CN114441699B - 同时测定注射液中葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用高效液相色谱法同时测定葡萄糖酸钙注射液中葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙的含量的方法，以葡萄糖酸钙和葡萄糖二酸钙为研究对象，利用高效液相色谱法同时测定，达到两种物质同时分离的目的。所述高效液相色谱条件为：采用糖分析色谱柱，以盐酸水溶液为流动相，柱温为25～45℃；检测器为示差折光检测器，检测器温度为35～45℃，外标法定量。该质量控制方法专属性、稳定性、准确性均较好，为添加葡萄糖二酸钙作为增溶剂的葡萄糖酸钙注射液的质量控制提供了简易可靠的分析方法。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，涉及使用高效液相色谱法同时测定葡萄糖酸钙注射液中葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙的含量的方法。
技术背景
钙，作为人体内含量最大的无机盐组成元素，在人体内含量高达1000-1300克。同时，钙也是人体生命活动最重要的参与者之一，如神经传导、免疫、消化、激素调控等。葡萄糖酸钙中的二价钙离子为生物活性钙，生物利用度高，是人体补钙首选药物。葡萄糖酸钙注射液是临床上的常用药物，用于治疗急性低血钙引起的手足抽搐、荨麻疹、急性湿疹及皮炎等多种疾病，以及治疗镁中毒、氟中毒、高钾血症等。
葡萄糖酸钙注射液为过饱和溶液，生产及贮存过程中存在易析出结晶等问题，可通过添加葡萄糖二酸钙等钙添加剂改善其溶解度。2020版中国药典规定葡萄糖酸钙注射液含葡萄糖酸钙(C12H22CaO14.H2O)应为标示量的97.0％～107.0％。本品需添加钙盐或其他适宜的稳定剂，但加入的钙盐按钙(Ca)计算，不得超过葡萄糖酸钙中含有钙量的5.0％。美国FDA橙皮书中载明，原研公司FRESENIUS KABI USA通过添加适量的葡萄糖二酸钙增加其溶解度。然而现行美国药典(USP40)、中国药典均采用EDTA配位法测定总钙，虽然方法简便对仪器的要求不高，但只能测定注射液的总钙量，不能反映葡萄糖酸钙或葡萄糖二酸钙在制剂中的比例。文献：高效液相色谱法同时测定复方葡萄糖酸钙口服溶液中2组分的含量[J]，中国药房2005年第16卷第17期，通过HPLC法同时测定葡萄糖酸钙口服液中葡萄糖酸钙及乳酸钙的含量，但无法分离并测定葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙的含量，如图1所示。
高效液相色谱法(HPLC)由于具有分离效能高、分析速度快等优点，在制剂的分离检测中应用较多，但目前同时测定葡萄糖酸钙注射液中葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙的含量方法尚未见报道。本发明开发了新的HPLC法同时测定葡萄糖酸钙注射液中葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙的含量。
发明内容
本发明提供一种利用高效液相色谱法同时测定葡萄糖酸钙注射液中葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙的含量的方法，以葡萄糖酸钙和葡萄糖二酸钙为研究对象，利用高效液相色谱法同时测定，达到两种物质同时分离的目的。
一种利用高效液相色谱法同时测定葡萄糖酸钙注射液中葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙的含量的方法，所述高效液相色谱法的条件为：采用糖分析色谱柱，固定相为磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，其规格为1.5μm，8.0×300mm；以盐酸水溶液为流动相，柱温为25～45℃；检测器为示差折光检测器，检测器温度为35～45℃，外标法定量。
进一步地，所述流动相为pH2.5～3.5盐酸水溶液；
进一步地，所述流动相为pH2.5～3.0盐酸水溶液；
进一步地，所述流动相为pH3.0～3.5盐酸水溶液；
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进一步地，所述流动相的流速为0.6～1.0mL·min-1；
进一步地，所述流动相的流速为0.6～0.8mL·min-1；
