CN108430455A - 色氨酸衍生物用于蛋白质配制剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供所包含的蛋白质包含对氧化易感的溶剂可及性氨基酸残基的方法和配制剂，其中使用N‑乙酰基色氨酸(NAT)来防止该蛋白质的氧化。本发明还提供用来生成此类配制剂的方法和使用此类配制剂的方法。还提供了用于测量蛋白质配制剂中NAT的降解的方法。

Description

色氨酸衍生物用于蛋白质配制剂的用途
对相关申请的交叉援引
本申请要求2015年12月30日提交的美国临时申请No.62/273,273和2016年4月12日提交的美国临时申请No.62/321,636的权益，据此通过援引完整收录其每一篇的内容。
发明领域
本发明涉及包含蛋白质且进一步包含N-乙酰基-色氨酸的液体配制剂，和用来生成和使用该液体配制剂的方法。
发明背景
氨基酸残基的氧化性降解是一种在蛋白质药物中常常观察到的现象。一些氨基酸残基对氧化易感，特别是甲硫氨酸(Met)，半胱氨酸(Cys)，组氨酸(His)，色氨酸(Trp)，和酪氨酸(Tyr)(Li et al.,Biotechnology and Bioengineering 48:490-500(1995))。典型地当蛋白质在各种加工步骤期间暴露于过氧化氢，光，金属离子或这些的组合时观察到氧化(Li et al.,Biotechnology and Bioengineering 48:490-500(1995))。特别是，暴露于光(Wei,et al.,Analytical Chemistry 79(7):2797-2805(2007))，AAPH或芬顿(Fenton)试剂(Ji et al.，J Pharm Sci 98(12):4485-500(2009))的蛋白质显示色氨酸残基上水平升高的氧化，而暴露于过氧化氢的蛋白质典型地只显示甲硫氨酸氧化(Ji et al.,J PharmSci 98(12):4485-500(2009))。光暴露可导致蛋白质氧化，其经由反应性氧种类(ROS)的形成，包括单态氧，过氧化氢和超氧化物(Li et al.,Biotechnology and Bioengineering48:490-500(1995)；Wei，et al.,Analytical Chemistry 79(7):2797-2805(2007)；Ji etal.,J Pharm Sci 98(12):4485-500(2009)；Frokjaer et al.,Nat Rev Drug Discov 4(4):298-306(2005))，而蛋白质氧化典型地经由芬顿介导的反应中的羟基自由基(Prouseket al.,Pure and Applied Chemistry 79(12):2325-2338(2007))和经由AAPH介导的反应中的烷氧基过氧化物(Werber et al.,J Pharm Sci 100(8):3307-15(2011))发生。色氨酸的氧化产生无数的氧化产物，包括羟基色氨酸，犬尿氨酸(Kyn)，和N-甲酰基犬尿氨酸，而且具有影响配制剂安全性和功效的潜力(Li et al.,Biotechnology and Bioengineering48:490-500(1995)；Ji et al.,J Pharm Sci 98(12):4485-500(2009)；Frokjaer et al.,Nat Rev Drug Discov 4(4):298-306(2005))。已经报告了与生物学功能丧失有关的单克隆抗体的重链互补决定区(CDR)中特定色氨酸残基的氧化(Wei,et al.,AnalyticalChemistry 79(7):2797-2805(2007))。最近关于Fab分子报告了由组氨酸配位的金属离子介导的Trp氧化(Lam et al.，Pharm Res 28(10):2543-55(2011))。还报告了同一研究中Fab配制剂中聚山梨酯20的自氧化，其导致各种过氧化物的生成。自氧化诱导的这些过氧化物的生成还可导致长期贮存期间蛋白质中的甲硫氨酸氧化，因为已经提出蛋白质中的Met残基起内部抗氧化剂的作用(Levine et al.，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 93(26):15036-15040(1996))且容易受到过氧化物氧化。蛋白质的氨基酸残基的氧化具有影响它的生物学活性的潜力。单克隆抗体(单抗)可能尤其如此。IgG1单抗中的Met254和Met430处的甲硫氨酸氧化潜在影响转基因小鼠中的血清半衰期(Wang et al.,Molecular Immunology 48(6-7):860-866(2011))且还影响人IgG1对FcRn和Fcγ受体的结合(Bertolotti-Ciarlet et al.,MolecularImmunology 46(8-9)1878-82(2009))。
药物产物制造和贮存期间需要评估蛋白质的稳定性，尤其以液体状态。药物配制剂的开发有时包括添加抗氧化剂以防止活性组分的氧化。将L-甲硫氨酸添加至配制剂导致蛋白质和肽中的甲硫氨酸残基氧化降低(Ji et al.,J Pharm Sci 98(12):4485-500(2009)；Lam et al.,Journal of Pharmaceutical Sciences 86(11):1250-1255(1997))。同样，已经显示添加L-色氨酸降低色氨酸残基的氧化(Ji et al.,J Pharm Sci 98(12):4485-500(2009)；Lam et al.,Pharm Res 28(10):2543-55(2011))。然而，L-Trp拥有UV区(260-290nm)中的强吸收，使之成为光氧化期间的主要靶(Creed，D.,Photochemistry andPhotobiology 39(4):537-562(1984))。已经假设Trp是一种内源光敏剂，增强酪氨酸(Babuet al.,Indian J Biochem Biophys 29(3):296-8(1992))和其它氨基酸(Bent et al.，Journal of the American Chemical Society 97(10):2612-2619(1975))的氧依赖性光氧化。已经证明L-Trp在暴露于光时能生成过氧化氢且L-Trp在UV光下经由超氧化物阴离子生成过氧化氢(McCormick et al.,Science 191(4226):468-9(1976)；Wentworth et al.,Science 293(5536):1806-11(2001)；McCormick et al.,Journal of the AmericanChemical Society 100:312-313(1978))。另外，已知色氨酸在暴露于光时生成单态氧(Davies,M.J.,Biochem Biophys Res Commun 305(3):761-70(2003))。与通过聚山梨酯20的自氧化诱导的蛋白质氧化相似，可能的是在正常操作条件下由蛋白质配制剂中的其它赋形剂(例如L-Trp)生成ROS时可发生蛋白质氧化。
液体配制剂中特定蛋白质残基对氧化的易感性可取决于残基对配制剂中的氧化剂(例如ROS)的可及性。溶剂可及性表面积(SASA)是生物分子(例如氨基酸残基)对溶剂可及的表面积的测量。蛋白质中氨基酸残基的SASA可指示残基对氧化的可得性。SASA可使用多种方法来计算，包括Shrake-Rupley算法，成对交叠线性组合(LCPO)法，和功率图法(Shrake,A&Rupley,JA.,J.Mol.Biol.79(2):351–371，1973；Weiser et al.，J.Comp.Chem.20(2):217–230，1999；Klenin et al.,J.Comp.Chem.32(12):2647–2653，2011)。最近，已经使用全原子分子动力学(MD)模拟来计算氨基酸残基的SASA，并展现对％SASA和Trp氧化易患性的二元依赖性(Sharma,V.et al.,PNAS.111(52):18601-18606,2014)。SASA因此可能是用于确定在给定蛋白质配制剂中包括抗氧化剂的合适性的一项有用参数。
根据最近的研究显而易见的是将标准赋形剂，诸如L-Trp和聚山梨酯，添加至想要稳定化蛋白质的蛋白质组合物可导致出乎意料且不想要的后果，诸如ROS诱导的蛋白质氧化。具有氧化倾向性残基的蛋白质组合物特别关注这一点。因此，仍然需要鉴定供蛋白质组合物中使用的备选赋形剂和开发此类组合物。美国专利公开文本No.2014/0322203和2014/0314778提供了色氨酸衍生物在蛋白质配制剂中的用途的例子。
据此通过援引将本文中提到的所有出版物，专利，专利申请和已公布专利申请的公开内容完整收入本文。
发明概述
本发明提供一种降低水性配制剂中多肽的氧化的方法，其包括将防止该多肽氧化的一定量的N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂，其中该多肽包含至少一个溶剂可及性表面积(SASA)大于约的色氨酸残基。本发明还提供一种降低水性配制剂中多肽的氧化的方法，其包括将防止该多肽氧化的一定量的N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂，其中该多肽包含至少一个溶剂可及性表面积(SASA)大于约30％的色氨酸残基。本发明还提供一种降低水性配制剂中多肽的氧化的方法，其包括测定该多肽中色氨酸残基的SASA值并如果至少一个色氨酸残基具有大于约的溶剂可及性表面积(SASA)的话，将防止该多肽氧化的一定量的N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂。在一些实施方案中，该色氨酸残基的SASA值是通过分子动力学模拟计算的。
在一些实施方案中，该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约5mM的浓度。在一些实施方案中，该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约1mM的浓度。在一些实施方案中，该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.3mM的浓度。
在一些实施方案中，该多肽的氧化降低约50％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。在一些实施方案中，该配制剂于约2℃至约8℃稳定约1095天。
在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。
在一些实施方案中，该配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。
在一些方面，本发明提供一种液体配制剂，其包含多肽和一定量的N-乙酰基色氨酸以防止该多肽氧化，其中该多肽具有至少一个SASA大于约的色氨酸残基。在一些实施方案中，该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约5mM的浓度。在一些实施方案中，该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约1mM的浓度。在一些实施方案中，该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.3mM的浓度。在一些实施方案中，该多肽的氧化降低约50％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。在一些实施方案中，该配制剂于约2℃至约8℃稳定约1065天。
在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。
在一些实施方案中，该配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。
在一些方面，本发明提供一种用来对配制剂筛选降低的多肽氧化的方法，其中该多肽包含至少一个SASA大于约的色氨酸残基，该方法包括将一定量的N-乙酰基色氨酸添加于包含该多肽的水性组合物，将2,2’-偶氮二(2-氨基丙烷)二氢氯化物(AAPH)添加至该组合物，将包含该多肽，N-乙酰基色氨酸和AAPH的组合物于约40℃温育约14小时，对该多肽测量该多肽中色氨酸残基的氧化，其中包含一定量的N-乙酰基色氨酸，导致该多肽的色氨酸残基不多于约20％氧化的配制剂对于降低的该多肽氧化是合适的配制剂。在一些实施方案中，该N-乙酰基色氨酸和AAPH温育小于约10小时，11小时，12小时，14小时，16小时，20小时，或24小时任一。在一些实施方案中，该多肽的色氨酸残基不多于约15％，20％，25％，30％，或35％任一氧化对于降低的该多肽氧化是合适的配制剂。
在一些方面，本发明提供一种用来对配制剂筛选降低的多肽氧化的方法，其包括测定该多肽中色氨酸残基的SASA值，其中SASA大于约的色氨酸残基经受氧化，将一定量的N-乙酰基色氨酸添加至包含该多肽的水性组合物，将2,2’-偶氮二(2-氨基丙烷)二氢氯化物(AAPH)添加至该组合物，将包含该多肽，N-乙酰基色氨酸和AAPH的组合物于约40℃温育约14小时，对该多肽测量该多肽中色氨酸残基的氧化，其中包含一定量的N-乙酰基色氨酸，导致该多肽的色氨酸残基不多于约20％氧化的配制剂对于降低的该多肽氧化是合适的配制剂。
在上述方面的一些实施方案中，该色氨酸残基的SASA值是通过分子动力学模拟计算的。
在一些方面，本发明提供一种试剂盒，其包含本文中描述的任一实施方案的液体配制剂。在一些方面，本发明提供一种制品，其包含本文中描述的任一实施方案的液体配制剂。
本文中提供的是包含蛋白质和N-乙酰基-色氨酸(NAT)的配制剂，和生成和使用该配制剂的方法。
在一些实施方案中，该液体配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。在一些实施方案中，该配制剂是水性的。
在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中色氨酸的氧化。
在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的色氨酸对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体(例如多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，或抗体片段)。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。
在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。
本发明还提供一种用于确定液体配制剂中的多肽是否包含对氧化易感的色氨酸残基的方法，该方法包括基于该多肽的氨基酸序列为该多肽中的每一个色氨酸残基计算一种或多种分子描述符并将该一种或多种分子描述符应用于在该一种或多种分子描述符上练习的机器学习算法以预测色氨酸氧化，其中该分子描述符包括下述中的一种或多种：a)距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，b)侧链溶剂可及性表面积(SASA)，c)δ碳SASA，d)距色氨酸δ碳在内的总正电荷，e)主链SASA，f)色氨酸侧链角，g)距色氨酸δ碳在内的包装密度，h)色氨酸主链角，i)假π轨道的SASA，j)主链柔性，或k)距色氨酸δ碳在内的总负电荷。在一些实施方案中，使用2，3，4，5，6，7，8，9，10或11种分子描述符。在一些实施方案中，该分子描述符包含下述：a)距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，b)侧链溶剂可及性表面积(SASA)，c)δ碳SASA，d)距色氨酸δ碳在内的总正电荷，e)主链SASA，f)色氨酸侧链角，和g)距色氨酸δ碳在内的包装密度。在一些实施方案中，特定位点处的色氨酸残基大于35％的氧化指示对氧化的易感性。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。
在一些实施方案中，该机器学习算法是通过匹配来自多肽基于该多肽的氨基酸序列的分子动力学模拟的分子描述符与该多肽中每一个色氨酸残基的实验数据来练习的。在一些实施方案中，该一种或多种分子描述符是使用计算机计算的。
本发明还提供一种用于降低多肽的氧化的方法，其包括依照包含机器学习算法的上文描述的任一实施方案鉴定对氧化易感的色氨酸残基，并在该多肽中引入氨基酸替代以将一个或多个对氧化易感的色氨酸残基用不经受氧化的氨基酸残基替换。在一些实施方案中，提供的是一种用于降低多肽的氧化的方法，其包括在该多肽中引入氨基酸替代以替换一个或多个对氧化易感的色氨酸残基，其中该一个或多个对氧化易感的色氨酸残基是通过包含机器学习算法的依照上文描述的任一实施方案的方法鉴定的。在一些实施方案中，该色氨酸残基是用选自由酪氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丙氨酸，和缬氨酸组成的组的氨基酸残基替换的。
本发明还提供一种用于降低水性配制剂中多肽的氧化的方法，其包括依照包含计算机学习算法的上文描述的任一实施方案的方法测定该多肽中一个或多个对氧化易感的色氨酸残基的存在，并将有效量的抗氧化剂添加至包含具有一个或多个对氧化易感的色氨酸残基的多肽的水性配制剂。在一些实施方案中，提供的是一种用于降低水性配制剂中多肽的氧化的方法，其包括将一定量的抗氧化剂添加至该水性配制剂至防止氧化，其中多肽包含一个或多个通过包含机器学习算法的上文描述的任一实施方案的方法鉴定的对氧化易感的色氨酸残基。在一些实施方案中，该抗氧化剂是N-乙酰基色氨酸。在一些实施方案中，该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约5mM的浓度。在一些实施方案中，该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约1mM的浓度。在一些实施方案中，该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.3mM的浓度。在一些实施方案中，该多肽的氧化降低约50％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。在一些实施方案中，该配制剂于约2℃至约8℃稳定约1095天。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。
本发明还提供一种液体配制剂，其包含多肽和一定量的N-乙酰基色氨酸以防止该多肽氧化，其中该多肽具有至少一个通过包含机器学习算法的上文描述的任一实施方案的方法测量的对氧化易感的色氨酸残基。在一些实施方案中，该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约5mM的浓度。在一些实施方案中，该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约1mM的浓度。在一些实施方案中，该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.3mM的浓度。在一些实施方案中，该多肽的氧化降低约50％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。在一些实施方案中，该配制剂于约2℃至约8℃稳定约1065天。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。在一些实施方案中，提供的是一种试剂盒，其包含该液体配制剂。在一些实施方案中，提供的是一种制品，其包含该液体配制剂。
本发明还提供一种用来对配制剂筛选降低的多肽氧化的方法，其中该多肽包含至少一个通过包含机器学习算法的上文描述的任一实施方案的方法鉴定的对氧化易感的色氨酸，该方法包括将一定量的N-乙酰基色氨酸添加至包含该多肽的水性组合物，将2,2’-偶氮二(2-氨基丙烷)二氢氯化物(AAPH)添加至该组合物，将包含该多肽，N-乙酰基色氨酸和AAPH的组合物于约40℃温育约14小时，对该多肽测量该多肽中色氨酸残基的氧化，其中包含一定量的N-乙酰基色氨酸，导致该多肽的色氨酸残基不多于约20％氧化的配制剂对于降低的该多肽氧化是合适的配制剂。在一些实施方案中，提供的是一种用来对配制剂筛选降低的多肽氧化的方法，其包括a)通过包含机器学习算法的上文描述的任一实施方案的方法鉴定包含一个或多个对氧化易感的色氨酸残基的多肽，b)将一定量的N-乙酰基色氨酸添加至包含步骤a)中鉴定的多肽的水性组合物，c)将2,2’-偶氮二(2-氨基丙烷)二氢氯化物(AAPH)添加至该组合物，d)将包含该多肽，N-乙酰基色氨酸和AAPH的组合物于约40℃温育约14小时，e)对该多肽测量该多肽中色氨酸残基的氧化，其中包含一定量的N-乙酰基色氨酸，导致该多肽的色氨酸残基不多于约20％氧化的配制剂对于降低的该多肽氧化是合适的配制剂。
在一些方面，本发明提供一种用来测量包含N-乙酰基色氨酸的组合物中的N-乙酰基色氨酸(NAT)降解的方法，该方法包括a)将该组合物应用于反相层析材料，其中将该组合物加载到已经在包含流动相A和流动相B的溶液中平衡的层析材料上，其中流动相A在水中包含酸且流动相B在乙腈中包含酸，b)用包含流动相A和流动相B的溶液自该反相层析材料洗脱该组合物，其中流动相B对流动相A的比与步骤a)相比升高，其中NAT降解物与完整NAT分开地自该层析洗脱，c)量化该NAT降解物和该完整NAT。在一些实施方案中，步骤a)中流动相B对流动相A的比是约2:98。在一些实施方案中，步骤b)中流动相B对流动相A的比线性升高。在一些实施方案中，步骤b)中流动相B对流动相A的比逐步升高。在一些实施方案中，该层析的流速是约1.0mL/分钟。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约30:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在约16分钟中升高至约30:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比进一步升高至约90:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在约18.1分钟中进一步升高至约90:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约26:74。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在约14分钟中升高至约26:74。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比进一步升高至约90:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在约16.5分钟中进一步升高至约90:70。在一些实施方案中，流动相A在水中包含约0.1％酸。在一些实施方案中，流动相B在乙腈中包含约0.1％酸。在一些实施方案中，该酸是甲酸。在一些实施方案中，该反相层析材料包含C18模块。在一些实施方案中，该反相层析材料包含固体支持物。在一些实施方案中，该固体支持物包含硅土。在一些实施方案中，该反相层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，该反相层析材料是高效液体层析(HPLC)材料或超高效液体层析(UPLC)材料。在一些实施方案中，通过240nm处的吸光度检测NAT和NAT降解产物。在一些实施方案中，通过质谱术鉴定NAT降解产物。在一些实施方案中，该组合物中NAT的浓度是约10nM至约1mM。在一些实施方案中，NAT降解产物包括N-Ac-(H,1,2,3,3a,8,8a-六氢-3a-羟基吡咯并[2,3-b]-吲哚2-羧酸)(N-Ac-PIC)，N-Ac-氧吲哚基丙氨酸(N-Ac-Oia)，N-Ac-N-甲酰基-犬尿氨酸(N-Ac-NFK)，N-Ac-犬尿氨酸(N-Ac-Kyn)和N-Ac-2a,8a-二羟基-PIC中的一种或多种。
在一些方面，本发明提供一种用来测量包含N-乙酰基色氨酸和多肽的组合物中的N-乙酰基色氨酸(NAT)降解的方法，该方法包括a)用约8M胍稀释该组合物，b)自该组合物去除该多肽，c)将该组合物应用于反相层析材料，其中将该组合物加载到已经在包含流动相A和流动相B的溶液中平衡的层析材料上，其中流动相A在水中包含酸且流动相B在乙腈中包含酸，d)用包含流动相A和流动相B的溶液自该反相层析材料洗脱该组合物，其中流动相B对流动相A的比与步骤a)相比升高，其中NAT降解物与完整NAT分开地自该层析洗脱，e)量化该NAT降解物和该完整NAT。在一些实施方案中，在约8M胍中稀释该组合物，使得该组合物中NAT的终浓度范围为自约0.05mM至约0.2mM。在一些实施方案中，在约8M胍中稀释该组合物，使得该组合物中多肽的终浓度小于或等于约25mg/mL。在一些实施方案中，通过过滤自该组合物去除该多肽。在一些实施方案中，该过滤使用分子量截留为约30kDal的过滤膜。在一些实施方案中，步骤a)中流动相B对流动相A的比是约2:98。在一些实施方案中，步骤b)中流动相B对流动相A的比线性升高。在一些实施方案中，步骤b)中流动相B对流动相A的比逐步升高。在一些实施方案中，该层析的流速是约1.0mL/分钟。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约30:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在约16分钟中升高至约30:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比进一步升高至约90:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在约18.1分钟中进一步升高至约90:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约26:74。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在约14分钟中升高至约26:74。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比进一步升高至约90:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在约16.5分钟中进一步升高至约90:70。在一些实施方案中，流动相A在水中包含约0.1％酸。在一些实施方案中，流动相B在乙腈中包含约0.1％酸。在一些实施方案中，该酸是甲酸。在一些实施方案中，该反相层析材料包含C18模块。在一些实施方案中，该反相层析材料包含固体支持物。在一些实施方案中，该固体支持物包含硅土。在一些实施方案中，该反相层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，该反相层析材料是高效液体层析(HPLC)材料或超高效液体层析(UPLC)材料。在一些实施方案中，通过240nm处的吸光度检测NAT和NAT降解产物。在一些实施方案中，通过质谱术鉴定NAT降解产物。在一些实施方案中，该组合物中NAT的浓度是约0.1mM至约5mM。在一些实施方案中，该组合物中NAT的浓度是约0.3mM。在一些实施方案中，NAT降解产物包括N-Ac-PIC，N-Ac-Oia，N-Ac-NFK，N-Ac-Kyn和N-Ac-2a,8a-二羟基-PIC中的一种或多种。
在上述方面的一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。在一些实施方案中，该多肽是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。
在一些方面，本发明提供一种用于监测组合物中NAT的降解的方法，其包括依照权利要求74-134任一项的方法测量该组合物的样品中NAT的降解，其中该方法重复一次或多次。在一些实施方案中，每个月，每2个月，每4个月或每6个月重复该方法。
在一些方面，本发明提供一种用于药物组合物的质量测定法，该质量测定法包括依照权利要求74-134任一项的方法测量该药物组合物的样品中NAT的降解，其中该组合物中测量的NAT降解物的量确定该药物组合物是否适合于施用于动物。在一些实施方案中，该药物组合物中NAT降解物的量小于约10ppm指示该药物组合物适合于施用于该动物。
要理解的是，可以组合本文中描述的各种实施方案的一种，一些，或所有特性以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面会变得对本领域技术人员显而易见。通过下面的详述进一步描述本发明的这些和其它实施方案。
附图简述
图1显示在蛋白质单抗2，单抗4，单抗1，和单抗6中NAT对各个色氨酸残基免于AAPH压力诱导的氧化的保护。两幅图呈现相同的数据，区别在于x轴刻度。图例包括所测试的每一个残基的电脑计算的溶剂可及性表面积。
图2A和2B显示AAPH所致色氨酸氧化和％侧链SASA之间的关系。图2A显示来自包括38种IgG1单抗的数据集的结果。图2B显示来自包括121种单抗的数据集的结果，其跨越多种多样框架，包括IgG1，IgG2，IgG4，和鼠。
图3显示随机决策森林精确性，作为练习期间所使用的评估量的数目的函数。
图4显示随机决策森林精确性，作为练习期间所考虑的特征的数目的函数。
图5显示随机决策森林精确性，作为练习期间所使用的树深度的函数。
图6显示14种最相关的基于模拟的分子描述符对于一种经过优化的随机决策森林的特征重要性(基尼(gini)重要性)。练习参数包括：5000个评估量，每个节考虑3个特征，和树深度10。
图7显示NAT的潜在降解物(b系列)，连同对应的Trp降解物(a系列)。
图8A显示经受不同压力条件后0.2mM NAT的反相层析图。标星的峰代表只在ICH光压力下观察到的峰。图8B显示AAPH压力样品中对于NAT和NAT降解物各波长间荧光和吸光度的比较。曲线已经标准化使得NAT峰设置为1AU。注意只有具有可测量荧光(激发波长＝240nm，发射波长＝342nm)的NAT降解物是峰4(指派为N-Ac-PIC，基于此数据和图15E中的MS片段化数据)。
图9显示合成NAT标准品与AAPH诱导的NAT降解物的保留时间比对。
图10显示5mM Met的共配制对总NAT氧化的影响(在含有组氨酸和非组氨酸的配制剂二者中)。显示一式两份注射的标准偏差。
图11显示蛋白质对AAPH诱导的NAT降解的影响。有或无1mg/ml(0.0067mM)蛋白质的含有0.3mM NAT的基于组氨酸的缓冲液经受AAPH压力。NAT降解物的分布和水平很大程度上独立于蛋白质的存在。显示一式两份注射的标准偏差。
图12显示蛋白质1稳定性样品和AAPH压力模型中的NAT降解的比较。插图显示标示区域的放大视图。
图13显示NAT UV-HPLC响应(于240nm)的线性。
图14描绘了在His缓冲液样品中的AAPH受压NAT的1-20倍稀释系列中NAT降解物显示线性响应。所有峰是于240nm检测的。
图15A-15F显示质谱片段化分析(片段化的文献报告在Todorovski,T.,M.Fedorova,and R.Hoffmann,Mass spectrometric characterization of peptidescontaining different oxidized tryptophan residues.J Mass Spectrom,2011.46(10):p.1030-8及其参考文献中)。图15A显示了峰2和3MS数据支持鉴定为N-Ac-Oia非对映异构体。标星的片段是Oia特征性的。图15B显示了峰6MS数据支持鉴定为N-Ac-Kyn。标星的片段是含有犬尿氨酸的分子特征性的。图15C显示了峰5MS数据支持鉴定为N-Ac-NFK。标星的片段是含有犬尿氨酸的分子特征性的。图15D显示了峰组1中的263.1离子和峰4具有相似的MS片段化样式且均不是N-Ac-HTP。标星的片段是5-HTP特征性的。图15E显示了峰4中的片段化样式与潜在的N-Ac-PIC片段化一致且报告于文献(Fang,L.,R.Parti,and P.Hu,Characterization of N-acetyltryptophan degradation products in concentratedhuman serum albumin solutions and development of an automated highperformance liquid chromatography-mass spectrometry method for theirquantitation.J Chromatogr A,2011.1218(41):p.7316-24)。试探性比对基于图8B中显示的荧光数据得到加强。图15F显示了峰组1中的双重氧化种类很可能是N-Ac-DiOia或N-Ac-3a,8a-二羟基-PIC。
发明详述
在一些方面，本发明提供降低水性配制剂中多肽的氧化的方法，其包括将防止该多肽氧化的一定量的N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂，其中该多肽包含至少一个溶剂可及性表面积(SASA)大于约的色氨酸残基。在一些方面，本发明提供降低水性配制剂中多肽的氧化的方法，其包括将防止该多肽氧化的一定量的N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂，其中该多肽包含至少一个溶剂可及性表面积(SASA)大于约30％的色氨酸残基。在一些方面，本发明提供降低水性配制剂中多肽的氧化的方法，其包括测定该多肽中色氨酸残基的SASA值并如果至少一个色氨酸残基具有大于约的溶剂可及性表面积(SASA)的话，将防止该多肽氧化的一定量的N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂。
在一些方面，本发明提供用来对配制剂筛选降低的多肽氧化的方法，其中该多肽包含至少一个SASA大于约的色氨酸残基，其中包含一定量的N-乙酰基色氨酸，导致该多肽的色氨酸残基不多于约20％氧化的配制剂对于降低的该多肽氧化是合适的配制剂。在一些方面，本发明提供用来对配制剂筛选降低的多肽氧化的方法，其包括测定该多肽中色氨酸残基的SASA值，其中SASA大于约的色氨酸残基经受氧化，其中包含一定量的N-乙酰基色氨酸，导致该多肽的色氨酸残基不多于约20％氧化的配制剂对于降低的该多肽氧化是合适的配制剂。
I.定义
在详细描述本发明之前，要理解的是，本发明不限于特定组合物或生物学系统，其当然可以有变化。还要理解的是，本文中使用的术语仅仅出于描述特定实施方案的目的，并非意图是限制性的。
术语“药物配制剂”指如下的制剂，其处于容许活性组分的生物学活性有效的形式，且不含另外的对会施用配制剂的受试者有不可接受的毒性的成分。此类配制剂是无菌的。
“无菌”配制剂没有活菌或者没有或基本上没有所有活的微生物及其孢子。
