CN113950530A - 核酸多联体产物的表达 - Google Patents

Abstract

提供了使用一种或多种核酸多联体产生表达产物的技术，所述核酸多联体包含编码一种或多种表达产物的核酸序列的串联重复。在一个实施方案中，可使用彼此具有预定义比率的第一核酸多联体和第二核酸多联体的多联体混合物共表达不同的表达产物。

Description

核酸多联体产物的表达

序列表

本申请含有以ASCII格式电子提交的序列表，且通过引用将其整体并入本文。创建于2019年5月15日的所述ASCII副本被命名为324586-1_SL.txt且大小为13,566字节。

技术领域

本公开总体上涉及核酸多联体的重组产物的表达，并且在某些实施方案中，涉及核酸多联体的重组产物的按比率共表达。已经在体内和无细胞表达系统中证实了按比率共表达。

背景技术

重组产物，包括蛋白、抗体和核酸，已广泛用于临床应用。这样的重组产物可利用核酸和/或蛋白表达机制以产生具有临床效用的目的产物。例如，免疫疗法和其它细胞疗法频繁地利用病毒载体来递送遗传有效负荷以治疗特定的疾病靶标。在一个实例中，用于细胞的基因修饰的有效负荷的病毒载体递送可用于治疗某些类型的血液癌，所述细胞具有用于CAR-T免疫疗法的嵌合抗原受体。病毒载体的其它应用包括在癌症疫苗、单基因疾病和感染性疾病中的应用。

重组DNA技术已经用于生产重组产物。然而，某些所需的产品可涉及复合的或以其他方式一起起作用的多个组分。这种多组分表达产物的生产可能是复杂的。生产重组产物的一种常见方法可涉及将不同组分分离到多个质粒。例如，多个质粒构建体的共表达可在体内和体外环境中进行。在一些实例中，可将多个质粒构建体瞬时转染到培养细胞中，并且使用那些培养细胞产生所需的重组产物，例如病毒载体、蛋白等。

然而，某些挑战与在细胞中使用多个质粒构建体有关。挑战之一是对多个质粒构建体的共表达的比率控制。例如，已经报道当每个质粒构建体编码不同的蛋白时，在单个细胞内的转染程序中来自相应质粒的两种(或更多种)蛋白的共表达可导致蛋白以广泛变化的比率表达，其中细胞亚群仅表达所需蛋白之一。

已经尝试了若干种方法以在单个活细胞中改善对蛋白的共表达比率的控制和实现所需的蛋白比率。例如，可构建多顺反子质粒而不是使用两个或更多个分开的质粒。例如，具有内部核糖体进入位点(IRES)和病毒2A肽的单个双启动子质粒可用于驱动具有降低的异质性的两种或更多种蛋白的共表达，尽管这需要费力地将每个开放阅读框克隆到多顺反子质粒中并因此增加质粒构建体的尺寸的代价。此外，由于质粒含有在细菌中维持所必要的另外的序列，使用质粒需要生产后纯化和QC分析以证明质粒生产中不存在细菌污染物，这对cGMP(临床良好制造)过程提出了重大挑战。后者尤其具有挑战性，因为质粒构建体的尺寸增加并且变得难以与细菌染色体DNA区分，这使得质粒DNA的生产后纯化复杂化。

因此，仍然存在对用于在体外和体内表达系统中可靠地控制重组产物表达的系统和方法的需要，尤其是用最少的人工制备。

发明内容

下文阐述本文所公开的某些实施方案的概述。应当理解，呈现这些方面仅用于向读者提供所述某些实施方案的简要概述，并且这些方面不旨在限制本公开的范围。实际上，该公开可涵盖以下可能未阐述的多个方面。

在一个实施方案中，提供了一种方法，其包括以下步骤：配制包含彼此具有预定义比率的至少第一核酸多联体和第二核酸多联体的多联体混合物，其中所述第一核酸多联体包含第一核酸序列的串联重复，而其中所述第二核酸多联体包含第二核酸序列的串联重复；以及共表达所述多联体混合物以由所述第一核酸序列产生第一表达产物和由所述第二核酸序列产生第二表达产物。

在另一个实施方案中，提供了一种方法，其包括以下步骤：配制包含预定义比例的至少两种核酸多联体的混合物，其中所述核酸多联体中的每一种包含两种或更多种核酸序列的串联重复；并且共表达所述混合物以从所述混合物中的每种核酸多联体产生两种或更多种表达产物。

在另一个实施方案中，提供了一种方法，其包括以下步骤：使用链置换滚环扩增来扩增包含第一核酸序列的至少一种模板，以产生包含所述第一核酸序列的串联重复的第一多联体；使所述第一多联体与包含第二核酸序列的串联重复的第二多联体接触以形成多联体混合物，所述多联体混合物具有所述第一核酸多联体与所述第二核酸多联体的预定义比率；共表达所述多联体混合物以由所述第一核酸序列产生第一表达产物和由所述第二核酸序列产生第二表达产物，其中所述第一表达产物与所述第二表达产物的比率和所述多联体混合物中所述第一核酸多联体与所述第二核酸多联体的预定义比率成比例。

在另一个实施方案中，提供了一种方法，其包括以下步骤：配制包含彼此具有预定义比率的至少一种核酸多联体和至少一种质粒的混合物，其中所述至少一种核酸多联体包含第一核酸序列的串联重复，并且其中所述至少一种质粒包含第二核酸序列；以及共表达所述混合物以由所述第一核酸序列产生第一表达产物和由所述第二核酸序列产生第二表达产物。

在另一个实施方案中，首先提供转染的细胞并用核酸多联体瞬时转染，所述核酸多联体包含核酸序列的串联重复，并在转染细胞中表达编码表达产物的核酸序列中的至少一个开放阅读框。在一个实施方案中，所提供的转染细胞已经用一种或多种核酸多联体和/或一种或多种质粒转染。以这种方式，可用核酸多联体顺序转染细胞。在一个替代的实施方案中，转染的细胞在用核酸多联体转染之前稳定表达一种或多种所需产物。

附图说明

当参照附图阅读以下详细描述时，本公开的这些和其他特征、方面和优点将变得更好理解，在所有附图中，相同的字符表示相同的部分，其中：

图1是根据本公开的实施方案用在表达系统中以产生所需表达产物的多联体的产生的示意图；

图2是根据本公开的实施方案用在共表达系统中以产生一种或多种所需的表达产物的两种或更多种多联体的产生的示意图；

图3是根据本公开的实施方案的共表达系统的潜在终产物的示意图；

图4是根据本公开的实施方案的共表达系统的潜在复合终产物的示意图；

图5是根据本公开的实施方案的彼此作用或作用于共表达系统的另一核酸或蛋白的潜在终产物的示意图；

图6是根据本公开的实施方案的混合表达策略的示意图，其中使用多联体表达多产物系统的所有或一些所需的表达产物；

图7是根据本公开的实施方案的慢病毒载体产物表达的实施方案的示意图；

图8是根据本公开的实施方案的慢病毒载体产物表达的实施方案的示意图；

图9是根据本公开的实施方案的腺伴随病毒载体产物表达的实施方案的示意图；

图10是根据本公开的实施方案的CRISPR产物表达的实施方案的示意图；

图11是显示根据本公开的实施方案的腺伴随病毒(AAV)衣壳蛋白的化学计量表达的琼脂糖凝胶照片；

图12是显示根据本公开的实施方案的轻链和重链多肽的化学计量表达的琼脂糖凝胶照片；

图13是表明根据本公开的实施方案，从完整的滚环扩增产生的多联体、滚环扩增产生的线性消化物和以不同浓度(18％和2％)转染到幼稚细胞中的质粒的AAV产生的条形图。

图14是表明根据本公开的实施方案从混合的多联体和质粒表达产物来源的AAV产生的条形图；以及

图15是表明根据本公开的实施方案从混合的多联体和质粒表达产物来源的慢病毒产生的条形图。

具体实施方式

下面将描述一个或多个具体实施方案。为了提供这些实施方案的简明描述，在说明书中没有描述实际实施方式的所有特征。应当理解，在任何这样的实际实施方式的开发中，如在任何工程或设计项目中，必须做出许多实施方式特定的决定以实现开发者的特定目标，例如符合系统相关和商业相关的约束，其可在各个实施方式间变化。此外，应当理解，这样的开发努力可能是复杂且耗时的，但是对于受益于本公开的本领域普通技术人员而言仍然是设计、构造和制造的常规任务。

大尺寸(即高分子量)的核酸的产物的表达与低效率相关。这种低效率可能是较大核酸的低转染效率的结果，这又导致所需终产物的产生减少，以及核酸之间对转录和翻译所需宿主因子的基于DNA序列的竞争。先前已经显示转染效率根据DNA尺寸而降低，并且已经显示与较小尺寸的质粒相比，尺寸大于10 kb的质粒具有显著降低的转染效率。本文提供了使用DNA多联体或DNA多联体混合物的表达技术，其中所述多联体包含编码所需表达产物(例如蛋白或核酸表达产物)的核酸序列的串联重复。在某些实施方案中，所公开的多联体可以比先前与低效率相关的尺寸更大(例如至少10kb)。然而，如本文所公开的，当两种或更多种多联体混合在一起时仍然实现高转染效率，尽管它们的尺寸大。而且，与较小尺寸的质粒混合的一种或多种多联体也实现了高转染效率，尽管两者之一的尺寸大。在一个实施方案中，使用链置换扩增(例如滚环扩增(RCA))产生多联体，以产生多个不同尺寸的多联体并包含编码所需表达产物的核酸序列的串联重复。也就是说，每个单独的多联体核酸分子中串联重复的数目可能是未知的。然而，即使在RCA导致的可变和/或混合多联体尺寸的情况下，也可实现高转染效率和产生所需表达产物。此外，即使不知道如本文提供的串联重复的确切数目，并且不控制核酸序列之间的对宿主因子的基于序列的竞争，也可实现所需的共表达产物的稳健生产和所需比率的控制。

此外，如本文所公开的，DNA多联体可与共表达系统结合使用，以按比率的方式可预测地共表达两种或更多种表达产物。两种或更多种多联体可被转染并共表达以产生共表达产物。可使用具有所需终产物的表达序列的未知数目串联重复的多联体产生按比率表达。在某些实施方案中，至少一种多联体具有大于约10kb的尺寸。两种或更多种多联体的转染和共表达可在单个细胞或无细胞表达系统中发生。由于关于尺寸和转染效率之间关系的常规知识，这是出乎意料的结果。因为对于调节转录和翻译的宿主因子的基于DNA序列的竞争具有不可预测的性质，这也是出乎意料的。例如，由于核酸多联体的大尺寸(例如典型的核酸多联体可以具有大于10kb的尺寸)，常规知识是包含两种或更多种不同核酸多联体的DNA混合物预期不能有效地进入单个细胞且预期不能产生所需的表达产物，特别是当核酸多联体未经处理时(例如核酸多联体在产生后没有进一步处理)。此外，多联体的尺寸通常不能够精确地确定，并且尺寸也不均匀，使得这种混合物(cocktail)或混合物(mixture)(包含以预先确定或定义的比率混合的两种或更多种多联体)的设计甚至更具挑战性。

如本文所公开的，包含第一和第二多联体并使用定义比率配制的核酸多联体混合物可用于共表达多联体混合物以产生共表达产物，所述共表达产物包含分别由多联体混合物的第一核酸多联体和第二核酸多联体产生的至少第一和第二表达产物。在某些实施方案中，第一和第二表达产物的比例与多联体混合物中第一和第二核酸多联体的定义比率成比例。

