KR101261845B1 - 유전자 발현을 증대시키는 신규한 핵산분자 및 이를 이용한 단백질 생산방법 - Google Patents

유전자 발현을 증대시키는 신규한 핵산분자 및 이를 이용한 단백질 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 발현을 증대시키는 신규한 stab 핵산분자에 관한 것으로서, 상기 stab 핵산분자는 프로모터와 목적유전자 사이에 포함됨으로써 다운스트림 (downstream) 목적유전자의 발현율을 증대시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)의 cry3Ba 유전자의 업스트림 (upstream)에 존재하는 신규한 stab 핵산분자, 및 상기 핵산분자의 3' 말단에 cry3Ba 구조유전자의 5' 말단의 핵산분자가 연결된 신규한 stab핵산분자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 stab 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주세포, 및 상기 숙주세포로부터 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

유전자 발현을 증대시키는 신규한 핵산분자 및 이를 이용한 단백질 생산방법 {NOVEL NUCLEIC ACIDS FOR ENHANCING GENE EXPRESSIONS AND A METHOD FOR PROTEIN PRODUCTION USING THE SAME}
본 발명은 유전자 발현을 증대시키는 신규한 stab 핵산분자에 관한 것으로서, 상기 stab 핵산분자는 프로모터와 목적유전자 사이에 포함됨으로써 다운스트림 (downstream) 목적유전자의 발현율을 증대시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)의 cry3Ba 유전자의 업스트림 (upstream)에 존재하는 신규한 stab 핵산분자, 및 상기 핵산분자의 3' 말단에cry3Ba 구조유전자의 5' 말단의 핵산분자가 연결된 신규한 stab핵산분자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 stab 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주세포, 및 상기 숙주세포로부터 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
특정 유전자로부터 전사된 mRNA는 단백질 생성 후 세포 내에서 분해가 일어나는데 특정 단백질의 발현 정도는 그를 코딩하는 mRNA의 합성과 분해의 비율에 따라 조절된다. 고등생물의 경우에는 5'에서 3' 방향의 엑소리보뉴클레아제 (exoribonuclease)에 의해 mRNA 분해가 일어나는 반면 (Muhlrad D et al. 1994. Genes Dev. 8: 855-866.), 대장균의 경우 mRNA는 처음에 RNaseE라는 엔도 RNA 분해효소 (endoribonuclease)에 의해 절단된 후 RNase II, RNase R, PNPase 등 3'에서 5' 방향으로 절단해 가는 RNA 분해효소들에 의해 2-5 뉴클레오티드의 작은 조각으로 절단되고 다시 올리고리보뉴클레아제 (oligoribonuclease)에 의해 모노머로 분해된다 (Deutscher MP. 2006. Nucleic Acids Res. 34: 659-666., Ghosh S and Deutscher MP. 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4372-4377).
미생물의 경우 5'에서 3' 방향으로 절단하는 엑소리보뉴클레아제가 발견되지 않았기 때문에 상기 대장균에서 mRNA가 분해되는 기작이 일반적이라고 생각되어져 왔다. 그러나 그람양성 세균인 바실러스 서틸리스의 전체 게놈 염기서열을 대장균과 비교한 결과 바실러스 서틸리스에서는 두가지 필수적인 효소인 RNaseE와 올리고리보뉴클레아제가 발견되지 않았다 (Condon C and Putzer H. 2002. Nucleic Acids Res. 30: 5339-5346.). 이는 대장균과 바실러스 서틸리스의 mRNA 분해기작이 서로 다르다는 것을 의미한다. 최근 바실러스 서틸리스에서 새로운 엑소리보뉴클레아제 RNase J1이 발견되었는데, 이 효소는 5'에서 3' 방향으로 RNA를 절단하며 (Mathy N et al. 2007. Cell 129: 681-692.) 다른 미생물에도 널리 퍼져 있었다 (Even S. 2005. Nucleic Acids Res. 33: 2141-2152.). 따라서 바실러스를 포함한 그람양성 세균에서는 RNase J1에 의한 mRNA 분해가 일반적임을 알 수 있다.
