WO2004094633A1 - Rhodococcus属細菌における組換えタンパク質を生産する方法 - Google Patents

Rhodococcus属細菌における組換えタンパク質を生産する方法 Download PDF

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WO2004094633A1
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gene
sequence
dna
plasmid
seq
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PCT/JP2004/005585
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English (en)
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Nobutaka Nakashima
Tomohiro Tamura
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

Definitions

  • the present invention relates to an expression vector capable of expressing a foreign gene in a bacterium belonging to the genus Rhodococcus.
  • the present invention provides an inducible expression vector and a constitutive expression vector capable of expressing a recombinant protein in a host cell, and a method for expressing a recombinant protein using the vector.
  • the present invention relates to a method for simultaneously co-expressing a plurality of genes encoded on different vectors in a genus cell. Background art
  • R. erythropolis is a kind of actinomycetes that can grow from 4 to 35 ° C. The most distinctive feature of the expression system using this strain as a host is that it can produce recombinant proteins at 10 or less, such as at 4 ° C. .
  • the present inventors have developed a group of expression vectors for bacteria of the genus O ⁇ COCC called pTip vectors. Was used for recombinant protein production (Japanese Patent Application No. 2004-73032,
  • the pTip vector is a thiostrepton-inducible expression vector, and in the ⁇ 0f / 0C0CC bacterium transformed with these expression vectors, the pTip vector is used when the thiostrepton is added to the culture medium. Only the production of foreign proteins is induced.
  • the present inventors have constructed a group of inducible expression vectors for the genus i1 ⁇ 2oi ococc called pTip vectors and used them for recombinant protein production.However, two points still need to be developed. I was
  • heterologous plasmids can coexist in the cells of a single bacterium, multiple recombinant proteins can be produced simultaneously.
  • a protein complex called 20S proteasome is composed of two polypeptides, ⁇ -subunit and / 3 subunit, which is necessary for producing a functional 20S proteasome complex as a recombinant. These two polypeptides must be co-expressed.
  • Co-expression of two polypeptides in a single cell can be achieved by introducing multiple foreign genes into a single expression vector, but the size of the vector increases and restriction enzymes The cloning process is often complicated or inconvenient due to site limitations.
  • a co-expression system for recombinant proteins using multiple expression vectors has been described in TO02 / 055709.
  • constitutive expression vectors are important tools for research on Rhodococcus bacteria, but constitutive expression vectors have not been developed.
  • the known constitutive expression vectors and bacteria in bacteria belonging to the genus i ⁇ oi ococ include those using a mutant nitrile hydratase gene promoter (JP-A-9-28382 and JP-A-10-248578), One using the rn? promoter is known (Mat sie et al., Curr. Microbiol. 45 240-244 [2002]).
  • the sequence differs from the DNA region required for autonomous replication in Oi OCOCCZAS bacteria used in the pTip vector constructed earlier by the present inventors. New equivalent sequences need to be separated and used.
  • all of the endogenous plasmid PRE2895 (5.4 kilobase spare; hereinafter abbreviated as kb) isolated from the R. erythropolis Km strain contains the minimal gene required for autonomous replication. (1.9 kb). Therefore, it was decided to isolate endogenous plasmids having different DNA sequences from other R. er.rw7o7 strains and construct a novel expression vector.
  • mutations were introduced into the gene promoter to create a mutant that expresses the foreign gene constitutively, that is, independently of thiostrepton. .
  • a vector having a newly different DNA region required for autonomous replication A vector having a gene promoter and capable of inducible expression, and a vector having a DNA region required for autonomous replication different from the pTip vector, wherein the gene promoter has a mutation introduced therein.
  • one host can be co-transformed with a vector containing genes encoding different foreign proteins, and the different foreign proteins can be co-expressed simultaneously in the co-transformed host. It is.
  • the present invention is as follows.
  • [1] 7 A promoter in which a mutation has been introduced into the -10 region sequence of a gene promoter, which comprises a nucleotide sequence of a mutated gene promoter capable of expressing a gene that is constitutively located downstream in a non-thiostrepton manner.
  • the promoter sequence for constitutively expressing a foreign gene is selected from [1] to [3].
  • a constitutive expression vector for a genus bacterium which comprises a base sequence of any of the DNAs, a ribosome binding site sequence downstream thereof, and a multicloning site sequence capable of introducing a foreign gene downstream thereof.
  • pNit-RT1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 101
  • pNit-RT2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 102
  • pNit-RC2 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 106
  • pNit-QT1 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 99
  • having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 100 J1 ⁇ 2Oi / OCC of [4] selected from the group consisting of pNit-QT2, pNit_QCl having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 103, and pNit-QC2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 104
  • [6] the expression vector of [4] or [5], which is selected from the group consisting of ftoi / dcocczAs spp. Erythropol is, R. iascians and R opacusi) ⁇ ;
  • nucleotide sequence of the DNA essential for the rolling circle replication mode is shown in SEQ ID NO: 90.
  • a stringent DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 90 or a DNA having a sequence complementary to the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 90 Any of [10] to [12] having a DNA that hybridizes under the conditions,
  • a transformant comprising the circular plasmid of any of [10] to [12],
  • An expression vector capable of expressing a foreign gene in a bacterium belonging to the genus Rhodococcus at a temperature of 4 ° C to 35 ° C which is a vector capable of replicating in a rolling cycle replication mode.
  • pTip-RTl having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 93
  • pTip-RT2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 94
  • pTip_RCl having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 97
  • SEQ ID NO: 98 Selected from the group consisting of pTip-RC2 having the nucleotide sequence shown in [15] to [19], an inducible expression vector for oi / ococc bacteria
  • An expression vector capable of constitutively expressing a foreign gene in a bacterium belonging to the genus Rhodococcus comprising a DNA sequence required for autonomous replication of the plasmid in a bacterium derived from the plasmid pRE ⁇ and [1] to [3] Constructs a foreign gene in a Rhodococcus genus bacterium at a temperature of 4 ° C to 35 ° C.
  • pNit-QT1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 99
  • pNit-QT2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 100
  • pNit-Qm having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 103
  • An i ⁇ OiOCOCCZAS bacterium which is an expression plasmid vector derived from at least two types of Rhodococcus bacteria which does not cause plasmid incompatibility with each other and which includes an expression plasmid vector containing a gene encoding a foreign protein.
  • at least two types of plasmid vectors are used as MA sequences required for autonomous replication of plasmids.
  • Oi / OCOCCAS bacteria that have a sequence and are capable of co-expressing a gene encoding a foreign protein at a temperature of 4 ° C to 35 ° C.
  • the two types of plasmid vectors each contain a promoter sequence for producing a foreign protein, a ribosome binding site sequence downstream thereof, and a multicloning site sequence capable of introducing a foreign gene downstream thereof.
  • Rhodococcus bacteria [29] One of the at least two plasmid vectors is one of the vectors [4], [5], [15] to [19], [20] and [21], and the other is [ [27] or [28] which is an inducible expression vector in which at least the promoter of the vector of any of [22] to [25] or the vector of [22] to [25] is replaced with at least the inducible promoter TipA gene promoter.
  • At least one of the two plasmid vectors is one of the vectors [4], [5], [15] to [19], [20] and [21], and the other is Are pTip-NH1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 49, pTip-NH2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 50, pTip-CH1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: PTip-CH2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 52, pTip-LNH1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 53, pTip-LNH2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 54, and SEQ ID NO: 55 PTip-LCH1 having a base sequence represented by SEQ ID NO: 56, pTip-LCH2 having a base sequence represented by SEQ ID NO: 56,
  • K pTip-LCHl K pTip- LCH2.1, any vector from [22] to [25] or any vector from [22] to [25] A vector selected from the group consisting of vectors capable of inducible expression in which at least the promoter is replaced with an inducible promoter, Tip A gene promoter. ? OifecocciW bacteria,
  • the MA sequence essential for the mouth-to-ring circle replication mode is DNA from position 3845 to position 5849 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 90, which is required for autonomous replication of pRE-derived plasmid
  • the DNA of the 1.9 kb region containing the J? 3 ⁇ 4 ⁇ and the gene is a genus oiococc ⁇ of any of [26] to [30],
  • Rhodococcus bacteria including an expression plasmid vector containing a gene encoding a foreign protein ⁇ oiococcy ⁇ ? Genus bacteria, at least two types of plasmid vectors contain the DNA
  • a zoiococciAS bacterium is transformed with at least two types of vectors, each having a DNA sequence having a rolling circle-type replication pattern derived from OiOCOCC bacteria and a DNA sequence required for autonomous replication of a plasmid derived from pRE2895.
  • a method of producing a foreign protein by co-expressing a gene encoding a foreign protein contained in each of the cultured vectors contained in each expression vector under a temperature condition of 4 ° C to 35 ° C,
  • At least one of the two plasmid vectors is one of the vectors [4], [5], [15] to [19], [20] and [21], and
  • One is pTip-NH1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 49, pTip-NH2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 50, pTip-CH1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51, PTip-CH2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 52, pTip-LNH1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 53, pTip-LNH2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 5 PTip-LCH1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, pTip-LCH2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 56, pTi
  • U pTip-LCHl.
  • K pTip-LCH2.
  • L Any one of vectors from [22] to [25] or one of [22] to [25].
  • the nucleotide sequence of the DNA essential for the rolling circle replication mode is the nucleotide sequence from position 3845 to position 5849 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 90, and the plasmid derived from pRE ⁇ "
  • the method according to any one of [32] to [34], wherein the DNA sequence required for autonomous replication is a DNA of a 1.9 kb region including and genes.
  • the present invention includes a circular plasmid isolated from a genus bacterium and capable of replicating in a rolling circle replication mode, and an expression vector constructed from the circular plasmid.
  • the oral-ring-circle-type replication mode is a type of replication of double-stranded circular DNA, in which a specific endonuclease causes a nick at a specific position on a specific DNA strand, and the nick This is a replication mode in which DNA synthesis is started from the 3'-0H end of the DNA, and proceeds around the nick-free circular DNA strand as a ⁇ type.
  • the A region necessary for the rolling circle-type replication mode is required, and examples include a gene.
  • a double-stranded origin of replication DSO (double-stranded origin) and a single-stranded origin of replication SS0 (single stranded origin) are required. Therefore, the circular plasmid capable of replicating in the rolling cycle type replication mode and the expression vector constructed from the circular plasmid of the present invention contain a DNA region necessary for the oral ring type replication mode, namely, A plasmid and an expression vector containing the i?
  • a double-stranded origin of replication DSO double-stranded origin
  • a single-stranded origin of replication SSO single-stranded origin
  • Such a plasmid can be isolated from a bacterium belonging to the genus i1 ⁇ 20 (£? C0CCiAS), for example, pRE8424 isolated from Hhodococcus erythropolis strain DSM8424, and its full-length sequence is shown in SEQ ID NO: 90.
  • Positions 3845 to 5849 are the DNA regions necessary for the rolling circle replication mode, that is, gene DNA, double-stranded origin of replication DSO (double-stranded origin) and single-stranded origin of replication SSO (single -stranded origin).
  • the present invention relates to a plasmid comprising DNA that hybridizes under stringent conditions to DNA that is complementary to the DNA constituting the plasmid represented by SEQ ID NO: 90, wherein the plasmid replicates in a rolling circle-type replication mode. It also includes plasmids that can be used.
  • the stringent condition refers to, for example, a condition in which the sodium concentration is 500 to 1000 mM, preferably 700 ⁇ , and the temperature is 50 to 70 ° C, preferably 65.
  • Such a plasmid has a full-length nucleotide sequence of 90% or more when calculated using the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 90 and BLAST or the like (for example, by using default, that is, using default parameters).
  • plasmid having a nucleotide sequence having a homology of 95% or more, more preferably 98% or more.
  • a gene, a double-stranded replication origin region DSO (double stranded or igin) and a single-stranded replication origin region SSO (single-st) expression vector containing a promoter sequence, a ribosome binding site sequence downstream thereof, and a multicloning site sequence capable of introducing a foreign gene downstream thereof are also encompassed by the present invention. .
  • it may contain a foreign gene and a transcription termination sequence, and the DNA sequence having promoter activity, the foreign gene and the transcription termination sequence constitute an expression cassette (Expression cassette).
  • the promoter sequence includes a promoter capable of inducibly expressing a foreign gene introduced downstream thereof by an inducing factor such as a drug, and a promoter capable of constitutively expressing a foreign gene independently of the inducing factor. included.
  • the former promoter capable of inducibly expressing a foreign gene includes, for example, a 77 gene promoter, which inducibly expresses a foreign gene downstream thereof in the presence of thostrepton.
  • the vector of the present invention may contain an appropriate promoter such as a TipA gene encoding the TipA protein, a 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ gene promoter for inducing the expression of the 7 ⁇ 4 gene, and the like.
  • the promoter for expression of the 7 ⁇ gene and the 77j3 ⁇ 44 gene constitutes an induc- er cassette.
  • the host cell is a bacterium belonging to the genus ⁇ ootococcw
  • the bacterium is susceptible to thiostrepton, and thus incorporates a thiostrepton resistance gene or the like that confers resistance to thiostrepton.
  • the / ⁇ gene promoter may be a sequence whose sequence is modified, such as the Z6 promoter.
  • the sequence of the four gene promoter is shown in FIG. Further, the latter constitutively capable of expressing a foreign gene, A promoter obtained by modifying a gene promoter is exemplified.
  • modified TipA gene promoter is a promoter in which a mutation has been introduced into the -10 region sequence of the TiM gene promoter motor.Specifically, a mutation in the -10 region sequence is added to the TATAAT sequence of the CAGCGT sequence. Promoters which are mutations of Further, as an example of such a promoter, the promoter contained in the sequence shown in FIG. 19 can be exemplified.
  • stringent DNA to the DNA having the promoter sequence shown in FIG. 12 or the DNA complementary to the DNA having the promoter sequence contained in the sequence shown in FIG. 19 is used.
  • Polynucleotides consisting of DNAs that hybridize under various conditions and having the same activity as the respective promoter activities can also be used as the promoter.
  • the stringent condition means, for example, a condition in which the sodium concentration is 500 to 1000 ⁇ , preferably 700 mM, and the temperature is 50 to 70 ° C, preferably 65 ° C.
  • Such a polynucleotide has a full-length nucleotide sequence of 90% or more, preferably 95% or more, when calculated using the nucleotide sequence of the above promoter and BLAST or the like (for example, by using default, that is, using default parameters). And more preferably a promoter consisting of a base sequence having 98% or more homology.
  • the present invention further includes a DNA region required for autonomous replication of a plasmid for Escherichia coli and a vector containing a selection marker for a transformant of Escherichia coli. It can be used as a shuttle vector with E. coli. At this time, Escherichia coli can be used as a constitutive expression vector. DNA regions required for autonomous replication of plasmids for E. coli (3 ⁇ 4El, Co / E2 sequence, etc.), and known transformants for E. coli, such as ampicillin resistance gene, can be used as selectable markers. Can be obtained from a known cloning vector for E. coli.
  • TipA gene promoter DNA region required for rolling circle replication mode
  • DSO double-st randed or igin
  • SSO single-stranded replication origin region
  • pTip-RT1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 94
  • pTip-RC1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 97
  • SEQ ID NO: 98 An example is pTip-RC2.
  • a vector having a promoter in which the mutation of the -10 region sequence of the 7 ⁇ 4 gene promoter is a mutation of the CAGCGT sequence to the TATAAT sequence is shown in SEQ ID NO: 101.
  • PNit-RT1 having a base sequence represented by SEQ ID NO: 102
  • pNit-RT2 having a base sequence represented by SEQ ID NO: 102
  • pNit-RC1 having a base sequence represented by SEQ ID NO: 105
  • sequence The salt represented by the number 106 PNi t-RC2 having a base sequence can be exemplified.
  • the stringent condition means, for example, a condition in which the sodium concentration is 500 to 1000 mM, preferably 700 mM, and the temperature is 50 to 70 ° C, preferably 65 ° C.
  • a vector has a full-length nucleotide sequence of 90% or less when calculated using the nucleotide sequence represented by the sequence number of the above vector and BLAST or the like (for example, using default, ie, default parameters). Above, preferably 95% or more, more preferably 98% or more of base sequences having a homology of 98% or more. The same applies to the following vectors represented by SEQ ID NOs.
  • the present invention further provides an MA region required for the above-described rolling cycle replication mode.
  • DNA regions required for autonomous replication include, for example, the JieM gene and the gene.
  • the gene and the DNA region containing the gene can be isolated from the endogenous plasmid PRE2895 isolated from the bacterium belonging to the genus i1 ⁇ 2oiococczA5, for example, .erythropolis; strain FCM2895.
  • the 1.9 kb region containing the J? Ej3 ⁇ 4 and ⁇ genes is from position 6233 to position 8166 of SEQ ID NO: 49, of which RepA 0RF is from position 6765
  • the DNA region containing the gene and the gene can be obtained by referring to the restriction map of the vector PHN129 (FIG. 1) described in Reference Examples below. It is a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA complementary to the DNA consisting of the nucleotide sequence represented by positions 6233 to 8166 of SEQ ID NO: 49, and confer autonomous replication ability to the vector. DNA can also be used as the gene of the present invention and as a 1.9 kb region containing the gene.
  • the stringent condition means, for example, a condition in which the sodium concentration is 500 to 1000 mM, preferably 700 mM, and the temperature is 50 to 70 ° C, preferably 65 ° C.
  • Such a DNA has a full-length nucleotide sequence from position 6233 to position 8166 of SEQ ID NO: 49. 90% or more, preferably 95% or more, and more preferably 98% or more when calculated using the base sequence represented by the position and BLAST or the like (for example, using default, that is, using default parameters).
  • DNA consisting of a base sequence having homology to The DNA region necessary for this autonomous replication is a promoter in which the -10 region sequence of the gene promoter has been mutated to the TATAAT sequence of the CAGCGT sequence, a liposome binding site sequence further downstream, and a foreign gene further downstream.
  • An expression vector containing an expression vector containing a multicloning site sequence capable of being introduced can constitutively express a foreign gene integrated into the multicloning site without depending on an inducing factor.
  • Such expression vectors include pNit-QT1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 99, pNit-QT2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 00, and SEQ ID NO: 103.
  • pTip-NH1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 49, which can inducibly express the introduced foreign gene in the presence of thiostrepton, and having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 50
  • pTip-NH2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51
  • pTip-CH2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 52
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 53 PTip-UHl
  • pTip-LNH2 having the base sequence of SEQ ID NO: 54
  • base sequence of SEQ ID NO: 55 PTip-LCH1, pTip-LCH2, pTip-CHl.K pTip-CH2.
  • the inducible expression vector must also contain an inducible set containing the TipA gene or a mutant thereof and a promoter for TipA gene expression, and a chiostrebton resistance gene.
  • the exogenous gene can be expressed by incorporating the exogenous gene into the expression vector of the present invention, introducing the gene into a host microorganism, and culturing the host microorganism. Integration of a foreign gene into an expression vector can be performed by a known genetic engineering technique, and introduction of an expression vector into a host microorganism can also be performed by a known technique. In addition, culture of host microorganisms should also be performed under appropriate conditions using a medium suitable for each microorganism. Culture may be performed under the following conditions. Host organisms that incorporate the vector include Rhodococcus sp. And E. coli.
  • the foreign gene is a gene encoding a target protein to be expressed using the vector of the present invention, and refers to a gene encoding a protein derived from an organism other than the host cell.
  • the protein to be expressed and produced using the vector of the present invention is not limited, and any protein can be a target.
  • a microorganism into which a host organism into which the expression vector of the present invention is introduced can grow at low temperature, for example,
  • R. erythropol is R. fascians and R. opacus ⁇ O) Rhodococcus WM ⁇ at a temperature suitable for normal microbial growth, i.e., at medium to high temperatures exceeding about 15 ° C.
  • Such a protein cannot be expressed at a temperature within the optimal growth temperature range of the host cell, but can be expressed at a temperature lower than the temperature within the preferred growth temperature range of the microorganism when the same or a different kind of host cell is used.
  • Proteins which are lethal to the host cell when expressed at a temperature within the preferred growth temperature range of the host microorganism, but whose temperature is lower than a temperature within the preferred growth temperature range of the same or a different type of host cell, A protein that is not lethal to the host cell, a temperature that, when expressed at a temperature within the preferred growth temperature range of the host cell, inhibits the growth of the host cell but is within the preferred growth temperature range of the same or a different type of host cell Proteins that do not inhibit the growth of those host cells at lower temperatures are referred to as inclusion bodies when expressed at temperatures within the preferred growth temperature range of the host cells Proteins that produce aggregates of inactive proteins but that are expressed as active, soluble proteins when expressed in those host cells at a temperature below the preferred growth temperature range for the same or different types of host cells. Examples include psychrophilic bacteria having a suitable growth temperature range of 20 ° C or less, metamorphic animals living in a low-temperature environment, and proteins derived from plants living in a low-temperature environment.
  • an inducible promoter contained in the expression vector of the present invention includes the TipA gene promoter.
  • expression production is induced by addition of thiostrepton.
  • thiostrepton may be added so as to have a final concentration of 0.1 g / ml or more, preferably 1 ⁇ g / ml or more. However, if it exceeds 10 / x / ml, growth will be poor.
  • the expression vector of the present invention contains a constitutive promoter, the exogenous gene is expressed and produced without adding an inducer.
  • expression vectors of the present invention expression vectors whose DNAs required for autonomous replication are different from each other are co-transformed into the same microbial cell at the same time, whereby the expression vectors are stably maintained in the cells, and each vector contains Exogenous genes can be expressed and produced simultaneously.
  • the foreign gene contained in each vector may encode the same protein or may encode a different protein.
  • the expression vector may be any combination of those capable of constitutively expressing a foreign gene and those capable of inducible expression, but a plurality of expression vectors differing in the DNA required for autonomous replication.
  • E. coli by selecting different replication origins for E. coli in the expression vector of the present invention, two types of proteins can be expressed simultaneously in E. coli.
  • FIG. 1 is a construction diagram of a plasmid pHN136 which is a packbone of an inducible expression vector. The positions of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. Numbers indicate base pairs (kilobase pair 1: kb).
  • FIG. 2 is a construction diagram of a plasmid PHN143 having a thiostrepton resistance gene. The positions of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. Numbers are base pairs Spare: kb).
  • CIAP stands for Cal f Intestine Alkaline Phosphatase, Blu. Stands for Blunt end.
  • FIG. 3 is a construction diagram of a plasmid PHN62 having an inducer cassette. The locations of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. Numbers indicate base pairs (kilobase pair-one: kb). Blu. Means Blunt end.
  • FIG. 4 is a construction diagram of a plasmid PHN153 having an express ion cassette. The locations of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. Numbers indicate base pairs (kilobasers: kb). CIAP stands for (Cal f Intestine Alkaline Phosphatase; Blu. Means Blunt end).
  • FIG. 5 is a construction diagram of a plasmid PHN169 having a tetracycline resistance gene. The positions of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. The numbers indicate base pairs (kilobase spares: kb).
  • CIAP means Cal f Intestine Alkaline Phosphatase, Blu. Means Blunt end.
  • FIG. 6 is a construction diagram of an inducible expression vector plasmid PHN170, ⁇ having PIP as a repo overnight gene. The positions of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. Numbers indicate base pairs (kilobase pair-one: kb).
  • CIAP means Calf Intestine Alkaline Phosphatase.
  • FIG. 7 is a construction diagram of an inducible expression vector plasmid pTip-NHL pTip-CHL pTip-LNHK pTip-LCHI having a multiple cloning site.
  • the restriction enzyme recognition site and the location of the structural gene are shown in the figure.
  • the numbers indicate base pairs (kilobase pairs: kb).
  • FIG. 8 is a construction diagram of an inducible expression vector plasmid pTip-NH2, pTip-CH2, pTip-LNH2, and pTip-LCH2 having a multiple cloning site.
  • the restriction enzyme recognition site and the location of the structural gene are shown in the figure.
  • the numbers indicate base pairs (kilobase pairs: kb).
  • FIG. 9A is a diagram showing a map of Tip-NHL pTip-CHK pTip-LNHL pTip-LNHh pTip-view, pTip-CH2, pTip-LNH2, and pTip-LCH2. The function of each region and the map of the plasmid are shown.
  • Figure 9b shows the 77T ⁇ gene promoter sequence of pTip-NH1, pTip-LNHl, or 77 / ⁇ 4- £ 6 DNA sequence from promoter sequence to multiple cloning site and gene transcription termination sequence.
  • FIG. 9c shows the DNA sequence from the 77 / ⁇ 4 gene promoter sequence of pTip-CH1, pTip-LCH1 or 4-Zff promoter sequence to the multicloning site and the 73 ⁇ 4 gene transcription termination sequence.
  • FIG. 9 d shows the DNA sequence from the pTip-NH2, pTip-LNH2 gene promoter sequence or 77; ⁇ 4- ⁇ ? Promoter sequence to the multiple cloning site and the 3 ⁇ 4 gene transcription termination sequence.
  • FIG. 9e shows the DNA sequence from the promoter sequence of 7 genes of pTip-CH2 and pTip-LCH2, or the J7i ⁇ -Z6? Promoter sequence to the multiple cloning site and the 3 ⁇ 4 gene transcription termination sequence.
  • FIG. 10 is a diagram showing a map of Tip-CH1.1, Tip-LCH1.1, pTip-CH2.1 and Tip-LCH2.1.
  • FIG. 11 is a construction diagram of control plasmid ⁇ 2 and PHN173 for measuring PIP activity. The positions of the restriction enzyme recognition site and the structural gene are shown in the figure. The numbers indicate base pairs (kilobase spares: kb).
  • CIAP means Calf Intestine Alkaline Phosphatase. ⁇ has both “Expression cassettej” and “Inducer cassettej, whereas PHN173 has only“ Expression cassettej ”and pHN172 does not have both cassettes.
  • FIG. 12 is a diagram showing a gene promoter sequence.
  • FIG. 13 shows the improvement of the / gene promoter to the 77-promoter.
  • FIG. 14 is a diagram showing a map of PRE8424.
  • the main restriction enzyme recognition sites are indicated in the figure, and the open reading frame (0RF) is indicated by an arrow.
  • the positions of DS0 and SS0 are indicated by squares.