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进一步地，所述流动相的流速为0.6mL·min-1；
进一步地，所述流动相的流速为0.8mL·min-1；
进一步地，所述流动相的流速为1.0mL·min-1；
进一步地，检测时进样量为20μL；
进一步地，所述柱温为25～45℃；
进一步地，所述柱温为25～35℃；
进一步地，所述柱温为35～45℃；
进一步地，所述柱温为25℃；
进一步地，所述柱温为35℃；
进一步地，所述柱温为45℃；
进一步地，检测器温度为35～45℃；
进一步地，检测器温度为35～40℃；
进一步地，检测器温度为40～45℃；
进一步地，检测器温度为35℃；
进一步地，检测器温度为40℃；
进一步地，检测器温度为45℃；
进一步地，检测波长为280nm。
采用高效液相色谱法同时测定葡萄糖酸钙注射液中葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙的成分，根据所述2种特征成分各自的标准曲线得到葡萄糖酸钙注射液中该2种特征成分的含量。
同时发明人将上述色谱条件进行了方法学验证。
1)专属性
取溶剂、空白溶液、葡萄糖酸钙、葡萄糖二酸钙对照品溶液以及混合对照品溶液，分别进样，考察溶剂和空白溶剂对葡萄糖酸钙和葡萄糖二酸钙测定的干扰情况及各组分间的分离情况，结果表明溶剂和空白溶剂对葡萄糖酸钙和葡萄糖二酸钙的测定均无干扰，且葡萄糖酸钙峰与葡萄糖二酸钙峰之间的分离度均大于1.5，本法专属性较好(图2)。
2)线性和范围
取葡萄糖酸钙、葡萄糖二酸钙对照品适量，分别用适量流动相溶解并稀释制成每1ml中含有葡萄糖酸钙4mg、葡萄糖二酸钙200μg的溶液，作为对照品储备液。取上述各储备液3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL置10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用水稀释制成一系列浓度的溶液，依法依次进样，记录色谱图。
葡萄糖酸钙：在1.2～2.8mg·mL-1的浓度范围内，葡萄糖酸钙浓度(X)与峰面积(Y)呈良好的线性关系，其线性回归方程为：Y＝16773X+5235.8，相关系数R2＝0.9997。
葡萄糖二酸钙：60～140μg·mL-1的浓度范围内，葡萄糖二酸钙浓度(X)与峰面积(Y)呈良好的线性关系，其线性回归方程为：Y＝126872X-354.1，相关系数R2＝0.9998，(表1)。
表1葡萄糖酸钙和葡萄糖二酸钙的标准曲线
3)准确度
按处方量的80％、100％、120％称取葡萄糖酸钙和葡萄糖二酸钙，按测定方法检测，计算回收率，结果见表2，表3。
表2葡萄糖酸钙回收率试验结果
表3葡萄糖二酸钙回收率试验结果
葡萄糖酸钙和葡萄糖二酸钙在各浓度下的平均回收率均在98％～102％之间，RSD(n＝9)均小于1.0％，该测定方法准确度良好。
4)精密度
a.重复性
由同一人员，取葡萄糖酸钙注射液(自制)(批号：2006131)样品适量，研磨成粉末，分别取6份各适量(约含福多司坦200mg)，按测定方法分别配制各6份相同浓度的供试品溶液，在相同的条件下进行测试，结果显示(表4)，葡萄糖酸钙注射液的6份供试品溶液中，葡萄糖酸钙和葡萄糖二酸钙的含量测定结果的RSD(n＝6)均小于2.0％，该方法重复性良好。
表4重复性试验结果
| 含量(％) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值(％) | RSD(％) |
| 葡萄糖酸钙 | 100.4 | 101.5 | 101.6 | 101.0 | 101.3 | 101.0 | 101.1 | 0.43 |
| 葡萄糖二酸钙 | 102.0 | 103.3 | 102.5 | 103.1 | 102.3 | 102.3 | 102.6 | 0.48 |
b.中间精密度
更换人员，在不同时间使用不同仪器，取葡萄糖酸钙注射液(自制)(批号：2006131)样品适量，按照“a.重复性”项下方法分别配制6份相同浓度的供试品溶液。连续测定，依法计算葡萄糖酸钙和葡萄糖二酸钙的含量，结果显示，葡萄糖注射液12份供试品溶液中葡萄糖酸钙和葡萄糖二酸钙的含量测定结果的RSD(n＝12)均小于2.0％，该方法精密度良好(表5)。
表5中间精密度试验结果
5)溶液稳定性