“稳定”配制剂为一种其中的蛋白质在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的。优选地，配制剂在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性，以及其生物学活性。贮藏期一般基于配制剂的预定架存期来选择。多种用于测量蛋白质稳定性的分析技术是本领域可得的且综述于例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)。可测量在选定量的光暴露和/或温度达选定时间段后的稳定性。可以多种不同方式定性和/或定量评估稳定性，包括评估聚集形式(例如使用大小排阻层析，通过测量浊度，和/或通过视觉检查)；评估ROS形成(例如通过使用光压力测定法或2，2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二氢氯化物(AAPH)压力测定法)；蛋白质的特定氨基酸残基的氧化(例如单克隆抗体的Trp残基和/或Met残基)；使用阳离子交换层析，图像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较还原型(reduced)和完整抗体；肽图(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估蛋白质的生物学活性或靶结合功能(例如抗体的抗原结合功能)；等。不稳定性可涉及下述任一项或多项：聚集，脱酰胺(例如Asn脱酰胺)，氧化(例如Met氧化和/或Trp氧化)，异构化(例如Asp异构化)，修剪/水解/片段化(例如铰链区片段化)，琥珀酰亚胺形成，不配对的半胱氨酸，N端延伸，C端加工，糖基化差异，等。
若在视觉检查颜色和/或澄清度时，或根据UV光散射或大小排阻层析的测量，蛋白质显示很少的聚集，沉淀，片段化，和/或变性或没有上述迹象的话，则它在药物配制剂中“保留其物理稳定性”。
若在给定时间的化学稳定性使得蛋白质被认定为仍然保留其如下文定义的生物学活性，则蛋白质在药物配制剂中“保留其化学稳定性”。化学稳定性可通过检测和量化蛋白质的化学改变形式来评估。化学改变可涉及蛋白质氧化，其可使用例如胰蛋白酶肽作图，反相高效液体层析(HPLC)和液体层析-质谱术(LC/MS)来评估。其它类型的化学改变包括蛋白质的电荷改变，其可通过例如离子交换层析或icIEF来评估。
若蛋白质在给定时间的生物学活性在制备药物配制剂时展现的生物学活性的约20％之内(诸如约10％之内)(在测定法的误差之内)，如在例如用于单克隆抗体的抗原结合测定法中测定的，则蛋白质在药物配制剂中“保留其生物学活性”。
如本文中使用的，蛋白质的“生物学活性”指蛋白质结合其靶物的能力，例如单克隆抗体结合抗原的能力。它可进一步包括可在体外或在体内测量的生物学应答。此类活性可以是拮抗性的或激动性的。
“对氧化易感的”蛋白质为包含一个或多个已经发现倾向于氧化的残基，诸如但不限于甲硫氨酸(Met)，半胱氨酸(Cys)，组氨酸(His)，色氨酸(Trp)，和酪氨酸(Tyr)的蛋白质。例如，单克隆抗体的Fab部分中的色氨酸氨基酸或单克隆抗体的Fc部分中的甲硫氨酸氨基酸可能对氧化易感。
蛋白质的“氧化异变”残基是在氧化测定法(例如AAPH诱导的或热诱导的氧化)中具有大于35％的氧化的残基。蛋白质中的残基的百分比氧化可以通过本领域已知的任何方法来测定，诸如用于位点特异性Trp氧化的胰蛋白酶消化，继以LC-MS/MS。
生物分子在溶剂中的“溶剂可及性表面积”或“SASA”是该生物分子对该溶剂可及的表面积。SASA可以以测量单位(例如平方埃)或作为对溶剂可及的表面积的百分比来表述。例如，多肽中的氨基酸残基的SASA可以是 或30％。SASA可以通过本领域已知的任何方法来测定，包括Shrake-Rupley算法，LCPO方法，功率图方法，或分子动力学模拟。
“等张”表示感兴趣的配制剂与人血液具有基本上相同的渗透压。等张配制剂一般会具有约250至350mOsm的渗透压。等张性可使用例如蒸气压或冰冻型渗透压计来测量。
如本文中使用的，“缓冲液”指通过其酸-碱配合成分的作用来抵抗pH变化的缓冲溶液。本发明的缓冲液优选具有在约4.5至约8.0的范围中的pH。例如，会控制pH在此范围中的缓冲液的一个例子是组氨酸乙酸酯。
“防腐剂”为如下的化合物，其可任选地包括在配制剂中以本质上降低其中的细菌作用，如此便于生产例如多次使用配制剂。潜在防腐剂的例子包括十八烷基二甲基苯甲基氯化铵，氯己双胺，苯扎氯铵(烃基苯甲基二甲基氯化铵的混合物，其中烃基是长链化合物)，和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇诸如酚，丁醇和苯甲醇，烃基对羟基苯甲酸酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，邻苯二酚，间苯二酚，环己醇，3-戊醇，和间甲酚。在一个实施方案中，本文中的防腐剂为苯甲醇。
如本文中使用的，“表面活性剂”指表面活性物质，优选非离子型表面活性剂。本文中的表面活性剂的例子包括聚山梨酯(例如聚山梨酯20和聚山梨酯80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基，肉豆蔻基，亚油基(linoleyl)，或硬脂基磺基甜菜碱；月桂基，肉豆蔻基，亚油基或硬脂基肌氨酸；亚油基，肉豆蔻基，或鲸蜡基甜菜碱；月桂酰胺基丙基，椰油酰胺基(cocamido)丙基，亚油酰胺基丙基，肉豆蔻酰胺基丙基，棕榈酰胺基(palmido)丙基，或异硬脂酰胺基丙基甜菜碱(例如月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺基丙基，棕榈酰胺基(palmido)丙基，或异硬脂酰胺基丙基二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠，或甲基油酰基牛磺酸二钠；和MONAQUATTM系列(MonaIndustries,Inc.,Paterson,N.J.)；聚乙二醇，聚丙二醇，及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如Pluronics，PF68等)；等。在一个实施方案中，本文中的表面活性剂是聚山梨酯20。在还有另一个实施方案，本文中的表面活性剂是泊洛沙姆188。
如本文中使用的，“药学可接受”赋形剂或载剂包括药学可接受载剂，稳定剂，缓冲剂，酸，碱，糖，防腐剂，表面活性剂，张度剂，等等，它们是本领域公知的(Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,22nd Ed.,Pharmaceutical Press,2012)。药学可接受赋形剂的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，乙酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸，L-色氨酸和甲硫氨酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；金属复合物，诸如Zn-蛋白质复合物；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如聚山梨酯，泊洛沙姆，聚乙二醇(PEG)，和PLURONICSTM。“药学可接受”赋形剂或载剂是那些可合理施用于受试者以提供有效剂量的所采用活性组分且在所采用的剂量和浓度对暴露于其的受试者无毒的。
配制的蛋白质优选本质上纯的且期望本质上同质的(例如没有污染性蛋白质等)。“本质上纯的”蛋白质意味着基于组合物的总重量，组合物包含以重量计至少约90％，优选以重量计至少约95％的蛋白质(例如单克隆抗体)。“本质上同质的”蛋白质意味着基于组合物的总重量，组合物包含以重量计至少约99％的蛋白质(例如单克隆抗体)。
术语“蛋白质”，“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性的或分支的，它可包含经修饰氨基酸，而且它可被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经天然地或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成，糖基化，脂化，乙酰化，磷酸化，或任何其它操作或修饰，诸如与标记构件缀合。还包括在该定义内的是例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的蛋白质。涵盖在本文中的定义内的蛋白质的例子包括哺乳动物蛋白质，诸如，例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；瘦蛋白；凝血因子诸如因子VIIIC，因子IX，组织因子，和vonWillebrands因子；抗凝血因子诸如蛋白C；心房利尿钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，诸如尿激酶或人尿液或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和β；肿瘤坏死因子受体，诸如死亡受体5和CD120；TNF相关凋亡诱导性配体(TRAIL)；B细胞成熟抗原(BCMA)；B淋巴细胞刺激物(BLyS)；增殖诱导性配体(APRIL)；脑啡肽酶；RANTES(活化时受到调节，正常情况下T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清清蛋白，诸如人血清清蛋白；Muellerian抑制性物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血管内皮生长因子家族蛋白质(例如VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，和P1GF)；血小板衍生的生长因子(PDGF)家族蛋白质(例如PDGF-A，PDGF-B，PDGF-C，PDGF-D，及其二聚体)；成纤维细胞生长因子(FGF)家族，诸如aFGF，bFGF，FGF4，和FGF9；表皮生长因子(EGF)；激素或生长因子的受体，诸如VEGF受体(例如VEGFR1，VEGFR2，和VEGFR3)，表皮生长因子(EGF)受体(例如ErbB1，ErbB2，ErbB3，和ErbB4受体)，血小板衍生的生长因子(PDGF)受体(例如PDGFR-α和PDGFR-β)，和成纤维细胞生长因子受体；TIE配体(血管生成素，ANGPT1，ANGPT2)；血管生成素受体，诸如TIE1和TIE2；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨衍生的神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神经生长因子，诸如NGF-b；转化生长因子(TGF)诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白诸如CD3，CD4，CD8，CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；趋化因子，诸如CXCL12和CXCR4；干扰素诸如干扰素-α，-β，和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF，GM-CSF，和G-CSF；细胞因子，诸如白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；midkine(肝素结合细胞因子)；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，诸如例如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节性蛋白质；整合素诸如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；肝配蛋白；Bv8；德尔塔样配体4(DLL4)；Del-1；BMP9；BMP10；卵泡抑素；肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)；Alk1；Robo4；ESM1；Perlecan(基底膜蛋白聚糖)；EGF样域，多重7(EGFL7)；CTGF及其家族成员；血小板反应蛋白，诸如血小板反应蛋白1和血小板反应蛋白2；胶原，诸如胶原IV和胶原XVIII；神经毡蛋白，诸如NRP1和NRP2；多效营养因子(PTN)；颗粒蛋白前体；增殖蛋白；刻缺蛋白，诸如刻缺蛋白1和刻缺蛋白4；脑信号蛋白，诸如Sema3A，Sema3C，和Sema3F；肿瘤相关抗原，诸如CA125(卵巢癌抗原)；免疫粘附素；及任何上文所列蛋白质的片段和/或变体，以及结合一种或多种蛋白质(包括例如任何上文所列蛋白质)的抗体，包括抗体片段。
本文中术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
“分离的”蛋白质(例如分离的抗体)指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的蛋白质(例如抗体)。其天然环境的污染性成分指将会干扰该蛋白质的研究，诊断或治疗用途的物质，可包括酶，激素，和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。既然蛋白质天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的蛋白质包括重组细胞内的原位蛋白质。然而，分离的蛋白质通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。
术语“恒定域”指免疫球蛋白分子中的如下部分，其相对于免疫球蛋白的其它部分，即含有抗原结合位点的可变域，具有更加保守的氨基酸序列。恒定域含有重链的CH1，CH2和CH3域(合称CH)及轻链的CHL(或CL)域。
抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞毒性中的参与。
根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(“κ”)和拉姆达(“λ”)。
如本文中使用的，术语IgG“同种型”或“亚类”意指由其恒定区的化学和抗原特征定义的任何免疫球蛋白亚类。根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于例如Abbas et al.,Cellular and Mol.Immunology,4th ed.,W.B.Saunders，Co.，2000。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价连接而形成的更大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”，“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体，而非下文定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。Fab片段包含重链和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为在Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密，非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和重链可以在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，每个可变域的三个HVR相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见例如Plückthun，于《The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，NewYork，第269-315页，1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，例如构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突变。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆，噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力，将靶物结合序列人源化，提高其在细胞培养物中的产量，降低其在体内的免疫原性，创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein，Nature，256:495-97(1975)；Hongo etal.，Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow et al.,Antibodies:A LaboratoryManual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling et al.,In:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.,1981))，重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)，噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu etal.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))，及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann et al.,Year in Immuno.7:33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks et al.,Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(参见例如美国专利No.4,816,567；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的HVR残基用具有期望特异性，亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠，大鼠，家兔，或非人灵长类动物的HVR残基替换的。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。可以进行这些修饰来进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；及美国专利No.6,982,321和7,087,409。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法：Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991)。还可参见van Dijk and van deWinkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5:368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人抗体但其内源基因座已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如美国专利6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)，关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
术语“高变区”，“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1，H2，H3)，三个在VL中(L1，L2，L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.,Immunity 13:37-45(2000)；Johnson and Wu,In:Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.Nature 363:446-448,(1993)；Sheriffet al.Nature Struct.Biol.3:733-736,(1996)。在一些实施方案中，HVR是互补决定区(CDR)。
本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到OxfordMolecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)，46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)，50-65或49-65(H2)和93-102，94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。
“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的HVR残基外的那些残基。
术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat et al.,见上文中的用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a，82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大约是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat et al.,Sequences of Immunological Interest. 5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabatet al.，见上文中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号方式。
术语“多特异性抗体”以最广义使用且具体涵盖包含具有多表位特异性(即能够特异性结合一种生物学分子上两种或更多种不同表位或能够特异性结合两种或更多种不同生物学分子上的表位)的抗原结合域的抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)的抗原结合域包含两个VH/VL单元，其中第一VH/VL单元特异性结合第一表位而第二VH/VL单元特异性结合第二表位，其中每个VH/VL单元包含重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体，具有两个或更多个VL和VH域的抗体，诸如Fab，Fv，dsFv，scFv，双抗体，双特异性双抗体和三抗体等抗体片段，已经共价或非共价连接的抗体片段。进一步包含至少部分重链恒定区和/或至少部分轻链恒定区的VH/VL单元也可称作“半体(hemimer)”或“半抗体”。在一些实施方案中，半抗体包含至少部分单个重链可变区和至少部分单个轻链可变区。在一些此类实施方案中，包含两个半抗体且结合两种抗原的双特异性抗体包含结合第一抗原或第一表位但不结合第二抗原或第二表位的第一半抗体和结合第二抗原或第二表位且不结合第一抗原或第一表位的第二半抗体。依照一些实施方案，该多特异性抗体是以5M至0.001pM，3M至0.001pM，1M至0.001pM，0.5M至0.001pM，或0.1M至0.001pM的亲和力结合每一种抗原或表位的IgG抗体。在一些实施方案中，半体包含的重链可变区的部分足以容许与第二半体形成分子内二硫键。在一些实施方案中，半体包含节突变或穴突变，例如为了容许与包含互补穴突变或节突变的第二半体或半抗体异二聚化。下文进一步讨论节突变和穴突变。
“双特异性抗体”指包含能够特异性结合一种生物学分子上的两种不同表位或能够特异性结合两种不同生物学分子上的表位的抗原结合域的多特异性抗体。双特异性抗体在本文中也可称作具有“双重特异性”或是“双重特异性的”。除非另外指明，双特异性抗体名称中列出受到双特异性抗体结合的抗原的次序是任意的。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两个半抗体，其中每一个半抗体包含单个重链可变区和任选至少部分重链恒定区，和单个轻链可变区和任选至少部分轻链恒定区。在某些实施方案中，双特异性抗体包含两个半抗体，其中每一个半抗体包含单个重链可变区和单个轻链可变区且并不包含超过一个单个重链可变区且并不包含超过一个单个轻链可变区。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两个半抗体，其中每一个半抗体包含单个重链可变区和单个轻链可变区，且其中第一半抗体结合第一抗原且不结合第二抗原且第二半抗体结合第二抗原且不结合第一抗原。
如本文中使用的，术语“节-入-穴”或“KnH”技术指通过在两条多肽相互作用的界面处将隆起(节)引入一条多肽并将空腔(穴)引入另一条多肽中，在体外或在体内将两条多肽配对在一起的技术。例如，已经在抗体的Fc:Fc结合界面，CL:CH1界面或VH/VL界面中引入KnH(见例如US2011/0287009，US2007/0178552，WO 96/027011，WO 98/050431，和Zhu等(1997)Protein Science 6：781-788)。在一些实施方案中，KnH在制造多特异性抗体期间驱动两条不同重链配对在一起。例如，在它们的Fc区中具有KnH的多特异性抗体可进一步包含连接至每个Fc区的单一可变域，或进一步包含与相似或不同轻链可变域配对的不同重链可变域。KnH技术还可用于将两个不同受体胞外域或包含不同靶物识别序列的任何其它多肽序列(例如包括亲和抗体(affibody)，肽体(peptibody)和其它Fc融合物)配对在一起。
如本文中使用的，术语“节突变”指在多肽与另一多肽相互作用的界面处向该多肽中引入隆起(节)的突变。在一些实施方案中，另一多肽具有穴突变(参见例如US 5,731,168，US 5,807,706，US 5,821,333，US 7,695,936，US 8,216,805，通过援引将每一篇完整收入本文)。
如本文中使用的，术语“穴突变”指在多肽与另一多肽相互作用的界面处向该多肽中引入空腔(穴)的突变。在一些实施方案中，另一多肽具有节突变(参见例如US 5,731,168，US 5,807,706，US 5,821,333，US 7,695,936，US 8,216,805，通过援引将每一篇完整收入本文)。
表述“线性抗体”指Zapata et al.(1995)Protein Eng,8(10):1057-1062中所描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的，或者是单特异性的。
如本文中使用的，术语“约”指技术领域普通技术人员确定的相应数值的可接受误差范围，这会部分取决于该值是如何测量或测定的，即测量系统的限制。例如，遵照本领域的实践，“约”可意味着在1个或超过1个标准偏差内。本文中提到“约”数值或参数包括和描述涉及该数值或参数本身的实施方案。例如，提到“约X”的描述包括“X”的描述。
如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数所指物，除非内容另有明确说明。如此，例如，提及“一个/种化合物”任选包括两个/种或更多个/种此类化合物的组合，诸如此类。
理解的是，本文所述发明的各个方面和实施方案包括“包含”，“由……组成”，和“基本上由……组成”方面和实施方案。
II.蛋白质配制剂和制剂
本文中的发明涉及包含蛋白质和N-乙酰基-色氨酸(NAT)的配制剂(例如液体配制剂)，其中该NAT防止该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该蛋白质对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的甲硫氨酸，半胱氨酸，组氨酸，色氨酸，和/或酪氨酸对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的色氨酸对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质包含至少一个溶剂可及性表面积(SASA)大于约至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)的色氨酸残基。在一些实施方案中，该SASA大于约 在一些实施方案中，该蛋白质包含至少一个SASA大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)的色氨酸残基。在一些实施方案中，该SASA大于约30％。SASA可以使用本领域知道的任何方法来计算，诸如Sharma,V.et al.,PNAS.111(52):18601-18606,2014中描述的电脑全原子分子动力学(MD)模拟方法。在一些实施方案中，色氨酸残基的SASA是于自约4.0至约8.5的pH范围测量的。在一些实施方案中，色氨酸残基的SASA是于范围为自约5℃至约40℃的温度测量的。在一些实施方案中，色氨酸残基的SASA是于范围为自约0mM至约500mM的盐浓度测量的。在一些实施方案中，色氨酸残基的SASA是于约5.0至约7.5的pH，约5℃至约25℃的温度和约0mM至约200mM的盐浓度测量的。在一些实施方案中，该蛋白质包含至少一个通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法预测对氧化易感的色氨酸残基。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。在一些实施方案中，该配制剂是液体配制剂。在一些实施方案中，该配制剂是水性配制剂。
在一些实施方案中，该配制剂中的NAT是自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)，或高至该NAT在该配制剂中可溶的最高浓度。在一些实施方案中，该配制剂中的NAT是约1mM。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中的一个或多个色氨酸氨基酸氧化。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质通过反应性氧种类(ROS)氧化。在又一个实施方案中，该反应性氧种类选自由单态氧，超氧化物(O2-)，烷氧基自由基，过氧基自由基，过氧化氢(H2O2)，三氧化二氢(H2O3)，三氧化氢自由基(HO3·)，臭氧(O3)，羟基自由基，和烷基过氧化物组成的组。例如，单克隆抗体的Fab部分中的色氨酸氨基酸和/或单克隆抗体的Fc部分中的甲硫氨酸氨基酸可以对氧化易感。
在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。该配制剂中的例示性蛋白质浓度包括自约1mg/mL至超过约250mg/mL，自约1mg/mL至约250mg/mL，自约10mg/mL至约250mg/mL，自约15mg/mL至约225mg/mL，自约20mg/mL至约200mg/mL，自约25mg/mL至约175mg/mL，自约25mg/mL至约150mg/mL，自约25mg/mL至约100mg/mL，自约30mg/mL至约100mg/mL或自约45mg/mL至约55mg/mL。
在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。在一些实施方案中，该抗体衍生自IgG1抗体序列。在又一个实施方案中，该NAT防止抗体的Fab部分中的一个或多个氨基酸氧化。在另一个又一个实施方案中，该NAT防止抗体的Fc部分中的一个或多个氨基酸氧化。
在一些实施方案中，该配制剂是水性的。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。例如，本发明的配制剂可包含单克隆抗体，本文中提供的防止该蛋白质氧化的NAT，和将该配制剂的pH维持于期望水平的缓冲剂。在一些实施方案中，本文中提供的配制剂具有约4.5至约9.0的pH。在一些实施方案中，本文中提供的配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在某些实施方案中，该pH在自pH 4.0至8.5的范围中，在自pH 4.0至8.0的范围中，在自pH 4.0至7.5的范围中，在自pH 4.0至7.0的范围中，在自pH 4.0至6.5的范围中，在自pH 4.0至6.0的范围中，在自pH4.0至5.5的范围中，在自pH 4.0至5.0的范围中，在自pH 4.0至4.5的范围中，在自pH 4.5至9.0的范围中，在自pH 5.0至9.0的范围中，在自pH 5.5至9.0的范围中，在自pH 6.0至9.0的范围中，在自pH 6.5至9.0的范围中，在自pH 7.0至9.0的范围中，在自pH 7.5至9.0的范围中，在自pH 8.0至9.0的范围中，在自pH 8.5至9.0的范围中，在自pH 5.7至6.8的范围中，在自pH 5.8至6.5的范围中，在自pH 5.9至6.5的范围中，在自pH 6.0至6.5的范围中，或在自pH 6.2至6.5的范围中。在本发明的某些实施方案中，该配制剂具有6.2或约6.2的pH。在本发明的某些实施方案中，该配制剂具有6.0或约6.0的pH。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。
在一些实施方案中，本文中提供的配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。如本文中使用的，用于治疗或施用目的的“受试者”或“个体”指任何归类为哺乳动物的动物，包括人，驯养和农场动物，和动物园，运动，或宠物动物，诸如犬，马，猫，牛，等。在一些实施方案中，该哺乳动物是人。
该配制剂中的蛋白质和抗体可使用本领域知道的方法来制备。该配制剂中的抗体(例如全长抗体，抗体片段和多特异性抗体)可以使用本领域可得的技术来制备，其非限制性例示性方法更为详细地描述于下面的节。本领域技术人员可改编本文中的方法来制备包含其它蛋白质，诸如基于肽的抑制剂的配制剂。对于普遍充分理解且常常采用的用于生成治疗性蛋白质的技术和规程，参见Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrooket al.,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.eds.,2003)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,J.Wiley and Sons,2002)；Current Protocols in Protein Science,(Horswill et al.,2006)；Antibodies，A Laboratory Manual(Harlow and Lane,eds.,1988)；Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,6th ed.,J.Wiley and Sons,2010)，将其均通过援引完整收入本文中。