  • FIG. 15 is a diagram showing the amino acid sequences of five conserved regions (Motif IV ⁇ Motif L Motif ILMotif III, C-terminal mot if) of the Rep protein of pRE8424, pAPL pBLL pJVL pIJlOL pSN22. Tyrosine residues that are important for the function of the Rep protein are boxed.
  • FIG. 16 is a diagram showing a DNA sequence which is particularly conserved among sequences considered to be DSO of pRE8424, pAPl, pBLK pJVL pIJlOK pSN22.
  • FIG. 17 is a diagram showing SS0 of PRE8424, that is, the sequence of nucleotide numbers 5268 to 5538 of SEQ ID NO: 90 in the sequence listing, and its possible secondary structure.
  • FIG. 18-1 shows a map of the pTip vector.
  • Fig. 18-2 is a diagram showing a map of the pNit vector.
  • FIG. 19 is a diagram showing the MA sequence of TipA-LGlOp-MCS-ALDH Nit-LGIO-MCS-ALDHi.
  • the wild-type -10 region sequence of the 77 ⁇ gene promoter is GCGT, and the -10 region sequence of the Nit promoter is TATAAT, each of which is surrounded by a square.
  • FIG. 20 is a diagram showing the results obtained by transforming the R. eryro / Ls KM3201 strain with pHN380, pHN410, pHC, pHN387, and PHN389, and measuring the peptidase activity of PIP.
  • Figure 21 shows the integration of PIP and GFP into two non-incompatible vectors, expression and purification in a single R. ery JCM3201 cell, followed by SDS polyacrylamide electrophoresis. It is a photograph showing the result of staining with Liant Green G-250. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Rhodococcus erythropoli and E. coli we first searched for a small endogenous plasmid present in Rhodococcus bacteria. Then, its presence was confirmed in Rhodococcus ery ro ⁇ is KM2895 strain. This plasmid was named PRE2895. The following is a specific description of plasmid isolation and its DNA sequencing.
  • Rhodococcus erythropolis strain JCM2895 was added to 5 ml of LB medium (1% Difco Bacto).
  • the above DNA sample was treated with restriction enzyme coRI and subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis (100 V, 30 minutes). As a result, the presence of one DNA fragment of about 5.4 kb was confirmed.
  • the approximately 5.4 kb MA fragment was excised from the gel, and the QIAdiiick Gel Extraction Kit was used.
  • PN30 is an endogenous plasmid PAL5000 isolated from Mycobacterium for tui turn 002 strain.
  • PAL5000 is sufficient for autonomous replication in each bacterium only in the region containing the putative ⁇ gene, putative gene, and putative origin of replication
  • PRE2895 isolated by the present inventors expresses only the same region. If incorporated in the evening, it is considered sufficient for autonomous replication in Rhodococcus bacteria. Was.
  • PCR oligodeoxyliponucleotide primers
  • the PCR enzyme used was Pfu turbo (manufactured by STRATAGENE).
  • Pfu turbo manufactured by STRATAGENE.
  • An Okb-amplified DNA containing the ampicillin resistance gene (Amp f in the figure) and the ⁇ 7E1 sequence region necessary for autonomous replication in E. coli was obtained.
  • This DNA fragment was double-digested with Scl and _ restriction enzymes, subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis (100 V, 30 minutes), cut out from the DNA fragment, and used with the QIAduick Gel Extraction Kit. Purified according to.
  • primers were designed to amplify a region deemed necessary for autonomous replication in bacteria of the genus ⁇ oiococc.
  • the sequence of the same primer is shown by SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing.
  • the two purified DNA fragments were ligated using DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) according to the manufacturer's instructions, and the resulting plasmid was named PHN129.
  • Amplification by PCR was performed using the primer described in 6.
  • a 0.5 kb DNA fragment obtained by double digesting this PCR fragment with BgJll and Pstl was subcloned into the alI and Pstl sites of PHN129.
  • the part connected by and is estimated As a result, the part connected by and is estimated Although within the gene's open reading frame (hereinafter abbreviated as 0RF), the BaEi recognition site was removed without replacing the encoded amino acid.
  • the Sa recognition site was located very close to the BanEi recognition site, it was designed so that the recognition site was excluded and the amino acid to be coded was not substituted in the primer set forth in SEQ ID NO: 5. Therefore, the ⁇ 3 ⁇ 4 recognition site is also removed at the same time as the recognition site.
  • This plasmid was named PHN135.
  • amplification by PCR was performed using the plasmid PHN135 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 5 and 6 in the sequence listing.
  • a 0.5 kb DNA fragment obtained by double digesting this PCR fragment with Pstl and 1 was subcloned into the Ps and Bglll sites of pHN135.
  • the portion linked to Banl and BgJU was the 0RF portion of the putative gene, but the recognition site was removed without replacing the encoded amino acid.
  • the resulting plasmid was named PHN136.
  • tiostreptone Antibiotics, tiostreptone, are used to induce protein expression, but 1 ⁇ 2i ⁇ OCOCC erythropolis is susceptible to the same substance and must be conferred resistance. Therefore ? ⁇ / rezAS possesses the thiostrepton resistance gene, tsr gene (Bibb et al., Mol. Gen. Genet. 19926-36 [1985]: In the figure,
  • Thio 1 was incorporated into the composite vector. It has been reported that this gene functions in Rhodococcus erythropolis and confers resistance to thostrevuvone (Shao and Behki, Lett. Appl. Microbiol. 21261-266).
  • genomic DNA of the eiw JCM4217 strain to be used as a PCR template was prepared as follows. 5 ml of SB medium (1% Difco Bacto Try tone,
  • protease K solution (20 mg / ml) and 60 / l of sodium dodecyl sulfate solution (10%) were added, mixed well, and incubated with 55 ⁇ for 2 hours. Thereafter, 200 l of a sodium chloride solution (5 M) and 500 n1 of closin form were added, and the mixture was rotated and stirred at room temperature for 20 minutes. Centrifuged and collected 700 supernatants. This was precipitated with isopropanol, dried, and dissolved in 50 l of a TE solution (10 M Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA [pH 8.0]).
  • Amplification by PCR was performed using the primers described in 9,10. Platinum Pix DNA polymerase was used for this PCR. A 0.6 kb DNA fragment obtained by digesting one end of this PCR fragment with, was purified, and the 5 'end on the blunt end side was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method. On the other hand, amplification was performed by PCR using the plasmid PHN137 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 11 and 12 in the sequence listing. In this PCR, platinum Pfx DNA polymerase was used. Obtained by digesting one end of this PCR fragment with coRI
  • the 0.5 kb DNA fragment was purified, and the 5 'end on the blunt end side was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method.
  • T4-polynucleotide kinase As a result of subcloning these two PCR fragments into the plasmid pGEM-3 ⁇ (! In the portion linked by, the recognition site was removed without replacing the encoded amino acid in the ORF portion of the gene.
  • This plasmid was named PHN143.
  • TipA protein must be present in the genus Rhodococcus for inducible expression by thostrepton.
  • Rhodococcus A structural gene encoding TipA protein was ligated downstream of the promoter (Fig. 3).
  • the promoter sequence of the gene encoding the aldehyde dehydrogenase-like protein of odococcus erythropolis (Nagy et al., J. Bacteriol. 676-687 [1995]) is used.
  • the promoter sequence of the gene encoding the aldehyde dehydrogenase-like protein of odococcus erythropolis Nagy et al., J. Bacteriol. 676-687 [1995]
  • the genomic DNA of the Septomyces coe / Co / or A3 (2) strain used as a template was worked and purified in the same manner as when genomic DNA was prepared from Streptomyces azureus.
  • the genomic DNA of Rhodococcus erythropolis JCM3201 strain was purified and worked in the same manner as when genomic DNA was prepared from Streptomyces azureus, except that it was cultured in 5 ml of LB medium. .
  • Amplification by PCR was performed using the genomic DNA of the Strep tomyces coelicolor A3 (2) strain purified as described above as a template and the primers of SEQ ID NOS: 13 and 14 in the sequence listing.
  • platinum Pix DNA polymerase was used.
  • DNA containing the 0RF of the gene and a transcription termination sequence downstream thereof was obtained.
  • amplification by PCR was performed using plasmid PHN33 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 9 and 17 in the sequence listing.
  • platinum Pix DNA polymerase was used.
  • a 0.5 kb DNA fragment obtained by digesting one end of this PCR fragment with IM was purified, and the 5 ′ end on the blunt end side was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method.
  • amplification by PCR was performed using plasmid PHN33 as a template and primers of SEQ ID NOS: 18 and 12 in the sequence listing.
  • Platinum Pfx DNA polymerase was used for this PCR.
  • PCR amplification was performed using plasmid PHN33 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 9 and 19 in the sequence listing.
  • platinum Pix DNA polymerase was used.
  • the 0.8 kb DNA fragment obtained by digesting one end of this PCR fragment with Xbai was purified and further blunt-ended by a conventional method.
  • the 5 'end was phosphorylated by T4-polynucleotide kinase. Meanwhile, the plasmid
  • primers described in SEQ ID NOs: 20 and 12 in the sequence listing Amplification by PCR was carried out using —.
  • platinum Pfx DNA polymerase was used.
  • One end of this PCR fragment was digested with Kpnl to obtain a 0.3 kb DNA fragment, which was purified, and the blunt-end 5 ′ end was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method.
  • pHN62 A plasmid having 74 genes lacking both restriction enzyme sites was obtained and named pHN62.
  • PIP 101-105 [1996]: hereinafter referred to as PIP
  • 0RF indicated as PIP 0RF in the figure
  • the primer of SEQ ID NO: 24 in the sequence listing is designed so that the 6XHis tag is added to the C-terminus of the PIP protein in order to remove the termination codon of the gene and to facilitate protein purification.
  • the 6XHis tag is a contiguous sequence consisting of six consecutive histidine residues, and a protein fused with the tag has high affinity for nickel ions and the like. Therefore, purification by metal chelate chromatography using nickel ions or the like is easy and easy (Crowe et al., Methods Mol. Biol. 31 371-387 [1994]).
  • the 0.9 kb DNA fragment from the PIP gene was double-digested with the restriction enzyme Nco ⁇ and subcloned into the Nco site of pHN150u. As a result, a plasmid containing the 0RF of the gene was created immediately downstream of the promoter sequence of the gene. It was named pHN151u.
  • PCR amplification was performed using the primer described in SEQ ID NOS: 25 and 26 in the sequence listing, using the genomic DNA of the CM3201 strain as a template (4) went.
  • DNA containing the transcription termination sequence of the ⁇ ⁇ gene (Nagy et al., J. Bacteriol. 177676-687 [1995]: indicated as ALDHt in the figure) was obtained.
  • This 0.2k DNA fragment was double-digested with the restriction enzymes Spd and Xba ⁇ and subcloned into pHN151u (D SpeL i3 ⁇ 4al site.
  • the 0RF of the P gene was immediately downstream of the 7;
  • a plasmid containing a transcription termination sequence of the HA gene immediately downstream of the plasmid was created, and named PHN153.
  • Transformation of Rhodococcus erythropolis with a plasmid requires an appropriate transformation marker. Therefore, we decided to connect and use a drug resistance gene downstream of a strong promoter that functions in genus bacteria.
  • the Tufl gene promoter encoding Elongation factor Tu derived from 5 rej3 OTyc bacteria was used because it has been reported that the promoter strongly transcribes downstream genes (Wezel et al., Bioc im.
  • PCR was performed using the genomic DNA of Strep tomyces coe (3 ⁇ 4i? R A3 (2) strain purified in (4) above as a template and the primers of SEQ ID NOs: 27 and 28 in the sequence listing. As a result, an amplified DNA of 0.2 kb containing the promoter sequence of the gene (denoted as Tuf lp in the figure) was obtained, and platinum Pfx DNA polymerase was used in this PCR.
  • This fragment was purified, the 5 'end was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method, and then subcloned into the Hini site of plasmid pBluescript II t SK (+) (subcloned.
  • the orientation is from the 5 'direction of the DNA to the Kjrnl recognition site-: ⁇ // gene promoter sequence-coRI recognition site).
  • This plasmid was named PHN158.
  • amplification was performed by PCR using plasmid PHN159 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 33 and 34 in the sequence listing.
  • Pfu turbo DNA polymerase was used.
  • One end of this PCR fragment was digested with 1 to obtain a 1. Ikb DNA fragment, which was purified, and the 5 'end on the blunt end side was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method.
  • amplification was performed by PCR using plasmid PHN159 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 31 and 35 in the sequence listing.
  • Piu turbo DNA polymerase was used.
  • a 0.8 kb DNA fragment obtained by digesting one end of this PCR fragment with Xho ⁇ was purified, and the blunt-end 5 'unterminated end was digested with T4-polynucleotide kinase by a conventional method. Phosphorylated.
  • PCIU amplification was performed using plasmid PHN159 as a template and primers of SEQ ID NOs: 36 and 34 in the sequence listing.
  • Pfu turbo DNA polymerase was used.
  • a 0.8 kb DNA fragment obtained by digesting one end of this PCR fragment with No was purified, and the 5 'end on the blunt end side was phosphorylated with T4-polynucleotide kinase by a conventional method. .
  • pHN152 a 1.1 kb DNA fragment obtained by double digestion of PHN62 with J3l and K was subcloned into the Xba ⁇ site of pHN144.
  • the resulting plasmid was named pHN152.
  • PHN154 a 1.2 kb DNA fragment obtained by double digestion of PHN153 with Xba ⁇ was subcloned into the BsrGL Spel site of PHN152.
  • the resulting plasmid was named PHN154.
  • a 1.6 kb DNA fragment obtained by double digestion of pHN169 with Spel was subcloned into the Xbal site of pHN154 (the subcloned direction was from the 5 'direction of DNA. -Tetracycline resistance gene 0RF-J3 ⁇ 4 gene promoter sequence).
  • a plasmid containing the gene under the control of the gene promoter was created, and the resulting plasmid was named ⁇ .
  • a sequence derived from lambda phage gene 10 which is considered to have high translation efficiency, has a ribosome binding site downstream of the TiM gene motor for high expression of the recombinant protein.
  • a hybrid promoter consisting of the 77; ⁇ gene promoter and a ribosome binding site derived from the lambda phage genelO (hereinafter referred to as the 7 ⁇ 4-Z6 promoter):
  • Figure 13 shows the improvement of the ribosome binding site (RBS) sequence for changing the 77 ⁇ promoter to a promoter.
  • RBS ribosome binding site
  • the end is ready to be ligated to the vector double-digested with col and Si7el, and this double-stranded synthetic DNA (denoted as MCS Linker ⁇ co in the figure) is converted to ⁇ oI, Spel
  • the site was subcloned.
  • the resulting plasmid was named pTip-NH1.
  • the synthetic oligodeoxyliponucleotides described in SEQ ID NOs: 40 and 41 in the sequence listing are also double-stranded.
  • the synthesized DNA (indicated as MCS Linker CNco in the figure) was subcloned into the 5 ⁇ 1 site of pHN170.
  • the resulting plasmid was named pTip-CH1.
  • the hybrid DNA comprising the ribosome binding site derived from the gene promoter sequence and lambda phage ize was double-digested with the restriction enzymes ⁇ I and ol, and the Bs Ncol of pTip-NHl and pTip-CH1 was digested. Each site was subcloned.
  • the resulting plasmids were named pTip-LNH1 and pTip-LCH1, respectively.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid ⁇ as a template and the primers shown in SEQ ID NOS: 21 and 42 in the sequence listing. as a result, A DA containing the gene promoter was obtained. This 0.2 kb DNA fragment was double-digested with the restriction enzyme ⁇ I and Ndel, and subcloned into the ⁇ I, d site of PHN170. The resulting plasmid was named PHN183.
  • the synthetic oligodeoxyliponucleotides described in SEQ ID NOs: 43 and 44 in the sequence listing include sequences that serve as multiple cloning sites and have mutually complementary sequences. The two are mixed in equimolar amounts, treated with 70 for 10 minutes, cooled to room temperature over 20 minutes,
  • Amplification by PCR was performed using plasmid pTip-LNH1 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 21 and 47 in the sequence listing.
  • hybrid DNA comprising a gene promoter and a ribosome binding site derived from lambda phage gene 10 was obtained.
  • This 0.2 kb DNA fragment was double-digested with the restriction enzymes ⁇ 53 ⁇ 4I and d, and subcloned into the ⁇ I and el sites of pTip-NH2 and pTip-CH2, respectively.
  • the resulting plasmids were named pTip-LNH2 and pTip-LCH2, respectively.
  • FIG. 9 shows the map of the plasmids prepared in the above (8) and (9) and the sequence around the multiple cloning site.
  • the solid arrow indicates an inverted repeat sequence present in the gene promoter.
  • the hatched arrow indicates the inverted repeat sequence present in the 3 ⁇ 4 ⁇ gene transcription termination sequence.
  • the -10 region, -35 region, and RBS which are generally present in prokaryotic promoter regions and are important for gene transcription, are boxed.
  • the most important SD sequence among RBS is underlined.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid pTip-CH1 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 21 and 48 in the sequence listing.
  • DNA containing the / ”3 ⁇ 44 gene port monitor and the multiple cloning site was obtained.
  • This 0.3 kb DNA fragment was double-digested with the restriction enzyme jBsii and 1 and subcutinated at the ⁇ ⁇ and Spel sites of pTip-CH1.
  • the resulting plasmid was named pTip-CHI.1.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid pTip-CH2 as a template and primers of SEQ ID NOS: 21 and 48 in the sequence listing.
  • DNA containing the gene promoter overnight and a multiple cloning site was obtained.
  • This 0.3 kb DNA fragment was double-digested with the restriction enzyme ⁇ rtil and subcloned into the ⁇ / «I and Spel sites of pTip-CH1.
  • the resulting plasmid was named pTip-CH2.1.
  • Amplification by PCR was performed using the plasmid pTip-LCH1 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 21 and 48 in the sequence listing.
  • DNA containing the TipA-LG10 promoter and a multi-cloning site was obtained.
  • This 0.3 kb DNA fragment was double-digested with the restriction enzymes BsiHl and ⁇ el and subcloned into the ⁇ 1 and Spel sites of pTip-CH1.
  • the resulting plasmid was named pTip-LCH1.1.
  • Amplification by PCR was performed using plasmid pTip-LCH2 as a template and the primers of SEQ ID NOS: 21 and 48 in the sequence listing.
  • DNA containing the TipA-LG10 promoter and a multiple cloning site was obtained.
  • This 0.3 kb DNA fragment was double-digested with the restriction enzymes ⁇ il and ⁇ el, and subcloned into pTip-CH1 at the ⁇ and Spel sites.
  • the resulting plasmid was named pTip-LCH2.1.
  • a 1.6 kb DNA fragment obtained by double digestion of PHN169 with Xba ⁇ and Sel was subcloned into the Xbal site of pHN144 (the subcloned direction was the tsr gene 0RF-tetracycline from the 5 'direction of DNA). Resistance gene 0RF-ampicillin resistance gene 0RF).
  • the resulting plasmid was named ⁇ 2.
  • PHN164 was obtained by double digestion with Xbal and Spel.
  • a 1.6 kb DNA fragment was subcloned into the Xba ⁇ site of pHN164 (the direction of subcloning was gene 0RF-tetracycline resistance gene 0RF-ampicillin resistance gene 0RF from the 5 'direction of DNA).
  • the resulting plasmid is named ⁇ 3 I put on.
  • ⁇ is a gene cassette (hereinafter referred to as an expression cassette) to which three factors, a gene promoter, a downstream gene and a 73 ⁇ 4 gene transcription termination sequence, are further downstream, and a TIicA gene promoter, and a downstream tip It has a gene cassette (hereinafter referred to as “Inducer cassette”) to which the two factors A and A are linked.
  • an expression cassette to which three factors, a gene promoter, a downstream gene and a 73 ⁇ 4 gene transcription termination sequence, are further downstream, and a TIicA gene promoter, and a downstream tip It has a gene cassette (hereinafter referred to as “Inducer cassette”) to which the two factors A and A are linked.
  • PHN173 has only an expression cassette, and PHN172 does not have both cassettes.
  • Each 400 xl was dispensed, flash frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 ° C until use.
  • the cells were taken out from -80 ° C, thawed on ice, and 3 ⁇ (about 300 ng each) of plasmid pHN170, pHN172, or pHN173 was added.
  • the mixture of the bacterial cells and DNA was transferred to an election-portion cuvette (Bio-Rad: 0.2 cm gap cuvette), and its electric field intensity was set to 12.5 kV / cm using the gene introduction device Genepulsa-1.
  • the pulse controller was set to an electric pulse with a capacitance of 25 F and an external resistance of 400 ⁇ .
  • the mixed solution of the cells and DNA subjected to the electric pulse treatment was mixed with 1 ml of LB medium, cultured at 30 ° C for 4 hours, and then collected.
  • the LB agar medium containing 20 g / ml tetracycline (agar concentration: 1.8%) Then, the cells were cultured at 30 ° C. for 3 days to obtain each transformant.
  • Kit Purification was performed using Kit (Qiagen) according to the instruction manual. Streptomyces coe / (3 ⁇ 47o "A3 (2) strain, R. Method for separating genomic DNA of DSM313 strain, and
  • the method for purifying plasmid DNA from J1 ⁇ 20 is the same as that described in Reference Example 1.
  • the genomic DNA of E. coli strain ER2508 (New England Biolabs) is QIAGEN
  • T4 DNA ligase was used.
  • Tables 1 and 2 list the main plasmids and strains used. bacteria of the genus i ⁇ oiococc,
  • Wr ⁇ M7yc ⁇ coe // co orA3 strain and E. coli were cultured with LuriaBroth (LB; 1% Bacto try ton, 0.5% Bacto yeast extract, 1% sodium chloride).
  • Rhodococcus bacterium and the method for transformation are described in Reference Example 1.However, when preparing a bacterium bacterium containing a plasmid in advance, an appropriate antibiotic should be used. This was performed from cells cultured in LB medium. When selecting transformants, use tetracycline (8 ⁇ g / ml in liquid medium, 20 iig I ml in solid medium), chloramphenicol (34 ng I ml) and ampicillin (50 g / ml). Using.
  • Proline iminopeptidase hereinafter referred to as PIP
  • GFP fluorescent green protein
  • the appropriate transformant of oiococc bacteria should be included Culture in LB medium at 30 ° C, and when the optical density (0.D.600) measured at a wavelength of 600 nm reaches 0.6, thiostrepton is adjusted to a final concentration of lzg / ml. (Solvent was dimethyl sulfoxide), and the culture was continued for another 16 hours.
  • transformants of Rhodococcus sp The cells were cultured in an LB medium at 30 ° C. until the DD 600 became 2.0.
  • the method for measuring the peptidase activity of PIP is described in detail below.
  • the culture solution of the bacterium belonging to the genus J ⁇ o ⁇ cocc expressing PIP as described above is made up to 200 l with 8 / ml of LB medium containing an appropriate antibiotic, and added at 60 ° C for 1 minute. Warm up. Then add 2 l of H-Pro-jSNA (100 mM; solvent is dimethyl sulfoxide) as a substrate of PIP and incubate at 60 ° C for 20 minutes (PIP is 60 ° C optimal temperature).
  • the optical density of the cell at 550 nm is also measured, so the optical density of the cell at 550 nm (0.D. 550) is measured separately and the value corresponding to the OD550 used at the time of measurement is measured.
  • the present inventors searched for a novel endogenous plasmid present in A erWiinw) /, and found R erythropolis JCM2893, R. erythropolis JCM2894, R. erythropolis DSM43200,
  • Small circular plasmids were isolated from four strains of R. ery DSM8424 and named pRE2893, PRE2894, pRE43200> PRE8424, respectively.
  • RepA and RepB proteins have the genes encoding the RepA and RepB proteins to be provided as operons, and these proteins are isolated from Mycobacterium fortuitum and are highly similar to the RepA and RepB proteins encoded by the 1 pAL5000 plasmid, and pRE2895 And PAL5000 autonomously replicated in a similar manner (Stolt and Stoker, Microbiology 142 2795-2802 [1996], Reference Example 1).
  • RRE8424 had a DNA sequence completely different from that of pRE2 ⁇ 5 (SEQ ID NO: 90 in the sequence listing, FIG. 1).
  • This plasmid has six open reading frames
  • DS0 double-stranded origin
  • the SS0 sequence generally has an advanced secondary structure such as a stem-loop structure, and in the case of a plasmid of the pIJ101 / pJVl family, a common sequence such as TAGCGT is often present in the loop portion of the stem-loop structure.
  • SS84 of PRE8424 also has an advanced secondary structure, and has a TAGCGG sequence in the loop (Fig. 17).
  • the present inventors have found that the derived plasmid of PRE8424 having the above mutation in TAGCGG was accumulated as a large amount of single-stranded DNA in R. erW ro / cell. Since single-stranded DNA accumulation is a hallmark of a rolling circle type plasmid (Khan, Microiol. Moi. Biol. Rev. 61442-455 [1997]), pRE8424 replicates autonomously in a rolling circle format. Became clear.
  • Figure 14 shows the map of PRE8424.
  • major restriction enzyme recognition sites are shown, and six 0RFs are indicated by arrows.
  • the positions of DS0 and SS0 are indicated by squares.
  • Figure 15 shows five conserved regions of the Rep protein of pRE8424, pAPl, pBLK pJVK pIJlOK pSN22 (Motif IV, Motif I, Motif II, Motif III, C-terminal motif;
  • FIG. 16 shows the particularly conserved DNA portion of the sequences considered to be DSO of pRE8424, pAPL pBLL pJVK pI JOL O pSN22.
  • GG dinucleotides that are particularly important for the function of DS0 are underlined (see Billington et al., J. Bacteriol. 7 ⁇ 3233-3236 [1998]).
  • FIG. 17 shows SS0 of pRE8424, that is, the sequence of nucleotide numbers 5268 to 5538 of SEQ ID NO: 90 in the sequence listing, and its possible secondary structure.
  • the prediction of the secondary structure is performed by mfold program, vers ion 3.0 (Michael Zuker, Washington University, St. Louis, Mo .; ht tp: // w w. Bioinfo. Rpi. Edu / appl icat ions / mfold / old / dna / forml. cgi).
  • the above TAGCGG sequence is indicated by a black circle.
