CN117778286A - 一种用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合及其制备方法和应用。所述工程菌包括含有外源sacB基因的大肠杆菌；所述工程质粒含有antiSacB元件。本发明设计特定的工程菌和工程质粒，在大肠杆菌的基因组中插入外源sacB基因，工程菌对蔗糖不耐受，而工程质粒能够解除工程菌的蔗糖敏感性，因而，在基因工程领域，可以以工程质粒为目的基因的表达载体，工程菌为表达宿主，可利用含有蔗糖的培养基，筛选成功导入目的基因的工程菌，无需使用抗生素标记。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合及其制备方法和应用。
背景技术
天然质粒是在许多细菌中发现的一类独立于染色体的环状DNA分子，能持续稳定地游离于染色体外自主复制，是基因克隆中最常见的载体分子。质粒本身可以携带外源目的基因用于质粒DNA基因治疗药物的开发，也是mRNA等细胞与基因治疗药物的基本原料，在医药领域具有极为广泛的应用。
目前质粒筛选标记通常是抗生素抗性基因，但质粒的制备过程中使用抗生素筛选具有一定不足，由于质粒在细菌间存在横向转移的可能，质粒携带的抗性基因以及DNA片段可能会在细菌细胞间转移，导致耐药性基因的扩散，阻碍抗生素的临床应用，因此，携带有耐药性基因的质粒作为CAR-T、mRNA等细胞与基因治疗药物的基本原料具有一定的风险。开发无抗生素筛选标记的方法逐渐引起人们重视，如CN102604983A公开了一种无质粒、无抗生素抗性筛选标记的基因工程菌的构建方法，该方法以pXKF3T5b质粒为载体，将目的基因转化到宿主细胞中，然后依次通过表达整合酶辅助质粒的去除、整合载体中的卡那霉素抗性基因的去除、三氯生诱导染色体进化和进化菌的发酵筛选等步骤，得到一种无质粒、目的基因拷贝数高的基因工程菌，且由于pXKF3T5b质粒的筛选标记是大肠杆菌本身的fabI基因(编码烯酰-乙酰基载体蛋白还原酶)，是三氯生抗性基因，因此所得到的工程菌无抗生素抗性筛选标记，不会引起环境中抗生素耐药菌泛滥。
综上所述，在构建工程菌时，质粒的筛选标记有着巨大的作用，构建完成的质粒需要转化入宿主菌中进行扩增与表达，而通过质粒自身筛选标记，可以将含有质粒的工程菌与不含质粒的细菌中迅速区分出来，减少了大量的筛选工作量。与此同时，减少抗生素的使用也有利于自然生态环境的保护和减缓微生物的耐药性进展。因此，一种非抗生素标记在重组工程菌的筛选中的应用意义重大。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合及其制备方法和应用，设计特定的工程菌和工程质粒，二者可组合使用，工程菌本身蔗糖不耐受，而导入工程质粒能够使工程菌具备蔗糖耐受性，从而可基于此进行筛选，无需使用抗生素标记。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合，所述工程菌包括含有外源sacB基因以及aadA基因的大肠杆菌；所述工程质粒含有antiSacB元件。
本发明中设计特定的工程菌和工程质粒，在大肠杆菌的基因组中插入外源sacB基因，基因sacB为蔗糖敏感基因，在大肠杆菌中表达分泌型2,6-对-D-果聚糖6-3-D-果糖基转移酶。在含有蔗糖的培养基中，该酶会催化蔗糖形成高分子量果聚糖，引起细胞毒性，导致细胞死亡。antiSacB元件可表达一段抑制SacB基因表达的RNA，此RNA可与SacB基因的mRNA结合，抑制SacB基因的正常转录和翻译，使得2,6-对-D-果聚糖6-3-D-果糖基转移酶不能正常表达，从而解除蔗糖对菌株的毒性，即，工程菌本身蔗糖不耐受，而工程质粒能够解除工程菌的蔗糖敏感性，因而，在基因工程领域，可以以工程质粒为目的基因的表达载体，工程菌为表达宿主，可利用含有蔗糖的培养基，筛选成功导入目的基因的工程菌，无需使用抗生素标记，可有效应用于应用于mRNA药物、基因治疗药物、细胞治疗药物等过程中的质粒生产。
优选地，所述所述工程菌中还含有外源抗性基因，所述抗性基因包括aadA等，aadA基因是外源性链霉素抗性基因，该基因的插入使大肠杆菌具备链霉素抗性，aadA基因可用于菌株表型鉴定，但并不是必须插入的基因，此外，aadA基因可用KanR基因、Amp基因等其余抗性基因代替。
优选地，所述大肠杆菌包括大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli Top10、E.coliJM108、E.coli XL10、E.coli JM109、E.coli Stable或E.coli stbl3等中任意一种。
优选地，所述工程质粒的出发质粒包括pVAX1、pUC57、pBBR1MCS、pET、pTT5或pCDNA3.1等中任意一种。
可以理解，本发明中所述sacB基因、aadA基因均为本领域技术人员知晓的基因序列，具备相同功能的序列均适用于本发明。
优选地，所述sacB基因的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
优选地，所述aadA基因的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
优选地，所述antiSacB元件的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列，本发明设计antiSacB元件，该序列为与E.coliK-12(GenBank:CP047127.1)基因组中sacB基因的启动子区域的反向互补序列，其转录出来的RNA能结合在sacB基因的启动子区域从而抑制该基因的正常转录和翻译。
优选地，所述工程质粒的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。
SEQ ID NO.1：
atgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactactgcactgctggcaggaggcgcaacccaagcgtttgcgaaagaaacgaaccaaaagccgtataaggaaacttacggcattacccatatcacccgccatgatatgctgcaaatccctgaacagcaaaaaaatgaaaaatatcaagtgcctgaattcgatcagtccaaaattaaaaatatctcttctgcaaaaggcctggacgtttgggacagctggccattacaaaacgctgacggcacagtcgcaaattatcacggctaccacatcgtctttgcattagccggagaccctaaaaatgcggatgatacatcgatttacatgttctatcaaaaagtcggcgaaacttctattgacagctggaaaaacgctggccgcgtctttaaagacagcgacaaattcgatgcaaatgattcaatcctgaaagaccaaacacaagaatggtctggttcagctacatttacatctgacggaaaaattcgtttattctacactgatttctccggtaaacattacggtaaacaaacactgacaactgcacaagtgaacgtatcaacatcagacagctctctgaacatcaacggtgtagaggattataaatcaatctttgacggtgacggcaaaacgtatcaaaatgtacaacagttcatcgatgagggcaactacagctccggtgataaccatacgctgagagatcctcactacgtagaagataaaggccacaaatacttagtatttgaagcaaacactggaactgaagacggctaccaaggcgaagaatcattatttaacaaagcatactatggcaaaagcacatcattcttccgccaagaaagtcaaaaacttctgcaaagtgataaaaaacgcactgctgaattagctaacggcgcactgggcatcattgagctaaacgatgactacacactgaaaaaagtgatgaaaccgctgattgcatctaacacagtcacagatgaaatcgaacgcgcgaacgtctttaaaatgaatggcaaatggtatctgttcactgattcccgcggatcaaaaatgacgatcgacggcatcacatctaatgacatttacatgcttggttatgtttctgattccttaactggcccatacaagccgctgaacaaaacaggccttgtgttaaaaatggatcttgatcctaacgatgtgacctttacttattcacactttgctgtgcctcaagctgaaggaaacaatgtcgtgattacaagctacatgacaaatagaggcttctatgcagacaaacaagcaacgtttgcgccaagcttcctgttgaacatcaaaggcaagaaaacgtctgttgtaaaagacagcatccttgaacaaggacaattaacaattaacaaataa。
SEQ ID NO.2：
atgagggaagcggtgatcgccgaagtatcgactcaactatcagaggtagttggcgtcatcgagcgccatctcgaaccgacgttgctggccgtacatttgtacggctccgcagtggatggcggcctgaagccacacagtgatattgatttgctggttacggtgaccgtaaggcttgatgaaacaacgcggcgagctttgatcaacgaccttttggaaacttcggcttcccctggagagagcgagattctccgcgctgtagaagtcaccattgttgtgcacgacgacatcattccgtggcgttatccagctaagcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattcttgcaggtatcttcgagccagccacgatcgacattgatctggctatcttgctgacaaaagcaagagaacatagcgttgccttggtaggtccagcggcggaggaactctttgatccggttcctgaacaggatctatttgaggcgctaaatgaaaccttaacgctatggaactcgccgcccgactgggctggcgatgagcgaaatgtagtgcttacgttgtcccgcatttggtacagcgcagtaaccggcaaaatcgcgccgaaggatgtcgctgccgactgggcaatggagcgcctgccggcccagtatcagcccgtcatacttgaagctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcctcgcgcgcagatcagttggaagaatttgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaaggtagtcggcaaataa。
SEQ ID NO.3：
taatgatttttatcaaaatcattaagttaaggtagatacacatcttgtcatatgatcaaatggtttcgccaaaaatcaataatcagacaacaagatgtgcgaactcgatattttacacgactctctttaccaattctacttgcagggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccgg。