按照“a.重复性”项下方法配制供试品溶液各1份，分别于0、2、4、6、8、10、12、24小时测定，考察对照品溶液供试品溶液中葡萄糖酸钙和葡萄糖二酸钙峰面积的变化情况。结果显示，供试品溶液在室温条件下放置12小时内稳定，葡萄糖酸钙和葡萄糖二酸的峰面积的RSD(n＝7)均小于2.0％，该方法稳定性良好(表6)。
表6溶液稳定性试验结果
| 峰面积 | 0h | 2h | 4h | 6h | 10h | 12h | 平均值 | RSD(％) |
| 葡萄糖酸钙 | 299186 | 298723 | 297773 | 296692 | 296743 | 296048 | 297440 | 0.39 |
| 葡萄糖二酸钙 | 10357 | 10397 | 10361 | 10333 | 10264 | 10305 | 10218 | 0.60 |
本发明所述检测方法相比现有检测技术具有以下优点：
1)本发明分析方法利用高效液相色谱法同时测定葡萄糖酸钙注射液中葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙的含量，有利于更好地控制添加葡萄糖二酸钙作为增溶剂的葡萄糖酸钙注射液的质量；2)本发明进行了流速、流动相pH、柱温参数的变化试验，流速相对值变化±20％、流动相pH 2.5～3.5、柱温变化±10℃时，葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙以及乳酸钙之间的理论塔板数及分离度仍符合要求，该含量测定方法耐用性良好；流动相pH2.5～3.5时，葡萄糖酸钙注射液中，葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙分离度大于1.5，分离良好；3)本发明的质量控制方法专属性、稳定性、准确性均较好，有利于更好地控制添加葡萄糖二酸钙作为增溶剂的葡萄糖酸钙注射液的质量，同时也为本品一致性评价提供了有效的分析方法；4)国内仿制药葡萄糖酸钙注射液中使用乳酸钙作为增溶剂，因此在方法的开发过程中，发明人也研究了通过本法对葡萄糖酸钙及乳酸钙含量的同时测定，其结果表明，本法同样适用于通过添加乳酸钙作为增溶剂的国内处方葡萄糖酸钙注射液产品的质量控制。
附图说明
图1使用文献(高效液相色谱法同时测定复方葡萄糖酸钙口服溶液中2组分的含量[J]，中国药房2005年第16卷第17期)方法分离葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙色谱图
图2专属性方法学验证HPLC色谱图，A.溶剂B.空白溶液C.葡萄糖酸钙对照品溶液D.葡萄糖二酸钙对照品溶液E.葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙混合对照品溶液(峰1：葡萄糖二酸钙，峰2：葡萄糖酸钙)
图3实施例1单独对照品葡萄糖酸钙溶液进样色谱图
图4实施例1单独对照品葡萄糖二酸钙溶液进样色谱图
图5实施例1葡萄糖酸钙及葡萄糖二酸钙混合对照品溶液进样色谱图
图6实施例2单独对照品葡萄糖酸钙溶液进样色谱图
图7实施例2单独对照品葡萄糖二酸钙溶液进样色谱图
图8实施例2葡萄糖酸钙及葡萄糖二酸钙混合对照品溶液进样色谱图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，根据本领域普通技术知识和惯用手段。以下实施例仅是本发明的部分优选实施例，不应当视为对本发明的限制，对本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明的范围内，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
除另有说明外，所用试剂均为分析纯。
葡萄糖酸钙对照品(含量99.0％，Sigma-Aldich，批号：099H0088)；葡萄糖二酸钙对照品(含量99.1％，Sigma-Aldich，批号：MKBV4157V)；盐酸(国药集团化学试剂有限公司，批号：20121212)；
葡萄糖酸钙注射液自制样品(每1ml含葡萄糖酸钙94mg，葡萄糖二酸钙4.5mg，批号：2006121，2006122)；
葡萄糖酸钙注射液采购样品(每1ml含葡萄糖酸钙94mg，葡萄糖二酸钙4.5mg，Fresenius Kabi，批号：6019988)；水为超纯水。
测试仪器：岛津LC-20AB高效液相色谱仪；RID-10A示差折光检测器；梅特勒Sevencompact pH计，梅特勒天平。
实施例1：
标准溶液的配置：
(1)供试品溶液：精密量取供试品1mL，置50mL量瓶中，用流动相稀释并定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