또한, 5’에서 3’방향으로 RNA를 절단하는 엑소리보뉴클레아제의 활성을 가지는 세균으로 아키아 (Archaea) 세균 중 할로박테리알스 (Halobacteriales), 메타노박테리알스(Methanobacteriales), 메타노코칼스 (Methanococcales), 메타노피랄스 (Methanopyrales), 메타노사시날스 (Methanosarcinales), 써머코칼스 (Thermococcales), 나노아캐오타 (Nanoarchaeota) 등이 있으며, 그람양성 세균으로는 악티노박테리아 (Actinobacteria), 피르미쿠트 (Firmicutes) 등이 있으며, 그람음성 세균으로 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 속, 리조비움 (Rhizobium) 속 및 아그로박테리움 (Agrobacterium) 속을 포함하는 알파 프로테오박테리아 (alpha-proteobacteria), 울리넬라 (Wolinella) 속, 헬리코박터 (Helicobacter) 속 및 캄필로박터 (Campylobacter) 속을 포함하는 엡실론프로테오박테리아 (epsilon-proteobacteria) 및 시아노박테리아（Cyanobacteria) 등이 있다(Nucleic Acids Res. 2005. 33: 2141-2152).
바실러스 균주에는 매우 안정한 mRNA들이 존재하는데 이들은 5' 말단에 2차 구조를 가지거나, 특정 단백질이 결합하거나 리보좀이 결합하여 mRNA를 보호하고 있다 (Agaisse H and Lereclus D. 1996. Mol. Microbiol. 20: 633-643., (Bechhofer DH and Dubnau D. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 498-502., Glatz E et al. 1996. Mol. Microbiol. 19: 319-328., Hambraeus G. 2002. Microbiol. 148: 1795-1803.). 이들 5' 말단의 보호는 mRNA가 RNase J1에 의해 분해되는 것을 방해하여 mRNA의 안정화에 도움을 주고 결국 하위 유전자의 발현량을 증대시킨다. 이 중 바실러스 츄린겐시스에서 유래된 cry3Aa 유전자의 경우엔 전사된 mRNA의 구조유전자 상위에 두 개의 SD염기서열 (Shine-Dalgarno sequence)이 있다 (Agaisse H and Lereclus D. 1996. Mol. Microbiol. 20: 633-643.). 이 중 상위의 SD (STAB-SD)에 30S 리보좀이 결합하여 하위의 mRNA가 RNase J1으로부터 분해되는 것을 방해하여 프로모터와 구조 유전자 사이에 전사체를 안정화시키는 동안 하위의 SD 염기서열에 30S와 50S 리보좀이 결합하여 해독이 일어난다. 이는 전사체를 안정화시키는 염기서열인 stab의 존재에 의해서이다(Mathy N et al. 2007. Cell 129: 681-692.). 상기 cry3Aa의 STAB-SD는 다른 프로모터와 결합하여도 하위 유전자의 발현양을 증대시킨다는 보고가 있다 (Park HW et al. 1998. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3932-3938). 그러나 cry3Aa STAB-SD 이외의 다른 STAB-SD에 대한 체계적 조사나 연구는 아직 이루어지지 않았다.
이에 본 발명자들은 상기 cry3Aa STAB-SD 이외에 다른 STAB-SD활성을 갖는 서열을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)의 cry3Ba 유전자의 업스트림 (upstream)에서 신규한 stab 핵산분자를 발견하였고, 나아가 상기 핵산분자의 3' 말단에 cry3Ba 유전자의 5' 말단이 결합된 더 긴 핵산분자 역시 신규한 stab 핵산분자로 작용할 수 있어, 이들 신규한 stab 핵산분자를 공지의 다른 프로모터 뒤에 위치시키는 경우에도 다운스트림 (downstream) 유전자의 발현량을 증대시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)의 cry3Ba 유전자 유래의, STAB-SD 활성을 갖는 신규한 stab 핵산분자로서, 다운스트림 (downstream)에 위치한 유전자의 발현량을 증대시키는 신규한 stab 핵산분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 stab핵산분자를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 프로모터, stab핵산분자 및 목적유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및 (c) 상기 숙주세포로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적 단백질 생산방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 가지는 STAB-SD 활성을 갖는 신규한 stab 핵산분자에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 i) 서열번호 1의 핵산분자 및 ii) 상기 핵산분자의 3' 말단에 연결된 cryBa 구조유전자(structural gene)의 5' 말단의 핵산분자로 이루어진, STAB-SD 활성을 갖는 신규한 stab 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "STAB-SD"이란 30S 리보좀의 구성성분인 16S rRNA가 선택적으로 결합하는 부위지만, SD(Shine Dalgarno) 염기서열과는 달리 구조유전자의 시작코돈과는 100 bases 이상 멀리 떨어져 존재하는 부위로서, "STAB-SD활성"이란 엑소리보뉴클레아제 (exoribonuclease)로 부터 RNA를 보호하는 역할을 담당하며, 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)의 경우 RNase J1으로부터 보호하는 기능을 수행하는 활성을 가질 수 있어서 다른 프로모터와 결합하여도 하위 유전자의 빌현량을 증가시킬 수 있는 활성을 의미한다.
