하는 NAT의 양을 포함하는 액체 제형은 단백질의 감소된 산화에 적합한 제형이다. 일부 구현예에서, SASA는 모든-원자 분자 동력학 모의실험에 의해 인실리코로 측정된다. 일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다.
일부 구현예에서, 단백질의 감소된 산화를 위한 액체 제형을 스크리닝하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 a) 단백질 내 트립토판 잔기의 SASA 값을 측정하고, b) NAT의 특정 양을, i) 약 50 Å2 내지 약 250 Å2 초과 (예를 들어, 약 임의의 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 또는 250 Å2 초과, 이들 값 사이의 임의의 영역을 포함한다)의 SASA; 또는 ii) 약 15% 내지 약 45 % 초과 (예를 들어, 약 임의의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45% 초과)의 SASA를 갖는 트립토판 잔기의 수를 기준으로 액체 제형에 부가하고, c) 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 영역을 포함한다)의 2,2’-아조비스 (2-아미노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH)를 액체 제형에 부가하고, d) 단백질, N-아세틸-트립토판 및 AAPH를 포함하는 액체 제형을 약 10시간 내지 약 20시간 (예를 들어, 약 임의의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20시간, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 동안 약 35℃ 내지 약 45℃ (예를 들어, 약 임의의 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45℃, 이들 값 사이의 임의의 영역을 포함한다)에서 항온처리하고, e) 단백질 내 트립토판 잔기의 산화를 위해 단백질을 측정함을 포함하고, 여기서, 단백질 내 트립토판 잔기의 약 20% 이하 (예를 들어, 약 임의의 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 이하, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 산화를 유도하는 NAT의 양을 포함하는 액체 제형은 단백질의 감소된 산화에 적합한 제형이다. 일부 구현예에서, SASA는 모든-원자 분자 동력학 모의실험에 의해 인실리코로 측정된다. 일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다.
일부 구현예에서, 단백질의 감소된 산화를 위한 액체 제형을 스크리닝하는 방법이 제공되고, 상기 단백질은 MD 모의실험을 기준으로 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성의 연합 상에서 트레이닝된 기계 학습 알고리즘에 의해 산화에 민감한 것으로 예측된 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함하고, 상기 방법은 a) 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 영역을 포함한다)의 N-아세틸-트립토판 (NAT)을, 단백질을 포함하는 액체 제형에 부가하고, b) 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)의 2,2’-아조비스 (2-아미노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH)를 액체 제형에 부가하고, c) 단백질, NAT 및 AAPH를 포함하는 액체 제형을 약 10시간 내지 약 20시간 (예를 들어, 약 임의의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20시간, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 동안 약 35℃ 내지 약 45℃ (예를 들어, 약 임의의 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45℃, 이들 값 사이의 임의의 영역을 포함한다)에서 항온처리하고, d) 단백질 내 트립토판 잔기의 산화를 위해 단백질을 측정함을 포함하고, 여기서, 단백질 내 트립토판 잔기의 약 20% 이하 (예를 들어, 약 임의의 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 이하, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 산화를 유도하는 NAT의 양을 포함하는 액체 제형은 단백질의 감소된 산화에 적합한 제형이다. 일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다. 일부 구현예에서, 기계 학습 알고리즘은 상기된 임의의 무작위 결정 포레스트에 따른 무작위 결정 포레스트이다. 일부 구현예에서, 무작위 결정 포레스트는 적어도 약 20 (예를 들어, 적어도 약 임의의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000 이상) 평가기, 적어도 약 1 (예를 들어, 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상) 특성, 및 적어도 약 2 (예를 들어, 적어도 약 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 이상)의 트리 깊이로 트레이닝되었다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수, 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 트립토판 델타 탄소 (stdev)의 7Å이내 총 양전하, 골격 SASA (stdev), 트립토판 측쇄 각도, 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 팩킹 밀도, 트립토판 골격 각도 (stdev), 슈도-파이 오비탈의 SASA, 골격 유연성, 및 트립토판 델타 탄소의 7Å이내 총 음전하를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분자 표현자는 2 내지 11 (예를 들어, 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11)의 분자 표현자를 포함한다. 일부 구현예에서, 트립토판 분자 표현자에 대한 값은 액체 제형 중 단백질에 대한 파라미터를 사용하는 MD 모의실험에 의해 인실리코로 결정한다. 일부 구현예에서, 산화 검정에서 잔기의 적어도 약 임의의 30% (예를 들어, 적어도 약 임의의 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 이상)의 산화는 산화에 대한 민감성을 지적한다.
VI. 단백질 제형의 투여
상기 액체 제형은 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 볼러스로서 정맥내 투여 또는 특정 시기 동안 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하내, 관절내, 활액내, 척추강내, 경구, 국소, 흡입 또는 유리체내 경로에 의해 단백질 (예를 들어, 항체)의 치료를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게 인간에게 투여된다. 하나의 구현예에서, 액체 제형은 정맥내 투여에 의해 포유동물에 투여된다. 상기 목적을 위해, 제형은 예를 들어, 시린지를 사용하거나 IV 라인을 통해 주사될 수 있다. 하나의 구현예에서, 액체 제형은 피하 투여에 의해 포유동물에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 액체 제형은 유리체내 투여에 의해 투여된다.
단백질의 적당한 용량(“치료학적 유효량”)은 예를 들어, 치료될 조건, 병태의 중증도 및 과정, 상기 단백질이 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는 지의 여부, 이전 치료요법, 환자의 임상적 병력 및 단백질에 대한 반응, 사용되는 단백질의 유형 및 담당의의 재량에 의존할 것이다. 단백질은 적합하게 1회 또는 일련의 치료 과정에서 환자에게 투여되고 향후 진단으로부터 임의의 시점에서 환자에게 투여될 수 있다. 상기 단백질은 유일한 치료제로서 또는 미지의 병태를 치료하는데 유용한 다른 약물 또는 치료요법과 연계하여 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 “치료”는 치료학적 치료 및 예후적 또는 예방적 대책 둘 다를 언급한다. 치료를 필요로 하는 자들은 장애를 예방되어야 하는 자들뿐만 아니라 이미 장애를 앓는 자들을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 “장애”는 포유동물이 미지의 장애에 걸릴 성향이 있는 병리학적 병태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 치료로부터의 이득을 얻는 임의의 병태이다.
약리학적 감각에서, 본 발명과 관련하여, 단백질 (예를 들어, 항체)의 “치료학적 유효량”은 항체가 효과적인 치료에 대한 장애의 예방 또는 치료에 효과적인 양을 언급한다. 일부 구현예에서, 투여되는 단백질의 치료학적 유효량은 하나 이상의 투여이든 상관 없이 환자 체중의 약 0.1 내지 약 50 mg/kg (예를 들어, 약 0.3 내지 약 20 mg/kg, 또는 약 0.3 내지 약 15 mg/kg)의 범위일 것이다. 일부 구현예에서, 단백질의 치료학적 유효량은 하루 용량 또는 수회 하루 용량으로부터 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질의 치료학적 유효량은 하루 보다 덜 빈번하게, 예를 들어, 매주 또는 매달 투여된다. 예를 들어, 단백질은 1회 이상의 주마다 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4주 이상 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 이상 마다) 약 100 내지 약 400 mg (예를 들어, 약 임의의 100, 150, 200, 250, 300, 350, 또는 400 mg, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)의 용량을 투여될 수 있거나 1회 이상의 주마다 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4주 이상 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 이상 마다) 약 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 15.0, 또는 20.0 mg/kg의 용량으로 투여된다. 용량은 단일 용량 또는 다중 용량으로서 투여될 수 있고 (예를 들어, 2, 3, 4 이상의 용량), 예를 들어, 주입으로 투여될 수 있다. 상기 치료요법의 진행은 통상적인 기술에 의해 용이하게 모니터링된다.
VII. NAT의 분해를 측정하는 방법
본원 발명은 또한 단백질의 감소된 산화에 대한 액체 제형을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 제형 중 단백질을 효과적으로 보호하기 위해, 제형 중 NAT는 민감한 Trp 잔기에 대해 희생적으로 산화되어야만 하고; 이와 같이, NAT 분해제는 NAT를 함유하는 약품의 취급 및 저장 동안에 형성되는 것으로 예상될 수 있다. NAT에 대한 비율 및 분해 경로를 이해하는 것은 약품에 존재하는 분해된 NAT 종이 치료학적 단백질과 함께 환자에 투여될 것이기 때문에 중요하다. 문헌에 NAT 분해에 대한 단일 보고는 승온에서 장기간 저장 후에 농축된 HSA 용액 중에서 관찰된 2개의 NAT 분해제 (N-Ac-PIC, 2b, 및 N-Ac-3a,8a-디하이드록시-PIC, 3b)를 동정하고 정량하기 위한 다수의 반응 모니터링 LC-MS 방법과 함께 2차원 크기 배제 크로마토그래피 탭핑 방법을 사용하였다(문헌참조: Fang, L., 등, J Chromatogr A, 2011, 1218(41): 7316-24). Trp 자체의 분해는 보다 철저하게 연구되었고 (문헌참조: Ji, J. A., 등, J Pharm Sci, 2009, 98(12): 4485-500; Simat, T. J. 및 H. Steinhart, J Agric Food Chem, 1998, 46(2): 490-498) 보다 큰 그룹의 분해제가 보고되었고, 이는 PIC (2a), 옥시인돌릴알라닌 (Oia, 4a), 디옥시인돌릴알라닌 (DiOia, 5a), 키누레닌 (Kyn, 6a), N-포밀-키누레닌 (NFK, 7a), 및 5-하이드록시-Trp (5-OH-Trp, 8a)를 포함한다.
일부 양상에서, 본 발명은 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물에서 N-아세틸 트립토판 (NAT) 분해를 측정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 상기 조성물을 역상 크로마토그래피 물질에 적용하고 (여기서, 상기 조성물은 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중에서 평형화된 크로마토그래피 물질 상으로 로딩되고, 이동상 A는 수중 산을 포함하고 이동상 B는 유기 용매 중 산을 포함한다), b) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액으로 역상 크로마토그래피 물질로부터 조성물을 용출시키고 (여기서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 a)와 비교하여 증가되고, NAT 분해제는 온전한 NAT와는 별도로 크로마토그래피로부터 용출된다), c) NAT 분해제 및 온전한 NAT를 정량함을 포함한다. 구현예에서, 단계 a)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 임의의 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 6:94, 7:93, 8:92, 9:91, 또는 10:90이다. 구현예에서, 단계 a)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 2:98이다. 일부 구현예에서, 단계 b)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 선형으로 증가한다. 다른 구현예에서, 단계 b)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계적으로 증가한다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다.
일부 양상에서, 본 발명은 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물에서 N-아세틸 트립토판 (NAT) 분해를 측정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 상기 조성물을 역상 크로마토그래피 물질에 적용하고 (여기서, 상기 조성물은 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중에서 평형화된 크로마토그래피 물질 상으로 로딩되고, 이동상 A는 수중 산을 포함하고 이동상 B는 아세토니트릴 중 산을 포함한다), b) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액으로 역상 크로마토그래피 물질로부터 조성물을 용출시키고 (여기서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 a)와 비교하여 증가되고, NAT 분해제는 온전한 NAT와는 별도로 크로마토그래피로부터 용출된다), c) NAT 분해제 및 온전한 NAT를 정량함을 포함한다. 구현예에서, 단계 a)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 임의의 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 6:94, 7:93, 8:92, 9:91, 또는 10:90이다. 구현예에서, 단계 a)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 2:98이다. 일부 구현예에서, 단계 b)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 선형으로 증가한다. 다른 구현예에서, 단계 b)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계적으로 증가한다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 임의의 0.25 mL/분, 0.5 mL/분, 0.75 mL/분, 1.0 mL/분, 1.25 mL/분, 1.5 mL/분, 1.75 mL/분, 2.0 mL/분, 또는 2.5 mL/분이다. 일부 구현에에서, 크로마토그래피의 유속은 약 임의의 1.0 mL/min이다.
일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 임의의 25:75, 28:72, 30:70, 32:68, 또는 35:65이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 30:70으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피의 개시로부터 약 임의의 14, 15, 16, 17 또는 18분 후 약 임의의 25:75, 28:72, 30:70, 32:68, 35:65로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피의 개시로부터 약 16분 후 약 임의의 25:75, 28:72, 30:70, 32:68, 또는 35:65로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 30:70으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피의 개시로부터 약 16분 후 약 30:70으로 증가된다. 일부 구현예에서, 유속은 약 1 mL/min이다.
일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 임의의 85:15, 90:10, 또는 95:5로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 30:70으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피의 개시로부터 약 임의의 16, 17, 18, 19 또는 20분 후 약 임의의 85:15, 90:10, 또는 95:5로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피의 개시로부터 약 18.1분 후 약 임의의 85:15, 90:10, 또는 95:5로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 90:10으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피의 개시로부터 약 18.1분 후 약 90:10으로 증가된다. 일부 구현예에서, 유속은 약 1 mL/min이다.
일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 임의의 24:76, 25:75, 26:70, 27:73, 또는 28:71로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 26:74로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피의 개시로부터 약 임의의 12, 13, 14, 15 또는 16분 후 약 임의의 24:76, 25:75, 26:70, 27:73, 28:71로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피의 개시로부터 약 14분 후 약 임의의 24:76, 25:75, 26:70, 27:73, 또는 28:71로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 26:74로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피의 개시로부터 약 14분 후 약 26:74로 증가된다. 일부 구현예에서, 유속은 약 1 mL/min이다.
