KR860001820B1 - 마크로라이드 유도체의 제조방법 - Google Patents

마크로라이드 유도체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

마크로라이드 유도체의 제조방법
본 발명은 마이코플라즈마의 감염증 치료에 유용한 다음 일반식(1)의 신규 마크로라이드 유도체 및 그의 산부가염의 제조방법에 관한 것이다.
Figure kpo00001
상기식에서
R은 포르밀 또는 하이드록시메틸이고;
R1은 수소 또는 C1-6알카노일이며;
R2는 수소 또는
Figure kpo00002
(여기에서 R3는 수소 또는 C1-6알카노일이다)이고, 단 R1또는 R3중의 하나는 수소가 아니어야 한다.
신규의 개선된 항생물질이 끊임없이 요구되고 있다. 인체의 질병 치료에 유용한 항생물질외에도, 또한 수의 분야에서도 개선된 항생물질을 필요로 하고 있다. 효능의 증가, 항균역의 확대, 생체내효율의 증가 및 약제학적 성질의 개선(예, 보다 좋은 경구흡수, 더 높은 혈중 또는 조직농도, 더 길어진 체내반감기, 및 더욱 유리한 배설률 또는 배설경로 및 대사율 또는 대사의 형식)이 개선된 항생물질의 몇가지 목표이다.
마크로신 및 락테노신은 미합중국 특허 명세서 제3,326,759호에 기술된 항생물질이다. 마크로신 및 락테오신의 구조는 다음과 같다.
Figure kpo00003
락테노신:R2=h
본 발명에 따라, 신규의 마크로라이드 유도체 및 그의 산부가염이 각종 병원균의 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
R1은 바람직하게는 수소, 아세틸 또는 프로피오닐이고 R3는 바람직하게는 수소, 아세틸, 프로피오닐, n-부티릴 또는 이소발레릴이다.
특정 유도체는 티로신에 대해 저항력 있는 미생물에 대해서 활성이 있다. 몇몇 마크로신 에스테르를 티로신 보다 경구적으로 흡수가 더 잘되며, 경구투여후 티로신 보다 혈중농도를 더 높인다.
일반식(1)에 입체화학적 구조가 표시되어 있지 않지만, 입체화학은 마크로신의 경우와 같다.
본 발명의 화합물은 마크로신 또는 락테노신을 아실화 효소계(들)의 존재하에 아실 공여체와 접촉시켜 세포 또는 효소제제의 형으로 제조할 수 있다.
다음의 유기체들은 본 발명화합물의 제조에 적절한 아실화효소를 가지고 있다:
스트렙토마이세스 서모톨러란스(Streptomyces thermotolernas)균주 ATCC 11416(한국기탁번호:KFCC-10084, 기탁일:1984.4.27, 기탁기관:한국종균협회) 및 NRRL 15270(한국 기탁번호:KFCC-10085, 기탁일:1984.4.27, 기탁기관:한국종균협회) 및 스트렙토마이세스 펀지사이디커스 아종 에스피노마이세티커스(Streptomyces fungicidicus subsp. espinomyceticus) ATCC 21574(한국 기탁번호:KFCC-10086, 기탁일:1984.4.27, 기탁기관:한국종균협회).
R이 포르밀인 일반식(1)의 화합물이 본 발명의 바람직한 화합물이다. 이들 화합물은 처음에 생체전환 반응으로 제조된다. "C-20-디하이드로"로 불리워지는 R이 하이드록시메틸인 일반식(1)의 화합물은 R이 포르밀인 일반식(1)의 화합물의 화학적 또는 생화학적 환원에 의해 제조된다.
R2가
Figure kpo00004
인 일반식(1)의 화합물은 마크로신 유도체이다.
본 발명의 바람직한 그룹인 이들 화합물은 마크로신을 생체전환에서 기질로 사용하여 제조한다.
R2가 수소인 일반식(1)의 화합물은 락테노신 유도체이다. 이 락테노신 유도체는 생체전환 반응에 락테노신을 사용하거나, 상응하는 마크로신 유도체로부터 마이카로즈 그룹을 산 가수분해하여 제조할 수 있다. 이러한 형태의 산가수분해 방법은 본 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 공정을 수행하는 경우, 전환효소를 생성하는 유기체는 일반적으로 스트렙토마이세스 속의 균주 배양에 사용된 방법으로 배양시키지만, 전환 효소의 완전한 아실화 효능을 얻기위한 조건을 채택한다. 배양기는 바람직하게는 포도당, 맥아당, 서당, 전분 또는 맥아엿, 알코올(예, 에탄올 및 글리세틸), 식물성 및 동물성 유지(油脂) 및 왁스, 유기산(예, 아세트산 및 시트르산) 및 이들 산의 염과 같은 탄소원을 포함한다. 그런데 그런 탄소원으로, 기타의 동화할 수 있는 성분을 사용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 또는 2개 이상을 조합하여, 사용된 탄소원에 따라 일반적으로 0.5 내지 10g/dι, 바람직하게는 2 내지 6g/dι의 농도로 사용할 수 있다. 질소원으로는 카제인, 펩톤, 제분품(대두, 옥수수, 면실 및 효모와 세균의 제제로 제조)과 같은 동물, 식물 및 미생물질의 단백질이 풍부한 유기화합물, 암모늄 염과 같은 각종의 통상적인 무기화합물 또는 유기체로 동화할 수 없는 기타의 질소가 풍부한 화합물이 있다.
