DK153500B - Fremgangsmaade til fremstilling af fructose - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af fructose Download PDFInfo
- Publication number
- DK153500B DK153500B DK399880AA DK399880A DK153500B DK 153500 B DK153500 B DK 153500B DK 399880A A DK399880A A DK 399880AA DK 399880 A DK399880 A DK 399880A DK 153500 B DK153500 B DK 153500B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- glucose
- fructose
- glucosone
- process according
- enzyme
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C29/00—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring
- C07C29/09—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by hydrolysis
- C07C29/10—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by hydrolysis of ethers, including cyclic ethers, e.g. oxiranes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D301/00—Preparation of oxiranes
- C07D301/02—Synthesis of the oxirane ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
DK 153500 B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af fructose ud fra glucose.
De enestående fysiske, kemiske og metaboliske egenskaber af g krystallinsk fructose giver særlige anvendelsesmuligheder, som ikke findes for giucoseisomerase-fremsti 1 let majssirup med højt fructoseindhold (HFCS), som typisk indeholder 42¾ fructose, 50% dextrose og 8% polysaccharider. Medens HFCS er omtrent så sød som saccharose, er krystallinsk fructose ca. 50% sødere og kan anvendes i lavere koncentrationer til frembringelse af den samme sødhed. HFCS konkurrerer primært på de direkte omkostninger med flydende sukkerarter i en lang række traditionelle næringsmiddelanvende!ser i enten tør eller flydende form, primært til farmaceutiske anvendelser og i næ-ringsmidler, hvor der ønskes en reduktion af kalorieindholdet pr. sødhedsenhed. Krystallinsk fructose anvendes i diætslik og is og kan hensigtsmæssigt supplere eller erstatte glucose, saccharose eller HFCS i drikkevarer.
Fremstillingen af krystallinsk fructose i kommerciel målestok 20 har stødt på en række alvorlige problemer.
Et af de største problemer er fremstillingsprisen. Den eneste kommercielt acceptable produktionsmetode hidtil var baseret på først at fremstille en glucose-fructose-sirupblanding ud fra 25 glucose (under anvendelse af enten giucoseisomerase eller alkalisk isomerisering) eller saccharose (via invertsukker), derpå fysisk at separere de to sukkerarter {ionbytning eller selektiv calciumsaltudfældning) og endelig at udvinde fructo-sen fra den vandige opløsning i krystallinsk form (podning el-30 ler metanoludfældning).! Den fysiske separeringsbehandling af de to sukkerarter er nødvendig, da krystallinsk fructose i bedste fald vanskeligt og hyppigt umuligt kan udvindes fra en vandig opløsning, med mindre i alt væsentligt alle ioniske stoffer, restglucose og andre forureninger fjernes.15 £n sådan 35 behandling er dyr og resulterer derfor i en høj markedspris for fructose - en pris, som ikke kan konkurrere med rørsukker.
Litteraturen angiver, at lave koncentrationer af fructose kan fremstilles ud fra glucoson. Så tidligt som i 1889 blev frue- 2
DK 153500B
tose dannet ved reduktion af D-glucoson med zinkpulver i vandig eddikesyre.6 Denne reduktion er blevet anvendt som en analytisk test til bestemmelsen af D-glucoson i adskillige biologiske stoffer.8>' 1°· 12 Reduktion af D-glucoson til D-fructose er også 5 blevet gennemført med natriumborhydrid .Omdannelse af D-glucoson til fructose er en mulig enzymatisk reaktion, da re-duktaser, som gennemfører reduktionen af -CHO*-CH2OH, kendes . I4
Litteraturen angiver også, at lave koncentrationer af glucoson kan fremstilles ud fra glucose. Der er blevet beskrevet adskillige metoder til at oxidere glucose - med H2024 eller med kobberacetat.5 I hver af disse reaktioner er omdannelsesudbytterne lave (<30%), og der opstår mange biprodukter. Glucose er blevet omdannet til D-glucoson ved først at fremstille et derivat af glucosen {f.eks. ved omsætning med phenyl hydrazin til fremstilling af glucosazon6 eller ved omsætning med p-to-luidin7) og derpå kemisk behandle dette derivat til dannelse af D-glucoson. I disse reaktioner var udbytterne ikke over 2Q 50%, og de reagenser, der ikke genvindes, er for dyre til kommerciel brug. Anvendelsen af aromaholdige reagenser kunne desuden give problemer i forbindelse med opnåelse af sukkerarter af rimelig kvalitet.
Omdannelse af glucose til D-glucoson er også en kendt enzyma-25 tisk reaktion. Så tidligt som i 1932 blev det anført, at glucose blev oxideret til D-glucoson af den krystallinske form for en mollusk, Saxidomus giganteous.8 I 1937 blev det anført, at D-glucoson dannes ved oxidationen af glucose, stivelse, maltose eller saccharose med piasmolyserede præparater af to 30 skimmelsvampe, Aspergillus parasiticus og Aspergillus flavus-oryzae.
I 1956 blev den enzymatiske oxidation af glucose til glucoson i en rød alge, Iridophycus flaccidum,10 beskrevet. En carbohy-35 dratoxydase blev isoleret fra mycelium af Bas idiomyceten, Po-lyporus obtusus, som oxiderede glucose til D-glucoson.H Der blev ikke angivet noget om udbytter. Endelig blev der i 1978 påvist giucose-2-oxidase-akt i vitet i basid iomyceten, Oudeman- 3
DK 153500B
siella mucida, såvel som i andre træforrådnende svampe.I2 De bedste udbytter, der blev angivet, var ikke over 50%. I alle disse tilfælde antages det, at D-g1ucosonproduktionen er ledsaget af dannelsen af hydrogenperoxid.
5
Det har nu vist sig, at i alt væsentlig ren fructose kan fremstilles ud fra glucose ved en fremgangsmåde, som er ejendommelig ved, at man tilvejebringer en vandig opløsning af D-gluco-se, omdanner ca. 95% af D-glucosen i opløsning til D-glucoson ved enzymatisk oxidation med et oxidoreduktaseenzym i nærværelse af oxygen, mens man fjerner eller udnytter co-produceret hydrogenperoxid og efter omdannelsen hydrogenerer D-glucosonet til D-fructose ved hjælp af en hydrogeneringskatalysator. Herved bliver den dyre fysiske separering af restglucose fra fructose eller fra en fructoserig sirup unødvendig. Den resulterende fructose, der er i alt væsentlig fri for glucose og alle andre saccharider, udvindes enten som en vandig opløsning eller i fast form.
Opfindelsen skal nu forklares nærmere under henvisning til de 20 medfølgende tegninger, hvori fig. 1 er et skematisk diagram over et foretrukket eksempel på fremgangsmåden ifølge opfindelsen, 2g fig. 2 viser molekylstrukturen af D-glucose, fig. 3 viser molekylstrukturen af D-glucoson, og fig. 4 viser molekylstrukturen af D-fructose.
2Q Med hensyn til molekylstrukturen af D-glucoson vil fagfolk på dette område vide, at det er blevet hævdet, at der eksisterer adskillige andre former af molekylet i vandig opløsning. En række af disse er cykliske.2'3 I den foreliggende beskrivelse anvendes udtrykkene "glucose", 35 "D-glucose" og "dextrose" skiftevis til at omfatte dette mono-saccharid i en eller anden form - opløsning eller tør. Figur 2 betegner glucose.
4
DK 153500B
I den foreliggende beskrivelse anvendes udtrykkene "D-gluco-son" og "D-arabino-2-hexosulose" 1 flæng. Figur 3 betegner D-glucoson.