일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 임의의 85:15, 90:10, 또는 95:5로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 30:70으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피의 개시로부터 약 임의의 14.5, 15.5, 16.5, 17.5 또는 18.5분 후 약 임의의 85:15, 90:10, 또는 95:5로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피의 개시로부터 약 16.5분 후 약 임의의 85:15, 90:10, 또는 95:5로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 90:10으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피의 개시로부터 약 16.5분 후 약 90:10으로 증가된다. 일부 구현예에서, 유속은 약 1 mL/min이다.
일부 구현예에서, 이동상 A는 물 중 임의의 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 또는 1.0% (v/v)의 산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 물 중 약 0.1%의 산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 물 중 약 0.1%의 포름산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 5는 아세토니트릴 중 임의의 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 또는 1.0% (v/v)의 산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 아세토니트릴 중 약 0.1%의 산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 아세토니트릴 중 약 0.1%의 포름산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 물 중 약 0.1%의 포름산을 포함하고 이동상 B는 아세토니트릴 중 약 0.1%의 포름산을 포함한다.
일부 양상에서, 본 발명은 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물에서 N-아세틸 트립토판 (NAT) 분해를 측정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 상기 조성물을 역상 크로마토그래피 물질에 적용하고 (여기서, 상기 조성물은 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중에서 평형화된 크로마토그래피 물질 상으로 로딩되고, 이동상 A는 물 중 0.1% (v/v) 포름산을 포함하고 이동상 B는 유기 용매 중 0.1% (v/v) 포름산을 포함하고, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 2:98이다), b) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액으로 역상 크로마토그래피 물질로부터 조성물을 용출시키고 (여기서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 70:30으로 증가됨에 이어서 약 90:10으로 증가되고, 여기서, NAT 분해제는 온전한 NAT와는 별도로 크로마토그래피로부터 용출된다), c) NAT 분해제 및 온전한 NAT를 정량함을 포함한다. 일부 구현예에서, 유속은 약 1.0 mL/분이고 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피 개시 후 약 16분 후 약 70:30으로 증가됨에 이어서 크로마토그래피 개시로부터 약 18분 후 약 90:10으로 증가된다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다.
일부 양상에서, 본 발명은 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물에서 N-아세틸 트립토판 (NAT) 분해를 측정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 상기 조성물을 역상 크로마토그래피 물질에 적용하고 (여기서, 상기 조성물은 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중에서 평형화된 크로마토그래피 물질 상으로 로딩되고, 이동상 A는 물 중 0.1% (v/v) 포름산을 포함하고 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.1% (v/v) 포름산을 포함하고 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 2:98이다), b) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액으로 역상 크로마토그래피 물질로부터 조성물을 용출시키고 (여기서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 70:30으로 증가됨에 이어서 약 90:10으로 증가되고, NAT 분해제는 온전한 NAT와는 별도로 크로마토그래피로부터 용출된다), c) NAT 분해제 및 온전한 NAT를 정량함을 포함한다. 일부 구현예에서, 유속은 약 1.0 mL/분이고 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피 개시 후 약 16분 후 약 70:30으로 증가됨에 이어서 크로마토그래피 개시로부터 약 18분 후 약 90:10으로 증가된다.
일부 양상에서, 본 발명은 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물에서 N-아세틸 트립토판 (NAT) 분해를 측정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 상기 조성물을 역상 크로마토그래피 물질에 적용하고 (여기서, 상기 조성물은 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중에서 크로마토그래피 물질 상으로 로딩되고, 이동상 A는 물 중 0.1% (v/v) 포름산을 포함하고 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.1% (v/v) 포름산을 포함하고, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 2:98이다), b) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액으로 역상 크로마토그래피 물질로부터 조성물을 용출시키고 (여기서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 74:26으로 증가됨에 이어서 약 90:10으로 증가되고, 여기서, NAT 분해제는 온전한 NAT와는 별도로 크로마토그래피로부터 용출된다), c) NAT 분해제 및 온전한 NAT를 정량함을 포함한다. 일부 구현예에서, 유속은 약 1.0 mL/분이고 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 크로마토그래피 개시 후 약 14분 후 약 74:26으로 증가됨에 이어서 크로마토그래피 개시로부터 약 16.5분 후 약 90:10으로 증가된다.
일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 물질은 C8 잔기 또는 C18 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 물질은 C18 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 물질은 고체 지지체를 포함한다. 일부 구현에에서, 고체 지지체는 실리카를 포함한다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 물질은 칼럼에 함유된다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질 또는 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 칼럼은 Agilent ZORBAX® SB-C18 크로마토그래피 칼럼이다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피 칼럼은 Agilent ZORBAX® SB-C18 3.5 μm, 4.6 × 75 mm 크로마토그래피 칼럼이다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피는 약 0℃ 내지 약 30℃ 범위의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피는 임의의 약 0℃, 5℃, 20℃ 또는 30℃에서 수행된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피는 실온에서 수행된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피는 약 5℃에서 수행된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피는 5℃ ± 3℃에서 수행된다.
일부 구현예에서, NAT 및 NAT 분해제 생성물은 240 nm에서의 흡광도에 의해 검출된다. 일부 구현예에서, NAT 분해 생성물은 질량 크로마토그래피에 의해 동정된다. 일부 구현예에서, 조성물 중 NAT 농도는 약 10 nM 내지 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 NAT의 농도는 약 임의의 10 nM, 25 nM, 50 nM, 75 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 μM, 2.5 μM, 5 μM, 7.5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM, 250 μM, 500 μM, 750 μM, 또는 1 mM 미만이다. 일부 구현예에서, 조성물 범위에서 NAT의 농도는 약 10 nM 내지 약 100 nM, 약 100 nM 내지 약 500 nM, 약 500 nM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 500 μM, 또는 약 500 μM 내지 약 1 mM이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, NAT 분해 생성물은 N-Ac-(H, 1,2,3,3a,8,8a-헥사하이드로-3a-하이드록시피롤로 [2,3-b]-인돌 2-카복실산) (N-Ac-PIC), N-Ac-옥시인돌릴알라닌 (N-Ac-Oia), N-Ac- N-포르밀-키누레닌 (N-Ac-NFK), N-Ac-키누레닌 (N-Ac-Kyn) 및 N-Ac-2a,8a-디하이드록시-PIC 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N-아세틸 트립토판 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에서 N-아세틸 트립토판 (NAT) 분해를 측정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 폴리펩타이드를 변성시키고, b) 상기 조성물로부터 폴리펩타이드를 제거하고, c) 상기 조성물을 역상 크로마토그래피 물질에 적용하고 (여기서, 상기 조성물은 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중에서 크로마토그래피 물질 상으로 로딩되고, 이동상 A는 수중 산을 포함하고 이동상 B는 아세토니트릴 중 산을 포함한다), d) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액으로 역상 크로마토그래피 물질로부터 조성물을 용출시키고 (여기서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 a)와 비교하여 증가되고, NAT 분해제는 온전한 NAT와는 별도로 크로마토그래피로부터 용출된다), e) NAT 분해제 및 온전한 NAT를 정량함을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 구아니딘을 사용한 처리에 의해 변성시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 구아니딘으로 변성시키고 여기서 상기 구아니딘은 약 7 M 내지 약 9 M의 최종 농도로 조성물에 첨가한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 구아니딘으로 변성시키고 여기서 상기 구아니딘은 약 8 M의 최종 농도로 조성물에 첨가한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N-아세틸 트립토판 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에서 N-아세틸 트립토판 (NAT) 분해를 측정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 상기 조성물을 약 8 M의 구아니딘으로 희석시키고, b) 상기 조성물로부터 폴리펩타이드를 제거하고, c) 상기 조성물을 역상 크로마토그래피 물질에 적용하고 (여기서, 상기 조성물은 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중에서 크로마토그래피 물질 상으로 로딩되고, 이동상 A는 수중 산을 포함하고 이동상 B는 아세토니트릴 중 산을 포함한다), d) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액으로 역상 크로마토그래피 물질로부터 조성물을 용출시키고 (여기서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 a)와 비교하여 증가되고, NAT 분해제는 온전한 NAT와는 별도로 크로마토그래피로부터 용출된다), e) NAT 분해제 및 온전한 NAT를 정량함을 포함한다.
상기 구현예의 일부 구현예에서, 조성물은 약 8 M의 구아니딘 중에 희석시켜 조성물 중 NAT의 최종 농도가 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM 범위 이도록 한다. 상기 구현예의 일부 구현예에서, 조성물은 약 8 M의 구아니딘 중에 희석시켜 조성물 중 NAT의 최종 농도가 약 0.05 mM 내지 약 0.2 mM 범위 이도록 한다. 상기 구현예의 일부 구현예에서, 조성물은 약 8 M의 구아니딘 중에 희석시켜 조성물 중 NAT의 최종 농도가 임의의 0.05 mM, 0.06 mM, 0.07 mM, 0.08 mM, 0.09 mM, 0.10 mM, 0.12 mM, 0.14 mM, 0.16 mM, 0.18 mM 또는 약 0.2 mM 미만이도록 한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 8M 구아니딘 중에 희석시켜 조성물 중 폴리펩타이드의 최종 농도가 임의의 약 5 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 35 mg/mL, 약 40 mg/mL, 약 45 mg/mL, 약 50 mg/mL, 또는 약 100 mg/mL 이하이도록 한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 8M 구아니딘 중에 희석시켜 조성물 중 폴리펩타이드의 최종 농도가 약 5 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 15 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 30 mg/mL 내지 약 35 mg/mL, 약 35 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 40 mg/mL 내지 약 45 mg/mL, 약 145mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL 내지 약 100 mg/mL이도록 한다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 조성물로부터 여과에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 여과는 약 30 kDal의 분자량 컷오프를 갖는 여과 막을 사용한다.
상기 구현예의 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 3.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 상기 구현예의 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제형은 약 임의의 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 7.0, 7.5, 또는 8.0의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제형은 대상체에 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 상기된 방법에 따라 조성물의 샘플 중에서 NAT의 분해를 측정함을 포함하는 조성물에서 NAT의 분해를 모니터링하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 1회 이상 반복된다. 일부 구현예에서, 방법은 적어도 약 임의의 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 반복된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에서 매일, 주마다, 또는 월마다 또는 임의의 조합으로 반복된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 적어도 약 월마다, 2개월 마다, 3개월 마다, 4개월 마다, 5개월 마다, 6개월 마다, 9개월 마다 또는 적어도 약 연 1회 반복된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 약제학적 조성물에 대한 품질 검정을 제공하고, 상기 품질 검정은 상기된 방법에 따라 약제학적 조성물의 샘플 중에 NAT의 분해를 측정함을 포함하고, 여기서, 상기 조성물 중에서 측정된 NAT 분해물의 양은 상기 약제학적 조성물이 동물 투여용으로 적합한지를 결정한다. 일부 구현예에서, 약 임의의 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, 5 ppm, 6 ppm, 7 ppm, 8 ppm, 9 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, 70 ppm, 80 ppm, 90 ppm, 또는 100 ppm 미만의 약제학적 조성물 중 NAT 분해물의 양은 약제학적 조성물이 동물 투여용으로 적합하다는 것을 지적한다. 일부 구현예에서, 약 10ppm 미만의 약제학적 조성물 중 NAT 분해물의 양은 약제학적 조성물이 동물 투여용으로 적합하다는 것을 지적한다.
VIII. 제조 물품
발명의 또 다른 구현예에서, 발명의 액체 제형을 유지하고 임의로 이의 사용 지침서를 제공하는 컨테이너를 포함하는 제품이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 단백질 (예를 들어, 항체) 및 N-아세틸-트립토판 (NAT)을 포함하고, 여기서, 상기 단백질은 약 50 Å2 내지 약 250 Å2 초과 (예를 들어, 약 임의의 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 또는 250 Å2 초과, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)의 SASA와 함께 적어도 하나의 트립토판 잔기 a); 약 15% 내지 약 45% 초과 (예를 들어, 약 임의의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45% 초과)의 SASA와 함께 b); 또는 MD 모의실험을 기준으로 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성의 연합 상에 트레이닝된 기계 학습 알고리즘에 의한 산화에 민감한 것으로 예측된 c)를 포함한다. 일부 구현예에서, 액체 제형 중 NAT의 양은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 임의의 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 또는 10.0 mM, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)이다. 일부 구현예에서, 단백질의 산화는 약 40% 내지 약 100%까지 (예를 들어, 약 임의의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%까지, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 감소한다. 일부 구현예에서, 액체 제형은 약 0℃ 내지 약 5℃ (예를 들어, 약 임의의 0, 1, 2, 3, 4 또는 5℃, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함하는)에서 적어도 약 12개월 (예를 들어, 적어도 약 임의의 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다) 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 액체 제형 중 단백질의 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 액체 제형은 수성 제형이다.
적합한 컨테이너는 예를 들어, 병, 바이엘 및 시린지를 포함한다. 컨테이너는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 예시적 컨테이너는 2-20 cc 단일 용도 유리 바이엘이다. 대안적으로, 다중용량 제형을 위해, 상기 컨테이너는 2-100 cc 유리 바이엘일 수 있다. 컨테이너는 제형, 및 이의 위에 표지를 유지하거나 이와 연관되어 컨테이너는 사용 지침을 지적할 수 있다. 제품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 니들, 시린지 및 사용 지침서와 함께 팩키지 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 견지에서 바람직할 수 있는 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
팩키지 삽입물은 지시, 용도, 용량, 투여, 금기사항 및/또는 상기 치료학적 생성물의 용도에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는 치료학적 생성물의 상업적 팩키지에 통상적으로 포함되는 지침서를 언급한다.