본 발명의 용어 "stab핵산분자"란, 프로모터에 의해 전사된 mRNA의 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독 핵산 서열 중 STAB-SD 활성을 가지는, mRNA의 안정화에 기여하는 서열을 말한다.
바람직하게는 본 발명의 stab핵산분자는 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)의 cry3Ba 유전자의 프로모터와 목적유전자 사이에서 동정되었으며, 서열번호 1의 염기서열을 가지는, STAB-SD 활성을 갖는 신규한 stab 핵산분자일 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 stab핵산분자는 상기 서열번호 1의 핵산분자의 3' 말단에 cry3Ba 구조유전자의 5' 말단의 핵산분자가 융합된 stab핵산분자일 수 있다.
본 발명에서 "구조유전자의 5' 말단"이란 유전자의 번역 시작 지점부터를 의미하며, 이는 구조 유전자의 N 말단을 코딩하는 부분을 의미한다. 상기 N 말단은 STAB-SD 활성을 나타낼 수 있는 부분까지를 제한 없이 포함될 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 stab핵산분자는 서열번호 2로 기재되는 염기서열일 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 stab핵산분자의 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이되더라도, 동일한 STAB-SD활성을 보유하는 한 본 발명의 범주에 속하는 것은 당업자에게 자명하다. 따라서, 바람직하게는 본 발명은 다운스트림 (downstream) 목적유전자의 발현을 증대시킬 수 있는 서열이라면, 서열번호 1 또는 2와 상동성을 갖는 서열을 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 70%의 상동성, 더욱 바람직하게는 80%, 더더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 cry3Ba로부터 유래된 cry3Ba 구조유전자의 5' 말단 일부를 포함한 약간 긴 stab 핵산분자를 phoB 프로모터 뒤에 존재시켰을 경우 GFP(Green Fluorescent Protein) 발현이 현저하게 증가하는 것을 확인하여(도 6), stab핵산분자의 유전자 발현 증대효과에 stab핵산분자가 유래된 해당 유전자의 구조유전자의 5' 말단이 중요한 역할을 한다는 사실을 확인하였다.
본 발명에서 stab핵산분자의 확보는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어 적절한 프라이머 서열을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 또한, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성기술을 이용하여 제조할 수도 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 cry3Ba stab 핵산분자의 경우, 적절한 프라이머 서열을 이용하여, PCR을 통해서 분리 제조하였다.
바람직하게는 본 발명의 stab핵산분자는 프로모터와 목적유전자 사이에 존재하여, 다운스트림 (downstream)에 존재하는 목적유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 이는 STAB-SD를 포함한 신규한 stab핵산분자가 RNA의 5' 말단이 엑소리보뉴클리뉴클레아제 (exoribonuclease)에 의해 분해되는 것을 방해하여 RNA 구조의 안정화를 통해서 전사체를 안정화시키는 동안 하위의 SD염기서열에 30S와 50S 리보좀이 결합하여 해독이 일어나서, 목적유전자의 발현을 증가시키는 역할을 수행하기 때문이다.
본 발명의 용어 "목적유전자"는 발현율의 증대를 바라는 단백질을 코딩하는 다운스트림(downstream)의 유전자를 의미하며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 목적유전자라면 제한없이 사용될 수 있다. 의학, 산업적으로 유용한 목적 단백질의 예로는 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 리셉터 및 리셉터의 단편, 항체 및 항체 단편, 단선 항체, 구조 단백질, 독소 단백질 및 식물 생체방어 유도물질 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 stab핵산분자의 다운스트림 (downstream)에 존재할 수 있는 목적유전자의 예가 제한되는 것은 아니다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 신규한 stab핵산분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명과 관련된 발현 벡터는 플라스미드 벡터 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79 및 pUC19 등), 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 (예: λgt4, λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등), 효모 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV (Human immunodeficiency virus) MLV (Murine leukemia virus) ASLV (Avian sarcoma/leukosis), SNV (Spleen necrosis virus), RSV (Rous sarcoma virus), MMTV (Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스 (Adenovirus), 아데노 관련 바이러스 (Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 플라스미드 pD32 (대한민국 특허출원 제10-2008-0122155)와 pAD-PSA4 (대한민국 특허출원 제10-2008-0074253호), pDG-PSA4 (대한민국 특허출원 제10-2008-0074253호) 을 SpeI과 BamHI로 절단한 후 확보된 stab핵산분자의 서열을 삽입함으로써 벡터를 제조하였다.