(2)对照品溶液：
单独对照品溶液：分别精密称取葡萄糖酸钙、葡萄糖二酸钙对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含有葡萄糖酸钙2mg、葡萄糖二酸钙100μg的溶液，作为单独对照品溶液。混合对照品溶液：精密称取葡萄糖酸钙、葡萄糖二酸钙对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含有葡萄糖酸钙2mg、葡萄糖二酸钙100μg的溶液，作为混合对照品溶液。
样品测定：
色谱柱：Shodex sugar色谱柱(1.5μm，8.0×300mm)
流动相：以pH 3.0稀盐酸溶液为流动相
检测波长：280nm
柱温：35℃
流速：0.8mL/min
进样量：20μL。
葡萄糖酸钙注射液(自制)：取2006121批样品；葡萄糖酸钙注射液(采购)：取6019988批样品，分别按供试品溶液制备方法制得供试品溶液进样，记录色谱图，如图3,4,5所示。按外标法以峰面积计算含量，结果如表1所示。
表7实施例1样品含量测定结果
结果：专属性良好，辅料无干扰；线性和范围：葡萄糖酸钙(1.2～2.8mg·mL-1)、葡萄糖二酸钙(60～140μg·mL-1)，葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙浓度与峰面积呈良好的线性关系；准确度：葡萄糖酸钙和葡萄糖二酸钙的平均回收率分别为98.9％和98.9％，RSD分别为0.30％和0.69％。结论：此法专属性较高，准确度良好且方便快捷，分离效果好，可用于同时测定葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙的含量。
实施例2：
参照实施例1中标准溶液的配置、色谱条件及检测步骤，只是样品批号改为2006122，色谱条件中流动相改为pH 2.5稀盐酸。
结果：葡萄糖酸钙对照品溶液、葡萄糖二酸钙对照品溶液进样，峰形良好。葡萄糖酸钙及葡萄糖二酸钙混合对照品溶液进样，两者峰形良好，且分离度大于1.5，分离良好，可用于同时测定葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙的含量，如图6,7,8所示。
Claims (9)
1.一种利用高效液相色谱法同时测定葡萄糖酸钙注射液中葡萄糖酸钙与葡萄糖二酸钙的含量的方法，所述高效液相色谱法的条件为：采用糖分析色谱柱，固定相为磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，其规格为1.5μm，8.0×300mm；以pH 2.5～3.5盐酸水溶液为流动相，流动相的流速为0.6～1.0mL·min-1，柱温为25～45℃；检测器为示差折光检测器，检测器温度为35～45℃，外标法定量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相为pH 2.5～3.0盐酸水溶液，或pH3.0～3.5盐酸水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，流动相为pH 2.5盐酸水溶液，或pH 3.0盐酸水溶液，或pH 3.5盐酸水溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相的流速为0.6～0.8mL·min-1，或0.8～1.0mL·min-1。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，流动相的流速为0.6mL·min-1，或0.8mL·min-1，或1.0mL·min-1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柱温为25～35℃，或35～45℃。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述柱温为35℃，或40℃，或45℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测器温度为35～40℃，或40～45℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测器温度为35℃，或40℃，或45℃。
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