5 I den foreliggende beskrivelse betegner udtrykkene "fructose", "D-fructose" og "levulose” ensbetydende den isomer af glucose, som er sødere end glucose. Udtrykket "krystallinsk fructose" anvendes i den foreliggende tekst til at betegne dette monosaccharid i vandfri form. Figur 4 viser fructose.
10
Som nævnt og henvist til ovenfor kendes lavkoncentrationsomdannelser af glucose til D-glucoson og af D-glucoson til fructose i den videnskabelige litteratur, men ideen med at koble disse to reaktioner til f remsti lling af fructose ud fra glucose har ikke været indlysende for andre. Den succesfulde an-15 vendelse af disse to reaktioner til fremstilling af krystallinsk fructose fra glucose er desuden en økonomisk, kommercielt nyttig proces, som ikke før den foreliggende opfindelse er blevet beskrevet. Hverken i forbindelse med den rapporterede omdannelse af glucose til D-glucoson eller den rapporte- 20 rede omdannelse af D-glucoson til fructose overvejede man ide-én med at fremstille krystallinsk fructose ud fra glucose. D-glucoson blev kemisk syntetiseret på grund af, at det blev ønsket som en kemi sk standard. D-glucoson blev påvist i biologiske systemer enten uden hensigt (f.eks. som en ukendt kompc-25 nent i en biokemisk vej under undersøgelse) eller med forsæt (f.eks. som en del af en undersøgelse af den biokemiske oxidation af glucose i blod). D-glucoson blev reduceret til fructose som en analytisk plet-test for nærværelsen af D-glucoson.
30 Med mindre både omdannelsen af glucose til D-glucoson og omdannelsen af D-glucoson til fructose gennemføres i højt udbytte, ville den industrielle produktion af krystallinsk fructose ved hjælp af denne metode blive uoverkommelig, da den dyre fysiske separeringsbehandling til fjernelse af res tg 1u-35 cose stadig ville være nødvendig. Ifølge den foreliggende opfindelse omdannes glucose let og fuldstændigt til D-glucoson under anvendelse af et renset oxidoreduktaseenzym såsom carbo-hydratoxidase eller glucose-2-oxidase. Det ved den foreliggen- 5
DK 153500B
de opfindelse opnåede udbytte overstiger det i litteraturen beskrevne for dette enzym. Denne høje omdannelse til D-glucoson fjerner behovet for fysisk at separere eventuelt resterende uomdannet glucose.
5
Visse oxidoreduktaser har katalytisk virkning med hensyn til at oxidere hydroxyIgruppen på det andet carbon af glucose, idet de fremmer oxidationen af denne hydroxylgruppe til en ke-togruppe, f.eks. ved omdannelse af strukturen i fig. 2 til jQ strukturen i fig. 3. Disse specifikke oxidoreduktaseenzymer, der er beskrevet i eksemplerne heri, omtales varierende som "glucose-2-oxidase", "pyranose-2-oxidase" og "carbohydratoxi-dase". Glucose-2-oxidase besidder en høj specificitet over for glucose som substrat, hvorimod carbohydratoxidase, selv om det ._ har glucose som foretrukket substrat, har en bredere substrat- 1 b specificitet. Ethvert enzym, som er i stand til at omdanne hy-droxylgruppen på det andet carbon af glucose til en ketogruppe og ikke ellers væsentligt påvirke resten af glucosemolekylet, falder inden for den foreliggende opfindelses omfang. Et så-2q dant enzym kan specificeres som et enzym, der har glucose-2-oxidaseaktivitet.
Et foretrukket carbohydratoxidaseenzym er afledt af mikroorganismen Polyporus obtusus. Kilder for giucose-2-oxidase omfatter adskillige andre mikroorganismer, mollusker og røde alger, 25 som refereret ovenfor. Disse enzymer og deres kilder er kun indikative og skal ikke betragtes som omfattende alle egnede enzymer og deres kilder inden for den foreliggende opfindelses omfang.
30 Enzymerne kan opnås ved, at mikroorganismerne dyrkes i bevæget, neddyppet kultur ved stuetemperatur ved hjælp af sædvanlige metoder. Enzymet udvindes af myceliet af mikroorganismen.
Enzymet anvendes fortrinsvis i immobi1 i seret form, selv om 35 frit enzym også kan anvendes. Fremgangsmåderne til enzymimmobilisering er velkendte for fagfolk på dette område og består af omsætning af en opløsning af enzymet med et af et stort antal overfladebehandlede eller -ubehandlede organiske og uorga- 6
DK 153500B
niske støttematerialer. Indbefattet heri er polyacrylamid, ethylenmaleinsyrecopolymerer, methacrylbaserede polymerer, po-lypeptider, styrenbaserede polymerer, agarose, cellulose, dex-tran, silica, porøse glasperler, trækul eller carbon black, 5 træ og savsmuld, hydroxyapatit og aluminium- eller titanhydroxid. Enzymer i denne form har forøget stabilitet, forlænget levetid og anvendelighed og udvindelighed. Reaktioner, hvori der anvendes immobi1iserede enzymer, kan gennemføres i søjler eller reaktionsbeholdere eller andre egnede reakto-10 rer.
Foruden carbohydratoxidase- eller g 1 ucose-2-oxidaseenzymerne behøves en kilde for oxygen. En fremgangsmåde til hydrogenper-oxidfjernelse eller -udnyttelse kræves også i reaktionen til omdannelse af glucose til D-glucoson. Dette skyldes, at H2O2 oxiderer visse kritiske steder på enzymmolekylet, hvilket be-skadiger dets funktion. Fremgangsmåder til hydrogenperoxid-fjernelse omfatter (1) dekomponer ing ved hjælp af enzymet ka-talase, (2) dekomponer ing ved hjælp af kendte kemiske midler 20 °9 (3) dekomponer ing ved anvendelse af dekomponer ingsmatrikser såsom manganoxid eller carbon black^·6'*7 som det immobilise-rende støttemateriale for oxidoreduktaseenzymet. I en foretrukket alternativ metode kan det dannede hydrogenperoxid, fremfor at blive dekomponeret, blive forbrugt til fremstilling 25 af et værdifuldt co-produkt. Sammenkobling af D-g1ucosonfremstilling med propylenhalohydrin- eller propylenox idfremstilling er et foretrukket eksempel som vist i fig. 1.
Den enzymatiske omdannelse af glucose til D-glucoson gennemføres fortrinsvis i vand ved omtrent neutral pH-værdi, men kan 30 gennemføres inden for et pH-værdi interval fra ca. tre til ca. otte ved anvendelse af passende puffere. Denne omdannelse gennemføres fortrinsvis ved omgivelsernes temperatur, men kan gennemføres inden for temperaturintervallet fra ca. 15eC til ca.