본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 프로모터의 핵산분자 서열, stab핵산분자 및 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산분자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에서 "조절 요소"란 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 전사, 번역 또는 발현의 증진을 돕거나 이에 영향을 미치는 비해독화된 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 발현벡터는 stab핵산분자를 필수적으로 포함하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 프로모터 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "프로모터"란 폴리머라제 (polymerase)에 대한 결합 부위를 포함하고 다운스트림 (downstream)에 위치한 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 비해독 핵산서열을 말한다. 본 발명의 stab 핵산분자의 업스트림 (upstream)에 위치할 수 있는 프로모터는, 당업계에서 사용되는 어떠한 프로모터라도 가능하며, 그 제한을 두는 것이 아니다. 바람직하게는 상기 프로모터는 그람양성 세균에서 유래한 프로모터일 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)의 cry3Aa 프로모터 또는 바실러스 서틸러스 (Bacillus subtilis)의 phoB 프로모터를 stab핵산분자의 업스트림 (upstream)에 위치시킴으로서, stab폴리뉴클레오티의 다운스트림 (downstream)에 위치한 목적유전자의 발현이 증가됨을 확인하였다 (도 2, 4 및 6). 본 발명의 바람직한 실시예에서는 stab핵산분자의 업스트림 (upstream)에 cry3A α 프로모터 및 phoB 프로모터를 삽입함으로써 stab핵산분자로 인한 다운스트림 (downstream) 목적유전자의 발현증가를 확인하였다 (실시예 1 내지 3). 또 한 본 발명의 발현 벡터는 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 조절 서열, 예를 들어, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 등을 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 시그널은 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 수송을 용이하게 한다. 인핸서 서열은 프로모터에서 다양한 부위에 위치하여 인핸서 서열이 없을 때의 프로모터에 의한 전사 활성과 비교하여, 전사 활성을 증가시키는 핵산 염기서열이다. 신호서열에는 숙주가 에스케리키아 (Escherichia) 속 균인 경우에는 PhoA 신호서열, OmpA 신호서열 등이, 숙주가 바실러스속 균인 경우에는 α-아밀라아제 신호서열, 서브틸리신 신호서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MF α신호서열, SUC2 신호서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 신호서열, a-인터페론 신호서열, 항체 분자 신호서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다.
또한, 벡터는 선택마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포를 선별 가능하다. 선택마커의 대표적인 예로써, 영양 요구 마커(auxotrophic marker)인 ura4, leu1, his3등을 등을 들 수 있으나 상기 예에 의해 본 발명에서 사용될 수 있는 선택마커의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 벡터로 목적 단백질을 코딩하는 핵산서열은 프로모터와 stab핵산분자의 다운스트림 (downstream)에 삽입되어 발현된다. 상기 벡터로 삽입 가능한 목적 단백질은 특별히 제한되지 않으나, 의학 또는 산업적으로 유용한 목적 단백질의 예로는 호르몬, 사이토카인, 효소, 응고인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사 인자, 항원 또는 항체 등을 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 stab핵산분자에 의한 프로모터의 발현양의 증대를 보기 위해서 베타갈락토시데이즈 (β- galactosidase) 또는 GFP (Green Flurorescent Protein)를 코딩하는 핵산서열을 삽입하여 확인하였다 (도 2, 4 및 6).