  • An unnecessary restriction enzyme recognition site BaMl was present in the 2.0 k region essential for autonomous replication of PRE8424, and the work to remove it was performed as follows.
  • Amplification of DNA by PCR was performed using PRE8424 as a template and synthetic oligodeoxyliponucleotide primers (hereinafter abbreviated as primers) described in SEQ ID NOs: 57 (sHN389) and 58 (sHN390) in the sequence listing. went.
  • the resulting 1.0 kb fragment contains part of the 5 'end of?. The 5 'end of this fragment is phosphorylated and pBluescript I I SK (+)
  • PHN372 has a 2.0 k region essential for autonomous replication of pRE8424, and the Ban i site present in PRE8424 has been removed. Removal of the 3 ⁇ site did not affect the function of autonomous replication of PRE8424.
  • the genomic DNA of R erythropolis DSM 313 was templated ⁇ , and SEQ ID NO: 61 (SHN335 ), 62 (sHN336), and DNA was amplified by PCR.
  • the primer was designed based on the sequence having the highest homology between the csrl gene and the gene. As a result, an amplified band of 0.7 kb was confirmed. When the DNA sequence of this PCR product was determined, it had extremely high homology to the Cr gene.
  • primers represented by SEQ ID NOS: 63 (sHN349) and 64 (sHN351) in the sequence listing were designed, and were subjected to inverse PCR.
  • the full length chloramphenicol resistance gene of Rerythropolis DSM 313 was isolated.
  • the DNA used as the template is i ?.
  • 0.1 ng of genomic DNA of DSMS1S strain was cut with 5a / I and self-cyclized with ligase.
  • the resulting PCR product was 2.3 kb, and the entire DNA sequence of this fragment was determined. There was one 0RF in this fragment, and the gene was named ⁇ / ⁇ (denoted Chlr in the figure).
  • Amplification of DNA was performed by PCR using the genomic DNA of R. erythropolis DSM 313 strain as a template and the primers of SEQ ID NOS: 65 (sHN361) and 66 (sHN362) in the sequence listing. The obtained 0.5 kb fragment was used for the chloramphenicol resistance gene.
  • a 1.8 kb fragment containing the chloramphenicol resistance gene was excised from PHN346 (Example 4) with Xba ⁇ and d and introduced into the site of pHN154 (Japanese Patent Application No. 2002-235008).
  • the resulting plasmid was named PHN347.
  • a 1.1 kb fragment was excised from ⁇ ⁇ (see Reference Example) with 5 pd and introduced into the BsrGl I Spel site of PHN347.
  • the resulting plasmid was named PHN348.
  • Both PHN171 and PHN348 are expression vectors in which the repo overnight gene and PIP have been introduced into the MCS of the pTip vector (see Reference Example), whereas PHN171 has a tetracycline resistance gene as a transformation marker. Only differ in that they carry the chloramphenicol resistance gene.
  • the ribosome binding site sequence (TipA-RBS) originally present downstream of the ⁇ gene promoter was changed to a ribosome binding site sequence derived from pacteriophage gene 10 with high translation efficiency. Yes ( Promoter; see Reference Example).
  • the 6XHis tag is designed at the C-terminal side of PIP to facilitate protein purification.
  • the 6XHis tag is a contiguous sequence consisting of six consecutive histidine residues, and a protein fused with it has a high affinity for nickel ions and the like. Therefore, purification is facilitated by metal chelate chromatography using nickel ions or the like (Crowe et al., Methods Mol. Biol. 31 371-387 [1994]).
  • DNA was amplified by PCR using PHN171 as a template and primers described in SEQ ID NOs: 69 (sHN368) and 70 (sHN373) in the sequence listing.
  • 0.2 kb obtained Fragment contains the 5 'end of the thiostrepton resistance gene (r gene; denoted as Thior in the figure) (Bibb et al., MoI. Gen. Genet. 199 26-36 [1985]).
  • This fragment was digested with BsrQl and CM and introduced into the ⁇ ⁇ and ⁇ 348 at the / GI I CM site, respectively.
  • the resulting plasmids were named PHN357 and PHN358, respectively.
  • Example 3 A 2.0 kb fragment from PHN372 (Example 3) containing a region essential for autonomous replication of the plasmid presented in PRE8424 was excised with ⁇ I and ffpal, and introduced into the Bsi / Hpal sites of pHN357 and pHN358, respectively.
  • the resulting plasmids were named pHN379 and PHN380, respectively.
  • the synthetic oligodeoxyliponucleotides described in SEQ ID NOs: 71 and 72 in the sequence listing include sequences that become MCS sites and have mutually complementary sequences. These two were mixed in equal volumes, treated at 70 ° C for 10 minutes, cooled to room temperature over 20 minutes, and 2. stranded (MCS type 1). As a result, the end is ready to be ligated to the vector double-digested with cd and & d, and the double-stranded synthetic DNA is ligated with pHN379 and pHN380 Nco ⁇ I
  • the resulting plasmid Were named pTip-RT2 and pTip-RC.
  • pTip-RT1 a fragment containing a 0.3 kb ⁇ gene, one of LG10_RBS, and MCS type 1 was excised with ⁇ I and Suel, and introduced into the ⁇ I Spel sites of pHN171 and PHN348, respectively.
  • the resulting plasmids were named pTip_QTl and pTip-QCl.
  • pTip-RT2 From pTip-RT2, a fragment containing a 0.3 kb 7j ⁇ gene promoter, LG10-RBS, and MCS type 2 was excised with JI and & and introduced into the /// Spel sites of ⁇ and ⁇ 348, respectively.
  • the resulting plasmids were named pTip-QT2 and pTip-QC2.
  • Figure 18-1 shows a map of pTip vectors (pTip-QTl, pTip-QT2, pTipRTl, pTip-RT2, pTip-QC1, pTip-QC2, pTip-RCK pTip-RC2).
  • Thior is the thiostrepton resistance gene
  • Tuflp is the Tufl gene promoter
  • T ⁇ tr is the tetracycline resistance gene
  • Chlr is the chloramphenicol resistance gene (each pTip-vector is either Tuilp-Tetr or Chlr.
  • ALDH is the TJwA promoter that transcribes the TJ'PA gene (TipA), Ampr is the ampicillin resistance gene, ColEl is the E. coli origin of replication, ALDHt is the 3 ⁇ 4 gene transcription termination sequence, MCS Indicates a multicloning site (each pTip-vector has one of MCS typel or MCS type 2), TipAp is a gene promoter, TipA-LGlOp is a Z6 promoter, and Rep is a region essential for autonomous replication of plasmid in?.
  • FIG. 20 shows the DNA sequence of the TipA-LG10 promoter X2 motor MCS-73 ⁇ 4 gene terminator.
  • solid arrows indicate an inverted repeat sequence present in the 7j ⁇ gene promoter.
  • the hatched arrow indicates the inverted repeat sequence present in the J3 ⁇ 4 gene transcription termination sequence.
  • the -10 and -35 regions, which are generally present in prokaryotic promoter regions and are important for gene transcription, are boxed.
  • the TATAAT sequence enclosed in the square is The mutation introduced when the promoter was created from the gene promoter is shown (detailed in Example 7).
  • the present inventors decided to introduce a mutation into the 7 ′′ 74 gene promoter to change the inducible type into a constitutive type promoter.
  • the chiostrepton-TipA protein complex It has long been known that the body binds and promotes the transcription of its genes (Holmes et al.,
  • PHN150U is a plasmid in which the wild-type J73 ⁇ 44 gene promoter is cloned into the MCS of p Bluescript II SK (+), and the two primers are phosphorylated at their 5 ′ ends.
  • the resulting PCR fragment was self-cyclized by a ligase reaction, and the resulting plasmid was named PHN231.
  • PHN231 has a promoter cloned into the MCS of p Bluescript II SK (+).
  • Example 5 was introduced into the Ilpal I Ai site.
  • Each of the resulting plasmids was named PHN382.
  • a fragment containing a 0.2 kb ⁇ promoter was excised from PHN231 (Example 7) with ⁇ and Nco ⁇ , and introduced into the B / Ncol sites of PHN381 and pHN382, respectively.
  • the resulting plasmids were named pHN383 and pHN387, respectively.
  • the DNA was amplified by PCR using PHN231 (Example 7) as a template and the primers of SEQ ID NOS: 81 (sHN147) and 82 (sHN376) in the sequence listing.
  • the obtained 0.2 kb fragment does not contain the RBS portion of the / promoter. Digest this fragment with ⁇ 5 / € ⁇ and Xbal to obtain PHN381 and pHN382. Each was introduced at the I Xbal site. The resulting plasmids were named pHN385 and PHN389, respectively.
  • the Nit promoter (excluding the RBS part)-LG10 The hybrid DNA of RBS is used as the Nit-LG10 promoter.
  • MA was amplified by PCR using PHN171 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 83 (sHN388) and 84 (sHN120) in the sequence listing.
  • the resulting 1.9 kb fragment contains the i-15 operon from PRE2895. This fragment was digested with BsiHi and Hpal, and introduced into the BsrGlI Hpal sites of PHN387 and pHN389, respectively. The resulting plasmids were named pHN407 and pHN409, respectively.
  • a 2.2 kb fragment was excised from Tip-RTl (Example 6) with Ncol and Kpnl, and introduced into the ⁇ ol / ⁇ sites of ⁇ 407, ⁇ 385, ⁇ 409, and ⁇ 389, respectively.
  • the resulting plasmids were named pNit-QT1 and pNit-RTL pNit-QCK pNit-RCl, respectively.
  • DNA was amplified by PCR using PHN385 (Example 8) as a template and the primers of SEQ ID NOS: 81 (sHN147) and 85 (SHN160) in the sequence listing.
  • the resulting 0.2 kb fragment contains the promoter.
  • This fragment was digested with ⁇ rGI and N (M.
  • a 2.0 kb MCS type 2, ampicillin resistance gene, and a fragment containing ⁇ 1 were cut out from pTip-RT2 (Example 6) with Ndel and K.
  • the above two DNA fragments were simultaneously introduced into the i3 ⁇ 4I / Kpnl sites of pHN407, PHN385, pHN409, and pHN389 (Example 8), and the resulting plasmids were pNit-QT2, pNit-RT2, pNit-QC2, pNit -Named RC2 respectively.
  • Figure 18-2 shows a map of Nit vectors (pNit-QTl, pNit-QT2, pNit-RTLpNit-RT2, pNit-QC1, pNit-QC2, pNit-RCL pNit-RC2). Abbreviations and the like are as described in Example 6.
  • FIG. 20 the names of the plasmids used for the transformation and their simple characteristics are shown.
  • the black bars indicate that the transformants were treated with thiostrepton, and the shaded bars indicate the transformants with thiostrepton.
  • 2 shows the peptidase activity of PIP when not treated.
  • Transformants using the PHN380 TipA-LGlO promoter (with a gene cassette consisting of-in the backbone of the pTip vector) are regulated by gene expression control using thiostrepton, but PHN410 (Nit promoter). Genetic power consisting of The transformant with the set in the backbone of the pTip vector) is Chiostrev. Ton-based gene expression control is not working.
  • PHN387 is a plasmid obtained by removing the gene cassette consisting of the phostostrepton resistance gene and the 3 ⁇ 4 gene promoter-7 ⁇ 4 gene from PHN410, and the transformant using this plasmid also lacks thiostrepton. Even PIP is expressed. This means that gene expression from the promoter occurs even without the TipA protein.
  • the results of using the transformants with pHN387 and PHN389 suggested that the sequence of RBS was not related to the regulation of gene expression by thiostrepton.
  • PHN381 is obtained by replacing the Nit-LG10 promoter of PHN389 with a promoter all at once, but the transformant in pHN381 does not constitutively express PIP. From the above, it can be seen that the Nitrogen promoter and the promoter are constitutive promoters and do not require TipA protein for their expression.
  • JCM1 (W02, R. aczw DSM44193 was transformed.
  • the difference between pHN409 and pHN389 is only in whether the region essential for autonomous replication is derived from PRE ⁇ or PRE8424. is there.
  • R. erythropolisKii when PIP peptidase activity was compared between cells transformed with PHN409 and cells transformed with pHN389, there was almost no difference, and cells transfected with PHN409 were slightly higher. .
  • the results were almost the same even when R. fascians JCM10002 and R. opacus DSM44193 were used as hosts.
  • the PIP peptidase activity of i ?. fascians JCM10002 and R. DSM44193 was lower than that of R. erythropolisKimi when using any of the plasmids.
  • CM3201 strain erythropolis J
  • the genome size of CM 3201 strain was also calculated as 6 Mb.
  • pNit-QC2 had a copy number of 47: 5
  • pNit-RC2 had a copy number of 64: 5.
  • heterologous plasmids having the same origin of replication cannot coexist in cells. This is due to a phenomenon called plasmid inco-immediate atibility (Novick, Microbiol. Rev. 57381-395 [1987]), which has also been reported in genera closely related to Rhodococcus bacteria (Stolt and Stoker, Microbiology 142 2795-2802 [1996]).
  • the present inventor considered that two R. erWrojw / endogenous plasmids having different sequences were separated (PRE2895 and pRE8424), so that multiple plasmids can coexist in a single cell and can be used for recombinant protein production. I got it. Therefore, first, plasmid incompatibility of the pTip-and pNit-vector groups was examined.
  • Transformants were selected on LB solid medium.
  • Table 4 shows the results.
  • the second column from the right shows the number of colonies that appeared on the solid medium containing tetracycline during the second transformation using 1 g of each plasmid DNA.
  • Table 4 shows the efficiency of the second transformation was significantly reduced and the efficiency of the first transformed plasmid after the second transformation was high.
  • the plasmid derived from pRE2 ⁇ and the plasmid derived from PRE8424 as described in Example 12 were completely compatable and could coexist in one R. ery ro // cell. Taking advantage of this, we attempted to co-express PIP and GFP in a single cell.
  • the DNA was amplified by PCR using the primers described in 6 (sHN337) and 87 (sHN338).
  • the resulting 0.2 kb fragment contains the 5 'end of the GFP gene. This fragment was digested with col to phosphorylate the 5 'end of this fragment.
  • PHN187 was used as a template, and the primers described in SEQ ID NOs: 88 (sHN339) and 89 (sHN340) in the sequence listing were used.
  • the resulting 0.5 kb fragment contains the 3 'end of the GFP gene. This fragment was digested with g71I and its 5 'end was phosphorylated. Simultaneously transfer these two DNA fragments to the NcoW Bgll sites of pNi t-QTl and pNi t-RT1.
  • the resulting plasmids were named pHN425 and pHN426, respectively. pHN425 and PHN426 contain the full-length 6 ⁇ gene, and are fused with a sequence that adds a 6XHis tag to the C-terminal side of GFP. In addition, the d site existing inside the gene was removed during the above operation, but the function of GFP did not change.
  • R. ery r ⁇ w? / JCM3201 was co-transformed with PHN425 and PHN389, and transformants were selected on a medium containing both tetracycline and chloramphenicol.
  • R. ey ⁇ ro ⁇ JCM3201 was transformed with PHN426 and PHN409, and co-transformants were selected on a medium containing both tetracycline and chloramphenicol.
  • iN.6 and JCM3201 were transformed with HN425, PHN426, p89, and PHN409, respectively. These six transformants expressed PIP and GFP as described in Example 1, and were purified by metal chelate chromatography using nickel ions.
  • Purification of the recombinant protein and SDS polyacrylamide electrophoresis of the sample before and after purification were performed by the following method.
  • the 6XHis tag is attached to the C-terminal of PIP, and purification was performed using Ni-NTA Superilow (manufactured by Qiagen) according to the instruction manual.
  • the specific purification method is shown below, and the purification work was performed in step 4.
  • the cells expressing the protein (20 ml culture solution) were collected, and 1 ml of NT-Buf fer (50 mM Tris-HC1
  • the cells were destroyed by reciprocating shaking at a speed of 6 m / sec for 20 seconds with a (SAVANT). 20, centrifuged at OOO X g, and Ni-NTA Superflow previously equilibrated with NT-Buf fer was added to 700 zl of the supernatant to a bed volume of 401.
  • Ni-NTA Superflow beads were bound to the 6XHis-tagged protein. After washing the beads four times with NT-Buf fer,
  • the suspension was suspended three times in NTE-Buf fer (50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 100 mM sodium chloride, 1 mM dithiothreitol, 400 mM imidazole), and the 6 XHis tag was added to the beads.
  • the protein was eluted.
  • NTE-Buf fer 50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 100 mM sodium chloride, 1 mM dithiothreitol, 400 mM imidazole
  • the sample was subjected to 12% SDS polyacrylamide electrophoresis. After SDS polyacrylamide electrophoresis, the gel was stained with Coomassie Brilliant Green G-250. Indicated.
  • the odd-numbered lanes indicate the crude cell extract (that is, the sample before purification), and the even-numbered lanes indicate the sample after purification by metal chelate chromatography.
  • Lanes 1 and 2 are samples from R. erythropolis JCM3201 co-transformed with PHN425 and PHN389
  • lanes 3 and 4 are samples from cells co-transformed with PHN426 and PHN409
  • lanes 5 and 6 are PHN425.
  • Samples from transformed cells Lanes 7 and 8 are samples from cells transformed with pHN426,
  • Lanes 9 and 10 are samples from cells transformed with pHN389, Lanes 11 and 12 are transformed with pHN409 This is a sample from isolated cells.
  • Table 1 shows a list of each plasmid used in the examples
  • Table 2 shows a list of strains used in the examples
  • Table 3 shows R. erythropolis JGM3201, R. fascians JCM10002 of pNU-QC2 and pNit-RC2.
  • Table 4 shows the results of co-transformation of R. erythropol is JCM3201 with pNi t-QC2, pNi t-RC2, pNi t-QT2, and pNi t-RT2. .
  • pHN362 Rep DSO, IR I, mutated IR II on pHN267
  • pHN363 Rep DSO, mutated IR I, mutated IR II on pHN267
  • pHN322 Rep DSO, IR I, IR II (SSO) on pHN267
  • pHN343 Rep DSO, IR II (SSO) on pHN267
  • pHN344 Rep DSO, IR I, IR II (SSO) on pHN267
  • pHN324 Rep IR I, IR II (SSO) on pHN267
  • pHN348 6xHis-PIP in MCS of pTip-QC1 This study pHN380 6xHis-PIP in MCS of pTip-RC1
  • pHN407 6xHis-PIP in MCS of pNit-QT1 This study pHN385 6xHis-PIP in MCS of pNit-RT1
  • pHN389 6xHis-PIP in MCS of pNit-RC1 This study pHN410 Pjip A and LG10-RBS of pHN380 were substituted into
  • Rhodococcus erythroplis JCM2895 Japan Collection of Microorganisms Source of pRE2895
  • Rhodococcus erythroplis DSM8424 German Collection of Microorganisms Source of pRE8424
  • Rhodococcus erythroplis JCM2893 Japan Collection of Microorganisms Source of pRE2893
  • Rhodococcus erythroplis JCM2894 Japan Collection of Microorganisms Source of pRE2894
  • Rhodococcus erythroplis DSM43200 German Collection of Microorganisms Source of pRE43200
  • Rhodococcus erythroplis JCM3201 Japan Collection of Microorganisms Host strain to express recombinant proteins
  • Rhodococcus fascians JCM10002 Japan Collection of Microorganisms Host strain to express recombinant proteins
  • Rhodococcus opacus DSM44193 German Collection of Microorganisms Host strain to express recombinant and Cell Cultures proteins
  • Rhodococcus ruber JCM3205 Japan Collection of Microorganisms Host strain to express recombinant proteins
  • Rhodococcus rhodochrous JCM3202 Japan Collection of Microorganisms Host strain to express recombinant
  • Transformation efficiency of pNit-QC2 and pNit-RC2 Host cell Plasmid Ft.erythropolis R. fasclans R.opacus pNit-QC2 3.8 x 10 5 8.2 x 10 2 1.6 x 10 4
  • a vector capable of replicating in a novel ring-circle-type replication mode of the present invention which is capable of inducing expression of a foreign gene in a genus bacterium at a temperature of 4 ° C to 35 ° C with an inducing substance.
  • a vector and a vector capable of constitutively expressing a foreign gene in an inducer-independent manner a foreign protein can be efficiently produced by a genus bacterium. This makes it possible to express and produce a protein that is difficult or impossible to express at a temperature condition suitable for normal growth of microorganisms, that is, at an intermediate temperature higher than about 15 ° C.
  • At least two types of expression plasmid vectors derived from bacteria belonging to the genus 1 ⁇ 2o ⁇ which do not cause plasmid incompatibility with each other ⁇ At least two types of plasmids are used as rolling DNA sequences required for autonomous replication of plasmids.
  • a vector containing a cycle-type replication mode and a vector containing the DNA sequence necessary for autonomous replication of pRE ⁇ -derived plasmids can be stably maintained in the same microbial cell without causing incompatibility problems.

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Abstract

Rhodococcus属細菌中で外来遺伝子を構成的に発現し得る発現ベクターの提供。　TipA遺伝子プロモーターの-10領域配列に変異を導入したプロモーターであって、チオストレプトン非依存的に構成的に下流に存在する遺伝子を発現し得る変異TipA遺伝子プロモーターの有する塩基配列からなるDNAおよび外来遺伝子を構成的に発現するためのプロモーター配列が請求項１から３のいずれか１項に記載のDNAの有する塩基配列であって、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む、Rhodococcus属細菌用構成型発現ベクター。

Description

明 細 書
Rhodococcus属細菌における組換えタンパク質を生産する方法 技術分野 .