使用由RCA产生的多联体以表达所需终产物提供了优于其它表达模板例如质粒构建体的益处。滚环扩增能够快速产生对于预期应用完全相关和具有生物活性的特定DNA序列(例如DNA微环)，例如编码包含包装、转导和表达元件的最小病毒载体和病毒产生所需的蛋白的那些。这允许DNA增加的比活力(编码区段/DNA质量)。相反，质粒含有在细菌中维持必要的但对于预期应用是不必要的另外的序列。因为RCA多联体不是在细菌中制造的，所以RCA的使用避免了外源细菌组分或纯化试剂对最终DNA产物的潜在污染。所公开的多联体合成在没有细菌的情况下进行，且因此无细菌来源的内毒素。RCA多联体还消除或减少了对大规模细菌生长、DNA纯化柱、内毒素去除和与细菌衍生产物相关的质量控制的需要，例如QC分析以证明质粒产物中不存在细菌污染物(基因组DNA和RNA)。相反，核酸多联体可以在没有细菌的情况下制备和繁殖，并且因此需要最少的生产后纯化，从而提供适于cGMP制造的成本和复杂性益处。此外，RCA产生的多联体可用于编码对细菌有毒的产物，其难以在基于细菌的系统中扩大。这是因为可用于编码有毒产物的构建体由于在细菌生长期间产物的泄漏表达而难以维持，导致构建体从细菌中丢失或细菌死亡。

此外，RCA产生的多联体能够简化需求点的DNA生产和扩大。使用等温扩增反应，可以在少于一天内从模板DNA廉价地生产毫克至克数量的滚环扩增的DNA。产生5 mg RCA DNA的总“动手”时间少于1小时。相反，使用无内毒素纯化柱从大肠杆菌的DH5α菌株分离超螺旋质粒需要大约8小时。因此，与标准细菌来源的质粒相比，滚环扩增预期提供更简单且更便宜的制造方法。

此外，RCA方法允许将经修饰的核苷酸插入到扩增的DNA中，该可能性在活细胞中基于质粒的系统中是受限的。经修饰的核苷酸可有助于产生具有增强的核酸酶抗性、增强的稳定性、延长的基因表达和增加的基因组整合效率的功能化DNA。在一个实施方案中，与仅含有标准核苷酸的RCA DNA相比，转染用硫代磷酸核苷酸修饰的RCA DNA提供了延长的蛋白表达。因此，在一个实施方案中，本技术可用于从具有掺入的经修饰核苷酸的多联体产生或制造表达产物。

图1是使用如本文提供的至少一种多联体生产所需表达产物的示意图。环状模板14中的表达序列12用于使用滚环扩增(RCA)产生包含表达序列12的串联重复的多联体16。多联体16一旦产生，可在用于表达系统20之前纯化或以其它方式清洗，在操作中，表达系统20作用于多联体16以表达表达序列12，从而产生表达产物26。然而，在某些实施方案中，可应用多联体16而无需在表达系统20中进行另外的处理。表达系统20可为如本文公开的基于细胞的或无细胞的表达系统。一旦产生，可收集表达产物26用于合适的治疗方案或其它应用。多联体16的表达产物26可包含一种或多种蛋白和/或核酸表达产物。

在某些实施方案中，多联体16可以单独使用或与表达系统20中的其它多联体16(例如两种或更多种多联体16)或与其它表达载体(例如与质粒混合)联合使用，所述质粒可用于无细胞表达系统或在基于细胞的系统中共转染以共表达多种表达产物26。在一个具体的实施方案中，尺寸约10kb或更大的多联体16可用于基于细胞的表达系统以产生表达产物26。与其它技术相反，本公开证明大尺寸的多联体和多联体混合物在基于细胞的表达系统中不经历相对于相似尺寸的质粒相同的转染效率降低，也不经历降低表达系统中共表达效率的对宿主因子的基于DNA序列的竞争。

图2是使用多种多联体的混合物共表达所需表达产物的示意图。携带表达序列12a的串联重复并经由RCA从模板14a产生的第一多联体16a可与携带表达序列12b的串联重复并经由RCA从模板14b产生的第二多联体12b混合，如本文所提供的。表达序列12a、12b可以不同，使得表达系统20产生多种表达产物26a、26b。也就是说，不是在不同的表达系统20中产生不同的表达产物26a、26b，而是不同的表达产物26a、26b可在相同的表达系统20中共表达，例如同时产生。此外，表达产物26a、26b(等等)的比率可基于混合物中多联体16a、16b(等等)的比率或与混合物中多联体16a、16b(等等)的比率成比例。

虽然可以根据质粒构建体以及任何插入的表达序列的尺寸容易地确定重组质粒的尺寸，但是多联体的尺寸可以变化。然而，本技术的实施方案涉及假定每个多联体16是单体，而不是试图确定每个多联体16中表达序列12的串联重复的确切数目。该假设用于确定多联体16彼此之间的摩尔比。例如，第一多联体16a可具有已知碱基长度为1000的表达序列12a的串联重复，而第二多联体16b可具有已知碱基长度为1500的表达序列12b的串联重复。因此，为了实现第一多联体12a :第二多联体12b的摩尔比为1:1，在用于共表达的多联体混合物中，第二多联体16b的总重量应为第一多联体16a总重量的1.5倍。应当理解，多联体16可都为单链的或都为双链的或为单链和双链的混合物。对于任何另外的多联体16，也可确定摩尔比。表1总结了用于腺伴随病毒(AAV)的三多联体16共表达系统的摩尔比的实例，并使用摩尔比可基于表达序列12单体(或携带表达序列的质粒/环状构建体，例如模板14)尺寸的假设。

用作多联体单体尺寸假设的质粒构建体	尺寸(kb)	所需的比率	摩尔比的微克DNA	质量比的微克DNA
					pscAAV-GFP	4.4	1	1.00	1.00
pAAV-RC6	7.3	1	1.66	1.00
					pHelper	11.6	1	2.6	1.00

表1：AAV共表达的质量比和摩尔比

可基于多联体12a、12b的估计尺寸和由RCA产生的多联体12a、12b的估计浓度来估计摩尔比。

因此，尽管已经报道了通过在单个细胞中转染不同的质粒来共表达两种或更多种蛋白，所表达蛋白的比率存在很大变化(例如许多细胞亚群仅表达两种蛋白构建体之一)，但是本技术促进了与表达系统20中使用的多联体16的比率成比例的共表达产物的可程控比率。虽然多联体具有与变化的尺寸相关的不确定性，但是本公开证明，使用多联体16共表达所需的表达产物26以可程控的比率产生稳健的表达。

应当理解，在共表达工作流程中，多联体16可基于相应表达产物26的期望比率以预先确定或预定义比率混合或配制。也就是说，为了获得第一表达产物26a与第二表达产物26b所需的比率，提供给表达系统20的多联体混合物可用彼此以预定义比率存在于混合物中的多联体16a、16b配制。对于两种多联体16，多联体16的比率可为1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10等。对于三种或更多种多联体16，多联体16的比率可表示为C₁:C₂:C_N，其中C₁、C₂至C_N中的每一个可为1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10等，并且可不为相同的整数。在某些实施方案中，该比率是摩尔比而不是简单的质量比。在一个实施方案中，约1:1的摩尔比的多联体16产生约1:1的比率的相应表达产物26。此外，对于包含一种或多种DNA多联体16的共表达系统，可测量DNA的精确长度而不是推断或估计多联体尺寸，以确定所公开的适当比率。

在某些实施方案中，共表达产物可通过配制包含定义比率的第一核酸多联体和第二核酸多联体的多联体混合物来形成；共表达所述多联体混合物以产生各自分别由所述多联体混合物的第一核酸多联体和第二核酸多联体产生的至少第一表达产物和第二表达产物；其中第一表达产物和第二表达产物的比率与多联体混合物中第一核酸多联体和第二核酸多联体的定义比率成比例。在某些实施方案中，第一和第二表达产物的比率与第一和第二核酸多联体所定义的比率基本上相同。

图3-5是共表达核酸多联体以形成所需终产物的实施方案的示意图。一种或多种共表达产物可以是非复合共表达产物或复合共表达产物的形式。在某些实施方案中，非复合共表达产物可包含共表达并以非复合形式存在的两种或更多种表达产物。例如，共表达产物可包含第一表达产物30和第二表达产物34，它们被共表达并随后彼此不形成复合物，如图3所示。每种表达产物可以独立地是蛋白、RNA或其组合。此外，各多联体16(16a、16b，任选地16c)可产生多种表达产物，如表达产物32、36、38所示。

在某些实施方案中，复合共表达产物可包含两种或更多种表达产物40、42，其各自的多联体16a、16b共表达并随后彼此形成复合物50，如图4所示。例如，复合共表达产物可包含第一表达产物40和第二表达产物42，它们被共表达并彼此形成复合物50。每种表达产物可以独立地是蛋白、RNA或其组合。此外，如所示的，其它多联体16c也可产生表达产物(例如表达产物46)，其也可形成复合物50的一部分。复合共表达产物的非限制性实例可包括抗体(例如单克隆抗体(mAb))、病毒样颗粒、CRISPR或慢病毒。

图5是共表达产物可包含作用于分子的第一表达产物的实施方案。第一表达产物可为由不同的表达产物58、60、62形成的复合共表达产物56。在一个实施方案中，第一表达产物56可为酶，而作用的分子64可为酶作用的底物。在一个实施方案中，分子64是多联体。在一个实施方案中，复合物56与分子的相互作用产生产物66，其又可与复合物56及其组分形成复合物70。在另一个实施方案中，第一表达产物可为蛋白，而第二表达产物可为DNA。表达系统还可包括形成不是末端复合物70的一部分的表达产物(例如表达产物68)的另外的多联体(例如多联体16b)。作用于分子的共表达产物的非限制性实例包括从DNA转染细胞产生的重组腺伴随病毒(AAV)，其中所述分子是多联体。

根据本公开，配制了包含定义比率的第一核酸多联体和第二核酸多联体的多联体混合物。共表达多联体混合物以产生各自分别由多联体混合物的第一核酸多联体和第二核酸多联体产生的至少第一表达产物和第二表达产物，其中第一表达产物和第二表达产物的比率与多联体混合物中第一核酸多联体和第二核酸多联体的定义比率成比例。

在某些实施方案中，第一和第二核酸多联体中的至少一个包含最小表达序列。最小表达序列编码不含宿主细胞中DNA增殖所需的外源序列的一种或多种所需产物。最小表达序列可以经计算机设计并在体外合成。在一个实施方案中，每个各自的表达序列12可包含开放阅读框(ORF)和可操作地连接到开放阅读框的启动子。在某些实施方案中，表达序列中的至少一种可包含一个与多于一个ORF可操作地连接的启动子。例如，表达序列中的一种可包含功能性连接到两个不同ORF的启动子。

在使用两种或更多种多联体16的实施方案中，本文提供的多联体混合物可包括两种或更多种多联体16的混合物，其中每种各自的多联体16相对于彼此具有不同的表达序列12(即具有不同序列的核酸)。应当理解，多联体混合物可由第一类型的多个多联体16的第一子集(具有第一核酸序列的串联重复)和第二类型的多个多联体16的第二子集(具有不同于第一核酸序列的第二核酸序列的串联重复)形成，使得混合物包含第一子集和第二子集的多联体16。此外，在实施方案中，多联体混合物可包含第三类型的多联体16的第三子集(具有不同于第一核酸序列和第二核酸序列的第三核酸序列的串联重复)等。如所述的，在每个单独的子集中，多联体16的尺寸(碱基长度)和它们相应的串联重复数可以变化。

图6是根据本公开的实施方案的用于产生表达产物的技术的不同实施方式的示意图。在一些实施方案中，可能需要产生多种表达产物以形成复合物或彼此相互作用以形成最终所需的终产物。在表达工作流程期间，根据表达产物的类型或表达产物的所需定制或可变性，可将这些表达产物分成不同的表达媒介物(不同的多联体16，或在一些实施方案中，一种或多种多联体16和一种或多种质粒例如质粒80或质粒82的混合物)。