65*0._Trykket er fortrinsvis atmosfærisk tryk, men kan variere 35 fra tryk under til tryk over atmosfæretryk. Ethvert carbohy- dratmateriale, som ad kemisk eller enzymatisk vej giver glu cose, er en egnet kilde for glucose til omdannelse til D- 7
DK 153500B
glucoson og fructosesynthese. Disse stoffer omfatter: cellu lose, stivelse, saccharose, majssirup, HFCS og andre sirupper indeholdende forskellige mængder af glucose og fructose.
g Efter omdannelse af i alt væsentlig alt glucosen til D-gluco-son omdannes D-glucoson let og i alt væsentlig fuldstændigt til fructose under anvendelse af molekulært hydrogen og en passende katalysator. Kata 1ysatorerne, som er velegnede til det andet trin af denne proces, er en hvilken som helst af de 10 velkendte hydrogeneringskatalysatorer. Disse katalysatorer omfatter et eller flere metaller eller metalliske forbindelser med hydrogeneringsvirkning. Katalysatoren kan anvendes alene eller i blanding med acceleratorer. De foretrukne katalysatorer er valgt blandt grundstofferne i gruppe VIII i det perio-^g diske system. Disse grundstoffer, der hyppigt betegnes som de ædle metaller, omfatter nikkel, platin, palladium, rhodium etc. De mest foretrukne katalysatorer er palladium og nikkel. Andre tilfredsstillende katalysatorer er de metalliske grundstoffer fra gruppe Ib og Ilb i det periodiske system inklusive 20 kobber og zink. Overgangsmetaller er også tilfredsstillende katalysatorer til denne proces. Disse omfatter chrom, wolfram og mangan.
Katalysatorerne kan have form af det katalytiske metal eller metalforbindelse understøttet på en fast inaktiv bærepartikel.
2 5
Disse understøttede katalysatorer er nyttige til heterogene hydrogeneringer, hvori hydrogengassen og organisk fødemateria- le bringes i kontakt over en uopløselig form af katalysatoren.
Egnede bærere omfatter silica, aluminiumoxid, zirkoniumoxid, kiselgur, carbon og blandinger deraf.
30
Den foretrukne katalysator er pa 11 ad ium-på-carbon.
Katalysatoren kan have form af små uopløselige partikler, der danner en opslæmning i reaktionszonen, f.eks, Raney nikkel.
35
Heterogenkatalysatorer dannes almindeligivs ved aflejring af et salt af metallet, f.eks. et oxid, carbonat eller hydroxid, på den faste bærer. Disse stoffer omdanens så in situ til den 8
DK 153500B
aktive form af katalysatoren. Alternativt kan mellemprodukterne i denne proces reduceres til slutproduktet ved anvendelse af en reduktion ad kemisk vej. Det foretrukne stof til denne homogene reduktion er natriumborhydrid, som skal indgå i 5 støkiometriske mængder. Hydrogeneringen kan gennemføres ved omgivelsernes temperatur og tryk, men kan gennemføres ved højere eller lavere temperatur og tryk.
Prøverne, som anvendtes til at analysere sukkerarterne, er gi-vet nedenfor: 1. Tyndt!agskromatografi {TLC). Avicelbelagte glasplader fremkaldes med et 8:8:2:4 (efter volumen) isopropanol:pyridin:ed-dikesyre:vand-opløsningsmiddelsystem. Glucose og fructose har Rf-værdier på 0,5-0,6. D-glucoson har en Rf på 0,4-0,5 streg.
i 5 (Rf * den afstand, som stoffet vandrer fra begyndelsespunk-tet/opløsningsmiddelfrontafstanden fra begyndelsespunktet).
Når pladerne sprøjtes med triphenyltetrazoliumchlorid (2% TTC i 0,5N NaOH), giver både D-glucoson og fructose øjeblikkeligt røde pletter; glucose giver kun en rød plet efter opvarmning i 20 10 min ved 100°C. Når pladerne sprøjtes med diphenylamin/ani-1in/phosphorsyre/ethylacetat-reagens (0,15 g/0,8 ml/11 ml/100 ml), giver glucose en brun plet, og 0-glucoson giver en purpurfarvet streg og fructose giver en gul plet ved opvarmning i 10 min til 95°C.
25 2. Højeffektiv væskekromatografi (HPLC). En μ-Bondapak-carbo-hydratsøjle indkøbt hos Waters Associates køres med 15% vandig acetonitril indeholdende 0,001 M kaliumphosphatpuffer, pH-vær-di 7, ved en strømningshastighed på 2 ml/min. Glucose har en 30 retentionstid Rf på 11,5 og D-glucoson en Rf på 14,0 og fructose en Rf på 9,5. Der gennemføres forsøg på et spektra physics SP8000-instrument under anvendelse af både en Waters Associates-brydningsindeksdetektor og en Schoeffel-UV-detektor med variabel bølgelængde indstillet til 192 nm.
35 3. Massespektrometri (MS). Den følgende derivatiseringsproto-kol anvendes ti! at gøre de kemiske komponenter flygtige: g
DK 153500B
(a) Til ca. 100 mg af den 1 yof i 1 i serede prøve sættes 110 mg N, N-di phenylhydraziη (H2NN02} og 1 ml 75¾ vandig ethanol. Reaktionsblandingen omhvirvles og får derpå lov til at henstå natten over ved stuetemperatur.
5 (b) 3 ml vand sættes til reaktionsblandingen, og det resulterende bundfald skilles fra supernatanten ved centrifugering og dekantering. Til dette bundfald sættes 1 ml af en l:l-blanding af pyridin/eddikesyreanhydrid. Reaktionsblandingen anbringes i et 35-40°C vandbad i 15 min med lejlighedvis omrystning.
(c) 2 ml vand tilsættes for at standse reaktionen, og derpå ekstraheres blandingen 2 gange med 3 ml portioner af ethyl-ether. Etheren tørres over en ringe mængde vandfrit natriumsulfat, og derpå afdrives etheren ved svag opvarmning (-40*0) og 15 strømmende nitrogen.
(d) Det resulterende faste stof eller den resulterende sirup er klar til massespektrometri sk analyse.
2Q Forventede reaktioner: -CH0 -CH=NNø2 >C = 0 (1) H2NN02_^ )C = 0 (upåvirket) -OH (2) AC2O, pyridin -OAc 25 Glucose giver en molekylion ved masse 556 (C28H32N2°10) °9 en baseion ved masse 168 (N02-ionfragment); fructose giver en molekylion ved masse 390 (CiøH22°H); D-glucoson giver en molekylion ved masse 512 (C26H28N2°9) °9 en intens diagnostisk fragmention ved masse 223 (0C-CH=N-Nø2“ionfragment). Forsøg 30 foretages på et Finnigan GC/MS/DS Model 4023-instrument indstillet til 70 eV elektron-impact-ionisering og til en sondetemperatur på 2200C.
4. Kolometrisk testrørsprøve. Analysen af D-glucoson i nærvæ-g5 relse af et overskud af glucose bestemmes let ved hjælp af to kolometriske metoder. Under anvendelse af triphenyltetrazoli-umchlorid (TTC) er bestemmelsesmetoden baseret på en differential reduktionshastighed af de to sukkerarter. Til et 20 ml 10 .
DK 153500B
testrør sættes 0,5 ml prøve plus 0,1 ml 1% vandig TTC plus 0,4 ml 6N NaOH. Efter nøjagtigt 5 min forløb tilsættes 15 ml eddi-kesyre/ethanol (1:9), og indholdet i testrøret omhvirvles. Med vand som blindprøve måles absorbansen ved 480 nm under anven-5 delse af en Varian 635 UV/VIS-spektrometer. Glucose reducerer TTC til et rødt pigment, en triphenylformazan, ca. 100 gange langsommere end en ækvivalent mængde D-glucoson. Under anvendelse af diphenyl amin/ani1 in/phosphorsyrereagens er bestemmelsesmetoden baseret på de forskellige farver, der dannes med 10 sukkerarter af forskellige strukturer. Til et 20 ml testrør sættes 0,2 ml prøve plus 5 ml af den følgende reagensblanding: diphenylamin 0,15 g anilin 0,80 ml isopropanol 100 ml phosphorsyre 11 ml
Testrørene anbringes i 37°C vandbad i 60 min. Glucose giver en gulfarvet opløsning; D-glucoson giver en purpurfarvet opløsning.