在一些实施方案中，依照上文描述的任何配制剂(例如液体配制剂)，该配制剂包含两种或更多种蛋白质(例如该配制剂是两种或更多种蛋白质的共配制剂)。例如，在一些实施方案中，该配制剂是包含两种或更多种蛋白质和N-乙酰基-色氨酸(NAT)的共配制剂，其中该NAT防止该两种或更多种蛋白质中的至少一种氧化。在一些实施方案中，该NAT防止该两种或更多种蛋白质中的多种氧化。在一些实施方案中，该NAT防止该两种或更多种蛋白质中的每一种氧化。在一些实施方案中，该两种或更多种蛋白质中的至少一种包含至少一个如下的色氨酸残基：a)溶剂可及性表面积(SASA)大于约至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)；b)SASA大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)；或c)通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法预测对氧化易感。在一些实施方案中，该两种或更多种蛋白质中的多种包含至少一个如下的色氨酸残基：a)溶剂可及性表面积(SASA)大于约至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)；b)SASA大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)；或c)通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法预测对氧化易感。在一些实施方案中，该两种或更多种蛋白质中的每一种包含至少一个如下的色氨酸残基：a)溶剂可及性表面积(SASA)大于约至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)；b)SASA大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)；或c)通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法预测对氧化易感。在一些实施方案中，该两种或更多种蛋白质中的至少一种是抗体，诸如多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。在一些实施方案中，该两种或更多种蛋白质中的多种是抗体，诸如独立选自多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段的抗体。在一些实施方案中，该两种或更多种蛋白质中的每一种是抗体，诸如独立选自多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段的抗体。在一些实施方案中，该配制剂中的一种或多种抗体衍生自IgG1抗体序列。在一些实施方案中，该配制剂是液体配制剂。在一些实施方案中，该配制剂是水性配制剂。
A.抗体制备
本文中提供的液体配制剂中抗体针对感兴趣抗原。优选地，抗原是生物学重要多肽，而且对罹患病症的哺乳动物施用抗体可在该哺乳动物中导致治疗好处。然而，也涵盖针对非多肽抗原的抗体。
在抗原是多肽的情况中，它可以是跨膜分子(例如受体)或配体，诸如生长因子。例示性抗原包括如下分子，诸如血管内皮生长因子(VEGF)；CD20；ox-LDL；ox-ApoB100；肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体化激素；高血糖素；凝固因子，诸如因子VIIIC，因子IX，组织因子，和(冯)维勒布兰德(vonWillebrand)氏因子；抗凝固因子，诸如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原活化剂，诸如尿激酶或人尿型或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；林蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子受体，诸如死亡受体5和CD120；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(活化时受到调节，正常情况由T-细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清清蛋白，诸如人血清清蛋白；穆勒(Muellerian)抑制性物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白质，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；活化素；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5，或NT-6)，或神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，诸如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，诸如CD3，CD4，CD8，CD19和CD20；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态生成蛋白(BMP)；干扰素，诸如干扰素-α，-β，和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF，GM-CSF，和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，诸如例如AIDS被膜的一部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，诸如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，诸如HER2，HER3或HER4受体；和任何上文所列多肽的片段。
(i)抗原制备
可溶性抗原或其片段(任选缀合有其它分子的)可作为免疫原用于生成抗体。对于跨膜分子，诸如受体，它们的片段(例如受体的胞外结构域)可用作免疫原。或者，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可衍生自天然来源(例如癌细胞系)，或者可以是经重组技术转化而表达跨膜分子的细胞。对于制备抗体有用的其它抗原及其形式对于本领域技术人员会是显而易见的。
(ii)某些基于抗体的方法
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烃基，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质缀合可能是有用的，例如匙孔虫戚血蓝蛋白，血清清蛋白，牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原，免疫原性缀合物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或缀合物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂缀合得到的缀合物进行加强免疫。缀合物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
感兴趣的单克隆抗体可使用杂交瘤方法来生成，其首先记载于Kohler et al.,Nature,256:495(1975)，并进一步记载于例如Hongo et al.,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring HarborLaboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling et al.,in:Monoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981),和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)，关于人-人杂交瘤。别的方法包括那些记载于例如U.S.Pat.No.7,189,826的，其关于自杂交瘤细胞系生成单克隆人天然IgM抗体。人杂交瘤技术(三元杂交瘤(Trioma)技术)记载于Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimentaland Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
关于各种其它杂交瘤技术，参见例如US 2006/258841；US 2006/183887(完全人的抗体)；US 2006/059575；US 2005/287149；US 2005/100546；US 2005/026229；和U.S.Pat.Nos.7,078,492和7,153,507。一种使用杂交瘤方法来生成单克隆抗体的例示性方案记载如下。在一个实施方案中，免疫小鼠或其它适宜宿主动物(诸如仓鼠)以引发生成或能够生成会特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射感兴趣的多肽或其片段和佐剂诸如单磷脂酰脂质A(MPL)/海藻糖二棒分枝菌酸酯(TDM)(Ribi Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,Mont.)，在动物中生成抗体。感兴趣的多肽(例如抗原)或其片段可使用本领域公知方法来制备，诸如重组方法，其中一些在本文中有进一步描述。对来自经免疫动物的血清测定抗抗原抗体，并任选施用加强免疫。自生成抗抗原抗体的动物分离淋巴细胞。或者，在体外免疫淋巴细胞。
然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。参见例如Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986)。可使用高效融合，支持选定的抗体生成细胞稳定地高水平生成抗体，且对培养基诸如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。例示性的骨髓瘤细胞包括但不限于鼠骨髓瘤系，诸如那些衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可得自索尔克(Salk)研究所细胞分发中心，San Diego，Calif.USA)的，及SP-2或X63-Ag8-653细胞(可得自美国典型培养物保藏中心,Rockville,Md.USA)的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，例如含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的培养基。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的会含有次黄嘌呤，氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选地，使用无血清杂交瘤细胞培养方法来降低动物衍生血清的使用，诸如胎牛血清，如记载于例如Evenet al.，Trends in Biotechnology，24(3),105-108(2006)。
作为提高杂交瘤细胞培养物生产力的工具的寡肽记载于Franek,Trends inMonoclonal Antibody Research，111-122(2005)。具体地，标准培养基富含某些氨基酸(丙氨酸，丝氨酸，天冬酰胺，脯氨酸)或蛋白质水解产物级分，而且可通过由3-6个氨基酸残基构成的合成寡肽来显著遏制凋亡。所述肽以毫摩尔或更高浓度存在。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定结合本文中描述的抗原的单克隆抗体的生成。可通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Scatchard分析来测定。参见例如Munson et al.，Anal.Biochem.107:220(1980)。
在鉴定得到生成具有期望特异性，亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(参见例如Goding,supra)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液，腹水或血清适当分开。一种用于自杂交瘤细胞分离蛋白质的规程记载于US 2005/176122和U.S.Pat.No.6,919,436。该方法包括在结合过程中最低限度地使用盐，诸如易溶盐，而且优选还在洗脱过程中使用少量的有机溶剂。
(iii)某些文库筛选方法
本文中描述的配制剂和组合物中的抗体可以通过使用组合库筛选具有期望活性的抗体来生成。例如，本领域知道用于构建噬菌体展示库及对此类文库筛选具有期望的结合特性的抗体的多种方法。此类方法一般记载于Hoogenboom et al.in Methods inMolecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa，N.J.，2001)。例如，一种产生感兴趣抗体的方法是经由使用如Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93中所描述的噬菌体抗体文库。
原则上，通过筛选噬菌体文库来选择合成的抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区(Fv)片段的噬菌体。通过针对所需抗原的亲和层析来淘选此类噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。任何抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat et al.，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242,BethesdaMd.(1991),卷1-3中记载的合适的恒定区(Fc)序列来构建全长抗体克隆。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，分别来自轻链(VL)和重链(VH)，都呈现三个高变环(HVR)或互补决定区(CDR)。可变域可以功能性的展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短的，柔性的肽共价相连)，或者作为Fab片段(其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用)，如Winter etal.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆，如Winter et al.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无需任何免疫，如Griffiths et al.,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区及用来在体外实现重排，如Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。
在某些实施方案中，通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH与VL结构域通过柔性多肽间隔物在同一多肽链上相连，例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，另一条链分泌入细菌宿主细胞周质，在此装配Fab-外壳蛋白结构，其通过替换一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom etal.，Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991)所述。
一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核酸。如果希望文库偏向抗抗原克隆，那么可以给受试者免疫接种抗原以产生抗体应答，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个实施方案中，如下得到了偏向抗抗原克隆的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(且缺乏功能性内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗抗原抗体应答，使得抗原免疫接种产生生成针对抗原的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的生成在下文中有描述。
可以如下获得抗抗原反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选规程来分离表达抗原特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过使用抗原亲和层析进行的细胞分离或者细胞对荧光染料标记的抗原的吸附及后续的荧光激活细胞分选(flow-activated cellsorting,FACS)。
或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可能的抗体全集的更佳展现，而且还容许使用抗原在其中没有抗原性的任何动物(人或非人的)物种构建抗体文库。对于构建体外掺入抗体基因的文库，从受试者收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种(诸如人，小鼠，大鼠，兔类，luprine，犬，猫，猪，牛，马和禽类物种等)获得感兴趣的免疫细胞。
从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸并扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，可以如下获得所需DNA，即从淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，接着用与重排的VH和VL基因的5'和3'末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如Orlandi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集供表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的外显子的5'末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi等(1989)和Ward et al.,Nature,341:544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外显子内，如Jones et al.,Biotechnol.，9:88-89(1991)所述，正向引物基于恒定区内，如Sastry etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中可以掺入简并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。在某些实施方案中，如下将文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的VH和VL重排，例如如Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)的方法中所述或Orum et al.,Nucleic Acids Res.,21:4491-4498(1993)的方法中所述。为了将所扩增的DNA克隆入表达载体，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如Orlandi等(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clackson etal.,Nature,352:624-628(1991)所述。
合成重排的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人VH基因区段已经克隆和测序(Tomlinson et al.,J.Mol.Biol.,227:776-798(1992))，并定位(Matsuda etal.,Nature Genet.,3:88-94(1993))；这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构造)可用于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboomand Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性集中于单一长度的长H3环，如Barbas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457-4461(1992)所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams and Winter,Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993))，而且可用于生成合成轻链全集。基于一系列VH和VL折叠结构及L3和H3长度的合成V基因全集将编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，依照Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V基因区段。
抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将VH与VL基因全集联合在一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefe et al.,Gene,128:119-126(1993)所述，或者在体内通过组合感染来重组载体，例如Waterhouse et al.,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993)中记载的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库容量限制。分开克隆未免疫的VH和VL全集，一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得每个细胞包含一种不同组合来联合两个文库，库容量只受细胞存在数的限制(约1012个克隆)。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，并共包装成噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(Kd -1为约10-8M)的多样性抗体。
或者，可以将全集序贯克隆入同一载体，例如如Barbas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后克隆，例如如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)所述。PCR装配还可用于将VH和VLDNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内联合VH与VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如Embleton et al.,Nucl.Acids Res.,20:3831-3837(1992)所述。
未免疫文库(天然的或合成的)生成的抗体可具有中等亲和力(Kd -1为约106-107M-1)，但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建次生文库并再次选择，如Winter等(1994)，见上文所述。例如，在Hawkins et al.,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)的方法或Gram et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89:3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶在体外随机引入突变(Leung et al.,Technique,1:11-15(1989))。另外，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO 9607754(公布于1996年3月14日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构域与得自未免疫供体的天然存在V结构域变体全集重组，并在数轮链改组中筛选更高亲和力，如Marks et al.,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述。此技术容许生成亲和力约10-9M或小于10-9M的抗体和抗体片段。
文库的筛选可通过本领域已知的多种技术来实现。例如，抗原可用于包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或者缀合至生物素以用链霉亲合素包被的珠捕捉，或者用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。
在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接触固定化的抗原。正常情况下，选择包括pH，离子强度，温度等等的条件来模拟生理学条件。对结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如Barbas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA,88:7978-7982(1991)所述，或者用碱洗脱，例如如Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者通过抗原竞争洗脱，例如在与Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。此外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。
选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可以通过使用短时间的清洗，多价噬菌体展示，及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动力学(和强结合亲和力)的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示(如Bass et al.,Proteins,8:309-314(1990)和WO 92/09690所述)及低抗原包被密度(如Marks et al.,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述)来促进。
有可能在对抗原具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机突变(例如如有些亲和力成熟技术中所进行的)有可能产生许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制抗原，罕见的高亲和力噬菌体能竞争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化抗原一起温育，但是生物素化抗原的浓度以摩尔计低于抗原的目标摩尔亲和常数。然后可以用链霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”容许依照结合亲和力来选择抗体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值2倍的突变体克隆。还可以操作用于清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。
抗抗原克隆可以基于活性进行选择。在某些实施方案中，本发明提供了结合天然表达抗原的活细胞或结合游离漂浮抗原或附着于其它细胞结构的抗原的抗抗原抗体。对应于此类抗抗原抗体的Fv克隆可以如下选出：(1)如上所述从噬菌体文库分离抗抗原克隆，并任选通过在合适的细菌宿主中培养所分离的噬菌体克隆群来扩增该群体；(2)选出分别想要阻断和不阻断其活性的第二蛋白质和抗原；(3)使抗抗原噬菌体克隆吸附至固定化的抗原；(4)使用过量的第二蛋白质来洗脱任何不想要的，识别抗原结合决定簇(其与第二蛋白质的结合决定簇交叠或共享)的克隆；并(5)洗脱在步骤(4)后仍然吸附的克隆。任选的是，具有期望的阻断/不阻断特性的克隆可以通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步富集。
编码杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增感兴趣的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞，猿COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5:256(1993)及Pluckthun,Immunol.Revs,130:151(1992)。
编码Fv克隆的DNA可以联合编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如适宜的DNA序列可得自Kabat等，见上文)以形成编码全长或部分长度重链和/或轻链的克隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG，IgM，IgA，IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。衍生自一种动物(诸如人)物种的可变域DNA，然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的编码序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在某些实施方案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成全长或部分长度人重链和/或轻链的编码序列。
还可以修饰编码衍生自杂交瘤的抗抗原抗体的DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定域的编码序列替换衍生自杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如如Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984)中的方法)。可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA，通过共价连接免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可以以该方式制备具有Fv克隆或杂交瘤克隆衍生抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。
(iv)人源化抗体和人抗体
本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))，即用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中显著少于完整的人可变域用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些CDR残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。
用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变域的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims et al.,J.Immunol.，151:2296(1993)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.，196:901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚类(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.,Proc.Natl.AcadSci.USA,89:4285(1992)；Presta et al.,J.Immnol.,151:2623(1993))。
更为重要的是抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照该方法的一个实施方案，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
本文中描述的配制剂和组合物中的人抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成人单克隆抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如Kozbor J.Immunol.，133:3001(1984)；Brodeur et al.，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York，1987)；及Boerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991).
例如，有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann et al.,Year in Immuno.,7:33(1993)；及Duchosal et al.Nature355:258(1992)。
基因改组也可用于自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitopeimprinting)，如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变区用人V结构域基因全集替换，产生非人链-人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链恢复了在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后破坏的抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶体的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公开于1993年4月1日)。与传统的通过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR或CDR残基。
(v)抗体片段