例如，某些类型的表达产物可包括可定制的核酸表达产物86。可定制的核酸表达产物86可通过使用具有定制的或所需的表达序列的模板14来产生。可能难以预测终用户可能感兴趣的特定核酸表达产物86。因此，如本文提供的试剂盒或表达产物生产系统87可将可定制的或更可变的区域分离成分开的模板14和多联体16，而不是将可变核酸表达产物86的核酸序列掺入包含更恒定或不变的其它所需的终产物的表达序列12中。以这种方式，更不变的表达产物88可作为预先制备的单独模板14或试剂盒组件的一部分提供，所述试剂盒组件将可定制表达产物86的表达序列12掺入不同的多联体16或质粒82中。在另一个实施方案中，可针对在应用之间不改变的更恒定或可预测的组分选择质粒，并可针对在应用之间可变或可定制的组分选择DNA多联体(从质粒或微环模板扩增)。下面参照图7-10讨论所述不同构建体的实例。

慢病毒

图7-8是慢病毒载体生产系统的示意图。慢病毒载体的产生可用于多种基因疗法应用，包括在CAR-T疗法的制备期间。特别地，使用本文公开的技术产生的慢病毒载体可用于产生CAR-T疗法细胞。在一个实施方案中，由所公开的技术产生的慢病毒载体的慢病毒转基因可编码嵌合抗原受体。

慢病毒具有线性单链RNA(ssRNA)基因组。在第二代慢病毒载体生产所描述的实施方案中，ENV蛋白(例如VSV-G)可由第一多联体的表达序列编码，侧接长末端重复(LTR)序列的所需转基因序列可为第二多联体的表达序列的一部分，并且包装蛋白可存在于具有编码GAG、POL、REV和TAT基因的ORF的第三多联体上(图7)。在第三代慢病毒生产的另一个布置中(图8)，包装蛋白进一步分成两个包装多联体，且GAG、POL存在于一个多联体上，而REV存在于另一个多联体上。

根据本公开，通过在HEK293T细胞中以化学计量比配制和转染RCA DNA(分别编码VSV-G包膜、GAG/POL、REV和GFP mRNA)的混合物实现功能性慢病毒的有效生产。通过RCA扩增编码GAG/POL (pLP1, Invitrogen)、REV (pLP2, Invitrogen)、VSV-G包膜(pLP/VSVG,Invitrogen)和包装GFP mRNA (pLenti-GFP, Cell Biolabs)的质粒以产生包含每个质粒的串联重复的高分子量、超支化多联体以评价成功的病毒载体生产。病毒载体可从活细胞或通过无细胞表达产生。

根据本公开，配制了包含多种核酸多联体的多联体混合物，其中所述多种核酸多联体的每一种之间具有限定的比率。共表达多联体混合物以产生多种表达产物，每种表达产物由相应的核酸多联体产生，其中多种表达产物中每一种之间的比率与多联体混合物中每种相应核酸多联体之间的定义比率成比例。

尽管公开的实施方案涉及用于产生慢病毒载体的多种多联体，但在其它实施方案中，也考虑多联体和质粒的混合物。在一个实施方案中，当编码其它组分的质粒构建体与转基因多联体共转染到共表达系统中时，使用多联体仅表达转基因。在另一个实施方案中，当编码其它组分的质粒与多联体混合物共转染到共表达系统中时，所需的转基因和ENV蛋白从两种不同多联体的混合物共表达。本技术可包括同时转染一种或多种包含慢病毒转基因的多联体以及具有病毒载体的其它组分的开放阅读框的任何质粒或多联体(一种或多种包装多联体或质粒；和一种包膜多联体或质粒)到表达系统中，例如HEK293T生产细胞或A293T细胞。共表达可以在细胞或无细胞中进行。

在某些实施方案中，将各个RCA产物以1:1:1:1的摩尔比混合并转染到HEK239T细胞中。在某些实施方案中，一个或多个RCA DNA多联体可被质粒DNA替代。可使用RCA DNA与质粒DNA的不同比率，例如分别具有1:3:3:3和3:1:1:1摩尔比的pLenti-GFP:LP1:LP2:LP3。在任一情况下，多联RCA DNA有效地与质粒DNA协同产生相当量的慢病毒。

腺伴随病毒(AAV)

野生型AAV具有大约4.7千碱基(kb)的线性单链DNA(ssDNA)基因组，在末端具有两个145个核苷酸长的反向末端重复体(ITR)。ITR侧接两种病毒基因——Rep(复制)和Cap(衣壳)，分别编码非结构和结构蛋白。Rep基因编码四种调节蛋白，Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。这些蛋白参与AAV基因组复制。Cap基因编码三种衣壳蛋白，VP1(病毒体蛋白1)、VP2和VP3。在AAV血清型中，AAV2最广泛地用于体外和体内基因递送。

AAV ITR含有涉及基因组拯救、复制和包装的所有顺式作用元件，并与反式作用病毒编码区(即Rep和Cap基因区)分离。在重组AAV (rAAV)载体设计中，顺式作用病毒DNA元件(例如ITR)可与目标序列连接，而Rep和Cap基因区可以反式提供。通常，通过用质粒(AAV顺式质粒，所述质粒含有由侧接AAV ITR的目的DNA构成的克隆重组AAV基因组)和以反式表达病毒Rep和Cap基因的不同质粒转染生产细胞产生rAAV颗粒。腺病毒辅助因子例如E1A、E1B、E2A、E4ORF6和VA RNA可通过腺病毒感染或将提供这些腺病毒辅助因子的第三质粒转染到生产细胞中来提供。如果HEK293细胞用作AAV生产细胞，则辅助因子包括E2A、E4ORF6和VARNA，因为HEK293细胞已经含有E1A/E1b基因。

生产重组AAV，特别是重组AAV2的一种技术依赖于将野生型腺病毒感染到含有AAVRep/Cap基因以及AAV载体DNA的细胞系中。另一种方法(无辅助方法)是基于在宿主细胞(例如HEK293细胞)中AAV生产所需的所有元件的无腺病毒瞬时转染。其涉及用3种质粒共转染AAV生产细胞：(1)AAV转移质粒，其中目的基因(例如“转基因”)置于两个ITR之间；(2)携带AAV Rep-Cap基因的质粒；和(3)提供从腺病毒分离的辅助基因的辅助质粒。这些基因(E4、E2a和VA)介导AAV复制。将转移质粒、Rep/Cap和辅助质粒转染到含有E1A/E1b基因的宿主细胞例如HEK293细胞中，以产生感染性AAV颗粒。

尽管使用野生型腺病毒可诱导的AAV生产细胞系的方法可以在培养物中扩大规模并生产具有非常高效价的AAV载体，但是从AAV产物中完全消除腺病毒是非常有挑战性的，并且就载体安全性和特异性而言，非常不期望野生型腺病毒被污染。另一方面，尽管瞬时转染方法产生不含腺病毒的高效价AAV载体，但该方法是劳动密集型且昂贵的。

此外，已经报道了在转染程序中来自不同质粒的单个细胞中AAV的重组共表达以广泛变化的比率表达。AAV cap基因以约1:1:10的化学计量编码三种结构蛋白(VP1、VP2和VP3)。为了实现这种所需的化学计量，产生AAV衣壳蛋白的重组方法通常利用复杂的启动子诱导和/或低拷贝数和高拷贝数质粒的组合来实现VP1、VP2和VP3的1:1:10表达比，例如在基于酵母的表达中。

根据本公开，已经使用一种或多种多联体证实了VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的化学计量表达。表达可在细胞中或无细胞中进行。在某些实施方案中，混合和补充核酸多联体可以在无细胞蛋白表达反应中以1:1:10的比率进行。

根据本公开，配制了包含多种核酸多联体的多联体混合物，其中所述多种核酸多联体的每一种之间具有定义的比率。共表达多联体混合物以产生多种表达产物，每种表达产物由相应的核酸多联体产生，其中多种表达产物中每种之间的比率与多联体混合物中每种相应核酸多联体之间的定义比率成比例。

在某些实施方案中，除所需的转基因外，多种核酸多联体中的每一种都分开地编码关键复制和病毒衣壳因子。在某些实施方案中，核酸多联体中的至少一种包含最小表达序列。最小表达序列可以经计算机设计并在体外合成(例如下面列出的SEQID #1-#3)。在另一个实施方案中，转基因(例如转基因有效负荷)存在于与一种或多种REP/CAP多联体分开的多联体上。此外，根据所需的表达系统，另一个多联体可包含一个或多个辅助序列。尽管所公开的实施方案涉及用于产生AAV载体的多种多联体，但在其它实施方案中，也考虑多联体和质粒的混合物。在一个实施方案中，当编码其它组分的质粒构建体与转基因多联体共转染到共表达系统中时，使用多联体仅表达转基因。在另一个实施方案中，当编码其它组分的质粒与多联体混合物共转染到共表达系统中时，所需的转基因和衣壳蛋白从两种不同DNA多联体的混合物共表达。本技术可包括同时转染一种或多种包含AAV转基因的多联体以及具有用于病毒载体的其它组分的开放阅读框的任何质粒或多联体。

CRISPR

图10是用II型CRISPR系统产生CRISPR/Cas9基因组编辑的共表达系统的示意图。当用于基因组编辑时，该系统包括Cas9、crRNA、tracrRNA以及用于非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)的DNA修复模板的任选区段。

CRISPR/Cas9常常使用质粒转染靶细胞。质粒的主要组分包括crRNA、tracrRNA、sgRNA、Cas9蛋白和修复模板。crRNA含有指导RNA，其定位宿主DNA的正确区段以及结合tracrRNA的区域。tracrRNA与crRNA结合并形成活性复合物。单指导RNA(sgRNA)是由tracrRNA和至少一个crRNA组成的组合RNA。可以将多个crRNA和tracrRNA包装在一起以形成单指导RNA(sgRNA)。该sgRNA可与Cas9基因连接在一起并制成质粒以转染到细胞中。一旦这些已经组装到质粒中并转染到细胞中，Cas9蛋白在crRNA的帮助下在宿主细胞的DNA中发现正确的序列，并且取决于Cas9变体，在DNA中产生单链或双链断裂。

本技术还可用于使用多联体16产生或制造靶向CRISPR/Cas9系统以代替常规的基于质粒的技术。第一和第二核酸多联体可以分别包含第一和第二表达序列。第一和第二表达序列之一包含编码目的蛋白(例如Cas9)的开放阅读框(ORF)和与开放阅读框可操作地连接的启动子。另一表达序列可包含编码crRNA、tracrRNA、sgRNA或修复模板的开放阅读框(ORF)。

抗体

免疫球蛋白或抗体包含特征化学计量的重链和轻链。例如，免疫球蛋白G (IgG)包含通过二硫键结合在一起的两条相同的重链和两条相同的轻链。产生免疫球蛋白的常规重组方法可能需要复杂地设计含有DNA、RNA或蛋白序列元件(例如不同启动子、内部核糖体进入位点、翻译后切割位点或不同强度的聚腺苷酸化信号)的单载体表达盒，以实现例如在CHO细胞中抗体重链和轻链所需的表达比率。轻链与重链多肽的表达比率已被认为是所需抗体的重组体产量以及限制不需要的聚集体和片段的关键参数。

本技术还可用于生产或制造抗体，其中通过使用预先确定比率的第一和第二核酸多联体以更流线型和更稳健的方式产生轻链与重链多肽的表达比，从而产生所需比率的轻链与重链多肽。在一个实施方案中，第一和第二核酸多联体可分别包含第一和第二表达序列，其中每个表达序列包含开放阅读框(ORF)和与开放阅读框可操作地连接的启动子。在某些实施方案中，第一和第二表达序列的ORF可各自分别编码抗体的重链和轻链。在某些实施方案中，表达序列之一可包含一个与超过一个ORF可操作地连接的启动子。例如，表达序列之一可包含功能性连接到两个不同ORF的启动子，一个ORF编码抗体的重链，而另一个ORF编码抗体的轻链。在另一个实施方案中，可配制多联体混合物以表达双特异性抗体，其中第一多联体编码包含第一抗体的轻链和重链结构域的第一表达序列，而第二多联体编码包含第二抗体的轻链和重链结构域的第二表达序列。