20
Kilder for de rene sukkerarter, der anvendes i de forskellige analytiske aspekter, er angivet nedenfor: 1. D-glucose blev indkøbt fra Applied Science Laboratories, 25 99% rent.
2. D-fructose blev indkøbt fra Applied Science Laboratories, 99+% rent.
3. D-glucoson blev syntetiseret kemisk ved hjælp af følgende 30 metode: 20 g glucose blandes med 1 liter destilleret vand indeholdende 27 ml iseddikesyre. 44 g phenyl hydrazin tilsættes. Reaktionen gennemføres i 3 timer ved 80°C under kraftig omrøring ved hjælp af en mekanisk omrører og afkøles derpå til stuetemperatur natten over. Det faste stof filtreres fra og 35 vaskes med 10% eddikesyre, vand og derpå ethylether. Det faste stof tørres omhyggeligt i en vakuumovn ved 50eC. Forsøgsudbyttet er 16,1 g glucosazon. Glucosazonet anbringes i en 3-hal-set, 3 liter kolbe, og 450 ml ethanol, 750 ml destilleret vand
DK 153500B
π og 9 ml iseddike tilsættes. 27,8 g frisk benzaldehyd tilsættes og bringes til tilbagesvaling med kraftig omrøring ved hjælp af en mekanisk omrører. Reaktionen tilbagesvales i 5 timer. Svaleren vendes, og 450 ml destilleres over, idet der tilsæt-5 tes 750 ml destilleret vand (via en tildrypningstragt) til kolben. Reaktionsblandingen afkøles natten over for at tillade udfældning af benzaldehydpheny1hydrazon. Opløsningen filtreres, og resten vaskes med destilleret vand ("1 liter), indtil vandet bliver klart. Filtratet plus vaskevæskerne koncentreres 10 til 500 ml og ekstraheres derpå med 10 gange 300 ml portioner ethylether. For at slippe af med resterende ethylether i den vandige opløsning anbringes den på en rotationsfordamper i 30 min. Den vandige opløsning ledes gennem en 4 gange 100 cm søjle indeholdende omhyggeligt acetone-vasket Amber!ite XAD-2.
15 Søjlen vaskes med yderligere 200 ml vand for at fjerne resterende glucoson. De forenede vandige portioner lyofi 1iseres. Forsøgsudbytte af glucoson er 3,4 g (16¾ samlet udbytte).
De følgende eksempler belyser fremgangsmåden ifølge opfindel-20 sen yderligere. Med mindre andet er anført, er alle temperaturerne omgivelsernes temperatur (ca. 25°C) og alle tryk omgivelsernes tryk (ca. 1 atm).
Eksempel 1 25 I alt væsentligt fuldstændig omdannelse af glucose til D-glu-coson under anvendelse af immobi1iseret carbohydratoxidase er vist i dette eksempel.
Glucose (2 g) sættes til 20 ml destilleret vand i en 100 ml 3Q Pyrex-kolbe, og sukkeropløsningen omrøres. Oxygengas bobles ind i kolben, og 3 mg katalase (Sigma Chemical Co., C-40, fra okselever) tilsættes. Agaroseitnmobi 1 iseret carbohydratoxidase fremstillet som angivet nedenfor ud fra 200 ml kultur sættes også til kolben.
3 5
Til fremstilling af enzymet dyrkes mycelpuder af Polyporus ob-tusus ATCC nr. 26733 på skråstivnede gær/maltekstraktagarsub-strater som følger: gærekstrakt (3 g), maltekstrakt (3 g), 12
DK 153500B
agar (20 g), pepton (5 g) og glucose (10 g) sættes til destilleret vand (1 liter), og pH-værdien indstilles på 6,7. Mediet steriliseres ved 121°C i 15 min. pH-værdien indstilles så på 6,4. Organismen podes på de skråstivnede agarsubstrater og 5 dyrkes i 7 dage ved 25eC. Den på det skråstivnede substrat dyrkede organisme anvendes derpå til podning af gær/maltek-straktmedium (20 ml medium i 125 ml Erlenmeyerkolbe), fremstillet som ovenfor (men uden tilsætning af agar). Organismen dyrkes i 9 dage på et roterende rysteapparat ved 25°C. Kultu-10 ren vakuumfiltreres gennem Whatman papir nr. 541 i en Buchner-tragt. De på filterpapiret tilbageholdte mycelier indeholder enzymet.
Mycelierne, opnåede af 400 ml kultur, vaskes to gange med 0,05M 15 kaliumphosphatpuffer ved pH-værdi 7,0. Mycelierne anbringes så i et Waringblandeapparat, som indeholder 70 ml 0,05M kalium-phosphatpuffer ved pH-værdi 7,0 og homogeniseres derpå i 3 min. Blandingen centrifugeres så ved 6000 omdr. pr. min i 20 min, og supernatanten dekanteres fra det faste stof. Til su-2Q pernatanten, anbragt i en 500 ml Erlenmeyerkolbe, sættes 19 g polyethylenglycol (vægt 4000), og opløsningen omrøres i 30 min. Suspensionen centrifugeres så ved 7000 omdr. pr. min i 20 min. Supernatanten dekanteres fra og kasseres. 15 ml 0,2M na-triumchlorid plus 15 ml 0,05 M kal i umphosphatpuf f er ved pH-25 værdi 7,0 sættes derpå til bundfaldet og omhvirvles. Opløsningen får lov til at henstå i 30 min, i hvilket tidsrum der dannes et bundfald. Blandingen centrifugeres ved 14000 omdr. pr. min i 20 min. Der afdekanteres en uigennemsigtig, hvid supernatant indeholdende cellefrit, renset enzym.
30
Immobilisering af enzymerne på agarose kan gennemføres som følger: Det cellefri rensede enzym dialyseres mod 500 ml destilleret vand natten over. Derpå tilsættes 5 ml 0,1 M natri-umbicarbonat ved pH-værdi 8,0. Til denne opløsning sættes 5 g aktiveret CH-sepharose 4B (vasket og genopkvældet på et sint-35 ret glasfilter under anvendelse af 500 ml 1 mM HC1). Under anvendelse af et ende-over-endeblandingsapparat blandes gelsuspensionen i en time ved 25°C. Gelsuspensionen vaskes så først
DK 153500 B
13 med 40 ml 0,1 M natriumbicarbonat ved pH-værdi 8,0, derpå med 40 ml 0,05 M Tris puffer ved pH-værdi 8,0 indeholdende 0,5 M natriumchlorid og derpå med 0,5 M natriumformiatpuffer ved pH-værdi 4,0 også indeholdende 0,5 M natriumchlorid.
5
Prøve af reaktionsblandingen udtages på forskellige tidspunkter og analyseres for glucose og D-glucoson. Under anvendelse af HPLC foretages kvantitativ bestemmelse af spidsarealerne af spidserne ved 11¾ på 11,5 min (glucose) og R* på 14,0 min (D-jq glucoson), og koncentrationer af tilstedeværende sukker beregnes. Der opnås følgende resultater:
Reaktionstid, Glucose, D-glucoson, % glucose omdannet timer g _g_ til D-glucoson 15 0 2,0 0,0 0 1 1,2 0,8 40 2 0,5 1,5 75 3 0,2 1,8 90 4 0,1 1,9 99+ 20
Den væsentlige omdannelse af glucose til D-glucoson vises også ved forsvinden af pletten ved Rf på 0,58 (glucose) og tilsynekomsten af stregen ved Rf på 0,43-0,49 (D-glucoson) i løbet af reaktionen og ved forøgelsen af absorbansen ved 480 nm i 25 løbet af reaktionen under anvendelse af TTC-kolorimetritest-rørsprøven.