抗体片段可以通过传统手段来生成，诸如酶促消化，或者通过重组技术来生成。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体有优势。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于到达实体瘤。某些抗体片段的综述参见Hudson et al.(2003)Nat.Med.9:129-134。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.,Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)；及Brennan et al.,Science 229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab，Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carteret al.,Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。包含补救受体结合表位残基，具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员会是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点，缺少恒定区的唯一类型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering,Borrebaeck编,见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)多特异性抗体
多特异性抗体具有对至少两种不同表位的结合特异性，其中所述表位通常来自不同抗原。尽管此类分子通常只结合两种不同表位(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein etal.，Nature，305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO 93/08829及Traunecker et al.,EMBO J.,10:3655-3659(1991)。
依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链，CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。通常在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO 94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh et al.,Methods in Enzymology,121:210(1986)。
依照WO96/27011中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。一种界面包含抗体恒定域的至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源缀合的”抗体。例如，可以将异源缀合物中的一种抗体与亲合素偶联，而将另一种抗体与生物素偶联。此类抗体已经建议用于例如将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO 91/00360,WO 92/200373,和EP 03089)。异源缀合抗体可以使用任何方便的交联方法来制备。合适的交联剂连同许多交联技术是本领域众所周知的，而且披露于美国专利No.4,676,980。
文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.,Science,229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab'片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby et al.,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab'片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。
还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tuft et al.,J.Immunol.,147:60(1991)。
(vii)单域抗体
在有些实施方案中，本文中描述的抗体是单域抗体(single-domain antibody)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或者整个或部分轻链可变域的单一多肽链。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.；参见例如美国专利No.6,248,516 B1)。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。
(viii)抗体变体
在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以是通过将适宜的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除，插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基酸序列。
(ix)抗体衍生物
可进一步修饰本发明的配制剂和组合物中的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。在某些实施方案中，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三口恶烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇，及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能，抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
(x)载体，宿主细胞，和重组方法
也可以使用重组方法来生成抗体。为了重组生成抗抗原抗体，分离编码抗体的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规规程容易的分离编码抗体的DNA并测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列，复制起点，一种或多种标志基因，增强子元件，启动子，和转录终止序列。
(a)信号序列构件
本文中描述的配制剂和组合物中的抗体不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽重组生产，所述异源多肽优选是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(例如受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列，α因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列)，酸性磷酸酶前导序列，白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列，或WO90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
(b)复制起点
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌，酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，来自2μ质粒的复制起点适合于酵母，而各种病毒复制起点(SV40，多瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。
(c)选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素，新霉素，甲氨蝶呤，或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素，霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是能够鉴定有能力摄取抗体编码核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR，谷氨酰胺合酶(GS)，胸苷激酶，金属硫蛋白-I和-II优选灵长类金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等。
例如，通过将转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR基因转化的细胞。在这些条件下，DHFR基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可使用内源DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
或者，通过将转化子在含有L-甲硫氨酸亚砜亚胺(Msx)(L-methioninesulfoximine)(GS的一种抑制剂)的培养基中进行培养来鉴定经GS基因转化的细胞。在这些条件下，GS基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可以与上文描述的DHFR选择/扩增系统组合地使用GS选择/扩增系统。
或者，可以通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素，新霉素，或G418的培养基中的细胞生长来选择经编码感兴趣抗体，野生型DHFR基因，和另一种选择标志诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利4,965,199。
适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb etal.,Nature 282:39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志。Jones,Genetics 85:12(1977).酵母宿主细胞基因组中存在trp1损害随之提供了用于通过在不存在色氨酸下生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van denBerg,Bio/Technology 8:135(1990)。还披露了适用于通过克鲁维氏酵母属的工业菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer et al.,Bio/Technology 9:968-975(1991)。
(d)启动子构件
表达和克隆载体一般包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码抗体的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶启动子，色氨酸(trp)启动子系统，和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适地插入真核表达载体。
适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，与氮代谢有关的降解酶，金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。
抗体在哺乳动物宿主细胞中自载体的转录可通过例如从病毒诸如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(诸如腺病毒2)，牛乳头瘤病毒，禽类肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙肝病毒，猿猴病毒40(SV40)基因组，或从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及从热休克启动子获得的启动子来控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes etal.,Nature 297:598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
(e)增强子元件构件
常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白，弹性蛋白酶，清蛋白，甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp 100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子，和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。可以将增强子剪接到载体中，位于抗体编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。
(f)转录终止构件
用于真核宿主细胞(酵母，真菌，昆虫，植物，动物，人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中披露的表达载体。
(g)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物，酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
可以在细菌中生产全长抗体，抗体融合蛋白，和抗体片段，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如在将治疗性抗体缀合至自身在肿瘤细胞破坏方面显示出效力的细胞毒剂(例如毒素)时。全长抗体在循环中具有较长的半衰期。大肠杆菌中的生成是较快的且较合算的。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利No.5,648,237(Carteret.al.),美国专利No..5,789,199(Joly et al.),美国专利No.5,840,523(Simmons etal.),其描述了使表达和分泌优化的翻译起始区(TIR)和信号序列。还可参见Charlton,Methods in Molecular Biology,卷248(B.K.C.Lo,编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254,其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段。表达后，可以在可溶性级分中自大肠杆菌细胞浆液分离抗体，并可以通过例如蛋白A或G柱(取决于同种型)来纯化抗体。可以实施最终的纯化，其类似于用于纯化在例如CHO细胞中表达的抗体的工艺。
在原核生物以外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。啤酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可获得许多其它属，种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)，威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，弯颈霉属(Tolypocladium)，和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。关于讨论酵母和丝状真菌用于生产治疗性蛋白质的用途的综述参见例如Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)。
可选择如下的某些真菌和酵母株，其中糖基化途径已经“人源化”，导致具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的生成。参见例如Li et al.，Nat.Biotech.24:210-215(2006)(记载了巴斯德毕赤氏酵母中糖基化途径的人源化)；及Gerngross et al.,见上文。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
还可利用棉，玉米，马铃薯，大豆，矮牵牛，番茄，浮萍(Leninaceae)，苜蓿(M.truncatula)，和烟草的植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177；6,040,498；6,420,548；7,125,978；和6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
可使用脊椎动物细胞作为宿主，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCCCRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1,ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCCCCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562,ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，诸如NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参阅例如Yazaki andWu,Methods in Molecular Biology,卷248(B.K.C.Lo,编,Humana Press，Totowa，NJ，2003),pp.255-268。
用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子，选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
(h)培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生产抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)，极限必需培养基(MEM,Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM,Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素，运铁蛋白或表皮生长因子)，盐(诸如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)，缓冲剂(诸如HEPES)，核苷酸(诸如腺苷和胸苷)，抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)，痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件(诸如温度，pH等)就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
(xi)抗体的纯化
在使用重组技术时，可以在细胞内，在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992)记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)，EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么一般首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析，疏水相互作用层析，凝胶电泳，透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，其中亲和层析是通常优选的纯化步骤之一。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.,EMBO J.5:1567-1575(1986))。蛋白L可用于纯化基于κ轻链的抗体(Nilson et al.，J.Immunol.Meth.164(1):33-40(1993))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级，乙醇沉淀，反相HPLC，硅土上的层析，肝素SEPHAROSETM上的层析，阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析，层析聚焦，SDS-PAGE，和硫酸铵沉淀。
一般而言，用于制备供研究，测试，和临床中使用的抗体的各种方法学是本领域完善建立的，与上文所述方法学一致，和/或是本领域技术人员认为适合于特定的感兴趣抗体的。
B.选择生物学活性抗体
可对如上所述生成的抗体进行一种或多种“生物学活性”测定法以选择从治疗观点看具有有益特性的抗体。可对抗体筛选其结合生成它时所针对的抗原的能力。例如，对于抗DR5抗体(例如drozitumab)，可在检测结合死亡受体5(DR5)的能力的测定法中评估抗体的抗原结合特性。
在另一个实施方案中，可通过例如饱和结合；ELISA；和/或竞争测定法(例如RIA)来测定抗体的亲和力。
还有，可对抗体进行其它生物学活性测定法，例如为了评估它作为治疗剂的有效性。此类测定法是本领域已知的且依赖于抗体的靶抗原和预定用途。
为了筛选结合感兴趣抗原上的特定表位的抗体，可实施常规交叉阻断测定法，诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow andDavid Lane(1988)中记载的。或者，可实施表位作图例如如Champe et al.，J.Biol.Chem.270：1388-1394(1995)所述来测定抗体是否结合感兴趣表位。
C.配制剂的制备
本文中提供的是制备液体配制剂的方法，该液体配制剂包含蛋白质和防止该液体配制剂中的该蛋白质氧化的NAT。该液体配制剂可以通过混合具有期望程度的纯度的该蛋白质与防止该液体配制剂中该蛋白质的氧化的NAT来制备。在某些实施方案中，要配制的蛋白质尚未经受在先冻干且本文中的感兴趣配制剂是水性配制剂。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在又一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。在某些实施方案中，该抗体是全长抗体。在一个实施方案中，该配制剂中的抗体是抗体片段，诸如F(ab’)2，在该情况中可能需要要解决全长抗体可能不发生的问题(诸如将抗体修剪成Fab)。该配制剂中存在的蛋白质的治疗有效量通过考虑例如施用的期望剂量体积和模式来决定。该配制剂中的例示性蛋白质浓度包括自约1mg/mL至超过约250mg/mL，自约1mg/mL至约250mg/mL，自约10mg/mL至约250mg/mL，自约15mg/mL至约225mg/mL，自约20mg/mL至约200mg/mL，自约25mg/mL至约175mg/mL，自约25mg/mL至约150mg/mL，自约25mg/mL至约100mg/mL，自约30mg/mL至约100mg/mL或自约45mg/mL至约55mg/mL。在一些实施方案中，本文中描述的蛋白质对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中选自由甲硫氨酸，半胱氨酸，组氨酸，色氨酸，和酪氨酸组成的组的氨基酸中的一种或多种对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的色氨酸对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质包含溶剂可及性表面积(SASA)大于约至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)的色氨酸残基。在一些实施方案中，该SASA大于约在一些实施方案中，该蛋白质包含SASA大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)的色氨酸残基。在一些实施方案中，该SASA大于约30％。在一些实施方案中，于自约4.0至约8.5的pH范围测量色氨酸残基的SASA。在一些实施方案中，于范围为自约5℃至约40℃的温度测量色氨酸残基的SASA。在一些实施方案中，于范围为自约0mM至约500mM的盐浓度测量色氨酸残基的SASA。在一些实施方案中，于约5.0至约7.5的pH，约5℃至约25℃的温度和约0mM至约500mM的盐浓度测量色氨酸残基的SASA。在一些实施方案中，该蛋白质包含至少一个通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法预测对氧化易感的色氨酸残基。在一些实施方案中，本文中提供的抗体对该抗体的Fab部分和/或Fc部分中的氧化易感。在一些实施方案中，本文中提供的抗体对该抗体的Fab部分中的色氨酸氨基酸处的氧化易感。在又一个实施方案中，对氧化易感的色氨酸氨基酸在该抗体的CDR中。在一些实施方案中，本文中提供的抗体对该抗体的Fc部分中的甲硫氨酸氨基酸处的氧化易感。在一些实施方案中，该液体配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。
通过本文中的发明提供的液体配制剂包含蛋白质和防止该液体配制剂中的蛋白质氧化的NAT。在一些实施方案中，该配制剂中的NAT处于自约0.1mM至超过约10mM的浓度，或高至该NAT在该配制剂中可溶的最高浓度。在某些实施方案中，该配制剂中的NAT处于自约0.1mM至约10mM，约0.1mM至约9mM，自约0.1mM至约8mM，自约0.1mM至约7mM，自约0.1mM至约6mM，自约0.1mM至约5mM，自约0.1mM至约4mM，自约0.1mM至约3mM，自约0.1mM至约2mM，自约0.3mM至约2mM，自约0.5mM至约2mM，自约0.6mM至约1.5mM，或自约0.8mM至约1.25mM的浓度。在一些实施方案中，该配制剂中的NAT是约1mM。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中的一种或多种氨基酸氧化。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中选自由色氨酸，甲硫氨酸，酪氨酸，组氨酸，和/或半胱氨酸组成的组的一种或多种氨基酸氧化。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中的色氨酸氧化。在一些实施方案中，该NAT防止由反应性氧种类(ROS)所致的该蛋白质的氧化。在又一个实施方案中，该反应性氧种类选自由单态氧，超氧化物(O2-)，烷氧基自由基，过氧基自由基，过氧化氢(H2O2)，三氧化二氢(H2O3)，三氧化氢自由基(HO3·)，臭氧(O3)，羟基自由基，和烷基过氧化物组成的组。在又一个实施方案中，该NAT防止抗体的Fab部分中的一种或多种氨基酸氧化。在另一个又一个实施方案中，该NAT防止抗体的该Fc部分中的一种或多种氨基酸氧化。
在一些实施方案中，通过本文中的发明提供的液体配制剂包含蛋白质和防止该液体配制剂中的蛋白质氧化的NAT，其中该蛋白质的氧化降低约40％至约100％。在一些实施方案中，该蛋白质的氧化降低约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围。
蛋白质中氧化的量可以例如使用RP-HPLC，LC/MS，或胰蛋白酶肽作图中的一种或多种来测定。在一些实施方案中，使用RP-HPLC，LC/MS，或胰蛋白酶肽作图中的一种或多种和下面的公式作为百分比测定蛋白质中的氧化：
在一些实施方案中，通过本文中的发明提供的液体配制剂包含蛋白质和防止该液体配制剂中的蛋白质氧化的NAT，其中不多于约40％至约0％的该蛋白质氧化。在一些实施方案中，不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围的该蛋白质氧化。
在一些实施方案中，通过本文中的发明提供的液体配制剂包含蛋白质和防止该液体配制剂中的蛋白质氧化的NAT，其中该蛋白质中至少一个氧化异变色氨酸的氧化降低约40％至约100％。在一些实施方案中，该氧化异变色氨酸的氧化降低约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围。在一些实施方案中，该蛋白质中氧化异变色氨酸残基中每一个的氧化降低约40％至约100％(诸如约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围)。
在一些实施方案中，通过本文中的发明提供的液体配制剂包含蛋白质和防止该液体配制剂中的蛋白质氧化的NAT，其中该蛋白质中不多于约40％至约0％的至少一个氧化异变色氨酸氧化。在一些实施方案中，不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围的氧化异变色氨酸氧化。在一些实施方案中，该蛋白质中氧化异变色氨酸残基中的每一个不多于约40％至约0％(诸如不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围)氧化。
在一些实施方案中，该液体配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。本发明的液体配制剂在pH缓冲溶液中制备。本发明的缓冲剂具有自约4.0至约9.0的范围中的pH。在某些实施方案中，该pH在自pH 4.0至8.5的范围中，在自pH 4.0至8.0的范围中，在自pH 4.0至7.5的范围中，在自pH 4.0至7.0的范围中，在自pH 4.0至6.5的范围中，在自pH 4.0至6.0的范围中，在自pH 4.0至5.5的范围中，在自pH 4.0至5.0的范围中，在自pH 4.0至4.5的范围中，在自pH 4.5至9.0的范围中，在自pH 5.0至9.0的范围中，在自pH 5.5至9.0的范围中，在自pH 6.0至9.0的范围中，在自pH6.5至9.0的范围中，在自pH 7.0至9.0的范围中，在自pH 7.5至9.0的范围中，在自pH 8.0至9.0的范围中，在自pH 8.5至9.0的范围中，在自pH 5.7至6.8的范围中，在自pH 5.8至6.5的范围中，在自pH 5.9至6.5的范围中，在自pH 6.0至6.5的范围中，或在自pH 6.2至6.5的范围中。在本发明的某些实施方案中，该液体配制剂具有6.2或约6.2的pH。在本发明的某些实施方案中，该液体配制剂具有6.0或约6.0的pH。会控制pH在这个范围内的缓冲剂的例子包括有机和无机酸和其盐。例如，乙酸盐/酯(例如组氨酸乙酸酯，精氨酸乙酸酯，乙酸钠)，琥珀酸盐/酯(例如组氨酸琥珀酸酯，精氨酸琥珀酸酯，琥珀酸钠)，葡萄糖酸盐/酯，磷酸盐/酯，富马酸盐/酯，草酸盐/酯，乳酸盐/酯，柠檬酸盐/酯，和其组合。缓冲剂浓度可以是自约1mM至约600mM，取决于例如缓冲剂和该配制剂的期望等张性。在某些实施方案中，该配制剂包含组氨酸缓冲剂(例如自约5mM至100mM的浓度)。组氨酸缓冲剂的例子包括组氨酸氯化物，组氨酸乙酸酯，组氨酸磷酸酯，组氨酸硫酸酯，组氨酸琥珀酸酯，等。在某些实施方案中，该配制剂包含组氨酸和精氨酸(例如组氨酸氯化物-精氨酸氯化物，组氨酸乙酸酯-精氨酸乙酸酯，组氨酸磷酸酯-精氨酸磷酸酯，组氨酸硫酸酯-精氨酸硫酸酯，组氨酸琥珀酸酯-精氨酸琥珀酸酯，等)。在某些实施方案中，该配制剂包含浓度自约5mM至100mM的组氨酸和浓度为50mM至500mM的精氨酸。在一个实施方案中，该配制剂包含组氨酸乙酸酯(例如约20mM)-精氨酸乙酸酯(例如约150mM)。在某些实施方案中，该配制剂包含组氨酸琥珀酸酯(例如约20mM)-精氨酸琥珀酸酯(例如约150mM)。在某些实施方案中，该配制剂中的组氨酸是自约10mM至约，35mM，约10mM至约30mM，约10mM至约25mM，约10mM至约20mM，约10mM至约15mM，约15mM至约35mM，约20mM至约35mM，约20mM至约30mM或约20mM至约25mM。在又一些实施方案中，该配制剂中的精氨酸是自约50mM至约500mM(例如约100mM，约150mM，或约200mM)。
本发明的液体配制剂可进一步包含糖，诸如二糖(例如海藻糖或蔗糖)。如本文中使用的，“糖”包括一般组成(CH2O)n和其衍生物，包括单糖，二糖，三糖，多糖，糖醇，还原糖，非还原糖，等。本文中的糖的例子包括葡萄糖，蔗糖，海藻糖，乳糖，果糖，麦芽糖，右旋糖酐，甘油(glycerin)，右旋糖酐，赤藻糖醇，甘油(glycerol)，阿糖醇，木糖醇(sylitol)，山梨糖醇，甘露糖醇，蜜二糖，松三糖，棉子糖，甘露三糖，水苏糖，麦芽糖，乳果糖，麦芽酮糖，葡萄糖醇，麦芽糖醇，乳糖醇，异麦芽酮糖，等。
可任选地将表面活性剂添加至该抗体配制剂。例示性表面活性剂包括非离子型表面活性剂，诸如聚山梨酯(例如聚山梨酯20，80，等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188，等)。所添加的表面活性剂的量使得它降低所配制的抗体的聚集和/或使配制剂中的颗粒形成降至最低和/或降低吸附。例如，表面活性剂可以以自约0.001％至超过约1.0％，重量/体积的量存在于该配制剂中。在一些实施方案中，表面活性剂以自约0.001％至约1.0％，自约0.001％至约0.5％，自约0.005％至约0.2％，自约0.01％至约0.1％，自约0.02％至约0.06％，或约0.03％至约0.05％，重量/体积的量存在于该配制剂中。在某些实施方案中，表面活性剂以0.04％或约0.04％，重量/体积的量存在于该配制剂中。在某些实施方案中，表面活性剂以0.02％或约0.02％，重量/体积的量存在于该配制剂中。在一个实施方案中，该配制剂不包含表面活性剂。
在一个实施方案中，该配制剂含有上文鉴定的药剂(例如抗体，缓冲剂，糖，和/或表面活性剂)且本质上没有一种或多种防腐剂，诸如苯甲醇，酚，间甲酚，氯丁醇和苄索氯铵。在另一个实施方案中，该配制剂中可包括防腐剂，特别是该配制剂是多剂配制剂的情况。防腐剂的浓度可以在自约0.1％至约2％，优选自约0.5％至约1％的范围中。该配制剂中可包括一种或多种其它药学可接受载剂，赋形剂或稳定剂，诸如Remington’sPharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中描述的那些，前提是它们对该配制剂的期望特征没有不利影响。本文中的例示性药学可接受赋形剂进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)描述于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一个方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖氨聚糖酶诸如软骨素酶组合。
该配制剂可进一步包含金属离子螯合剂。金属离子螯合剂是本领域技术人员公知的，而且包括但不必然限于氨基聚羧酸酯，EDTA(乙二胺四乙酸)，EGTA(乙二醇-二(β-氨基乙基醚)-N,N,N’,N’-四乙酸)，NTA(氮川三乙酸)，EDDS(乙二胺二琥珀酸盐)，PDTA(1,3-丙二胺四乙酸)，DTPA(二乙撑三胺五乙酸)，ADA(β-丙氨酸二乙酸)，MGCA(甲基甘氨酸二乙酸)，等。另外，本文中的一些实施方案包含膦酸盐/膦酸螯合剂。