类病毒颗粒

本技术也可用于生产或制造类病毒颗粒。类病毒颗粒的非限制性实例包括HPV和Gardasil(人乳头瘤病毒四价6型、11型、16型和18型)疫苗。HPV编码两种衣壳蛋白，L1和L2。主要衣壳蛋白L1可自发装配成72-五聚体二十面体结构，其非常类似于天然病毒体。次要衣壳蛋白L2虽然不是衣壳形成所需的，但可以每个衣壳平均约36个L2分子存在(估计L1:L2比率为约9:1至11:1)。Gardasil(人乳头瘤病毒四价6型、11型、16型和18型)疫苗是四种不同L1衣壳体的重组VLP制剂，每种均各自由面包酵母单独表达。

第一和第二核酸多联体可分别包含第一和第二表达序列。第一和第二表达序列可包含分别编码第一和第二目的蛋白，例如衣壳蛋白L1和L2的开放阅读框(ORF)。每种表达序列还可包含与相应的开放阅读框可操作地连接的启动子。在某些实施方案中，表达序列之一可包含一个与超过一个ORF可操作地连接的启动子。例如，表达序列之一可包含功能性连接到两个不同ORF的启动子，一个ORF编码衣壳蛋白L1，而另一个ORF编码衣壳蛋白L2。

实施例

除非另有说明，否则实施例中描述的成分可从普通化学品供应商商购获得。在实施例部分中使用的一些缩写扩展如下：“mg”：毫克；“ng”：纳克；“pg”：皮克；“fg”：毫微微克；“mL”：毫升；“mg/mL”：毫克每毫升；“mM”：毫摩尔浓度；“mmol”：毫摩尔；“pM”：皮摩尔浓度；“pmol”：皮摩尔；“μL”：微升；“min.”：分钟和“h.”：小时。

实施例1：1:1:10 RCA混合物的腺伴随病毒(AAV)衣壳蛋白的化学计量表达

VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的化学计量表达通过在无细胞蛋白表达反应中以1:1:10的比率混合和补充RCA DNA来证明，如图11所示。经计算机设计分开编码VP1、VP2和VP3的最小表达序列并在体外合成(SEQ ID #1-#3)。

SEQ ID #1

CCGGGATCCTTCTTTAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTGCTGACGGATATCTGCCGGATTGGTTGGAAGATAACCTTAGCGAAGGTATACGAGAGTGGTGGGATTTGAAGCCAGGGGCACCAAAGCCGAAGGCAAATCAACAAAAGCAAGACGACGGACGTGGATTGGTGTTGCCGGGATATAAGTATTTGGGACCGTTTAACGGTCTTGATAAGGGCGAGCCAGTTAACGCAGCAGACGCTGCAGCATTAGAACACGATAAGGCATACGATCAACAACTTAAGGCGGGGGATAACCCTTACCTTCGTTACAATCACGCTGACGCCGAGTTTCAAGAAAGGTTGCAAGAAGATACGAGCTTTGGTGGTAACCTTGGACGAGCAGTGTTCCAAGCTAAGAAGCGGGTCCTAGAGCCGTTTGGACTTGTTGAAGAAGGCGCAAAAACAGCACCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCAAAGCCCACAAGAGCCGGATAGCTCCAGCGGAATTGGAAAGACTGGACAACAGCCGGCAAAGAAGCGTCTGAATTTTGGACAAACCGGTGATTCCGAGAGCGTACCAGATCCACAGCCGCTTGGTGAGCCACCAGCTACACCAGCAGCTGTTGGCCCTACGACAATGGCAAGCGGCGGTGGCGCACCAATGGCTGATAATAACGAAGGTGCAGACGGGGTTGGAAACGCAAGCGGAAATTGGCATTGTGATAGCACGTGGCTTGGGGATCGTGTTATCACGACGTCAACGAGAACGTGGGCACTTCCGACGTATAACAACCACTTGTACAAGCAAATTAGCTCGGCAAGTACGGGGGCAAGCAACGATAATCACTACTTTGGATATTCCACGCCGTGGGGATATTTTGATTTTAACCGCTTTCATTGTCACTTTAGCCCGCGTGATTGGCAACGGCTTATCAACAATAATTGGGGATTTCGACCGAAGCGGCTTAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAGGTCAAAGAAGTAACCACGAACGACGGTGTAACGACGATCGCCAATAATCTTACGAGCACGGTGCAAGTGTTTTCCGATTCTGAGTATCAACTTCCGTACGTCCTTGGTTCCGCACATCAAGGGTGTTTACCGCCTTTTCCGGCCGACGTTTTTATGATCCCGCAATACGGATACCTTACGCTAAATAACGGGTCCCAAGCAGTGGGAAGAAGCAGCTTCTATTGCCTTGAATATTTTCCAAGCCAAATGCTTCGGACCGGAAATAACTTTACCTTTAGCTATACGTTTGAAGACGTGCCGTTTCATTCGTCATACGCACATAGCCAAAGCCTAGATCGCCTTATGAATCCGTTGATCGATCAGTACCTTTACTATCTCAATCGCACGCAAAATCAAAGCGGATCAGCACAAAATAAAGACCTGCTGTTTAGCCGCGGATCTCCAGCTGGCATGAGCGTACAACCGAAGAATTGGCTTCCGGGACCCTGCTATAGGCAACAACGCGTAAGTAAGACGAAGACGGATAACAACAATAGCAACTTTACGTGGACAGGGGCTTCGAAGTACAATCTTAACGGAAGGGAATCCATTATTAACCCTGGCACAGCTATGGCTAGCCACAAAGACGATAAAGATAAGTTCTTTCCGATGTCCGGCGTCATGATTTTCGGAAAAGAGTCCGCAGGTGCATCGAATACGGCACTTGATAACGTAATGATCACGGACGAAGAAGAGATAAAGGCTACGAATCCGGTCGCAACAGAGCGATTCGGAACGGTTGCGGTAAATCTTCAATCGAGCAGCACAGATCCGGCAACTGGCGACGTCCACGTTATGGGCGCACTTCCCGGCATGGTCTGGCAAGATAGGGACGTGTACCTTCAGGGACCGATTTGGGCTAAGATACCGCATACAGACGGACATTTTCACCCAAGTCCGCTTATGGGGGGATTTGGATTAAAGCACCCGCCGCCGCAAATACTCATAAAGAACACACCGGTGCCAGCAAATCCGCCGGCAGAGTTTAGTGCAACGAAGTTTGCAAGCTTTATCACACAATACAGCACGGGACAAGTAAGCGTAGAGATCGAGTGGGAATTGCAAAAAGAGAATAGCAAGCGCTGGAATCCCGAAGTGCAATATACGTCCAACTACGCGAAGAGCGCAAACGTTGATTTCACGGTCGATAACAACGGACTTTATACGGAACCGCGTCCGATTGGAACGAGATATTTGACGCGACCGCTTTAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGCAGAGATCTCCG

SEQ ID #2

CCGGGATCCTTCTTTAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCACCTGGAAAGAAGCGACCGGTTGAGCAATCTCCGCAAGAGCCGGATAGCTCCAGCGGAATTGGAAAGACTGGACAACAACCGGCCAAGAAGCGATTGAATTTTGGACAAACGGGGGATTCCGAGAGTGTGCCTGATCCACAACCACTTGGCGAGCCACCAGCAACACCAGCTGCAGTTGGCCCGACAACAATGGCATCTGGCGGCGGCGCACCAATGGCTGATAACAACGAAGGGGCAGACGGTGTTGGAAACGCAAGCGGAAATTGGCATTGTGATTCGACGTGGCTTGGTGATAGGGTCATAACGACAAGCACGCGAACGTGGGCATTACCCACGTATAACAATCACCTCTACAAGCAAATTAGCAGCGCTAGCACTGGTGCATCGAACGATAACCACTACTTTGGGTATAGCACACCGTGGGGATATTTCGATTTTAATCGGTTTCACTGCCATTTTAGCCCAAGGGATTGGCAACGTCTTATCAACAATAACTGGGGATTTAGGCCTAAGCGCCTTAATTTCAAGCTGTTTAACATTCAGGTCAAAGAAGTAACGACGAACGACGGGGTGACGACGATCGCAAATAATCTTACGTCCACGGTGCAAGTTTTTAGCGATAGCGAGTATCAATTACCGTACGTGCTTGGAAGCGCACATCAAGGTTGTCTTCCACCGTTTCCGGCAGACGTCTTTATGATTCCGCAATACGGATACCTTACGCTTAATAACGGAAGCCAAGCTGTAGGTCGGTCTAGCTTTTACTGCCTTGAATACTTTCCGTCACAAATGCTTCGTACCGGAAACAACTTTACGTTTAGCTACACGTTTGAAGACGTGCCGTTTCACAGCTCGTACGCACATTCACAAAGCCTTGATCGCCTTATGAATCCGCTTATCGATCAATACCTCTATTATCTAAACCGGACGCAGAACCAATCGGGATCGGCACAAAACAAAGATTTGTTGTTTAGTCGCGGCAGTCCGGCTGGCATGAGCGTACAACCGAAGAATTGGTTGCCGGGTCCTTGTTATCGTCAACAACGCGTAAGCAAGACGAAGACAGATAACAATAACAGCAATTTTACTTGGACGGGGGCATCCAAGTATAATCTGAACGGACGTGAATCCATCATAAACCCCGGCACAGCTATGGCAAGCCACAAAGACGATAAAGATAAGTTCTTTCCGATGTCCGGCGTTATGATCTTTGGAAAAGAATCAGCTGGGGCAAGTAATACGGCGCTTGATAACGTCATGATAACCGACGAAGAAGAGATCAAGGCAACGAATCCGGTCGCAACGGAACGTTTTGGAACCGTTGCGGTCAATCTTCAATCCAGCAGCACAGATCCGGCAACTGGCGACGTACACGTAATGGGCGCACTTCCTGGCATGGTGTGGCAAGATAGAGACGTGTACCTTCAAGGGCCGATTTGGGCAAAGATACCGCATACGGACGGACACTTTCATCCATCCCCACTTATGGGTGGATTTGGACTTAAGCACCCGCCACCGCAAATTCTTATAAAGAACACGCCGGTACCAGCTAATCCGCCGGCTGAGTTTAGCGCAACCAAGTTTGCAAGCTTTATCACGCAATATTCCACGGGACAGGTAAGCGTTGAGATCGAGTGGGAACTTCAAAAAGAGAATAGCAAGCGCTGGAATCCGGAAGTCCAGTATACATCCAATTACGCGAAGAGCGCAAACGTCGATTTCACGGTGGATAATAACGGACTATACACGGAACCGAGACCGATTGGAACAAGGTATTTGACGCGACCGCTTTAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGCAGAGATCTCCG

SEQ ID #3

CCGGGATCCTTCTTTAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCATCTGGCGGCGGCGCACCAATGGCAGATAATAACGAAGGTGCAGACGGGGTTGGTAACGCTTCCGGAAATTGGCACTGTGATAGCACGTGGCTTGGTGATCGTGTGATCACAACAAGCACACGAACGTGGGCCTTACCGACGTACAACAATCACTTGTACAAGCAAATCAGCAGCGCATCCACAGGGGCATCTAACGATAACCACTATTTCGGATACAGCACGCCGTGGGGATATTTTGATTTTAACCGGTTTCACTGCCATTTTAGTCCCCGCGATTGGCAAAGACTGATCAACAACAATTGGGGATTTCGTCCGAAGCGACTTAATTTCAAGCTGTTCAACATACAAGTCAAAGAAGTGACGACGAACGACGGGGTTACGACGATAGCAAATAACCTAACGAGCACGGTGCAAGTATTTAGCGATAGCGAGTATCAACTTCCGTACGTACTTGGATCAGCACATCAAGGGTGCCTTCCACCGTTTCCGGCAGACGTTTTTATGATTCCGCAATACGGATACCTTACGTTGAATAACGGAAGCCAAGCAGTTGGAAGGTCCAGCTTCTACTGTCTTGAATACTTTCCCAGCCAAATGCTTCGCACTGGAAACAACTTTACCTTCAGCTATACATTTGAAGACGTGCCGTTTCATAGTAGCTACGCTCATAGCCAAAGCCTTGATCGACTTATGAATCCGCTTATTGATCAATACCTGTATTACCTCAATCGCACACAGAATCAATCCGGATCGGCACAAAACAAAGATTTGCTCTTTAGCCGCGGCTCACCAGCTGGCATGTCCGTTCAACCGAAGAATTGGCTTCCTGGACCGTGTTATCGTCAACAAAGGGTCTCCAAGACGAAGACGGATAACAACAACAGCAATTTTACGTGGACGGGTGCGAGTAAGTACAATCTTAACGGACGCGAGAGCATTATTAATCCTGGCACAGCAATGGCTAGCCACAAAGACGATAAAGATAAGTTTTTCCCGATGTCCGGCGTCATGATTTTTGGAAAAGAGAGTGCAGGTGCATCGAATACGGCACTAGATAACGTAATGATCACGGACGAAGAAGAAATCAAGGCCACGAATCCTGTAGCAACGGAAAGGTTTGGAACGGTTGCGGTGAATTTGCAAAGCAGCTCCACAGATCCAGCTACCGGCGACGTTCACGTAATGGGCGCATTACCCGGCATGGTCTGGCAAGATCGAGACGTATATCTTCAAGGTCCGATCTGGGCTAAGATTCCACATACTGACGGACACTTTCATCCAAGCCCTCTTATGGGTGGATTTGGACTTAAGCATCCGCCGCCGCAAATTCTCATCAAGAATACGCCGGTGCCGGCAAATCCACCAGCAGAGTTTAGCGCAACCAAGTTTGCTAGCTTTATCACGCAATATTCGACGGGACAAGTGAGCGTCGAGATAGAGTGGGAACTTCAGAAAGAGAACAGCAAGCGGTGGAATCCGGAAGTACAGTATACGAGCAATTACGCAAAGAGCGCAAACGTCGATTTTACCGTCGATAACAACGGGCTTTATACAGAGCCGAGACCGATAGGTACGCGGTATCTTACGCGTCCGCTTTAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGCAGAGATCTCCG

每个表达序列包含T7启动子和T7基因10前导核糖体结合位点，分别用于启动无细胞mRNA转录和蛋白翻译。用BamHI和BglII消化编码最小表达序列的双链DNA以产生互补突出端，用于分子内连接到DNA小环中，随后进行外切核酸酶处理(ExoI, ExoIII)以消化任何剩余的非环状DNA。然后使用滚环扩增(RCA)产生基本上由每种最小表达序列的串联重复组成的高分子量、超支化的多联体。如本文所提供，RCA可如美国专利号10,077,459和美国专利号9,938,568中所公开的来进行，所述专利的公开内容出于所有目的通过引用并入本文。RCA提供了实现偶联的体外转录和翻译反应的容易、经济和稳健的选项的益处。在加入连接的小环模板和400 μM dNTP之前，预先清理RCA试剂(包含水、反应缓冲液、40 μM引物和20ng/μL phi29 DNA聚合酶)的污染DNA。使用具有序列+N+N(atN)(atN)(atN)*N (AT六聚体)的六聚体引物进行扩增，并且将10 μM α-S-dATP包含在反应中以使所得RCA产物硫代化。使用Quant-It™ Picogreen® dsDNA测定试剂盒(ThermoFisher Inc)从100 μL的总RCA反应体积量化RCA产物，并且随后直接施加到无中间纯化的无细胞蛋白表达反应。为了实现VP1、VP2和VP3的化学计量表达，将各个RCA产物以1:1:10的质量比在Expressway^TM提取物(ThermoFisher Inc)中混合，使得每50 μL反应的总DNA含量为0.5 μg。为了对照的目的，通过向50 μL ExpressWay反应中加入0.5 μg各自的RCA DNA，在分开的无细胞反应中表达VP1、VP2和VP3(分别约82kD、66kD和60kD)。将Fluorotect^TM GreenLYS体外翻译标记(Promega)加入到所有无细胞表达反应中，以用荧光BODIPY-FL标记随机标记新生赖氨酸残基(经由反密码子UUU tRNA)。将所有无细胞表达反应在Eppendorf ThermoMixer(1200rpm)中在30℃孵育6小时，且随后通过SDS-PAGE分析以使用Typhoon可变模式成像仪(GE Healthcare)通过凝胶内荧光使所有BODIPY标记的翻译产物可视化。图11中呈现的数据证明了VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的化学计量表达，如供应给无细胞蛋白表达反应的RCADNA 的1:1:10比率所规定的。在某些实施方案中，编码装配活化蛋白(AAP)并以1:1:1:10比率(相对于VP1、VP2、VP3)表达的RCA产物可用于增强病毒衣壳装配和折叠。或者，编码VP3和AAP的RCA混合物可能足以驱动类病毒颗粒在体外的化学计量表达。

实施例2：从1:2 RCA混合物的免疫球蛋白链的化学计量表达

使用两种不同的RCA核酸多联体产物证明免疫球蛋白重链和轻链的化学计量表达。分开编码IgG重链和轻链的最小表达序列经计算机设计并在体外合成(SEQ ID #4-#5)。

SEQ ID #4

CCGGGATCCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTAATTCCGGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCACCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCAAGTGGGTCACCTTCATCTCCCTGCTGTTCCTCTTCTCGTCTGCCTACTCCGACATTCAAATGACACAGTCGCCGTCCTCCCTGTCCGCGTCCGTGGGTGATCGGGTCACCATTACTTGCCGGGCGTCGCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCACCTAAGCTCCTTATCTACGCGGCCAGCACACTTCAGAGCGGCGTGCCGTCAAGGTTCTCGGGGTCCGGATCAGGCACCGACTTCACTCTGACTATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAACGCTACAACAGAGCTCCCTACACGTTTGGTCAAGGCACCAAAGTGGAGATCAAGCGCACCGTGGCCGCCCCCTCGGTGTTCATCTTTCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCAGGAACTGCCTCCGTGGTCTGCCTGCTGAACAACTTCTATCCGCGCGAGGCTAAGGTGCAGTGGAAGGTCGACAACGCACTCCAGAGCGGAAACTCCCAGGAGTCCGTGACCGAACAGGACTCCAAGGATAGCACCTACTCACTCTCGTCCACCCTGACTTTGAGCAAGGCCGACTACGAAAAGCATAAGGTCTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGACTGTCCTCCCCTGTGACCAAGTCCTTCAATCGGGGGGAGTGTTAATAACATCTGACTGAAAAAAAAAAAGTTTAAACACTAGTCCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGCAGAGATCTCCG

SEQ ID #5

CCGGGATCCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTAATTCCGGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCACCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCAAGTGGGTCACCTTCATCTCCCTGCTGTTTCTGTTCTCCTCCGCATACTCGGAAGTCCAACTTGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGACGCAGCCTGAGACTGTCGTGTGCTGCGTCCGGATTCACTTTTGACGATTACGCTATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCCGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTGTCCGCCATCACTTGGAACAGCGGACACATCGACTACGCTGATTCTGTGGAGGGCCGCTTCACTATCTCGCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTTCAAATGAATTCCCTGCGGGCCGAGGATACTGCTGTGTACTACTGCGCCAAGGTGTCCTACCTGTCCACTGCGTCGTCACTCGACTACTGGGGCCAGGGCACGCTGGTCACCGTGTCCAGCGCGTCCACCAAGGGTCCGAGCGTGTTCCCGCTTGCCCCGTCATCGAAGTCTACCTCGGGCGGCACCGCCGCCCTCGGTTGCCTCGTCAAGGATTACTTCCCGGAGCCCGTGACTGTGTCCTGGAATAGCGGCGCCCTGACCTCGGGAGTGCACACATTCCCGGCGGTGCTGCAGTCAAGCGGTTTGTACTCCCTGTCGTCCGTCGTGACCGTGCCTAGCTCATCCCTGGGGACCCAGACCTACATTTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGTCGTGCGACAAGACCCATACCTGCCCTCCGTGCCCGGCCCCTGAGTTGCTCGGGGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCGCCGAAGCCTAAGGATACTCTTATGATTAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTCAGCCACGAGGACCCCGAAGTCAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTCCATAACGCCAAGACTAAGCCAAGGGAGGAGCAGTATAACAGCACTTACCGGGTGGTGTCAGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGACTGGCTCAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCACCCATTGAGAAGACCATTAGCAAGGCCAAGGGACAGCCACGGGAACCACAGGTGTACACCCTTCCCCCATCCCGCGACGAACTGACTAAGAACCAAGTGTCCCTCACCTGTCTCGTGAAGGGATTCTACCCGAGCGACATCGCAGTCGAGTGGGAATCGAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACGACTCCTCCGGTGCTGGACTCCGACGGTTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCTGTTATGCACGAAGCCTTGCACAACCACTACACACAGAAGTCACTCTCCCTGTCGCCCGGCAAGTAATAACATCTGACTGAAAAAAAAAAAGTTTAAACACTAGTCCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGCAGAGATCTCCG

表达序列包含来自脑心肌炎病毒(EMCV)的T7启动子和内部核糖体进入位点(IRES)，分别用于启动无细胞mRNA转录和蛋白翻译。用BamHI和BglII消化编码最小表达序列的双链DNA以产生互补突出端，用于分子内连接到DNA小环中，随后进行外切核酸酶处理(ExoI, ExoIII)以消化任何剩余的非环状DNA。然后使用滚环扩增(RCA)产生基本上由每种最小表达序列的串联重复组成的高分子量、超支化的多联体。如实施例1所述进行RCA和量化。使用Quant-It^TM Picogreen® dsDNA测定试剂盒(ThermoFisher Inc)从100 μL的总RCA反应体积量化RCA产物，并且随后通过乙醇沉淀纯化。为了实现化学计量表达，将分别编码轻链和重链的各个RCA产物以1:2的质量比在1步人偶联IVT提取物(ThermoFisher Inc)中混合，使得每25 μL反应的总DNA含量为125 ng。为了对照的目的，通过向25 μL 1步反应中加入125 ng各自的RCA DNA，在分开的无细胞反应中表达各个轻链和重链(分别约26kD和52kD)。将Fluorotect^TM GreenLYS体外翻译标记(Promega)加入所有无细胞表达反应中，以用荧光BODIPY-FL标记随机标记新生赖氨酸残基(经由反密码子UUU tRNA)。图12中呈现的数据证明了轻链和重链多肽的化学计量表达，如由供应给无细胞蛋白表达反应的RCA DNA的比率所规定的。无细胞蛋白表达反应可通过增加提取物的微粒体含量以促进最终IgG分子的信号肽加工和二硫键形成而进一步增强。