At produktet helt bestemt er D-glucoson, bekræftes ved deriva-tisering efterfulgt af massespektrometri som beskrevet tidligere. De diagnostiske D-glucosonmasseioner ved masse 512 30 (molekylion) og masse 223 (0C-CH=N-Nø2-ionfragment) opnås for produktet.
Eksempel 2 35 Det følgende eksempel illustrerer den kemiske omdannelse af D-glucoson til fructose under anvendelse af forskellige katalysatorer: 14
DK 153500B
D-glucoson (20 mg) sættes til 2 ml destilleret vand i et mi-kro-hydrogenatorapparat (Superlco, Inc.). Katalysatoren (50 mg) tilsættes derpå, og til apparatet fødes hydrogengas - kontinuerligt tilboblet, hvis den er ved atmosfærisk tryk, char-5 gevis tilsat, hvis trykket er over atmosfærisk tryk.
Efter 5 timers forløb analyseres resterende D-glucoson og det dannede fructose.
Under anvendelse af HPLC foretages der kvantitativ bestemmelse 10 af spidsarealerne af spidserne R^ på 14,0 min. (D-glucoson) og R^ på 9/5 min. (fructose) og koncentrationerne af tilstedeværende sukker beregnes. Der opnås følgende resultater: %D-glucoson 15 Katalysator3_Tryk_omdannet til fructose 50% ruthenium på alum i- atmosfærisk 40 n i umoxi d 5% rhodium på carbon atmosfærisk 50 20 5% platin på carbon atmosfærisk 60 55 psi 70 10% platin på carbon atmosfærisk 75 2 5 platin-sort atmosfærisk 80 platinoxid 55 psi 65 5% palladium på carbon atmosfærisk over 90 30 55 psi over 90
Raney nikkel atmosfærisk 30b katalysatorer var fra Engelhard Industries, bortset fra Raney Nickel, som var fra Pfaltz og Bauer, Inc.
35 bDenne katalysator reducerer også det dannede fructose - en uønsket virkning.
15
DK 153500B
Omdannelsen af D-glucoson til fructose vises også ved, at der ikke optræder nogen streg ved Rf på 0,43-0,49 (D-glucoson) og tilstedeværelsen af plette ved Rf på 0,52.
5 At produktet helt bestemt er fructose beskræftes ved deriva-tisering efterfulgt af massespektometri, som beskrevet tidligere. Den diagnostiske fructosemassei on ved masse 390 (mole-kylion) opnås for produktet.
Eksempel 3 10 I alt væsentlig fuldstændig omdannelse af D-glucoson til fructose under forskellige hydrogeneringsbetingelser vises i dette eksempel.
Reaktion A: 15 - D-glucoson (1 g) sættes til 200 ml destilleret vand i et mikro-hydrogenatorapparat. 5% palladium {Pd) på carbon (1 g) tilsættes så, og hydrogengas bobles kontinuerligt til beholderen ved atmosfærisk tryk og omgivelsernes temperatur. Efter 20 24 timers forløb tilsættes yderligere 5% palladium på carbon (500 mg). Reaktionen er afsluttet efter 30 timers forløb.
Reaktion B: D-glucoson (1 g) opløses i 136 ml vand, og 0,1 g 5¾ palladium Zo på carbon sættes til opløsningen. Opløsningen anbringes i en trykbeholder forsynet med en effektiv magnetomrører. Apparatet sættes under tryk på 500 psig med H2 efter den sædvanlige fjernelse af luft. Beholderen opvarmes til 130°C, medens ind-3Q holdet omrøres kraftigt. Den beregnede mængde H2 optages i løbet af 75 min. Efter fjernelse af katalysator og afdampning af vand i vakuum fås der som rest en sirup. Produktet identificeres som fructose. Proton NMR-spektret bekræfter desuden fraværelsen af mannitol og sorbitol, produkterne ved yderlige-3g re reduktion.
16
DK 153500B
Reaktion C: D-glucoson (2 g) opløses i 140 ml 88% vandig ethanol og omsættes som i reaktion B. Den teoretiske mængde H2 forbruges i _ løbet af 16 timer.
O
Betingelserne for hver reaktion og de opnåede resultater er sammenfattet i den følgende tabel: Vægtforhold
10 af katalysa- °C
tor til Opløsnings- Tempe- Tryk Tid %
Reaktion qlucoson_middel_ratur_psiq timer omdannelse A 1,5 H2O 25 0 30 95% B 0,1 H20 130 625 1,25 100% 15 C 0,1 (88:12)EtOH: 130 575 4 100% H20
Det fremgår, at hydrogeneringen af D-glucoson til fructose kan gennemføres under en lang række forskellige betingelser inklu-sive ændringer i temperatur, tryk, opløsningsmiddel, reaktionstid og vægtforhold af katalysator til substrat. Palladiumkatalysatoren reducerer ikke yderligere fructose.
Eksempel 4 25 Det følgende repræsenterer et eksempel på i alt væsentlig fuldstændig omdannelse af glucose til fructose ved indvirkning af immobiliseret carbohydratoxidase efterfulgt af kemisk reduktion .
3Q Glucose (1 g) sættes til 50 ml destilleret vand i en 250 ml
Pyrexkolbe og sukkeropløsningen omrøres. Agarose-immobi1iseret carbohydratoxidase fremstillet som i eksempel 1 af 50 ml cellefrit, renset enzym, sættes så til kolben sammen med 1 mg ka-talase (som i eksempel I).
35
Atten timer senere dekanteres den vandige opløsning fra det faste stof. Analyse af denne opløsning viser, at 99% af glu-cosen er blevet omdannet til D-glucoson.
17
DK 153500B
Den vandige opløsning anbringes i en 100 ml Pyrexkolbe og omrøres. 1 g 5% palladium på carbonkatalysator tilsættes, og hydrogengasbobli ngen startes. Efter 24 timers forløb filtreres den vandige opløsning fra det faste stof under anvendelse af 5 Whatman no. 1 filterpapir og Celite filtreringshjælpemiddel. Analyse viser, at over 95¾ består af fructose.
Eksempel 5
Dette eksempel viser fremstillingen af krystallinsk fructose 10 , .
af glucose.
Den enzymatiske omdannelse af glucose til D-glucoson og den kemiske reaktion af D-glucoson til fructose giver den vandige opløsning fra eksempel 4. Dette vandige filtrat inddampes til 15 tørhed under vakuum ved 45°C. Der fås et hvidt fast stof, som hurtigt omdannes til en gummiagtig rest.
Denne rest opløses i 10 ml varm ethanol, og opløsningen får derpå lov til at afkøle ved stuetemperatur i 5 dage. Det re-20 suiterende hvide krystallinske stof har de samme fysiske egenskaber (dvs. udseende, smeltepunkt og optisk drejning) som krystallinsk fructose. Det er krystallinsk fructose.
Eksempel 6 25 Dette eksempel viser i alt væsentligt fuldstændig enzymatisk omdannelse af glucose til D-glucoson under anvendelse af glucose-2-oxidase.
Reaktionen og betingelserne fra eksempel 1 (under anvendelse 30 af agarose som det immobi 1 i serende støttemateriale) gentages, idet glucose-2-oxidase anvendes i stedet for carbohydratoxi-dase. Efter 5 timers reaktion var mere end 99¾ af glucosen omdannet til D-glucoson.