다양한 목적을 위해, 예를 들어, 액체 제형 중 단백질의 산화를 감소시키기 위해 또는 단백질의 감소된 산화를 위한 액체 제형을 스크리닝하기 위해 유용하고, 이는 임의로 제품과 조합되는 키트가 또한 제공된다. 본 발명의 키트는 단백질 (예를 들어, 항체)를 포함하는 하나 이상의 컨테이너를 포함하고 상기 키트는 약 50 Å2 내지 약 250 Å2 초과 (예를 들어, 약 임의의 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 또는 250 Å2 초과, 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함한다)의 SASA와 함께 적어도 하나의 트립토판 잔기 a); 약 15% 내지 약 45 % 초과 (예를 들어, 약 임의의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45% 초과)의 SASA와 함께 b); 또는 MD 모의실험을 기준으로 트립토판 잔기의 복수의 분자 표현자와 트립토판 잔기 산화 민감성의 연합 상에 트레이닝된 기계 학습 알고리즘에 의한 산화에 민감한 것으로 예측된 c), NAT, AAPH, 및/또는 본원에 기재된 임의의 방법에 따른 사용 지침서를 포함한다. 본 발명의 키트에 제공된 지침서는 전형적으로 표지 또는 팩키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상에 서면 지침서이지만, 기계-판독가능한 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 있는 지침서)가 또한 허용가능하다.
명세서는 당업자가 발명을 수행할 수 있기에 충분한 것으로 고려된다. 본원에 나타내고 기재된 것들뿐만 아니라 발명의 다양한 변형은 이전의 기재로부터 당업자에게 자명하게 되고 첨부된 청구범위 내에 속한다. 모든 공개물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 이의 전문이 참조로 본원에 인용된다.
실시예
본 발명은 하기의 실시예를 참조로 보다 완전하게 이해된다. 이들은 그러나 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지 말아야 한다. 본원에 기재된 실시예 및 구현예가 단지 설명을 목적하는 것이고 이의 관점에서 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안되고 본원의 취지 및 이해의 범위 내 및 첨부된 청구범위 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다.
실시예 1: 산화로부터 NAT 보호의 평가.
SASA 계산
지적된 단백질 잔기들에 대한 SASA는 하기 문헌에 기재된 인실리코 모든-원자 분자 동력학 모델링 방법을 사용하여 계산되었다 (문헌참조: Sharma, V. 등 (supra)). 간략하게, 단백질의 구조는 3D 결정 구조 또는 상동성 모델로부터 수득되었고, 요구되는 바와 같은 이온 및 명백한 용매 분자를 첨가한다. SASA는 GROMACS의 g_sas를 사용하여 계산되었고, 상호 정보 계산은 국부적으로 수행된다 (문헌참조: Eisenhaber F. 등, J. Comput.Chem.16(3): 273-284, 1995; Lange O.F. 등 Proteins, 70(4) 1294-1312, 2008). 평균 제곱근 변동, 수소 결합, 및 2차 구조는 각각 GROMACS의 statusg_rsmf, g_hbond, 및 dssp를 사용하여 계산하였다. 샤논 엔트로피 (Shannon entropy) 및 상호 정보는 이전에 공개된 방법을 사용하여 계산하였다 (문헌참조: Kortkhonjia E, 등, Mabs 5(2) 306-322, 2013). MD 모의실험은 Amber 11 (FF99SB) 고정-하전력장 (fixed-charge force field)을 사용하여 수행하였고; SASA는 아레아이몰을 사용하여 계산하였고 (문헌참조: Bailey S, Acta.Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.50(Pt 5): 760-763, 1994); 100-ns 궤적은 이들이 가용한 계산력 내에서 충분한 데이터를 제공하기 때문에 사용하였다.
AAPH 스트레스
단백질 Mab1, Mab2, 및 Mab3/Mab4는 나트륨 아세테이트 완충액 (20 mM 나트륨 아세테이트 pH 5.5)으로 투석하고 Mab5/Mab6은 히스티딘계 완충액 (20 mM 히스티딘 하이드로클로라이드 pH 5.5)으로 투석하였다. 단백질 용액은 상응하는 완충액 중에서 1 mg/mL 단백질의 최종 농도로 희석하고 1 mM 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH)를 첨가하였다. 농축된 스톡 용액으로부터의 N-아세틸-Trp (NAT)는 0 내지 5 mM의 농도로 각각의 단백질 용액에 첨가하였다. 샘플은 16시간 동안 40℃에서 항온처리하고 메티오닌으로 켄칭하고 초기 투석 완충액 + 100 mM 슈크로스로 완충액 교환하였다.
LC-MS 트립신 작용 펩타이드 맵핑
Mab2, Mab1, 및 Mab3/Mab4의 AAPH-스트레스된 샘플의 부위-특이적 변형은 마이크로스케일 트립신 작용 펩타이드 분해에 이어서 액체 크로마토그래피-질량 분광측정 (LC-MS)을 사용하여 모니터링하였다 (문헌참조: Anderson, N. 등, Nov.20, 2014, American Pharmaceutical Review). 각각의 스트레스된 샘플 30 μL (250 μg)는 환원 카복시메틸화 완충액 (6 M 구아니딘 HCL, 360 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 8.6) 190 μL로 희석시켜 단백질을 변성시켰다. 변성 후, 4 μL의1 M DTT는 각각의 혼합물에 첨가하였고 환원 반응은 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 이어서 샘플은 요오도아세트산 10.4 μL의 첨가로 카복시메틸화하고 15분 동안 암실에서 실온에서 보관하였다. 알킬화 반응은 2 μL의 1 M DTT를 첨가하여 켄칭시켰다. 환원되고 알킬화된 샘플은 PD-10 칼럼 (GE Healthcare) 상에서 트립신 분해 완충액 (25 mM Tris, 2 mM CaCl2, pH 8.2)으로 완충액 교환하였다. 이어서 샘플은 1:50 중량의 효소 대 단백질 비율로 서열 분석 등급 트립신 (Promega)을 첨가함에 의해 분해하였다. 분해 반응은 37℃에서 4시간 동안 항온처리하고 이어서 100% 포름산 (FA)을 샘플에 3.0% (v/v)의 최종 FA 농도로 첨가함에 의해 켄칭하였다.
각각의 분해된 샘플의 펩타이드 맵핑은 써모 Q 정밀 플러스 고분리 질량 분광측정 시스템 (HRMS)에 커플링된 워터스 (Waters)사의 아쿠이티 (Acquity) H-부류 UHPLC 상에서 수행하였다. 10 μg 주사의 분해된 샘플의 분리는 CSH C18 칼럼 (워터스, 1.7 μm 입자 크기, 2.1 mm x 150 mm) 전개 상에서 0.3 mL/분의 유속 및 77℃로 제어된 칼럼 온도로 수행하였다. 용매 A는 물 중 0.1% FA로 이루어져 있고 용매 B는 아세토니트릴 중 0.1% FA로 이루어져 있다. 농도구배는 표 1에 나타낸다. 칼럼 용출물은 214 nm에서 모니터링하였다. 완전 MS-SIM 데이터는 200-2000 m/z의 스캔 범위 상에서 17,500의 분리능에서 수집하였다. 양성 이온 모드에서 전기 분무 이온화는 3.50 kV의 니들 분무 전압을 사용함에 의해 성취하였다. 목적하는 산화-성향 부위는 이전에 동일한 마이크로스케일 트립신 작용 분해를 사용함에 이어서 PTM의 잔기-특이적 위치 결정을 위해 사용되는 MS/MS 단편과 함께 LC/MS-MS에 의해 각각의 mAb에 대해 특징 분석하였다. 각각의 부위에서 산화 수준은 써모 X캘리버 생약제학적 특징 분석 소프트웨어를 사용하는 추출된 이온 크로마토그래피 (EIC)에 의해 결정하였다. 산화의 상대적 %는 산화된 펩타이드 종의 피크 면적을 본래의 및 산화된 펩타이드의 피크 면적의 합으로 나누어 계산하였다. 트립토판 부위에 대해 보고된 총 산화 값은 단지 Wox1 (+16) 및 NFK/Wox2 (+32)의 합이다. 펩타이드 맵핑에 대한 보다 상세한 내용은 다음 문헌을 참조한다: Andersen, N. 등, Rapid UHPLC-HRMS Peptide Mapping for Monoclonal Antibodies. Amer. Pharm. Rev., 2014.
Figure pct00004
산화로부터 NAT 보호
하기의 산화-성향 트립토판 잔기는 AAPH-유도된 산화로부터 NAT 보호에 대해 평가하였다: Mab2 W53 및 W106; Mab4 W52; Mab1 W103; 및 Mab6 W103/104. 각각의 단백질은 1 mM AAPH를 사용하여 상기된 바와 같이 AAPH 스트레스에 적용하였다. NAT는 Mab2, Mab4, 및 Mab1에 대해 0, 0.05, 0.1, 및 0.3 mM, 그리고 Mab6에 대해 0, 0.1, 및 1 mM로 첨가하였다. 하기 도 1 및 표 2 및 3에 나타낸 바와 같이, NAT는 AAPH 스트레스로부터 수득한 산화로부터 각각의 시험된 잔기를 보호할 수 있었다.
Figure pct00005
트립토판 산화 민감성의 예측
하기 도 2a에 나타낸 바와 같이, 트립토판 잔기 SASA의 함수로서 AAPH에 의한 % 산화는 38 IgG1 mAb로부터 데이터를 사용하여 플롯팅하였다. 30% SASA의 컷오프를 사용하여, 조사된 잔기의 87%는 35% 초과의 산화 수준을 가졌다. 트립토판 잔기의 단일 분자 표현자인 % SASA는 상기 항체 집단에서 산화에 대한 민감성을 예측하는데 고도로 정확하였다. 그러나, 하기도 2b에 나타낸 바와 같이, 다양한 프레임워크와 함께 121 mAb로부터의 트립토판 잔기를 포함하도록 데이터 세트를 확장 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG4, 뮤린)은 단독으로 % SASA를 기준으로 산화 민감성의 덜 정확한 예측을 수득하였다.
실시예 2: 트립토판 산화 민감성의 예측을 위한 기계 학습.
SASA와 같은 단일 모의실험-기반 분자 표현자를 사용하여 예를 들어, 특이적 IgG 서브부류에 대해 특정 조건에서 트립토판 산화 민감성에 대한 매우 정확한 예측을 수득할 수 있다. 그러나, 다양한 프레임워크에 걸쳐 있는 잔기의 트립토판 산화 민감성을 예측하는 경우, 정확도는 다수의 분자 표현자를 사용함에 의해 개선될 수 있다. 본원 발명자는 기계 학습을 사용하여 MD 모의실험-기반 분자 표현자 세트와 트립토판 산화 민감성의 상호관계를 규명하여 산화 민감성에 대해 어떠한 실험적 데이터가 가용하지 않은 시험 트립토판 잔기의 안정성을 정확하기 예측하기 위해 사용될 수 있는 모델을 생성하여 후보 분자를 선택하기 위해 보다 신속한 파이프라인을 가능하게 한다. 추가로, 모델에서 분자 표현자의 상대적 중요성이 결정되었고 이는 잠재적으로 안정성을 구동하는 근본적인 기작을 지적한다.
분자 표현자
하기의 분자 표현자는 상기된 인실리코 모든-원자 분자 동력학 모델링 방법을 사용하여 계산하였다. 6개의 MD 모의실험은 하기의 파라미터를 사용하여 각각의 트립토판 잔기에 대해 수행하였다: 유일한 Fv-영역, 모의실험 당 100 ns 스냅샷, 명시적 물, 일정 압력, 양성자화된 HIS와 함께 3개 모의실험, 양성자화된 HIS ("pH")와 함께 3개 모의실험, 및 3 fs 단계 크기. MD-유래된 분자 표현자는 국소 화학 환경의 환형 핑거프린팅을 포함하였다: 전하, 소수성; 수소 결합; 및 골격 및 아미노산 측쇄의 국소 구조.
트립토판 델타 탄소의 7Å이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수
각각의 분자 모의실험의 각각의 프레임에 대해, 각각의 트립토판의 델타 탄소의 7Å이내 모든 원자들을 추적하였다. 이들 원자 중, 임의의 아스파르트산 잔기의 측쇄 상의 산소 원자들인 것들을 계수하였다. 최종 값은 모의실험의 지속기간 동안 상기 계수의 시간-평균을 나타낸다.
측쇄 SASA ( stdev )
각각의 분자 모의실험의 각각의 프레임에 대해, 각각의 트립토판 측쇄의 용매-접근 가능한 표면적 (SASA)을 계산하였다. 간략하게, 모의실험에서 각각의 원자 상에 집중된 구형점은 물 분자의 반경과 함께, 각각의 원자 반경을 함께 부가함에 의해 생성하였다. 이웃하는 구형의 반경 내에 있는 모든 점을 제거하고 모든 나머지 점 사이의 면적을 합산하여 SASA에 대한 값을 생성하였다. 상기 표현자의 최종 값은 모의실험의 지속기간 동안의 트립토판 측쇄 원자들의 SASA의 표준 편차를 나타낸다.