实施例3：用于功能性AAV病毒生产的RCA混合物的配制

重组AAV制造通常涉及将3种不同质粒(Rep/Cap质粒、辅助质粒和包装的DNA转基因质粒)同时转染到HEK293T生产细胞中。当制造用于临床试验的病毒载体时使用瞬时转染的惯例，因为与悬浮适应的细胞相比，治疗性病毒可以从贴壁依赖性生产细胞以高产率快速产生，通常具有更高的效价(没有显著的预优化)。然而，AAV的扩大规模制造受到制造质粒DNA的交付周期和费用的限制。在此，通过在HEK293T细胞中以1:1:1的比率配制和转染RCA DNA的混合物(编码Rep/Cap质粒、辅助质粒和GFP转基因质粒)显示了功能性AAV病毒载体的有效生产。使用RCA扩增编码Rep/Cap (pAAV-RC6, Agilent Genomics)、辅助质粒(pHelper, Agilent Genomics)和包装的DNA转基因质粒(pscAAV-GFP, Cell Biolabs)的质粒，如本文公开的进行和量化，以产生包含每种质粒的串联重复的高分子量、超支化的多联体。为了产生AAV颗粒，将各个RCA产物以1:1:1的质量或摩尔比混合，并使用DharmaFECTkB试剂将4 μg总DNA转染到HEK239T细胞中。为了对照的目的，将4 μg质粒DNA或RCA DNA的线性消化物(在多联体用ScaI内切核酸酶切割为双链单体之后)以类似1:1:1的比率转染到HEK293T细胞中。将DNA混合物与DharmaFECT在室温下预孵育10分钟，然后与HEK293T细胞孵育约20小时，接着将新鲜培养基提供给转染的细胞。在转染后3天，通过收获和洗涤细胞收集AAV粗裂解物，然后进行4个冻融循环(通过约-72℃的干冰/乙醇浴，随后在37℃水浴中温热)。通过离心(10,000g x 10min)去除细胞碎片，并将AAV粗裂解物与幼稚的HEK293T细胞以两种不同的终浓度(18％和2％)在新鲜培养基中孵育。转导后3天，通过流式细胞术，针对用于适当门控的合适对照量化GFP阳性细胞。图13中总结的数据表明，完整RCA多联体的AAV产量与质粒DNA相当。与使用多联形式和消化形式的1:1:1摩尔比的RCA DNA相比，1:1:1质量比的RCA DNA产生更少的病毒。比率比较显示1:1:1 DNA质量比降低了DNA混合物中最长编码DNA的相对量；因此，pHelper DNA可能限制病毒生产。在随后的实验中，将各个RCA DNA与各个质粒混合以通过转染评价1:1:1摩尔组合。在所有情况下，多联RCA DNA有效地与质粒DNA协作以产生相当量的AAV病毒，如图14所示。

实施例4：用于功能性慢病毒生产的RCA混合物的配制

通过在HEK293T细胞中以化学计量比配制和转染RCA DNA的混合物(分开地编码VSV-G包膜、Gag/POL、Rev和GFP mRNA)证明了功能性慢病毒的有效生产。通过RCA扩增编码Gag/POL (pLP1, Invitrogen)、Rev (pLP2, Invitrogen)、VSV-G包膜(pLP3, Invitrogen)和包装的GFP mRNA (pLenti-GFP, Cell Biolabs)的质粒，如本文公开的进行和量化，以产生包含每种质粒的串联重复的高分子量、超支化的多联体。使用具有序列+N+N(atN)(atN)(atN)*N (AT六聚体)的六聚体引物进行扩增，并且将10 μM α-S-dATP任选地包含在pLenti-GFP反应中以使所得RCA产物硫代化。为了产生慢病毒，将各个RCA产物以1:1:1:1的质量比混合，并使用DharmaFECT kB试剂将约3 μg总DNA转染到HEK239T细胞中。为了对照的目的，将约3 μg环状质粒或质粒的线性消化物(在用ScaI或PvuI内切核酸酶切割后)以类似1:1:1:1的比率转染到HEK293T细胞中。将DNA混合物与DharmaFECT在室温下预孵育10分钟，然后与HEK293T细胞孵育约20小时，接着替换为新鲜培养基。在转染后三天收集用过的培养基(含有慢病毒)，并在存在5 µg/mL聚凝胺的情况下转导幼稚的HEK293T细胞之前通过0.2μm注射器式过滤器过滤。病毒转导后约24小时，将新鲜培养基提供给细胞并再培养2-3天。随后收集细胞(转导后3-4天)，并通过流式细胞术针对合适的门控对照量化GFP阳性细胞。图15中总结的数据证明从完整RCA多联体产生了非优化的慢病毒。RCA产物或质粒的特定化学计量混合物是实例，并且慢病毒可使用替代化学计量混合物产生。例如，测试了RCA DNA混合物与质粒DNA的较高比率，具体地，分别为pLenti-GFP:LP1:LP2:LP3 1:3:3:3和3:1:1:1的摩尔组合。在任一情况下，多联RCA DNA有效地与质粒DNA协同产生相当量的慢病毒，如图15所示。

多联体产生和多联体表达产物

本文提供了使用多联体(例如多联体16)产生所需表达产物的技术，所述表达产物可包含一种或多种蛋白或核酸。所得表达产物可在表达后收集(例如纯化、收获)并用作受试者的治疗或疗法方案的一部分。本公开的实施方案包括从如本文提供的多联体产生一种或多种表达产物，并使用产生的表达产物治疗受试者。例如，所公开的技术可用于产生编码所需转基因的病毒载体。因此，如本文提供的表达产物可为病毒载体的一部分，所述病毒载体包含具有编码所需转基因的表达序列的核酸且可用作基因疗法方案的一部分，所述基因疗法方案中用病毒载体治疗受试者。因为转基因是基于受试者的疗法需要选择的，所以转基因可为病毒载体生产系统的可变的或可定制的组分，而病毒载体生产系统的其它组分是恒定的或较少可变的。此外，病毒载体的某些组分可基于所需的向性或患者特征来选择。因此，本文提供了包括病毒载体生产系统的预制或预生产部分以及试剂和前体分子的试剂盒，所述部分是恒定的或选自几种可能的选项，以允许用户产生系统的可定制部分。

在另一个实施方案中，可使用多联体表达产物产生定制抗体。在另一个实施方案中，可使用多联体表达产物产生CRISPR/Cas9系统。在另一个实施方案中，可以使用多联体表达产物产生类病毒颗粒。虽然已经公开了包括与基因编辑、基因疗法和定制分子相关的产物表达的某些实施方案，但是应当理解，所公开的技术可用于产生用于其它应用的合适的表达产物。这些包括多亚基蛋白复合物(例如人DNA聚合酶α是1:1:1:1比率的4个不同亚基的复合物)，和可以进行生物化学途径的不同步骤的酶组合。

在整个说明书中，特定术语的示例应被认为是非限制性实例。单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。如在整个说明书和权利要求书中使用的近似语言可应用于修饰任何可允许变化而不导致与其相关的基本功能改变的定量表示。

本公开可使用核酸扩增技术作为产生表达产物的工作流程的一部分。如本文所用，术语“引物”是指与靶核酸序列(例如待扩增的DNA模板)杂交以引发核酸合成反应的短线性寡核苷酸。引物可以是RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或嵌合序列。引物可含有天然的、合成的或经修饰的核苷酸。根据经验确定引物长度的上限和下限。引物长度的下限是在核酸扩增反应条件下与靶核酸杂交时形成稳定双链体所需的最小长度。非常短的引物(通常小于3个核苷酸长)在这种杂交条件下不与靶核酸形成热力学稳定的双链体。上限常常由靶核酸中除预先确定的核酸序列以外的区域中形成双链体的可能性决定。通常，合适的引物长度在约3个核苷酸长至约40个核苷酸长的范围内。

如本文所用，术语“随机引物”是指引物序列的混合物，其通过使寡核苷酸序列中任何给定位置处的核苷酸随机化而产生，以这样的方式使得给定位置可由任何可能的核苷酸或其类似物组成(完全随机化)。因此，随机引物是寡核苷酸序列的随机混合物，由序列内核苷酸的每种可能的组合组成。例如，六聚体随机引物可由序列NNNNNN或(N)₆表示。六聚体随机DNA引物由4个DNA核苷酸(A、C、G和T)的每种可能的六聚体组合组成，产生包含4⁶ (4,096)个独特六聚体DNA寡核苷酸序列的随机混合物。当靶核酸序列未知或用于进行全基因组扩增反应时，随机引物可有效地用于引发核酸合成反应。随机引物在引发和产生双链滚环扩增(RCA)产物而不是单链RCA产物方面也是有效的，这取决于引物的浓度。

如本文所用，术语“核苷酸类似物”是指在结构上类似于天然存在的核苷酸的化合物。核苷酸类似物可具有改变的磷酸骨架、糖部分、核碱基或其组合。核苷酸类似物可为天然核苷酸、合成核苷酸、经修饰的核苷酸或替代置换部分(例如肌苷)。通常，具有改变的核碱基的核苷酸类似物尤其赋予不同的碱基配对和碱基堆积特性。如本文所用，术语“LNA(锁定核酸)核苷酸”是指核苷酸类似物，其中核苷酸的糖部分含有锁定在核糖核酸(RNA)模拟糖构象中的双环呋喃糖单元。从化学角度来看，从脱氧核糖核苷酸(或核糖核苷酸)到LNA核苷酸的结构变化是有限的，即在2'位置和4'位置的碳原子之间引入另外的键(例如2'-C,4'-C-氧基亚甲基键；例如参见Singh, S. K.等人, Chem. Comm., 4,455-456, 1998或Koshkin, A. A.等人, Tetrahedron, 54, 3607−3630, 1998.))。LNA核苷酸中呋喃糖单元的2'和4'位置可通过O-亚甲基键(例如氧基-LNA: 2'-O, 4'-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核苷酸)、S-亚甲基(硫代-LNA)或NH-亚甲基部分(氨基-LNA)等连接。这种连接限制了呋喃糖环的构象自由度。LNA寡核苷酸对互补单链RNA和互补单链或双链DNA显示增强的杂交亲和力。LNA寡核苷酸可诱导A型(类RNA)双链体构象。具有改变的磷酸-糖骨架的核苷酸类似物(例如PNA、LNA)常常尤其修饰链特性，例如二级结构形成。在字母命名前的星号(*)表示由字母命名的核苷酸是硫代磷酸修饰的核苷酸。例如，*N表示硫代磷酸修饰的随机核苷酸。字母命名前的加(+)号表示由字母命名的核苷酸是LNA核苷酸。例如，+A表示腺苷LNA核苷酸，而+N表示锁定的随机核苷酸(即随机LNA核苷酸)。如本文所用，术语“硫代磷酸核苷酸”或“硫代核苷酸”是指具有改变的磷酸骨架的核苷酸，其中糖部分通过硫代磷酸酯键连接。在寡核苷酸序列的磷酸骨架中，硫代磷酸酯键含有硫原子作为非桥接氧原子的替代物。这种修饰可使核苷酸间键对核酸酶降解具有抗性。硫代核苷酸(硫代dNTP)可包括但不限于α-S-dGTP、α-S-dCTP、α-S-dATP或α-S-dTTP。

如本文所用，术语“滚环扩增(RCA)”是指经由滚环机制扩增环状核酸模板(例如单链/双链DNA环)的核酸扩增反应。滚环扩增反应通过引物与环状(常常是单链)核酸模板的杂交而启动。然后，通过在环状核酸模板周围连续前进，以反复复制核酸模板的序列(滚环机制)，核酸聚合酶延伸与环状核酸模板杂交的引物。滚环扩增通常产生包含环状核酸模板序列的串联重复单元的多联体。滚环扩增可为表现出线性扩增动力学的线性RCA (LRCA)(例如使用单一特异性引物的RCA)，或者可为表现出指数扩增动力学的指数RCA (ERCA)。滚环扩增也可使用产生超支化多联体的多重引物(多重引物滚环扩增或MPRCA)进行。例如，在双引物RCA中，一个引物可与环状核酸模板互补(如在线性RCA中一样)，而另一个可与RCA产物的串联重复单元核酸序列互补。因此，双引物RCA可作为具有指数扩增动力学的链反应进行，其特征在于涉及引物和两条链的多重杂交、引物延伸和链置换事件的系列级联。这常常产生一组离散的多联的双链核酸扩增产物。RCA可在体外在等温条件下使用合适的核酸聚合酶例如Phi29 DNA聚合酶进行。合适的聚合酶具有链置换DNA合成能力。在某些实施方案中，可以使用包含核苷酸类似物的随机引物混合物进行滚环扩增。