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "숙주세포"란 다른 미생물 또는 유전자를 기생시켜 영양을 공급하는 세포로, 벡터가 숙주세포에 형질전환됨으로써 숙주세포 내에서 다양한 유전적 또는 분자적 영향을 미치게 되는 세포를 의미한다. 숙주세포는 외부 DNA를 받아들일 수 있는 수용성 (competence) 상태에서, 벡터와 같은 외부 DNA가 삽입될 수 있는데, 벡터가 숙주세포에 성공적으로 도입되면, 해당 벡터의 유전형질을 숙주세포에 제공하게 된다. 본 발명의 stab핵산분자는 엑소리보뉴클리뉴클레아제(exoribonuclease)로부터 RNA를 안정화 시켜, 그 발현의 효율을 높일 수 있는 바, 본 발명의 숙주세포는 5’에서 3’방향으로 RNA를 절단하는 엑소리보뉴클리뉴클레아제의 활성을 가지는 세포라면 제한없이 사용될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 숙주 세포는 그람양성 세균, 아키아 (Archaea) 세균, 또는 그람음성 세균일 수 있다. 그람양성 세균의 예로는 바실러스 서틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 시리우스 (Bacillus cereus), 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis) 또는 브레비바실러스 브레비스 (Brevibacillus brevis)를 포함하며, 나아가 락토바실러스 (Lactobacillus) 속, 리스테리아 (Listeria) 속, 패니바실러스 (Paenibacillus) 속, 악티노마이세스 (Actinomyces) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 노카르디아 (Nocardia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 또는 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속을 포함할 수 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 그람양성 세균의 종류가 제한되는 것은 아니다. 그람음성 세균의 예로는, 시아노박테리아 (Cyanobacteria)로, 바람직하게는 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 속, 리조비움 (Rhizobium) 속, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 속, 울리넬라 (Wolinella) 속, 헬리코박터 (Helicobacter) 속 또는 캄필로박터 (Campylobacter) 속인 세균 등을 포함하나, 상기 예에 의해 본 원 발명의 벡터가 형질전환될 수 있는 그람음성 세균의 종류가 제한 되는 것은 아니다.
바람직하게 숙주 세포에 벡터를 도입하는 방법은 형질전환 방법이 이용될 수 있다. "형질전환"이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 벡터를 형질전환 시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 방법이 제한없이 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 특정 프로모터 및 상기한 stab핵산분자를 사용하여, 목적 유전자의 과발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 stab핵산분자를 stab핵산분자가 유래된 유전자의 프로모터의 종류에 상관없이 다양한 프로모터의 다운스트림에 위치시킬 경우, 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자의 과발현을 유도할 수 있어 목적 유전자가 코딩하는 단백질에 유용하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 cry3Aa 프로모터 서열을 포함하지만 cry3Aa 자체의 stab핵산분자를 포함하지 않는 벡터를 pD3S0로 명명하였으며, 상기 벡터를 사용하여 프로모터와 목적유전자인 베타갈락토시데이즈 (β- galactosidase) 유전자 사이에 본 발명의 stab핵산분자인 cry3Ba의 stab핵산분자(이하 '3BaS1', 서열번호 1)를 삽입한 벡터 pD3BaS를 제조하였다(도 1). 또한 바실러스 서틸리스 phoB 프로모터 서열을 포함하는 벡터를 pDG-PSA3로 명명하였으며, 상기 벡터를 사용하여 프로모터와 목적유전자인 베타갈락토시데이즈 유전자 사이에 본 발명의 상기 stab핵산분자인 3BaS1을 삽입한 벡터 pDG-P4BaS를 제조하였다(도 3). 또한 바실러스 서틸러스 phoB 프로모터 서열을 포함하는 벡터 pAD-PSA4를 제조하고 상기 벡터의 프로모터와 목적 유전자인 GFP(Green Fluorescent Protein) 유전자 사이에 본 발명의 stab핵산분자인 3BaS1을 삽입한 벡터 pAP12를 제조하고, 상기 3BaS1에 cry3Ba 구조유전자의 5' 말단을 결합시킨 stab핵산분자(이하, '3BaS2' 서열번호 2)를 삽입한 벡터 pAP13을 제조하였다(도 5).
본 발명은 상기 플라스미드 벡터를 당업계에서 사용되는 통상적인 형질전환방법을 통해 바실러스 속 균주에 도입, 배지에서 배양함으로써, 목적단백질인 베타갈락토시데이즈의 발현량을 확인하였다. 목적단백질로 사용한 베타갈락토시데이즈의 발현양을 비교 분석한 결과 3BaS1 stab핵산분자는 약 10배 정도 cry3Aa 프로모터의 발현양을 증가시켰다 (도 2).
한편 phoB 프로모터의 경우, 3BaS1은 약 3배 정도 베타갈락토시데이즈의 발현양을 증가시키고(도 4), 3BaS2는 13 배 정도 GFP 발현양을 증가시켰다 (도 6).
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 (a) 프로모터, stab핵산분자 및 목적유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 제조된 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및 (c) 상기 숙주세포로부터 목적 유전자가 코딩하는 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 프로모터는 당업계에서 사용되는 어떠한 프로모터라도 사용 가능하며 벡터의 상기 stab 업스트림에 제한효소 및 PCR 방법을 사용하여 삽입될 수 있다. 또한 제조된 벡터는 일반적인 형질전환 방법으로 숙주세포에 도입함으로써 제조될 수 있는데, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 자연도입법을 이용하여 바실러스 서틸리스 168에 도입하여, 단백질 발현량을 측정하였다.