질소원도 또한 단독으로 또는 배지와 조합하여 0.1 내지 10g/dι의 농도로 사용할 수 있다. 유기질소원으로서 바람직한 농도는 1 내지 6g/dι이고, 무기원의 농도는 더 낮다. 배지는 또한 부기염(예, 인산염, 마그네슘염, 광염), 증식촉진용 물질(예, 효모즙, 육즙) 및 비타민 또는 비타민이 풍부한 물질을, 유기체 및 나머지배지 조성물에 따라 0.01 내지 0.5g/dι의 농도로 함유한다.
통기 교반법으로 유기체를 통기적으로 배양시킨다. 배지의 pH는 약 4.5 내지 약 9.0, 바람직하게는 6 내지 8의 범위내로 유지시킨다. 약 20 내지 40℃에서 유지시키는데, 스트렙토마이세스 서모톨러란스의 바람직한 온도 범위는 30° 내지 40℃가 된다.
아실화 효소는 증식기의 초기에 생성되어 증식이 중지된 후에도 유지된다. 3-하이드록실그룹의 아실화는 증식초기의 세포로 가장 용이하며, 4"-하이드록실 그룹의 아실화는 증식말기에서 정지기까지의 세포로가장 용이하다.
아실화는 배양기내 또는 배지로부터 분리한 후의 증식 세포 또는 휴지기의 세포로 수행할 수 있거나, 예를 들어 건조세포 또는 세포균질물 또는 세포균질물에서 수득한 상청액과 같은 각종효소 제제로 수행할 수 있다. 아크릴아미드 중합체에 고정된 것과 같은 고정효소 제제 또는 고정미생물도 또한 사용할 수 있다.
티로신의 경우, 2개의 효소계가 독립적으로 아실화에 포함된다. 이 효소는 아실그룹을 3- 및 4"-하이드록실 그룹으로 전환시키므로 "마크로라이드 3-아실 전이효소" 및 마크로라이드 4"-아실 전이효소"라고 명명하였다. 이들 효소계는 특정아실 그룹을 더 좋아한다. 마크로라이드 3-아실 전이효소는 바람직하게는 아세틸 및 프로피오닐그룹 순으로 전이시키는 반면 마크로라이드 4"-아실 전이 효소는 이소발레릴, n-부티릴 및 프로피오닐 그룹순으로 전이시킨다.
조효소 A(CoA)는 아실 그룹의 일반적인 담체이며, 아실 CoA는 병합해야할 아실 그룹의 직접공여체로 제공된다. 대표적인 아실 CoA의 전구화합물은 세포대사를 통해 세포내에서 생성된다. 사용된 아실 CoA로는 바람직하게는 아세틸 CoA, 프로피오닐 CoA, n-부티릴 CoA 및 이소발레릴 CoA가 있으며, 그의 전구화합물로는 아세트산, 프로피오산, n-부티르산 및 이소발레르산과 같은 유기산 및 이들의 염(예, 칼륨염, 나트륨염 및 암모늄염등), 에스테르(예, 메틸에스테르 및 에틸에스테르 등) 및 아미드가 있다. 또한 아미노산(예, α-아미노-부티르산, 노르발린, L-로이신) 및 케토산(예, α-케토부티르산 및 α-케토발레르산)도 포함된다.
일반적으로 CoA 및 아실전구물질로 아실 CoA를 생성시키는 능력이 부족한 효소계로 반응을 수행할때, 아실 CoA를 반응배지에 가한다. 아실 CoA 생성계(예, 세포증식조건 등)가 효과적일 때는 아실 전구물질을 단독으로 사용할 수 있다. 일반적으로 반응 배지에 가해진 아실 공여체의 양은 그 공여체가 아실 CoA이면, 대략 항생물질의 기질에 상당하는 양이다. 전구물질이 사용되면, 몰비가 더 큰 화합물(예, 3 내지 10몰)이 필요하다.
생세포는 탄소원으로부터 각종 대사 순환계를 거쳐 아세틸 CoA를 생성할 수 있으므로, 충분한 량의 탄소원이 존재하면, 일반적으로 내생성 아세틸 CoA를 사용함으로써 아세틸화가 일어난다. 그런 반응계에서, 프로피오닐 CoA 및 기타 CoA는 아세틸 CoA 보다 훨씬 소량생성되며, 전자로부터 아실화된 생성물의 소량만이 반응혼합물에 존재한다.
아실 CoA가 반응에 사용되면, CoA는 통상의 CoA 분리법으로 반응배지로부터 회수할 수 있으며, 회수한 CoA는 아실 CoA의 합성에 다시 사용할 수 있다.
마크로신 또는 락테노신을 수용액, 약산성 수용액 또는 반응에 역효과를 미치지 않는 용매(예, 메탄올 및 에탄올) 중의 용액과 같은 형태로 반응혼합물에 가한다. 그런 용매의 혼합물(예, 메탄올 및 물)도 또한 사용할 수 있다. 이 기질은 또한 현탁제, 슬러리 또는 미세분말로 가할 수 있다. 반응 혼합물중 마크로신 또는 락테노신의 농도는 일반적으로 약 0.1 내지 50g/ι, 바람직하게는 0.5 내지 30g/ι이다.