SEQ ID NO.4：
tctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttctcgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagctctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgataatgatttttatcaaaatcattaagttaaggtagatacacatcttgtcatatgatcaaatggtttcgccaaaaatcaataatcagacaacaagatgtgcgaactcgatattttacacgactctctttaccaattctacttgcagggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccggtcagaattggttaattggttgtaacattattcagattgggcttgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcg。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合的制备方法，所述制备方法包括：
将sacB基因插入到大肠杆菌的基因组中，得到所述工程菌；
将antiSacB元件插入到出发质粒中，得到所述工程质粒。
第三方面，本发明提供第一方面所述的用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合在筛选工程菌中的应用。
第四方面，本发明提供一种筛选工程菌的方法，所述方法包括：
将目标基因插入到第一方面所述工程质粒中，得到重组质粒，将所述重组质粒转化入所述工程菌中，将转化后的工程菌在含有蔗糖的培养基中培养，挑选生长的单菌落即为含有重组质粒的工程菌。
优选地，所述培养基中蔗糖的浓度为10％～50％(质量百分比)，优选为11％、12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、42％、45％、46％、48％或49％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明中设计特定的工程菌和工程质粒，在大肠杆菌的基因组中插入外源sacB基因，sacB基因在大肠杆菌中表达分泌型2,6-对-D-果聚糖6-3-D-果糖基转移酶，在培养基中含有蔗糖的条件下，会导致菌株毒性，即，工程菌本身蔗糖不耐受，而工程质粒能够解除工程菌的蔗糖敏感性，因而，在基因工程领域，可以以工程质粒为目的基因的表达载体，工程菌为表达宿主，可利用含有蔗糖的培养基，筛选成功导入目的基因的工程菌，无需使用抗生素标记。
附图说明
图1为大肠杆菌基因组插入sacB和aadA基因片段示意图；
图2为pCMBI-B04质粒图谱；
图3A为不含质粒的E.coli DH5αc于LB培养基上培养结果图；
图3B为不含质粒的E.coli DH5αc在含有20％蔗糖的LB培养基上培养结果图；
图3C为含有pCMBI-B04质粒的E.coli DH5αc于含有20％蔗糖的LB培养基上培养结果图；
图4为pCMBI-B04-A质粒图谱。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例构建工程菌和工程质粒。
1、工程菌构建
以E.coli DH5α为出发菌株，利用基因重组技术在大肠杆菌DH5α基因组中插入含sacB基因(SEQ ID NO.1)以及aadA基因(SEQ ID NO.2)(示意图如图1所示)，得到工程菌，命名E.coli DH5αc，其具有硫酸链霉素抗性，且对蔗糖敏感，具体实验过程包括：
(1)通过基因合成获得sacB基因(SEQ ID NO.1)，aadA基因(SEQ ID NO.2)；
(2)通过PCR扩增从E.coli DH5α基因组上扩增获得插入位点(ybhB基因与ybhC基因之间序列区域)上游300bp片段(命名为同源臂A)以及插入位点下游300bp片段(命名为同源臂B)；
(3)通过重叠PCR法将同源臂A、sacB基因、aadA基因、同源臂B这4个片段依次首尾相连扩增获得插入基因片段(结构为5’-同源臂A-sacB基因-aadA基因-同源臂B-3’)，用于后续进行Red同源重组；
(4)通过基因合成获得质粒pKD46，将质粒转化E.coli DH5α制备菌株pKD46-DH5α，菌株接种至50mL LB培养基中，30℃培养至OD600＝0.2，加入0.5％L-阿拉伯糖，继续30℃诱导培养至OD600＝0.5，收集菌体，制备pKD46-DH5α电转化感受态细菌；
(5)500ng插入基因片段与200μLpKD46-DH5α电转化感受态细菌混匀后，置于0.2cm电转杯中，电转仪设置参数为电压2500V，电阻200Ω，电容25μF；电击完成后，迅速加入含有L-阿拉伯糖的LB培养基1mL，30℃复苏2h后涂布至链霉素平板；
(6)采用菌落PCR法鉴定插入片段是否成功整合至E.coli DH5α基因组，筛选获得阳性克隆；
(7)阳性克隆接种于5mL LB培养基中42℃过夜培养，消除pKD46质粒，通过平板分纯以及表型鉴定，即可筛选获得丢失pKD46质粒的阳性克隆，此克隆即为菌株E.coli DH5αc，其具有硫酸链霉素抗性，且对蔗糖敏感。
2、工程质粒构建
以pVAX1为出发质粒，将antiSacB片段(SEQ ID NO.3)(也可使用相似度30％以上的序列)作为载体序列的一部分构建质粒，得到重组质粒pCMBI-B04，图谱如图2所示，具体实验过程包括：
(1)通过基因合成获得antiSacB片段(SEQ ID NO.3)；
(2)通过PCR扩增从pUC57质粒上扩增获得ori序列，基因合成获得beta-gal-1+NeoR/KanR序列；