또한 상기 방법으로 형질전환된 숙주세포는 필요에 따라 당업계에서 통상적으로 사용되는 배양 방법을 통하여 배양될 수 있다. 바람직하게 본 발명은 형질전환된 바실러스 균주를 DSM배지 및 CLPYG 배지에서 배양하여 목적단백질의 생산을 유도하였다.
본 발명에서 회수되는 목적단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 플라스미드 벡터의 제조시 필요에 따라 다른 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 추가적으로 포함될수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His (hexa histidine)일 수 있으나, 상기 예들에 의하여 목적단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다. 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질의 경우, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 원하는 목적단백질을 용이하게 회수할 수 있다.
본 발명의 stab핵산분자를 이용하여, 다양한 숙주세포에서 특정 프로모터의 발현을 증가시켜 유용한 효소 또는 단백질을 대량 발현시키는 데 도움을 주어 산업적으로 유용한 단백질의 생산에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 플라스미드 pD3S0 및 pD3BaS를 도식화한 그림이다. ApR, SpR 및 CmR은 각각 암피실린, 스펙티노마이신 및 클로르암페니콜 저항성유전자를 나타낸다. P cry3Aa 는 stab핵산분자를 포함하지 않은 cry3Aa 프로모터를 의미한다.
도 2는 도 1에 표시된 플라스미드를 함유한 균주를 대상으로 베타갈락토시데이즈의 발현양을 비교 분석한 그림이다. no stab은 pD3S0를 의미한다.
도 3은 플라스미드 pDG-PSA3 및 pDG-P4BaS를 도식화한 그림이다. ApR, SpR 및 CmR은 각각 암피실린, 스펙티노마이신 및 글로르암페니콜 저항성 유전자를 나타낸다. P phoB 는 바실러스 서틸러스 유래 phoB 프로모터를 의미한다.
도 4는 도3에 표시된 플라스미드를 함유한 균주를 대상으로 베타갈락토시데이즈의 발현양을 비교 분석한 그래프이다.
도 5는 플라스미드 pAD-PSA3, pAP12 및 pAP13을 도식화한 그림이다. ApR 및 CmR은 각각 암피실린 및 클로르암페니콜 저항성유전자를 나타내며 Rep1060은 바실러스용 복제원점을 나타낸다. P phoB 는 바실러스 서틸리스 유래 phoB 프로모터를 의미한다.
도 6은 도 5에 표시된 플라스미드를 함유한 균주를 대상으로 GFP의 발현양을 유세포분석기로 분석한 그림이다. 화살표는 발현된 GFP 피크를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 예시적으로 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: stab 핵산분자 확보 및 이를 이용한 cry3Aa 프로모터 발현양 증대
<1-1> stab핵산분자 확보
cry3Ba로부터 유래된 stab핵산분자(3BaS1)는 프라이머 3BaS-F (서열번호 3)와 3BaS-R (서열번호 4)을 사용하여 PCR로 확보하였다. 확보된 상기 stab핵산분자는 SpeI과 BamHI으로 절단한 후 플라스미드 pD32 (대한민국 특허출원 제10-2008-0122155호)의 SpeI과 BamHI 부위에 삽입하여 플라스미드 pD3BaS를 완성하였다 (도 1). 대조구로 사용된 stab핵산분자를 포함하지 않는 플라스미드 pD3S0 (도 1)는 플라스미드 pD32를 SpeI과 BamHI으로 절단하고 Klenow 효소로 양 말단을 블런트엔드 (blunt end)로 만든 후 라이게이션 (ligation)하여 만들었다. 제작된 상기 플라스미드들은 자연도입법으로 바실러스 서틸리스 168 (Kunst F. et al. 1997. Nature. 390:249-256)에 도입하였다.
<1-2> stab핵산분자에 의한 cry3Aa 프로모터 발현양 증대
상기 플라스미드 pD3S0 및 pD3BaS를 포함한 바실러스 서틸리스 균을 DSM 배지 (Harwood CR and Cutting SM. 1990. p549. Molecular Biological Methods for Bacillus. John Wiley & Sons Ltd.)에 접종한 후 배양 중인 세포를 1시간 간격으로 취하여 베타갈락토시데이즈 (β-galactosidase)의 활성을 톨루엔을 사용하는 방법 (Harwood CR and Cutting SM. 1990. p443. Molecular Biological Methods for Bacillus. John Wiley & Sons Ltd.)으로 측정하였다. 그 결과 3BaS1은 약 10배 정도 cry3Aa 프로모터의 발현양을 증가시켰다 (도 2).