아실화 반응의 조건은 사용된 효소를 생성시키는 유기체 배양에 사용된 방법과 유사하며, 효소 반응에도 바람직하다. 반응 온도는 약 25° 내지 43℃, 바람직하게는 약 28 내지 40℃의 범위이다. pH는 5.0 내지 8.5의 범위내로 유지시키며, 바람직하게는 3-위치의 아실화의 경우 5.5 내지 8.0, 4"-위치의 아실화의 경우 6.5 내지 8.5로 유지시킨다. 세포증식이 없는 반응의 pH를 유지시키기 위해서 적절한 완충액을 사용할 수 있다. 효소반응에 통상적으로 사용된 완충액(예, 황산염 및 시트르산염 완충액등)을 사용할 수 있다. 아세틸화 반응에는 아세테이트 완충액 또는 아세틸그룹을 함유하는 완충액을 사용해야 한다. 이반응 기간은 일반적으로 30분 내지 10시간이다.
본 발명의 일반식(1)의 화합물은 산부가염을 형성한다. 이 산부가염도 또한 항생물질로 유용하며, 본 발명의 일부이다. 다른 관점에서, 그러한 염은 예를들면, 에스테르 유도체를 분리시키고, 정제시키기 위한 중간체로 유용하다. 이외에도, 염은 개선된 물에 대한 용해도를 갖는다.
대표적인 적잘한 염으로는 예를들면, 황산, 염산, 인산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 락트산, 말레산, 푸마르산, 팔미트산, 콜산, 파모산, 무스산, D-글루탐산, d-캄포르산, 글루타르산, 글리콜산, 프탈산, 타르타르산, 포름산, 라우르산, 스테아르산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 소르브산, 피크르산, 벤조산, 신남산등과 같은 유기 및 무기산과의 표준반응으로 생성된 염이 있다.
약제학적으로 무독한 산부가염이 본 발명의 특히 바람직한 염의 그룹이다.
본 발명의 유도체는 병원균 특히, 그림-양성균 및 마이코플라즈마(Mycoplasma) 종의 증식을 억제한다. 예를들면, 표 I 및 II에는 특정세균을 억제하는 화합물의 최소억제 농도(MIC)를 요약하였다. 표 I의 MIC는 표준아가-희석 분석법으로 측정한다. 표 II의 MIC는 통상적인 육즙-희석 마이크로타이터 시험(broth-dillution microtiter test)으로 얻는다.
[표 I]
일반식(1) 화합물의 항생물질 활성
Figure kpo00005
[표 II]
일반식(1) 화합물의 항생물질 활성
Figure kpo00006
본 발명의 화합물은 마이코플라즈마 갈리셉티컴(Mycoplasma galisepticum)으로 야기된 시험적 감염증에 대해 생체내에서 활성을 나타내었다. 이 시험에서, 생후 1 내지 3일된-병아리의 복부기낭에 마이코플라즈마 갈리셉티컴의 육즙배양기 0.2mι를 주사하여 병아리에게 감염증을 유발시킨다. 이 화합물을 0.5g/gal에 상당하는 용량으로 감염된 날에 2회, 감염이 된 다음날에 2회, 몇 3일째에 1회 섭식으로 투여한다. 감염이 된 후 21일에 병아리의 체중을 달고 혈액샘플을 취한후 병아리를 참수시킨다. 기낭장해의 여부를 기록한다. 이 실험의 결과는 표 III에 요약하였다.
[표 III]
병아리중의 마크로신 유도체의 항마이코플라즘 활성
Figure kpo00007
본 발명에 사용하기 위한 바람직한 미생물은 스트렙토마이세스 서모톨러란스 NRRι 15270(한국 기탁번호; KFCC-10085)이다. 이 스트렙토마이세스 서모톨러란스 균주는 일반식(1)의 유도체를 생성시키기 위해 마크로신 및 락테노신을 아실화시키는 개선된 능력을 가지고 있다. 또한, 스트렙토마이세스 서모톨러란스 균주는 미합중국 특허 명세서 제4,092,473호에 기술된 티로신유도체를 생성시키기 위해 티로신을 아실화시키는 개선된 능력도 가지고 있다. 따라서 본 발명은 부가적으로 다음 일반식(2)의 화합물의 개선된 제조방법도 제공한다.
Figure kpo00008
상기식에서
R4는 수소, 아세틸 또는 프로피오닐이고,
R5는 수소, n-부티릴 또는 이소발레릴인데, 단 R4및 R5중의 하나는 수소가 아니어야 한다.
스트렙토마이세스 서모톨러란스 ATCC 11416균주 (한국기탁번호:KFCC-10084)로 부터 유도된 본 발명의 스트렙토마이세스 서모톨러란스 군주는 스트렙토마이세스 서모톨러란스 ATCC 11416 (한국기탁번호:KFCC-10084) 군주보다 다각적인 면에서 더 우월하다. 본 발명의 균주의 가장 중요한 형질은 유용한 화합물을 생성시키기 위해 마크로신, 락테노신 및 티로신을 아실화시키는 개선된 능력이다.
본 발명의 개선된 생체전환균주는 스트렙토마이세스 서모톨러란스 ATCC 11416 (한국기탁번호:KFCC-10084)의 돌연변이 균주 522의 그룹중에서 발견되었다. 이 돌연변이종의 그룹에서, 192개는 마크로라이드 항생물질을 아실화시키는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 이 조사에 의거하여, 항생물질을 아실화시키는 그들의 능력이 뛰어난 것으로 22개의 배양물을 선택하였다. 이들 중에서 바람직한 형질을 토대로 7개를 선택하여 추가로 시험하였다. 본 발명의 균주는 이 그룹중에서 발견되었다. 모(母) 배양물과 다른 선택된 돌연변이종을 비교하면, 본 발명의 스트렙토마이세스 서모톨러란스가 마크로라이드 항생물질을 3- 및 4"-위치에서 아실화 시키는 그의 능력에 있어서 모든 것들보다 우월하다. 이 신규의 균주는 생성유도체의 수율을 더 높이면서 항생물질을 더욱 신속히 아실화시킨다. 이외에도, 모(母)균주가 그의 아실화 능력이 불규칙한 반면에, 신규의 균주는 일관된 아실화를 제공한다.