本発明は、 Rhodococcus属細菌中で外来遺伝子を発現し得る発現ベクターに関 する。
また、 本発明は、 宿主細胞中で組換えタンパク質を発現することができる誘導 型発現べク夕一および構成型発現べクター、 および該べクタ一を用いて組換え夕 ンパク質 ¾発現させる方法に関する。 さらに、 本発明は 属細胞内で 異なるベクター上にコードされる複数の遺伝子を同時に共発現する方法に関する。 背景技術
現在、 真核生物由来のタンパク質を組換え体として大量調製するためには大腸 菌を宿主とした発現システムが広く用いられている。 これは該システムが扱いが 容易でかつ最も研究が進んでいるからである （We ickert et al. , Curr. Op in. Biotechnol. 7: 494-499 [1996] )。
一方、 本発明者は以前に
Figure imgf000002_0001
も組換えタンパク質生産 の宿主として用いることができることを示した （特開 2004-73032、 特願
2002-235008)。 R. erythropolisは 4 から 35 °Cまで増殖可能な放線菌の一種 で、 この菌を宿主とした発現システムの最大の特徴は 4 °Cなど 10 以下での組 換えタンパク質生産が可能な点である。 他の大腸菌やバチルス属細菌、 酵母菌、
Sf9昆虫細胞（Cereghino and Cregg, Curr. Op in. Biotechnol. 10 422-427 [1999]、
Mi l ler, Curr. Op in. Genet. Dev. 3 97-101 [1993] ) を用いたシステムでは、
10 °C以下での組換えタンパク質生産は極めて困難である。 10 X：以下で組換え夕 ンパク質を生産させることで、 それまでは生産困難だったタンパク質、 例えば宿 主細胞の増殖を阻害するものや 30 °C前後では不溶化するもの、 低温に適応した 生物由.来のタンパク質、 などを生産することが可能になった。
本発明者等は、 pTipベクターと呼ばれる一群の O^COCC 属細菌用発現べク ターを構築し、 組換えタンパク質生産に用いていた （特開 2004-73032、 特願
2002-235008)。 これらベクターは、 抗生物質チォストレプトンでその発現が誘導 される /' 遺伝子のプロモーターを含み、その下流に外来遺伝子（発現させるベ き遺伝子） をクローン化するためのマルチクローニング部位 （MCS) を含む。 従つ て pTipベクターは、チォストレプトン誘導型発現ベクターであり、 これら発現べ クタ一で形質転換された^ 0f/0C0CC 属細菌においては、 チォストレプトンが培 養液中に添加されたときにのみ、 外来タンパク質の生産が誘導される。
非特許文献 1
We ickert e t al. , Curr. Op in. B iot echnol. 7: 494-499 [1996] 非特許文献 2
Cereghino and Cregg, Curr. Op in. Biotechnol. 10 422-427 [1999] 非特許文献 3
Mi l ler, Curr. Op in. Gene t. Dev. 3 97-101 [1993] 発明の開示
上記のように本発明者らは、 pTipベクターと呼ばれる一群の i½oi ococc 属細 菌用誘導型発現ベクターを構築し、 組換えタンパク質生産に用いていたが、 未だ 2点開発すべき点が残されていた。
第 1に、 前記 pT ipベクターはすべて、 ^?0 ^0 ^属細菌内で自律複製するた めに必要な MA領域 （複製起点等） がーつの内在性プラスミドに由来していたた めに、別々の外来遺伝子を含む複数の発現ベクターを同時に、安定に、^ Oi OCOCC 属細菌内に共存させることは困難であった。 これは同一の自律複製起点を持つ異 種プラスミ ドが細菌内で共存できない、 プラスミ ド不和合性 （pl asmid incompat ib i l i ty) と呼ばれる現象によるもので、多くの細菌でこの現象が報告さ れている （Novick, Microb io l. Rev. 51 381-395 [1987] )。 異種プラスミドを単 一の細菌の菌体内で共存させることが出来れば、 複数の組換えタンパク質を同時 に生産することが出来る。 例えば、 20S プロテアゾームと呼ばれるタンパク質複 合体は αサブュニットと /3サブュニットの 2つのポリペプチドから構成されてお り、 機能的な 20Sプロテアソーム複合体を組換え体として生産する場合には、 こ れら 2つのポリペプチドを共発現させなければならない。 2つのポリペプチドを 単一細胞内で共発現させる際には、 1つの発現ベクターに複数の外来遺伝子を導 入することによって、 達成することも出来るが、 ベクターのサイズが大きくなつ たり、 制限酵素部位の都合上クローニング過程が複雑になったり、 不便であるこ とが多い。 現在まで J? 0i/0C0CCiAS属細菌において、 複数の発現ベクターを用いた 組換えタンパク質の共発現系は TO02/055709に記載されたものが存在した。
第 2に、 Rhodococcus属細菌の研究のためには、 誘導型発現べクタ一のみなら ず、 構成型発現ベクターも重要なツールであるが、 構成型発現ベクターが未開発 であったことである。 なお、 既知の i^oi ococ As属細菌における構成型発現べク ターとレ は、 変異型二トリルヒドラ夕一ゼ遺伝子プロモーターを用いたものや (特開平 9-28382、 特開平 10- 248578)、 rn?プロモータ一を用いたものが知られ ている (Mat su i e t al. , Curr. Microbiol. 45 240-244 [2002] )。
^o^cocc 属細菌の中には、 PCB (polychlor inated biphenyl)や農薬等、様々 な難分解性化合物を分解する菌株が多数知られており （バイオレメディエーショ ン） (Be l l e t al. , J. Appl. Microbiol. 85 195-210 [1998] )、 また、 ある菌株 はアクリルアミド等有用な化合物を菌体内に蓄積させる事も知られていて、 すで に工業生産に利用されている（バイオプロセス ィオリアクター） (Yamada e t al. , B iosc i. B iotech. Biochem. 60 1391-1400 [1996] )。 従って、 上述した 2点の改 良点が克服されれば、 組換えタンパク質生産時のみならず、 バイオレメディエー シヨン、 バイオプロセスの研究時においても o^cocc 属細菌用発現ベクター の利用性が増すと考えられる。
まず、 プラスミド不和合性の問題を解決するためには、 本発明者らが先に構築 した pTipベクターに用いていた Oi OCOCCZAS属細菌内で自律複製するために必要 な DNA領域とは配列が違う同等の配列を新たに分離し、 利用する必要がある。 前 記 pTipベクタ一では全て R. erythropolis Km 株から分離した内在性プラス ミド PRE2895 (5. 4キロべ一スペア一；以下 kbと略） のうち、 自律複製に必要最 小限な 遺伝子を含む領域 （1. 9 kb) を用いていた。 従って、 他の R. e r½rw7o7 株から DNA配列の異なる内在性プラスミドを分離し、新規発現べク 夕一を構築することとした。 また、 ^Oi OCOCC 属細菌の形質転換体選択マ一力 —として、前記 pTipベクターにおいてはテトラサイクリン耐性遺伝子のみ開発し ていたが、 複数のプラスミドで形質転換するためには、 別の抗生物質に対する耐 性遺伝子を新規に開発する必要がある。 本発明者は、 ϋ erythropolis DSM 313 株がクロラムフエニコ一ルに対して耐性であることを見出し、 耐性を付与してい る遺伝子を分離し、 利用することとした。
さらに、 構成型発現べクタ一開発のため、 遺伝子プロモータ一に変異を導 入し、 構成的に、 即ち、 チォストレプトン非依存的に、 外来遺伝子を発現せしめ る変異体を作製することとした。
" このようにして、 PRE2895が有する自律複製に必要な領域および誘導型の TipA 遺伝子プ ψモータ一を有する前記 pTipベクターの他に、新たに異なる自律複製す るために必要な DNA領域を有するベクタ一であって、 遺伝子プロモーターを 有しており誘導発現が可能なベクター、前記 pTipベクターとは異なる自律複製す るために必要な DNA領域を有するベクターであって、 遺伝子プロモーターに 変異を導入したプロモーターを有しており構成的に発現が可能なベクター、 およ び前記 pTipベクタ一と同じ自律複製するために必要な DNA領域および TipA遺伝 子プロモーターに変異を導入したプロモーターを有しており構成的に発現が可能 なベクターを構築した。 これらのベクターのうち自律複製するために必要な DNA 領域が異なる 2種類のベクターであって、 それぞれ異なる外来タンパク質をコー ドする遺伝子を含むベクタ一で一つの宿主を共形質転換することが可能であり、 該共形質転換した宿主で該異なる外来タンパク質を同時に共発現させることが可 能である。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
[ 1 ] 7 遺伝子プロモーターの- 10領域配列に変異を導入したプロモーターで あって、 チォストレプトン非依存的に構成的に下流に存在する遺伝子を発現し得 る変異 遺伝子プロモーターの有する塩基配列からなる DNA、
[ 2 ] -10領域配列の変異が、 CAGCGT配列の TATAAT配列への変異である [ 1 ]の DNA、
[ 3 ] '配列番号 1 0 7で表される塩基配列を有する、 [ 2 ]の DNA、
[ 4 ] 外来遺伝子を構成的に発現するためのプロモーター配列が [ 1 ]から [ 3 ]の いずれかの DNAの有する塩基配列であって、その下流にリボソーム結合部位配列、 更にその下流に、 外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む、 属細菌用構成型発現べクタ一、
[5] 配列番号 1 0 1に表される塩基配列を有する pNit- RT1、配列番号 1 0 2に 表される塩基配列を有する pNit- RT2、配列番号 1 0 5に表される塩基配列を有す る pNit- RC1、配列番号 1 06に表される塩基配列を有する pNit-RC2、配列番号 9 9に表される塩基配列を有する pNit- QT1、配列番号 1 00に表される塩基配列を 有する pNit-QT2、配列番号 1 0 3に表される塩基配列を有する pNit_QCl、配列番 号 1 04に表される塩基配列を有する pNit - QC2、からなる群から選択される [4] の J½Oi/OCC?CCiA?属細菌用構成型発現べクタ一、
[6] ftoi/dcocczAs属糸田菌カ erythropol is、 R. iasciansお び R opacusi)ヽ らなる群から選択される、 [4]または [5]の発現ベクター、
[7] さらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必要な DNA領域を含み、 大腸菌中 で複製可能な [ 4 ]から [ 6 ]のいずれかの発現べクター、
[8] [4]から [7]のいずれかの発現べクタ一を含む形質転換体、 および
[9] [4]から [7]のいずれかの発現ベクターを用いて 4でから 3 5°Cの温度で 組換えタンパク質を生産する方法。
さらに、 本発明は以下の通りである。
[1 0] oi/ococc 属細菌から単離された、 口一リングサークル型の複製様式 で複製し得る環状プラスミド、
[1 1] oi/ococc 属細菌から単離された、 ローリングサ一クル型の複製様式 に必須な i? 遺伝子、 2本鎖複製起点領域 DSO (double-stranded origin) およ び 1本鎖複製起点領域 SSO (single-stranded origin) を有する [1 0]の環状プ ラスミド、
[1 2] ローリングサークル型の複製様式に必須な DNAの塩基配列が配列番号 9 0に表される.塩基配列の第 3845位から第 5849位の塩基配列である、 [1 1]の環 状プラスミド、
[1 3 ] 配列番号 90に表される塩基配列を有する DNAまたは配列番号 90に表 される塩基配列を有する DNAに相補的な配列を有する DNAにストリンジェントな 条件下でハイブリダィズする DNAを有する [10]から [12]のいずれかのプラス Sド、
[14] [10]から [12]のいずれかの環状プラスミドを含む形質転換体、
[1 5] ローリングサ一クル型の複製様式で複製し得るベクターであって、 Rhodococcus属細菌中で外来遺伝子を 4°Cから 35 の温度条件下で発現しうる 発現ベクター、
[16] ?½i/OCOCCZA5属細菌から単離された、 口一リングサークル型の複製様式 に必須な ^ 遺伝子、 2本鎖複製起点領域 DSO (double-stranded origin) およ び 1本鎖複製起点領域 SSO (single-stranded origin) を有する [1 5]の発現べ クタ一、 、
[17] ローリングサークル型の複製様式に必須な DNAの塩基配列が配列番号 9 0に表される塩基配列の第 3845位から第 5849位の塩基配列である、 [16]の発 現ベクター、
[1 8] 外来遺伝子を発現誘導するための誘導型プロモーター配列、 その下流に リボソーム結合部位配列、 更にその下流に、 外来遺伝子を導入可能なマルチクロ 一二ング部位配列を含む [15]から [17]のいずれかの発現ベクター、
[19] 発現誘導のための誘導型プロモーターが Tij¾遺伝子プロモーターで、誘 導物質がチォストレプトンである、 [1 8]の発現ベクター、
[20] プロモーターの塩基配列が [1]から [3]のいずれかの DNAの有する塩基 配列からなる [4]の発現ベクター、
[2 1] 配列番号 93に表される塩基配列を有する pTip-RTl、配列番号 94に表 される塩基配列を有する pTip- RT2、 配列番号 97に表される塩基配列を有する pTip_RCl、配列番号 98に表される塩基配列を有する pTip-RC2からなる群から選 択される [15]から [1 9]のいずれかの oi/ococc 属細菌用誘導型発現べクタ
[22] Rhodococcus属細菌中で外来遺伝子を構成的に発現し得る発現ベクター であって、 プラスミド pRE ^由来の 属細菌中でのプラスミドの自 律複製に必要な DNA配列および [1]から [3]のいずれかのプロモ一夕一配列 DNA を含む、 Rhodococcus属細菌中で 4 °Cから 35 °Cの温度条件下で外来遺伝子を構 成的に発現し得る発現ベクター、
[23] プラスミド pRE 由来の ^iococciw属細菌中でのプラスミドの自律 複製に必要な DNA配列が および 遺伝子を含む 1.9kbの領域の DNA配列 である [22]の発現ベクター、
[24] 構成型プロモーター配列の下流に、 さらにリボソーム結合部位配列、 更 にその下流に、 外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む [2 2]または [23]の発現ベクター、
[25] 配列番号 99に表される塩基配列を有する pNit- QT1、配列番号 1 00に 表される塩基配列を有する pNit-QT2、配列番号 103に表される塩基配列を有す る pNit- Qm、配列番号 104に表される塩基配列を有する pNit- QC2、からなる群 から選択される [22]から [24]のいずれかの 属細菌用構成型発現 べゥ々一
[ 2 6 ] 互いにプラスミ ド不和合性を起こさない少なく とも 2種類の 属細菌由来のプラスミドを含む i^OiOCOCCiW属細菌であって、 少な くとも 2種類のプラスミドが、 プラスミドの自律複製に必要な DNA配列として、 それぞれ口一リングサークル型複製様式をもつ DNA配列と、 pRE 由来のプラ スミドの自律複製に必要な DNA配列を有する、 属細菌、
[ 2 7 ] 互いにプラスミ ド不和合性を起こさない少なく とも 2種類の Rhodococcus属細菌由来の発現プラスミドベクタ一であり外来タンパク質をコー ドする遺伝子を含む発現プラスミドベクターを含む i^OiOCOCCZAS属細菌であって、 少なくとも 2種類のプラスミドベクターが、 プラスミドの自律複製に必要な MA 配列として、 それぞれ^ OiOCOCCiW属細菌由来のローリングサークル型複製様式 をもつ DNA配列と、 pRE 由来のプラスミドの自律複製に必要な DNA配列を有 し、 外来タンパク質をコードする遺伝子を 4 °Cから 35 °Cの温度条件下で共発現 し得る 力 Oi/OCOCCAS属細菌、
[28] 2種類のプラスミドベクターが外来タンパク質を生産せしめるためのプ 口モーター配列、 その下流にリボソーム結合部位配列、 更にその下流に、 外来遺 伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列、 をそれぞれ全て含む、 [27]の Rhodococcus属細菌、 [29] 少なくとも 2種類のプラスミドベクターの一方が、 [4]、 [5]、 [1 5] 〜[19]、 [20]および [21]のいずれかのベクターであり、もう一方が、 [22] から [25]のいずれかのベクターもしくは [22]から [25]のベクターにおいて 少なくともプロモーターを誘導型プロモーターである TipA遺伝子プロモーター に置換した誘導発現し得るベクターである、 [27]または [28]の odococcus 属細菌、
[30] 少なくとも 2種類のプラスミドベクタ一の一方が、 [4]、 [5]、 [1 5] 〜[1 9]、 [20]および [2 1]のいずれかのベクターであり、 もう一方が、 配列 番号 49に表される塩基配列を有する pTip- NH1、配列番号 50に表される塩基配 列を有する pTip- NH2、配列番号 51に表される塩基配列を有する pTip- CH1、配列 番号 52に表される塩基配列を有する pTip- CH2、配列番号 53に表される塩基配 列を有する pTip- LNH1、配列番号 54に表される塩基配列を有する pTip- LNH2、配 列番号 55に表される塩基配列を有する pTip- LCH1、 配列番号 56に表される塩 基配列を有する pTip- LCH2、配列番号 9 1に表される塩基配列を有する pTip- QT1、 配列番号 92に表される塩基配列を有する pTip- QT2、配列番号 95に表される塩 基配列を有する pTip- QC1、 配列番号 96に表される塩基配列を有する pTip-QC2、 pTip-CHl. L pTip-CH2. K pTip-LCHl. K pTip- LCH2.1、 [22]から [25]のいず れかのベクターまたは [22]から [25]のいずれかのベクターにおいて少なくと もプロモータ一を誘導型プロモーターである Tip A遺伝子プロモーターに置換し た誘導発現し得るベクタ一からなる群から選択されるベクターである、 [27]か ら [29]のいずれかの i? OifecocciW属細菌、
[3 1] 口一リングサークル型の複製様式に必須な MA配列が配列番号 90に表 される塩基配列の第 3845位から第 5849位の DNAであり、 pRE 由来のプラス ミドの自律複製に必要な DNA配列が J?¾^および 遺伝子を含む 1.9kbの領域 の DNAである [26]から [30]のいずれかの oiococc^属細菌、
[ 3 2 ] 互いにプラスミ ド不和合性を起こさない少なく とも 2種類の
Rhodococcus属細菌由来の発現プラスミドベクターであり外来タンパク質をコー ドする遺伝子を含む発現プラスミドベクタ一を含む^ oiococcy^？属細菌であって、 少なくとも 2種類のプラスミドベクターが、 プラスミドの自律複製に必要な DNA 配列として、 それぞれ OiOCOCC 属細菌由来のローリングサークル型複製様式 をもつ DNA配列と、 pRE 2895由来のプラスミドの自律複製に必要な DNA配列を有 する少なくとも 2種類のベクタ一で zoiococciAS属細菌を形質転換し、 培養しそ れぞれの発現べクタ一が含む外来タンパク質をコードする遺伝子を 4 °Cから 35°Cの温度条件下で共発現させて該外来タンパク質を産生させる方法、
[3 3] 2種類のプラスミドベクタ一が外来タンパク質を生産せしめるためのプ ロモ—夕一配列、 その下流にリボソーム結合部位配列、 更にその下流に、 外来遺 伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列、 をそれぞれ全て含む、 [3 2]の 方法、
[34] 少なくとも 2種類のプラスミドベクタ一の一方が、 [4]、 [5]、 [1 5] 〜[1 9]、 [20]および [2 1]のいずれかのベクタ一であり、 もう一方が、 配列 番号 49に表される塩基配列を有する pTip- NH1、配列番号 50に表される塩基配 列を有する pTip-NH2、配列番号 5 1に表される塩基配列を有する pTip- CH1、配列 番号 52に表される塩基配列を有する pTip- CH2、配列番号 53に表される塩基配 列を有する pTip- LNH1、配列番号 54に表される塩基配列を有する pTip- LNH2、配 列番号 5 5に表される塩基配列を有する pTip-LCHl、 配列番号 56に表される塩 基配列を有する pTip- LCH2、配列番号 9 1に表される塩基配列を有する pTip- QT1、 配列番号 92に表される塩基配列を有する pTip- QT2、配列番号 9 5に表される塩 基配列を有する pTip- QC1、 配列番号 9 6に表される塩基配列を有する pTip- QC2、 pTip-CHl. pTip-CH2. U pTip-LCHl. K pTip-LCH2. L [ 2 2 ]から [ 2 5 ]のいず れかのベクタ一または [2 2]から [2 5]のいずれかのベクタ一において少なくと もプロモ一夕一を誘導型プロモーターである TipA.遺伝子プロモーターに置換し た誘導発現し得るベクタ一からなる群から選択されるべクタ一である、 [3 2]か ら [34]のいずれかの方法、
[3 5] ローリングサークル型の複製様式に必須な DNAの塩基配列が配列番号 9 0に表される塩基配列の第 3845位から第 5849位の塩基配列であり、 pRE ^"由 来のプラスミドの自律複製に必要な DNA配列が および 遺伝子を含む 1.9 kbの領域の DNAである [3 2]から [34]のいずれかの方法。
以下、 本発明を詳細に説明する。 本発明は、 属細菌から単離された、 ローリングサークル型の複製 様式で複製し得る環状プラスミドおよび該環状プラスミドから構築された発現べ クタ一を包含する。 口一リングサークル型の複製様式とは、 二本鎖環状 DNAの複 製の一様式であり、 特異的ェンドヌクレアーゼの作用により特定の DNA鎖上の特 定の位置にニックが入り、 そのニックの 3'- 0H端から DNA合成が開始され、 ニッ クの入っていない環状 DNA鎖を铸型として一回りする形で進む複製様式をいう。 このような複製様式をとるためには、 ローリングサークル型の複製様式に必要な A領域が必要であり、 例えば 遺伝子が挙げられる。 さらに、 2本鎖複製起 点領域 DSO (double-stranded origin) および 1本鎖複製起点領域 SS0 (single stranded origin) が必要である。 従って、 本発明のローリングサ一ク ル型の複製様式で複製し得る環状プラスミドおよび該環状プラスミドから構築さ れた発現ベクターは、 口一リングサークル型の複製様式に必要な DNA領域、 すな わち i? 遺伝子、 2本鎖複製起点領域 DSO (double-stranded origin) および 1 本鎖複製起点領域 SSO (single-stranded origin) を含むプラスミドおよび発現 ベクターである。 このようなプラスミドは、 i½0(£?C0CCiAS属細菌から単離するこ とができ例えば、 Hhodococcus erythropolis DSM8424株から単離した pRE8424 が挙げられ、 その全長配列を配列番号 90に示す。配列番号 90中、 第 3845位か ら 5849位までがローリングサークル型の複製様式に必要な DNA領域、 すなわち 遺伝子の DNA、 2本鎖複製起点領域 DSO (double-stranded origin) および 1 本鎖複製起点領域 SSO (single-stranded origin) を表す。
本発明は、 配列番号 90で表されるプラスミドを構成する DNAに相補的な DNA にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNAから構成されるプラスミ ドであって、 ローリングサークル型の複製様式で複製し得るプラスミドも包含す る。 ここで、 ストリンジェントな条件とは、例えば、 ナトリウム濃度が 500〜1000 mM、 好ましくは 700 ιηΜであり、 温度が 50〜70 °C、 好ましくは 65 ででの条件を いう。 このようなプラスミドはその全長塩基配列が配列番号 9 0で表される塩基 配列と BLAST等 （例えば、 デフォルトすなわち初期設定のパラメ一夕を用いて） を用いて計算したときに、 90%以上、好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 98% 以上の相同性を有する塩基配列からなるプラスミドである。 該プラスミドから得られたローリングサークル型の複製様式に必要な DNA領域 である 遺伝子、 2本鎖複製起点領域 DSO (doubl e-s t randed or igin) および 1本鎖複製起点領域 SSO (s ingle-s t randed or igin) を含み、 さらにプロモー夕 一配列、 その下流にリボソーム結合部位配列、 更にその下流に、 外来遺伝子を導 入可能なマルチクローニング部位配列を含む発現べクタ一も本発明に包含される。 さらに、 外来遺伝子および転写終結配列を含んでいてもよく、 プロモーター活性 を有する DNA配列、 外来遺伝子および転写終結配列は発現カセット （Express ion casse t t e) を構成する。 ここで、 プロモーター配列は薬剤等の誘導因子によりそ 'の下流に導入した外来遺伝子を誘導的に発現し得るプロモーターも、 誘導因子に 依存する となく構成的に外来遺伝子を発現し得るプロモータ一も含まれる。 前 者の誘導的に外来遺伝子を発現し得るプロモーターとして、例えば 77 遺伝子プ 口モーターが挙げられ、 チォストレプトンの存在下でその下流の外来遺伝子を誘 導的に発現する。さらに、本発明のベクタ一は、 TipAタンパク質をコ一ドする TipA 遺伝子、 7 ^4遺伝子の発現を誘導する ¾ί ^遺伝子プロモーター等の適当なプロ モータ一を含んでいてもよい。 7 ^遺伝子および 77j¾4遺伝子発現用プロモータ 一は誘導カセット （Inducer casse t te) を構成する。 宿主細胞が ^ootococc w属 に属する細菌である場合、該細菌はチォストレプトンに対して感受性であるため、 チォストレプトンに対しての耐性を付与するチォストレブトン耐性遺伝子等を組 込む。 さらに、 / ^遺伝子プロモーターは Z6 プロモーター等のその配列 を改変させたものでもよい。 4遺伝子プロモーターの配列は図 1 2に示される。 また、 後者の構成的に外来遺伝子を発現し得るプロモーターとして、 前記
Figure imgf000012_0001
遺伝子プロモーターを改変したプロモーターが挙げられる。 このような改変 TipA 遺伝子プロモーターとしては、 TiM遺伝子プ口モーターの- 10領域配列に変異を 導入したプロモータ一が挙げられ、 具体的には、 -10 領域配列の変異が、 CAGCGT 配列の TATAAT配列への変異であるプロモーターが挙げられる。さらに、 このよう なプロモーターの一例として、 図 1 9に示す配列に含まれるプロモーターが例示 できる。
また、 図 1 2に示すプロモーターの配列を有する DNAまたは図 1 9に示す配列 に含まれるプロモーターの配列を有する DNAに相補的な DNAにストリンジェント な条件下でハイブリダイズする DNAからなり、 それぞれのプロモーター活性と同 等の活性を有するポリヌクレオチドもプロモーターとして用いることができる。 ここで、ストリンジェン卜な条件とは、例えば、ナトリゥム濃度が 500〜1000 πιΜ、 好ましくは 700 mMであり、温度が 50〜70 °C、好ましくは 65 °Cでの条件をいう。 このようポリヌクレオチドはその全長塩基配列が上記プロモーターの塩基配列と BLAST 等 （例えば、 デフォルトすなわち初期設定のパラメ一夕を用いて） を用い て計算したときに、 90 %以上、 好ましくは 95 %以上、 さらに好ましくは 98 %以上 の相同性を有する塩基配列からなるプロモーターである。
' 本発明は、 さらに前記ベクターにさらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必要 な DNA領^ならびに大腸菌の形質転換体選択マ一カーを含むベクタ一も含まれ、 このようなベクターは Oi OCOCC 属細菌と大腸菌とのシャトルベクターとして 利用できる。 この際、 大腸菌では構成型発現ベクターとして利用することができ る。大腸菌用プラスミドの自律複製に必要な DNA領域としては（¾ El、 Co/E2配列 等、 大腸菌の形質転換体選択マーカ一としてはアンピシリン耐性遺伝子などの公 知のものを使用することができ、 これらは公知の大腸菌用クローニングベクター から得ることができる。 .