组合物中存在张度剂以调节或维持液体的张度。当与带电荷的大生物分子诸如蛋白质和抗体一起使用时，它们还可充当“稳定剂”，因为它们能与氨基酸侧链的带电荷基团相互作用，由此减小分子间和内相互作用的潜力。张度剂可以以以重量计0.1％至25％之间，或更加优选以重量计1％至5％之间的任何量存在，对其它组分的相对量加以考虑。优选的张度剂包括多羟基糖醇，优选三羟基或更高级的糖醇，诸如甘油，赤藻糖醇，阿糖醇，木糖醇，山梨糖醇和甘露糖醇。
本文中的配制剂还可含有超过一种对所治疗的特定适应证必需的蛋白质或小分子药物，优选那些具有互补活性的，对其它蛋白质没有不利影响的。例如，在该抗体是抗DR5(例如drozitumab)的情况中，可将它与另一种药剂(例如化疗剂和抗肿瘤剂)组合。
在一些实施方案中，该配制剂用于体内施用。在一些实施方案中，该配制剂是无菌的。该配制剂可以通过穿过无菌过滤膜过滤而变得无菌。一般将本文中的治疗性配制剂放置入具有无菌存取口的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋。施用路径依照已知的且公认的方法，诸如以合适的方式，例如通过皮下，静脉内，腹膜内，肌肉内，动脉内，损害内，关节内，或玻璃体内路径的注射或输注，表面施用，吸入或通过持续释放或延长释放手段，通过单次或多次推注或较长一段时间上的输注。
本发明的液体配制剂可以是在贮存后稳定的。在一些实施方案中，该液体配制剂中的蛋白质在于约0至约5℃(诸如约1，2，3，或4℃任一)贮存至少约12个月(诸如至少约15，18，21，24，27，30，33，36个月任一，或更久)后是稳定的。在一些实施方案中，评估或测量该液体配制剂中的蛋白质的物理稳定性，化学稳定性，或生物学活性。可使用本领域知道的任何方法来评估稳定性和生物学活性。在一些实施方案中，通过贮存后该液体配制剂的蛋白质的氧化来测量稳定性。稳定性可以通过配制时间左右以及贮存后评估该配制剂中的抗体的物理稳定性，化学稳定性，和/或生物学活性来测量。物理和/或稳定性可以以多种不同方式定性和/或定量评估，包括评估聚集物形成(例如使用大小排阻层析，通过测量浊度，和/或通过视觉检查)；通过使用阳离子交换层析或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较还原的和完整抗体；肽图(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗体的生物学活性或抗原结合功能；等。不稳定性可导致聚集，脱酰胺(例如Asn脱酰胺)，氧化(例如Trp氧化)，异构化(例如Asp异构化)，修剪/水解/片段化(例如铰链区片段化)，琥珀酰亚胺形成，不配对的半胱氨酸，N端延伸，C端加工，糖基化差异，等。在一些实施方案中，使用RP-HPLC，LC/MS，或胰蛋白酶肽作图中的一种或多种测定蛋白质中的氧化。在一些实施方案中，使用RP-HPLC，LC/MS，或胰蛋白酶肽作图中的一种或多种和下面的公式作为百分比测定抗体中的氧化：
要用于体内施用的配制剂应当是无菌的。这容易通过在制备该配制剂之前或之后穿过无菌过滤膜过滤来实现。
本文中还提供的是生成液体配制剂或防止液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括将一定量的防止蛋白质氧化的NAT添加至液体配制剂。在某些实施方案中，该液体配制剂包含抗体。本文中提供的防止蛋白质氧化的NAT的量是自约0.1mM至约10mM或本文中公开的任何量。在一些实施方案中，该液体配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。
III.预测色氨酸氧化的方法
本文中的发明还提供一种预测液体配制剂中的蛋白质的残基(诸如色氨酸)对氧化的易感性的方法。可利用电脑使用蛋白质序列信息通过分子动力学(MD)模拟(诸如全原子MD模拟)确定的分子描述符将液体配制剂中的蛋白质归类为具有对氧化易感的残基(诸如色氨酸残基)。想要有能够在分子描述符的多样阵列间将液体配制剂中的蛋白质精确预测或归类为具有对氧化易感的残基的模型，诸如计算机学习算法。
提供了生成计算机学习算法来预测液体配制剂中的蛋白质的残基(诸如色氨酸)对氧化的易感性的方法。在一些实施方案中，该方法牵涉a)提供包含氧化热点残基的练习集，其与i)该氧化热点残基的多种分子描述符(例如附近天冬氨酸侧链氧，侧链SASA，δ碳SASA，附近正电荷，主链SASA，等等)的值和ii)该氧化热点残基是否对氧化易感有关；和b)将该练习集应用于机器学习算法(例如随机决策森林)，由此练习该机器学习算法以预测氧化易感性。在一些实施方案中，该方法进一步包括提供该机器学习算法(例如随机决策森林)以预测一个或多个具有该多种分子描述符的值的测试残基对氧化的易感性，包括将该一个或多个测试残基中的每一个的多种分子描述符应用于该机器学习算法(例如随机决策森林)和使用该机器学习算法的多数投票将该一个或多个测试残基归类为是否对氧化易感。在一些实施方案中，该分子描述符是电脑通过MD模拟确定的。在一些实施方案中，氧化测定法中至少约30％(诸如至少约35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或更多任一)的残基氧化指示对氧化的易感性。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。
在一些实施方案中，该机器学习算法是随机决策森林算法，其中引导技术与随机变量选择组合使多重决策树生长(Ho,T.K.Proceedings of the 3rd InternationalConference on Document Analysis and Recognition,Montreal,QC,14-16 August1995.pp.278-282；Ho,T.K.IEEE Transactions on Pattern Analysis and MachineIntelligence.20(8)832-844,1998)。这些多重决策树在本文中有时称为树的集体或随机决策森林。在一些实施方案中，该随机决策森林包含至少约20(此类至少约20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000，5000，10000或更多任一)个决策树(在本文中还称为“评估量”)。在一些实施方案中，为了该随机决策森林中的每一个树的每一个分支处的考虑随机选择的变量(在本文中还称为“特征”)的数目是至少约1(诸如至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或更多任一)。在一些实施方案中，为了该随机决策森林中的每一个树的每一个分支处的考虑随机选择的变量的数目(在本文中还称为“树深度”)介于约1至约20之间(诸如介于约1至15，1至10，1至5，5至20，5，15，或5至10任一之间，包括这些值之间的任何范围)。该变量包括多肽链中的氨基酸残基的分子描述符。在一些实施方案中，该分子描述符是电脑通过MD模拟确定的。在一些实施方案中，该分子描述符包括距测试残基δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距测试残基δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，测试残基侧链角，距测试残基δ碳在内的包装密度，测试残基主链角(stdev)，假π轨道的SASA，主链柔性，和距测试残基δ碳在内的总负电荷。在一些实施方案中，观察集合分成每一个树的子分支的次数的最大数目是至少约2(诸如至少约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，或更多任一)。在一些实施方案中，观察集合分成每一个树的子分支的次数的最大数目介于约2至约30之间(诸如在约2至20，2至15，2至10，2至5，5至30，5至25，5至20，5至15，或5至10任一之间，包括这些值之间的任何范围)。可以将关于测试残基的分子描述符的信息应用于该树的集体以获得关于该测试残基是否对氧化易感的预测。该预测是通过取得该集体中的所有树的预测的多数投票来进行的。
在一些实施方案中，为了使用MD模拟确定距测试残基δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，对于每一次分子模拟的每一帧，追踪距该测试残基的δ碳在内的所有原子，而且在这些原子中，对那些是任何天冬氨酸残基的侧链上的氧原子计数，并以此计数在该模拟的持续时间上的时间平均值计算最终值。
在一些实施方案中，为了使用MD模拟确定侧链SASA，对于每一次分子模拟的每一帧，通过将每一个原子半径与水分子的半径加到一起来生成在该模拟中的每一个原子上集中的球体的点，消除在邻近球体的半径内的所有点，并对所有剩余点之间的面积求和以生成SASA的值，并以该测试残基侧链原子在该模拟的持续时间上的平均SASA或此计算的标准偏差计算此描述符的最终值。
在一些实施方案中，为了使用MD模拟确定δ碳SASA，对于每一个模拟的每一帧，如上述所述计算测试残基δ碳的SASA，并以该测试残基δ碳在该模拟的持续时间上的平均SASA或此计算的标准偏差计算此描述符的最终值。
在一些实施方案中，为了使用MD模拟确定距测试残基δ碳在内的总正电荷，对于每一个模拟的每一帧，追踪与距该测试残基的δ碳在内的带电荷氨基酸侧链有关的所有原子，将这些原子的总正电荷加到一起，并以此数量在该模拟的持续时间上的平均值或此计算的标准偏差计算最终值。
在一些实施方案中，为了使用MD模拟确定主链SASA，对于每一次分子模拟的每一帧，如上文所述计算该测试残基的主链氮原子的SASA，并以该主链氮原子在该模拟的持续时间上的平均SASA或此计算的标准偏差计算此描述符的最终值。
在一些实施方案中，为了使用MD模拟确定测试残基侧链角，贯穿该模拟追踪该测试残基侧链的χ1和χ2角，并以该测试残基在最预示氧化的角区域中度过的时间的百分比计算此描述符，其中所述角区域是通过运行与该测试残基相同的氨基酸的许多不同残基的许多不同模拟，将这些模拟上的所有χ1和χ2角绘图，并将共同发生的角组合聚簇而确定的。
在一些实施方案中，以在该测试残基δ碳上集中的半径的球体内的蛋白质原子的时间平均数目，使用MD模拟计算距测试残基δ碳在内的包装密度。
在一些实施方案中，以在该模拟的持续时间上与该测试残基的主链有关的平均ψ角或此计算的标准偏差使用MD模拟计算测试残基主链角。
在一些实施方案中，为了使用MD模拟确定假π轨道的占据体积，以高度恰当近似被测试残基π轨道占据的空间的圆柱体的底对待该测试残基的侧链，追踪在该模拟期间落在该圆柱体的体积内的所有原子，为该模拟的每一帧计算落在该圆柱体的体积内的所有蛋白质原子的总体积，并以该测试残基π轨道被其它蛋白质原子占据的时间平均体积计算最终值。
在一些实施方案中，为了使用MD模拟确定主链柔性，在每一个模拟上计算该测试残基的主链氮的均方根波动。比对该模拟中的每一帧，为每一帧计算每一个氮原子旅行的距离，将每一帧的此距离平方，确定此平方距离在所有帧间的平均值，并以该平方距离的此平均值的平方根计算此描述符的最终值。
在一些实施方案中，为了使用MD模拟确定距测试残基δ碳在内的总负电荷，对于每一个模拟的每一帧，追踪与距该测试残基的δ碳在内的带电荷氨基酸侧链有关的所有原子，将这些原子的总负电荷加到一起，并以此数量在该模拟的持续时间上的时间平均值计算最终值。
例如，在一些实施方案中，提供的是一种生成用于预测液体配制剂中的蛋白质的测试残基是否对氧化易感的随机决策森林的方法，其包括a)提供包含氧化热点残基的练习集，其中每一个残基与i)该残基的多种分子描述符的值和ii)该残基是否对氧化易感有关；并b)将该练习集应用于随机决策森林，由此练习该随机决策森林以预测氧化易感性，其中该随机决策森林中的决策树个体的数目是至少约20(此类至少约20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000，5000，10000或更多任一)，为了该随机决策森林中的每一个决策树的每一个分支处的考虑随机选择的变量的最大数目是至少约1(诸如至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或更大任一)，且观察集合分成每一个树的子分支的次数的最大数目是至少约2(诸如至少约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，或更多任一)。在一些实施方案中，该多种分子描述符包括距测试残基δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距测试残基δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，测试残基侧链角，距测试残基δ碳在内的包装密度，测试残基主链角(stdev)，假π轨道的SASA，主链柔性，和距测试残基δ碳在内的总负电荷。在一些实施方案中，该多种分子描述符包括距测试残基δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距测试残基δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，和测试残基侧链角。在一些实施方案中，该多种分子描述符包含2和11个之间(诸如2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11个任一)的分子描述符。在一些实施方案中，该分子描述符是基于包含该测试残基的蛋白质的氨基酸序列确定的，诸如Fv区，当该蛋白质是抗体时。在一些实施方案中，该分子描述符是电脑使用液体配制剂中的蛋白质的参数通过MD模拟确定的。在一些实施方案中，该测试残基和该氧化热点残基是相同氨基酸的残基(例如，它们都是色氨酸残基)。在一些实施方案中，该测试残基和该氧化热点残基是色氨酸残基。在一些实施方案中，氧化测定法中至少约30％(诸如至少约35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或更多任一)的残基氧化指示对氧化的易感性。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。
在一些实施方案中，提供的是一种预测液体配制剂中的蛋白质的测试残基是否对氧化易感的方法，其包括a)测定该测试残基的多种分子描述符的值；并b)将该测试残基的多种分子描述符应用于在该多种分子描述符上练习的随机决策森林以预测氧化易感性，其中该随机决策森林的多数投票将该测试残基归类为是否对氧化易感。在一些实施方案中，该随机决策森林是如下练习的，即提供包含氧化热点残基的练习集，其中每一个残基与i)该残基的多种分子描述符的值；和ii)该残基是否对氧化易感有关；并将该练习集应用于随机决策森林，由此练习该随机决策森林以预测氧化易感性，其中该随机决策森林中决策树个体的数目是至少约20(此类至少约20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000，5000，10000或更多任一)，为了该随机决策森林中的每一个决策树的每一个分支处的考虑随机选择的变量的最大数目是至少约1(诸如至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或更多任一)，且观察集合分成每一个树的子分支的次数的最大数目是至少约2(诸如至少约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，或更多任一)。在一些实施方案中，该多种分子描述符包括距测试残基δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距测试残基δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，测试残基侧链角，距测试残基δ碳在内的包装密度，测试残基主链角(stdev)，假π轨道的SASA，主链柔性，和距测试残基δ碳在内的总负电荷。在一些实施方案中，该多种分子描述符包括距测试残基δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距测试残基δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，和测试残基侧链角。在一些实施方案中，该多种分子描述符包含2和11个之间(诸如2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11个任一)的分子描述符。在一些实施方案中，该分子描述符是基于包含该测试残基的蛋白质的氨基酸序列确定的，诸如Fv区，当该蛋白质是抗体时。在一些实施方案中，该分子描述符的值是电脑使用液体配制剂中的蛋白质的参数通过MD模拟确定的。在一些实施方案中，该测试残基和该氧化热点残基是相同氨基酸的残基(例如，它们都是色氨酸残基)。在一些实施方案中，该测试残基和该氧化热点残基是色氨酸残基。在一些实施方案中，氧化测定法中至少约30％(诸如至少约35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或更多任一)的残基氧化指示对氧化的易感性。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。
在一些实施方案中，提供的是一种预测液体配制剂中的蛋白质的测试色氨酸残基是否对氧化易感的方法，其包括a)测定该测试色氨酸残基的多种分子描述符的值；并b)将该测试色氨酸残基的多种分子描述符应用于在该多种分子描述符上练习的随机决策森林以预测氧化易感性，其中该随机决策森林的多数投票将该测试色氨酸残基归类为是否对氧化易感。在一些实施方案中，该随机决策森林是如下练习的，即提供包含色氨酸氧化热点残基的练习集，其中每一个残基与i)该残基的多种分子描述符的值；和ii)该残基是否对氧化易感有关；并将该练习集应用于随机决策森林，由此练习该随机决策森林以预测色氨酸氧化易感性，其中该随机决策森林中决策树个体的数目是至少约20(此类至少约20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000，5000，10000或更多任一)，为了该随机决策森林中的每一个决策树的每一个分支处的考虑随机选择的变量的最大数目是至少约1(诸如至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或更多任一)，且观察集合分成每一个树的子分支的次数的最大数目是至少约2(诸如至少约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，或更多任一)。在一些实施方案中，该多种分子描述符包括距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距色氨酸δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，色氨酸侧链角，距色氨酸δ碳在内的包装密度，色氨酸主链角(stdev)，假π轨道的SASA，主链柔性，和距色氨酸δ碳在内的总负电荷。在一些实施方案中，该多种分子描述符包括距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距色氨酸δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，和色氨酸侧链角。在一些实施方案中，该多种分子描述符包含2和11个之间(诸如2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11个任一)的分子描述符。在一些实施方案中，该分子描述符是基于包含该测试色氨酸的蛋白质的氨基酸序列确定的，诸如Fv区，当该蛋白质是抗体时。在一些实施方案中，该分子描述符的值是电脑使用液体配制剂中的蛋白质的参数通过MD模拟确定的。在一些实施方案中，氧化测定法中至少约30％(诸如至少约35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或更多任一)的残基氧化指示对氧化的易感性。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。
在一些实施方案中，提供的是一种确定液体配制剂中包含色氨酸残基的蛋白质是否对氧化易感的方法，其包括a)测定该蛋白质中的每一个色氨酸残基的多种分子描述符的值；并b)将该多种分子描述符应用于在该多种分子描述符上练习的随机决策森林以预测氧化易感性，其中每一个色氨酸残基的该随机决策森林的多数投票将该残基归类为是否对氧化易感，且其中如果该随机决策森林将至少一个色氨酸残基归类为对氧化易感的话，该蛋白质确定为包含对氧化易感的色氨酸残基。在一些实施方案中，该随机决策森林是如下练习的，即提供包含色氨酸氧化热点残基的练习集，其中每一个残基与i)该残基的多种分子描述符的值；和ii)该残基是否对氧化易感有关；并将该练习集应用于随机决策森林，由此练习该随机决策森林以预测色氨酸氧化易感性，其中该随机决策森林中决策树个体的数目是至少约20(诸如至少约20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000，5000，10000或更多任一)，为了该随机决策森林中的每一个决策树的每一个分支处的考虑随机选择的变量的最大数目是至少约1(诸如至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或更多任一)，且观察集合分成每一个树的子分支的次数的最大数目是至少约2(诸如至少约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，或更多任一)。在一些实施方案中，该多种分子描述符包括距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距色氨酸δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，色氨酸侧链角，距色氨酸δ碳在内的包装密度，色氨酸主链角(stdev)，假π轨道的SASA，主链柔性，和距色氨酸δ碳在内的总负电荷。在一些实施方案中，该多种分子描述符包括距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距色氨酸δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，和色氨酸侧链角。在一些实施方案中，该多种分子描述符包含2和11个之间(诸如2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11个任一)的分子描述符。在一些实施方案中，每一个色氨酸残基的分子描述符是基于包含该色氨酸残基的蛋白质的氨基酸序列确定的，诸如Fv区，当该蛋白质是抗体时。在一些实施方案中，该分子描述符的值是电脑使用液体配制剂中的蛋白质的参数通过MD模拟确定的。在一些实施方案中，氧化测定法中至少约30％(诸如至少约35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或更多任一)的残基氧化指示对氧化的易感性。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。
IV.降低氧化的方法
本文中的发明还提供一种降低液体配制剂中的蛋白质的氧化的方法，其包括添加一定量的防止该液体配制剂中的蛋白质氧化的NAT。在一些实施方案中，该蛋白质对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的甲硫氨酸，半胱氨酸，组氨酸，色氨酸，和/或酪氨酸对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的色氨酸对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质包含至少一个溶剂可及性表面积(SASA)大于约至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)的色氨酸残基。在一些实施方案中，该SASA大于约在一些实施方案中，该蛋白质包含至少一个SASA大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)的色氨酸残基。在一些实施方案中，该SASA大于约30％。在一些实施方案中，于自约4.0至约8.5的pH范围测量色氨酸残基的SASA。在一些实施方案中，于范围为自约5℃至约40℃的温度测量色氨酸残基的SASA。在一些实施方案中，于范围为自约0mM至约500mM的盐浓度测量色氨酸残基的SASA。在一些实施方案中，于约5.0至约7.5的pH，约5℃至约25℃的温度和约0mM至约200mM的盐浓度测量色氨酸残基的SASA。在一些实施方案中，该SASA是电脑通过全原子分子动力学模拟确定的。在一些实施方案中，该蛋白质包含至少一个通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法预测对氧化易感的色氨酸残基。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)，或高至该NAT在该配制剂可溶的最高浓度。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是约1mM。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中的一个或多个色氨酸氨基酸氧化。在一些实施方案中，该蛋白质的氧化降低约40％至约100％(诸如通过约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，不多于约40％至约0％(诸如不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围)的该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该NAT防止由反应性氧种类(ROS)所致的该蛋白质的氧化。在又一个实施方案中，该反应性氧种类选自由单态氧，超氧化物(O2-)，烷氧基自由基，过氧基自由基，过氧化氢(H2O2)，三氧化二氢(H2O3)，三氧化氢自由基(HO3·)，臭氧(O3)，羟基自由基，和烷基过氧化物组成的组。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。例如，本发明的配制剂可包含单克隆抗体，本文中提供的防止蛋白质氧化的NAT，和将该配制剂的pH维持于期望水平的缓冲剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该配制剂是水性的。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质(例如，该配制剂是包含两种或更多种蛋白质的共配制剂)。
在一些实施方案中，提供的是一种降低液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括将一定量的防止蛋白质氧化的NAT添加至该配制剂，其中该蛋白质包含至少一个SASA大于约至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)的色氨酸残基。在一些实施方案中，该蛋白质包含至少一个SASA大于约的色氨酸残基。在一些实施方案中，该SASA是电脑通过全原子分子动力学模拟确定的。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)，或高至该NAT在该配制剂中可溶的最高浓度。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是约1mM。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中的一个或多个色氨酸氨基酸氧化。在一些实施方案中，该蛋白质的氧化降低约40％至约100％(诸如约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，不多于约40％至约0％(诸如不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围)的该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该NAT防止由反应性氧种类(ROS)所致的该蛋白质的氧化。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该抗体衍生自IgG1抗体序列。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。
在一些实施方案中，提供的是一种降低液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括测定该蛋白质中的色氨酸残基的SASA值并如果至少一个色氨酸残基具有大于约至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)的SASA的话，将一定量的防止蛋白质氧化的NAT添加至该配制剂。在一些实施方案中，该蛋白质包含至少一个SASA大于约的色氨酸残基。在一些实施方案中，该SASA是电脑通过全原子分子动力学模拟确定的。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)，或高至该NAT在该配制剂可溶的最高浓度。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是约1mM。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中的一个或多个色氨酸氨基酸氧化。在一些实施方案中，该蛋白质的氧化降低约40％至约100％(诸如约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，不多于约40％至约0％(诸如不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围)的该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该NAT防止由反应性氧种类(ROS)所致的该蛋白质的氧化。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该抗体衍生自IgG1抗体序列。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。
在一些实施方案中，提供的是一种降低液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括测定该蛋白质中的色氨酸残基的SASA值并基于具有大于约 至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)的SASA的色氨酸残基的数目将一定量的NAT添加至该配制剂，其中添加至该配制剂的该量的NAT防止该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该SASA是电脑通过全原子分子动力学模拟确定的。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是约1mM。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中的一个或多个色氨酸氨基酸氧化。在一些实施方案中，该蛋白质具有超过一个SASA大于(或大于30％)的色氨酸残基且添加足够量的NAT以防止每一个色氨酸残基氧化。在一些实施方案中，该蛋白质的氧化降低约40％至约100％(诸如约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，不多于约40％至约0％(诸如不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围)的该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该NAT防止由反应性氧种类(ROS)所致的该蛋白质的氧化。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该抗体衍生自IgG1抗体序列。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。
在一些实施方案中，提供的是一种降低液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括将一定量的防止蛋白质氧化的NAT添加至该配制剂，其中该蛋白质包含至少一个SASA大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)的色氨酸残基。在一些实施方案中，该蛋白质包含至少一个SASA大于约30％的色氨酸残基。在一些实施方案中，该SASA是电脑通过全原子分子动力学模拟确定的。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)，或高至该NAT在该配制剂中可溶的最高浓度。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是约1mM。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中的一个或多个色氨酸氨基酸氧化。在一些实施方案中，该蛋白质的氧化降低约40％至约100％(诸如约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，不多于约40％至约0％(诸如不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围)的该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该NAT防止由反应性氧种类(ROS)所致的该蛋白质的氧化。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该抗体衍生自IgG1抗体序列。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。
在一些实施方案中，提供的是一种降低液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括测定该蛋白质中的色氨酸残基的SASA值并如果至少一个色氨酸残基具有大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)的SASA的话，将一定量的防止蛋白质氧化的NAT添加至该配制剂。在一些实施方案中，该蛋白质包含至少一个SASA大于约30％的色氨酸残基。在一些实施方案中，该SASA是电脑通过全原子分子动力学模拟确定的。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)，或高至该NAT在该配制剂中可溶的最高浓度。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是约1mM。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中的一个或多个色氨酸氨基酸氧化。在一些实施方案中，该蛋白质的氧化降低约40％至约100％(诸如约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，不多于约40％至约0％(诸如不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围)的该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该NAT防止由反应性氧种类(ROS)所致的该蛋白质的氧化。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该抗体衍生自IgG1抗体序列。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。