본 발명의 스트렙토마이세스 서모톨러란스 균주는 1983년 1월 20일에 기탁되어 [Northern Regional Research Center, Agricultural Research, North Central Region 1815 North University Street, Peoria, IL linois, 61604], 기탁번호 NRRL 15270 (한국기탁번호:KFCC-10085)으로 이용되고 있다.
다른 유기체와 같이, 스트렙토마이세스 서모톨러란스 NRRL 15270(한국기탁번호:KFCC-10085)의 특성을 변형시킨다. 예를들면, 각종 공지의 물리적 및 화학적 돌연변이 유발원(예, 자외선, X-레이, 감마-레이, 및 N-메틸-N'-니트로-N-니트로조구아니딘)으로 NRRL 15270균주(한국기탁번호:KFCC-10085)를 처리하여 NRRL 15270균주 (한국기탁번호:KFCC-10085)의 조환형, 돌연변이체, 인공변형체를 수득할 수 있다.
본 발명에는 마크로신, 락테노신 및 티로신을 아실화시키는 개선된 능력을 보유하고 있는 스트렙토마이세스 서모톨러란스 NRRL 15270 (한국기탁번호:KFCC-10085)의 자연발생 및 인공변형체, 돌연변이체 및 조환형을 모두 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 마이코플라즈마의 감염증치료에 특히 유용하다. 이러한 목적으로, 일반식(1)의 화합물을 감염되었거나, 감염될 염려가 있는 온혈 동물에게 비경구 또는 경구투여한다. 이 화합물은 또한 예를 들어, 분제의 형태로 동물 또는 가금류를 수용한 폐쇄된 공간 또는 실내에 뿜어줌으로써 투여할 수 있다. 동물 또는 가금류는 공기중에 존재하는 분제를 호흡하여 흡수하며, 분제는 또한 눈을 통해서도 체내에 흡수된다(안구내주입법).
감염증 치료에 유효한 용량은 감염증의 중증도, 동물의 연령, 체중 및 상태에 따라 변화시킨다. 그런데, 비경구적 투여에 필요한 총용량은 일반적으로 체중 kg당 약 1 내지 약 100mg, 바람직하게는 약 1 내지 약 50mg의 범위내이다.
경구투여에 필요한 용량은 일반적으로 체중 kg당 약 1 내지 약 300mg, 바람직하게는 약 1 내지 약 100mg이다. 용법은 적절히 만들 수 있다.
화합물을 투여하는 가장 실용적인 방법은 공급사료 또는 음료수로 제형화하는 것이다. 통상의 건조사료, 액체사료 및 펠렛사료를 포함한 각종 사료를 사용할 수 있다.
마이코플라즈마 감염증 치료에 유용한 제제는 일반식(1)의 화합물과 적절한 담체로 이루어진다. 조성물은 약제한 분야에 공지된 방법으로 비경구 또는 경구투여용으로 제형화 할 수 있다.
동물용 사료로 약제를 제형하는 방법은 공지되어 있다. 바람직한 방법은 약물 처리한 사료의 제조에 사용되는 농축-약제 프레믹스를 제조하는 것이다. 통상의 프레믹스는 프레믹스 파운드당 약 1 내지 약 200g의 약제를 함유할 수 있다. 프레믹스는 액상 또는 고상제제일 수 있다.
동물 또는 가금류용 사료의 최종제제는 투여해야 할 약제의 양에 좌우된다. 일반식(1)의 화합물을 함유하는 사료를 제조하기 위해서 사료를 제형화하고, 혼합하며 펠렛화시키는 통상의 방법을 사용할 수 있다.
이들 화합물을 함유하는 효과적인 주사용 조성물은 현탁제 또는 액제형일 수 있다. 적절한 제제의 제조에 있어서, 일반적으로 산부가염의 수용해도가 유리염기 보다 더 큰것이 인지될 것이다. 유사하게, 유리염기는 중성 또는 염기성 용액보다는 회 산 또는 산성용액에 더 잘 용해된다.
액제형에서, 화합물을 생리적으로 무독한 담체중에 용해시킨다. 그런 담체는 적절한 용매, 보존제(예, 벤질알코올), 경우에 따라 완충제로 이루어진다. 유용한 용매로는 예를들면, 물 및 수성알코올, 글리콜 및 카보네이트 에스테르(예, 디에틸카보네이트)가 있다. 그러한 수용액은 일반적으로 유기용매를 50용적%까지 함유한다.
주사용 현탁액 조성물은 보조제와, 또는 보조제없이 담체로서 액체 현탁화 매질을 필요로 한다. 현탁화 매질로는 수성 폴리비닐피롤리돈, 불활성오일(예, 식물성오일 또는 정제도가 높은 광유) 또는 수성 카복시메틸셀룰로오즈를 들을 수 있다.
현탁액조성물에 현탁된 화합물을 유지시키기 위해서는 적절한 생리적으로 무독한 보조제가 필요하다. 보조제는 카복시메틸셀룰로오즈, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알지네이트와 같은 농조화제중에서 선택할 수 있다. 다수의 계면활성제가 현탁화제로도 유용하다. 레시틴, 알킬페놀 폴리에틸렌옥사이드 부가물, 나프탈렌설포네이트, 알킬벤젠설포네이트 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 에스테르가 유용한 현탁화제이다.