如本文所用，术语“滚环扩增(RCA)产物”或“RCA产物DNA”是指其中环状核酸模板(例如单/双链DNA环)经由滚环扩增反应机制扩增的核酸扩增产物。模板的尺寸相对于RCA产品较小。滚环扩增通常产生包含环状核酸模板序列的串联重复单元的多联体。滚环扩增产物DNA可通过表现出线性扩增动力学的线性RCA (LRCA)(例如使用单一特异性引物的RCA)或通过表现出指数扩增动力学的指数RCA(ERCA)产生。滚环扩增产物DNA也可通过使用多重引物(多重引物滚环扩增或MPRCA)产生，其中滚环扩增产物DNA是超支化多联体。在双引物RCA中，一个引物可以与环状核酸模板互补(如在线性RCA中一样)，而另一个可与RCA产物DNA的串联重复单元核酸序列互补。RCA产物DNA可通过RCA在体外在等温条件下使用合适的核酸聚合酶例如Phi29 DNA聚合酶产生。

DNA扩增技术例如滚环扩增(RCA)可用于从环状核酸模板开始产生大量高质量的DNA。滚环扩增可产生包含相应环状核酸模板的串联重复单元的核酸多联体。核酸多联体可为线性或分支多联体。

如本文所用，术语“核酸多联体”(例如如本文公开的多联体16)是指具有核酸序列(例如表达序列12)的串联重复或串联重复单元的核酸分子。术语“多联体”、“核酸多联体”和“DNA多联体”在整个公开中可以互换使用。多联体可为单链或双链的。如本文所用，术语“双链多联体DNA”是指含有串联连接的相同DNA序列的多个拷贝的双链DNA分子。从RCA产生的多联体可大于1千碱基(kb)、大于10kb、大于150kb。在一个实施方案中，多联体可在50kb-150kb的范围内。多联体的尺寸与起始模板(例如模板14)的尺寸和串联重复的数目有关，其可能变化。因此，对模板溶液进行的RCA可以产生具有相同序列的串联重复但具有可变数目的串联重复并因此具有可变长度的多联体库。在某些实施方案中，核酸多联体可包含多个串联重复序列，其中多个串联重复序列中的每一个都包含编码表达产物的表达序列。

在某些实施方案中，核酸多联体是DNA多联体。DNA多联体可使用DNA小环作为模板产生，其中DNA小环基本上由最小表达序列组成。所得多联体含有衍生自DNA小环的最小表达序列的串联重复。在某些实施方案中，最小表达序列基本上由启动子、不依赖帽的翻译元件和开放阅读框组成。在某些实施方案中，核酸多联体包含经修饰的核苷酸、核苷酸类似物或其组合。

如本文所用，术语“表达序列”或“表达序列的重复单元”(例如表达序列12)是指能够表达RNA和/或蛋白的DNA序列。因此，表达产物包含蛋白、RNA或其混合物。

在寻求蛋白表达的某些实施方案中，表达序列可包含具有表达能力的单元，其包含开放阅读框(ORF)和可操作地连接到开放阅读框的启动子。在一个实施方案中，ORF可编码一种或多种蛋白。被编码的蛋白可以相同或不同。在一些实施方案中，表达序列可包含一个与多于一个ORF可操作连接的启动子。

在寻求RNA表达的某些实施方案中，表达序列可包含具有RNA表达能力的单元，其包含至少一个启动子和转录终止序列。

多联体序列的重复单元可以包括启动子、开放阅读框、核糖体结合位点和翻译终止序列。它可另外含有实质上不影响RCA产物的体外转录和/或翻译的序列。例如，它可进一步包含例如翻译增强子序列、绝缘子序列或转录终止序列的序列。

合适的启动子的许多实例是本领域已知的，包括例如T7 RNA聚合酶启动子序列或衍生自病毒例如CMV或SV40的启动子序列。

同样，合适的核糖体结合位点的许多实例是本领域已知的，包括例如内部核糖体进入位点(IRES)、polyA片段、不依赖于物种的翻译前导序列(SITS)，Kozak共有序列和Shine-Dalgarno序列。绝缘子序列通常提高核糖体结合或翻译起始的效率。本领域中存在许多合适的绝缘子序列的实例，包括例如编码多组氨酸片段的序列。在一些实施方案中，可通过在核糖体结合位点周围插入间隔序列或通过在表达的蛋白的N-末端优化或插入密码子凭经验确定绝缘子序列。在某些实施方案中，表达序列可包含polyA序列、转录终止序列、绝缘子序列或其组合。

在某些实施方案中，表达序列的开放阅读框可包含密码子优化的序列、纯化标签序列、衍生自IRES的氨基末端肽融合序列、用于蛋白酶切割或核苷酸切割的序列或其组合。在一些实施方案中，表达序列包含编码序列和非编码序列。

开放阅读框的密码子优化序列可提高RCA产物的翻译速率或质量。密码子优化通常通过增加目的基因的翻译效率来改善蛋白表达。还可通过优化定制设计的基因内的密码子使用来增加基因的功能性。在密码子优化实施方案中，物种中的低频密码子可被高频密码子取代，例如，对于亮氨酸，低频密码子UUA可被高频密码子CUG取代。密码子优化可增加mRNA稳定性并因此调整蛋白翻译或蛋白折叠的速率。此外，密码子优化可以定制转录和翻译控制、修饰核糖体结合位点或稳定mRNA降解位点。

表达序列的开放阅读框可包含用于纯化表达产物(例如表达的蛋白)的纯化标签序列。标签序列可为亲和标签、用于蛋白酶切割的标签或其组合。亲和标签可用于重组蛋白的快速纯化和检测。

表达序列的开放阅读框可包含衍生自IRES的氨基末端肽融合序列以增强核糖体识别。

在一些实施方案中，表达序列含有编码序列，其中编码序列在真核细胞中编码或产生所需的蛋白表达产物。编码序列是含有特定目的基因的核酸序列。通常，编码序列包含启动子和开放阅读框(ORF)。编码序列可任选地包含不依赖帽的翻译元件(CITE)。在一些实施方案中，编码序列进一步包含核糖体结合位点。编码序列可包含位于开放阅读框外但在表达序列内的转录终止子序列。

在一个或多个实施方案中，多个串联重复序列中的每一个都包含至少一个表达序列。在一些实施方案中，所述至少一个表达序列包含至少一个编码序列。在这样的实施方案中，所述至少一个表达序列的至少一个编码序列包含至少一个启动子和至少一个开放阅读框。在一些实施方案中，多个串联重复序列中的每一个包含两个或更多个表达序列。包括编码序列的所述两个或多个表达序列可编码相同的蛋白或不同的蛋白。在一些实施方案中，表达序列包含与至少一个开放阅读框功能性连接的至少一个启动子。例如，一方面，在表达序列中，一个启动子与一个开放阅读框功能性连接。另一方面，在表达序列中，一个启动子与两个不同的开放阅读框功能性连接。在一些实施方案中，表达序列可包含与两个或更多个开放阅读框功能性连接的两个或更多个启动子。

表达序列可包含可操作地连接到两个不同开放阅读框(例如第一开放阅读框和第二开放阅读框)的启动子，每一个所述开放阅读框都编码彼此不同的蛋白。在该实例中，单个启动子经由不依赖帽的翻译元件与两个开放阅读框功能性连接。每个开放阅读框包含翻译起始和翻译终止序列。表达序列需要翻译终止或终止序列，否则可能合成无限的多蛋白，这是不期望的。然而，转录终止密码子对于导致在转录时产生多顺反子mRNA的第一开放阅读框可以是任选的。在这种情况下，可选择第一和第二开放阅读框之间的插入序列，使得在体内蛋白表达时，即使产生单个多顺反子mRNA，它也可以翻译为两种不同的蛋白。通过翻译第一开放阅读框合成第一蛋白之后可以是核糖体滑动到第二开放阅读框的第二翻译起始序列，以启动从第二开放阅读框合成第二蛋白。这可通过在第一和第二开放阅读框之间并入“自切割序列”来实现。合适的自切割序列(例如病毒P2A基序)有助于从一个单一mRNA产生两种或更多种蛋白。

在一些实施方案中，表达序列含有非编码序列，其中非编码序列产生所需的RNA表达产物。这样的表达序列不含有任何编码序列。非编码序列包含启动子和转录终止序列。非编码序列通常缺乏开放阅读框。含有非编码序列的表达序列也称为RNA表达序列。在一些实施方案中，表达序列基本上由非编码序列组成。在一些其它实施方案中，表达序列包含编码序列和非编码序列，其中RNA可由表达序列的非编码序列产生。在这样的实施方案中，所需蛋白也可随后从相同表达序列的编码序列产生。在一些实施方案中，可从真核细胞中提取产生的RNA用于不同的下游应用。在一个实施方案中，提取的RNA可随后包装到慢病毒系统中以在另一个细胞中递送。非编码序列可包括但不限于反义RNA、短干扰RNA (siRNA)、短发夹RNA (shRNA)、微小RNA (miRNA)、微小RNA模拟物、转运RNA (tRNA)、核糖体RNA (rRNA)或其组合的序列。非编码序列还可包括CRISPR RNA (tracrRNA、crRNA、sgRNA或gRNA)、小核RNA (snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)、Piwi相互作用RNA (piRNA)、端粒酶RNA、剪接体RNA、增强子RNA、反转录转座子、X无活性特异性转录物(Xist)、由RNA聚合酶I和RNA聚合酶III编码的RNA或其组合。

如所述的，编码序列和非编码序列都包含启动子。本领域已知的任何合适的启动子，包括例如T7 RNA聚合酶或CMV启动子序列，可用于本文所述的方法中。同样，可使用本领域已知的任何合适的核糖体结合位点，包括但不限于IRES、polyA片段、不依赖于物种的翻译前导序列(SITS)，Kozak共有序列和Shine-Dalgarno序列。

开放阅读框包含翻译起始和翻译终止序列。在一些实施方案中，开放阅读框包含用于增强翻译的密码子优化序列。开放阅读框可包含用于增强核糖体识别的衍生自内部核糖体进入位点(IRES)的氨基末端肽融合序列、用于纯化所需蛋白的标签序列或其组合。CITE可包含IRES、翻译增强元件(TEE)或其组合。

所需蛋白可通过标签序列纯化，其中标签序列可为用于亲和纯化的融合标签、用于蛋白酶切割的标签或其组合。用于亲和纯化的融合标签可用于表达蛋白的快速纯化和检测。这些标签也称为亲和标签。亲和标签可包括多组氨酸标签、谷胱甘肽S-转移酶标签(GST)、血细胞凝集素(HA)、myc(衍生自c-myc基因产物)、FLAG(由包括肠激酶裂解位点的8个氨基酸Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Ly组成)或其组合。融合标签有助于所需蛋白的快速纯化或检测，然而，标签可能不被认为是重组蛋白的永久固定物或结构域。因此，重组蛋白结构和功能的高度分析性研究常常需要去除融合标签。通过使用另一种类型的标签(例如蛋白酶切割标签)，可从蛋白中去除用于纯化的标签。蛋白酶切割标签可用于切割特定蛋白或肽序列内的独特肽键。蛋白酶切割标签可包括，例如，PreScission^TM蛋白酶标签(GE Healthcare Life Sciences)或凝血酶蛋白酶标签(GE Healthcare Life Sciences)。