델타 탄소 SASA ( stdev )
각각의 모의실험의 각각의 프레임에 대해, 각각의 트립토판 델타 탄소의 용매-접근 가능한 표면적 (SASA)을 이전에 기재된 바와 같이 계산하였다. 상기 표현자의 값은 모의실험의 지속기간 동안 트립토판 델타 탄소의 SASA의 표준 편차를 나타낸다.
트립토판 델타 탄소 ( stdev )의 7Å이내 총 양전하
각각의 모의실험의 각각의 프레임에 대해, 각각의 트립토판의 델타 탄소의 7Å이내 하전된 아미노산 측쇄와 연관된 모든 원자들을 추적하였다. 이들 원자들의 총 양전하는 함께 부가하였다. 최종 값은 모의실험의 지속기간 동안 상기 양의 표준 편차를 나타낸다.
골격 SASA ( stdev )
각각의 분자 모의실험의 각각의 프레임에 대해, 각각의 트립토판의 골격 질소 원자의 용매-접근 가능한 표면적 (SASA)을 계산하였다. 상기 표현자는 모의실험의 지속기간 동안 골격 질소 원자의 SASA의 표준 편차이다.
트립토판 측쇄 각도
트립토판 측쇄의 chi1 및 chi2 각도는 모의실험을 통해 추적하였다. 많은 상이한 트립토판 잔기 상의 chi1 및 chi2 각도 모두 및 모의실험을 그래프로 나타낸 경우, 통상적으로 존재하는 각도 조합의 클러스터는 명백해 졌다. K-평균 클러스터링을 사용하여 12 영역들 각각의 중심을 한정하였다.
트립토판 산화를 가장 예측케 하는 각도 영역은 Chi1=76 도 및 Chi2=98 도에서 집중된 “클러스터 5”였다. 각각의 개별 트립토판 잔기에 대해, 이것이 클러스터 5에 소비되는 시간의 백분율은 모의실험 상에서 추적되었고 디스크립토로서 무작위 결정 포레스트에 부가하였다.
트립토판 델타 탄소의 7Å이내 팩킹 밀도
팩킹 밀도는 트립토판 델타 탄소 상에 집중된 반경 7Å의 구형 내 단백질 원자의 시간-평균 수로서 계산하였다.
트립토판 골격 각도 ( stdev )
상기 표현자는 모의실험의 지속기간 동안 각각의 트립토판 잔기의 골격과 연관된 psi 각도의 표준 편차를 측정함에 의해 계산하였다.
슈도 -파이 오비탈의 점령된 용적
각각의 트립토판 잔기의 측쇄는 트립토판 파이-오비탈에 의해 점령된 공간에 근접하기 위해 9Å의 높이를 갖는 실린더의 기저로서 처리되었다. 모의실험 동안에 실린더의 용적 내 속하는 모든 원자들을 추적하였다. 실린더의 용적 내 속하는 모든 단백질 원자의 총 용적은 모의실험의 각각의 프레임에 대해 계산하였다. 최종 값은 다른 단백질 원자에 의해 점령되는 트립토판 파이-오비탈의 시간-평균 용적을 나타낸다.
골격 유동성
각각의 트립토판 잔기의 골격 질소의 평균 제곱근 변동은 각각의 모의실험에 대해 계산하였다. 간략하게. 모의실험에서 각각의 프레임을 정렬하였다. 각각의 질소 원자에 의해 이동되는 거리는 각각의 프레임에 대해 계산하였다. 각각의 프레임에 대한 상기 거리는 제곱화하고 상기 모든 프레임에 걸친 상기 제곱 거리의 평균을 구하였다. 최종적으로, 제곱근은 제곱 거리의 평균으로 취하여 트립토판의 골격 질소의 평균 제곱근 변동을 생성하였다.
트립토판 델타 탄소의 7Å이내 총 음전하
각각의 모의실험의 각각의 프레임에 대해, 각각의 트립토판의 델타 탄소의 7Å이내 하전된 아미노산 측쇄와 연관된 모든 원자들을 추적하였다. 이들 원자들의 총 음전하는 함께 부가하였다. 최종 값은 모의실험의 지속기간 동안 상기 양의 시간-평균을 나타낸다.
무작위 결정 포레스트의 생성
실험적으로 결정된 산화 수준과 함께 68 분자에서 121 트립토판 잔기에 대한 분자 표현자 세트에 대한 값은 상기된 바와 같이 계산하였다. 35% 초과의 산화를 갖는 트립토판 잔기는 "불안정한"것으로서 분류하였고, 35% 미만의 산화를 갖는 것들은 "안정한"것으로서 분류하였다. 일반적인 분자 표현자는 또한 IgG 형, IgG 골격 정보, 트립토판 잔기의 CDR 위치, CDR 길이, 서열에서 이전 및 후속적 잔기 및 다른 산화 핫스팟의 수를 포함하는 트립토판 잔기의 각각과 연관되었다.
실험적 데이터의 조합 (안정하거나 불안정한 트립토판 잔기) 및 트립토판 분자 표현자 (모의실험 데이터)를 사용하여 무작위 결정 포레스트를 트레이닝하여 어느 모의실험-기반 출력이 트립토판 안정성에 상응하는지를 알게 되었다. 무작위 결정 포레스트의 정확도는 일정 범위의 파라미터 상에서 평가하여 트레이닝을 위한 최적의 조건을 동정하고 트립토판 산화를 예측하기 위해 가장 중요한 표현자는 최적화된 파라미터를 사용하여 생성된 무작위 결정 포레스트를 사용하여 평가하였다.
무작위 결정 포레스트의 정확도는 2개의 방법을 사용하여 평가하였다. 하나의 방법에서, “아웃 오브 백” 오차를 계산하였다. 아웃 오브 백 오차는 예측된 모델 정확도의 신뢰할 수 있는 평가치인 것으로 기계 학습 문헌에서 입증되었다 (문헌참조: James, G., 등, An introduction to Statistical Learning.31, 316-321 (2013). 간략하게, 부트스트랩 응집은 트레이닝 세트 X = x1, …, xn에 적용하였고, 이들의 부트스트랩 샘플에서 x을 갖지 않은 트리만을 사용하는 각각의 트레이닝 샘플 x에 대한 평균 예측 오차를 계산하였다. 다른 방법에서, 데이터 세트는 무작위 결정 포레스트를 트레이닝하기 위해 사용되는 트레이닝 세트 (데이터 80%) 및 수득한 무작위 결정 포레스트에 적용된 시험 세트 (나머지 데이터 20%)로 나누었다. 시험 세트에 대한 예측 오차를 사용하여 분자 정확도를 계산하였다.
무작위 결정 포레스트에 대한 최적의 트레이닝 조건을 결정하기 위해, 하기의 파라미터를 다양하게 하고 모델 정확도를 평가하였다: 무작위 결정 포레스트 (또는 평가기)에 포함된 개별 결정 트리의 수, 무작위 결정 포레스트 (또는 특성)에서 각각의 트리의 각각의 브랜치에서 고려를 위해 무작위로 선택된 변수의 수, 및 관찰 풀이 서브-브랜치 (또는 트리 깊이)로 나누어지는 시간의 최대 수.트립토판 산화 모델 정확도에 대한 평가기의 최적의 수는 200 이상이었다 (도3 참조). 85% 초과의 정확도는 여전히 30 평가기만큼 적게 성취되었다. 특성의 최적의 수는 1 내지 4의 범위이다 (도4 참조). 최적의 트리 깊이는 5 이상이었다 (참조: 도5 참조). 정확한 모델은 2 정도로 낮은 트리 깊이로 여전히 성취되었다. 이들 결과를 기준으로, 하기의 최적화된 파리미터를 사용하여 무작위 결정 포레스트를 생성하였다: 5000 평가기, 결절 당 고려되는 3 특성, 및 10의 트리 깊이. 수득한 최적화된 무작위 결정 포레스트에 대한 아웃 오브 백 오차 계산은 89.2%의 정확도를 산출하였다. 데이터를 트레이닝 및 시험 세트로 나누면서, 최적화된 무작위 결정 포레스트의 정확도는 80% 민감성 및 89% 특이성과 함께 88%인 것으로 밝혀졌다 (표 4 참조).
Figure pct00006
최적화된 무작위 결정 포레스트에서 모의실험 기반 분자 표현자의 상대적 중요성은 gini 중요성을 사용하여 평가하였고 도 6에서 14 분자 표현자에 대해 나타낸다. 가장 중요한 표현자는 인근 아스파르트산 측쇄 산소, 이어서 등급 순서로 측쇄 SASA (stdev), 델타 탄소 SASA (stdev), 인근 양전하 (stdev), 골격 SASA (stdev), pH 7에서 트립토판 측쇄 각도, pH 7에서 팩킹 밀도, 골격 각도 (stdev), 골격 변동, 슈도 pi 오비탈의 SASA, pH 5에서 팩킹 밀도, pH 5에서 트립토판 측쇄 각도, pH 5에서 인근 음전하, 및 pH 7에서 인근 음전하이다.
실시예 3: 상이한 스트레스 조건 및 제형 하에 NAT 분해의 특징 분석.
NAT 안정성을 시스템적으로 평가하기 위해, 본원 발명자는 NAT 분해를 정량하기 위해 UV 검출과 조합된 역상 (RP) 크로마토그래피를 개발하였다. NAT는 단백질 제형에 전형적인 완충 시스템에 첨가하였고 재조합 단백질이 전형적인 제조 및 저장 조건 동안에 적용될 수 있는 것들을 모방하도록 디자인된 스트레스에 적용하였다: 알킬 퍼옥사이드, 펜톤 화학 (Fenton chemistry), UV 광, 및 열 스트레스 (문헌참조: Grewal, P., 등, Mol Pharm, 2014.11(4): 1259-72; Ji, J. A., 등, J Pharm Sci, 2009. 98(12): 4485-500; Torosantucci, R., 등, Pharm Res, 2014.31(3): 541-53). 본원 발명의 연구에서, 10 초과의 상이한 NAT 분해물이 관찰되었고 주요 종이 동정되었다.
화학물질
주지된 경우를 제외하고는 화학물질은 제조원 (Sigma)로부터 구입하였다. 사용된 모든 화학물질은 분석 등급 순도였다. 단백질 치료학적 샘플은 차이니즈 햄스터 난소 세포 또는 이. 콜라이에서 생성되고 친화성 크로마토그래피 및/또는 이온-교환 크로마토그래피를 포함하는 일련의 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다. 주요 NAT 분해물의 합성 (도7 참조, NAT 분해 구조물에 대해)은 하기된 바와 같은 문헌의 방법을 적용함에 의해 성취하였다.
일반 합성 과정
가능한 경우 무수 용매를 사용하였다. 제조용 역상 크로마토그래피는 Phenomenex Gemini-NX 10μ C18 110Å100 mm×30 mm 정제용 HPLC 칼럼을 사용한 워터스 2525 HPLC 시스템 상에서 수행하였다. 이동상 A = Milli-Q H2O, 0.1% 포름산. 이동상 B = 아세토니트릴, 농도구배 = 0 내지 12분으로부터 0-20% B, 254 nm에서 분획 수거는 UV 신호 역치 (10-1 Au)에 의해 유도하였다. 분획은 목적하는 생성물의 존재에 대해 LC/MS에 의해 분석하였다. 모든 정제용 분리를 위해, 목적하는 피크의 전면부 및 후면부를 함유하는 분획물은 순도를 개선시키기 위해 풀링된 분획과 함께 포함되지 않았다.
최종 생성물의 LC/MS 샘플 분석은 열 과학적 오비트랩 질량 분광측정기를 사용하여 반복적으로 본문에 기재된 워터스 H-부류 UPLC 및 크로마토그래피 조건을 사용하여 수행하였다. 완전 스캔 정확한 질량 데이터는 50-800 m/z의 스캔 범위 상에서 양이온 방식으로 15,000의 분리능에서 수집하였다. MS2는 사용 금지된 동력학 배제와 함께 상부 3개의 이온 상에서 수행하였다.
NMR 분석은 과중수소화된 DMF에서 수행하였다.
트립토판 유도체의 아세틸화를 위한 일반적인 과정
트립토판 유도체는 아세토니트릴에 첨가하였다 (문헌참조: anhydrous, J. T. Baker) (최종 농도 200 mM). 디-이소프로필에틸아민 (DIPEA, 5 당량)을 첨가하고 이어서 직후 1.1 당량의 아세트산 무수물 (Ac2O)을 첨가하였다. 반응은 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 여과하여 미반응 출발 물질을 제거하고 용매는 진공에서 제거하였다. 물질은 디메틸포름아미드 (DMF) 중에서 용해시키고 목적하는 생성물은 prep-RPLC로 정제하였다.
N-Ac-Kyn (N-Ac-DL-키누레닌) 6b
DL-키누레닌 (Sigma Aldrich)은 상기 일반적인 과정에 의해 아세틸화하였다. DL-키누레닌 (800 mg, 3.84 mmol)은 40 ml의 아세토니트릴에 첨가하여 담황색 현탁액을 형성하였다. DIPEA (5 당량) 및 Ac2O (1.1 당량)를 첨가하였다. 16시간 동안 실온에서 교반한 후, 주요 현탁된 고체를 용해시키고 용액은 암황색/암오렌지색이었다. 제조용 크로마토그래피에 의한 분리 및 분리된 분획 물질 부분의 동결건조는 428 mg의 솜털 담황색 고체를 산출하였다. 수득된 생성물 (RP-HPLC에 의한 99%의 순도, 44% 수율)은 LC-MS (m/z = 251.103) 및 NMR에 의해 특징 분석되었다.