액체현탁화 매질의 친수성, 밀도 및 표면장력에 영향을 주는 여러물질들이 각각의 경우에 주사용 현탁액 제조를 도울 수 있다. 예를들면, 실리콘소포제, 소르비톨 및 설탕이 현탁화제로 유용할 수 있다.
본 발명을 더욱 상세히 설명하고자, 다음의 실시예를 제공한다:
[실시예 1]
스트렙토마이세스 서모톨러란스의 돌연변이체에 의한 마크로신의 3-0-아세틸마크로신, 3-0-아세틸-4"-0-(n-부티릴) 마크로신 및 3-0-아세틸-4"-0-이소발레릴마크로신으로의 생체전환
A. 접종물 제조
스트렙토마이세스 서모톨러란스 NRRL 15270 (한국기탁번호:KFCC-10085)의 포장형성이 잘된 사면에서 포자를 긁어내어 수득한, 동결건조된 포자현탁액 또는 포자현탁액을 멸균 배지에 접종시킴으로써 적절한 영양접종물을 얻을 수 있는데 최상의 결과는 액체질소에 보존했던 표준영양 접종물에서 접종된 배양물을 사용하여 얻을 수 있다. 액체-질소-저장접종물은 다음 방법으로 제조한다:
스트렙토마이세스 서모톨러란스 NRRL 15270 (한국기탁번호:KFCC-10085)의 동결건조 펠렛을 멸균수(2mι) 중에 현탁시킨다. 생성된 포자 현탁액을 250mι 광-구 삼각플라스크의 멸균 배지 50mι에 0.4% 부피/부피(V/V)율로 접종시킨다.
이 배지는 다음의 조성물을 가진다:
Figure kpo00009
FeSO4·7H2O (2g)를 농 HCL 27mι를 함유하는 증류수 100mι에 용해시킨다. 이 용액을 상기 KCL/MgSO4·7H2O 용액에 가하여 크자펙액의 무기질을 조제한다.
접종된 배지가 들어있는 플라스크를 260RPM으로 진탕하는 2인치-직경 아아크의 회전진탕기 상에서 24시간 동안 37℃로 유지시킨다. 다음에 영양배지를 수집하여 글리세롤 : 락토오즈 : 물(2 : 1 : 7)의 멸균 현탁화제로 1 : 1(부피 : 부피)로 희석하여 멸균튜브에 분주한다(2mι/튜브). 다음에 희석한 접종물을 적절한 저장용기내의 액체질소상에 저장하고, 진탕플라스크 전환 배양물의 배양을 위한 저장물 및 발효조 접종물로 사용한다.
B. 일반 진탕-플라스크 전환법
일반적으로 1/5의 배양물-부피 대 플라스크-부피비로 진탕-플라스크 전환반응을 수행한다. 멸균 CSI 배지에 액체-질소 저장된 접종물을 0.4% V/V 비로 접종시켜, 2-인치-직경 아아크의 회전진탕기 상에서 260RPM으로 22 내지 24시간 동안 37℃에서 배양시킨다. 마크로신을 함유하는 농축된 메탄올성 용액 및 DL-노르발린 및 L-로이신을 함유하는 멸균된 중성 용액을 각기 0.5mg 마크로신/mι 및 아미노산 각각 1.0mg/mι의 최종농도로 전환 배양물에 가한다. 이 배양물을 상술한 바와 같이 추가로 24시간 배양시킨 후 수집한다. 배양물 전체를 pH 약 8.5 내지 9.0으로 조절하고, 동용적의 에틸아세테이트로 반복 추출하여 전환-생성물을 회수한다. 최종물을 합하여 진공하에 농축 건고시킨다. 각종 전환생성물을 반전상(RP) 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)시켜 정제형으로 회수한다.
일반적으로 진탕-플라스크 전환법은 기질을 8 내지 10시간에 상응하는 3-0-아세틸 유도체로 완전히 전환시키고, 이어서 3-0-아세틸 중간체를 3-0-아세틸-4"-0-(n-부티릴)/및 또는 3-0-아세틸-4"-0-이소 발레릴 유도체로 전환시킨다. 전환시간이 24 내지 28시간을 초과하면, 생성물이 부분적으로 C-20디하이드로 유도체로 전환된다.
C. 교반된 발효조의 일반적인 전환법
교반된 발효조(탱크)의 접종물은 1ι 광-구 삼각플라스크중의 멸균 CSI 배지 200mι에 액체-질소 저장접종물을 0.4% V/V 비로 접종시켜 제조한다. 다음에 이 종 배양물을 2-인치 직경 아아크의 회전 진탕기상에서 260RPM으로 22시간 동안 37℃에서 배양시킨다. 생성된 영양배양물은 멸균배지 25ι를 함유하는 교반된 발효조를 접종시키는데 (0.8% 접종물, V/V) 사용하며, 이는 다음의 성분을 갖는다:
Figure kpo00010
α다우코닝(Dow Corning, Chicago, IL) 약 126℃, 20 내지 23psi에서 45분간 멸균시킨다.
발효온도는 37℃로 유지시킨다. 발효기 임펠러(impeller)측에 설치된 6개의 날개가 달린 6-인치 직경의 임펠러를 300RPM으로 회전시켜 교반시킨다. 바닥의 임펠러 아래에서 발효조로 멸균공기를 0.5V/V/m로 스파지하여 배양물을 통기시킨다. dι-노르발린(25g), L-로이신(25g)을 함유하는 멸균된 중성용액(2ι)과 메탄올중의 마크로신(12.5g)의 용액 50 내지 100mι를 증식의 22 내지 24시간 후에 배양물에 가한다. 대다수의 경우 12 내지 16시간 내에 전환이 완결되지만 추가로 22 내지 24시간 동안 계속해서 발효시킨다.