如所述的，编码序列的开放阅读框可包含密码子优化的序列，其中密码子优化的序列是通过考虑不同因素(例如密码子偏倚、背景(contextual)密码子偏好和/或各个密码子的偏好)产生的。开放阅读框的密码子优化序列可提高RCA产物的翻译速率或质量。密码子优化通常通过增加目的基因的翻译效率来改善编码序列的蛋白表达。还可通过优化定制设计的基因内的密码子使用来增加基因的功能性。在密码子优化实施方案中，物种中的低频密码子可被高频密码子取代，例如，对于亮氨酸，低频密码子UUA可被高频密码子CUG取代。密码子优化可增加mRNA稳定性并因此调整蛋白翻译或蛋白折叠的速率。此外，密码子优化可定制转录和翻译控制、修饰核糖体结合位点或稳定mRNA降解位点。

转录终止序列通常位于DNA模板中基因的3'末端。转录终止序列在新合成的mRNA中提供信号以启动从转录复合物中释放mRNA的过程，这也有助于所需蛋白产物的有效翻译。绝缘子序列通常增加核糖体结合或翻译起始的效率。可使用本领域中存在的合适的绝缘子序列的许多实例，包括例如编码多组氨酸片段的序列。在一些实施方案中，可通过在核糖体结合位点周围插入间隔序列或通过在表达的蛋白的N-末端优化或插入密码子凭经验确定绝缘子序列。

在一些实施方案中，表达序列包含编码序列、非编码序列或其组合。编码序列包含启动子、开放阅读框和任选的不依赖帽的翻译元件(CITE)。编码序列的不依赖帽的翻译元件(CITE)可为内部核糖体进入位点(IRES)、翻译增强元件(TEE)或其组合。可对编码序列的开放阅读框进行密码子优化以增强翻译。开放阅读框还可包含用于纯化所需蛋白的标签序列、用于增强核糖体识别的衍生自IRES的氨基末端肽融合序列或其组合。表达序列还包括polyA序列、转录终止序列、绝缘子序列或其组合。

在一些实施方案中，表达序列是缺乏质粒在宿主细胞中增殖所需的任何外源序列的最小表达序列。用于表达所需蛋白的最小表达序列至少包含启动子、核糖体结合位点和翻译终止序列。用于表达所需RNA的最小表达序列至少包含启动子、核糖体结合位点和翻译终止序列。在一些实施方案中，双链RCA产物DNA基本上由最小表达序列的串联重复组成。在这样的实施方案中，表达序列可另外含有实质上不影响使用RCA产物DNA作为模板的体内蛋白表达或RNA表达的序列。例如，它可进一步包含例如翻译增强子序列、绝缘子序列或转录终止序列的序列。RCA产物DNA的最小表达序列不包含任何外源序列，例如抗生素选择基因，或在宿主细胞中克隆、选择、筛选和/或复制所需的任何其它附属序列。RCA产物可为含有最小表达序列的串联重复的线性或分支多联体。RCA产物DNA的最小表达序列可衍生自仅包含最小表达序列的DNA小环。

双链多联体DNA可进一步包含含肌苷的核苷酸、锁定核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸、2-氨基-脱氧腺苷、2-硫代-脱氧胸苷、聚阳离子核苷酸或其组合。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸(例如含肌苷的核苷酸、锁定核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸、2-氨基-脱氧腺苷、2-硫代-脱氧胸苷、聚阳离子核苷酸)是用于滚环扩增的引物序列的一部分。

多种方法可用于制备用于所公开技术的DNA小环模板。在一些实施方案中，可将线性DNA模板环化以产生DNA小环模板。在一个示例性实施方案中，线性DNA模板的环化可通过酶促反应实现，例如通过与连接酶例如DNA连接酶一起孵育。在一些实施方案中，线性DNA模板的末端与核酸序列杂交，使得末端紧密接近。然后与连接酶一起孵育可实现杂交的线性DNA模板的环化，以产生DNA小环。合适的DNA小环模板也可通过使用合适的PCR引物对较大DNA(例如基因组DNA或来自DNA文库的DNA)的一部分进行PCR扩增，然后环化PCR产物来产生。DNA小环也可通过化学合成合适的线性寡核苷酸，然后环化合成的寡核苷酸来产生。在一些实施方案中，合成的线性寡核苷酸可基本上由最小表达序列组成，并经由DNA连接酶实现环化以产生DNA小环。

本文提供了可用于产生表达产物(例如表达产物26)的表达系统(例如表达系统20)。表达系统20可为基于细胞的表达系统(例如哺乳动物、昆虫)或无细胞表达系统。基于细胞的表达系统的实例包括基于CHO、NIH3T3、BHK、HepG2和HEK 293细胞的表达系统。

在某些实施方案中，“无细胞表达系统”是指体外转录和翻译系统。无细胞表达通常涵盖两种模式：(1)在单一反应中制备mRNA和蛋白或(2)在第一个反应中制备mRNA，并将所得mRNA产物加入第二个分开的翻译反应中。衍生自DNA小环的RCA产物可用于任一模式(1)或(2)。例如，在一个实施方案中，可将RCA产物提供给“偶联的体外转录-翻译反应”，其中RCA产物DNA被转化为mRNA，而该mRNA在具有产生RNA和蛋白的能力的一种反应混合物中同时表达为蛋白。在另一个实施方案中，可将RCA产物提供给“连接的转录-翻译反应”，其中首先将RCA产物DNA转化为mRNA，而将mRNA单独加入翻译反应混合物中以表达蛋白。在某些实施方案中，将多联体提供给未经处理(或未经任何进一步处理)的无细胞表达系统。在一个实施方案中，在扩增例如RCA后直接将多联体加入到无细胞系统中。术语“进一步处理”意指包括多联体的限制性消化、连接或其组合的行为。然而，在一些实施方案中，在进行无细胞表达之前(例如使用真核细胞提取物)可分离RCA产物(例如通过沉淀)以从反应介质中去除盐或任何其它污染物(例如引物或较小片段化的DNA)。

无细胞表达系统可为体外翻译、无细胞蛋白表达、无细胞翻译或无细胞蛋白合成系统。无细胞表达系统的非限制性实例是无真核细胞表达系统。在某些实施方案中，在将多联体DNA置于无细胞表达系统之前，可将多联体DNA固定在基质上。体外表达重组产物后，可从无细胞表达系统中回收基质固定的多联体DNA；并重新用于随后的体外转录和翻译反应。

可通过任何方法将多联体DNA(例如双链多联体DNA)递送至真核细胞表达系统，所述方法包括但不限于电穿孔、声致穿孔、穿刺转染、转导、光学转染、磁转染、核转染、流体动力学递送、热休克介导的基因递送、纳米颗粒介导的基因枪递送、磷酸钙介导的递送、阳离子聚合物介导的递送或脂质体介导的递送。

在一些实施方案中，提供了包含含有多个串联重复序列的外源双链多联体DNA的真核细胞。在一个实施方案中，多个串联重复序列中的每一个都包含硫代磷酸核苷酸，其中硫代磷酸核苷酸与总核苷酸的比率为至少1:1600。用于转染到真核细胞中以产生所述细胞的外源双链多联体DNA可为未加工的或经加工的RCA产物DNA。真核细胞可为原生动物、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

所公开的实施方案的技术效果包括使用核酸多联体改善所需表达产物的表达，所述核酸多联体的尺寸通常与所需表达产物的稳健转染和生产无关。此外，虽然多联体可包含未知或可变数目的串联重复的表达序列，但是不同的多联体可例如基于摩尔比按比率地共表达，以产生预测的和稳健比率的所得表达产物。本公开证明，具有一种或多种所需表达产物的核酸表达序列的多联体可替代传统表达技术(例如质粒)和/或与传统表达技术(例如质粒)结合使用，以产生具有改善的纯度和稳健的共表达的所需表达产物。此外，核酸多联体可用于产生更复杂的结构或组件，其中多个共表达产物彼此缔合。

前述实施例说明了本公开的一些特征，并且是从所有可能的实施方案的集合中选择的实施方案。虽然本文仅示出和描述了某些特征，但是受益于本公开的本领域技术人员将能够做出修改/改变以优化参数。因此，前述实施方案在所有方面都被认为是说明性的，而不是限制本文所述的实施方案。当提供范围时，这些范围包括其间的所有子范围。

本书面描述使用实施例，包括最佳模式，并且还使本领域的任何技术人员能够实践所公开的实施方案，包括制造和使用任何设备或系统以及执行任何并入的方法。可授予专利的范围由权利要求限定，并且可包括本领域技术人员想到的其他实例。如果这些其他实例具有与权利要求的文字语言没有区别的结构元素，或者如果它们包括与权利要求的文字语言无实质性区别的等同结构元素，则这些其他实例旨在处于权利要求的范围内。

Claims (19)

1. 一种方法，其包括：

配制包含彼此具有预定义比率的至少第一核酸多联体和第二核酸多联体的多联体混合物，其中所述第一核酸多联体包含第一核酸序列的串联重复，而其中所述第二核酸多联体包含第二核酸序列的串联重复；且

共表达所述多联体混合物以由第一核酸序列产生第一表达产物和由第二核酸序列产生第二表达产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其包括使用滚环扩增产生第一核酸多联体和第二核酸多联体。

3.根据权利要求2所述的方法，其包括使用滚环扩增以扩增环状或质粒DNA以产生第一核酸多联体和/或第二核酸多联体。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中第一串联重复和/或第二串联重复是所述环状或质粒DNA的至少一部分的串联重复。

5.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其包括用所述多联体混合物转染培养的细胞以引起共表达，或其中所述共表达在无细胞表达系统中。

6.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其中所述第一核酸多联体、所述第二核酸多联体或两者的长度超过10kb。

7.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其包括收集所述第一表达产物和所述第二表达产物。

8.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其中所述第一核酸多联体或所述第二核酸多联体中的一个或两者在所述共表达之前未经处理。

9.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其中所述第一表达产物是病毒的包膜蛋白或包装蛋白，而所述第二表达产物包含所述病毒的转基因，其中所述第一表达产物和所述第二表达产物形成用于递送所述转基因的病毒载体。

10.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其中所述第一表达产物是核酸产物而所述第二表达产物是蛋白产物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一表达产物与所述第二表达产物形成复合物。

12.根据上述权利要求中一项或多项所述的方法，其中所述第一表达产物作用于所述多联体混合物中的第三核酸多联体。

13. 一种方法，其包括：

配制包含预定义比率的至少两种核酸多联体的混合物，其中每种所述核酸多联体中包含两种或更多种核酸序列的串联重复；且

共表达所述多联体混合物以由所述混合物中的每种核酸多联体产生两种或更多种表达产物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述多联体混合物中的各个多联体的核酸序列包含多个表达序列，当表达所述多个表达序列以产生所述两种或更多种表达产物时，产生多种蛋白。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述多联体混合物中的各个多联体的核酸序列包含多个表达序列，当表达所述多个表达序列以产生所述两种或更多种表达产物时，产生包含至少一种蛋白表达产物和至少一种核酸表达产物的混合物。

16.一种方法，其包括：

使用链置换滚环扩增来扩增包含第一核酸序列的至少一种模板以产生包含所述第一核酸序列的串联重复的第一多联体；

使所述第一多联体与包含第二核酸序列的串联重复的第二多联体接触以形成多联体混合物，所述多联体混合物具有所述第一核酸多联体与所述第二核酸多联体的预定义比率；且

共表达所述多联体混合物以由所述第一核酸序列产生第一表达产物和由所述第二核酸序列产生第二表达产物，其中所述第一表达产物与所述第二表达产物的比率和所述多联体混合物中所述第一核酸多联体与所述第二核酸多联体的预定义比率成比例。

17.根据权利要求16所述的方法，其包括允许所述第一表达产物与所述第二表达产物形成复合物。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述第一表达产物和所述第二表达产物包含来自相同病毒的不同病毒产物，例如腺病毒或慢病毒。

19.根据权利要求16-18中一项或多项所述的方法，其中所述第一表达产物包含病毒mRNA而所述第二表达产物包含多种病毒包装蛋白。

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