UV 및 닌하이드린 염색에 의한 TLC 분석으로 출발 물질의 부재를 확인하였다.
N-Ac-NFK (Nα-아세틸-N'-포르밀-키누레닌) 7b
N-Ac-NFK는 하기 문헌에 의해 보고된 문헌 프로토콜을 적용함에 의해 합성하였다: C. E. Dalgliesh in J. Chem.Soc.1952, 137-141. 포름산 (Sigma, 98-100%, 360 μl) 및 아세트산 무수물의 혼합물 (문헌참조: J. T. Baker, Anhydrous 99%, 105 μl)은 30분 동안 교반하고 이후 100 mg의 N-아세틸-DL-키누레닌을 첨가하였다. 2시간 동안 반응 후, LC/MS 분석은 여전히 출발 물질의 존재를 보여주었고, 이 지점에서 포름산 (120 μl) 및 아세트산 무수물 (35 μl)의 제2 첨가는 반응이 완료되도록 하였다. 제2 첨가 후 1시간 수행된 LC/MS 분석은 출발 물질의 부재 및 목적하는 생성물의 형성을 보여주었다. 반응 혼합물은 실온에서 15 ml의 물에 첨가하고 냉장저장하였다. 담갈색 결정이 밤새 형성되었다. 이들을 여과하고 빙냉 수로 세척하고 습윤 잔사를 동결건조시켜 솜털 담갈색 고체로서 목적하는 생성물 10 mg을 산출하였다. 수득된 생성물 (RP-HPLC에 의한 90%의 순도, 9.0% 수율)은 LC-MS (m/z = 279.098) 및 NMR에 의해 특징 분석되었다.
Oia (옥스인돌릴-DL-알라닌) 부분입체이성체 4a
Oia는 하기 문헌에 의해 보고된 문헌 프로토콜을 적용함에 의해 합성하였다: Itakura, K.; Uchida, K.; Kawakishi, S. in Chem. Res. Toxicol. 1994, 7, 185-190.　DMSO (900 μl) 및 페놀 (100 mg, 1.06 mmol)은 주위 온도에서 5 mL의 37% HCL과 예비 혼합하였다. DL-Trp (1.0 g, 4.9 mmol)는 30 ml의 빙초산 중에 현탁시키고 혼합물에 첨가하였다. 반응은 주위 온도에서 교반하였다. 진행은 주기적으로 LC-MS에 의해 검사하였다. 4시간 후, LC/MS는 출발 물질의 소실 및 목적하는 생성물 매쓰 (m/z = 221)를 갖는 2개의 밀접하게 용출하는 피크의 형성을 확인하였다. 진공하에 용매의 제거는 암갈색 시럽을 유도하였다. 물질은 4 ml의 DMF 중에 용해시켰다. 부분입체이성체를 분리하기 위한 어떠한 시도 수행하지 않았고, 목적하는 부분입체이성체 생성물의 정제는 정제용 -RPLC를 사용하여 수행하였다. 목적하는 분획물을 조합하고 동결건조시켜 305 mg의 솜털 백색 고체를 생성하였다. 수득된 생성물 (28% 수율) 은 LC-MS (m/z = 221)로 특징 분석하였다.
N-Ac-Oia (N-아세틸-옥스-인돌릴 알라닌) 부분입체이성체 4b
옥스-인돌릴-DL-알라닌 부분입체이성체 4a (100 mg)는 상기 일반적인 과정에 따라 아세틸화하였다. 16시간 후, LC/MS는 반응이 완성되었음을 확인시켜 주었다. 용매는 진공에서 제거하였다. 제조용 크로마토그래피 및 동결건조는 56 mg의 솜털 백색 분말을 산출하였다. 부분입체이성체를 분리하기 위한 어떠한 시도 하지 않았다. 수득된 부분입체이성체 생성물 (RP-UPLC에 의한 89% 순도, 47% 수율) 은 LC-MS (m/z = 263.102) 및 NMR에 의해 특징 분석되었다. UV 및 닌하이드린 염색에 의한 TLC 분석으로 출발 물질의 부재를 확인하였다.
N-Ac-5-HTP (N-아세틸-5-하이드록시-트립토판) 8b
5-HTP 8a (150 mg)는 상기 일반적인 과정에 따라 아세틸화하였다. 16시간 후, LC/MS는 반응이 완성되었음을 확인시켜 주었다. 용매는 진공에서 제거하였다. 제조용 크로마토그래피 및 동결건조는 58 mg의 솜털 백색 분말을 산출하였다. 수득된 생성물 (32% 수율)은 LC-MS (m/z = 263.1) 및 NMR에 의해 특징 분석되었다. UV 및 닌하이드린 염색에 의한 TLC 분석으로 출발 물질의 부재를 확인하였다.
2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH) 산화 스트레스
AAPH (Calbio Chem, 99.8%)를 사용하여 알킬 퍼옥사이드에 의한 산화 분해를 모델링하였다. pH 5.5에서 0.3 mM NAT ± 5 mM L-Met pH 5.5를 함유하는 히스티딘 및 비-히스티딘 완충제는 수성 AAPH 용액을 사용하여 1.0 mM의 AAPH의 최종 농도로 처리하였다. Milli-Q H2O의 등가 용적을 대조군 샘플에 첨가하였다. 샘플은 16시간 동안 40℃에서 항온처리하였다. 산화는 L-Met를 20 mM의 최종 농도로 첨가하여 켄칭하였다. 켄칭 용액의 첨가 후, 최종 NAT 농도는 0.2 mM이었다.
펜톤 스트레스 (Fenton Stress)
FeCl2 (Sigma Aldrich, 98% 순도) 및 H2O2 (Sigma Aldrich, H2O 중 30% w/w)를 각각 0.2 mM 및 10 ppm의 최종 농도로 0.3 mM NAT ± 5 mM L-Met, pH 5.5를 사용하여 pH 5.5에서 히스티딘-함유 완충액에 첨가하였다. H2O2의 첨가시, 바이엘은 간략하게 볼텍싱하고 40℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 산화는 L-Met를 100 mM의 최종 농도로 첨가하여 켄칭하였다. 켄칭 용액의 첨가 후, 최종 NAT 농도는 0.2 mM이었다.
광 스트레스
기관 (International Conference on Harmonization (ICH) Expert Working Group)에 의해 추천된 약물/생성물 광안정성 시험을 수행하기 위해 디자인된 광 박스 [Atlas SunTEST CPS+ Xenon Light Box (Chicago, IL)]를 사용하여 NAT-함유 샘플에 광 스트레스를 제공하였다. ICH 광안정성 시험은 120만 룩스-시간의 백색광 및 200 W-시간/m2의 UV 광으로서 정의되고; 광 박스는 24시간 기간 동안 스트레스를 제공하도록 프로그램화하였다. 0.3 mM NAT ± 5 mM L-Met를 함유하는 히스티딘 및 비-히스티딘 완충제는 멸균 유리 바이엘에 분취 첨가하였다 (1 ml/바이엘l). 바이엘을 캡핑하고 광 박스 내 이들의 측면 상에 위치시켜 광원으로의 노출을 최대화하였다. 각각의 완충제 조건에 대한 대조군 샘플은 포일로 덮고 노출 지속기간 동안 광 박스에 위치시켰다. HPLC 분석 전, 다른 스트레스 모델과의 일관성을 위해, 완충제는 Milli-Q H2O를 사용하여 0.2 mM의 최종 NAT 농도로 희석시켰다.
열 스트레스
1.0 mM NAT를 함유하는 히스티딘 및 비-히스티딘 완충제는 멸균 유리 바이엘에 분취 첨가하였다 (5 ml/바이엘, 완충제 당 6 바이엘). 바이엘은 스트레스 동안에 지정된 온도에서 암실 박스에 보관하고 분석때까지 저장을 위해 (5개월 동안 매월 취해진 시점) -70oC로 이동시켰다. 각각의 완충액의 샘플에 대한 초기 시점은 -70oC에 가깝게 이전시켰다. 분석 전, 샘플을 해동시키고 Milli-Q H2O를 사용하여 0.2 mM의 최종 NAT 농도로 희석시켰다.
HPLC 분석
NAT 및 NAT 분해물은 Agilent ZORBAX SB-C18 3.5 μm, 4.6 x 75 mm 역상 칼럼을 사용하는 Agilent 1200 시리즈 HPLC 또는 워터스 H 부류 UPLC 상에서 분리하였다. 칼럼 온도는 온도조절 제어기에 의해 30 ± 0.8℃에서 유지하였다. HPLC 및 UPLC를 위해 사용되는 농도구배는 표 5 및 6에 각각 열거한다 (주지사항: UPLC 상에 보다 짧은 농도구배는 보다 이른 체류 시간을 수용하기 위해 디자인하였고 칼럼-재평형화 기간은 1.0 ml/분의 유속에서 보다 큰 범위의 시스템 압력으로 인해 연장되었다). NAT 분해 생성물은 240 nm에서 검출되었다. 표준 밴드폭 세팅 (Agilent 1200 HPLC에 대해 8 nm, 워터스 H-부류에 대해 4.8 nm)은 각각의 장비 상에서 분석을 위해 사용하였다. 자동 샘플 채취기는 5 ± 3℃에서 유지하였다. 10 nmol의 NAT 및/또는 NAT 분해물 (대부분의 샘플에 대해 50 μl)은 분석을 위해 칼럼 상으로 주입하였다. 크로마토그램은 Dionex Chromeleon 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하였다.
Figure pct00007
LC/MS에 의한 샘플의 분석
LC/MS 샘플 분석은 열 과학적 오비트랩 질량 분광측정기를 사용하여 반복적으로 상기된 워터스 H-부류 UPLC 및 크로마토그래피 조건을 사용하여 수행하였다. 완전 스캔 정확한 질량 데이터는 50-800 m/z의 스캔 범위 상에서 양이온 방식으로 15,000의 분리능에서 수집하였다. MS2는 사용 금지된 동력학 배제와 함께 상부 3개의 이온 상에서 수행하였다.
결과
스트레스된 샘플 패널 디자인
NAT 안정성은 4개의 상이한 대표적 스트레스에 노출 후 평가하였다: 1) 약제학적 제조 동안에 스테인레스 강과의 접촉으로 인해 침출될 수 있는 철에 의해 유발된 잠재적 산화를 모사하는 펜톤 화학 (Fenton chemistry) (H2O2 + Fe2 +), 2) 폴리소르베이트 세제의 분해에 의해 생성된 알킬 퍼옥사이드를 모사하는 AAPH 스트레스, 3) 광안정성을 평가하기 위해 제약 산업에서 사용되는 거친 광 스트레스인 기관 (International Conference on Harmonization (ICH))의 광 스트레스 (120만 룩스 시간, 200w hr/m2), 및 4) 생약제의 장기 분해를 모의실험하기 위해 가속화된 열 스트레스. 각 스트레스의 강도는 전형적인 저장 수명 및 제조 및 서로 유사한 분해 강도와 비교하여 거친 것으로 선택되어 상이한 스트레스 모델에 의해 유도된 변화가 비교될 수 있도록 한다. 이들 연구는 mAb에 대해 전형적으로 사용되는 것들과 일관된 제형으로 수행하였다. 히스티딘은 산화적으로 활성인 것으로 공지되어 있으므로 히스티딘 및 비-히스티딘 함유 완충제는 적절한 경우 사용하였다.
방법 개발
C18 칼럼을 사용하는 역상 크로마토그래피는 NAT 분해를 모니터링하기 위해 사용하였다. 농도구배 조건은 NAT 및 NAT 분해물의 적합한 분리능을 보장하기 위해 선택하였다 (도 8a). 용출물은 저수준의 종의 적당한 민감성을 보장하기 위해 선택된 파장인 240 nm에서 모니터링하였다 [일부 종은 보다 높은 파장에서 검출되지 않았고 (예를 들어, 280 nm), 신호:노이즈는 보다 낮은 파장에서 하강하였다 (예를 들어, 214 nm), 도 8b를 참조한다]. 최종 크로마토그래피 조건은 관련 범위를 통해 선형 반응을 제공하였다: 0.01-1.0 mM NAT (도13) 및 AAPH-스트레스된 NAT 샘플에서 분해물의 1-20-배 희석 (도14 참조). NAT 및 주요 분해물의 자동샘플 채취기 안정성은 5℃에서 12시간까지 동안 확립하였다 (데이터는 나타내지 않음).
단백질-함유 샘플은 구아니딘 중에서 희석시키고 단백질은 초-여과 (30 kDa 분자량 컷-오프를 갖는 Amicon 스핀 여과기)를 통해 제거하였다. 불완전한 회수는 일부 mAb에 대해 카오트로프의 부재에서 관찰되었고, 이는 NAT와 단백질 간의 비공유 상호작용이 일어날 수 있음을 시사한다. NAT는 이전에 인간 혈청 알부민 (HAS)에 결합하는 것으로 입증되었지만 (문헌참조: Anraku, M., 등, Biochim Biophys Acta, 2004.1702(1): p. 9-17), 지금까지 mAb에 결합하는 것으로 보고된 적이 없다. 최종 샘플 제조 조건을 사용하여, NAT의 회수는 3개의 시험된 항체/항체 유도체에 대해 94-99%였고 NAT 분해물의 회수는 98-100%였다 (데이터는 나타내지 않음).