일반적으로 기질을 가한후 3시간 이내에 마크로신이 3-0-아세틸 마크로신으로 급속히 전환된다. 3-0-아세틸 마크로신의 3-0-아세틸-4"-0-(n-부티릴) 마크로신 및 3-0-아세틸-4"-0-이소발레릴마크로신 유도체로의 전환은 다소 더 늦은 속도로 일어난다. 최대 4"-에스테르 생성은 일반적으로 기질을 첨가한 후 약 7 내지 16시간 후에 일어난다. 기질을 가한후 약 7 내지 8시간 후에 전환된 배양물을 수집하면, 3,4"-디에스테르로의 전환은 대략 85 내지 95% 완결되고, C-20-디하이드로 생성물의 생성은 최소가 된다.
3-0-아세틸-4"-0-이소발레릴 마크로신을 제조할 때, 배지에 L-로이신(배양물 25ι당 50g)을 가하는 것이 바람직하다.
C-20-디하이드로 화합물이 바람직하면, 발효시간을 더 연장하는데 바람직하게는 약 22 내지 약 30시간이다.
D. 분석법
이 분석법은 생체전환공정을 탐지하고, 개개의 생체전환 생성물을 분리하는데 유용하다. 생체전환 생성물을 함유하는 육즙의 샘플(4mι)를 NaOH로 조절하여, 에틸 아세테이트(2mι)로 1회 추출한다. 생성된 현탁액을 원심분리하여, 에틸 아세테이트 부분을 반전상 HPLC(Waters μ-Bondapak C-18 또는 Merck LiChrosorb RP-18을 흡착제로 사용)로 분석한다. 3-0-아세틸마크로신은 용매계 H2O/MeOH/NH4COOH(40/60/0.2)를 사용하여 분석하는 반면; 3,4"-디에스테르는 H2O/MeOH/NH4COOH(25/75/0.2)계로 분석한다 .마크로신 및 에스테르 유도체는 280nm의 자외선(UV) 흡광도로 검출한다.
E. 전환 생성물의 분리
수산화나트륨으로 발효육즙의 pH를 약 8.5로 조절시킨다. 에틸 아세테이트(2부피)를 세차게 교반시키면서 가한다. 생성된 유상액을 세파(Sepa) 원심분리기를 통해 세포의 파편들을 침강시키고 유화상태를 파괴시킨다. 세포의 파편 및 수상을 버린다. 유기층을 진공농축시켜 오일상 잔사를 얻고, 이를 오일이 없는 무수조 제제를 수득할 때까지 헥산으로 반복하여 연마시킨다. 조 제제의 수득량은 3 내지 9g의 범위내이다.
조건 조 제제를 순수한 형태의 적절한 유도체가 수득될때까지 반전상 HPLC로 반복하여 정제시킨다.
처음에, 조 건조 추출물(약 3 내지 7g의 양)을 H2O/CH3CN/디에틸아민(65/35/0.1)용 매계로 예비용 HPLC(Waters Prep/500-반전상)시켜 디에스테르에서 3-0-아세틸마크로신을 분리시킨다. 280nm의 UV 및 분석용 HPLC에 의해 측정된 적절한 분획을 합하여 수상으로 농축시킨 후 동결건조시켜 건조제제를 얻는다.
적절한 용매계를 사용하여 38"×1/2" 또는 25.5"×1" LP-1/C18칼럼의 HPLC로 모노-및 디-에스테르를 더 정제시킨다:
Figure kpo00011
장-탈착질량분광측정법(FDMS, Field desorption mass spectrometry)은 다음의 모(母) 이온을 나타낸다.
화합물 M+1
3-0-아세틸마크로신 944
3-0-아세틸-4"-0-(n-부티릴) 마크로신 1014
3-0-아세틸-4"-0-이소발레릴마크로신 1028
[실시예 2]
3-0-아세틸마크로신으로 부터 3-0-아세틸락테노신의 제조
3-0-아세틸마크로신(350mg)을 1N 황산(43mι)에 가한다. 생성된 용액을 실온에서 약 1시간 동안 교반시킨 다음 농 NaHCO3수용액으로 중화시킨다(약 (pH 7.5로). NaOH를 가하여 용액의 pH를 8.5로 조절시킨 후, 에틸 아세테이트(동용적)로 5회 추출한다. 에틸 아세테이트 추출물을 합하여, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 증발시켜 조 3-0-아세틸락테노신(302.5mg)을 수득한다.
이 물질을 38-인치×1/2인치 LP-1/C18실리카-겔칼럼을 사용하고, H2O/CH3CN/피리딘/HOAc (78.4/19.6/1.5/0.5) 용매계로 약 5mι/분의 유속으로 용출시키는 HPLC로 정제시킨다. 2% 피리디늄 아세테이트를 함유하는 H2O/CH3CN(3:1)의 용매계를 2mι/분의 유속으로 사용하고, 280nm의 자외선(UV)으로 검출하여 하이버 II칼럼(HIBAR II Column, lichrosorb RP-18, 250×4.6mm, Merck)상의 분석용 HPLC로 적절한 분획을 확인한다. 바람직한 분획을 합하여 증발시켜 3-0-아세틸락테노신 165.5mg을 수득한다.
FDMS 질량이온(M+1)=800.