실시예 2: stab 핵산분자에 의한 phoB 프로모터 발현양 증대
stab핵산분자에 의한 발현양 증대가 cry3Aa 프로모터에 한정되는 것인 지 알아보기 위하여 상기 stab핵산분자를 다른 프로모터에 적용하였다. 이를 위해 상기 stab핵산분자를 SpeI과 BamHI으로 절단한 후 바실러스 서틸러스 phoB 프로모터를 가진 벡터 pDG-PSA4(대한민국 특허출원 제10-2008-0074253호)의 SpeI과 BamHI 부위에 삽입하여 플라스미드 pDG-P4BaS를 완성하였다(도 3). 대조구로는 stab핵산분자를 포함하지 않는 phoB 프로모터를 가진 플라스미드 pDG-PSA3를사용하였다(도 3). 상기 플라스미드 pDG-PSA3, pDG-P4BaS를 포함한 바실러스 서틸러스 균을 CLPYG 배지 (Choi SK and Saier MH. 2005. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 10: 40-50)에 접종한 후 배양중인 세포를 1시간 간격으로 취하여 베타갈락토시데이즈(galactosidase)의 활성을 톨루엔을 사용하는 방법 (Harwood CR and Cutting SM. 1990. p443. Molecular biological Methods for Bacillus. John Wiley & Sons Ltd.)으로 측정하였다. 그 결과 3BaS1는 약 3배 정도 phoB 프로모터의 발현양을 증가시켰다(도 4).
실시예 3: 구조유전자의 5' 말단이 결합된 stab 핵산분자 확보 및 이를 이용한 phoB 프로모터 발현양 증대
<3-1> 구조 유전자의 5' 말단이 결합된 stab핵산분자 확보
한편 상기 실시예 <1-1>에서 제작한 stab핵산분자 3BaS1에서 cry3Ba 구조유전자의 5' 말단 일부가 포함된 stab핵산분자(3BaS2)는 프라이머 3BaS-F3 (서열번호 5)와 프라이머 3BaS-R3 (서열번호 6)를 사용하여 플라스미드 pAP12로부터 PCR로 확보하였다. 상기 플라스미드 pAP12는 stab핵산분자 3BaS1을 SpeI과 BamHI으로 절단한 후 플라스미드 pAD-PSA4 (대한민국 특허출원 제10-2008-0074253호)의 SpeI과 BamHI 부위에 삽입하여 완성하였다 (도 5). 확보된 상기 stab핵산분자 3BaS2는 SpeI과 BamHI으로 절단한 후 플라스미드 pAD-PSA4의 SpeI과 BamHI 부위에 삽입하여 플라스미드 pAP13를 완성하였다 (도 5). 대조구로 사용된 stab핵산분자를 포함하지 않는 플라스미드 pAD-PSA3는 플라스미드 pAD-PSA4를 SpeI과 BamHI으로 절단하고 Klenow 효소로 양 말단을 블런트엔드 (blunt end)로 만든 후 라이게이션 (ligation)하여 만들었다 (도 5). 제작된 상기 플라스미드들은 자연도입법으로 바실러스 서틸리스 168 (Kunst F. et al. 1997. Nature. 390:249-256)에 도입하였다.
<3-2> stab핵산분자에 의한 phoB 프로모터 발현양 증대
상기 플라스미드 pAD-PSA3, pAP12, pAP13을 포함한 바실러스 서틸리스 균을 CLPYG 배지 (Choi SK and Saier MH. 2005. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 10: 40-50)에 접종하여 28시간 배양한 후 유세포분석기를 이용하여 GFP의 발현양을 비교분석하였다. 그 결과 3BaS1은 phoB 프로모터의 발현양을 증가시키지 못하였으나 3BaS2는 phoB 프로모터의 발현양을 약 13배 증가시켰다 (도 5).