스트레스된 샘플 패널의 분석
6개 주요 새로운 피크 및 다수의 소수 피크로 나타나는 다수의 NAT 분해물은 모든 스트레스 조건에 대해 관찰되었다 (도8a, 하기의 도면을 참조한다. NAT 분해 구조물에 대해 도 7). 각각의 샘플에 대해 총 NAT 분해는 NAT 피크 면적을 각각의 스트레스 모델에 대해 대조군 샘플과 비교함에 의해 계산하였다 (표 7). NAT 분해는 3% (열 스트레스, 비-His 완충액) 내지 83% (ICH 광 스트레스, His 완충제) 범위였다.
Figure pct00008
대략적으로 30-40%의 NAT 분해는 모든 시험된 조건하에서 펜톤 및 AAPH 스트레스에 대해 관찰되었고 분해물의 수준 및 분포는 일반적으로 완충제 중 히스티딘의 존재와는 무관하였다 (도8a, 하기의 도면을 참조한다. NAT 분해 구조물에 대해 도 7). NAT는 ICH 광 스트레스하에 보다 큰 완충제 민감성 (즉, 히스티딘과 비-히스티딘 제형 간의 차이)을 경험하였다 (도 8a). 광 스트레스 항에 비-히스티딘 완충제 중 NAT의 안정성이 AAPH 및 펜톤 스트레스와 정량적으로 유사한 NAT 분해를 유도하였고 (28% vs. 33-41% 상실), 분해물의 분포는 변화하였고 새로운 피크를 관찰하였다 (“*”로 지적된 피크, 도 8a). 상당히 보다 높은 수준의 분해(>80%)는 광 스트레스하에 히스티딘 완충제에서 관찰되었고 이는 새로운 피크와 함께 이전에 관찰된 NAT 분해물의 상승된 수준을 유도한다 (도 8a).
종합적으로, 분해된 샘플 패널에서 프로필 간의 두드러진 일관성이 관찰되었고, ICH 광 스트레스 조건하에서 관찰된 소수 피크는 제외한다 (하기의 도에서 “*”로 지적된 피크도 8a). 이것은 과산화수소/하이드록실 라디칼 (펜톤 스트레스) 및 알킬 퍼옥사이드 (AAPH)가 통상의 경로를 통해 NAT를 분해시킬 수 있음을 시사하고, 반면 UV 광에 의해 유도된 반응성 산소 종 (ROS) (H2O2, 단일선 산소, 슈퍼옥사이드)은 추가의 분해 경로를 제공할 수 있다. 히스티딘의 존재가 ICH 광 조건하에서 NAT 분해를 증가시킨다는 관찰은 히스티딘 자체가 광반응이고 따라서 ROS 수준 및 유형을 증가시킬 수 있다는 보고와 일치한다 (문헌참조: Stroop, S.D. 등, J Pharm Sci, 2011.100(12): p. 5142-55). 통상의 NAT 분해 프로필이, 시험된 이들 다양한 스트레스 조건하에서 관찰되는 경우, 약품 중에 임의의 NAT 분해가 이들 동일한 종의 생성을 유도할 가능성이 있다.
분해물 동정
이어서, 분해된 NAT 분해물 종의 동정은 LC/MS/MS를 사용하여 수행하였다. 주요 피크에 대한 분자 이온은 표 8에 열거한다 (LC/MS에 의한 적당한 신호 강도를 나타내는 모든 피크의 완전한 목록은 표 9에 포함된다). 주요 피크 2, 3, 및 4는 263.1 (NAT+16)의 m/z를 가졌고, 이는 NAT의 단일 산화 반응과 일치한다. 주요 피크 2 및 3은 유사한 MS1 및 MS2 스펙트럼을 갖고 (도15a) 모니터링된 모든 스트레스 및 흡광도 파장에 걸쳐 일관된 비율을 갖기 때문에 (도8b), 이들 피크는 잠정적으로 N-Ac-Oia 4b의 상호전환 부분입체이성체로서 할당되었다 (하기 도 참조구조물에 대해 도 7). 유사한 Trp 종은 트립토판의 과산화수소 처리 후 보고되었다 (문헌참조: Simat, T. J. 및 H. Steinhart, J Agric Food Chem, 1998. 46(2): p. 490-498). 상기 할당은 추가로 이전에 옥시인돌릴알라닌 (Oia)-함유 펩타이드를 지적하는 것으로 이전에 보고된 130.1에서 MS2 이온의 관찰에 의해 지지된다 (문헌참조: Todorovski, T. 등, J Mass Spectrom, 2011.46(10): p. 1030-8(도15a).
Figure pct00009
주요 피크 5 및 6은 각각 279.10 (NAT +32) 및 251.10 (NAT+4)의 m/z를 가졌고 280 nm에서 약한 흡광도를 겆거나 전혀 갖지 않았다 (도 8b). 이들 성질은 인돌 환의 상실을 시사하고 Trp, NFK (7a, Trp +32) 및 Kyn (6a, Trp + 4)의 주요 공지된 생리학적 분해물 중 2개와 일치한다 (문헌참조: Dreaden K., 등, PLoS One, 2012.7(7): p. e42220) (하기 도면을 참조한다: 구조물에 대해 도 7). 이들 종이 상응하는 N-아세틸화된 버젼, N-Ac-NFK 7b 및 N-Ac-Kyn 6b를 나타내는지를 평가하기 위해 (구조물에 대해 도 7을 참조한다), 충돌 유도된 해리를 사용하여 2개의 종에 대해 MS2 스펙트럼을 생성하였다. 각각은 m/z = 174.1에서 강한 신호를 나타냈다 (도15b 및 도15c), 이는 이전에 키누레닌의 특징으로서 보고되었다 (문헌참조: Todorovski, T. 등, J Mass Spectrom, 2011.46(10): p. 1030-8). 상기 정보를 토대로 이들 종은 각각 잠정적으로 N-Ac-NFK 7b 및 N-Ac-Kyn 6b로서 할당되었다 (구조물에 대해 도 7을 참조한다).
이들 종의 실체를 확인하기 위해, N-Ac-Oia 4b, N-Ac-NFK 7b, 및 N-Ac-Kyn 6b의 실제 표준물을 상기된 합성 과정을 사용하여 합성하였다. 스트레스된 NAT 샘플 중 피크의 크로마토그래피 및 MS2 프로필 둘 다는 실제 샘플의 것들과 정렬하였고 (도9 및 도15a 내지 15c)는 이들 피크의 동정에 대한 추가의 지지를 제공한다.
5-OH-Trp 8a가 Trp의 주요 생리학적 이화물인 경우, N-Ac-5-OH-Trp 8b의 합성 표준물 (하기 도면 참조구조물에 대해 도 7)을 또한 제조하여 종이 NAT에 대한 주요 분해 경로를 따라 있는지를 평가하였다. LC-MS/MS에 의한 실제 N-Ac-5-OH-Trp 8b 표준물의 분석은 화합물이 체류 시간 또는 질량 분광측정 데이터가 관찰된 NAT 분해물과 일치하지 않음으로써 임의의 스트레스된 NAT 샘플에서 유의적 양으로 존재하지 않았음을 지적했다 (도9 및 도15d). 인돌 환의 벤젠 부분 상에서 산화된 Trp 유도체로부터 유래된 MS2 단편화 146.1 (문헌참조: Todorovski, T. 등, J Mass Spectrom, 2011.46(10): p. 1030-8)은 임의의 단일 산화된 NAT 분해물 종에서 관찰되지 않았고 이는 하이드록실화의 최소 수준이 NAT 산화 동안에 인돌 환의 4, 5, 6, 또는 7 위치에서 일어남을 시사한다 (도15a 및 도15d).
피크 그룹 1 및 피크 4에서 단일 산화된 NAT 종은 잠정적으로 N-Ac-PIC 2b의 입체이성체로서 동정되었고 (하기 도면구조물에 대해 도 7) 피크 그룹 1에서 이중 산화된 NAT 종은 각각 유사하게 잠정적으로 N-Ac-3a, 8a-디하이드록시 PIC 3b의 입체이성체로서 할당되었다. 이들 분자는 NAT-함유 HSA 제형의 연장된 열 스트레스 (25℃에서 3년) 시 보고된 유일한 NAT 분해물이었고 (문헌참조: Fang, L. 등, Chromatogr A, 2011.1218(41): p. 7316-24) 본원 발명자의 연구에서 관찰된 MS2 단편화 패턴은 상기 보고와 일치한다. (도15e 및 도15f). 추가로, 피크 4는 이들 연구에서 형광 검출을 사용하여 관찰된 유일한 NAT 분해물이고 (도8b), 이는 H, 1,2,3,3a,8,8a-헥사하이드로-3a-하이드록시피롤로 [2,3-b]-인돌 2-카복실산 (PIC) 2a가 형광성인 유일한 통상의 Trp 분해물 중 하나라는 보고와 일치한다 (문헌참조: Simat, T. J. 등, J Agric Food Chem, 1998. 46(2): 490-498). 이들 종에 대한 실제 표준물이 제조되지 않았기 때문에 이들 실체는 결론적으로 결정될 수 없고 이중 산화된 N-Ac-디옥시인돌릴알라닌 (N-Ac-DiOia)이 또한 불완전하게 분리된 피크 그룹 1에 존재할 가능성이 남아있다. 피크 할당은 표 8에 요약한다.
이들 연구 (N-Ac-PIC, N-Ac-Oia, N-Ac-NFK, N-Ac-Kyn, 및 N-Ac-2a,8a,-디하이드록시-PIC)에서 관찰된 NAT 분해물은 대체로 과산화수소 (PIC, Oia, NFK, Kyn, DiOia, 및 5-OH-Trp)를 사용한 처리에 의해 산화된 유리된 트립토판에 대해 시매트 등(Simat 등)에 의해 보고된 것들과 일치한다 (문헌참조: Simat, T. J. J Agric Food Chem, 1998. 46(2): p. 490-498). 펩타이드 및 단백질에서 트립토판 분해물의 확정적 동정은 제한되지만 (많은 트립토판 유도체의 등압 성질은 펩타이드 및 단백질 수준에서 분해물의 동정을 복잡하게 하고 개별 잔기들의 분리는 분해를 유도할 수 있다), 펩타이드/단백질 문헌은 NAT 연구와 유사하게 일치한다 (문헌참조: Simat, T. J. 등, J Agric Food Chem, 1998. 46(2): p. 490-498; Fedorova, M., 등, Proteomics, 2010.10(14): p. 2692-700; Li, Y., 등, Anal Chem, 2014.86(14): p. 6850-7; Ronsein, G.E., 등, J Am Soc Mass Spectrom, 2009. 20(2): p. 188-97). 주지할 하나의 차이는 5-OH-Trp 이고 - 이것은 생체내 Trp의 주요 분해물이고 (트립토판 하이드록실라제 경로를 통한) 유리된 Trp에 대한 시매트 등에 의한 연구에서 관찰되었지만 - 이것은 동일한 과산화수소 조건하에서 트리펩타이드 Ala-Trp-Ala의 산화시 미량의 수준만이 관찰되었고, 조사된 펩타이드 및 단백질 문헌에서 확정적으로 동정되지 않았고 NAT에 대한 본원 발명자의 연구에서 관찰되지 않았다.
종합해 보면, 이것은 아미드화된 N-말단을 함유하는 Trp 유도체 (NAT에서 및 펩타이드/단백질에서와 같이)가 비-효소 조건하에서 유리된 Trp에 상대적으로 5위치에서 산화에 덜 민감할 수 있음을 시사한다.
NAT 분해에 대한 다른 부형제 및 단백질의 효과
이어서, NAT 분해에 대한 다른 부형제의 영향을 평가하였다. 특정 목적하는 것은 항산화제로서 형에 통상적으로 부가되는 또 다른 항산화제인 Met의 존재이다. 일반적으로, 완충제 제형 중 5 mM Met의 내포는 총 NAT 산화에서 전체 감소를 유도하였고 (표 7, 도10), 이것은 Met 중 티오에테르 모이어티가 산화 싱크로서 작용할 수 있다는 추정과 일치한다. NAT 안정성에 대한 Met의 영향은 산화 모델 간에 다양하였다: Met는 AAPH 모델 (4-8% 총 NAT 상실, 완충제에 의존하여)에서 NAT 안정성에 대한 온건한 개선, ICH 광 스트레스 조건하에서 약간 양호한 개선 (10-16%) 및 펜톤 모델에서 유의적 개선 (25%)을 만들었다 (표 8). 펜톤 조건에서 Met와 제형화되는 경우 NAT 산화에서 유의적 감소는 과산화수소를 켄칭시키는 Met로 인간 것일 수 있다 (문헌참조: Ji, J. A., 등, J Pharm Sci, 2009. 98(12): p. 4485-500). Met의 부가는 Met-제형화된 스트레스 샘플 중에서 관찰된 주요 종의 분포가 Met 없이 제형화된 것들로부터 변화되지 않았기 때문에 모델 시스템 각각에서 산화 기작을 변화시키지 않는 것으로 나타났다 (데이터는 나타내지 않음).
AAPH-유도된 NAT 분해에 대한 단백질의 저농도의 영향이 또한 분석되었다. 2개의 항체 (단백질 1 및 단백질 2)는 완충액 중에서 1.0 mg/ml로 희석시키고 0.3 mM NAT (~ 45:1 mol NAT:mol 단백질)와 제형화하였다. AAPH 스트레스 시, NAT 분해의 수준은 대체로 산화 종의 분포에서와 같이 단백질-함유 및 단백질-부재 용액 (NAT 피크 면적에서 ~40% 상실) 간에 일치하였다(도11 참조). 이들 결과는 저수준의 단백질의 존재가 시험된 산화 (알킬 퍼옥사이드-유도된) 스트레스 조건하에서 NAT 분해 수준/경로에 고유적으로 영향을 미치지 않음을 시사한다.