(3)E.coli DH5αc在LB平板上划线后，挑取1株单克隆菌株接种至50mLLB培养基中，37℃培养至OD600＝0.4后，用0.05M浓度的CaCl2溶液洗涤制备E.coli DH5αc化学转化感受态细菌；
(4)antiSacB片段、ori序列、beta-gal-1+NeoR/KanR序列这3片段采用《ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒》(Vazyme，货号C115)进行同源重组，重组反应液转化E.coli DH5αc化学转化感受态细菌，并涂布KanR抗性平板；
(5)通过抗性平板筛选、菌落PCR以及Sanger测序法，在平板上筛选获得序列正确的重组质粒pCMBI-B04以及pCMBI-B04-DH5αc菌株，并对菌株pCMBI-B04-DH5αc进行表型鉴定，鉴定其对蔗糖是否敏感。
在含有20％蔗糖的LB培养基上进行培养，结果如图3A-图3C所示，图3A为不含质粒的E.coli DH5αc于LB培养基上正常生长；图3B为不含质粒的E.coliDH5αc在含有20％蔗糖的LB培养基上无法生长；图3C为含有pCMBI-B04质粒的E.coli DH5αc于含有20％蔗糖的LB培养基上正常生长。
实施例2
以pCMBI-B04为出发质粒，删除质粒上的NeoR/KanR抗性序列，得到重组质粒pCMBI-B04-A，图谱如图4所示，具体实验过程包括：
(1)通过PCR扩增从pCMBI-B04质粒上扩增获得除NeoR/KanR抗性序列以外的其余载体序列，命名为pCMBI-B04-A扩增产物；
(2)E.coli DH5αc在LB平板上划线3次后，挑取1株单克隆菌株接种至50mL LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.4后，用0.05M CaCl2溶液洗涤制备E.coli DH5αc化学转化感受态细菌；
(3)pCMBI-B04-A扩增产物转化E.coli DH5αc化学转化感受态细菌，并涂布于含有20％蔗糖的LB固体培养基平板上；
(4)通过平板筛选、菌落PCR以及Sanger测序法，在平板上筛选获得序列正确的重组质粒pCMBI-B04-A。
在基因工程领域，可以以工程质粒为目的基因的表达载体，工程菌为表达宿主，可利用含有蔗糖的培养基，筛选成功导入目的基因的工程菌，无需使用抗生素标记，可有效应用于应用于mRNA药物、基因治疗药物、细胞治疗药物等过程中的质粒生产。
综上所述，本发明设计特定的工程菌和工程质粒，在大肠杆菌的基因组中插入外源sacB基因，sacB基因在大肠杆菌中表达分泌型2,6-对-D-果聚糖6-3-D-果糖基转移酶，在培养基中含有蔗糖的条件下，会导致菌株毒性，即，工程菌本身蔗糖不耐受，而工程质粒能够解除工程菌的蔗糖敏感性，因而，在基因工程领域，可以以工程质粒为目的基因的表达载体，工程菌为表达宿主，可利用含有蔗糖的培养基，筛选成功导入目的基因的工程菌，无需使用抗生素标记。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合，其特征在于，所述工程菌包括含有外源sacB基因大肠杆菌；所述工程质粒含有antiSacB元件。
2.根据权利要求1所述的用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌E.coliDH5α、E.coliTop10、E.coliJM108、E.coli XL10、E.coliJM109、E.coli Stable或E.coli stbl3中任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合，其特征在于，所述工程质粒的出发质粒包括pVAX1、pUC57、pBBR1MCS、pET、pTT5或pCDNA3.1中任意一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合，其特征在于，所述sacB基因的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合，其特征在于，所述工程菌还含有抗性基因；
优选地，所述抗性基因包括aadA基因、KanR基因或Amp基因中任意一种；
优选地，所述aadA基因的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合，其特征在于，所述antiSacB元件的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
7.根据权利要求1-6任一项所述的用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合，其特征在于，所述工程质粒的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。
8.一种权利要求1-7任一项所述的用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将sacB基因插入到大肠杆菌的基因组中，得到所述工程菌；
将antiSacB元件插入到出发质粒中，得到所述工程质粒。
9.权利要求1-7任一项所述的用于非抗生素筛选的工程菌和工程质粒组合在筛选工程菌中的应用。
10.一种筛选工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
将目标基因插入到权利要求1-7任一项所述工程质粒中，得到重组质粒，将所述重组质粒转化入所述工程菌中，将转化后的工程菌在含有蔗糖的培养基中培养，挑选生长的单菌落即为含有重组质粒的工程菌。
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