실시예 1 및 2의 화합물의 핵자기공명(NMR) 스펙트럼은 표 IV에 요약하였다(δ, CDCL3).
[표 IV]
일반식(1) 화합물의 NMR 공명
Figure kpo00012
Figure kpo00013
[실시예 3]
기질로서 락테노신을 사용하여 실시예 1의 방법에 따라 3-0-아세틸락테노신을 제조할 수 있다.
[실시예 4]
C-20의 포르밀 그룹의 환원이 완결될때 까지, 이소프로필 알코올과 같은 알코올 수용액 중에서 3-0-아세틸마크로신을 수소화붕소 나트륨과 반응시켜 20-디하이드로-3-0-아세틸마크로신을 제조할 수 있다.
[실시예 5]
억제농도의 탄소 및 질소원을 함유하는 배지를 사용하여 탄소원이 거의 소비되었을때 마크로신을 가하는 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법에 따라 반응시켜 4"-0-이소발레릴마크로신을 제조할 수 있다.
기타 3-0-아실화된 마크로신 및 3-0-아실-4"-0-이소발레릴마크로신 생성물과 공동으로 생성된 생성물을 크로마토그라피법, 예를들면 실시예 1에서와 같은 반전-상 HPLC로 공동생성물로 부터 분리시킨다.
[실시예 6 내지 15]
전 실시예의 방법을 사용하여 제조할 수 있는 본 발명에 따른 기타 화합물로는
3-0-프로피오니마크로신,
3-0-프로피오닐락테노신,
3-0-프로피오닐-4"-(n-부티릴)마크로신,
3-0-아세틸-4"-0-아세틸마크로신,
3-0-프로피오닐-4"-0-이소발레릴마크로신,
4"-0-(n-부티릴)마크로신,
3-0-아세틸-20-디하이드로마크로신,
3-0-아세틸-20-디하이드로마크로신,
3-0-아세틸-20-디하이드로-4"-이소발레릴마크로신,
20-디하이드로-3-프로피오닐락테노신
[실시예 16]
스트렙토마이세스 서모톨러란스 NRRL 15270(한국 기탁번호:KFCC-10085)과 스트토렙 마이세스 서모톨러란스 ATCC 11416(한국 기탁번호:KFCC-10084)의 아실화 능력의 비교
마크로라이드 항생물질 티로신 및 마크로신을 3'- 및 4"-위치에서 에스테르화 시키는 스트렙토마이세스 서모톨러란스 ATCC 11416(한국 기탁번호:KFCC-10084) 및 스트렙토마이세스 서모톨러란스 NRRL 15270(한국 기탁번호:KFCC-10085)의 능력을 비교한다. 멸균 CSI 배지(배지:플라스크비 1:5)에 각 유기체의 동결 건조 펠렛을 접종시켜 각 유기체의 영양배양물을 조제한다. 배양물을 2-인치 직경 아아크의 회전 진탕기(260RPM)상에서 24시간동안 37℃에서 배양시킨다. 이 배양물을 0.4% 부피/부피 비로 CSI 배지의 발효육즙을 접종하는데 사용한다. 영양배양물에 대해서 기술한 바와 같이 발효 육즙을 24시간 동안 배양시킬다. 다음에 각 유기체의 발효배양물을 더 작은 플라스크에 등분하여 1:5 배지 대 플라스크비를 유지시킨다. 메탄올중의 각 화합물(마크로신 또는 티로신)의 농축용액 및 L-로이신의 멸균 중성액을 한쌍의 발효 배양물에 가하여 마크로신 또는 티로신의 최종 농도를 0.5mg/mι, L-로이신은 2mg/mι로 만든다. 배양물을 6시간 추가 배양시킨 후 수집한다. 발효 육즙의 pH를 8.5로 조절하고, 동용적의 에틸 아세테이트로 2회 추출하여 생체전환 생성물을 분리시킨다. 에틸 아세테이트 추출물을 진공하에 농축 건조시킨 다음 에틸아세테이트로 그들의 발표부피를 반으로 재구성한다. 박층 크로마토크라피(TLC) 및 HPLC로 추출물을 검사한다.
분석에는 에틸아세테이트/디에틸아민/메탄올 (95/5/10)중에 전개된 실리카-겔 판을 사용하고; 단파 UV 및 아니스알데히드 스프레이로 반점을 검출한다. 반전-상 HPLC 시스템에는 워터즈 μ-본다팩 C18칼럼, H2O/MeOH/NH4COOH(25/75/0.2)용매계 및 280nm의 UV 검출기가 사용돈다.
TLC 및 HPLC에 의한 측정결과, 스트렙토마이세스 서모톨러란스 15270(한국 기탁번호:KFCC-10085) 배양물은 스트렙토마이세스 서모톨러란스 ATCC 11416(한국 기탁번호:KFCC-10084)배양물 보다 더 특이적으로 마크로신 및 티로신을 그들의 3-0-아실-4"-0-아실 에스테르로 전환시킨다. TLC에 따른 비교는 강도, 즉 스트렙토마이세스 서모톨러란스 ATCC 11416(한국 기탁번호:KFCC-10084)배양기에서 생성된 것보다 스트렙토마이세스 서모톨러란스 NRRL 15270(한국 기탁번호:KFCC-10085)으로 실험하여 생성된 더 짙은 반점에 있어서, 현저한 차이를 보여준다. 생성될 3-0-아세틸-4"-이소발레릴마크로신 및 3-0-아세틸-4"-0-이소발레릴 티로신의 양을 측정한 HPLC 피크 높이를 비교한 것은 스트렙토마이세스 서모톨러란스 ATCC 11416(한국 기탁번호:KFCC-10084)에 의한 아실화와 비교하여 스트렙토마이세스 서모톨러란스 NRRL 15270(한국 기탁번호:KFCC-10085)아실화에 있어서 특이적인 증가를 나타냄을 보여준다.