약품 제형 중 NAT의 실시간 안정성
직접적인 상기 모델 경험과 함께, 이어서 mAb의 제조 및 저장에 일어날 것으로 예상되는 NAT 산화의 양이 탐구되었다. 도12는 AAPH 모델 스트레스 시스템과, NAT, Met 및 mAb 제형에 전형적인 다른 부형제와 공동 제형화된 150 mg/ml (1.0 mM)에서의 항체의 비교를 설명한다. 결과는 초기 시점에 대해, 6개월 동안 -20℃ 및 5℃에서 (전형적인 저장 조건을 대표하는), 및 6개월 동안 25℃에서 (가속화된 안정성 조건을 대표하는) 나타낸다. 산화 수준은 제조 후 및 시험된 전형적 저장 조건하에서 직접적으로 무시할만 하다. 25℃에서 6개월 후, 일부 분해가 관찰되었다 (총 NAT 상실 = 16.8%). 흥미로운 것은, 상응하는 비히클은 유의적으로 보다 낮은 NAT 분해를 보여주었고 - 상기 단백질 함유 샘플은 25℃에서 3개월 후 7.5% NAT 상실을 가졌고, 상응하는 비히클은 NAT의 1% 상실만을 보여주었다. 심지어 보다 높은 온도에서 (도12), 비히클은 최소 NAT 분해를 보여주었고 이는 단백질의 고농도의 존재가 일부 경우에 가속화된 열 조건하에서 NAT 분해를 증가시킬 수 있다. 가속화된 안정성 샘플에 존재하는 5개의 주요 종은 스트레스 모델에서 동정된 주요 종과 상응하였고 (도12), 이는 상기 모델이 약품 샘플 중 NAT 분해 경로를 충실히 해명함을 시사한다.
요약하면, 단백질 치료제에서 Trp 잔기들에 대한 산화적 스트레스에 대한 보호를 제공하는 것으로 공지된 항산화제인, N-Ac-트립토판의 안정성을 평가하기 위한 크로마토그래피 방법을 사용하여, NAT는 N-Ac-Oia, N-Ac-PIC, N-Ac-Kyn, 및 N-Ac-NFK를 포함하는, 통상의 분해물 세트로 분해되는 것으로 나타났다 (하기 도면 참조구조물에 대해 도 7) -- 이는 대체로 다양한 스트레스 조건하에서 스트레스 유형과는 무관하였고 상이한 모델 제형에서 이러한 발견은 이전에 보고되지 않았다. 이들 분해물은 일반적으로 Trp 산화에 대한 문헌과 일치하고 연구된 스트레스 모델에서 NAT 분해가 가장 통상적인 생리학적 Trp 분해물인 5-하이드록시트립토판의 N-아세틸화된 버젼의 생성을 유도하지 않았다는 것은 제외된다. 이론에 국한되는 것 없이, 이것은 비-효소적 조건하에서 NAT (및 아마도 연장에 의한 단백질에서 Trp 잔기)가 Trp 이화작용과 동일한 중간체를 통해 분해되지 않음을 시사한다. 사실, 이론에 국한되는 것 없이, 데이터는 NAT의 산화가 인돌 환의 2 및 3 위치 상에서 1차적으로 일어남을 시사한다.

Claims (137)

  1. 특정 양의 N-아세틸트립토판을 제형에 첨가하여 폴리펩타이드의 산화를 방지함을 포함하는 수성 제형 중 폴리펩타이드의 산화를 감소시키는 방법으로서, 상기 폴리펩타이드가 약 80Å2 초과의 용매-접근가능한 표면적 (SASA)을 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함하는, 방법.
  2. 특정 양의 N-아세틸트립토판을 제형에 첨가하여 폴리펩타이드의 산화를 방지함을 포함하는 수성 제형 중 폴리펩타이드의 산화를 감소시키는 방법으로서, 상기 폴리펩타이드가 약 30% 초과의 용매-접근가능한 표면적 (SASA)을 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함하는, 방법.
  3. 폴리펩타이드 내 트립토판 잔기의 SASA 값을 결정하고 특정 양의 N-아세틸트립토판을 제형에 첨가하여 적어도 하나의 트립토판 잔기가 약 80Å2 초과의 용매-접근 가능한 표면적 (SASA)을 갖는 경우 폴리펩타이드의 산화를 방지함을 포함하는, 수성 제형 중 폴리펩타이드의 산화를 감소시키는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 트립토판 잔기의 SASA 값이 분자 동력학 모의실험에 의해 계산되는, 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-아세틸트립토판이 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 제형에 첨가되는, 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-아세틸트립토판이 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 농도로 제형에 첨가되는, 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-아세틸트립토판이 약 0.3 mM의 농도로 제형에 첨가되는, 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 산화가 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%까지 감소되는, 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 약 1095일 동안 약 2℃ 내지 약 8℃에서 안정한, 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형 중 상기 단백질 농도가 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL인, 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 제형인, 방법.
  14. 청구항 1 내지13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 항체인, 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 항체가 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편인, 방법.
  16. 폴리펩타이드의 산화를 방지하기 위해 폴리펩타이드 및 특정 양의 N-아세틸트립토판을 포함하는 액체 제형으로서, 상기 폴리펩타이드가 약 80Å2초과의 SASA를 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 갖는, 액체 제형.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 N-아세틸트립토판이 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 제형에 첨가되는, 액체 제형.
  18. 청구항 16 또는 17에 있어서, 상기 N-아세틸트립토판이 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 농도로 제형에 첨가되는, 액체 제형.
  19. 청구항 16 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-아세틸트립토판이 약 0.3 mM의 농도로 제형에 첨가되는, 액체 제형.
  20. 청구항 16 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 산화가 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%까지 감소되는, 액체 제형.
  21. 청구항 16 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 약 1065일 동안 약 2℃ 내지 약 8℃에서 안정한, 액체 제형.
  22. 청구항 16 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형 중 상기 단백질 농도가 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL인, 액체 제형.
  23. 청구항 16 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는, 액체 제형.
  24. 청구항 16 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는, 액체 제형.
  25. 청구항 16 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 제형인, 액체 제형.
  26. 청구항 16 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 항체인, 액체 제형.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 항체가 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편인, 액체 제형.
  28. 폴리펩타이드의 감소된 산화를 위한 제형을 스크리닝하기 위한 방법으로서, 상기 폴리펩타이드가 약 80Å2 초과의 SASA를 갖는 적어도 하나의 트립토판 잔기를 포함하고, 상기 방법은:
    특정 양의 N-아세틸트립토판을, 폴리펩타이드를 포함하는 수성 조성물에 첨가하는 단계,
    2,2'-아조비스 (2-아미노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH)를 상기 조성물에 첨가하는 단계,
    상기 폴리펩타이드, N-아세틸트립토판 및 AAPH를 포함하는 조성물을 약 40℃에서 약 14시간 동안 항온처리하는 단계,
    상기 폴리펩타이드 내 트립토판 잔기의 산화에 대해 폴리펩타이드를 측정하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 폴리펩타이드의 약 20% 이하의 트립토판 잔기의 산화를 유도하는 특정 양의 N-아세틸트립토판을 포함하는 제형이 폴리펩타이드의 감소된 산화에 적합한 제형인, 방법.
  29. 폴리펩타이드의 감소된 산화에 대한 제형을 스크리닝하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    상기 폴리펩타이드 내 트립토판 잔기의 SASA 값을 결정하는 단계로서, 여기서, 약 80Å2 초과의 SASA를 갖는 트립토판 잔기가 산화에 적용되는 단계,
    특정 양의 N-아세틸트립토판을, 폴리펩타이드를 포함하는 수성 조성물에 첨가하는 단계,
    2,2'-아조비스 (2-아미노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH)를 상기 조성물에 첨가하는 단계,
    상기 폴리펩타이드, N-아세틸트립토판 및 AAPH를 포함하는 조성물을 약 40℃에서 약 14시간 동안 항온처리하는 단계,
    상기 폴리펩타이드 내 트립토판 잔기의 산화에 대해 폴리펩타이드를 측정하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 폴리펩타이드의 약 20% 이하의 트립토판 잔기의 산화를 유도하는 특정 양의 N-아세틸트립토판을 포함하는 제형이 폴리펩타이드의 감소된 산화에 적합한 제형인, 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 트립토판 잔기의 SASA 값이 분자 동력학 모의실험에 의해 계산되는, 방법.
  31. 청구항 16 내지 26 중 어느 한 항의 액체 제형을 포함하는 키트.
  32. 청구항 16 내지 26 중 어느 한 항의 액체 제형을 포함하는 제품.
  33. 액체 제형 중 폴리펩타이드가 산화에 민감한 트립토판 잔기를 포함하는지를 결정하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 상기 폴리펩타이드 내 각각의 트립토판 잔기에 대해 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 기준으로 하나 이상의 분자 디스크립터를 계산하는 단계 및 상기 하나 이상의 분자 디스크립터를 하나 이상의 분자 디스크립터 상에 트레이닝된 기계 학습 알고리듬에 적용하여 트립토판 산화를 예측하는 단계를 포함하고, 상기 분자 디스크립터가 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:
    a) 트립토판 델타 탄소의 7Å 이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수
    b) 측쇄 용매 접근가능한 표면적 (SASA),
    c) 델타 탄소 SASA,
    d) 트립토판 델타 탄소의 7Å 이내 총 양전하,
    e) 골격 SASA,
    f) 트립토판 측쇄 각도,
    g) 트립토판 델타 탄소의 7Å 이내 팩킹 밀도,
    h) 트립토판 골격 각도,
    i) 슈도-pi 오비탈의 SASA,
    j) 골격 유동성, 또는
    k) 트립토판 델타 탄소의 7Å 이내 총 음전하.
  34. 청구항 33에 있어서, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 분자 디스크립터가 분자 모의실험에 사용되는, 방법.
  35. 청구항 33에 있어서, 상기 분자가 하기를 포함하는 방법:
    a) 트립토판 델타 탄소의 7Å 이내 아스파르트산 측쇄 산소의 수
    b) 측쇄 용매 접근가능한 표면적 (SASA),
    c) 델타 탄소 SASA,
    d) 트립토판 델타 탄소의 7Å 이내 총 양전하,
    e) 골격 SASA,
    f) 트립토판 측쇄 각도, 및
    g) 트립토판 델타 탄소의 7Å 이내 팩킹 밀도.
  36. 청구항 33 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기계 학습 알고리듬이 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 기준으로 폴리펩타이드의 분자 동력학 모의실험으로부터의 분자 디스크립터를 상기 폴리펩타이드 내 각각의 트립토판 잔기에 대한 실험적 데이터와 일치시킴에 의해 트레이닝되는, 방법.
  37. 청구항 33 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 특정 부위에서 트립토판 잔기의 35% 초과의 산화가 산화에 대한 민감성을 지적하는, 방법.
  38. 청구항 33 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 분자 디스크립터가 컴퓨터를 사용하여 계산되는, 방법.
  39. 청구항 33 내지38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 항체인, 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 항체가 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편인, 방법.
  41. 청구항 33 내지 40 중 어느 한 항의 방법에 따라 산화에 민감한 트립토판 잔기를 동정하고 상기 폴리펩타이드 내 아미노산 치환을 산화에 적용되지 않는 아미노산 잔기와 함께 산화에 민감한 하나 이상의 트립토판 잔기를 대체하기 위해 도입함을 포함하는, 폴리펩타이드의 산화를 감소시키기 위한 방법.
  42. 상기 폴리펩타이드 내 아미노산 치환을 산화에 민감한 하나 이상의 트립토판 잔기를 대체하기 위해 도입함을 포함하는 폴리펩타이드의 산화를 감소시키기 위한 방법으로서, 산화에 민감한 상기 하나 이상의 트립토판 잔기가 청구항 33 내지 40 중 어느 한 항의 방법에 의해 동정되는, 방법.
  43. 청구항 41 또는 42에 있어서, 상기 트립토판 잔기가 티로신, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 알라닌 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 의해 대체되는, 방법.
  44. 청구항 33 내지 38 중 어느 한 항의 방법에 따라 산화에 민감한 폴리펩타이드 내 하나 이상의 트립토판 잔기의 존재를 결정하고 산화에 민감한 하나 이상의 트립토판 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 수성 제형에 유효량의 항산화제를 첨가함을 포함하는, 상기 수성 제형 중 폴리펩타이드의 산화를 감소시키기 위한 방법.
  45. 특정 양의 항산화제를 수성 제형에 첨가하여 산화를 방지함을 포함하는, 상기 수성 제형 중 폴리펩타이드의 산화를 감소시키기 위한 방법으로서, 폴리펩타이드가 청구항 33 내지 38 중 어느 한 항의 방법에 의해 동정된 산화에 민감한 하나 이상의 트립토판 잔기를 포함하는, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 항산화제가 N-아세틸트립토판인, 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 N-아세틸트립토판이 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 제형에 첨가되는, 방법.
  48. 청구항 46 또는 47에 있어서, 상기 N-아세틸트립토판이 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 농도로 제형에 첨가되는, 방법.
  49. 청구항 46 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-아세틸트립토판이 약 0.3 mM의 농도로 제형에 첨가되는, 방법.
  50. 청구항 44 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 산화가 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%까지 감소되는, 방법.