在一些实施方案中，提供的是一种降低液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括测定该蛋白质中的色氨酸残基的SASA值并基于具有大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)的SASA的色氨酸残基的数目将一定量的NAT添加至该配制剂，其中添加至该配制剂的该量的NAT防止该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该SASA是电脑通过全原子分子动力学模拟确定的。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是约1mM。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中的一个或多个色氨酸氨基酸氧化。在一些实施方案中，该蛋白质的氧化降低约40％至约100％(诸如约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，不多于约40％至约0％(诸如不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围)的该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该NAT防止由反应性氧种类(ROS)所致的该蛋白质的氧化。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该抗体衍生自IgG1抗体序列。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。
SASA可以使用电脑全原子分子动力学模拟方法来计算，其描述于Sharma,V.etal.(见上文)，更加详细地描述于下文实施例。
在一些实施方案中，提供的是一种降低液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括将一定量的防止蛋白质氧化的抗氧化剂添加至该配制剂，其中该蛋白质包含至少一个通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法预测对氧化易感的色氨酸残基。在一些实施方案中，该抗氧化剂是N-乙酰基色氨酸(NAT)。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)，或高至该NAT在该配制剂中可溶的最高浓度。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是约1mM。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中的一个或多个色氨酸氨基酸氧化。在一些实施方案中，该蛋白质的氧化降低约40％至约100％(诸如约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，不多于约40％至约0％(诸如不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围)的该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该NAT防止由反应性氧种类(ROS)所致的该蛋白质的氧化。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。在一些实施方案中，该机器学习算法是依照上文描述的任何随机决策森林的随机决策森林。在一些实施方案中，该随机决策森林是以至少约20(此类至少约20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000，5000，10000或更多任一)个评估量，至少约1(诸如至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或更多任一)个特征，和至少约2(诸如至少约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，或更多任一)的树深度练习的。在一些实施方案中，该多种分子描述符包括距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距色氨酸δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，色氨酸侧链角，距色氨酸δ碳在内的包装密度，色氨酸主链角(stdev)，假π轨道的SASA，主链柔性，和距色氨酸δ碳在内的总负电荷。在一些实施方案中，该多种分子描述符包含2和11个之间(诸如2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11个任一)的分子描述符。在一些实施方案中，该色氨酸分子描述符的值是电脑使用液体配制剂中的蛋白质的参数通过MD模拟确定的。在一些实施方案中，氧化测定法中至少约30％(诸如至少约35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或更多任一)的残基氧化指示对氧化的易感性。
在一些实施方案中，提供的是一种降低液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括将一定量的防止蛋白质氧化的NAT添加至该配制剂，其中该蛋白质包含至少一个通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法预测对氧化易感的色氨酸残基。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)，或高至该NAT在该配制剂中可溶的最高浓度。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是约1mM。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中的一个或多个色氨酸氨基酸氧化。在一些实施方案中，该蛋白质的氧化降低约40％至约100％(诸如约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，不多于约40％至约0％(诸如不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围)的该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该NAT防止由反应性氧种类(ROS)所致的该蛋白质的氧化。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。在一些实施方案中，该机器学习算法是依照上文描述的任何随机决策森林的随机决策森林。在一些实施方案中，该随机决策森林是以至少约20(此类至少约20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000，5000，10000或更多任一)个评估量，至少约1(诸如至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或更多任一)个特征，和至少约2(诸如至少约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，或更多任一)的树深度练习的。在一些实施方案中，该多种分子描述符包括距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距色氨酸δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，色氨酸侧链角，距色氨酸δ碳在内的包装密度，色氨酸主链角(stdev)，假π轨道的SASA，主链柔性，和距色氨酸δ碳在内的总负电荷。在一些实施方案中，该多种分子描述符包含2和11个之间(诸如2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11个任一)的分子描述符。在一些实施方案中，该色氨酸分子描述符的值是电脑使用液体配制剂中的蛋白质的参数通过MD模拟确定的。在一些实施方案中，氧化测定法中至少约30％(诸如至少约35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或更多任一)的残基氧化指示对氧化的易感性。
在一些实施方案中，提供的是一种降低液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括基于通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法预测对氧化易感的色氨酸残基的数目将一定量的NAT添加至该配制剂。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)，或高至该NAT在该配制剂中可溶的最高浓度。在一些实施方案中，添加至该配制剂的NAT的量是约1mM。在一些实施方案中，该NAT防止该蛋白质中的一个或多个色氨酸氨基酸氧化。在一些实施方案中，该蛋白质的氧化降低约40％至约100％(诸如约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，不多于约40％至约0％(诸如不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围)的该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该NAT防止由反应性氧种类(ROS)所致的该蛋白质的氧化。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。在一些实施方案中，该机器学习算法是依照上文描述的任何随机决策森林的随机决策森林。在一些实施方案中，该随机决策森林是以至少约20(此类至少约20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000，5000，10000或更多任一)个评估量，至少约1(诸如至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或更多任一)个特征，和至少约2(诸如至少约任一2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，或更多)的树深度练习的。在一些实施方案中，该多种分子描述符包括距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距色氨酸δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，色氨酸侧链角，距色氨酸δ碳在内的包装密度，色氨酸主链角(stdev)，假π轨道的SASA，主链柔性，和距色氨酸δ碳在内的总负电荷。在一些实施方案中，该多种分子描述符包含2和11个之间(诸如2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11个任一)的分子描述符。在一些实施方案中，该色氨酸分子描述符的值是电脑使用液体配制剂中的蛋白质的参数通过MD模拟确定的。在一些实施方案中，氧化测定法中至少约30％(诸如至少约35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或更多任一)的残基氧化指示对氧化的易感性。
在一些实施方案中，提供的是一种降低液体配制剂中的蛋白质氧化的方法，其包括在该蛋白质中引入氨基酸替代以将一个或多个预测对氧化易感的色氨酸残基用不经受氧化的氨基酸残基替换，其中该预测是通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法。在一些实施方案中，将该一个或多个色氨酸残基中的每一个用独立选自由酪氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丙氨酸，和缬氨酸组成的组的残基替换。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含至少一种依照本文中描述的任何蛋白质的另外的蛋白质。在一些实施方案中，该机器学习算法是依照上文描述的任何随机决策森林的随机决策森林。在一些实施方案中，该随机决策森林是以至少约20(此类至少约20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000，5000，10000或更多任一)个评估量，至少约1(诸如至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或更多任一)个特征，和至少约2(诸如至少约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，或更多任一)的树深度练习的。在一些实施方案中，该多种分子描述符包括距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距色氨酸δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，色氨酸侧链角，距色氨酸δ碳在内的包装密度，色氨酸主链角(stdev)，假π轨道的SASA，主链柔性，和距色氨酸δ碳在内的总负电荷。在一些实施方案中，该多种分子描述符包含2和11个之间(诸如2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11个任一)的分子描述符。在一些实施方案中，该色氨酸分子描述符的值是电脑使用液体配制剂中的蛋白质的参数通过MD模拟确定的。在一些实施方案中，氧化测定法中至少约30％(诸如至少约35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或更多任一)的残基氧化指示对氧化的易感性。
V.筛选方法
本文中的发明还提供一种对液体配制剂筛选降低的蛋白质氧化的方法。在一些实施方案中，该蛋白质对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的甲硫氨酸，半胱氨酸，组氨酸，色氨酸，和/或酪氨酸对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质中的色氨酸对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质包含至少一个溶剂可及性表面积(SASA)大于约至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)的色氨酸残基。在一些实施方案中，该SASA大于约在一些实施方案中，该蛋白质包含至少一个SASA大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)的色氨酸残基。在一些实施方案中，该SASA大于约30％。在一些实施方案中，该蛋白质中的色氨酸通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法预测对氧化易感。在一些实施方案中，该蛋白质的氧化降低约40％至约100％(诸如约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，不多于约40％至约0％(诸如不多于约40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，或0％任一，包括这些值之间的任何范围)的该蛋白质氧化。在一些实施方案中，该配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该抗体衍生自IgG1抗体序列。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。
在一些实施方案中，提供的是一种对液体配制剂筛选降低的蛋白质氧化的方法，其中该蛋白质包含至少一个i)SASA大于约至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)；或ii)SASA大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)的色氨酸残基，该方法包括a)将自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)的N-乙酰基-色氨酸(NAT)添加至包含该蛋白质的液体配制剂，b)将自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)的2,2’-偶氮二(2-氨基丙烷)二氢氯化物(AAPH)添加至该液体配制剂，c)将该包含该蛋白质，NAT和AAPH的液体配制剂于约35℃至约45℃(诸如约35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，或45℃任一，包括这些值之间的任何范围)温育约10小时至约20小时(诸如约10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20小时任一，包括这些值之间的任何范围)，并d)对该蛋白质测量该蛋白质中色氨酸残基的氧化，其中包含一定量的NAT，导致该蛋白质中的色氨酸残基不多于约20％(诸如不多于约20，15，10，5，4，3，2，或1％任一，包括这些值之间的任何范围)氧化的液体配制剂对于降低的该蛋白质氧化是合适的配制剂。在一些实施方案中，该SASA是电脑通过全原子分子动力学模拟确定的。在一些实施方案中，该液体配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。在一些实施方案中，该抗体衍生自IgG1抗体序列。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。
在一些实施方案中，提供的是一种对液体配制剂筛选降低的蛋白质氧化的方法，其包括a)测定该蛋白质中色氨酸残基的SASA值，b)基于具有i)大于约至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)的SASA；或ii)大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)的SASA的色氨酸残基的数目将一定量的NAT添加至该液体配制剂，c)将自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)的2,2’-偶氮二(2-氨基丙烷)二氢氯化物(AAPH)添加至该液体配制剂，d)将包含该蛋白质，N-乙酰基-色氨酸和AAPH的液体配制剂于约35℃至约45℃(诸如约35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，或45℃任一，包括这些值之间的任何范围)温育约10小时至约20小时(诸如约10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20小时任一，包括这些值之间的任何范围)，并e)对该蛋白质测量该蛋白质中色氨酸残基的氧化，其中包含一定量的NAT，导致该蛋白质中的色氨酸残基不多于约20％(诸如不多于约20，15，10，5，4，3，2，或1％任一，包括这些值之间的任何范围)氧化的液体配制剂对于降低的该蛋白质氧化是合适的配制剂。在一些实施方案中，该SASA是电脑通过全原子分子动力学模拟确定的。在一些实施方案中，该液体配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。在一些实施方案中，该抗体衍生自IgG1抗体序列。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。
在一些实施方案中，提供的是一种对液体配制剂筛选降低的蛋白质氧化的方法，其中该蛋白质包含至少一个通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法预测对氧化易感的色氨酸残基，该方法包括a)将自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)的N-乙酰基-色氨酸(NAT)添加至包含该蛋白质的液体配制剂，b)将自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)的2,2’-偶氮二(2-氨基丙烷)二氢氯化物(AAPH)添加至该液体配制剂，c)将包含该蛋白质，NAT和AAPH的液体配制剂于约35℃至约45℃(诸如约35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，或45℃任一，包括这些值之间的任何范围)温育约10小时至约20小时(诸如约10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20小时任一，包括这些值之间的任何范围)，并d)对该蛋白质测量该蛋白质中色氨酸残基的氧化，其中包含一定量的NAT，导致该蛋白质中的色氨酸残基不多于约20％(诸如不多于约20，15，10，5，4，3，2，或1％任一，包括这些值之间的任何范围)氧化的液体配制剂对于降低的该蛋白质氧化是合适的配制剂。在一些实施方案中，该液体配制剂中的蛋白质(例如抗体)浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。在一些实施方案中，该机器学习算法是依照上文描述的任何随机决策森林的随机决策森林。在一些实施方案中，该随机决策森林是以至少约20(此类至少约20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000，5000，10000或更多任一)个评估量，至少约1(诸如至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或更多任一)个特征，和至少约2(诸如至少约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，或更多任一)的树深度练习的。在一些实施方案中，该多种分子描述符包括距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，距色氨酸δ碳在内的总正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，色氨酸侧链角，距色氨酸δ碳在内的包装密度，色氨酸主链角(stdev)，假π轨道的SASA，主链柔性，和距色氨酸δ碳在内的总负电荷。在一些实施方案中，该多种分子描述符包含2和11个之间(诸如2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11个任一)的分子描述符。在一些实施方案中，该色氨酸分子描述符的值是电脑使用液体配制剂中的蛋白质的参数通过MD模拟确定的。在一些实施方案中，氧化测定法中至少约30％(诸如至少约35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或更多任一)的残基氧化指示对氧化的易感性。
VI.蛋白质配制剂的施用
依照已知方法将液体配制剂施用于需要用蛋白质(例如抗体)治疗的哺乳动物，优选人，诸如静脉内施用，作为推注或通过一段时间里的连续输注，通过肌肉内，腹膜内，脑脊髓内，皮下，关节内，滑膜内，鞘内，口服，表面，吸入，或玻璃体内路径。在一个实施方案中，通过静脉内施用将液体配制剂施用于哺乳动物。为了此类目的，可例如使用注射器或经IV线注射配制剂。在一个实施方案中，通过皮下施用将液体配制剂施用于哺乳动物。在还有另一个实施方案中，通过玻璃体内施用来施用液体配制剂。
蛋白质的适宜剂量(“治疗有效量”)将取决于例如要治疗的状况，状况的严重性和过程，施用蛋白质是为了预防还是治疗目的，先前的疗法，患者的临床史和对蛋白质的响应，所使用的蛋白质的类型，和主治内科医师的斟酌。将蛋白质以一次或在一系列治疗中合适地施用于患者，而且可以在诊断后的任何时间施用于患者。可作为唯一治疗或与在治疗所讨论的状况中有用的其它药物或疗法联合施用蛋白质。如本文中使用的，术语“治疗”指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。那些需要治疗的包括那些早就具有病症的以及那些要预防病症的。如本文中使用的，“病症”指会受益于治疗的任何状况，包括但不限于慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物趋向于所讨论病症的病理状况。
在药理学意义上，在本发明的语境中，蛋白质(例如抗体)的“治疗有效量”指有效预防或治疗抗体可有效治疗的病症的量。在一些实施方案中，所施用的蛋白质的治疗有效量会在约0.1至约50mg/kg(诸如约0.3至约20mg/kg，或约0.3至约15mg/kg)患者体重的范围中，无论是通过一次或多次施用。在一些实施方案中，作为日剂量，或作为多个日剂量施用治疗有效量的蛋白质。在一些实施方案中，不及每天频繁地施用治疗有效量的蛋白质，诸如每周或每月。例如，可以以每一或多周(诸如每1，2，3，或4周或更多，或每1，2，3，4，5，或6个月或更多)约100至约400mg(诸如约100，150，200，250，300，350，或400mg任一，包括这些值之间的任何范围)的剂量施用蛋白质，或以每一或多周(诸如每1，2，3，或4周或更多，或每1，2，3，4，5，或6个月或更多)约1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，15.0，或20.0mg/kg的剂量施用蛋白质。剂量可以作为单剂或作为多剂(例如2，3，4，或更多剂)施用，诸如输注。此疗法的进展容易通过常规技术来监测。
VII.用于测量NAT降解的方法
本文中的发明还提供一种对液体配制剂筛选降低的蛋白质氧化的方法。为了有效保护配制剂中的蛋白质，该配制剂中的NAT必须胜过易感Trp残基牺牲性氧化；因而，可预期NAT降解在含有NAT的药物产物的操作和贮存期间形成。了解NAT的比率(rate)和降解途径是重要的，因为该药物产物中存在的降解NAT种类会连同治疗性蛋白质施用于患者。文献中关于NAT降解的一份报告使用二维大小排阻层析诱捕方法，连同多重反应监测LC-MS方法，来鉴定和量化在于升高的温度长期贮存后的浓缩的HSA溶液中观察到的两种NAT降解物(N-Ac-PIC，2b，和N-Ac-3a,8a-二羟基-PIC，3b)(Fang，L.，et al.,J Chromatogr A,2011,1218(41):7316-24)。Trp自身的降解已经得到更为全面的研究(Ji，J.A.，et al.，J Pharm Sci，2009，98(12):4485-500；Simat,T.J.and H.Steinhart,J Agric Food Chem,1998,46(2):490-498)，而且已经报告了群体大得多的降解物，包括PIC(2a)，氧吲哚基丙氨酸(Oia，4a)，二氧吲哚基丙氨酸(DiOia，5a)，犬尿氨酸(Kyn，6a)，N-甲酰基-犬尿氨酸(NFK，7a)，和5-羟基-Trp(5-OH-Trp，8a)。
在一些方面，本发明提供用来测量包含N-乙酰基色氨酸的组合物中的N-乙酰基色氨酸(NAT)降解的方法，该方法包括a)将该组合物应用于反相层析材料，其中将该组合物加载到在包含流动相A和流动相B的溶液中平衡的该层析材料上，其中流动相A在水中包含酸且流动相B在有机溶剂中包含酸，b)用包含流动相A和流动相B的溶液自该反相层析材料洗脱该组合物，其中流动相B对流动相A的比与步骤a)相比升高，其中NAT降解物与完整NAT分开地自该层析洗脱，c)量化该NAT降解物和该完整NAT。在多个实施方案中，步骤a)中流动相B对流动相A的比是约1:99，2:98，3:97，4:96，5:95，6:94，7:93，8:92，9:91，或10:90任一。在多个实施方案中，步骤a)中流动相B对流动相A的比是约2:98。在一些实施方案中，步骤b)中流动相B对流动相A的比线性升高。在其它实施方案中，步骤b)中流动相B对流动相A的比逐步升高。在一些实施方案中，该有机溶剂是乙腈。
在一些方面，本发明提供用来测量包含N-乙酰基色氨酸的组合物中的N-乙酰基色氨酸(NAT)降解的方法，该方法包括a)将该组合物应用于反相层析材料，其中将该组合物加载到在包含流动相A和流动相B的溶液中平衡的该层析材料上，其中流动相A在水中包含酸且流动相B在乙腈中包含酸，b)用包含流动相A和流动相B的溶液自该反相层析材料洗脱该组合物，其中流动相B对流动相A的比与步骤a)相比升高，其中NAT降解物与完整NAT分开地自该层析洗脱，c)量化该NAT降解物和该完整NAT。在多个实施方案中，步骤a)中流动相B对流动相A的比是约1:99，2:98，3:97，4:96，5:95，6:94，7:93，8:92，9:91，或10:90任一。在多个实施方案中，步骤a)中流动相B对流动相A的比是约2:98。在一些实施方案中，步骤b)中流动相B对流动相A的比线性升高。在其它实施方案中，步骤b)中流动相B对流动相A的比逐步升高。
在一些实施方案中，该层析的流速是约0.25mL/分钟，0.5mL/分钟，0.75mL/分钟，1.0mL/分钟，1.25mL/分钟，1.5mL/分钟，1.75mL/分钟，2.0mL/分钟，或2.5mL/分钟任一。在一些实施方案中，该层析的流速是约1.0mL/min任一。
在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约25:75，28:72，30:70，32:68，或35:65任一。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约30:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在自层析开始起约14，15，16，17或18分钟任一中升高至约25:75，28:72，30:70，32:68，或35:65任一。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在自层析开始起约16分钟中升高至约25:75，28:72，30:70，32:68，或35:65任一。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约30:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在自层析开始起约16分钟中升高至约30:70。在一些实施方案中，流速是约1mL/min。
在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约85:15，90:10，或95:5任一。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约30:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在自层析开始起约16，17，18，19或20分钟任一中升高至约85:15，90:10，或95:5任一。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在自层析开始起约18.1分钟中升高至约85:15，90:10，或95:5任一。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约90:10。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在自层析开始起约18.1分钟中升高至约90:10。在一些实施方案中，流速是约1mL/min。
在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约24:76，25:75，26:70，27:73，或28:71任一。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约26:74。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在自层析开始起约12，13，14，15或16分钟任一中升高至约24:76，25:75，26:70，27:73，或28:71任一。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在自层析开始起约14分钟中升高至约24:76，25:75，26:70，27:73，或28:71任一。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约26:74。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在自层析开始起约14分钟中升高至约26:74。在一些实施方案中，流速是约1mL/min。
在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约85:15，90:10，或95:5任一。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约30:70。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在自层析开始起约14.5，15.5，16.5，17.5或18.5分钟任一中升高至约85:15，90:10，或95:5任一。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在自层析开始起约16.5分钟中升高至约85:15，90:10，或95:5任一。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比升高至约90:10。在一些实施方案中，流动相B对流动相A的比在自层析开始起约16.5分钟中升高至约90:10。在一些实施方案中，流速是约1mL/min。
在一些实施方案中，流动相A在水中包含约0.01％，0.05％，0.1％，0.5％，或1.0％(v/v)任一的酸。在一些实施方案中，流动相A在水中包含约0.1％酸。在一些实施方案中，该酸是甲酸。在一些实施方案中，流动相A在水中包含约0.1％甲酸。在一些实施方案中，流动相B在乙腈中包含约0.01％，0.05％，0.1％，0.5％，或1.0％(v/v)任一的酸。在一些实施方案中，流动相B在乙腈中包含约0.1％酸。在一些实施方案中，该酸是甲酸。在一些实施方案中，流动相B在乙腈中包含约0.1％甲酸。在一些实施方案中，流动相A在水中包含约0.1％甲酸且流动相B在乙腈中包含约0.1％甲酸。
在一些方面，本发明提供用来测量包含N-乙酰基色氨酸的组合物中的N-乙酰基色氨酸(NAT)降解的方法，该方法包括a)将该组合物应用于反相层析材料，其中将该组合物加载到在包含流动相A和流动相B的溶液中平衡的该层析材料上，其中流动相A在水中包含0.1％(v/v)甲酸且流动相B在有机溶剂中包含0.1％(v/v)甲酸，流动相B对流动相A的比是2:98；b)用包含流动相A和流动相B的溶液自该反相层析材料洗脱该组合物，其中流动相B对流动相A的比升高至约70:30，然后升高至约90:10，其中NAT降解物与完整NAT分开地自该层析洗脱，c)量化该NAT降解物和该完整NAT。在一些实施方案中，流速是约1.0mL/分钟且流动相B对流动相A的比在层析开始后约16分钟中升高至约70:30，然后在自层析开始起约18分钟后升高至约90:10。在一些实施方案中，该有机溶剂是乙腈。