TipA遺伝子プロモーター、ローリングサークル型の複製様式に必要な DNA領域、
2本鎖複製起点領域 DSO (double-s t randed or igin) および 1本鎖複製起点領 域 SSO (s ingl e-s t randed origin) を含み、 さらに前記プロモーター配列の下流 にリボソーム結合部位配列、 更にその下流に、 外来遺伝子を導入可能なマルチク ローニング部位配列および大腸菌用プラスミドの自律複製に必要な DNA領域を含 む oi/ococczw用発現ベクターとして、 配列番号 9 3に表される塩基配列を有す る pT ip- RT1、配列番号 9 4に表される塩基配列を有する pTip- RT2、配列番号 9 7 に表される塩基配列を有する pTip- RC 1、配列番号 9 8に表される塩基配列を有す る pTip- RC2が例示できる。 また、 77; ^遺伝子プロモーターの代わりに 7^4遺伝 子プロモーターの- 10領域配列の変異が CAGCGT配列の TATAAT配列への変異であ るプロモーターを有するベクタ一としては、 配列番号 1 0 1に表される塩基配列 を有する pNi t- RT 1、配列番号 1 0 2に表される塩基配列を有する pNi t- RT2、配列 番号 1 0 5に表される塩基配列を有する pNi t- RC 1、配列番号 1 0 6に表される塩 基配列を有する pNi t- RC2が例示できる。 これらの、配列番号で表され 塩基配列 からなる構成する DNAに相補的な DNAにストリンジェン卜な条件下でハイプリダ ィズする DNAから構成されるベクターであって、 外来遺伝子を宿主微生物中で発 現し得るベクターも本発明に包含される。ここで、ストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が 500〜1000 mM、 好ましくは 700 mMであり、 温度が 50 〜70 °C、 好ましくは 65 °Cでの条件をいう。 このようなベクターはその全長塩基 配列が上記ベクターの配列番号で表される塩基配列と BLAST等 （例えば、 デフォ ルトすなわち初期設定のパラメータを用いて） を用いて計算したときに、 90 %以 '上、好ましくは 95 %以上、 さらに好ましくは 98 %以上の相同性を有する塩基配列 からなる クタ一である。 配列番号で示される以下のベクタ一についても同様で める。
本発明は、 さらに上記のローリングサ一クル型の複製様式に必要な MA 領域
( e 遺伝子、 DS0および SS0) ではなく、 他の自律複製に必要な DNA領域を含む 発現ベクターをも包含する。 このように複製に必要な DNA領域が異なる発現べク ター同士は、 一つの宿主に同時に導入し、 安定に保持することができる。 他の自 律複製に必要な DNA領域として例えば、 JieM遺伝子および 遺伝子が挙げら れる。 遺伝子および 遺伝子を含む DNA領域は、 i½oi ococczA5属細菌、 例 えば . erythropolis； FCM2895株から分離した内在性プラスミド PRE2895から単 離することができる。 J?ej¾遺伝子および ^遺伝子を含む 1. 9 kbの領域は、 配 列番号 4 9の第 6233位から第 8166位であり、 このうち RepA 0RFは 6765位から
7652位、 RepB ORFは 7652から 7936位である。 また、 遺伝子および 遺 伝子を含む DNA領域は後述の参考例に記載のベクター PHN129の制限地図 （図 1 ) を参照すれば得ることができる。 また、 配列番号 4 9の第 6233位から第 8166位 で表される塩基配列からなる DNAに相補的な DNAにストリンジェントな条件下で ハイブリダィズする DNAであって、 ベクターに自律複製能を付与する DNAも本発 明の 遺伝子および 遺伝子を含む 1. 9 kbの領域として用いることができ る。 ここで、 ストリンジェン卜な条件とは、例えば、 ナトリウム濃度が 500〜1000 mM、 好ましくは 700 mMであり、 温度が 50〜70 °C、 好ましくは 65 °Cでの条件を いう。このような DNAはその全長塩基配列が配列番号 4 9の第 6233位から第 8166 位で表される塩基配列と BLAST等 （例えば、 デフォルトすなわち初期設定のパラ メータを用いて） を用いて計算したときに、 90 %以上、 好ましくは 95 %以上、 さ らに好ましくは 98 %以上の相同性を有する塩基配列からなる DNAである。 この自 律複製に必要な DNA領域おょぴ 遺伝子プロモーターの- 10領域配列が CAGCGT 配列の TATAAT配列へ変異したプロモーター、さらにその下流にリポソ一ム結合部 位配列、 更にその下流に、 外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列 を含む発現べクタ一を含む発現ベクターはマルチクローニング部位に組込まれた 外来遺伝子を誘導因子に依存することなく構成的に発現することができる。 この 'ような発現ベクターとして、配列番号 9 9に表される塩基配列を有する pNi t- QT1、 配列番号 ¾ 0 0に表される塩基配列を有する pNi t- QT2、配列番号 1 0 3に表され る塩基配列を有する pNi t- QC 1、 配列番号 1 0 4に表される塩基配.列を有する pNi t - QC2、 からなる群から選択される 属細菌用構成型発現ベクター が挙げられ、 さらにチォストレプトンの存在下で、 導入された外来遺伝子を誘導 的に発現し得る配列番号 4 9に表される塩基配列を有する pT ip- NH1、配列番号 5 0に表される塩基配列を有する pT ip- NH2、配列番号 5 1に表される塩基配列を有 する pTip- CH1、配列番号.5 2に表される塩基配列を有する pTip- CH2、配列番号 5 3に表される塩基配列を有する pTip-UHl、 配列番号 5 4に表される塩基配列を 有する pT ip- LNH2、配列番号 5 5に表される塩基配列を有する pTip- LCH1、配列番 号 5 6に表される塩基配列を有する pTip- LCH2、 pTip-CHl. K pTip-CH2. Κ pTip-LCHl. 1および pTip- LCH2. 1の誘導性プロモーターを前記の 77; ^遺伝子プロ モーターの- 10領域配列の変異が CAGCGT配列の TATAAT配列への変異であるプロ モ一ターに置換したベクタ一が挙げられる。 なお、 誘導型発現ベクターは TipA 遺伝子もしくはその変異体および TipA遺伝子発現用プロモーターを含む誘導力 セットならびにチォストレブトン耐性遺伝子も含んでいる必要がある。
本発明の上記発現ベクターに外来遺伝子を組み込み、 宿主微生物に導入し該宿 主微生物を培養することにより、 該外来遺伝子を発現させることができる。 発現 ベクタ一への外来遺伝子の組込みは公知の遺伝子工学的手法により行うことがで き、 宿主微生物への発現べクタ一の導入も公知の手法で行うことができる。 さら に、 宿主微生物の培養も、 それぞれの微生物に適合した培地を用いて適当な条件 下で培養を行えばよい。 ベクターを組込む宿主生物としては、 Rhodococcus属細 菌および大腸菌が挙げられる。 ここで、 外来遺伝子とは、 本発明のベクターを用 いて発現させようとする標的タンパク質をコードする遺伝子であり、 宿主細胞以 外の生物由来のタンパク質をコードする遺伝子をいう。 本発明のベクタ一を用い て発現産生させるタンパク質は限定されず、 いかなるタンパク質も対象となり得 る。 本発明の発現ベクターを導入する宿主生物が低温で増殖可能な微生物、 例え
¾ R. erythropol is R. fasciansお R. opacus ^O) Rhodococcus WM ^ る場合、 通常の微生物の増殖に適した温度条件、 即ち約 15 °Cを超える中高温で
'発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質を発現産生させること ができる。 このようなタンパク質として、 宿主細胞の至適生育温度範囲内の温度 で発現できないが同一のまたは異なる種類の宿主細胞を用いた場合にその微生物 の好適生育温度範囲内の温度よりも低温で発現できるタンパク質、 宿主微生物の 好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞にとって致死性となる が同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温で はそれらの宿主細胞に致死性でないタンパク質、 宿主細胞の好適生育温度範囲内 の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種 類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞の増 殖を阻害しないタンパク質、 宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた 塲合に封入体と呼ばれる不活性なタンパク質の凝集を作るが同一のまたは異なる 種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温でそれらの宿主細胞で発 現させた場合に活性のある可溶性タンパク質となるタンパク質、 好適生育温度範 囲が 20 °C以下である好冷菌、 低温環境下に生存する変温動物、 低温環境下に生 存する植物由来のタンパク質が挙げられる。
発現ベクターが含んでいるプロモーターが誘導型のプロモーターの場合、 誘導 物質の宿主微生物の培養系に添加することにより、 外来遺伝子の発現産生を誘導 することができる。本発明の発現ベクターが含む誘導型プロモーターとして、 TipA 遺伝子プロモーターが挙げられ、 該遺伝子プロモータ一を含んでいる場合、 チォ ストレプトンの添加により発現産生が誘導される。 この際チォストレプトンは、 終濃度 0. 1 g/ml以上、好ましくは 1 ^ g/ml以上となるように添加すればよい。 ただし、 10 /x /ml を越えると生育が悪くなる。 また、 本発明の発現べクタ一が 構成型のプロモータ一を含んでいる場合は、 誘導物質を添加することなく外来遺 伝子が発現産生される。
本発明の発現ベクターのうち、 自律複製に必要な DNAが互いに異なる発現べク 夕一は同一の微生物細胞に同時に共形質転換することにより、 該細胞内で安定に 維持され、 それぞれのベクターが含んでいる外来遺伝子を同時に発現産生させる ことができる。 この場合、 それぞれのベクターが含んでいる外来遺伝子は同じ夕 ンパク質をコードするものでも、 異なるタンパク質をコードするものでもよい。 '例えば、 2つのサブュニッ卜からなるタンパク質のそれぞれのサブュニットを自 律複製に 、要な DNAが互いに異なる別々の発現べクタ一に組込んで、 同一の微生 物細胞に導入することにより、一つの細胞内で各サブュニットが同時に発現され、 サブユニット同士が会合して完全なタンパク質が産生される。 この際、 発現べク 夕一は構成的に外来遺伝子を発現し得るもの、 誘導的に発現し得るものの何れの 組合わせを用いてもよいが、 自律複製に必要な DNAが異なる複数の発現ベクター のすベてを誘導的に外来遺伝子を発現し得るものにし、 発現誘導物質で発現誘導 することにより、 2種類以上の外来タンパク質を同時に発現産生させることがで さる。
さらに、 本発明の発現べクタ一中の大腸菌用複製起点について異なるものを選 択することにより、 大腸菌においても 2種類のタンパク質を同時発現させること ができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003- 116280号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、誘導型発現ベクターのパックボーンになるプラスミド pHN136の構築図 である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キ 口ベースペア一： kb) を示す。
図 2は、チォストレプトン耐性遺伝子を持つプラスミド PHN143の構築図である。 図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。 数字は塩基対 （キロべ一 スペア一： kb) を示す。 CIAPは Cal f Intest ine Alkal ine Phosphataseを、 Blu. は平滑末端 （Blunt end ) を意味する。
図 3は、 Inducer casset teを持つプラスミド PHN62の構築図である。 図中に制 限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペア一： kb) を示す。 Blu.は平滑末端 （Blunt end) を意味する。
図 4は、 Express ion casset teを持つプラスミド PHN153の構築図である。 図中 に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をレめす。 数字は塩基対 （キロベースべ ァー： kb) を示す。 CIAPは (Cal f Intest ine Alkal ine Phosphataseを Blu.は平 滑末端 （Blunt end) を意味する。
図 5は、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミド PHN169の構築図である。 図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。 数字は塩基対 （キロべ一 スペア一： kb) を示す。 CIAPは Cal f Intest ine Alkal ine Phosphataseを、 Blu. は平滑末端 （Blunt end) を意味する。
図 6は、 PIP をレポ一夕一遺伝子として持つ誘導型発現べクタ一プラスミド PHN170, ρΗΝΠΙの構築図である。 図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置を 示す。 数字は塩基対 （キロベースペア一： kb) を示す。 CIAP は Calf Intest ine Alkal ine Phosphataseを意味する。
図 7は、 マルチクローニング部位を持つ誘導型発現ベクタープラスミ ド pTip-NHL pTip-CHL pTip-LNHK pTip- LCHlの構築図である。 図中に制限酵素認 識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペア一： kb) を示 す。
図 8は、 マルチクローニング部位を持つ誘導型発現べクタ一プラスミ ド pTip- NH2、 pTip- CH2、 pTip- LNH2、 pTip- LCH2の構築図である。 図中に制限酵素認 識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペア一： kb) を示 す。
図 9 aは、 Tip-NHL pTip-CHK pTip-LNHL pTip-LNHh pTip -觀、 pTip- CH2、 pTip- LNH2、 pTip- LCH2のマップを示す図である。 各領域の機能と、 プラスミドの マップを示す。
図 9 bは、 pTip- NH1、 pTip-LNHl の 77j ^遺伝子プロモーター配列、 または 77/^4- £6 プロモ一夕一配列から、 マルチクローニング部位、 遺伝子転写終 結配列までの DNA配列を未す。
図 9 cは、 pTip- CH1、 pTip-LCHl の 77/^4遺伝子プロモーター配列、 または 4-Zff プロモーター配列から、 マルチクロ一ニング部位、 7¾ 遺伝子転写終 結配列までの DNA配列を示す。
図 9 dは、 pTip- NH2、 pTip-LNH2 の 遺伝子プロモーター配列、 または 77;¾4-Ζί? プロモーター配列から、 マルチクローニング部位、 ¾ 遺伝子転写終 結配列までの DNA配列を示す。
図 9 eは、 pTip- CH2、 pTip-LCH2 の 7 遺伝子プロモータ 配列、 または J7i^-Z6 ?プロモーター配列から、 マルチクローニング部位、 ¾ 遺伝子転写終 結配列までの DNA配列を示す。
図 10は、 Tip-CHl.1、 Tip-LCHl.1、 pTip-CH2.1および Tip-LCH2.1のマツ プを示す図である。
図 11は、 PIP活性測定のためのコントロールプラスミド ρΗΝΠ2、 PHN173の構 築図である。 図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置を示す。 数字は塩基対 (キロべ一スペア一： kb) を示す。 また、 CIAP は Calf Intestine Alkaline Phosphataseを意味する。 ρΗΝΠΟは、「Expression cassettejと「Inducer cassettej 両方をもつのに対して、 PHN173 は 「Expression cassettej のみをもち、 pHN172 は両 cassetteを持たない。
図 12は、 遺伝子プロモーター配列を示す図である。
図 13は、 / 遺伝子プロモータ一の 77 - プロモーターへの改良を示す 図である。
図 14は、 PRE8424 のマップを示す図である。 図中には主な制限酵素認識部位 が示されていて、 オープンリーディングフレーム （0RF) が矢印で示されている。 DS0と SS0の位置が四角で示されている。
図 15は、 pRE8424、 pAPL pBLL pJVL pIJlOL pSN22の Repタンパク質の 5 力所の保存された領域（Motif IVゝ Motif L Motif ILMotif III、 C- terminal mot if) のアミノ酸配列を示す図である。 Rep タンパク質の機能に重要とされるチロシン 残基は四角で囲ってある。 図 1 6は、 pRE8424、 pAPl、 pBLK pJVL pIJlOK pSN22の DSOと考えられる配 列のうち、 特に保存された DNA配列を示す図である。
図 1 7は、 PRE8424の SS0、即ち配列表中の配列番号 90のうちヌクレオチド番 号 5268から 5538の配列と、 その取りうる二次構造を示す図である。
図 1 8— 1は、 pTipベクターのマップを示す図である。
図 1 8— 2は、 pNitベクタ一のマップを示す図である。
図 1 9は、 TipA - LGlOp一 MCS - ALDH Nit-LGIO - MCS - ALDHiの MA配列を 示す図である。 77^遺伝子プロモーターの野生型- 10領域配列は GCGTで、 Nit プロモーターの- 10領域配列は TATAATで、 おのおの四角で囲まれている。
図 2 0は、 R. ery ro o/Ls KM3201株を pHN380、 pHN410、 pH讓、 pHN387、 PHN389で、形質転換し、 PIPのべプチダーゼ活性を測定した結果を示す図である。 図 2 1は、 PIP、 GFPを不和合性を起こさない 2つのベクターに組込み、 単一の R. ery JCM3201細胞で、 発現、 精製し、 SDSポリアクリルアミド電気泳 動結果後、 ゲルをクマシ一プリリアントグリーン G- 250で染色した結果を示す写 真である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔参考例 1〕
(1) Rhodococcus erythropolis Rhodococcus i V ^^ ^ί 能なプラスミドの分離とその一部 DNA配列の決定 '
Rhodococcus erythropoli と大腸菌の複合べクタ一を作成するために、 まず Rhodococcus属細菌内に存在する小型の内在性プラスミドを検索した。 すると、 Rhodococcus ery ro^ is KM2895 株にその存在が確認された。 このプラスミ ドに PRE2895と名前を付けた。 以下にプラスミドの分離と、 その DNA配列決定に ついて具体的に述べる。
Rhodococcus erythropolis JCM2895 株を 5 ml の LB 培地 （1% Difco Bacto
Try tone, 0.5% Difco Yeast Extract, 1.0¾ 塩化ナトリウム） にて、 30 でで 30 時間培養した菌体から QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製）を用いて RE2895 を精製した。 この際、 Buffer P1 250 ilに懸濁後、 Buffer P2 250 lを加える 前に、 5 1のリゾチーム （lOOmg/ml) を加え 37 °Cで 30分インキュベートした 点を除いては、 使用説明書通りに作業した。
上記 DNAサンプルを制限酵素 coRIで処理し、 1.0%ァガロースゲル電気泳動（100 V、 30分） に供したところ、 約 5.4 kbの DNA断片 1本の存在が確認された。
この約 5.4 kbの MA断片をゲルから切り出し、 QIAdiiick Gel Extraction Kit
(QIAGEN社製） を用いて、 使用説明書通りに精製した。 得られた coRI断片を常 '法 (Sambrook et al.， Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd edition
[1989] , old Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ) に 従って、 プラスミド pBluescript II SK (+) (STRATAGENE社製） の coRI部位に サブクローンし、 このプラスミドに PHN79と名前を付けた。
PHN79を Reverse, M13- 20両プライマ一 （共に STRATAGENE社製） を用い、 DNA シークェンサ一 ABI PRISM (R) 3100 Genetic Analyzer (ABI 社製） を用いて、 使 用説明書に準じて、 PHN79の塩基配列を約 400塩基ずつそれぞれ決定した。 相同 性検索の結果、 PHN79にサブクローンされた Rhodococcus erythropol isKM 株由来の DNA領域はその 99.8%の配列が GenBankに受入番号 AF312210として登録 されている 5403塩基対の環状 DNA、 pN30と一致した。
分離した PRE2895は全塩基配列を決定しなかったが、 pN30との相同性は極めて 高く、また制限酵素切断地図も PN30の配列から予想されるものと一致したことか ら、 これらの相同性はプラスミド全体にわたっていると予想された。 また、 pN30 は Mycobacterium for tui turn 002 株から分離された内在性プラスミド PAL5000
(Rauzer et al. , Gene 71315-321 [1988], Stolt and Stoker, Microbiology 142
2795-2802 [1996] )、 Rhodococcus erythropolis NI 86/21 株から分離された
PFAJ2600 (De Mot et al. , Microbiology 1433137-3147 [1997]) と相同性が高 く、 類似の機構で自律複製していると考えられた。 PAL5000は推定 ^ ^遺伝子、 推定 遺伝子、推定複製開始点を含む領域のみで各細菌内で自律複製するため に十分であるため、 本発明者らが分離した PRE2895も同様の領域のみを発現べク 夕一中に組み込めば、 Rhodococcus属細菌内で自律複製するために十分と考えら れた。
(2) ベクタ一プラスミド PHN136の構築
前記 （1) で分離した PRE2895の一部と大腸菌内で自律複製可能なプラスミド の一部を用いて両菌の複合ベクターを作成するため以下の作業を行った （図 1)。 プラスミド pBluescript II SK (-) (STRATAGENE社製）をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 1、 2に記載の合成オリゴデォキシリポヌクレオチドプライ マー （以下プライマ一と略記） を用いて、 ポリメラーゼチェーンリアクション法 (以下、 PCRと略記： Saiki et al., Science, 239487-491 [1988]) による ]) NA の増幅を行った。 なお、 用いた PCR用の酵素は Pfu turbo (STRATAGENE社製） で ある。 その結果、 アンピシリン耐性遺伝子 （図中においては Ampfと表記） と大腸 菌内で自律複製させるために必要な <¾7E1 配列領域を含む 2. Okb の増幅された DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素 S clと _ ίΙで二重消化し、 1.0%ァガロー スゲル電気泳動 （100 V、 30分） に供し、 該 DNA断片を切り出し、 QIAduick Gel Extraction Kitを用いて、 使用説明書に準じて精製した。
一方、 pN30 (前記 （1)) の配列をもとに^ oiococc 属細菌内で自律複製する ために必要と思われる領域を増幅するプライマーを設計した。 なお、 同プライマ —の配列は配列表中の配列番号 3、 4で示される。 プラスミド pHN79をテンプレ ートとして、両プライマ一を用いて PCRによる増幅を行ったところ 1.9kbの増幅 された DNAを得た。 この DNA断片を制限酵素 ^ I と Sadで二重消化し、 1.0% ァガ口一スゲル電気泳動 （100 V、 30分） に供し、 該 DNA断片を切り出し、 上述 の方法と同様に精製した。
上記 2つの精製された DNA断片を DNA Ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製） を用 いて、使用説明書通りにライゲーシヨンし、得られたプラスミドに PHN129と名前 を付けた。
次に PHN129に存在する制限酵素認識部位 BaiM SaJlを除去するため以下の作 業をおこなった。 まず、 PHN129 をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 5、
6に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 この PCR断片を BgJll と Pstlで二重消化して得られた 0.5 kbの DNA断片を PHN129の a lI、 Pstl部位 にサブクローンした。結果、 と で連結された部分においては推定 遺伝子のオープンリーディングフレーム （以下 0RFと略記） 内であるが、 コード されるアミノ酸が置換されることなく、 BaEi 認識部位が除去された。また Sa 認識部位は BanEi認識部位のごく近傍に存在したが、 配列番号 5に記載のプライ マー中において、 認識部位が除かれ、 かつ、 コ一ドされるアミノ酸が置換さ れないよう設計されていることから、 認識部位と同時に《¾ 認識部位も除 去されている。 このプラスミドに PHN135と名前を付けた。
次に PHN135に存在する制限酵素認識部位 を除去するため以下の作業をお こなった。 まず、 プラスミド PHN135をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 5、 6に記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 この PCR断片を Pstlと 1で二重消化して得られた 0.5 kbの DNA断片を pHN135の Ps 、 Bglll 部位にサブクローンした。 結果、 Ban l と BgJUで連結された部分においては推 定 遺伝子の 0RF部分であるが、コードされるァミノ酸が置換されることなく、 認識部位が除去された。 この結果得られたプラスミドに PHN136と名前をつ けた。
(3) ベクタープラスミド PHN143の構築
タンパク質の発現誘導には抗生物質チォストレプトンを用いるが、 ½i^OCOCC erythropolisは同物質に対して感受性であるために、耐性を付与させなければな らない。 そこで ？ ^ /rezASが持つチォストレプトン耐性遺伝子、 tsr 遺伝子 (Bibb et al. , Mol. Gen. Genet. 19926-36 [1985] ：図中においては、
Thio1と表記する） を複合べクタ一中に組み込むこととした。 なお、 この遺伝子が Rhodococcus erythropolis内で機能し、 チォストレブトン耐性を付与すること はすでに報告されている (Shao and Behki, Lett. Appl. Microbiol. 21261-266
[1995])。 以下に、 同遺伝子の分離について具体的に述べる （図 2)。
まず、 PCRのテンプレートに使用する eiw JCM4217株のゲ ノム DNAを以下のように調製した。 5mlの SB培地 （1% Difco Bacto Try tone,
0.5% Difco Yeast Extracts 0.5% 塩化ナトリゥム、 0.1% Glucose、 5 mM塩化マ グネシゥム、 0.5% グリシン） にて 30 °Cで培養した同菌株を 500 lの SETバッ フ了 (75 mM塩化ナトリゥム、 25 mM EDTA [pH8.0] , 20 mM Tris-HCl [pH7.5] ) に懸濁した。 そこに、 5 lのリゾチーム溶液 （100 mg/ml) を加え、 37 °Cで 30 分インキュベートした。 そして、 14 lのプロテアーゼ K溶液 （20 mg/ml) と 60 / lの硫酸ドデシルナトリウム溶液 （10%) を加え、 よく混合した後 55 ^で 2時 間インキュベートした。 その後、 200 lの塩化ナトリウム溶液 （5 M) と 500 n 1 のクロ口ホルムを加え、 20分間室温で回転撹拌した。 遠心分離し、 700 の 上清をとつた。 これをイソプロパノール沈殿後、乾燥させ、 50 lの TE溶液（10 M Tris-HCl [pH8. 0] , 1 mM EDTA [pH8. 0] ) に溶解した。
上記のように精製した
Figure imgf000024_0001
JCM4217株のゲノム DNAをテンプ レートとして、 配列表中の配列番号 7、 8に記載のプライマ一を用いて、 PCR に 'よる増幅を行った。 その結果、 チォストレプトン耐性遺伝子を含む l. l kbの増幅 された を得た。なおこの DNA断片はプラチナ Pfx DNAポリメラーゼ（Gibco BRL 社製） を用いたため、 その末端は平滑末端である。 この DNA断片を精製し、 常法 (Saibrook et al. , Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd edi t ion [1989] , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spr ing Harbor, N. Y. ) ίこ従レ 5' 末端を Τ4-ポリヌクレオチドキナ一ゼによりリン酸化した後、 プラスミ ド pGEM-3Zf (+) (Promega社製） の el l部位にサブクローンした （サブクローン された向きは DNAの 5'方向から ffMU I認識部位- 遺伝子 0RF- coRI認識部位 である）。 このプラスミドに pHN137と名前を付けた。
次に PHN137に存在する制限酵素認識部位 Sanを除去するため以下の作業をお こなった。 まず、 プラスミド PHN137をテンプレートとして、 配列表中の配列番号
9、 1 0に記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 なおこの PCR にはプラチナ Pix DNA ポリメラーゼを用いた。 この PCR 断片の片方の末端を で消化して得られた 0. 6 kbの DNA断片を精製し、 さらに常法により平滑 末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオチドキナ一ゼによりリン酸化した。 一方、 プ ラスミド PHN137をテンプレートとして、配列表中の配列番号 1 1、 1 2に記載の プライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。なおこの PCRにはプラチナ Pfx DNA ポリメラーゼを用いた。 この PCR断片の片方の末端を coRIで消化して得られた
0. 5 kbの DNA断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の 5'末端を T4-ポリヌ クレオチドキナーゼによりリン酸化した。 これら 2つの PCR断片を同時にプラス ミド pGEM- 3Ζί (!)の m、滅 1部位にサブクローンした結果、 平滑末端同士 で連結された部分においては 遺伝子の 0RF部分であるが、 コードされるアミ ノ酸が置換されることなく、 認識部位が除去された。 このプラスミドに PHN143と名前を付けた。
( 4 ) ベクタープラスミド PHN62の構築
チォストレプトンによつて誘導型発現をさせるためには Rhodococcus属細菌内 に TipA タンパク質を存在させなければならない。 そのために、 Rhodococcus
Figure imgf000025_0001
から構成的なプロモータ一を分離し、 その下流に T ipAタンパク質 をコードする構造遺伝子を連結した（図 3 )。構成的に機能するプロモーターとし 'ては odococcus erythropol isのアルデヒドデヒドロゲナーゼ様夕ンパク質を コードす ¾ 遺伝子 （Nagy e t al. , J. Bac t erio l. 676-687 [1995] ) の プロモーター配列を用いた。
テンプレートに使用する S eptomyces coe /Co/or A3 (2)株のゲノム DNA は Streptomyces azureusからゲノム DNAを調製したときと同様に作業し、精製した。 また、 Rhodococcus erythropolis JCM3201株のゲノム DNAは 5 mlの LB培地で 培養した点を除いては Streptomyces azureusからゲノム DNAを調製したときと同 様に作業し、 精製した。 .
上述のように精製した Strep tomyces coel iColor A3 (2)株のゲノム DNAをテン プレートとして、 配列表中の配列番号 1 3、 1 4に記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの PCRにはプラチナ Pix DNAポリメラーゼを用 いた。その結果、 遺伝子の 0RF並びにその下流の転写終結配列を含む DNA (図 中においては TipAと表記） を得た。
この PCR断片の片方の末端を Bg l lで消化して得られた 0. 9 kbの DNA断片を精 製し、さらに常法により平滑末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオチドキナーゼに よりリン酸化した。 一方、 上述のように精製した Rhodococcus erythropolis
JCM3201株のゲノム DNAをテンプレートとして、 配列表中の配列番号 1 5、 1 6 に記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 アルデヒド デヒドロゲナーゼ様タンパク質をコードする J^ 遺伝子 （Nagy e t al. , J.
