JP4749060B2 - 新規プロモーターdna及び該dnaを用いたタンパク質の生産方法 - Google Patents
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Description
更に、P22プロモーター、及び、P22プロモーターがプロモーターとして機能する位置に組換えDNAを含有するベクターDNAを提供する。
ベクターDNA pNY301(特開平10−295378号)を元に作製したプロモーター活性評価用ベクターを用いて、P22プロモーターと、現在、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞とする組換えタンパク質生産に用いられている主要なプロモーターとのプロモーター活性の比較評価を行った。
対照として用いるプロモーターを含有しないプラスミドDNAであるpNF1を以下の手順により作製した。
次いで、1)で得たpNF1を元に、レポーター遺伝子であるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が組み込まれているが、プロモーターを含有しないプラスミドDNAであるpNF1−bgaを作製した。
1)と同様に、XSDM及びXXRVをプライマーに用いpNY301を鋳型に用いたPCRを行うことでpNY301からP5プロモーターを除いた部分を増幅し、得られたDNA断片を制限酵素NdeIとXhoIで処理し、約3.3 kbpのDNA断片を回収した。
更に上記で得たpNF2を制限酵素BspHIとBamHIで処理して3.4 kbpの断片を回収した。また、2)と同様によりPCRで増幅したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むDNA断片を制限酵素BspHIIとBamHIで処理し、約2 kbpのDNA断片を回収した。
本発明のP22プロモーターを含有するベクターDNAであるpNF4を以下の手順により構築した。
上記のpNF4を制限酵素BspHIとBamHIで処理して約3.7kbpのDNA断片を回収した。更に、2)と同様の方法で得たβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むDNA断片を制限酵素BspHIとBamHIで処理し、前記の約3.7kbpのDNA断片とT4 DNAリガーゼで連結し、P22プロモーターとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するベクターDNAを作製した。このベクターDNAをpNF4−bgaとした。
pNY301を制限酵素BspHIとBamHIで処理し、pNY301が含有しているP5プロモーターを含む3.4kbpのDNA断片を回収した。更に、2)と同様の方法で得たβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むDNA断片を制限酵素BspHIとBamHIで処理し、前記の3.4kbpのDNA断片とT4 DNAリガーゼで連結し、P5プロモーターとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するベクターDNAを作製した。このベクターDNAをpNY301−bgaとした。
次いで、実施例2で作製したブレビバチルス・チョウシネンシスHPD31-S5の形質転換体をそれぞれ培養し、プロモーター活性の比較評価を行った。なお、このプロモーター活性の比較評価では、生産されたβ−ガラクトシダーゼの活性値をプロモーター活性の指標として用いた。
Claims (6)
- 以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のプロモーター活性を示すDNA。
(a)配列番号1の配列からなるDNA。
(b)配列番号1の配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
(c)配列番号1の配列に対して、1または複数のヌクレオチドが置換、欠失、付加、及び/または、挿入された配列からなるDNA。 - 請求項1に記載のDNAを含有するベクターDNA。
- 請求項1に記載のDNA、及び、該DNAがプロモーターとして機能する位置に組換えDNAを含有するベクターDNA。
- 請求項3に記載のベクターDNAを保持する原核生物細胞。
- ブレビバチルス(Brevibacillus)属細菌である請求項4に記載の原核生物細胞。
- 請求項4または請求項5に記載の原核生物細胞を培養する工程を含むことを特徴とするタンパク質またはポリペプチドを生産する方法。
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