在一些方面，本发明提供用来测量包含N-乙酰基色氨酸的组合物中的N-乙酰基色氨酸(NAT)降解的方法，该方法包括a)将该组合物应用于反相层析材料，其中将该组合物加载到在包含流动相A和流动相B的溶液中平衡的该层析材料上，其中流动相A在水中包含0.1％(v/v)甲酸且流动相B在乙腈中包含0.1％(v/v)甲酸，流动相B对流动相A的比是2:98；b)用包含流动相A和流动相B的溶液自该反相层析材料洗脱该组合物，其中流动相B对流动相A的比升高至约70:30，然后升高至约90:10，其中NAT降解物与完整NAT分开地自该层析洗脱，c)量化该NAT降解物和该完整NAT。在一些实施方案中，流速是约1.0mL/分钟且流动相B对流动相A的比在层析开始后约16分钟中升高至约70:30，然后在自层析开始起约18分钟后升高至约90:10。
在一些方面，本发明提供用来测量包含N-乙酰基色氨酸的组合物中的N-乙酰基色氨酸(NAT)降解的方法，该方法包括a)将该组合物应用于反相层析材料，其中将该组合物加载到在包含流动相A和流动相B的溶液中的该层析材料上，其中流动相A在水中包含0.1％(v/v)甲酸且流动相B在乙腈中包含0.1％(v/v)甲酸，流动相B对流动相A的比是2:98；b)用包含流动相A和流动相B的溶液自该反相层析材料洗脱该组合物，其中流动相B对流动相A的比升高至约74:26，然后升高至约90:10，其中NAT降解物与完整NAT分开地自该层析洗脱，c)量化该NAT降解物和该完整NAT。在一些实施方案中，流速是约1.0mL/分钟且流动相B对流动相A的比在层析开始后约14分钟中升高至约74:26，然后在自层析开始起约16.5分钟后升高至约90:10。
在一些实施方案中，该反相层析材料包含C8模块或C18模块。在一些实施方案中，该反相层析材料包含C18模块。在一些实施方案中，该反相层析材料包含固体支持物。在一些实施方案中，该固体支持物包含硅土。在一些实施方案中，该反相层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，该反相层析材料是高效液体层析(HPLC)材料或超高效液体层析(UPLC)材料。在一些实施方案中，该反相层析柱是AgilentSB-C18层析柱。在一些实施方案中，该反相层析柱是AgilentSB-C18 3.5μm，4.6×75mm层析柱。
在一些实施方案中，该层析是于范围为自约0℃至约30℃的温度实施的。在一些实施方案中，该层析是于约0℃，5℃，20℃，或30℃任一实施的。在一些实施方案中，该层析是于室温实施的。在一些实施方案中，该层析是于约5℃实施的。在一些实施方案中，该层析是于5℃±3℃实施。
在一些实施方案中，NAT和NAT降解产物是通过240nm处的吸光度检测的。在一些实施方案中，NAT降解产物是通过质谱术鉴定的。在一些实施方案中，该组合物中NAT的浓度是约10nM至约1mM。在一些实施方案中，该组合物中NAT的浓度小于约10nM，25nM，50nM，75nM，100nM，250nM，500nM，750nM，1μM，2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，25μM，50μM，75μM，100μM，250μM，500μM，750μM，或1mM任一。在一些实施方案中，该组合物中NAT的浓度范围介于约10nM和约100nM，约100nM和约500nM，约500nM和约1μM，约1μM和约100μM，约100μM和约500μM，或约500μM和约1mM之间。
在上述方法的一些实施方案中，该NAT降解产物包括N-Ac-(H,1,2,3,3a,8,8a-六氢-3a-羟基吡咯并[2,3-b]-吲哚2-羧酸)(N-Ac-PIC)，N-Ac-氧吲哚基丙氨酸(N-Ac-Oia)，N-Ac-N-甲酰基-犬尿氨酸(N-Ac-NFK)，N-Ac-犬尿氨酸(N-Ac-Kyn)和N-Ac-2a,8a-二羟基-PIC中的一种或多种。
在一些实施方案中，本发明提供用来测量包含N-乙酰基色氨酸和多肽的组合物中的N-乙酰基色氨酸(NAT)降解的方法，该方法包括a)使该多肽变性，b)自该组合物去除该多肽，c)将该组合物应用于反相层析材料，其中将该组合物加载到在包含流动相A和流动相B的溶液中的该层析材料上，其中流动相A在水中包含酸且流动相B在乙腈中包含酸，d)用包含流动相A和流动相B的溶液自该反相层析材料洗脱该组合物，其中流动相B对流动相A的比与步骤a)相比升高，其中NAT降解物与完整NAT分开地自该层析洗脱，e)量化该NAT降解物和该完整NAT。在一些实施方案中，该多肽是通过胍处理变性的。在一些实施方案中，该多肽是用胍变性的，其中将胍添加至该组合物至约7M至约9M的终浓度。在一些实施方案中，该多肽是用胍变性的，其中将胍添加至该组合物至约8M的终浓度。
在一些实施方案中，本发明提供用来测量包含N-乙酰基色氨酸和多肽的组合物中的N-乙酰基色氨酸(NAT)降解的方法，该方法包括a)用约8M胍稀释该组合物，b)自该组合物去除该多肽，c)将该组合物应用于反相层析材料，其中将该组合物加载到在包含流动相A和流动相B的溶液中的该层析材料上，其中流动相A在水中包含酸且流动相B在乙腈中包含酸，d)用包含流动相A和流动相B的溶液自该反相层析材料洗脱该组合物，其中流动相B对流动相A的比与步骤a)相比升高，其中NAT降解物与完整NAT分开地自该层析洗脱，e)量化该NAT降解物和该完整NAT。
在上述实施方案的一些实施方案中，在约8M胍中稀释该组合物，使得该组合物中NAT的终浓度范围为自约0.01mM至约0.5mM。在上述实施方案的一些实施方案中，在约8M胍中稀释该组合物，使得该组合物中NAT的终浓度范围为自约0.05mM至约0.2mM。在上述实施方案的一些实施方案中，在约8M胍中稀释该组合物，使得该组合物中NAT的终浓度小于约0.05mM，0.06mM，0.07mM，0.08mM，0.09mM，0.10mM，0.12mM，0.14mM，0.16mM，0.18mM或约0.2mM任一。在一些实施方案中，在约8M胍中稀释该组合物，使得该组合物中多肽的终浓度小于或等于约5mg/mL，约10mg/mL，约15mg/mL，约20mg/mL，约25mg/mL，约30mg/mL，约35mg/mL，约40mg/mL，约45mg/mL，约50mg/mL，或约100mg/mL任一。在一些实施方案中，在约8M胍中稀释该组合物，使得该组合物中多肽的终浓度是约5mg/mL至约10mg/mL，约10mg/mL至约15mg/mL，约15mg/mL至约20mg/mL，约20mg/mL至约25mg/mL，约25mg/mL至约30mg/mL，约30mg/mL至约35mg/mL，约35mg/mL至约40mg/mL，约40mg/mL至约45mg/mL，约145mg/mL至约50mg/mL，或约50mg/mL至约100mg/mL。
在一些实施方案中，通过过滤自该组合物去除该多肽。在一些实施方案中，该过滤使用分子量截留为约30kDal的过滤膜。
在上述实施方案的一些实施方案中，该配制剂具有约3.5至约7.0的pH。在上述实施方案的一些实施方案中，该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该配制剂具有约3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，7.0，7.5，或8.0任一的pH。
在一些实施方案中，该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。
在一些实施方案中，该配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。在一些实施方案中，该多肽是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于监测组合物中NAT的降解的方法，其包括依照上文描述的方法测量该组合物的样品中NAT的降解，其中该方法重复一次或多次。在一些实施方案中，该方法重复至少约2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次，9次，或10次任一。在一些实施方案中，每天，每周，或每个月或其任何组合重复该方法。在一些实施方案中，至少约每个月，每2个月，每3个月，每4个月，每5个月，每6个月，每9个月或至少约一年一次重复该方法。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于药物组合物的质量测定法，该质量测定法包括依照上文描述的方法测量该药物组合物的样品中NAT的降解，其中该组合物中测量的NAT降解物的量确定该药物组合物是否适合于施用于动物。在一些实施方案中，该药物组合物中NAT降解物的量小于约1ppm，2ppm，3ppm，4ppm，5ppm，6ppm，7ppm，8ppm，9ppm，10ppm，20ppm，30ppm，40ppm，50ppm，60ppm，70ppm，80ppm，90ppm，或100ppm任一指示该药物组合物适合于施用于该动物。在一些实施方案中，该药物组合物中NAT降解物的量小于约10ppm指示该药物组合物适合于施用于动物。
VIII.制品
在本发明的另一个实施方案中，提供一种制品，其包含装有本发明的液体配制剂的容器，而且任选提供它的使用说明。在一些实施方案中，该液体配制剂包含蛋白质(例如抗体)和N-乙酰基-色氨酸(NAT)，其中该蛋白质包含至少一个a)SASA大于约至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)；b)SASA大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)；或c)通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法预测对氧化易感的色氨酸残基。在一些实施方案中，该液体配制剂中NAT的量是自约0.1mM至约10mM(诸如约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，或10.0mM任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，该蛋白质的氧化降低约40％至约100％(诸如约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，该液体配制剂于约0℃至约5℃(诸如约0，1，2，3，4或5℃任一，包括这些值之间的任何范围)稳定至少约12个月(诸如至少约12，15，18，21，24，27，30，33，或36个月任一，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，该液体配制剂中该蛋白质的浓度是自约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，该蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该抗体衍生自IgG1抗体序列。在一些实施方案中，该液体配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。在一些实施方案中，该液体配制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，该液体配制剂是水性配制剂。
合适的容器包括例如瓶，管形瓶和注射器。容器可以自各种材料形成，诸如玻璃或塑料。一种例示性容器为2-20cc一次使用的玻璃管形瓶。或者，对于多剂配制剂，容器可以是2-100cc玻璃管形瓶。容器装有配制剂，而且该容器上或关联的标签可指示使用说明。制品可进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料，包括其它缓冲剂，稀释剂，滤器，针头，注射器，和印有使用说明的包装插页。
包装插页指治疗性产品的商业包装中通常包括的用法说明书，其含有关于有关此类治疗性产品的使用的适应证，用法，剂量，施用，禁忌症和/或警告的信息。
还提供了对于多种目的有用的试剂盒，例如用于降低液体配制剂中的蛋白质的氧化或用于对液体配制剂筛选降低的蛋白质氧化，任选与制品组合。本发明的试剂盒包括一个或多个包含蛋白质(例如抗体)，NAT，AAPH的容器，和/或依照本文中描述的任何方法的使用说明，该蛋白质(例如抗体)包含至少一个a)SASA大于约至约(诸如大于约50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，225，或任一，包括这些值之间的任何范围)；b)SASA大于约15％至约45％(诸如大于约15，20，25，30，35，40，或45％任一)；或c)通过在色氨酸残基氧化易感性与该色氨酸残基基于MD模拟的多种分子描述符的联系上练习的机器学习算法预测对氧化易感的色氨酸残基。本发明的试剂盒中供应的用法说明书典型地是标签或包装插页上的书面用法说明书(例如试剂盒中包括的纸张)，但是机器可读的用法说明书(例如磁或光存储盘上承载的用法说明书)也是可接受的。
认为本说明书足以使得本领域技术人员实施本发明。根据上述描述，在本文所示和所述之外对本发明的各种更改对本领域技术人员会变得显然，而且落在所附权利要求的范围之内。据此通过援引完整收录本文中引用的所有出版物，专利，和专利申请用于所有目的。
实施例
通过参考下述实施例，会更加全面地理解本发明。然而，它们不应解释为限制本发明的范围。要理解，本文中描述的实施例和实施方案只是出于例示目的，而且根据它们，本领域技术人员会想到各种变更和变化，而且它们被包括在本申请的精神和范围及所附权利要求的范围内。
实施例1。免于氧化的NAT保护的评估。
SASA计算
使用Sharma,V.et al.(supra)中描述的电脑全原子分子动力学模拟方法计算指定蛋白质残基的SASA。简言之，自3D晶体结构或同源性模型任一获得蛋白质的结构，根据需要添加离子和显式(explicit)溶剂分子。使用GROMACS的g_sas计算SASA，本地执行互信息计算(Eisenhaber F.et al.,J.Comput.Chem.16(3):273-284,1995；Lange O.F.etal.Proteins 70(4):1294-1312,2008)。分别使用GROMACS的statusg_rsmf，g_hbond，和dssp计算均方根波动，氢键，和二级结构。使用先前发表的方法计算Shannon熵和互信息(Kortkhonjia E,et al.,MAbs 5(2):306-322,2013)。使用Amber 11进行MD模拟(FF99SB固定电荷力场；使用areaimol计算SASA(Bailey S,Acta.Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.50(Pt 5):760-763,1994)；使用100-ns轨迹，因为它们提供在可用计算能力内的足够数据。
AAPH压力
将蛋白质单抗1，单抗2，和单抗3/单抗4透析入钠乙酸盐/酯缓冲液(20mM乙酸钠pH5.5)中并将单抗5/单抗6透析入基于组氨酸的缓冲液(20mM组氨酸氢氯化物pH 5.5)中。将蛋白质溶液在相应的缓冲液中稀释至1mg/mL蛋白质的终浓度并添加1mM 2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二氢氯化物(AAPH)。以0至5mM的浓度自浓缩的储存溶液将N-乙酰基-Trp(NAT)添加至每一种蛋白质溶液。将样品于40℃温育16小时，接着用甲硫氨酸淬灭并缓冲液交换至初始透析缓冲液加100mM蔗糖。
LC-MS胰蛋白酶肽作图
使用微规模胰蛋白酶肽消化接着液体层析-质谱术(LC-MS)监测单抗2，单抗1，和单抗3/单抗4的AAPH受压样品的位点特异性修饰(Anderson,N.et al.,Nov.20,2014,American Pharmaceutical Review)。用190μL还原羧甲基化缓冲液(6M盐酸胍，360mMTris，2mM EDTA，pH 8.6)稀释30μL(250μg)每一份受压样品以使蛋白质变性。变性后，将4μL1M DTT添加至每一份混合物并将还原反应于37℃温育1小时。然后通过添加10.4μL碘乙酸来羧甲基化样品并在黑暗中于室温保存15分钟。通过添加2μL 1M DTT来淬灭烷基化反应。在PD-10柱(GE Healthcare)上将还原的且烷基化的样品缓冲液交换入胰蛋白酶消化缓冲液(25mM Tris，2mM CaCl2，pH 8.2)中。然后通过以酶对蛋白质比1:50(以重量计)添加测序级胰蛋白酶(Promega)来消化样品。将消化反应于37℃温育4小时，然后通过将100％甲酸(FA)添加至样品至3.0％(v/v)的最终FA浓度来淬灭。
在偶联Thermo Q Exactive Plus高分辨率质谱系统(HRMS)的Waters Acquity H级UHPLC上实施每一份消化样品的肽作图。在以0.3mL/min的流速运行且柱温度控制于77℃的CSH C18柱(Waters，1.7μm粒度，2.1mm x 150mm)中实施消化样品的10μg注射的分开。溶剂A由水中的0.1％FA组成且溶剂B由乙腈中的0.1％FA组成。梯度显示于表1。于214nm监测柱流出液。以17,500的分辨率在200-2000m/z的扫描范围上收集完整MS-SIM数据。通过使用3.50kV的针喷射电压实现阳离子模式的电子喷射离子化。先前使用相同的微规模胰蛋白酶消化，接着LC/MS-MS(MS/MS片段化用于PTM的残基特异性定位)为每一种单抗表征了氧化倾向性感兴趣位点。使用Thermo XCalibur生物药物表征软件通过萃取离子层析(EIC)确定每一个位点处的氧化水平。通过氧化肽种类的峰面积除以天然和氧化肽的峰面积的和计算氧化的相对百分比。为色氨酸位点报告的总氧化值仅仅是Wox1(+16)和NFK/Wox2(+32)的和。对于肽作图的更多详情，参见Andersen,N.et al.,Rapid UHPLC-HRMS Peptide Mapping forMonoclonal Antibodies.Amer.Pharm.Rev.,2014。
表1
时间(min) ％溶剂A ％溶剂B
0.0 99 1
2.0 87 13
9.5 62 38
12.5 25 75
12.6 10 90
13.0 10 90
13.1 99 1
22.0 99 1
免于氧化的NAT保护
对下述氧化倾向性色氨酸残基评估免于AAPH诱导的氧化的NAT保护：单抗2W53和W106；单抗4W52；单抗1W103；和单抗6W103/104。如上文描述的使用1mM AAPH使每一种蛋白质经受AAPH压力。对于单抗2，单抗4，和单抗1以0，0.05，0.1，和0.3mM添加NAT，并对于单抗6以0，0.1，和1mM添加NAT。如图1和表2和3中显示的，NAT能够保护每一种测试残基免于AAPH压力所致氧化。
表2。色氨酸残基的氧化
表3。蛋白质的保护
蛋白质 残基 于0.1mM NAT的保护(％)1
单抗2 W53 79
单抗2 W106 56
单抗4 W52 43
单抗1 W103 17
单抗6 W103/104 44
1：作为(于0mM NAT的Δ氧化-于0.1mM NAT的Δ氧化)/于0mM NAT的Δ氧化计算
色氨酸氧化易感性的预测
如图2A中显示的，作为色氨酸残基SASA的函数，使用来自38种IgG1单抗的数据将AAPH所致％氧化绘图。使用30％SASA的截留，87％的检查残基具有大于35％的氧化水平。色氨酸残基的一种分子描述符，％SASA，在这个抗体群体中预测对氧化的易感性中是高度精确的。然而，如图2B中显示的，扩充数据集至包括来自121种具有各式各样框架(例如IgG1，IgG2，IgG4，鼠)的单抗的色氨酸残基导致仅仅基于％SASA的氧化易感性预测不太精确。
实施例2。用于色氨酸氧化易感性预测的机器学习。
使用一种基于模拟的分子描述符，诸如SASA，能产生关于某些条件中的色氨酸氧化易感性的高度精确的预测，诸如对于特定IgG亚类。然而，在预测各式各样的框架间残基的色氨酸氧化易感性时，通过使用多种分子描述符能改善精确性。我们使用机器学习来关联一组基于MD模拟的分子描述符与色氨酸氧化易感性，产生一种可用于精确预测关于氧化易感性的实验数据不可得的测试色氨酸残基的稳定性的模型，容许更快的管道来选择候选分子。而且，确定了分子描述符在模型中的相对重要性，潜在指向驱动稳定性的根本机制。
分子描述符
使用上文描述的电脑全原子分子动力学模拟方法计算下述分子描述符。使用下述参数对每一个色氨酸残基运行六次MD模拟：仅Fv区，100ns快照每次模拟，显式水，恒定压力，3次模拟有质子化HIS，3次模拟有去质子化HIS(“pH”)，和3fs步长。MD衍生的分子描述符包括局部化学环境的循环指纹：电荷，疏水性；成氢键；和主链和氨基酸侧链的局部结构。
距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目
对于每一次分子模拟的每一帧，追踪距每一个色氨酸的δ碳在内的所有原子。在这些原子中，对那些是任何天冬氨酸残基的侧链上的氧原子的计数。最终值代表此计数在模拟的持续时间上的时间平均值。
侧链SASA(stdev)
对于每一次分子模拟的每一帧，计算每一个色氨酸侧链的溶剂可及性表面积(SASA)。简言之，通过将每一个原子半径与水分子的半径加到一起来生成在该模拟中的每一个原子上集中的球体的点。消除在邻近球体的半径内的所有点，并在所有剩余点之间对面积求和以生成SASA值。此描述符的最终值代表在模拟的持续时间上色氨酸侧链原子的SASA的标准偏差。
δ碳SASA(stdev)
对于每一个模拟的每一帧，如先前所述计算每一个色氨酸δ碳的溶剂可及性表面积(SASA)。此描述符的值代表在模拟的持续时间上色氨酸δ碳的SASA的标准偏差。
距色氨酸δ碳在内的总正电荷(stdev)
对于每一个模拟的每一帧，追踪距每一个色氨酸的δ碳在内的与带电荷的氨基酸侧链有关的所有原子。将这些原子的总正电荷加到一起。最终值代表在模拟的持续时间上此数量的标准偏差。
主链SASA(stdev)
对于每一次分子模拟的每一帧，计算每一个色氨酸的主链氮原子的溶剂可及性表面积(SASA)。此描述符是在模拟的持续时间上主链氮原子的SASA的标准偏差。
色氨酸侧链角
贯穿模拟追踪色氨酸侧链的χ1和χ2角。当将许多不同色氨酸残基和模拟上的所有χ1和χ2角绘图时，共同发生的角组合的簇变得显而易见。使用K均值聚簇来定义12个区域中的每一个的中心。
最预示色氨酸氧化的角区域是于χ1＝76度和χ2＝98度集中的“簇5”。对于每一个色氨酸残基个体，在模拟上追踪在簇5中花费的时间的百分比并作为一个描述符添加至随机决策森林。
距色氨酸δ碳在内的包装密度
作为在色氨酸δ碳上集中的半径的球体内的蛋白质原子的时间平均的数目计算包装密度。
色氨酸主链角(stdev)
通过在该模拟的持续时间上测量与每一个色氨酸残基的主链有关的ψ角的标准偏差来计算此描述符。
假π轨道的占据体积
作为高度为以近似被色氨酸π轨道占据的空间的圆柱体的底对待每一个色氨酸残基的侧链。追踪在模拟期间落在圆柱体的体积内的所有原子。对于模拟的每一帧，计算落在圆柱体的体积内的所有蛋白质原子的总体积。最终值代表被其它蛋白质原子占据的色氨酸π轨道的时间平均的体积。
主链柔性
在每一个模拟上计算每一个色氨酸残基的主链氮的均方根波动。简言之，比对模拟中的每一帧。为每一帧计算每一个氮原子旅行的距离。将每一帧的此距离平方，并取得在所有帧间此平方距离的平均值。最终，取得此平方距离的平均值的平方根以生成色氨酸的主链氮的均方根波动。
距色氨酸δ碳在内的总负电荷
对于每一个模拟的每一帧，追踪距每一个色氨酸的δ碳在内的与带电荷氨基酸侧链有关的所有原子。将这些原子的总负电荷加到一起。最终值代表在模拟的持续时间上此数量的时间平均值。
随机决策森林的生成
如上文所述计算具有实验测定的氧化水平的68种分子中的121个色氨酸残基的一组分子描述符的值。具有大于35％氧化的色氨酸残基归类为“不稳定”，而那些具有小于35％氧化的归类为“稳定”。通用分子描述符还与每一个色氨酸残基有关，包括IgG类型，IgG框架信息，色氨酸残基的CDR位置，CDR长度，序列中在前和在后的残基，和其它氧化热点的数目。
使用实验数据(稳定或不稳定的色氨酸残基)和色氨酸分子描述符(模拟数据)的组合来练习随机决策森林以获悉哪些基于模拟的输出对应于色氨酸稳定性。在一系列参数上评估随机决策森林的精确性以鉴定用于练习的最佳条件，而且利用使用经过优化的参数生成的随机决策森林将对于预测色氨酸氧化最重要的描述符排序。
使用两种方法评估随机决策森林的精确性。在一种方法中，计算“袋外”误差。已经在机器学习文献中证明袋外误差是预示模型精确性的一项可靠评估量(James,G.,et al.,An introduction to Statistical Learning.Springer.pp 316-321,2013)。简言之，将引导聚集应用于练习集X＝x1，…，xn，并计算每一个练习样品上的均值预测误差xi，只使用在它们的引导样品中不具有xi的树。在另一种方法中，将数据集拆分成用于练习随机决策森林的练习集(80％的数据)和应用于所得随机决策森林的测试集(剩余20％的数据)。使用测试集的预测误差来计算模型精确性。
为了确定随机决策森林的最佳练习条件，改变下述参数并评估模型精确性：随机决策森林中包括的决策树个体(或评估量)的数目，为了随机决策森林中的每一个树的每一个分支处的考虑随机选择的变量(或特征)的数目，和观察集合分成子分支的次数的最大数目(或树深度)。色氨酸氧化模型精确性的评估量的最佳数目大于或等于200(见图3)。用少至30个评估量仍然实现85％以上的精确性。特征的最佳数目范围在1和4之间(见图4)。最佳树深度大于或等于5(见图5)。以低至2的树深度仍然实现一种精确模型。基于这些结果，使用下述经过优化的参数来生成一种随机决策森林：5000个评估量，每个节考虑3个特征，和树深度10。所得经过优化的随机决策森林的袋外误差计算产生89.2％的精确性。将数据拆分成练习和测试集，发现经过优化的随机决策森林的精确性是88％，灵敏度80％和特异性89％(见表4)。
表4：随机决策森林精确性
预测是稳定的 预测是不稳定的
稳定的 17 2
不稳定的 1 4
基于模拟的分子描述符在经过优化的随机决策森林中的相对重要性使用基尼重要性评估，并在图6中显示头14种分子描述符。最重要的描述符是附近天冬氨酸侧链氧，接着以排位次序是侧链SASA(stdev)，δ碳SASA(stdev)，附近正电荷(stdev)，主链SASA(stdev)，于pH7的色氨酸侧链角，于pH 7的包装密度，主链角(stdev)，主链波动，假π轨道的SASA，于pH 5的包装密度，于pH 5的色氨酸侧链角，于pH 5的附近负电荷，和于pH 7的附近负电荷。
实施例3。不同压力条件和配制剂下NAT降解的表征。
为了系统性评估NAT稳定性，我们开发了一种反相(RP)层析方法与UV检测的组合来量化NAT降解。将NAT添加至蛋白质配制剂典型的缓冲剂系统并经受设计用于模拟典型的制造和贮存条件期间重组蛋白质可能经受的那些的压力：烷基过氧化物，芬顿化学，UV光，和热压力(Grewal,P.,et al.,Mol Pharm,2014.11(4):1259-72；Ji,J.A.,et al.,J PharmSci,2009.98(12):4485-500；Torosantucci,R.,et al.,Pharm Res,2014.31(3):541-53)。在我们的研究中，观察超过10种不同NAT降解物并鉴定主要种类。
化学药品
除非注明，化学药品购自Sigma。所使用的所有化学药品均是分析纯级别的。蛋白质治疗剂样品在中国仓鼠卵巢细胞或大肠杆菌中生成并通过一系列层析步骤来纯化，包括亲和层析和/或离子交换层析。主要NAT降解物(NAT降解物结构见图7)的合成通过如下文所述改编文献方法来实现。
通用合成规程
在可能时使用无水溶剂。使用Phenomenex Gemini-NX 10μC18100mm×30mm制备性HPLC柱在Waters 2525 HPLC系统上实施制备性反相层析。流动相A＝Milli-Q H2O，0.1％甲酸。流动相B＝乙腈，梯度＝0-12分钟0-20％B，通过于254nm的UV信号阈(10-1Au)来触发级分收集。通过LC/MS对级分分析期望产物的存在。对于所有制备性分开，为了改善纯度，合并级分不包括含有期望峰的开头和结尾部分的级分。
与Thermo Scientific Orbitrap质谱仪串联，使用Waters H-Class UPLC和正文中描述的层析条件进行最终产物的LC/MS样品分析。在50-800m/z的扫描范围上以阳离子模式以15,000的分辨率收集全扫描精确质量数据。对头三种离子实施MS2，停用动态排除。
在全氘化DMF中实施NMR分析。
用于乙酰化色氨酸衍生物的通用规程
将色氨酸衍生物添加至乙腈(无水，J.T.Baker)(终浓度200mM)。添加二异丙基乙胺(DIPEA，5eq)，紧接着是1.1eq的乙酸酐(Ac2O)。将反应于室温搅动16小时。过滤混合物以去除未反应的起始材料，并在真空中去除溶剂。在二甲基甲酰胺(DMF)中溶解材料并通过prep-RPLC纯化期望产物。
N-Ac-Kyn(N-Ac-DL-犬尿氨酸)6b
通过上文通用规程将DL-犬尿氨酸(Sigma Aldrich)乙酰化。将DL-犬尿氨酸(800mg，3.84mmol)添加至40ml乙腈以形成浅黄色悬浮液。添加DIPEA(5eq)和Ac2O(1.1eq)。于室温搅动16小时后，大多数悬浮固体溶解且溶液颜色为深黄色/橙色。通过制备性层析的分开和部分分离级分材料的冻干产生428mg蓬松浅黄色固体。通过LC-MS(m/z＝251.103)和NMR表征获得的产物(RP-UPLC纯度99％，44％产率)。
通过UV和茚三酮染色的TLC分析确认缺失起始材料。
N-Ac-NFK(Nα-乙酰基-N’-甲酰基-犬尿氨酸)7b
通过改编C.E.Dalgliesh in J.Chem.Soc.1952,137-141报告的文献方案合成N-Ac-NFK。将甲酸(Sigma，98-100％，360μl)和乙酸酐(J.T.Baker，无水99％，105μl)的混合物搅动30分钟，之后添加100mg N-乙酰基-DL-犬尿氨酸。反应2小时后，LC/MS分析仍然显示存在起始材料，于该点进行第二次添加甲酸(120μl)和乙酸酐(35μl)以迫使反应完全。第二次添加后1小时实施的LC/MS分析显示缺失起始材料和形成期望产物。于室温将反应混合物添加至15ml水并冷冻。浅褐色晶体形成过夜。将这些过滤，用冰冷的水清洗，并冻干湿的残留物以产生10mg期望产物，为蓬松浅褐色固体。通过LC-MS(m/z＝279.098)和NMR表征获得的产物(RP-UPLC纯度90％，9.0％产率)。
Oia(羟吲哚基-DL-丙氨酸)非对映异构体4a
通过改编Itakura,K.；Uchida,K.；Kawakishi,S.in Chem.Res.Toxicol.1994,7,185-190报告的文献方案来合成Oia。于环境温度将DMSO(900μl)和苯酚(100mg，1.06mmol)与5mL 37％HCl预混合。在30ml冰乙酸中悬浮DL-Trp(1.0g，4.9mmol)并添加至混合物。于环境温度搅动反应。定期通过LC-MS检查进展。4小时后，LC/MS确认失去起始材料和形成具有期望产物质量(m/z＝221)的两个靠近洗脱峰。在真空下去除溶剂产生深褐色浆。在4ml DMF中溶解物质。没有进行尝试使非对映异构体分开；使用制备性RPLC进行期望非对映异构体产物的纯化。组合期望级分并冻干以生成305mg蓬松白色固体。通过LC-MS(m/z＝221)表征获得的产物(28％产率)。
N-Ac-Oia(N-乙酰基-羟吲哚基丙氨酸)非对映异构体4b
依照上文通用规程乙酰化羟吲哚基-DL-丙氨酸非对映异构体4a(100mg)。16小时后，LC/MS确认反应完全。在真空中去除溶剂。制备性层析和冻干产生56mg蓬松白色粉末。没有进行尝试使非对映异构体分开。通过LC-MS(m/z＝263.102)和NMR表征获得的非对映异构体产物(RP-UPLC纯度89％，47％产率)。通过UV和茚三酮染色的TLC分析确认缺失起始材料。
N-Ac-5-HTP(N-乙酰基-5-羟基-色氨酸)8b
依照上文通用规程乙酰化5-HTP 8a(150mg)。16小时后，LC/MS确认反应完全。在真空中去除溶剂。制备性层析和冻干产生58mg蓬松白色粉末。通过LC-MS(m/z＝263.1)和NMR表征获得的产物(32％产率)。通过UV和茚三酮染色的TLC分析确认缺失起始材料。
2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二氢氯化物(AAPH)氧化压力
使用AAPH(Calbio Chem，99.8％)来模拟烷基过氧化物所致氧化性降解。将含有0.3mM NAT±5mM L-Met pH 5.5的于pH 5.5的组氨酸和非组氨酸缓冲液用水性AAPH溶液处理至1.0mM AAPH的终浓度。将等同体积的Milli-Q H2O添加至对照样品。将样品于40℃温育16小时。通过添加L-Met至20mM的终浓度来淬灭氧化。添加淬灭溶液后，最终NAT浓度是0.2mM。
芬顿压力
将FeCl2(Sigma Aldrich，98％纯度)和H2O2(Sigma Aldrich，30％w/w，在H2O中)添加至含有0.3mM NAT±5mM L-Met，pH 5.5的于pH 5.5的含有组氨酸的缓冲液分别至0.2mM和10ppm的终浓度。添加H2O2后，将管形瓶简短漩涡震荡并于40℃温育3小时。通过添加L-Met至100mM的终浓度来淬灭氧化。添加淬灭溶液后，最终NAT浓度是0.2mM。
光压力
利用由国际协调会议(ICH)专家工作组推荐的设计用于进行药物物质/产物光稳定性测试的光盒[Atlas SunTEST CPS+Xenon光盒(Chicago，IL)]对含有NAT的样品提供光压力。ICH光稳定性测试定义为1.2x106勒克斯-小时白光和200W-小时/m2UV光；对光盒编程以在24小时的时段上提供压力。将含有0.3mM NAT±5mM L-Met的组氨酸和非组氨酸缓冲液分装入无菌玻璃管形瓶(1ml/管形瓶)。将管形瓶盖帽并侧放在光盒中以对光源的暴露最大化。在箔中覆盖每一种缓冲液条件的一份对照样品并置于光盒中达暴露的持续时间。为了与其它压力模型的一致性，在HPLC分析之前，将缓冲液溶液用Milli-Q H2O稀释至0.2mM的最终NAT浓度。
热压力
将含有1.0mM NAT的组氨酸和非组氨酸缓冲液分装入无菌玻璃管形瓶(5ml/管形瓶，6个管形瓶每种缓冲液)。在压力期间将管形瓶在深色盒中于指定温度保存并转移至-70℃进行贮存直至分析(每月取得时间点，持续5个月)。将每一种缓冲剂溶液的样品的初始时间点立即转移至-70℃。在分析之前，将样品融化并用Milli-Q H2O稀释至0.2mM的最终NAT浓度。
HPLC分析
使用Agilent ZORBAX SB-C18 3.5μm，4.6x 75mm反相柱在Agilent 1200系列HPLC或Waters H级UPLC上将NAT和NAT降解物分开。通过恒温控制器将柱温度保持于30±0.8℃。用于HPLC和UPLC的梯度分别在表5和6中列出(注释：设计UPLC上的较短梯度来供应较早的停留时间，并且由于1.0ml/min流速时较大范围的系统压力，延长柱再平衡时段)。于240nm检测NAT降解产物。在每一种仪器上使用标准带宽设置(8nm用于Agilent 1200 HPLC，4.8nm用于Waters H级)进行分析。将自动加样器维持于5±3℃。将10nmol NAT和/或NAT降解物(大多数样品50μl)注射到柱上进行分析。使用Dionex Chromeleon软件加工层析图。