Til fremstilling af enzymet glucose-2-oxidase dyrkes mycelkul-3 5 turer af Aspergillus oryzae ATCC no. 7252 i kød, gærekstrakt/-tryptonmedium som følger: kødekstrakt (5 g), gærekstrakt (5 g), trypton (3 g), dextrose (1 g) og Difco-sti vel se (24 g) sættes 18
DK 153500B
til destilleret vand (1 liter), og pH-værdien indstilles på 7,3. Mediet steriliseres ved 121°C i 35 min. Under anvendelse af sporer opnået på almindelig kendt måde podes mediet til opnåelse af ca. 3 x 104 sporer/ml og dyrkes i et roterende ry-5 steapparat (180 omdr. pr. min.) ved 30°C i 2 dage. Kulturen vakuumfiltreres gennem Whatmanpapir nr. 541 i en Buchnertragt og vaskes adskillige gange med vand. Mycelierne, der er tilbage på filterpapiret, indeholder enzymet.
Rensning og i mmob i lisering af enzymet kan så forløbe under anvendelse af fremgangsmåden fra eksempel 1.
D-glucoson kan så kemisk omdannes til fructose under anvendelse af fremgangsmåden fra eksempel 3.
15 Eksempel 7 I eksempel 1 blev koncentrationen af frit hydrogenperoxid, dannet ved omsætningen af glucose med carbohydratoxidase i forbindelse med D-glucosondannelsen, holdt så lav som mulig 20 ved anvendelse af katalase til dekomponer ing af hydrogenper-oxidet. En alternativ metode til at holde koncentrationen af frit hydrogenperoxid så lav som mulig er at koble fremstillingen heraf til en hydrogenperoxidudnyttende reaktion, som giver et ønskeligt (værdifuldt) co-produkt.
25 I dette eksempel kobles hydrogenperoxidproduktionen til produktionen af propylenbromhydrin, et mellemprodukt ved propy-lenoxidsynthesen ifølge begreber, som er angivet detaljeret i US patentskrift nr. 4.284.723 og US patentskrift nr.
4.247.641. Omsætningen af glucose og den immobi1iserede carbo-30 hydratoxidase fra Polyporus obtusus ATCC no. 26733 til dannelse af D-glucoson og hydrogenperoxid kobles til omsætningen af immobi1iseret tang- eller algeperoxidase fra Coralina sp. i nærværelse af bromid og propylen til dannelse af propylenbrom- hydrin. Slutresultatet af denne koblede reaktion er så co-pro-35 duktionen af glucoson til efterfølgende fructosedannelse og af propylenbromhydrin, som let omdannes til propylenoxid, som beskrevet i US patentskrift nr. 4.284.723 og US patentskrift nr.
19
DK 153500B
4.247.641. Ethvert enzym, som er i stand til at oxidere hydro-xylgruppen på 2-carbonatomet i glucose med ledsagende produktion af hydrogenperoxid, kan kobles til enhver halogenerende peroxidase og det sammensatte stof anvendes til alken-halohy-5 dr i nprodukt ion i overensstemmelse med læren i de førnævnte US patentskri fter.
Cellefrit, renset tang- eller algeperoxidaseenzym fremstilles som følger:
Coralina sp., opnået fra kysten af La Jolla, Californien, formales i en Virtis 45 homogen i sator i 5 min i destilleret vand. Homogenatet roteres ved 20.000 omdr. pr. min i 20 min. Super-natanten dekanteres fra og gemmes. Pillen resuspenderes i destilleret vand og centrifugeres igen. Supernatanten og den 15 tidligere nævnte supernatant forenes. Opløsningen bringes først til 33¾ og derpå til 55¾ mætning i ammoniumsulfat. Centrifugering og separering af pillen gennemføres i hvert trin.
Den 33^55¾ pillefraktion sendes gennem en DEAE-søjle under anvendelse af en 0,3M-1M phosphatpuffer-(pH-værdi 6,0)-gradi- 20 ent. Fraktionen, som eluerer ved 1M, dialyseres mod 20 mM pho-sphatpuffer (pH-værdi 6) natten over.
Den immobi1iserede tang- eller algeperoxidase fremstilles som følger .· 25
Glasperler (opnået fra Sigma Chemical Company, PG-700-200) aktiveres ved at suspendere 1 g glasperler i 18 ml deioniseret vand. 2 ml 10¾ (v/v)a-amino-propyltriethoxysilan tilsættes, og blandingens pH-værdi indstilles på 3-5 med 6N HC1. Blandingen gø omrystes ved 75°C i 2 timer. Glasperlerne vakuumtørres så natten over ved 80°C. 3,2 ml renset Coralina sp.-enzym, fremstillet som ovenfor, og 50 mg vandopløseligt carbodiimid sættes til glasperlerne. pH-værdien indstilles på 4,5, og blandingen omrystes så ved 4°C natten over. Produktet (enzymbelagte 35 perler) vaskes med vand. Aktiviteten måles som 2 monochlordi-medonenheder/g perler.
Immobi1iseret carbohydratoxidase på agarose fremstilles som i eksempel 1 af 10 ml cellefrit, renset enzym.
20
DK 153500B
En reaktionsblanding indeholdende følgende bestanddele anbringes i en 100 ml Pyrexkolbe: a) 1 g glasperler overtrukket med tang- eller algeperoxi- 5 dase, b) den ovenfor fremsti 11ede immobi1 i serede carbohydrat-oxidase, c) 800 mg kaliumbromid og d) 20 ml 0,01M kaliumphosphatpuffer, pH-værdi 7,0.
Både propylen og oxygen bobles til kolberne kontinuerligt. Reaktionen startes med 1 g glucose. Efter 20 timers forløb udtages en prøve af reaktionen, som analyseres for restglucose, D-glucoson og propylenbromhydrin . Det dannede propy1enbromhy- drin analyseres som følger·.
15 5 μΐ af reaktionsblandingen indsprøjtes i en Hewlett-Packard Model 402 gaskromatograf, forsynet med en 1,8 m gange 0,32 cm glassøjle, pakket med Porapak R (80/100 mesh). Strømningshastigheden indstilles på 30 ml/minut for helium, og søjletempe-20 raturen indstilles på 200°C. Retentionstider for propylenbrom-hydri.nerne er 9 min for l-brom-2-propanol og 10 min for 2-brom-l-propanol .
Produktidentitet blev bekræftet ved sammenligning med auten-25 tiske prøver af propylenbromhydrin: l-brom-2-propanol leveres af Pfaltz og Bauer, Inc.; 2-brom-l-propanol syntetiseres ved hjælp af lithiumaluminumhydridreduktion af 1-brompropiony1-chlorid. Reaktionsprodukterne og de autentiske prøver viser de samme retentionstider og identiske massespektra: brom identi-30 ficeres ved nærværelse af M- og (M+2)-isotopbundter af ens intensitet. Molekyl ionen for begge isomerer bekræftes ved kemisk ionisering med isobutanreagensgas (M+; m/e 138+140); for l-brom-2-propanol er hovedfragmenteringen det forventede tab af CH2=Br, medens hovedfragmenteringen for 2-brom-l-propanol 35 er det forventede tab af CH3CHBr.
Analysen af prøven viste en omdannelse på over 99% af glucose til D-glucoson og propylenbromhydrinomdannelse på 20 g/1.
DK 153500 B
21
Eksempel 8
Dette eksempel tjener til yderligere belysning af begreberne, som er angivet og vist i eksempel 7. I dette tilfælde erstatt-g es immobiliseret carbohydratoxidase med immobiliseret glucose-2-oxidase.