  51. 청구항 44 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 약 1095일 동안 약 2℃ 내지 약 8℃에서 안정한, 방법.
  52. 청구항 44 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형 중 상기 단백질 농도가 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL인, 방법.
  53. 청구항 44 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는, 방법.
  54. 청구항 44 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
  55. 청구항 44 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 제형인, 방법.
  56. 청구항 44 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 항체인, 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 항체가 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편인, 방법.
  58. 폴리펩타이드의 산화를 방지하기 위해 폴리펩타이드 및 특정 양의 N-아세틸트립토판을 포함하는 액체 제형으로서, 상기 폴리펩타이드가 청구항 33 내지 38 중 어느 한 항의 방법에 의한 측정시 산화에 민감한 적어도 하나의 트립토판 잔기를 갖는, 액체 제형.
  59. 청구항 58에 있어서, 상기 N-아세틸트립토판이 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 제형에 첨가되는, 액체 제형.
  60. 청구항 58 또는 60에 있어서, 상기 N-아세틸트립토판이 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 농도로 제형에 첨가되는, 액체 제형.
  61. 청구항 58 내지 60 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-아세틸트립토판이 약 0.3 mM의 농도로 제형에 첨가되는, 액체 제형.
  62. 청구항 58 내지 61 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 산화가 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%까지 감소되는, 액체 제형.
  63. 청구항 58 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 약 1065일 동안 약 2℃ 내지 약 8℃에서 안정한, 액체 제형.
  64. 청구항 58 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형 중 상기 단백질 농도가 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL인, 액체 제형.
  65. 청구항 58 내지 64 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는, 액체 제형.
  66. 청구항 58 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는, 액체 제형.
  67. 청구항 58 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 제형인, 액체 제형.
  68. 청구항 58 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 항체인, 액체 제형.
  69. 청구항 68에 있어서, 상기 항체가 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편인, 액체 제형.
  70. 폴리펩타이드의 감소된 산화를 위한 제형을 스크리닝하기 위한 방법으로서, 상기 폴리펩타이드가 청구항 33 내지 40 중 어느 한 항의 방법에 의해 동정된 산화에 민감한 적어도 하나의 트립토판을 포함하고, 상기 방법은:
    특정 양의 N-아세틸트립토판을, 폴리펩타이드를 포함하는 수성 조성물에 첨가하는 단계,
    2,2'-아조비스 (2-아미노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH)를 상기 조성물에 첨가하는 단계,
    상기 폴리펩타이드, N-아세틸트립토판 및 AAPH를 포함하는 조성물을 약 40℃에서 약 14시간 동안 항온처리하는 단계,
    상기 폴리펩타이드 내 트립토판 잔기의 산화에 대해 폴리펩타이드를 측정하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 폴리펩타이드의 약 20% 이하의 트립토판 잔기의 산화를 유도하는 특정 양의 N-아세틸트립토판을 포함하는 제형이 폴리펩타이드의 감소된 산화에 적합한 제형인, 방법.
  71. 폴리펩타이드의 감소된 산화에 대한 제형을 스크리닝하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 청구항 33 내지 40 중 어느 한 항의 방법에 의해 산화에 민감한 하나 이상의 트립토판 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 동정하는 단계,
    b) 특정 양의 N-아세틸트립토판을, 단계 a)에서 동정된 폴리펩타이드를 포함하는 수성 조성물에 첨가하는 단계,
    c) 2,2'-아조비스 (2-아미노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH)를 상기 조성물에 첨가하는 단계,
    d) 상기 폴리펩타이드, N-아세틸트립토판 및 AAPH를 포함하는 조성물을 약 40℃에서 약 14시간 동안 항온처리하는 단계,
    e) 상기 폴리펩타이드 내 트립토판 잔기의 산화에 대해 폴리펩타이드를 측정하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 폴리펩타이드의 약 20% 이하의 트립토판 잔기의 산화를 유도하는 특정 양의 N-아세틸트립토판을 포함하는 제형이 폴리펩타이드의 감소된 산화에 적합한 제형인, 방법.
  72. 청구항 58 내지 69 중 어느 한 항의 액체 제형을 포함하는 키트.
  73. 청구항 58 내지 72 중 어느 한 항의 액체 제형을 포함하는 제품.
  74. N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물 중에 N-아세틸 트립토판 (NAT) 분해를 측정하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 상기 조성물을 역상 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 여기서, 상기 조성물이 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중에 평형화된 크로마토그래피 물질 상으로 로딩되고, 이동상 A가 물 중 산을 포함하고 이동상 B가 아세토니트릴 중 산을 포함하는, 단계,
    b) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액으로 역상 크로마토그래피 물질로부터 상기 조성물을 용출시키는 단계로서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 단계 a)에 비해 증가되고, NAT 분해물이 온전한 NAT로부터 별도로 크로마토그래피로부터 용출되는 단계,
    c) 상기 NAT 분해물 및 상기 온전한 NAT를 정량하는 단계를 포함하는, 방법.
  75. 청구항 74에 있어서, 단계 a)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 2:98인, 방법.
  76. 청구항 74 또는 75에 있어서, 단계 b)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 선형으로 증가하는, 방법.
  77. 청구항 74 또는 75에 있어서, 단계 b)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 단계적으로 증가하는, 방법.
  78. 청구항 74 내지 77 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크로마토그래피의 유속이 약 1.0mL/분인, 방법.
  79. 청구항 78에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 30:70으로 증가되는, 방법.
  80. 청구항 79에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 16분 후 약 30:70으로 증가되는, 방법.
  81. 청구항 79 또는 80에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 90:70으로 추가로 증가되는, 방법.
  82. 청구항 81에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 18.1 분 후 약 90:70로 추가로 증가되는, 방법.
  83. 청구항 78에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 26:74로 증가되는, 방법.
  84. 청구항 83에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 14분 후 약 26:74로 증가되는, 방법.
  85. 청구항 83 또는 84에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 90:70으로 추가로 증가되는, 방법.
  86. 청구항 85에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 16.5분 후 약 90:70으로 추가로 증가되는, 방법.
  87. 청구항 74 내지 86 중 어느 한 항에 있어서, 이동상 A가 수 중 약 0.1% 산을 포함하는, 방법.
  88. 청구항 74 내지 87 중 어느 한 항에 있어서, 이동상 B가 아세토니트릴 중 약 0.1% 산을 포함하는, 방법.
  89. 청구항 74 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산이 포름산인, 방법.
  90. 청구항 74 내지 89 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피 물질이 C18 모이어티를 포함하는, 방법.
  91. 청구항 74 내지 90 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피 물질이 고체 지지체를 포함하는, 방법.
  92. 청구항 91에 있어서, 상기 고체 지지체가 실리카를 포함하는, 방법.
  93. 청구항 74 내지 92 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피 물질이 칼럼에 함유되는, 방법.
  94. 청구항 74 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피 물질이 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질 또는 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) 물질인, 방법.
  95. 청구항 74 내지 94 중 어느 한 항에 있어서, NAT 및 NAT 분해 생성물이 240 nm에서 흡광도에 의해 검출되는, 방법.
  96. 청구항 74 내지 95 중 어느 한 항에 있어서, NAT 분해 생성물이 질량 분광측정에 의해 동정되는, 방법.
  97. 청구항 74 내지 96 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중 NAT 농도가 약 10 nM 내지 약 1 mM인, 방법.
  98. 청구항 74 내지 97 중 어느 한 항에 있어서, NAT 분해 생성물은 N-Ac-(H, 1,2,3,3a,8,8a-헥사하이드로- 3a-하이드록시피롤로 [2,3-b]-인돌 2-카복실산) (N-Ac-PIC), N-Ac- 옥시인돌릴알라닌 (N-Ac-Oia), N-Ac- N-포르밀-키누레닌 (N-Ac-NFK), N-Ac-키누레닌 (N-Ac-Kyn) 및 N-Ac-2a,8a-디하이드록시-PIC 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  99. N-아세틸 트립토판 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 N-아세틸 트립토판 (NAT) 분해를 측정하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 상기 조성물을 약 8 M 구아니딘으로 희석시키는 단계,
    b) 상기 조성물로부터 폴리펩타이드를 제거하는 단계,
    c) 상기 조성물을 역상 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 여기서, 상기 조성물이 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중에 평형화된 크로마토그래피 물질 상으로 로딩되고, 이동상 A가 물 중 산을 포함하고 이동상 B가 아세토니트릴 중 산을 포함하는, 단계,
    d) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액으로 역상 크로마토그래피 물질로부터 조성물을 용출시키는 단계로서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 단계 a)에 비해 증가되고, NAT 분해물이 온전한 NAT로부터 별도로 크로마토그래피로부터 용출되는 단계,
    e) 상기 NAT 분해물 및 상기 온전한 NAT를 정량하는 단계를 포함하는, 방법.
  100. 청구항 99에 있어서, 상기 조성물은 약 8 M의 구아니딘 중에 희석시켜 상기 조성물 중 NAT의 최종 농도가 약 0.05 mM 내지 약 0.2 mM 범위 이도록 하는, 방법.
  101. 청구항 99 또는 100에 있어서, 상기 조성물은 약 8 M의 구아니딘 중에 희석시켜 상기 조성물 중 폴리펩타이드의 최종 농도가 약 25mg/mL 이하이도록 하는, 방법.
  102. 청구항 99 내지 101 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 여과에 의해 상기 조성물로부터 제거되는, 방법.
  103. 청구항 102에 있어서, 상기 여과가 약 30 kDal의 분자량 컷오프를 갖는 여과 막을 사용하는, 방법.
  104. 청구항 99 내지 103 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 2:98인, 방법.
  105. 청구항 99 내지 104 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 선형으로 증가하는, 방법.
  106. 청구항 99 내지 105 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 단계적으로 증가하는, 방법.
  107. 청구항 99 내지 106 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크로마토그래피의 유속이 약 1.0mL/분인, 방법.
  108. 청구항 107에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 30:70으로 증가되는, 방법.
  109. 청구항 108에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 16분 후 약 30:70으로 증가되는, 방법.
  110. 청구항 108 또는 109에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 90:70으로 추가로 증가되는, 방법.
  111. 청구항 110에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 18.1분 후 약 90:70으로 추가로 증가되는, 방법.
  112. 청구항 111에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 26:74로 증가되는, 방법.
  113. 청구항 112에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 14분 후 약 26:74로 증가되는, 방법.
  114. 청구항 112 또는 113에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 90:70으로 추가로 증가되는, 방법.
  115. 청구항 114에 있어서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 약 16.5분 후 약 90:70으로 추가로 증가되는, 방법.
  116. 청구항 99 내지 115 중 어느 한 항에 있어서, 이동상 A가 수 중 약 0.1% 산을 포함하는, 방법.
  117. 청구항 99 내지 116 중 어느 한 항에 있어서, 이동상 B가 아세토니트릴 중 약 0.1% 산을 포함하는, 방법.
  118. 청구항 99 내지 117 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산이 포름산인, 방법.
  119. 청구항 99 내지 118 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피 물질이 C18 모이어티를 포함하는, 방법.
  120. 청구항 99 내지 119 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피 물질이 고체 지지체를 포함하는, 방법.
  121. 청구항 120에 있어서, 상기 고체 지지체가 실리카를 포함하는, 방법.
  122. 청구항 99 내지 121 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피 물질이 칼럼에 함유되는, 방법.
  123. 청구항 99 내지 122 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피 물질이 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질 또는 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) 물질인, 방법.
  124. 청구항 99 내지 123 중 어느 한 항에 있어서, NAT 및 NAT 분해 생성물이 240 nm에서 흡광도에 의해 검출되는, 방법.
  125. 청구항 99 내지 124 중 어느 한 항에 있어서, NAT 분해 생성물이 질량 분광측정에 의해 동정되는, 방법.
  126. 청구항 99 내지 125 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중 NAT 농도가 약 0.1 mM 내지 약 5 mM인, 방법.
  127. 청구항 99 내지 126 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중 NAT 농도가 약 0.3 mM인, 방법.
  128. 청구항 99 내지 127 중 어느 한 항에 있어서, NAT 분해 생성물이 N-Ac-PIC, N-Ac-Oia, N-Ac-NFK, N-Ac-Kyn 및 N-Ac-2a,8a-디하이드록시-PIC 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  129. 청구항 99 내지 128 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형 중 상기 단백질 농도가 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL인, 방법.
  130. 청구항 99 내지 129 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는, 방법.
  131. 청구항 99 내지 130 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 긴장성 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
  132. 청구항 99 내지 131 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 제형인, 방법.
  133. 청구항 99 내지 132 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 항체인, 방법.
  134. 청구항 133에 있어서, 상기 항체가 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편인, 방법.
  135. 청구항 74 내지 134 중 어느 한 항의 방법에 따라 조성물의 샘플 중에서 NAT의 분해를 측정함을 포함하는 조성물에서 NAT의 분해를 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은 1회 이상 반복되는, 방법.
  136. 청구항 135에 있어서, 상기 방법이 매월, 2개월 마다, 4개월 마다 또는 6개월 마다 반복되는, 방법.
  137. 약제학적 조성물에 대한 품질 검정으로서, 청구항 74 내지 134 중 어느 한 항의 방법에 따라 상기 약제학적 조성물의 샘플 중에 NAT의 분해를 측정함을 포함하고, 여기서, 상기 조성물 중에서 측정된 NAT 분해물의 양은 상기 약제학적 조성물이 동물 투여용으로 적합한지를 결정하는, 품질 검정.
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