이상과 같이 본 발명의 stab핵산분자들은 다른 프로모터의 발현양을 증가시킬 수 있으며, 특히 구조 유전자의 5' 말단을 포함한 stab핵산분자는 다른 프로모터의 발현양을 현저히 증가시킬 수 있음을 확인함으로써 목적단백질의 과발현을 위해 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> NOVEL NUCLEIC ACIDS FOR ENHANCING GENE EXPRESSIONS AND A METHOD FOR PROTEIN PRODUCTION USING THE SAME <130> PA100007/KR <150> KR10-2009-0007587 <151> 2009-01-30 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 121 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(121) <223> 3BaS1 stab <400> 1 tcaggaaggg ggggatgcgc aaagaataaa aagagaatgc ttataatgtt caatggtttt 60 ataggaaggc attttatcag gtagaaagtt atgtattatg ataagaatgg gaggaagaaa 120 a 121 <210> 2 <211> 170 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(170) <223> 3BaS2 stab <400> 2 tcaggaaggg ggggatgcgc aaagaataaa aagagaatgc ttataatgtt caatggtttt 60 ataggaaggc attttatcag gtagaaagtt atgtattatg ataagaatgg gaggaagaaa 120 aatgaatcca aacaatcgaa gtgaatatga tacgataaag gttacaccta 170 <210> 3 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer of 3BaS-F <400> 3 tatactagtt caggaagggg gggatgcgca aagaataaaa agagaatgct tataatgttc 60 aatggtttta taggaaggc 79 <210> 4 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for 3BaS-R <400> 4 tatggatcct tttcttcctc ccattcttat cataatacat aactttctac ctgataaaat 60 gccttcctat aaaaccatt 79 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for 3BaS-F3 <400> 5 tatactagtt caggaagggg gggatg 26 <210> 6 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for 3BaS-R3 <400> 6 tatggatcct aggtgtaacc tttatcgtat catattcact tcgattgttt ggattcattt 60 ttcttcctcc cattcttatc 80

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 가지는, STAB-SD 활성을 갖는 신규한 stab 핵산 분자.
  2. 삭제
  3. i) 제1항의 핵산 분자, 및 ii) 상기 핵산 분자의 3' 말단에 연결된 cry3Ba 구조 유전자의 5' 말단의 핵산 분자로 이루어진 서열번호 2의 염기서열을 가지는, STAB-SD 활성을 갖는 신규한 stab 핵산 분자.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 stab 핵산 분자는 프로모터와 목적유전자 사이에 존재함으로서, 전사 후 RNA의 안정화 및 다운스트림 (downstream)의 목적유전자의 발현을 증가시키는 것인 신규한 stab 핵산 분자.
  5. 제1항 또는 제3항의 stab 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 벡터는 프로모터 및 목적유전자를 추가적으로 포함하는 벡터.
  7. 제5항에 있어서, 상기 벡터는 단백질 정제용 태그서열을 추가적으로 포함하는 벡터.
  8. 제6항에 있어서, 상기 프로모터는 cry3Aa 프로모터 또는 phoB 프로모터인 벡터.
  9. 제5항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 숙주세포는 그람양성 세균, 그람음성 세균 및 아키아 (Archaea) 세균으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세균인 숙주세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세균은 바실러스 서틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 시리우스 (Bacillus cereus), 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis), 브레비바실러스 브레비스 (Brevibacillus brevis), 락토바실러스 (Lactobacillus) 속, 패니바실러스 (Paenibacillus) 속, 리스테리아 (Listeria) 속, 클로스트리디움 (Clostridium) 속, 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 속, 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 속, 악티노마이세스 (Actinomyces) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces)속, 노카르디아 (Nocardia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속, 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 속, 리조비움 (Rhizobium) 속, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 속, 울리넬라 (Wolinella) 속, 헬리코박터 (Helicobacter) 속, 캄필로박터 (Campylobacter) 속, 및 시아노박테리아 (Cyanobacteria)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세균인 숙주세포.
  12. (a) 제5항의 벡터를 제조하는 단계; (b) 제조된 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및 (c) 상기 숙주세포로부터 목적유전자가 코딩하는 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 생산방법.
  13. 제12항에 있어서, (d) 컬럼을 이용하여 목적단백질을 정제하는 단계를 추가적으로 포함하는 목적단백질의 생산방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 목적단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 리셉터, 리셉터의 단편, 항체, 항체 단편, 단선 항체, 구조 단백질, 독소 단백질 및 식물 생체방어 유도물질로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 목적단백질의 생산방법.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6720167B1 (en) * 2000-08-14 2004-04-13 The Regents Of The University Of California Insecticidal bacteria, and methods for making and using them

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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논문2:CELL
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