Bac te-r io i. 177 676-687 [1995] ) のプロモータ一配列 (図中においては ALDHp と表記） を含む]) NAを得た。 なおこの PCRにはプラチナ Pix DNAポリメラーゼを 用いた。この PCR断片の片方の末端を で消化して得られた 0. 2kbの DNA断片 を精製し、 さらに常法により平滑末端側の 5'末端を T4 -ポリヌクレオチドキナー ゼによりリン酸化した。 これら 2つの PCR断片を同時にプラスミド PGEM-3Z +) の Xbal、 Ban l部位にサブクローンした結果、 ¾ 遺伝子のプロモー夕一配列の すぐ下流に Γ ί遺 子の 0RF並びに転写終結配列を含むプラスミドが作成され、 PHN33と名前を付けた。
次に PHN33に存在する制限酵素 Ncol認識部位 2力所（以下、 Nco\ (1)、 Ncol (2) と表記する） を除去するため以下の作業をおこなった。
まず、 プラスミド PHN33をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 9、 1 7 に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの. PCRにはブラ チナ Pix DNAポリメラーゼを用いた。 この PCR断片の片方の末端を IMで消化し て得られた 0. 5 kbの DNA断片を精製し、 さらに常法により平滑末端側の 5'末端 を T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。 一方、 プラスミド PHN33 をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 1 8、 1 2に記載のプライマ一を用 いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの PCRにはプラチナ Pfx DNAポリメラー ゼを用いた。この PCR断片の片方の末端を Κριήで消化して得られた 0. 6 kbの DNA 断片を精製し、 さらに常法により平滑末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオチドキ ナーゼによりリン酸化した。 これら 2つの PCR 断片を同時にプラスミ ド pGEM- 3ΖΠ+)の^ sl、 f wl部位にサブクローンした結果、 平滑末端同士で連結さ れた部分においては T 遺伝子の 0RF部分であるが、コードされるァミノ酸が置 換されることなく、 (1)認識部位が除去された。 このプラスミドに PHN50と名 前を付けた。
次に PHN33に存在する制限酵素認識部位 Ncol (2)を除去するため以下の作業を おこなった。 まず、 プラスミド PHN33をテンプレートとして、 配列表中の配列番 号 9、 1 9に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの PCR にはプラチナ Pix DNAポリメラーゼを用いた。 この PCR断片の片方の末端を Xbai で消化して得られた 0. 8 kbの DNA断片を精製し、 さらに常法により平滑末端側の
5'末端を T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。 一方、 プラスミド
PHN33 をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 2 0、 1 2に記載のプライマ —を用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの PCRにはプラチナ Pfx DNAポリ メラ一ゼを用いた。この PCR断片の片方の末端を Kpnlで消化して得られた 0. 3 kb の DNA断片を精製し、 さらに常法により平滑末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオ チドキナーゼによりリン酸化した。 これら 2つの PCR 断片を同時にプラスミド pGEM-3Zf (I)の J¾al、 Kpnl部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結され た部分においては TipA遺伝子の 0RF部分であるが、コードされるァミノ酸が置換 されることなく、 οΙ (2)認識部位が除去された。 このプラスミドに ρΗΝ51と名前 を付けた。
最後に以下の作業を行った。 ΡΗΝ50 を Xba\ と で二重消化して得られた
0. 7kbの 断片と PHN5 1を Sad と IQmlで二重消化した 0. 4kbの断 j†.を同時に プラスミド pGEM- 3Ζί (+)の XM、 Kpnl部位にサブクローンした。 結果、 Ncol (1)と
(2)両方の制限酵素部位を欠いた 7 4遺伝子を持つプラスミドを取得し、 こ れに pHN62と名前をつけた。
( 5 ) ベクタ一プラスミド PHN153の構築
目的のタンパク質を誘導的に発現せしめることができるかどうか確認するため に、 77; ^遺伝子のプロモーターの下流にレポ一夕一遺伝子として The r卿 1 as acidopJiilum虫来のプ ti ンイミノぺプチダーゼ (Tamura e t al. , FEBS Le t t. 398
101-105 [1996] ：以下 PIPと略記する） をコードする遺伝子の 0RF (図中におい ては PIP 0RFと表記） を連結し、 さらにその下流に転写のリードスルーを抑制す るために転写終結配列を連結した。 以下に具体的に述べる （図 4 )。
前記 （4 ) にて精製した Streptomyces coeliColor A3 (2)株のゲノム DNAをテ ンプレートとして、配列表中の配列番号 2 1 , 2 2に記載のプライマーを用いて、
PCRによる増幅を行った。 その結果、 7^4遺伝子のプロモーター配列 （図中にお いては TipApと表記） を含む 0. 2 kbの増幅された DNAを得た。なおこの PCRには プラチナ Pfx DNAポリメラーゼを用いた。 この断片を精製し、 常法により 5'末端 を T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミド pB luescr ip t
I I SK (+)の al部位にサブクローンした （サブクロ一ンされた向きは DNAの 5' 方向から Kpnl認識部位- 遺伝子プロモーター配列- 5sd認識部位である）。こ のプラスミドに pHN150uと名前を付けた。 次に、 プラスミド pRSET - PIP (Tamuraet al., FEBSLett. 101 - 105 [1996] ： 以下 PIPと略記する） をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 2 3， 24に 記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 なお、 配列表中の配列番 号 24のプライマーは 遺伝子の終止コドンを除いて、 かつタンパク質の精製 を容易にするために 6XHisタグが PIPタンパク質の C末端に付くように設計され ている。 6XHisタグは、 6つの連続したヒスチジン残基から成る連続配列で、 こ れを融合したタンパク質は、 ニッケルイオン等に高い親和性を示すようになる。 従って、 ニッケルイオン等を用いた金属キレートクロマトグラフィーで精製が容 、易になる （Crowe et al. , Methods Mol. Biol. 31 371-387 [1994])。 この PIP 遺伝子 拿む 0.9 kbの DNA断片を制限酵素 Nco\と で二重消化し、 pHN150u の Nco、 部位にサブクローンした結果、 遺伝子のプロモーター配列の すぐ下流に Ρ遺伝子の 0RFを含むプラスミドが作成され、 pHN151uと名前を付 けた。
次に、 前記 （4) て镜製しすこ Rhodococcus ery ro ； [CM3201株のゲノ ム DNAをテンプレートとして、 配列表中の配列番号 2 5, 26に記載のプライマ —を用いて、 PCRによる増幅を行った。その結果、 όί ^遺伝子の転写終結配列（Nagy et al., J. Bacteriol. 177676-687 [1995] ：図中においては ALDHtと表記) を 含む DNAを得た。 この 0.2k の DNA断片を制限酵素 Spdと Xba\で二重消化し、 pHN151u (D SpeL i¾al部位にサブクローンした。 その結果、 7; ^遺伝子のプロモ 一ター配列のすぐ下流に P遺伝子の 0RFを含み、またそのすぐ下流に H A遺伝 子の転写終結配列を含むプラスミドが作成され、 PHN153と名前を付けた。
(6) ベクタープラスミド PHN169の構築
Rhodococcus erythropolis をプラスミドで形質転換するためには適当な形質 転換マーカ一が必要になる。 そこで 属細菌内で機能する強力なプロ モーターの下流に薬剤耐性遺伝子を連結し、 使用することとした。 プロモーター としては、 5 rej3 OTyc 属細菌由来の Elongation factor Tuをコードする Tufl 遺伝子プロモーターを用いることとしたが、 これは同プロモーターが強力に下流 の遺伝子を転写せしめるとの報告があるからである （Wezel et al. , Bioc im.
Biophys. Acta 1219543-547 [1994])。 また、 薬剤耐性遺伝子は入手が容易なテ トラサイクリン耐性遺伝子を用いた。 以下に具体的に述べる （図 5 )。 前記 （4 ) にて精製した Strep tomyces coe (¾ i?r A3 (2)株のゲノム DNAをテ ンプレートとして、配列表中の配列番号 2 7 , 2 8に記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 遺伝子のプロモーター配列 （図中にお いては Tuf lpと表記） を含む 0. 2 kbの増幅された DNAを得た。 なおこの PCRには プラチナ Pfx DNAポリメラーゼを用いた。 この断片を精製し、 常法により 5'末端 を T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミド pB luescr ip t I I SK (+) の Hin i 部位にサブクローンした （サブクローンされた向きは DNA の 5'方向から Kjrnl認識部位 -: Γζ// 遺伝子プロモーター配列- coRI認識部位であ る）。 .、
このプラスミドに PHN158と名前を付けた。
次に、 プラスミド PACYC 184 (Rose, Nuc le ic Ac ids Res. 16 355 [1988] ) をテ ンプレートとして、配列表中の配列番号 2 9、 3 0に記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 テトラサイクリン耐性遺伝子 （図中にお いては Te tfと表記） を含む DNAを得た。 この 1. 3kbの DNA断片を制限酵素 Xho\ と Suelで二重消化し、 PHN158の SaF Spel部位にサブクローンした結果、 Tufl 遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にテトラサイクリン耐性遺伝子を含むブラ スミドが作成され、 PHN159と名前を付けた。
次に PHN159に存在する制限酵素認識部位 Πを除去するため以下の作業をお こなった。 まず、 プラスミド PHN159をテンプレートとして、 配列表 3 1、 3 2に 記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの DNA断片は Pfu turbo DNA ポリメラ一ゼを用いたため、 その末端は平滑末端である。 この PCR断 片の片方の末端を ^ olで消化して得られた 0. 5 kbの DNA断片を精製し、 さらに 常法により平滑末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化 した。一方、プラスミド PHN159をテンプレートとして、配列表中の配列番号 3 3、 3 4に記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの PCRには Pfu turbo DNAポリメラーゼを用いた。 この PCR断片の片方の末端を 1で消化 して得られた 1. Ikbの DNA断片を精製し、 さらに常法により平滑末端側の 5'末端 を T4-ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。 これら 2つの PCR断片を 同時にプラスミド pBluescript I I SK (+)の ¾ 、 Λ¾ Ι部位にサブクローンした 結果、 平滑末端同士で連結された部分においてはテトラサイクリン耐性遺伝子の 0RF部分であるが、 コードされるァミノ酸が置換されることなく、 £ 部位が除 去された。 このプラスミドに PHN165と名前を付けた。
次に PHN159に存在する制限酵素認識部位 Sailを除去するため以下の作業をお こなった。 まず、 プラスミド PHN159をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 3 1、 3 5に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 なおこの PCR には Piu turbo DNAポリメラーゼを用いた。 この PCR断片の片方の末端を Xho\ で消化して得られた 0. 8 kbの DNA断片を精製し、 さらに常法により平滑末端側の 5'未端を、 T4-ポリヌクレオチドキナ一ゼによりリン酸化した。 一方、 プラスミド PHN159をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 3 6、 3 4に記載のプライマ —を用いて、 PCIUこよる増幅を行った。 なおこの PCRには Pfu turbo DNA ポリメ ラーゼを用いた。 この PCR断片の片方の末端を No で消化して得られた 0. 8 kb の DNA断片を精製し，さらに常法により平滑末端側の 5'末端を T4-ポリヌクレオチ ドキナ一ゼによりリン酸化した。 これら 2つの PCR 断片を同時にプラスミド pBluescript I I SK (+) の Xho\、 o I部位にサブクロ一ンした結果、 平滑末端同 士で連結された部分においてはテトラサイクリン耐性遺伝子の 0RF部分であるが、 コードされるアミノ酸が置換されることなく、 認識部位が除去された。 この プラスミドに PHN166と名前を付けた。
最後に以下の作業を行った。 PHN166を と 5/?dで二重消化して得られた 0. 9 kbの DNA断片を PHN165の 、 el部位にサブクローンした。 結果、 £ と Sail 両方の制限酵素認識部位を欠くテトラサイクリン耐性遺伝子クローンを取 得し、 このプラスミドに pHN169と名前をつけた。
( 7 ) ベクタープラスミド ρΗΝΠ0、 ρΗΝ171の構築
前記 （2 ) から （6 ) までに分離してきた遺伝子群を連結し、 Rhodococcus 細菌内で誘導可能な発現ベクターを構築するために以下の作業を行った （図 6 )。
PHN143を 5adで消化して得られた 1. 1 kbの DNA断片を pHN136の ad部位に サブクローンした （サブクローンされた向きは DNAの 5'方向から推定 遺伝 子 0RF- 遺伝子 0RF-アンピシリン耐性遺伝子 0RFである）。 その結果できたプ ラスミドに PHN144と名前をつけた。
次に、 PHN62を J¾3lと K で二重消化して得られた 1. 1 kbの DNA断片を pHN144 の Xba\、 部位にサブクローンした。 その結果できたプラスミドに pHN152と 名前をつけた。
次に、 PHN153を と Xba\で二重消化して得られた 1. 2 kbの DNA断片を PHN152 の BsrGL Spel 部位にサブクローンした。 その結果できたプラスミドに PHN154と名前をつけた。
次に、 pHN 169を と Spelで二重消化して得られた 1. 6 kbの DNA断片を pHN 154 の Xbal部位にサブクローンした （サブクロ一ンされた向きは DNAの 5'方向から 遺伝 0RF-テトラサイクリン耐性遺伝子 0RF- J¾ 遺伝子プロモーター配列で ある）。 その結果 遺伝子プロモーターの制御下に置かれた / 遺伝子を含む プラスミドが作成され、 できたプラスミドに ρΗΝΠΟと名前をつけた。
また組み換えタンパク質の高発現化のため、 TiM遺伝子プ口モーター下流のリ ボゾーム結合部位を翻訳効率の良いとされるラムダファージ gene 10由来の配列
(Gold and Stormo, Me thods Enzymol. 589- 93 [1990] ) に変化させた （図 6 )。 以下に具体的に述べる。 .
プラスミド PHN170をテンプレートとして、配列表中の配列番号 2 1 , 3 7に記 載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 77;^遺伝子プロ モーターとラムダファージ genelO由来リボソーム結合部位からなるハイブリツ ドプロモータ一 （以下 7 ^4- Z6 プロモー夕一と表記する： 図中に置いては
TipA-LGlOpと表記） を得た。 この 0. 2 kbの DNA断片を制限酵素 Bsii と Nco\で 二重消化し、 HN170の ^1、 Ncol部位にサブクローンした。その結果 TipA-LGlO プロモーターの制御下に置かれた 遺伝子を含むプラスミドが作成され、 でき たプラスミドに PHN171と名前をつけた。 図 1 2に 1 ^プロモーター配列を、 図
1 3に 77 ^プロモーターの プロモーターへの改変のためのリボソーム 結合部位 (RBS)配列の改良を示す。
( 8 ) ベクタープラスミド pT ip- NH1、 pTip-CHL pT ip-LNHL pTip- LCH1の構築 前記 .（7 ) で述べたプラスミドからレポ一夕一である / 遺伝子を除き、 マルチ クローニング部位を導入するため以下の作業を行った （図 7 )。 配列表中の配列番号 3 8、 3 9に記載の合成オリゴデォキシリポヌクレオチド はマルチクローニング部位になる配列を含み、 お互いに相補的な配列を持つ。 こ れら 2つを等モル量ずつ混合し、 70 °Cで 10分処理し、 20分かけて室温に冷却し、 2本鎖化させた。 その結果、 その末端は colと Si7elで二重消化されたベクター と連結可能な状態になり、この 2本鎖化した合成 DNA (図中においては MCS Linker 丽 coと表記） を ρΗΝΠΟの oI、 Spel部位にサブクローンした。 その結果できた プラスミドに pTip- NH1と名前をつけた。 また、 配列表中の配列番号 4 0、 4 1に 記載の合成オリゴデォキシリポヌクレオチド （マルチクローニング部位になる配 列を含み、 お互いに相補的な配列を持つ） を同様に 2本鎖化させた合成 DNA (図 中においては MCS Linker CNcoと表記） を pHN170の 、 5^1部位にサブクロ ーンした。 その結果できたプラスミドに pTip- CH1と名前をつけた。
前記 （7 ) で述べた 77」¾遺伝子プロモーター配列とラムダファージ ize 由 来リボソーム結合部位からなるハイプリッド DNAを制限酵素^^ Iと olで二重 消化し、 pTip-NHlと pTip- CH1の Bs Ncol部位にそれぞれサブクローンした。 結果得られたプラスミドに pTip- LNH1、 pTip-LCHlとそれぞれ名前を付けた。
( 9 ) ベクタープラスミド pTip- NH2、 pTip- CH2、 pTip-LNH2, pTip-LCH2の構築 前記 （8 ) で述べたプラスミド pTip- NH1、 pTip-CHL pTip-LNHl
、 Tip-LCHl において、 マルチクローニング部位の最も上流の Ncol部位を に変更するために以下の作業を行った （図 8 )。
プラスミド ρΗΝΠΟをテンプレートとして、配列表中の配列番号 2 1、 4 2に記 載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、
Figure imgf000032_0001
遺伝子プロ モーターを含む D Aを得た。 この 0. 2 kbの DNA断片を制限酵素 ^ I と Ndelで 二重消化し、 PHN170の ^ I、 d部位にサブクローンした。 結果得られたブラ スミドに PHN183と名前を付けた。
配列表中の配列番号 4 3、 4 4に記載の合成オリゴデォキシリポヌクレオチド はマルチクローニング部位になる配列を含み、 お互いに相補的な配列を持つ。 こ れら 2つを等モル量ずつ混合し、 70 で 10分処理し、 20分かけて室温に冷却し、
2本鎖化させた。 その結果、 その末端は と で二重消化されたべクタ一 と連結可能な状態になり、この 2本鎖化した合成 DNA (図中においては MCS Linker 丽 deと表記） を PHN183の d、 S el部位にサブクローンした。 その結果できた プラスミドに pTip- NH2と名前をつけた。 また、 配列表中の配列番号 4 5、 4 6に 記載の合成オリゴデォキシリポヌクレオチド （マルチクローニング部位になる配 列を含み、 お互いに相補的な配列を持つ） を同様に 2本鎖化させた合成 DNA (図 中においては MCS Linker CNdeと表記） を PHN183の d、 S el部位にサブクロ —ンした。 その結果できたプラスミドに pTip-CH2と名前をつけた。
プラスミド pTip-LNHlをテンプレートとして、 配列表中の配列番号 2 1、 4 7 に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 遺伝子 プロモーターとラムダファージ gene 10由来リボソーム結合部位からなるハイプ リッド DNAを得た。この 0. 2kbの DNA断片を制限酵素 ^5 ¾Iと dで二重消化し、 pTip- NH2と pTip- CH2の ^^ I、 el部位にそれぞれサブクローンした。 結果得 られたプラスミドに pTip-LNH2、 pTip-LCH2とそれぞれ名前を付けた。
前記 （8 )、 ( 9 ) で作成したプラスミドのマップと、 マルチクローニング部位 周辺の配列をまとめて図 9に示す。該図中、実線の矢印は 遺伝子プロモータ 一中に存在する Inverted repeat配列を示す。斜線の矢印は ¾ ^遺伝子転写終結 配列に存在する Inverted repeat配列を示す。 また、 原核生物のプロモーター領 域に一般的に存在し、 遺伝子の転写に重要な- 10領域、 -35領域、 RBSは四角で囲 んである。 また RBSの中でも最も重要な SD配列 （Shine and Dalgarno, Eur. J. Biochem. 57 221-230 [1975] ) は下線を引いてある。
( 1 0 ) ベクタープラスミ ド pTip-CHl. 1、 pTip-CH2. K pTip-LCHl. K pTip-LCH2. 1の構築
前記 （8 ) 及び （9 ) で述べたプラスミド pTip- CH1、 pTip- CH2、 pTip-LCHL pTip-LCH2において、マルチクロ一ニング部位の XhcA部位以降の読み枠を市販の pETベクター （Novagen社） の読み枠と一致させるために以下の作業を行った （図 1 0 )。
プラスミド pTip- CH1をテンプレートとして、配列表中の配列番号 2 1、 4 8に 記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 /」¾4遺伝子プ 口モ^_ターとマルチクローニング部位を含む DNAを得た。 この 0. 3 kbの DNA断片 を制限酵素 jBsii と 1で二重消化し、 pTip- CH1の ^ ΪΙ、 Spel部位にサブク ローンした。 結果得られたプラスミドに pTip- CHI. 1と名前を付けた。 プラスミド pTip- CH2をテンプレートとして、配列表中の配列番号 2 1、 4 8に 記載のプライマーを用いて、 PCRによる増幅を行った。 その結果、 遺伝子プ ロモ一夕一とマルチクローニング部位を含む DNAを得た。 この 0. 3 kbの DNA断片 を制限酵素 ^rtil と で二重消化し、 pTip- CH1の ^/«I、 Spel部位にサブク ローンした。 結果得られたプラスミドに pTip- CH2. 1と名前を付けた。
プラスミド pT ip-LCHlをテンプレートとして、 配列表中の配列番号 2 1、 4 8 に記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 TipA-LGlO プロモータ一とマルチクロ一ニング部位を含む D N Aを得た。 この 0. 3kbの DNA 断片を制限酵素 BsiHlと ^elで二重消化し、 pTip- CH1の ^^1、 Spel部位にサ ブクロ一ンした。 結果得られたプラスミドに pTip- LCH1. 1と名前を付けた。
プラスミド pTip-LCH2をテンプレートとして、 配列表中の配列番号 2 1、 4 8 に記載のプライマーを用いて、 PCR による増幅を行った。 その結果、 TipA-LGlO プロモーターとマルチクローニング部位を含む D N Aを得た。 この 0. 3 kbの DNA 断片を制限酵素 ^ il と ^elで二重消化し、 pTip- CH1の ^ «、 Spel部位にサ ブクローンした。 結果得.られたプラスミドに pT ip- LCH2. 1と名前を付けた。
( 1 1 ) ベクタ一プラスミド pHN172、 pHN173の構築
発現の誘導が厳密に調節されているかを調べるために以下のようなコントロー ル実験用プラスミドを作成した （図 1 1 )。
PHN169を Xba\と S elで二重消化して得られた 1. 6 kbの DNA断片を pHN144の Xbal部位にサブクローンした（サブクローンされた向きは DNAの 5 '方向から tsr 遺伝子 0RF-テトラサイクリン耐性遺伝子 0RF-アンピシリン耐性遺伝子 0RFであ る）。 その結果できたプラスミドに ρΗΝΠ2と名前をつけた。
次に、 PHN153を BsAii と Xba\で二重消化して得られた 1. 2 kbの DNA断片を
PHN144 の Bsi 、 Spel 部位にサブクローンした。 その結果できたプラスミドに
PHN164と名前をつけた。次いで、 PHN169を Xbalと Spelで二重消化して得られた
1. 6kbの DNA断片を pHN164の Xba\部位にサブクローンした （サブクローンされ た向きは DNAの 5'方向から 遺伝子 0RF-テトラサイクリン耐性遺伝子 0RF -ァ ンピシリン耐性遺伝子 0RFである）。 その結果できたプラスミドに ρΗΝΠ3と名前 をつけた。
ρΗΝΠΟは、 遺伝子プロモータ一、 その下流に さらにその下流に 7¾ 遺伝子転写終結配列、 の 3因子が連結された遺伝子カセッ ト （以下 Expression cassette と表記） と、 TIicA遺伝子プロモ一夕一、 その下流に Tip A 遺伝子、 の 2因子が連結された遺伝子カセット （以下 Inducer cassetteと表記） 両方をもつ。
PHN173は Expression cassetteのみをもち、 PHN172は両 cassetteを持たない。
(1 2) Rhodococcus属細菌の形質転換
' Rhodococcus erythropolis JCM3201株を LB培地 100 mlにて対数増殖期に至 るまで 0,、°Cで振とう培養する。 培養液を 30分間氷冷し、 遠心分離し、 菌体を回 収する。 これに 100mlの氷冷滅菌水を加え、 よく撹拌し、 再び遠心分離し、 菌体 を回収する。 これに 100mlの氷冷 10%グリセリン溶液を加え、 よく撹拌し、 遠心 分離し、 菌体を回収する。 この氷冷 10%グリセリン溶液での洗浄をもう一度繰り 返し、 菌体を 5 mlの氷冷 10%グリセリン溶液に懸濁する。 400 xlずつ分注し、 液体窒素で瞬間冷凍し、 使用するまで- 80 °Cにて保存した。 -80 °Cから菌体を取 り出し、 氷上にて融解し.、 プラスミド pHN170、 または pHN172、 または pHN173を 3 \ (それぞれ約 300 ng)加えた。 この菌体と DNAの混合液をエレクト口ポレー シヨンキュベット （Bio- Rad 社： 0.2 cmギャップキュベット） に移し、 同社の遺 伝子導入装置ジーンパルサ一 Π を用いて、 電場強度 12.5 kV/cmで、 パルスコン トロ一ラ一の設定はキャパシタンス 25 F、外部抵抗 400 Ωにてそれぞれ電気パ ルスを与えた。 電気パルス処理した菌体と DNAの混合液を 1 mlの LB培地に混合 し、 30 °Cにて 4時間培養した後集菌し、 20 g/mlテトラサイクリン入り LB寒 天培地 （寒天は濃度 1.8« に塗布し、 30 °Cにて 3 日培養し、 それぞれの形質転 換体を得た。
〔実施例 1〕
実験方法
まず、以下の実施例 2から実施例 1 2に書かれた実験に用いた手法を列挙する。 フラスミドは全て、 常法 (Sambrook et al. , Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd edition [1989] , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)に従って構築した。ポリメラーゼチェーンリアクション法（以下、
PCRと略記； Saiki et al., Science 239487-491 [1988]) には全て Pfu turbo
(STRATAGENE社製） を用いた。 プラスミドから切り出した DNA断片は 1.0%ァガ ロースゲル電気泳動に供し、目的の DNA断片を切り出し、 QIAduickGel Extraction
Kit (Qiagen 社製） を用いて、 使用説明書に準じて精製した。 Streptomyces coe /(¾7o" A3 (2)株、 R.