Det i mmob i 1 i s'erede tang- eller algeperoxidaseenzym fremstilles som beskrevet i eksempel 7. Den immobi1iserede glucose-2-oxidase fremstilles som beskrevet i eksempel 6.
10
Reaktionsblandingen tilberedes som i eksempel 7, idet der i stedet for immobiliseret carbohydratoxidase anvendes immobiliseret giucose-2-oxidase.
Efter 20 timers forløb udtages der en prøve af reaktionsblandingen, som analyseres for restglucose, D-glucoson og propy-lenbromhydrin. Resultaterne viste en omdannelse på over 99¾ af glucose til D-glucoson og en propylenbromhydrinproduktion på 19,5 g/1 i ter .
20
Eksempel 9
Dette eksempel belyser en høj omdannelse af glucose til D-glucoson i løbet af et udstrakt tidsrum under anvendelse af immobiliseret carbohydratoxidase i en søjlereaktor.
25
Carbohydratoxidase (cellefrit, renset enzym) {10 ml), fremstillet som i eksempel 1, immobi1iseres på hydroxyapatit (kal-ciumphosphathydroxid) som følger:
Til 100 ml cellefrit, renset enzym sættes 20 g hydroxyapatit i 30 100 ml 1 mM kaliumphosphatpuffer ved pH-værdi 7,0. Blandingen omrøres i 30 min, og det faste stof skilles fra væsken ved dekantering, hvorpå det faste stof vaskes først med 200 ml 10 mM kaliumphosphatpuffer ved pH-værdi 7,0 og derpå med 200 ml dest i lieret vand.
35
Dette stof pakkes så i en glassøjle (0,5 cm x 4,5 cm). En 1¾ glucoseopløsning ledes gennem søjlen ved en strømningshastighed på 1,5 ml pr. time. Eluanten analyseres periodisk for restglucose og dannet D-glucoson.
Claims (13)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af fructose ud fra glucose, kendetegnet ved, at man tilvejebringer en vandig 25 opløsning af glucose, omdanner ca. 95¾ af glucosen i opløsning til D-glucoson ved enzymatisk oxidation med et oxidoreduktase-enzym i nærværelse af oxygen, mens man fjerner eller udnytter co-produceret hydrogenperoxid, og efter omdannelsen hydrogenerer D-glucosonet til D-fructose ved hjælp af en hydrogene-30 ringskatalysator.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at D-fructosen udvindes i krystallinsk form.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at 3 5 D-fructosen udvindes ved inddampning.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at D-fructosen udvindes ved udfældning. DK 153500B
5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at D-glucosonet fra oxidationen udvindes som en sirup og genopløses i et organisk opløsningsmiddel, hvori hydrogeneringen af D-glucosonet forårsager direkte udfældning af fructosekry- 5 stal ler.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at oxidoreduktaseenzymet har giucose-2-oxidase-akti vitet.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at enzymet er valgt fra den gruppe, der består af glucose-2-oxidase fra Aspergillus oryzae og carbohydratoxidase fra Polyporus obtusus.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, 15 at enzymet immobi1iseres.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hydrogenperoxidet fjernes ved enzymatisk dekomponer ing ved hjælp af katalase. 20
10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hydrogeneringstrinnet katalyseres ved hjælp af en hydrogeneringskatalysator valgt fra den gruppe, der består af grundstofferne i gruppe VIII, de metalliske grundstoffer i grupperne IB og IIB og overgangsmetallerne chrom, wolfram og 25 mangan.
11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at hydrogeneringskatalysatoren omfatter palladium på et støttemateriale. 30
12. Fremgangsmåde til fremstilling af krystallinsk fructose ud fra glucose, kendetegnet ved, at man tilvejebringer en vandig opløsning af D-glucose, omdanner mindst 95¾ af glucosen i opløsning til D-glucoson i opløsning ved anven- 35 delse af et immobi1iseret oxidoreduktaseenzym med glucose-2-oxidaseaktivitet, idet co-produceret hydrogenperoxid fjernes eller udnyttes, hydrogenerer D-glucosonet til D-fructose, og udvinder D-fructosen i krystallinsk form. DK 153500B
13. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den gennemføres i en søjlereaktor. 5 10 15 20 25 30 35
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK040083A DK153571C (da) | 1979-10-24 | 1983-02-01 | Fremgangsmaade til fremstilling af d-glucosone |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8810379 | 1979-10-24 | ||
| US06/088,103 US4246347A (en) | 1979-05-29 | 1979-10-24 | Process for the production of fructose |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK399880A DK399880A (da) | 1981-04-25 |
| DK153500B true DK153500B (da) | 1988-07-18 |
| DK153500C DK153500C (da) | 1988-12-05 |
Family
ID=22209387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK399880A DK153500C (da) | 1979-10-24 | 1980-09-22 | Fremgangsmaade til fremstilling af fructose |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4246347A (da) |
| EP (1) | EP0028136B1 (da) |
| JP (2) | JPS5858075B2 (da) |
| AT (1) | ATE11057T1 (da) |
| CA (1) | CA1166987A (da) |
| DE (1) | DE3069914D1 (da) |
| DK (1) | DK153500C (da) |
| ES (1) | ES8106933A1 (da) |
| FI (1) | FI69314C (da) |
| IE (1) | IE50248B1 (da) |
| IL (1) | IL61213A0 (da) |
| NO (1) | NO155628C (da) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4321323A (en) * | 1980-06-18 | 1982-03-23 | Standard Brands Incorporated | Carbohydrate process |
| US4321324A (en) * | 1980-06-18 | 1982-03-23 | Standard Brands Incorporated | Process for making glucosone |
| JPS57500965A (da) * | 1980-06-18 | 1982-06-03 | ||
| US4423149A (en) * | 1981-10-15 | 1983-12-27 | Cetus Corporation | Process for the production of D-glucosone |
| US4503153A (en) * | 1982-03-29 | 1985-03-05 | Cetus Corporation | Method for producing aldehydes from primary alcohols |
| US4440855A (en) * | 1982-06-30 | 1984-04-03 | Nabisco Brands, Inc. | Process for preparing L-glucosone |
| US4442207A (en) * | 1982-06-30 | 1984-04-10 | Nabisco Brands, Inc. | Process for production of glucosone |
| WO1984000778A1 (en) * | 1982-08-20 | 1984-03-01 | Cetus Corp | Process for the production of mannitol and sorbitol |
| US4568638A (en) * | 1983-05-16 | 1986-02-04 | Nabisco Brands, Inc. | Method for screening microorganisms for the production of glucose-2-oxidase |
| EP0125698B1 (en) * | 1983-05-16 | 1989-12-13 | NABISCO BRANDS, Inc. | A process for screening microorganisms producing glucose-2-oxidase |
| US4937192A (en) * | 1983-05-24 | 1990-06-26 | Cetus Corporation | Fungal chloroperoxidase method |
| US4707447A (en) * | 1983-05-24 | 1987-11-17 | Cetus Corporation | Fungal chloroperoxidase method |
| US4937191A (en) * | 1983-05-24 | 1990-06-26 | Cetus Corporation | Stable haloperoxidase method |
| US4707446A (en) * | 1983-05-24 | 1987-11-17 | Cetus Corporation | Stable haloperoxidase method |
| US4568645A (en) * | 1984-02-24 | 1986-02-04 | Cetus Corporation | Fungal pyranose-2-oxidase preparations |