에스테르화된 화합물의 HPLC 피크높이(mm로)는 다음과 같다.
Figure kpo00014
[실시예 17]
주사용 제제
A) 프로필렌글리콜에 일반식(1)의 기제를 가한다. 액제가 50%(부피로) 프로필렌글리콜, 4%(부피로) 벤질알콜 및 200mg/mι의 일반식(1)의 기제를 함유하도록 물과 벤질 알코올을 가한다.
B) 액제가 50mg/mι의 일반식(1)의 기제를 함유하는 것을 제외한 A)에 기술한 바와같이 액제를 제조한다.
C) 액제가 일반식(1)의 기체 350mg/mι를 함유하는 것을 제외한 A)에 기술된 바와 같이 액제를 제조한다.
D) 액제가 일반식(1)의 타트레이트 500mg/mι를 함유하는 것을 제외하고는 A)에 기술된 바와같이 액제를 제조한다.
E) 현탁액 mι당 일반식(1)의 기제 200mg을 함유하도록 미세분말의 일반식(1)의 화합물을 카보시메틸 셀룰로오즈에 골고루 혼합하면서 가하여 현탁액을 제조한다.
[실시예 18]
마이코플라즘 치료를 위한 병아리의 일용사료
체중을 급증시키기 위해 병아리에 공급하는 균형잡힌 고-에너지 일용사료는 다음 처방으로 제조한다:
Figure kpo00015
Figure kpo00016
1비타민 프레믹스는 완전사료 kg당 3000 IU 비타민 A, 900ICU의 비타민 D3, 40mg의 비타민 E, 0.7mg의 비타민 K, 1000mg의 콜린, 70mg의 니아신, 4mg을 판토텐산, 4mg의 리보플라빈, 100mcg의 비타민B12, 100mcg의 비오틴 및 125mg의 에톡시퀸을 제공한다.
2미량 무기질 프레믹스는 완전사료 kg당 75mg의 망간, 50mg의 아연, 25mg의 철 및 1mg의 요오드를 제공한다.
표준 사료-혼합 기술에 따라 물질들을 혼합한다. 병아리에게 물과 함께 사료를 마음껏 먹도록하여 마이코플라즈마 감염증에 대해서 병아리를 보호한다.

Claims (7)

  1. 마크로신 또는 락테노신을 수성배지 중에서 스트렙토마이세스 서모톨러란스(STreptomyces thermotoιernace) ATCC 11416(한국 기탁번호:KFCC-10084, 기탁일:1984.4.27, 기탁기관:한국종균협회), 스트렙토마이세스 서모톨러란스 NRRι 15270(한국 기탁번호:KFCC-10085, 기탁일:1984.4.27, 기탁기관:한국종균협회) 또는 스트렙토마이세스 펀지사이디커즈 아종 에피노마이세티커스(streptomyces fungicidicus Subsp. espinomyceticus) ATCC 21574(한국기탁번호:KFCC-10086, 기탁일:1984.4.27, 기탁기관:한국종균협회)에 의해 생성된 아실화효소계의 존재하에 아실 공여체와 상당한 량의 화합물이 생성될때까지 접촉시킴을 특징으로 하여 일반식(1)의 마크로라이드 또는 그의 산부가염을 제조하는 방법.
    Figure kpo00017
    상기식에서, R은 포르밀 또는 하이드록시메틸이고, R1은 수소 또는 C1-6알칸노일이며, R2는 수소 또는
    Figure kpo00018
    (여기에서 R3는 수소 또는 C1-6알카노일이다)이고, 단 R1또는 R3중의 하나는 수소가 아니어야 한다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 수소, 아세틸 또는 프로피오닐이고, R3가 수소, 아세틸, 프로피오닐, n-부티릴 또는 이소발레릴인 일반식(1)의 마크로라이드를 제조하는 방법.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, R이 포르밀인 일반식(1)의 마크로라이드를 제조하는 방법.
  4. 제1항, 2항 또는 3항에 있어서, R2가
    Figure kpo00019
    인 일반식(1)의 마크로라이드를 제조하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, R3가 수소인 방법.
  6. 제1항 내지 5항중 어느 하나에 있어서, 효소가 스트렙토마이세스 서모톨러란스 NRRι 15270 (한국 기탁번호:KFCC-10085, 기탁일:1984.4.27, 기탁기관:한국종균협회)으로 부터 생성되는 방법.
  7. 티로신을 수성배지중의 스트렙토마이세스 서모톨러란스 NRRι 15270(한국 기탁번호:KFCC-10085, 기탁일:1984.4.27, 기탁기관:한국종균협회)에 의해 생성된 아실화효소계의 존재하에 상당한 량의 화합물이 생성될 때까지 아실공여체와 접촉시킴을 특징으로 하여 다음 일반식(2)의 화합물을 제조하는 방법.
    Figure kpo00020
    상기식에서, R4는 수소, 아세틸 또는 피로피오닐이고, R5는 수소, n-부티릴 또는 이소발레릴인데, 단, R4또는 R5중의 하나는 수소가 아니어야 한다.
KR1019840001056A 1983-03-03 1984-03-02 마크로라이드 유도체의 제조방법 KR860001820B1 (ko)

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