Figure imgf000036_0001
DSM313株のゲノム DNAの分離法、 並びに
J½0(ocoi w属細菌からのプラスミド DNAの精製方法は参考例 1に記載したもの と同一である。大腸菌 ER2508株（New England Biolabs社）のゲノム DNAは QIAGEN
—社製 QIAGEN RNA/DNA Mini Kit を用い、 使用説明書に準じて精製した。 DNA断片 の 5'末端' リン酸化する必要のある場合は東洋紡社製 T4 polynucleotide kinase を用いた。 塩基配列決定には DNA シークェンサ一 ABI PRISM (R) 3100 Genetic
Analyzer (ABI社製） を用いた。 リガ一ゼ反応には New England Biolabs社製の
T4 DNA ligaseを用いた。
用いた主なプラスミ ド、 菌株を表 1， 2に示す。 i^oiococc 属細菌、
Wr^ M7yc^coe //¾ orA3(2)株、 大腸菌の培養は LuriaBroth (LB; 1% Bacto try ton, 0.5% Bacto .yeast extract, 1 % 塩化ナトリウム） で行った。
Rhodococcus属細菌のコンビテントセル作成法、 並びに形質転換法は参考例 1に 記されているが、 予めプラスミドを保持している 属細菌のコンビテ ントセルを作成する際には、適当な抗生物質を含んだ LB培地で培養した菌体から 行った。形質転換体を選択する際には、 テトラサイクリン（液体培地では、 8^g/ ml、 固体培地では 20 iig I ml), クロラムフエ二コール （34 ng I ml), アン ピシリン （50 g / ml) を用いた。
誘導型べクタ一を用いて Proline iminopeptidase (以下 PIP) または、 蛍光緑 色タンパク質 （以下 GFP) を Rhodococcus 属細菌にて発現させる際には、 oiococc 属細菌の形質転換体を適当な抗生物質を含む LB培地で 30 °Cにて培 養し、 600 nmの波長で測定したオプティカルデンシティ一 （0. D.600) が 0.6に なった時点で、 終濃度 l zg/mlになるようにチォス卜レプトン （溶媒はジメチ ルスルホォキサイド） を加え、 さらに 16時間培養を続けた。構成型ベクターを用 いて発現させる際には、 Rhodococcus属細菌の形質転換体を適当な抗生物質を含 む LB培地で 30 °Cにて 0. D. 600が . 0になるまで培養した。
PIP のべプチダーゼ活性を測定する方法を以下に詳述する。 上記のように PIP を発現させた J^o^cocc 属細菌の培養液を、 8 / mlの適当な抗生物質を含 む LB培地で 200 lにメスアップし、 60 °Cにて 1分加温する。 そこに PIPの基 質として 2 lの H- Pro- jS NA ( 100 mM；溶媒はジメチルスルホオキサイド） を加 え 60 °Cにて 20分インキュベートする （PIPは 60 °Cが至適温度）。 PIPによって H-Pro- ]3 NAから加水分解されて遊離した を観察するために、 発色剤として 134 1の Fas t Garne t GBC Sal t 溶液 （和光純薬社製で濃度 0. 5 mg / ml ： 1 M '酢酸ナトリウムバッファ一 （pH 4. 2)、 10% Tr i ton X- 100が溶媒） を加える。 PIP が発現し！:いなければ上記混合液は黄色を呈するが、 発現していれば赤色を呈す る。 また、 呈色した赤色を吸光分光光度計を用い、 550 nmでの吸光度 （A550) を 測定し、 PIP活性を定量した。 測定は Fas t Garne t GBC Sal tを加えた後、 滅菌水 666 ； u lを加え希釈して行った。
その際、 550 nmでは細胞のオプティカルデンシティ一も測定してしまうので、 550 nm での細胞のオプティカルデンシティ一 （0. D. 550) は別測定し、 測定時に 使用した O. D. 550 に相当する値を A550 の値から差し引いて補正した値を Ac550 とする。すなわち、 Ac550=A550-O. D. 550 XPIPの活性測定に使用した培養液量（ml) で計算される。 ユニット値は 「20分間の測定で得られる、 培養液 1 ml あたり、 0. D. 600= 1あたりの Ac550の値」 とし、 「Ac550+PIPの活性測定に使った培養液量 (ml) ÷0. D. 600」 で計算した。
〔実施例 2〕
R. erythropolisに存在する新規内在性プラスミド PRE8424の分離
本発明者は A erWiinw)/ に存在する新規内在性プラスミドを探索し、 R erythropolis JCM2893, R. erythropolis JCM2894, R. erythropolis DSM43200,
R. ery DSM8424 の 4株から小型の環状プラスミドを分離し、 それぞれ pRE2893、 PRE2894, pRE43200> PRE8424と名前を付けた。
これらのうち、 p願 93、 pRE2894、 pRE43200の脆配列を一部決定したところ、 本発明者が以前に R. erythropolis JCM2895株から分離していた pRE ^ (参考 例 1を参照） とほぼ同一の配列を有していた。 PRE2895 はプラスミドの複製に関 与する RepA、RepBタンパク質をコードする遺伝子を オペロンとして有して いるが、これらの夕ンパク質は Mycobacterium f o r t u i t umから分 され 1 pAL5000 プラスミドがコードする RepA、 RepBタンパク質と高度に類似しており、 pRE2895 と PAL5000が類似の様式で自律複製していることが示唆された（Stolt and Stoker, Microbiology 142 2795-2802 [1996], 参考例 1 )。 DRE2895と PAL5000の複製様 式は明らかでないが、両プラスミドの RepAタンパク質が ColE2プラスミドの Rep タンパク質に相同性があるため、 ColE2 プラスミド同様 「0型」 の自律複製様式 を有することが考えられた （Hiraga et al.， J. Bacteriol. 176 7233-7243 '[1994])。
一方、 RRE8424は pRE2<^5と全く異なる DNA配列を有していた （配列表中の配 列番号 9 0、 図 1)。 このプラスミドは 6つのオープンリーディングフレーム
(0RF； 0RF1から 0RF6) を持ち、 うち がコードするタンパク質 （図 14) は ローリングサークル様式で自律複製する一群のプラスミドが持つ J? 遺伝子がコ ードするタンパク質と相同性が高かった （Khan， Microiol. Mol. Biol. Rev. 61 442-455 [1997])。 中でも、 Arcanobacterium pyrogenes pAPl (Billington et al. , J. Bacteriol. 3233 - 3236 [1998])、 5 ^ oz/yc^ F/ 由来 ρΠΙΟΙ
(Kendall et al. , J. Bacteriol. 170 4634-4651 [1988] )、 Streptomyces phaeochromogenes 由来 JVl ( Servin— Gonzalez et al. , Microbiology 141 2499-2510 [1995] ) 、 Brevibacterium lactofermentum 由 来 pBLl
( Fernandez— Gonzalez et al. , J. Bacteriol. 176 3154-3161 [1994] ) 、 5 ^ ^(^/? /^ /^由来1)5^2(1(31&01^ al. , Plasmid 55— 69 [1994]) と相同性が高かった （図 1 5)。 これらのプラスミドは、 いずれもローリングサー クル型プラスミ ドの中でも pIJlOl/pJVl ファミリーに属するもので （Khan, Microiol. Moi. Biol. Rev. 61442-455 [1997])、 pRE8424 もこのファミリーに 属する口一リングサークル型プラスミドである可能性が示唆された。 以下、 0RF6 は と記載する。
一般に、 ローリングサークル型プラスミドが宿主細胞内で自律複製するために は、 前出の の他に、 2本鎖複製起点 （double- stranded origin；以下 DS0)、
1本鎖複製起点 （single- stranded origin；以下 SS0) となる DNA配列が必要で ある。 本発明者は様々な PRE8424の変異体を作成し、 erWzro /^ を形質転 換し、 様々な解析を行い、 DS0、 SSO配列の所在を同定した （図 14)。 DS0は配列 表中の配列番号 90のうちヌクレオチド番号 5514から 5970内に存在すると考え られたが、 他のローリングサークル型プラスミドの DS0配列との比較から、 配列 表中の配列番号 90のヌクレオチド番号 5705から 5734の配列が最も DS0の機能 に重要だと考えられた （図 1 6)。 また、 同定した SS0配列を図 1 7に示す。 SS0 配列は一般に、 ステム - ループ構造など高度な二次構造を持ち、 さらに、 pIJ101/pJVlファミリ一のプラスミドの場合、ステム ― ループ構造のループ部分 に TAGCGTなどからなる共通配列が存在する場合が多い。 PRE8424の SS0も高度な 二次構造、を持ち、 ループ部分に TAGCGG配列を持つ （図 1 7)。
本発明者は、 上記 TAGCGG に変異を持つ PRE8424 の派生プラスミ ドが R. erW力 ro / 細胞内に大量に一本鎖 DNAとして蓄積していたことを見いだした。 一本鎖 DNAの蓄積はローリングサークル型プラスミドのホールマークであること から (Khan, Microiol. Moi. Biol. Rev. 61442-455 [1997])、 pRE8424 はロー リングサークル様式で自律複製していることが明らかとなった。
PRE8424の派生プラス.ミドが宿主細胞である R. erythropolis内で自律複製す るためには、 Rep、 DSO, SSOを含む 2. Okbの領域、 すなわち配列表中の配列番号 90のうちヌクレオチド番号 3845から 5849までの領域、 で十分であった （以下 の実施例 3参照）。
図 14は PRE8424のマップを示す。 図 14中には主な制限酵素認識部位が示さ れていて、 6つの 0RFが矢印で示されている。 DS0と SS0の位置が四角で示され ている。
図 1 5は pRE8424、 pAPl、 pBLK pJVK pIJlOK pSN22の Repタンパク質の 5力 所の保存された領域 (Motif IV、 Motif I、 Motif II、 Motif III、 C- terminal motif ；
Billington et al., J. Bacteriol. 1803233-3236 [1998]参照） のアミノ酸配列 を示す。 数字は各領域間に存在するアミノ酸残基の数、 即ちギャップのアミノ酸 残基の数を示す。 完全に保存されたアミノ酸残基は星 （*)、 高度に保存された領 域は ·2つの点 ）、 比較的保存された領域は 1つの点 （.） で示した。 Repタンパ ク質の機能に重要とされるチロシン残基は四角で囲ってある。 図 1 6は pRE8424、 pAPL pBLL pJVK pI J lO L pSN22の DSOと考えられる配列 のうち、特に保存された DNA部分を示す。更に DS0の機能に特に重要な GGジヌク レオチドは下線を引いてある (Bi l l ington et al. , J. Bacteriol. 7^ 3233-3236 [1998]参照）。
図 1 7は pRE8424の SS0、 即ち配列表中の配列番号 9 0のうちヌクレオチド番 号 5268から 5538の配列と、 その取りうる二次構造を示した。 二次構造の予測は mfold program, vers ion 3. 0 (Michael Zuker, Washington Univers i ty, St. Loui s, Mo.； ht tp ://w w. bioinfo. rpi. edu/appl icat ions/mfold/old/dna/forml. cgi) に よって行った。 上述の TAGCGG配列を黒丸で示した。
〔実施例 3〕
PHN37 の構築
PRE8424 の自律複製に必須な 2. 0 k の領域には、 不必要な制限酵素認識部位 BaMlが存在していたので、 これを除去する作業を以下のように行った。
PRE8424をテンプレートとし、配列表中の配列番号 5 7 (sHN389)、 5 8 (sHN390) に記載の合成オリゴデォキシリポヌクレオチドプライマー （以下プライマーと略 記） を用いて、 PCRによる DNAの増幅を行った。 得られた 1. 0 kbの断片は ? の 5'末端側の一部を含む。 この断片の 5'末端をリン酸化し、 pBluescript I I SK (+)
(STRATAGENE社製） の cl l部位に導入し、 できたプラスミドに pHN371と名前 を付けた。 PRE8424をテンプレートとし、 配列表中の配列番号 5 9 (sHN391)、 6 0 (sHN321) に記載のプライマーを用いて、 PCRによる DNAの増幅を行った。 得 られた 1. 0 kbの断片は ? の 3'末端側の一部を含む。 この断片を a Hで消化 した後、 5'末端をリン酸化し、 PHN371の / §711部位に導入した。 できた プラスミドに PHN372 と名前を付けた。 PHN372は、 pRE8424の自律複製に必須な 2. 0 k の領域を持ち、かつ、 PRE8424には存在した Ban i部位は除去されている。 また、 3ΛΙ部位の除去は、 PRE8424の自律複製の機能には影響しなかった。
〔実施例 4〕
PHN346の構築'
Rhodococcus属細菌の形質転換体選択マーカーとして、 参考例に示すベクター の構築においてはテトラサイクリン耐性遺伝子のみ開発していたが、 複数のブラ スミドで形質転換するためには、 別の抗生物質に対する耐性遺伝子を新規に開発 する必要がある。 本発明者は、 R.
Figure imgf000041_0001
DSM 313 *がクロラムフエニコ ールに対して耐性をであることを見いだし、 耐性を付与している遺伝子を分離す ることとした。 Rhodococcus属細菌からは、 すでに 2つのクロラムフエ二コール 耐性遺伝子が分離されており (cisrA遺伝子、 ならびに cz/r遺伝子）、 これらの遺 伝子は互いに高い相同性を有している （De Mot et al. , Microbiology 143 3137-3147 [1997]、 Desomer et al.， Mol. Microbiol. 62377-2385 [1992] )0
R. erythropolis DSM 313 株のクロラムフエニコ一ル耐性遺伝子もこれらに相 同であることが予想されたので、 R erythropolis DSM 313株ゲノム DNAをテン プレート^:し、 配列表中の配列番号 6 1 (SHN335), 62 (sHN336) に記載のブラ イマ一を用いて、 PCRによる DNAの増幅を行った。 なお、 該プライマーは csrl遺 伝子と 遺伝子において最も相同性が高かった配列をもとにデザインした。 そ の結果、 0.7 kbの増幅されたバンドが確認された。 この PCR産物の DNA配列を決 定したところ、 C r 遺伝子に極めて高い相同性を有していた。 決定された配列を 元に、 配列表中の配列番号 63 (sHN349)、 64 (sHN351) に記載のプライマーを 設計し、 インバース PCR.(Ochman et al., Genetics 120621-623 [1988] ) にて R erythropolis DSM 313株のクロラムフエニコ一ル耐性遺伝子の全長を分離した。 テンプレートとして用いた DNAは i?.
Figure imgf000041_0002
DSMSlS株のゲノム DNA0.1 n gを 5a/Iで切断し、 リガーゼにより自己閉環化したものである。 得られた PCR産 物は 2.3 kbで、 この断片の全 DNA配列を決定した。 この断片中には 1つの 0RF が存在し、 この遺伝子に ^/ τίと名前を付けた （図中では Chlrと表記）。
R. erythropolis DSM 313株ゲノム DNAをテンプレートとし、 配列表中の配列 番号 6 5 (sHN361)、 66 (sHN362) に記載のプライマーを用いて、 PCRによる DNA の増幅を行った。 得られた 0.5 kb の断片はクロラムフエ二コール耐性遺伝子の
5'末端部分を含む。 この断片を で消化し、 その 5'末端をリン酸化した。 一 方、 R. erythropolis DSM 313株ゲノム DNAをテンプレートとし、 配列表中の配 列番号 67 (SHN363), 68 (sHN364) に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる
DNAの増幅を行った。 得られた 1.3kbの断片はクロラムフエ二コール耐性遺伝子 の 3'末端部分を含む。 この断片を で消化し、 その 5'末端をリン酸化した。 これら 2つの DNA断片を同時に pB luescr ip t I I SK (+)の Sacl I el部位に導 入し、 できたプラスミドに PHN346 と名前を付けた。 pHN346は全長のクロラムフ ェニコール耐性遺伝子を含むが、 該 0RF中にもともと存在していた coRl部位が 除かれている （ただし、 コードするタンパク質のアミノ酸配列は変化しない）。 〔実施例 5〕
Pro l ine iiinopept idase (PIP) をレポーター遺伝子として有する誘導型発現 ベクタ一の構築； pHN171、 PHN379, pHN348、 pHN380の構築
PHN346 (実施例 4 ) から 1. 8 kbのクロラムフエ二コール耐性遺伝子を含む断片 を Xba\と dで切り出し、 pHN154 (特願 2002-235008)の 部位に導入した。 この結果できたプラスミドに PHN347と名前を付けた。 ρΗΝΠ Ι (参考例を参照） か ら 1. 1 kbの断片を と 5pdで切り出し、 PHN347の BsrGl I Spel部位に導 入した。 出来たプラスミドに PHN348と名前を付けた。
PHN171も PHN348も pTipベクター（参考例を参照）の MCSにレポ一夕一遺伝子、 PIPが導入された発現ベクターであるが、 PHN171がテトラサイクリン耐性遺伝子 を形質転換マーカ一として持つのに対して、 PHN348がクロラムフエ二コール耐性 遺伝子を持っていることのみが異なる。 また、いずれのブラ ミドも ΠρΑ遺伝子 プロモータ一の下流に元来存在していたリボソーム結合部位配列 （TipA- RBS) は 翻訳効率の良い、 パクテリオファージ gene 10由来のリボソーム結合部位配列に 変更されている （
Figure imgf000042_0001
プロモーター；参考例を参照）。 PIPの Cの末端側に は、タンパク質の精製を容易にするために 6 XHi sタグが付くように設計されてい る。 6 XHi sタグは、 6つの連続したヒスチジン残基から成る連続配列で、 これを 融合したタンパク質は、 ニッケルイオン等に高い親和性を示すようになる。 従つ て、 ニッケルイオン等を用いた金属キレートクロマトグラフィーで精製が容易に なる (Crowe e t al. , Me thods Mo l. B io l. 31 371-387 [1994] )。
上述の PHN171と pHN348の DNA配列のうち、 pRE に由来するプラスミドの 自律複製に必須な 1. 9 kbの領域を、 PRE8424に由来するプラスミドの自律複製に 必須な 2. 0 kbの領域に変更するために以下の作業を行った。
PHN171をテンプレートとし、配列表中の配列番号 6 9 (sHN368)、 7 0 (sHN373) に記載のプライマ一を用いて、 PCRによる DNAの増幅を行った。 得られた 0. 2 kb の断片はチォストレプトン耐性遺伝子（ r遺伝子；図中では Thiorと表記）（B ibb e t al. , Mo l. Gen. Genet. 199 26-36 [1985] ) の 5'末端部分を含む。 この断片を BsrQlと CMで消化し、 ρΗΝΠ Ιと ρΗΝ348の / GI I CM部位にそれぞれ導入し た。 この結果出来たプラスミドにそれぞれ PHN357 と PHN358 と名前を付けた。 PHN372 (実施例 3 ) から 2. 0 kbの PRE8424に申来するプラスミドの自律複製に必 須な領域を含む断片を ^ Iと ffpalで切り出し、 pHN357と pHN358の Bsi / Hpal 部位にそれぞれ導入した。 この結果できたプラスミドに pHN379、 PHN380とそれぞ れ名前を付けた。
〔実施例 6〕
pTipベクタ一の構築
PHN17 K pHN348、 pHN379、 pHN380 (実施例 5 ) の PIP 遺伝子の代わりに、 MCS を導入し、 8種類の pTipベクターを構築した過程を示す。 なお、 今回作成した、 pTipベクターのうち、 4つ (pTip-RT K pTip- RT2、 pT ip-RC K pTip- RC2；後述) は、 参考例 1に記載の pTipベクターとは、 ^oi ococc^属細菌でプラスミドが自 律複製するのに必要な DNA領域が異なり、参考例 1に記載の pTipべクター全てと i^oi/ococciw属細菌内での不和合性を起こさない （後述）。 また、 残りの 4つ (pTip-QTL pTip- QT2、 pTip-QC l, pTip- QC2；後述） は、 参考例 1に記載の pT ip ベクターとは MCSの配列が一部異なっている。
配列表中の配列番号 7 1、 7 2に記載の合成オリゴデォキシリポヌクレオチド は MCS部位になる配列を含み、 お互いに相補的な配列を持つ。 これら 2つを等モ ル量ずつ混合し、 70 °Cで 10分処理し、 20分かけて室温に冷却し、 2.本鎖化させ た （MCS type l)。 その結果、 その末端は cdと &dで二重消化されたベクター と連結可能な状態になり、 この 2本鎖化した合成 DNAを pHN379、 pHN380の Nco\ I
Sjod部位にそれぞれサブクローンした。 その結果できたプラスミドに pT ip- RT 1、 pTip-RC lとそれぞれ名前をつけた。 配列表中の配列番号 7 3、 7 4に記載の合成 オリゴデォキシリポヌクレオチドを同様に 2本鎖化させ （MCS type 2)、 一方、 pT ip-LNH2 (参考例 1を参照）から 0. 2 kbの /W遺伝子プロモータ一と LG10- RBS を含む断片を Bsii と N で切り出した。これら 2つの DNA断片を同時に、 PHN379 と PHN380の rGI I I部位にそれぞれ導入した。 この結果できたプラスミド に pTip- RT2、 pTip-RC と名前を付けた。 pTip- RT1から 0· 3 kbの ΠρΑ遺伝子プ 口モータ一、 LG10_RBS、MCS type 1を含む断片を ^ Iと Suelで切り出し、 pHN171 と PHN348の β I Spel部位にそれぞれ導入した。 この結果できたプラスミド に pTip_QTl、 pTip-QClと名前を付けた。 pTip- RT2から 0.3 kbの 7j ^遺伝子プ 口モーター、 LG10- RBS、MCS type 2を含む断片を JIと & で切り出し、 ρΗΝΠΙ と ΡΗΝ348の / / Spel部位にそれぞれ導入した。 この結果できたプラスミド に pTip-QT2、 pTip- QC2と名前を付けた。
図 1 8-1に pTipベクター（pTip- QTl、pTip - QT2、pTipRTl、pTip - RT2、pTip - QC1、 pTip- QC2、 pTip-RCK pTip-RC2) のマップを示す。 該図中、 Thior はチォストレ プトン耐性遺伝子を、 Tuflpは Tufl遺伝子プロモーターを、 T^trはテトラサイク リン耐性遺伝子を、 Chlrはクロラムフエ二コール耐性遺伝子を （各 pTip-ベクタ 一は Tuilp- Tetrまたは Chlrいずれか一つを持つ）、 ALDH は TJ'PA遺伝子 (TipA) を転写せしめる TJwAプ iモーターを、 Amprはアンピシリン耐性遺伝子を、 ColEl は大腸菌の複製起点を、 ALDHt は ¾ 遺伝子転写終結配列を、 MCSはマルチクロ —ニング部位を （各 pTip-ベクターは MCS typelまたは MCS type 2のいずれか一 つを持つ）、 TipApは ' 遺伝子プロモ一夕一を、 TipA- LGlOpは Z6 プロ モーターを、 は PRE2895由来のプラスミドの ?. eir^ropo 内での自律 複製に必須な領域を、 Repは PRE8424由来のプラスミドの R. erythropolis内で の自律複製に必須な領域を（各 pTip-ベクタ一は ^または i?e のいずれか一 つを持つ） 示す。 なお、 実施例 9に書かれた pNitベクタ一 （後述） の図が該図、 右半分に記してあり、 記号などは上記のものと同じである。
図 20は、 TipA-LGlOプ X2モータ MCS - 7¾ 遺伝子ターミネータ一の DNA 配列を示す。 該図中、 実線の矢印は 7j ^遺伝子プロモーター中に存在する Inverted repeat配列を示す。 斜線の矢印は J¾ 遺伝子転写終結配列に存在する Inverted repeat 配列を示す。 また、 原核生物のプロモーター領域に一般的に存 在し、 遺伝子の転写に重要な- 10領域、 -35領域は四角で囲んである。 また、 四角 で囲まれた TATAAT配列は
Figure imgf000044_0001
遺伝子プロモータ一から プロモーターを作成 したときに導入した変異を示す （実施例 7に詳述）。
〔実施例 7〕 PHN231の構築
まず本発明者は、 7"7 4遺伝子プロモーターに変異を導入して、 誘導型から構成 型プロモーターに改変することとした。 TipA 遺伝子プロモーター配列中の inverted repeat」領域にチォストレプトン - TipAタンパク質複合体が結合し、 自らの遺伝子の転写を促進することは以前から知られていた （Holmes et al. ,
EMBOJ. 7^3183-3191 [1993] )。そこで、本発明者は該 DNA領域に、 inverted repeat 構造を破壊する変異を導入したら、 遺伝子プロモーターの転写活性に何らか の変化が現れるのではないかと考え、様々な 77 W遺伝子プロモーター変異体を作 成した。 それらのうち、 ： Ti¾4遺伝子プロモーターの所謂- 10 領域 （Fenton and
Gralla. Rroc. Natl. Acad. Sci. USA 989020-9025 [2001]) に変異を導入した もの （図 1 9 ； CAGCGTから TATAATへの変異） では、 チォストレプトン非存在下 でも、レポーター遺伝子の発現が観察された（図 2 0；実施例 1 0に詳述）。なお、 この TATAATからなる DNA配列は、大腸菌において非常に強力なプロモーターとし て機能する DNA配列中の - 10領域によく見られる配列である。 以上のことからこ の変異 遺伝子プロモータ一は構成型プロモ一夕一であると結論された。また、 この構成型プロモーターに Ύ (Non- Inducible 図中では '^と表記） プ 口モーターと名前を付けた。 プロモーターを構築した過程を以下に示す。. HN150u (参考例 1を参照） を テンプレートとし、 配列表中の配列番号 7 5 (sHN217)、 7 6 (sHN218) に記載の プライマーを用いてィンバース PCRにて DNAの増幅を行った。なお、 PHN150Uは、 p Bluescript II SK (+) の MCSに、 野生型 J7¾4遺伝子プロモーターがクローン 化されたプラスミドで、 また上記 2つのプライマ一はその 5'末端がそれぞれリン 酸化されている。 このィンバ一ス PCR断片をリガーゼ反応により自己閉環化し、 結果出来たプラスミドに PHN231と名前を付けた。 PHN231は プロモーターが p Bluescript II SK (+) の MCSにクローン化された形になっている。
〔実施例 8〕
PIP をレポ一夕一遺伝子として有する構成型発現ベクターの構築； pHN407、
PHN38-5, PHN409, pHN389の構築
pTip-NHl (参考例 1を参照） をテンプレートとし、 配列表中の配列番号 7 7 (SHN395) , 7 8 (sHN396) に記載のプライマーを用いて、 PCRによる DNAの増幅 を行った。 得られた 1. 6 kbの断片はテトラサイクリン耐性遺伝子を含む。 この断 片を Hpalと Kpnlで消化し、 ρΗΝ379 (実施例 5 ) の Hpal I Kpnl部位に導入した。 この結果出来たプラスミドに ρΗΝ381と名前を付けた。 ΡΗΝ346 (実施例 4 ) をテン プレートとし、 配列表中の配列番号 7 9 (sHN397)、 8 0 (sHN398) に記載のブラ イマ一を用いて、 PCRによる DNAの増幅を行った。 得られた 1. 8 kbの断片はクロ ラムフエ二コール耐性遺伝子を含む。 この断片を alと ； M7Iで消化し、 PHN380
(実施例 5 ) の Ilpal I Ai 部位に導入した。 この結果出来たプラスミドにそれ 'ぞれ PHN382と名前を付けた。 PHN231 (実施例 7 ) から 0. 2 kbの ^ プロモータ —を含む断片を β と Nco\で切り出し、 PHN381と pHN382の B / Ncol部 位にそれぞれ導入した。 この結果できたプラスミドに pHN383、 pHN387とそれぞれ 名前を付けた。 PHN231 (実施例 7 ) をテンプレートとし、 配列表中の配列番号 8 1 (sHN147)、 8 2 (sHN376) に記載のプライマーを用いて、 PCRによる DNAの増 幅を行った。
得られた 0. 2 kbの断片は /プロモーターのうち RBS部分は含んでいない。 この 断片を ·5/€Ιと Xbalで消化し、 PHN381と pHN382の
Figure imgf000046_0001
I Xbal部位にそれぞ れ導入した。 この結果出来たプラスミドに pHN385、 PHN389とそれぞれ名前を付け た。 また、 の Ni tプロモーター （RBS部分除く） - LG10RBSのハイプリッド DNA を Ni t - LG10プ Uモーターとする。 PHN171 をテンプレートとし、 配列表中の配列 番号 8 3 (sHN388)、 8 4 (sHN120) に記載のプライマーを用いて、 PCRによる MA の増幅を行った。得られた 1. 9 kbの断片は PRE2895由来の i? 15オペロンを含む。 この断片を BsiHiと Hpalで消化し、 PHN387と pHN389の BsrGl I Hpal部位にそ れぞれ導入した。 この結果出来たプラスミドに pHN407、 pHN409とそれぞれ名前を 付けた。
またコントロール実験用プラスミドとして、 pHN387から、 0. 2 kbの プロモ —ターを jBsii と Ncolで切り出した。この DNA断片を pHN380 (実施例 5 )の
I d部位に導入した。 この結果できたプラスミドに PHN410と名前を付けた。 〔実施例 9〕
pNi tベクターの構築 pHN407、 PHN385, pHN409、 pHN389 (実施例 8 ) の PIP 遺伝子の代わりに、 MCS を導入し、 8種類の pNitベクタ一を構築した過程を示す。
Tip-RTl (実施例 6 ) から 2.2 kbの断片を Ncolと Kpnlで切り出し、 ρΗΝ407、 ΡΗΝ385, ρΗΝ409、 ρΗΝ389の^ ol / τζΐ部位にそれぞれ導入した。 この結果でき たプラスミドに pNit- QT1、 pNit-RTL pNit-QCK pNit-RClとそれぞれ名前を付け た。 PHN385 (実施例 8)をテンプレートとし、配列表中の配列番号 8 1 (sHN147)、 8 5 (SHN160) に記載のプライマーを用いて、 PCRによる DNAの増幅を行った。 得られた 0.2 kbの断片は プロモーターを含む。この断片を ^rGIと N(M で消化した。 一方、 pTip- RT2 (実施例 6) から、 2.0 kbの MCS type 2、 アンピシ リン耐性遺伝子、 （¾ Ε1を含む断片を Ndelと K で切り出した。上記 2つの DNA 断片を同時に、 pHN407、 PHN385, pHN409、 pHN389 (実施例 8 ) の i¾I / Kpnl 部位にそれぞれ導入した。 この結果できたプラスミドに pNit- QT2、 pNit- RT2、 pNit - QC2、 pNit-RC2とそれぞれ名前を付けた。
図 1 8 - 2に Nitベクター（pNit- QTl、pNit - QT2、pNit - RTLpNit - RT2、pNit- QC1、 pNit- QC2、 pNit-RCL pNit-RC2) のマップを示す。 略号等は実施例 6に記された 通りである。
〔実施例 1 0〕
遺伝子プロモーター、 / プロモータ一からの の発現 pHN380、pHN410、 PHN38L PHN387, pHN389を用いて、 pTip、 pNitベクター群からの遺伝子発現様式 を観察した。 以下に、 その過程と結果を示す。
まず、 R.