表5。用于Agilent 1200 HPLC的梯度。
表6。用于Waters H级UPLC的梯度。
通过LC/MS分析样品
与Thermo Scientific Orbitrap质谱仪串联，使用Waters H级UPLC和上文描述的层析条件进行LC/MS样品分析。在50-800m/z的扫描范围上以阳离子模式以15,000的分辨率收集全扫描精确质量数据。对头三种离子实施MS2，停用动态排除。
结果
受压样品小组设计
在暴露于四种不同代表性压力之后评估NAT稳定性：1)芬顿化学(H2O2+Fe2+)，其模拟由源自药物生成期间与不锈钢的接触的铁浸出物引起的潜在氧化，2)AAPH压力，其模拟通过聚山梨酯去污剂降解生成的烷基过氧化物，3)国际协调会议(ICH)光压力(1.2x106勒克斯小时，200w hr/m2)，药物工业用于评估光稳定性的刺眼光压力，和4)加速热压力以模拟生物药品的长期降解。每一种压力的强度选择成与典型的贮存和制造相比苛刻的且降解强度彼此相似，使得能够进行由不同压力模型诱导的变化之间的比较。这些研究是用与通常用于单抗的那些一致的配制剂实施的。由于已知组氨酸是氧化活跃的，在相关时采用含有组氨酸和含有非组氨酸的缓冲液二者。
方法开发
利用使用C18柱的反相层析来监测NAT降解。选择梯度条件来确保NAT和NAT降解物的合适的解析(图8A)。于240nm监测洗出液，选择波长以确保低水平种类的足够的灵敏度[一些种类在较大的波长(例如280nm)检测不到且信号:噪声在较低的波长(例如214nm)下降，见图8B]。最终的层析条件贯穿相关范围提供线性响应：0.01-1.0mM NAT(图13)和降解物在AAPH受压NAT样品中的1-20倍稀释(图14)。NAT和主要降解物的加样器稳定性建立为于5℃高至12小时(数据未显示)。
在胍中稀释含有蛋白质的样品并经由超滤(Amicon旋转滤器，30kDa分子量截留)去除蛋白质。对一些单抗在离液剂缺失下观察到不完全回收，提示可发生NAT和蛋白质之间的非共价相互作用。先前已经证明NAT结合人血清清蛋白(HAS)(Anraku,M.,et al.，Biochim Biophys Acta,2004.1702(1):p.9-17)，但是至今尚未报告结合单抗。使用最终的样品制备条件，来自三种测试抗体/抗体衍生物的NAT回收是94-99％而NAT降解物的回收是98-100％(数据未显示)。
受压样品小组的分析
对所有压力条件观察到多种NAT降解物，以六个主要新峰和多个次要峰代表(图8A，NAT降解物结构见图7)。通过比较NAT峰面积与每一种压力模型的对照样品来计算每一份样品的总NAT降解(表7)。NAT降解范围为自3％(热压力，非His缓冲液)至83％(ICH光压力，His缓冲液)。
表7。模型压力条件和相应NAT降解
*标星的峰代表只在ICH光压力下观察到的峰。
在所有测试条件下对芬顿和AAPH压力观察到大约30-40％NAT降解，而且降解物的水平和分布一般独立于缓冲液组氨酸的存在(图8A，NAT降解物结构见图7)。NAT在ICH光压力下经历更大的缓冲剂敏感性(即组氨酸和非组氨酸配制剂之间的差异)(图8A)。虽然在光压力下非组氨酸缓冲液中NAT的稳定性引起与AAPH和芬顿压力定量相似的NAT降解(28％比33-41％损失)，但是降解物的分布改变且观察到新峰(见“*”标示的峰，图8A)。在光压力下在组氨酸缓冲液中观察到显著更高水平的降解(>80％)，导致水平升高的先前观察到的NAT降解物，连同新峰(图8A)。
总之，观察到降解样品小组中的曲线之间的惊人一致性，在ICH光压力条件下观察到的次要峰除外(图8A中“*”标示的峰)。这提示过氧化氢/羟基自由基(芬顿压力)和烷基过氧化物(AAPH)可经由一种共同途径降解NAT，而由UV光诱导的反应性氧种类(ROS)(H2O2，单态氧，超氧化物)可能呈现另外的降解途径。组氨酸的存在提高ICH光条件下的NAT降解的观察结果与组氨酸自身是光反应性的且因此提高ROS水平和类型的报告一致(Stroop,S.D.etal.,J Pharm Sci,2011.100(12):p.5142-55)。鉴于在这些各式各样测试压力条件下观察到的共同NAT降解概况，很可能的是药物产物中的任何NAT降解会引起这些相同种类生成。
降解物鉴定
接下来，使用LC/MS/MS探索降解的NAT降解物种类的身份。在表8中列出主要峰的分子离子(表9中包括根据LC/MS展现足够的信号强度的所有峰的完整列表)。主要峰2，3，和4具有263.1(NAT+16)的m/z，与NAT的一次氧化事件一致。由于主要峰2和3具有相似的MS1和MS2谱(图15A)和在监测的所有压力和吸光度波长之间一致的比(图8B)，因此这些峰试探性指派为N-Ac-Oia 4b(结构见图7)的互变非对映异构体。已经报告了过氧化氢处理色氨酸后的类似Trp种类(Simat,T.J.and H.Steinhart,J Agric Food Chem，1998.46(2):p.490-498)。此指派得到130.1处的MS2离子的观察结果的进一步支持，其先前报告指示含有氧吲哚基丙氨酸(Oia)的肽(Todorovski,T.et al.,J Mass Spectrom,2011.46(10):p.1030-8)(图15A)。
表8。NAT降解物鉴定
表9。NAT降解物种类的身份
主要峰5和6分别具有279.10(NAT+32)和251.10(NAT+4)的m/z，没有或具有弱的280nm处的吸光度(图8B)。提示吲哚环丢失的这些特性与Trp的主要已知生理性降解物中的两种，NFK(7a，Trp+32)和Kyn(6a，Trp+4)一致(Dreaden K.,et al,PLoS One,2012.7(7):p.e42220)(结构见图7)。为了评估这些种类是否代表相应N-乙酰化型式，N-Ac-NFK 7b和N-Ac-Kyn 6b(结构见图7)，使用碰撞诱导的解离来生成两种种类的MS2谱。每一个于m/z＝174.1展示强信号(图15B和图15C)，其先前报告是犬尿氨酸特征性的(Todorovski,T.etal.,J Mass Spectrom,2011.46(10):p.1030-8)。基于此信息，将这些种类分别试探性指派为N-Ac-NFK 7b和N-Ac-Kyn 6b(结构见图7)。
为了确认这些种类的身份，使用上文描述的合成规程来合成N-Ac-Oia 4b，N-Ac-NFK 7b，和N-Ac-Kyn 6b的可信标准品。受压NAT样品中的峰的层析和MS2概况均与可信样品的那些对齐(图9和图15A-15C)，对这些峰的鉴定给出另外的支持。
鉴于5-OH-Trp 8a是Trp的主要生理性分解代谢产物，还制备N-Ac-5-OH-Trp 8b(结构见图7)的合成标准品以评估该种类是否沿着NAT的主要降解途径。可信N-Ac-5-OH-Trp 8b标准品通过LC-MS/MS的分析指示该化合物并不以任何显著量存在于任何受压NAT样品中，因为保留时间和质谱术数据无一与观察到的NAT降解物一致(图9和图15D)。自在吲哚环的苯部分上已经氧化的Trp衍生物衍生的MS2片段离子146.1(Todorovski，T.et al.，JMass Spectrom,2011.46(10):p.1030-8)在任何一次氧化NAT降解物种类中没有观察到，提示在NAT氧化期间在吲哚环的4，5，6，或7位上发生最小限度水平的羟基化(图15A和图15D)。
分别将峰组1中的一次氧化NAT种类和峰4试探性鉴定为N-Ac-PIC 2b(结构见图7)的立体异构体，而且类似地将峰组1中的双重氧化NAT种类试探性指派为N-Ac-3a,8a-二羟基PIC 3b的立体异构体。这些分子是含有NAT的HSA配制剂在延长的热压力(于25℃达3年)后报告的唯一NAT降解物(Fang,L.et al.,Chromatogr A,2011.1218(41):p.7316-24)，而且在我们的研究中观察到的MS2片段化样式与该报告一致(图15E和图15F)。而且，峰4是在这些研究中使用荧光检测观察到的唯一NAT降解物(图8B)，与H,1,2,3,3a,8,8a-六氢-3a-羟基吡咯并[2,3-b]-吲哚2-羧酸(PIC)2a是发荧光的唯一常见Trp降解物之一的报告一致(Simat,T.J.et al.,J Agric Food Chem,1998.46(2):490-498)。由于没有制备这些种类的合成标准品，因此这些鉴定不能最终确定且仍然可能的是双重氧化的N-Ac-二氧吲哚基丙氨酸(N-Ac-DiOia)还存在于不完全解析的峰组1中。峰指派汇总于表8。
在这些研究中观察到的NAT降解物(N-Ac-PIC，N-Ac-Oia，N-Ac-NFK，N-Ac-Kyn，和N-Ac-2a,8a-二羟基-PIC)很大程度上与Simat等人关于通过过氧化氢处理氧化的游离色氨酸报告的那些(PIC，Oia，NFK，Kyn，DiOia，和5-OH-Trp)一致(Simat,T.J.J Agric FoodChem,1998.46(2):p.490-498)。肽和蛋白质中色氨酸降解物的确定性鉴定受到限制(因为许多色氨酸衍生物的等压(isobaric)性质使降解物在肽和蛋白质水平的鉴定变复杂，而且残基个体的分离可导致分解)，但是类似地肽/蛋白质文献与NAT研究一致(Simat,T.J.etal.，J Agric Food Chem,1998.46(2):p.490-498；Fedorova，M.，et al.,Proteomics,2010.10(14):p.2692-700；Li，Y.，et al.,Anal Chem,2014.86(14):p.6850-7；Ronsein,G.E.,et al.,J Am Soc Mass Spectrom,2009.20(2):p.188-97)。值得注意的一处不一致是5-OH-Trp–这是Trp在体内的主要降解物(经由色氨酸羟化酶途径)且在Simat等人关于游离Trp的研究中观察到–然而，它仅仅在三肽Ala-Trp-Ala在相同过氧化氢条件下氧化后以痕量水平观察到，在所调查的肽和蛋白质文献中没有确定性鉴定，且在我们关于NAT的研究中没有观察到。
总而言之，这提示在非酶促条件下相对于游离Trp含有酰胺化N末端的(正如在NAT中和在肽/蛋白质中)的Trp衍生物在5位可能对氧化不太易感。
其它赋形剂和蛋白质的NAT降解的影响
接下来，评估其它赋形剂对NAT降解的影响。特别感兴趣的是Met(常常作为抗氧化剂添加至药物产物配制剂的另一种抗氧化剂)的存在。一般而言，在缓冲剂配制剂中包括5mM Met引起总NAT氧化总体降低(表7，图10)，这与Met中的硫醚模块可充当氧化池的假设一致。Met对NAT稳定性的影响在氧化模型之间变化：Met在AAPH模型中对NAT稳定性做出适度改善(4-8％总NAT损失，取决于缓冲剂)，在ICH光压力条件下略微更好的改善(10-16％)，和在芬顿模型中显著的改善(25％)(表8)。在芬顿条件中与Met一起配制时NAT氧化的显著降低可能是由于Met淬灭过氧化氢(Ji,J.A.,et al.,J Pharm Sci，2009.98(12):p.4485-500)。添加Met看来没有改变每一个模型系统中的氧化机制，因为在Met配制的压力样品中观察到的主要种类的分布与在没有Met的情况下配制的那些相比没有变化(数据未显示)。
还分析了低浓度蛋白质对AAPH诱导的NAT降解的影响。将两种抗体(蛋白质1和蛋白质2)在缓冲液中稀释至1.0mg/ml并与0.3mM NAT一起配制(约45:1mol NAT:mol蛋白质)。在AAPH压力后，NAT降解的水平在含有蛋白质的和没有蛋白质的溶液之间很大程度上是一致的(NAT峰面积的约40％损失)，正如氧化剂种类的分布(图11)。这些结果提示低水平蛋白质的存在在所测试的氧化性(烷基过氧化物诱导的)压力条件下并不内在影响NAT降解水平/途径。
药物产物配制剂中NAT的实时稳定性
凭借手中的此模型经验，接下来探索预期在单抗的制造和贮存中发生的NAT氧化的量。图12图示与NAT，Met，和单抗配制剂典型的其它赋形剂共配制的含有150mg/ml(1.0mM)抗体的AAPH模型压力系统的比较。显示了初始时间点，-20℃和5℃达6个月(代表典型的贮存条件)，和25℃达6个月(代表加速稳定性条件)的结果。制造后和在所测试的典型贮存条件下的氧化水平可直接忽略。于25℃达6个月后，观察到一些降解(总NAT损失＝16.8％)。感兴趣的是，相应媒介显示显著更低的NAT降解–而含有蛋白质的样品于25℃达3个月后具有7.5％NAT损失，相应媒介仅仅显示NAT的1％损失。甚至在更高的温度(图12)，媒介显示最小限度的NAT降解，提示在一些情况中在加速热条件下高浓度蛋白质的存在可提高NAT降解。加速稳定性样品中存在的5个主要种类对应于压力模型中鉴定的主要种类(图12)，提示模型如实再现药物产物样品中的NAT降解途径。
总之，使用用于评估N-Ac-色氨酸(一种已知为蛋白质治疗剂中的Trp残基针对氧化性压力提供保护的抗氧化剂)的稳定性的层析方法，NAT显示降解成一组常见降解物--包括N-Ac-Oia，N-Ac-PIC，N-Ac-Kyn，和N-Ac-NFK(结构见图7)--在各式各样压力条件下和不同模型配制剂中很大程度上独立于压力类型，这是一项先前尚未报告的发现。这些降解物一般与关于Trp氧化的文献一致，例外在于所研究的压力模型中的NAT降解并不引起N-乙酰化型式的5-羟基色氨酸(最常见的生理性Trp降解物)生成。不受理论束缚，这提示在非酶促条件下，NAT(和可能，通过扩展，蛋白质中的Trp残基)并不经由与Trp分解代谢相同的中间物降解。事实上，不受理论束缚，数据提示NAT的氧化主要在吲哚环的2和3位上发生。

Claims (137)

1.一种降低水性配制剂中多肽的氧化的方法，其包括将防止该多肽氧化的一定量的N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂，其中该多肽包含至少一个溶剂可及性表面积(SASA)大于约的色氨酸残基。
2.一种降低水性配制剂中多肽的氧化的方法，其包括将防止该多肽氧化的一定量的N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂，其中该多肽包含至少一个溶剂可及性表面积(SASA)大于约30％的色氨酸残基。
3.一种降低水性配制剂中多肽的氧化的方法，其包括测定该多肽中色氨酸残基的SASA值并如果至少一个色氨酸残基具有大于约的溶剂可及性表面积(SASA)的话，将防止该多肽氧化的一定量的N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂。
4.权利要求3的方法，其中该色氨酸残基的SASA值是通过分子动力学模拟计算的。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约5mM的浓度。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约1mM的浓度。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.3mM的浓度。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中该多肽的氧化降低约50％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中该配制剂于约2℃至约8℃稳定约1095天。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中该配制剂中的蛋白质浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中该配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中该蛋白质是抗体。
15.权利要求14的方法，其中该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。
16.一种液体配制剂，其包含多肽和一定量的N-乙酰基色氨酸以防止该多肽氧化，其中该多肽具有至少一个SASA大于约的色氨酸残基。
17.权利要求16的液体配制剂，其中该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约5mM的浓度。
18.权利要求16或17的液体配制剂，其中该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约1mM的浓度。
19.权利要求16-18任一项的液体配制剂，其中该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.3mM的浓度。
20.权利要求16-19任一项的液体配制剂，其中该多肽的氧化降低约50％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。
21.权利要求16-20任一项的液体配制剂，其中该配制剂于约2℃至约8℃稳定约1065天。
22.权利要求16-21任一项的液体配制剂，其中该配制剂中的蛋白质浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。
23.权利要求16-22任一项的液体配制剂，其中该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。
24.权利要求16-23任一项的液体配制剂，其中该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。
25.权利要求16-24任一项的液体配制剂，其中该配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。
26.权利要求16-25任一项的液体配制剂，其中该蛋白质是抗体。
27.权利要求26的液体配制剂，其中该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。
28.一种用来对配制剂筛选降低的多肽氧化的方法，其中该多肽包含至少一个SASA大于约的色氨酸残基，该方法包括
将一定量的N-乙酰基色氨酸添加至包含该多肽的水性组合物，
将2,2’-偶氮二(2-氨基丙烷)二氢氯化物(AAPH)添加至该组合物，
将包含该多肽，N-乙酰基色氨酸和AAPH的组合物于约40℃温育约14小时，
对该多肽测量该多肽中色氨酸残基的氧化，
其中包含一定量的N-乙酰基色氨酸，导致该多肽的色氨酸残基不多于约20％氧化的配制剂对于降低的该多肽氧化是合适的配制剂。
29.一种用来对配制剂筛选降低的多肽氧化的方法，其包括
测定该多肽中色氨酸残基的SASA值，其中SASA大于约的色氨酸残基经受氧化，
将一定量的N-乙酰基色氨酸添加至包含该多肽的水性组合物，
将2,2’-偶氮二(2-氨基丙烷)二氢氯化物(AAPH)添加至该组合物，
将包含该多肽，N-乙酰基色氨酸和AAPH的组合物于约40℃温育约14小时，
对该多肽测量该多肽中色氨酸残基的氧化，
其中包含一定量的N-乙酰基色氨酸，导致该多肽的色氨酸残基不多于约20％氧化的配制剂对于降低的该多肽氧化是合适的配制剂。
30.权利要求29的方法，其中该色氨酸残基的SASA值是通过分子动力学模拟计算的。
31.一种试剂盒，其包含权利要求16-26任一项的液体配制剂。
32.一种制品，其包含权利要求16-26任一项的液体配制剂。
33.一种用于确定液体配制剂中的多肽是否包含对氧化易感的色氨酸残基的方法，该方法包括基于该多肽的氨基酸序列为该多肽中的每一个色氨酸残基计算一种或多种分子描述符并将该一种或多种分子描述符应用于在该一种或多种分子描述符上练习的机器学习算法以预测色氨酸氧化，其中该分子描述符包括下述中的一种或多种：
a)距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，
b)侧链溶剂可及性表面积(SASA)，
c)δ碳SASA，
d)距色氨酸δ碳在内的总正电荷，
e)主链SASA，
f)色氨酸侧链角，
g)距色氨酸δ碳在内的包装密度，
h)色氨酸主链角，
i)假π轨道的SASA，
j)主链柔性，或
k)距色氨酸δ碳在内的总负电荷。
34.权利要求33的方法，其中在该分子模拟中使用该分子描述符中的2，3，4，5，6，7，8，9，10或11种。
35.权利要求33的方法，其中该分子描述符包含下述：
a)距色氨酸δ碳在内的天冬氨酸侧链氧的数目，
b)侧链溶剂可及性表面积(SASA)，
c)δ碳SASA，
d)距色氨酸δ碳在内的总正电荷，
e)主链SASA，
f)色氨酸侧链角，和
g)距色氨酸δ碳在内的包装密度。
36.权利要求33-35任一项的方法，其中该机器学习算法是通过匹配来自多肽基于该多肽的氨基酸序列的分子动力学模拟的分子描述符与该多肽中每一个色氨酸残基的实验数据来练习的。
37.权利要求33-36任一项的方法，其中特定位点处的色氨酸残基大于35％的氧化指示对氧化的易感性。
38.权利要求33-37任一项的方法，其中该一种或多种分子描述符是使用计算机计算的。
39.权利要求33-38任一项的方法，其中该蛋白质是抗体。
40.权利要求39的方法，其中该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。
41.一种用于降低多肽的氧化的方法，其包括依照权利要求33-40任一项的方法鉴定对氧化易感的色氨酸残基并在该多肽中引入氨基酸替代以将一个或多个对氧化易感的色氨酸残基用不经受氧化的氨基酸残基替换。
42.一种用于降低多肽的氧化的方法，其包括在该多肽中引入氨基酸替代以替换一个或多个对氧化易感的色氨酸残基，其中该一个或多个对氧化易感的色氨酸残基是通过权利要求33-40任一项的方法鉴定的。
43.权利要求41或42的方法，其中该色氨酸残基是用选自由酪氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丙氨酸，和缬氨酸组成的组的氨基酸残基替换的。
44.一种用于降低水性配制剂中多肽的氧化的方法，其包括依照权利要求33-38任一项的方法测定该多肽中一个或多个对氧化易感的色氨酸残基的存在，并将有效量的抗氧化剂添加至包含具有一个或多个对氧化易感的色氨酸残基的多肽的水性配制剂。
45.一种用于降低水性配制剂中多肽的氧化的方法，其包括将一定量的抗氧化剂添加至该水性配制剂以防止氧化，其中多肽包含通过权利要求33-38任一项的方法鉴定的一个或多个对氧化易感的色氨酸残基。
46.权利要求45的方法，其中该抗氧化剂是N-乙酰基色氨酸。
47.权利要求46的方法，其中该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约5mM的浓度。
48.权利要求46或47的方法，其中该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约1mM的浓度。
49.权利要求46-48任一项的方法，其中该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.3mM的浓度。
50.权利要求44-49任一项的方法，其中该多肽的氧化降低约50％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。
51.权利要求44-50任一项的方法，其中该配制剂于约2℃至约8℃稳定约1095天。
52.权利要求44-51任一项的方法，其中该配制剂中的蛋白质浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。
53.权利要求44-52任一项的方法，其中该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。
54.权利要求44-53任一项的方法，其中该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。
55.权利要求44-54任一项的方法，其中该配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。
56.权利要求44-55任一项的方法，其中该蛋白质是抗体。
57.权利要求56的方法，其中该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。
58.一种液体配制剂，其包含多肽和一定量的N-乙酰基色氨酸以防止该多肽的氧化，其中该多肽具有至少一个通过权利要求33-38任一项的方法测量的对氧化易感的色氨酸残基。
59.权利要求58的液体配制剂，其中该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约5mM的浓度。
60.权利要求58或60的液体配制剂，其中该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.1mM至约1mM的浓度。
61.权利要求58-60任一项的液体配制剂，其中该N-乙酰基色氨酸添加至该配制剂至约0.3mM的浓度。
62.权利要求58-61任一项的液体配制剂，其中该多肽的氧化降低约50％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。
63.权利要求58-62任一项的液体配制剂，其中该配制剂于约2℃至约8℃稳定约1065天。
64.权利要求58-63任一项的液体配制剂，其中该配制剂中的蛋白质浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。
65.权利要求58-64任一项的液体配制剂，其中该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。
66.权利要求58-65任一项的液体配制剂，其中该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。
67.权利要求58-66任一项的液体配制剂，其中该配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。
68.权利要求58-67任一项的液体配制剂，其中该蛋白质是抗体。
69.权利要求68的液体配制剂，其中该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，或抗体片段。
70.一种用来对配制剂筛选降低的多肽氧化的方法，其中该多肽包含至少一个通过权利要求33-40任一项的方法鉴定的对氧化易感的色氨酸，该方法包括
将一定量的N-乙酰基色氨酸添加至包含该多肽的水性组合物，
将2,2’-偶氮二(2-氨基丙烷)二氢氯化物(AAPH)添加至该组合物，
将包含该多肽，N-乙酰基色氨酸和AAPH的组合物于约40℃温育约14小时，
对该多肽测量该多肽中色氨酸残基的氧化，
其中包含一定量的N-乙酰基色氨酸，导致该多肽的色氨酸残基不多于约20％氧化的配制剂对于降低的该多肽氧化是合适的配制剂。
71.一种用来对配制剂筛选降低的多肽氧化的方法，其包括
a)通过权利要求33-40任一项的方法鉴定包含一个或多个对氧化易感的色氨酸残基的多肽，
b)将一定量的N-乙酰基色氨酸添加至包含步骤a)中鉴定的多肽的水性组合物，
c)将2,2’-偶氮二(2-氨基丙烷)二氢氯化物(AAPH)添加至该组合物，
d)将包含该多肽，N-乙酰基色氨酸和AAPH的组合物于约40℃温育约14小时，
e)对该多肽测量该多肽中色氨酸残基的氧化，
其中包含一定量的N-乙酰基色氨酸，导致该多肽的色氨酸残基不多于约20％氧化的配制剂对于降低的该多肽氧化是合适的配制剂。
72.一种试剂盒，其包含权利要求58-69任一项的液体配制剂。
73.一种制品，其包含权利要求58-72任一项的液体配制剂。
74.一种用来测量包含N-乙酰基色氨酸的组合物中的N-乙酰基色氨酸(NAT)降解的方法，该方法包括
a)将该组合物应用于反相层析材料，其中将该组合物加载到在包含流动相A和流动相B的溶液中平衡的层析材料上，其中流动相A在水中包含酸且流动相B在乙腈中包含酸，
b)用包含流动相A和流动相B的溶液自该反相层析材料洗脱该组合物，其中流动相B对流动相A的比与步骤a)相比升高，其中NAT降解物与完整NAT分开地自该层析洗脱，
c)量化该NAT降解物和该完整NAT。
75.权利要求74的方法，其中步骤a)中流动相B对流动相A的比是约2:98。
76.权利要求74或75的方法，其中步骤b)中流动相B对流动相A的比线性升高。
77.权利要求74或75的方法，其中步骤b)中流动相B对流动相A的比逐步升高。
78.权利要求74-77任一项的方法，其中该层析的流速是约1.0mL/分钟。
79.权利要求78的方法，其中流动相B对流动相A的比升高至约30:70。
80.权利要求79的方法，其中流动相B对流动相A的比在约16分钟中升高至约30:70。
81.权利要求79或80的方法，其中流动相B对流动相A的比进一步升高至约90:70。
82.权利要求81的方法，其中流动相B对流动相A的比在约18.1分钟中进一步升高至约90:70。
83.权利要求78的方法，其中流动相B对流动相A的比升高至约26:74。
84.权利要求83的方法，其中流动相B对流动相A的比在约14分钟中升高至约26:74。
85.权利要求83或84的方法，其中流动相B对流动相A的比进一步升高至约90:70。
86.权利要求85的方法，其中流动相B对流动相A的比在约16.5分钟中进一步升高至约90:70。
87.权利要求74-86任一项的方法，其中流动相A在水中包含约0.1％酸。
88.权利要求74-87任一项的方法，其中流动相B在乙腈中包含约0.1％酸。
89.权利要求74-88任一项的方法，其中该酸是甲酸。
90.权利要求74-89任一项的方法，其中该反相层析材料包含C18模块。
91.权利要求74-90任一项的方法，其中该反相层析材料包含固体支持物。
92.权利要求91的方法，其中该固体支持物包含硅土。
93.权利要求74-92任一项的方法，其中该反相层析材料包含在柱中。
94.权利要求74-93任一项的方法，其中该反相层析材料是高效液体层析(HPLC)材料或超高效液体层析(UPLC)材料。
95.权利要求74-94任一项的方法，其中NAT和NAT降解产物通过240nm处的吸光度来检测。
96.权利要求74-95任一项的方法，其中NAT降解产物通过质谱术来鉴定。
97.权利要求74-96任一项的方法，其中该组合物中NAT的浓度是约10nM至约1mM。
98.权利要求74-97任一项的方法，其中NAT降解产物包括N-Ac-(H,1,2,3,3a,8,8a-六氢-3a-羟基吡咯并[2,3-b]-吲哚2-羧酸)(N-Ac-PIC)，N-Ac-氧吲哚基丙氨酸(N-Ac-Oia)，N-Ac-N-甲酰基-犬尿氨酸(N-Ac-NFK)，N-Ac-犬尿氨酸(N-Ac-Kyn)和N-Ac-2a,8a-二羟基-PIC中的一种或多种。
99.一种用来测量包含N-乙酰基色氨酸和多肽的组合物中的N-乙酰基色氨酸(NAT)降解的方法，该方法包括
a)用约8M胍稀释该组合物，
b)自该组合物去除该多肽，
c)将该组合物应用于反相层析材料，其中将该组合物加载到在包含流动相A和流动相B的溶液中平衡的层析材料上，其中流动相A在水中包含酸且流动相B在乙腈中包含酸，
d)用包含流动相A和流动相B的溶液自该反相层析材料洗脱该组合物，其中流动相B对流动相A的比与步骤a)相比升高，其中NAT降解物与完整NAT分开地自该层析洗脱，
e)量化该NAT降解物和该完整NAT。
100.权利要求99的方法，其中在约8M胍中稀释该组合物，使得该组合物中NAT的终浓度范围为自约0.05mM至约0.2mM。
101.权利要求99或100的方法，其中在约8M胍中稀释该组合物，使得该组合物中多肽的终浓度小于或等于约25mg/mL。
102.权利要求99-101任一项的方法，其中通过过滤自该组合物去除该多肽。
103.权利要求102的方法，其中该过滤使用分子量截留为约30kDal的过滤膜。
104.权利要求99-103任一项的方法，其中步骤a)中流动相B对流动相A的比是约2:98。
105.权利要求99-104任一项的方法，其中步骤b)中流动相B对流动相A的比线性升高。
106.权利要求99-105任一项的方法，其中步骤b)中流动相B对流动相A的比逐步升高。
107.权利要求99-106任一项的方法，其中该层析的流速是约1.0mL/分钟。
108.权利要求107的方法，其中流动相B对流动相A的比升高至约30:70。
109.权利要求108的方法，其中流动相B对流动相A的比在约16分钟中升高至约30:70。
110.权利要求108或109的方法，其中流动相B对流动相A的比进一步升高至约90:70。
111.权利要求110的方法，其中流动相B对流动相A的比在约18.1分钟中进一步升高至约90:70。
112.权利要求111的方法，其中流动相B对流动相A的比升高至约26:74。
113.权利要求112的方法，其中流动相B对流动相A的比在约14分钟中升高至约26:74。
114.权利要求112或113的方法，其中流动相B对流动相A的比进一步升高至约90:70。
115.权利要求114的方法，其中流动相B对流动相A的比在约16.5分钟中进一步升高至约90:70。
116.权利要求99-115任一项的方法，其中流动相A在水中包含约0.1％酸。
117.权利要求99-116任一项的方法，其中流动相B在乙腈中包含约0.1％酸。
118.权利要求99-117任一项的方法，其中该酸是甲酸。
119.权利要求99-118任一项的方法，其中该反相层析材料包含C18模块。
120.权利要求99-119任一项的方法，其中该反相层析材料包含固体支持物。
121.权利要求120的方法，其中该固体支持物包含硅土。
122.权利要求99-121任一项的方法，其中该反相层析材料包含在柱中。
123.权利要求99-122任一项的方法，其中该反相层析材料是高效液体层析(HPLC)材料或超高效液体层析(UPLC)材料。
124.权利要求99-123任一项的方法，其中通过240nm处的吸光度检测NAT和NAT降解产物。
125.权利要求99-124任一项的方法，其中通过质谱术鉴定NAT降解产物。
126.权利要求99-125任一项的方法，其中该组合物中NAT的浓度是约0.1mM至约5mM。
127.权利要求99-126任一项的方法，其中该组合物中NAT的浓度是约0.3mM。
128.权利要求99-127任一项的方法，其中NAT降解产物包括N-Ac-PIC，N-Ac-Oia，N-Ac-NFK，N-Ac-Kyn和N-Ac-2a,8a-二羟基-PIC中的一种或多种。
129.权利要求99-128任一项的方法，其中该配制剂中的蛋白质浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。
130.权利要求99-129任一项的方法，其中该配制剂具有约4.5至约7.0的pH。
131.权利要求99-130任一项的方法，其中该配制剂进一步包含一种或多种选自由稳定剂，缓冲液，表面活性剂，和张度剂组成的组的赋形剂。
132.权利要求99-131任一项的方法，其中该配制剂是适合于施用于受试者的药物配制剂。
133.权利要求99-132任一项的方法，其中该多肽是抗体。
134.权利要求133的方法，其中该抗体是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体或抗体片段。
135.一种用于监测组合物中NAT的降解的方法，其包括依照权利要求74-134任一项的方法测量该组合物的样品中NAT的降解，其中该方法重复一次或多次。
136.权利要求135的方法，其中每个月，每2个月，每4个月或每6个月重复该方法。
137.一种用于药物组合物的质量测定法，该质量测定法包括依照权利要求74-134任一项的方法测量该药物组合物的样品中NAT的降解，其中该组合物中测量的NAT降解物的量确定该药物组合物是否适合于施用于动物。
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