Figure imgf000047_0001
株を pHN380、 pHN410、 pHN38L pHN387、 pHN389 で、 形質転換した。 これら形質転換体を用いて PIPのべプチダーゼ活性を測定し た。 結果を図 20に示す。
図 20中、 形質転換に用いたプラスミドの名前とそれぞれの簡単な特徴が示し てあり、 黒いバーはチォストレプトンで該形質転換体を処理したとき、 網掛けの バーはチォストレブトンで該形質転換体を処理しなかったときの PIPのべプチダ ーゼ活性を示す。 PHN380 TipA-LGlOプ Uモータ— - からなる遺伝子カセッ トを pTipベクターの骨格に持つ）での形質転換体はチォストレプトンによる遺伝 子発現制御が働いているが、 PHN410 (Nitプ uモータ—— からなる遺伝子力 セットを pTipベクタ一の骨格中に持つ）での形質転換体はチォストレフ。トンによ る遺伝子発現制御が働いていない。 また、 PHN387は PHN410からチォストレブト ン耐性遺伝子と、 ：¾ 遺伝子プロモーター - 7^4遺伝子からなる遺伝子カセッ トを取り除いた形のプラスミドであるが、 このプラスミドでの形質転換体もチォ ストレプトンがなくても、 PIPが発現してい 。 つまり、 TipAタンパク質がなく ても、 プロモーターからの遺伝子発現がおこることを意味する。 pHN387、 PHN389による形質転換体を用いた結果から、 RBSの配列はチォストレプトンによ る遺伝子発現制御には関係ないことが示唆された。 PHN381は PHN389の Ni t - LG10 プロモータ一を プロモ一夕一に置換したものであるが、 pHN381での形 質転換体 は PIPの発現は構成的になっていない。 以上のことから、 Ni tプ Uモ 一ター、 プロモーターが構成型のプロモーターで、 その発現に T ipA夕 ンパク質を必要としないことがわかる。
なお、 pTip、 pNi tベクターからの PIPの発現は 30 °Cばかりでなく、 4 °Cでも 可能であったことを確認した。
〔実施例 1 1〕
PRE PRE8424由来プラスミドの自律複製に必須な領域の比較
pTipベクターと pNi tベクタ一群を用いて、 pRE 5、 pRE8424由来プラスミド の自律複製に必須な領域の特徴を調べた。
まず、 pNi t- QC2と pNi t- RC2の . eryt ropol is KU i, R. fascians Kmmi, R. opacus DSM44193, R. ruber JCM3205 および R. rhodochrous JCM3202 に 対する形質転換効率を調べた。 結果を表 3に示す。 表 3では各 1 のプラスミ ド DNAを用いて形質転換した時に、 クロラムフエ二コールを含む固体培地上に出 現したコロニー数を示す。 この結果から、 R. erythropolis i R. fascians JCM10002, R. aci^ DSM44193では、効率の差はあるものの、 pNi t- QC2と pNi t- RC2、 いずれでも形質転換が可能であることがわかった。 なお、 R. ruber JCM3205, R. rhodochrous JCM3202では形質転換体は得られなかった。
次に PHN409と PHN389 (実施例 9 ) で R. erythropolis JCM 320 K R. fascians
JCM1(W02、 R. aczw DSM44193を形質転換した。 なお、 pHN409と pHN389の違い は自律複製に必須な領域が PRE ^に由来するか PRE8424に由来するか、 だけで ある。 R. erythropolisKi iにおいて、 PHN409で形質転換した細胞と、 pHN389 で形質転換した細胞とで、 PIP ぺプチダーゼ活性を比較したところ、 ほとんど差 がないか、 若干 PHN409 で形質転換した細胞の方が高かった。 この結果は、 R. fascians JCM10002, R. opacus DSM44193 を宿主とした場合でもほぼ同様であつ た。また、 R. erythropolisKimiでの PIPぺプチダーゼ活性よりも i?. fascians JCM10002, R. DSM44193での PIPぺプチダーゼ活性の方がいずれのプラス ミドを用いた場合でも低かった。
次に pNit- QC2と pNit- RC2の R. erythropolis J CM 3201細胞内でのプラスミド コピー数を調べた。実験手法は Projanらの方法（Projanet al.， Plasiid 182-190 [1983] ) に従った。 この方法でプラスミ ドコピー数を計算するためには R. erythropolis J CM 3201のゲノムサイズを知る必要があるが、 van der Geizeらに よれば、 R. er roiw s ATCC4277株から派生した株、 R ery^nw? RG1株 のゲノムサイズが 6 メガべ一スペア一 （Mbp) であり、 かつ、 R. erythropolis ATCC4277株と R. erythropolis J CM 3201株がほぼ同等の菌株であることから、 R. erythropolis J CM 3201株のゲノムサイズも 6 Mb として計算した。 結果は、 pNit- QC2が、 47 士 5、 pNit- RC2が、 64 士 5のコピー数であった。
〔実施例 1 2〕
プラスミド不和合性
細菌では一般に、 同一の複製起点を持つ異種プラスミドは細胞内に共存できな いことが多い。 これはプラスミド不和合性 （plasmid inco即 atibility) と呼ばれ る現象によるもので (Novick, Microbiol. Rev. 57381-395 [1987])、 Rhodococcus 属細菌と近縁の 属でも報告されている （Stolt and Stoker, Microbiology 142 2795-2802 [1996])。 本発明者は、 配列の異なる 2つの R. erW rojw/ 内在性プラスミドを分離したことから （PRE2895と pRE8424)、 複数 のプラスミドを単一細胞内に共存させ、 組換えタンパク質生産に利用できると考 えた。 そこで、 まず、 pTip -、 pNit -ベクター群のプラスミド不和合性について調 ベた。
R. erW ro / ； ICM 3201に対して、 pNit- QC2または pNit- RC2で第一の形質 転換を行い、さらに、これらの形質転換体細胞に対して pNit - QT2または pNit_RT2 で第二の形質転換を行った。 第二の形質転換後は、 テトラサイクリンのみを含む
LB固体培地で形質転換体を選択した。 結果を表 4に示す。表 4中、 右から二番目 のカラムは、 各 1 gのプラスミド DNAを用いて第二の形質転換した時に、 テ卜 ラサイクリンを含む固体培地上に出現したコロニー数を示す。一番右のカラムは、 第二の形質転換後に、 第一の形質転換に用いたプラスミドが残っていたコロニー の確率（％；)、 即ち、 第二の形質転換後にテトラサイクリン耐性だったコロニーの 出現率を示す。 その際、 調べたコロニー数は各 20コロニー = 20) である。 表 4に示されたように、 同じ複製起点を持つ 2つのプラスミドを用いた場合、 第二 の形質転換効率が極端に低下したこと、 第二の形質転換後に第一の形質転換ブラ スミドが高頻度に消失していることから、 不和合性を引き起こしたといえる。 そ れに対して、 別種の複製起点を持つ 2つのプラスミドでは、 第二の形質転換効率 が低下しなかったこと、 第二の形質転換後にも第一の形質転換プラスミドが安定 に存在していることから不和合性を起こさなかったことが示唆された。 つまり、 pRE^^5から派生したプラスミドと、 PRE8424 から派生したプラスミドは完全に
「compat ibl e」 であると える。
〔実施例 1 3〕
組換えタンパク質の単一細胞内での共発現
実施例 1 2に書かれたように pRE2 ^から派生したプラスミドと、 PRE8424か ら派生したプラスミドは完全に compat ibl eで、一つの R. ery ro o/ 細胞内に 共存可能であった。 このことを利用して、 PIPと GFPの単一細胞内での共発現を 試みた。
まず、 PHN187 (参考例 1を参照） をテンプレートとし、 配列表中の配列番号 8
6 (sHN337)、 8 7 (sHN338) に記載のプライマーを用いて、 PCRによる DNAの増 幅を行った。 得られた 0. 2 kbの断片は GFP遺伝子の 5'末端側を含む。 この断片 を colで消化し、 この断片の 5'末端をリン酸化した。 一方、 PHN187をテンプレ ートとし、 配列表中の配列番号 8 8 (sHN339)、 8 9 (sHN340) に記載のプライマ
—を用いて、 PCRによる DNAの増幅を行った。 得られた 0. 5 kbの断片は GFP遺伝 子の 3'末端側を含む。 この断片を g71 Iで消化し、 その 5'末端をリン酸化した。 これら 2つの DNA断片を同時に pNi t-QTlと pNi t- RT1の NcoW Bgll 部位にそれ ぞれ導入し、できたプラスミドにそれぞれ pHN425、pHN426と名前を付けた。 pHN425、 PHN426は全長の 6^ 遺伝子含み、 GFPの C末端側に 6 XHisタグが付加されるよう な配列が融合されている。 また、 遺伝子内部に存在していた d部位は上記 作業中に除かれているが、 GFPの機能に変化はない。
PHN425と PHN389で、 R. ery r<w?/ JCM3201を共形質転換し、 形質転換体を テトラサイクリンとクロラムフエ二コール両方を含む培地で選択した。 また、 PHN426と PHN409で、 R. e y^ro ^ JCM3201を形質転換し、 共形質転換体をテ トラサイクリンとクロラムフエ二コール両方を含む培地で選択した。 また、 対照 実験として、 HN425, PHN426, p願 89、 PHN409で i?. 6び JCM3201をそ れぞれ形質転換した。 これら 6種類の形質転換体を実施例 1に記載されたように して PIPと GFPを発現させ、 ニッケルイオンを用いた金属キレートクロマトダラ フィ一で精製した。 組換えタンパク質の精製、 精製前並びに精製後のサンプルの SDSポリアクリルアミド電気泳動は以下の方法で行った。 PIPの C末端には 6 XHi s タグがついており、 Ni- NTA Superilow (Qiagen社製） を用いて、 その使用説明書 に準じて精製を行った。
以下に具体的な精製法を示すが、 精製の作業は 4 でで行った。 タンパク質を発 現させた菌体 （20 ml培養液分） を回収し、 1 mlの NT- Buf fer (50 mM Tris- HC1
( H 8. 0) , 100 mM塩化ナトリウム、 1 mMジチオスレイト一ル） に懸濁し、 1 gの ガラスビーズ（直径 0. 105-0. 125ミリメートル）を加えた。これを Fas t- prep FP120
(SAVANT社製） にて 6 m/秒の速度、 20秒間往復振とう運動させることで、 細胞 を破壊した。 20， OOO X gにて遠心し、 その上清 700 z lに、 予め NT- Buf ferで平 衡化された Ni- NTA Superf lowをベッド体積 40 1になるように加えた。 これを
1時間回転撹拌しながら Ni- NTA Superf lowビーズと 6 XHisタグのついたタンパ ク質とを結合させた。 このビーズを NT- Buf fer で 4回洗浄した後、 120 l の
NTE- Buf fer (50 mM Tris-HCl (pH 7. 0) , 100 mM塩化ナトリウム、 1 mMジチォ スレイトール、 400 mMイミダゾ一ル） に 3回懸濁することで、 ビーズから 6 XHis タグのついたタンパク質を溶出させた。上記サンプルのうち 10 n iを常法に従い、
12% SDSポリアクリルアミド電気泳動に供した。 SDSポリアクリルアミド電気泳動 結果後、 ゲルをクマシ一ブリリアントグリーン G- 250で染色した結果を図 2 1に 示した。
図 2 1中、 奇数番号のレーンは細胞の粗抽出液 （即ち、 精製前のサンプル）、 偶 数番号のレーンは金属キレートクロマトグラフィーで精製した後のサンプルを示 す。 また、 レ一ン 1， 2は PHN425 と PHN389で共形質転換した R. erythropolis JCM3201からのサンプル、 レーン 3， 4は PHN426と PHN409で共形質転換した細胞 からのサンプル、 レーン 5， 6は PHN425で形質転換した細胞からのサンプル、 レ ーン 7, 8は pHN426で形質転換した細胞からのサンプル、 レーン 9， 10は pHN389 で形質転換した細胞からのサンプル、 レーン 1 1, 12は pHN409で形質転換した細 '胞からのサンプルである。
図 2 1のレーン 2と 4に 2本のバンドが見られることから、 PIP、 GFPが、 単一 の細胞内で共発現され、精製されたことが示された。また、共発現させたとき（レ ーン 2、 4) と、 それぞれ単独で発現させたとき （レーン 6、 8、 10、 12) の PIP、 GFPの発現量に大きな差異は見られなかった。
表 1に実施例で用いた各プラスミドのリストを、 表 2に実施例で用いた菌株の リストを、表 3に pNU- QC2と pNi t- RC2の R. erythropolis JGM 3201, R. fascians JCM10002, R. opacus DSM44193 に対する形質転換効率を、 表 4に pNi t- QC2、 pNi t-RC2, pNi t-QT2、 pNi t-RT2による R. erythropol is J CM 3201への共形質転 換の結果を示す。
表 1 本発明に用いた主なプラスミド 分類 プラスミド名 備考 ソース
Cryptic plasmids of pRE2895 Source of RepAB (cryptic plasmid isolated from R. erythropolis
JCM2895) 特願 2002-235008 R. erythropolis pRE8424 · Source of Rep (cryptic plasmid isolated from R erythropolis
DS 8424) This study
PRE2893 Cryptic plasmid isolated from R. erythropolis JCM2893 This study PRE2894 Cryptic plasmid isolated from R. erythropolis JC 2894 This study PRE43200 Cryptic plasmid isolated from R. erythropolis DSM43200 This study
For identification pHN267 Kanr on pGEM 3Zf (+) This study of DSO and SSO pHN317 Rep, DSO, IR I, IR II (SSO) on pHN267 This study of pRE8424 pH隨 5 Rep, DSO, mutated IR I， IR II (SSO) on pHN267 This study
pHN362 Rep, DSO, IR I， mutated IR II on pHN267 This study pHN363 Rep, DSO, mutated IR I, mutated IR II on pHN267 This study pHN322 Rep, DSO, IR I, IR II (SSO) on pHN267 This study pHN343 Rep, DSO, IR II (SSO) on pHN267 This study pHN344 Rep, DSO, IR I， IR II (SSO) on pHN267 This study pHN324 Rep, IR I， IR II (SSO) on pHN267 This study
Source of Rep pHN372 2.0-kb region originating from pRE8424 on pBluescript SK (+), This study region for pTip- Bam l site is eliminated
and pNit- vectors pTip-vectors pTip-QT1 Tef, RepAB (pRE2895), MCS type 1 This study
PTipAf
pTip-QT2 Tef, RepAB (pRE2895)， MCS type 2 This study
PTipA'
pTip-RT1 Tef, Rep (pRE8424)， MCS type 1 This study
PTipA'
pTip-RT2 Tef, Rep (pRE8424), MCS type 2 This study
PTipA，
pTip-QC1 Chlr， RepAB (pRE2895), MCS type 1 This study
PTipA'
pTip-QC2 Chlr, RepAB (pRE2895), MCS type 2 This study
PTipA' pTip-RC1 PTjpA, Chlr， Rep (pRE8424), MCS type 1 This study pTip-RC2 PTipA, Chlr, Rep (pRE8424), MCS type 2 This study pNit-vectors pNit-QT1 P Tef, RepAB (pRE2895), MCS type 1 This study pNit -QT2 PNjt Tef, RepAB (pRE2895), MCS type 2 This study pNit -RT1 PNjt Tef, Rep (pRE8424)， MCS type 1 This study pNit -RT2 PNjt Tef, Rep (pRE8424), MCS type 2 This study pNit-QC1 PNW- Chf, RepAB (pRE2895), MCS type 1 This study pNit-QC2 PNj Chf , RepAB (pRE2895), MCS type 2 This study pNit-RC1 PNjt Chf t Rep (pRE8424), MCS type 1 This study pNit-RC2 PNj Chf, Rep (pRE8424), MCS type 2 This study
PIP expression pHN171 6xHis-PIP in MCS of pTip-LCH1 特願 2002-235008 vectors pHN379 6xHis-PIP in MCS of pTip-RT1 This study
pHN348 6xHis-PIP in MCS of pTip-QC1 This study pHN380 6xHis-PIP in MCS of pTip-RC1 This study pHN407 6xHis-PIP in MCS of pNit-QT1 This study pHN385 6xHis-PIP in MCS of pNit-RT1 This study pHN409 6xHis-PIP in MCS of pNit-QC1 This study pHN389 6xHis-PIP in MCS of pNit-RC1 This study pHN410 PjipA and LG10-RBS of pHN380 were substituted into
P^and wild-type TipA-RBS, respectively This study pHN387 LG10-RBS of pHN389 was substituted into wild-type RBS
of TipA-RBS This study p隨 81 PNl-t of pHN389 was substituted into jjp^ This study
GFP expression pHN425 6xHis-GFP in MCS of pTip-QT1 This study vectors pHN426 6xHis-GFP in MCS of pTip-RT1 This study 表 2
本発明に用いた主な菌株
属、種 菌株 ソース 適用
Rhodococcus erythroplis JCM2895 Japan Collection of Microorganisms Source of pRE2895
Rhodococcus erythroplis DSM8424 German Collection of Microorganisms Source of pRE8424
and Cell Cultures
Rhodococcus erythroplis JCM2893 Japan Collection of Microorganisms Source of pRE2893
Rhodococcus erythroplis JCM2894 Japan Collection of Microorganisms Source of pRE2894
Rhodococcus erythroplis DSM43200 German Collection of Microorganisms Source of pRE43200
and Cell Cultures
Rhodococcus erythroplis JCM3201 Japan Collection of Microorganisms Host strain to express recombinant proteins
Rhodococcus fascians JCM10002 Japan Collection of Microorganisms Host strain to express recombinant proteins
Rhodococcus opacus DSM44193 German Collection of Microorganisms Host strain to express recombinant and Cell Cultures proteins
Rhodococcus ruber JCM3205 Japan Collection of Microorganisms Host strain to express recombinant proteins
Rhodococcus rhodochrous JCM3202 Japan Collection of Microorganisms Host strain to express recombinant
Proteins
Streptomyces coelicolor JC 4979 Japan Collection of Microorganisms Source of dnak
transcription terminator
Escherichia coli DH5a General cloning
Escherichia coli ER2508 New England Biolabs Source of Kanr
表 3
pNit-QC2と pNit-RC2の形質転換効率 宿主細胞 プラスミド Ft. erythropolis R. fasclans R.opacus pNit-QC2 3.8 x 105 8.2 x 102 1 .6 x 104
pNit-RC2 2.8 x 105 4.0 x 102 5.2 x 102
表 4
R.ervthropolis JCM 3201株におけるプラスミド不和合性
第一の形質転 第二の形質転 第二の形質転換 第一の形質転換に用いた 換に用いた 換に用いた の効率 プラスミドが残っていた プラスミド プラスミド コロニーの率 （<¼; n = 20) なし pNit-QT2 3.2 x 105
pNit-QC2 pNit-QT2 2.0 x 10s 50
pNit-RC2 pNit-QT2 1.3 x 105 100 なし pNit-RT2 4.4 x 104
pNit-QC2 pNit-RT2 3.3 x 104 100
pNit-RC2 pNit-RT2 2.4 x 102 65
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性 本発明の新規な口一リングサークル型の複製様式で複製し得るベクターであつ て、 属細菌中で外来遺伝子を 4 °0から 3 5 °Cの温度条件下で誘導 物質により誘導発現しうる発現ベクターおよび外来遺伝子を誘導物質非依存的に 構成的に発現し得るベクターを用いることにより、 効率的に 属細菌 で外来タンパク質を産生させることができ、 特に宿主微生物として低温でも増殖 し得る微生物を用いることにより、 通常の微生物の増殖に適した温度条件、 即ち 約 15°Cを超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパ ク質を発現産生させることが可能である。 さらに、 互いにプラスミド不和合性を 起こさない少なくとも 2種類の ½o ^ 属細菌由来の発現プラスミドベクタ 一であっ^:、 少なくとも ·2種類のプラスミドが、 プラスミドの自律複製に必要な DNA配列として、 それぞれローリングサ一クル型複製様式をもつ DNA 配列と、 pRE^^ 由来のプラスミドの自律複製に必要な DNA配列を有するベクターは不和 合性の問題を起こすことなく、 同一の微生物細胞中で安定に維持され、 それぞれ のベクターが含む外来遺伝子がコードするタンパク質を同一の微生物細胞中で共 発現させることが可能である。 配列表フリ一テキスト
配列 1 〜 4 8 ：プライマー、 リンカ一
配列 4 9 〜 5 6 ：ベクター
配列 5 7 〜 8 9 ：プライマー、 リンカ一
配列 9 0 ：内在性プラスミド PRE8424
配列 9 1 〜 1 0 6 ：ベクター
配列 1 0 7 :改変 TiDA遺伝子プロモーター

Claims

請求の範囲
1 . T 遺伝子プロモーターの- 10領域配列に変異を導入したプロモーター であって、 チォストレプトン非依存的に構成的に下流に存在する遺伝子を発現し 得る変異 遺伝子プロモーターの有する塩基配列からなる DNA。
2 . -10領域配列の変異が、 CAGCGT配列の TATAAT配列への変異である請求項 1記載の DNAo
3 . 配列番号 1 0 7で表される塩基配列を有する、 請求項 2記載の DNA。
4 . 外来遺伝子を構成的に発現するためのプロモーター配列が請求項 1から 3のいずれか 1項に記載の DNAの有する塩基配列であって、 その下流にリポソ一 ム結合部位配列、 更にその下流に、 外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング 部位配列を含む、 属細菌用構成型発現ベクター。
5 . 配列番号 1 0 1に表される塩基配列を有する pNi t- RT1、 配列番号 1 0 2 に表される塩基配列を有する pNi t-RT2、配列番号 1 0 5に表される塩基配列を有 する pNit- RC1、配列番号 1 0 6に表される塩基配列を有する pNi t- RC2、配列番号 9 9に表される塩基配列を有する pNi t- QT1、配列番号 1 0 0に表される塩基配列 を有する pNi t- QT2、配列番号 1 0 3に表される塩基配列を有する pNi t-QCl、配列 番号 1 0 4に表される塩基配列を有する pNi t - QC2、からなる群から選択される請 求項 4記載の lihodococcus属細菌用構成型発現ベクター。
6 . Rhodococcus IH¾^ R. erythropol is、 R. fasciansお^ R opacus からなる群から選択される、 請求項 4または 5に記載の発現べクタ一。
7 . さらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必要な DNA領域を含み、 大腸菌 中で複製可能な請求項 4から 6のいずれか 1項に記載の発現ベクター。
8 . 請求項 4から 7のいずれか 1項に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
9 . 請求項 4から 7のいずれか 1項に記載の発現ベクターを用いて 4 °Cから 3 5 °Cの温度で組換えタンパク質を生産する方法。
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