| US4569913A (en) * | 1984-02-24 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | P. obtusus pyranose-2-oxidase preparation |
| US4569910A (en) * | 1984-02-24 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Methods and reagents for pyranosone production |
| US4569915A (en) * | 1984-02-24 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | P. obtusus strain |
| JPS6135743U (ja) * | 1984-08-01 | 1986-03-05 | 富士紡績株式会社 | 研磨布 |
| JPS6458475A (en) * | 1987-08-25 | 1989-03-06 | Rodeele Nitta Kk | Grinding pad |
| FR2665179B1 (fr) | 1990-07-25 | 1995-03-03 | Centre Nat Rech Scient | Procede d'hydroxylation d'un radical methylene acyclique ou cyclique en position allylique, composition pharmaceutique contenant des esters d'hydroxycholesterol et utilisation de ces compositions pour la preparation de medicaments. |
| US5747346A (en) * | 1991-08-29 | 1998-05-05 | Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. | Detection of novel carbohydrates directly associated with chronic alcoholism |
| US5958785A (en) * | 1991-08-29 | 1999-09-28 | Research Foundation For Mental Hygiene | Detection of a carbohydrate biomarker directly associated with chronic alcoholism |
| US5229118A (en) * | 1991-09-30 | 1993-07-20 | Aqua-10 Corporation | Feed and water additive and method of making same |
| FR2792939B1 (fr) * | 1999-04-27 | 2001-07-27 | Roquette Freres | Procede de preparation de fructose par hydrogenation de la glucosone |
| FR2798137A1 (fr) * | 1999-09-07 | 2001-03-09 | Bonneau Marguerite Gabr Calone | Appareil generateur de radicaux chimiques oxygenes et ses applications industrielles |
| FR2801901B1 (fr) * | 1999-12-07 | 2003-11-14 | Roquette Freres | Procede de transformation de matieres organiques, en particulier saccharidiques, comprenant une etape d'oxydation enzymatique en presence de ruthenium ou palladium |
| US20100173044A1 (en) * | 2007-07-27 | 2010-07-08 | Novozymes A/S | Maltobionate as antioxidant in food products |
| US7935740B2 (en) | 2008-12-30 | 2011-05-03 | Basell Poliolefine Italia S.R.L. | Process for producing high melt strength polypropylene |
| US20100174099A1 (en) * | 2009-01-05 | 2010-07-08 | Lyondell Chemical Technology, L.P. | Propylene oxide reactor gas distribution system |
| DE102009010714A1 (de) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Merck Patent Gmbh | Vernetzbare und vernetzte Polymere, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung |
| AT513928B1 (de) * | 2013-02-06 | 2015-06-15 | Annikki Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Fructose |
| CN107556345A (zh) * | 2017-08-24 | 2018-01-09 | 北京林业大学 | 一种酶催化结合化学催化制备果糖或甘露醇的方法 |
| EP3839054A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-23 | Cascat GmbH | Production of fructose from oligo- and/or polysaccharides |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3050444A (en) * | 1959-04-03 | 1962-08-21 | Dawes Lab Inc | Method for the production of levulose |
| US3956065A (en) * | 1973-02-02 | 1976-05-11 | Cpc International Inc. | Inert, non-porous granules for flow control in a plug flow reactor |
| JPS5239901B2 (da) * | 1973-02-12 | 1977-10-07 | ||
| US3868304A (en) * | 1973-02-16 | 1975-02-25 | Corning Glass Works | Method of making fructose with immobilized glucose isomerase |
| CA1116543A (en) * | 1978-06-12 | 1982-01-19 | Saul L. Neidleman | Method for producing epoxides and glycols from alkenes |
-
1979
- 1979-10-24 US US06/088,103 patent/US4246347A/en not_active Expired - Lifetime
-
1980
- 1980-09-18 NO NO802769A patent/NO155628C/no unknown
- 1980-09-19 FI FI802967A patent/FI69314C/fi not_active IP Right Cessation
- 1980-09-19 ES ES495185A patent/ES8106933A1/es not_active Expired
- 1980-09-22 DK DK399880A patent/DK153500C/da not_active IP Right Cessation
- 1980-09-29 JP JP55135732A patent/JPS5858075B2/ja not_active Expired
- 1980-09-29 CA CA000361229A patent/CA1166987A/en not_active Expired
- 1980-09-29 IE IE2031/80A patent/IE50248B1/en unknown
- 1980-10-06 IL IL61213A patent/IL61213A0/xx unknown
- 1980-10-23 EP EP80303764A patent/EP0028136B1/en not_active Expired
- 1980-10-23 DE DE8080303764T patent/DE3069914D1/de not_active Expired
- 1980-10-23 AT AT80303764T patent/ATE11057T1/de not_active IP Right Cessation
-
1983
- 1983-01-11 JP JP58002773A patent/JPS58190394A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO155628B (no) | 1987-01-19 |
| IE50248B1 (en) | 1986-03-05 |
| IL61213A0 (en) | 1980-12-31 |
| JPS5858075B2 (ja) | 1983-12-23 |
| NO155628C (no) | 1987-04-29 |
| EP0028136A1 (en) | 1981-05-06 |
| ATE11057T1 (de) | 1985-01-15 |
| JPS5661995A (en) | 1981-05-27 |
| NO802769L (no) | 1981-04-27 |
| FI802967A (fi) | 1981-04-25 |
| JPS58190394A (ja) | 1983-11-07 |
| ES495185A0 (es) | 1981-09-01 |
| IE802031L (en) | 1981-04-24 |
| DK153500C (da) | 1988-12-05 |
| CA1166987A (en) | 1984-05-08 |
| ES8106933A1 (es) | 1981-09-01 |
| FI69314B (fi) | 1985-09-30 |
| US4246347A (en) | 1981-01-20 |
| FI69314C (fi) | 1986-01-10 |
| EP0028136B1 (en) | 1985-01-02 |
| DE3069914D1 (en) | 1985-02-14 |
| JPH0157956B2 (da) | 1989-12-08 |
| DK399880A (da) | 1981-04-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK153500B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af fructose | |
| Itoh et al. | Preparation of D-psicose from D-fructose by immobilized D-tagatose 3-epimerase | |
| US4246345A (en) | Process for the production of 6-amino-6-deoxy-L-sorbose | |
| US6894199B2 (en) | Process for the production of xylitol | |
| US4247641A (en) | Method for producing epoxides and glycols from alkenes | |
| CN105837643B (zh) | 一种d-葡萄糖异构化制备d-果糖的方法 | |
| KR101031451B1 (ko) | 비타민 ｃ의 생성 방법 | |
| WO1996031615A1 (en) | Use of 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase to prepare 2-deoxyfucose, analogues and derivatives | |
| US4423149A (en) | Process for the production of D-glucosone | |
| CA1195276A (en) | Process for production of glucosone | |
| Volc et al. | C-2 and C-3 oxidation of D-Glc, and C-2 oxidation of D-Gal by pyranose dehydrogenase from Agaricus bisporus | |
| US4503153A (en) | Method for producing aldehydes from primary alcohols | |
| US4569913A (en) | P. obtusus pyranose-2-oxidase preparation | |
| EP0054067B1 (en) | Process for making fructose | |
| CA1220748A (en) | Process for the production of mannitol and sorbitol | |
| DK153571B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af d-glucosone | |
| US4569915A (en) | P. obtusus strain | |
| JP2574661B2 (ja) | ２−ケト−ｌ−グロン酸生成菌 | |
| US4734366A (en) | Biological process for L-fructose synthesis | |
| EP1392711B1 (en) | Process for the production of xylose | |
| FI69638B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av d-glukoson | |
| JPS60176595A (ja) | 生理活性物質ｍｌ−２３６ａ及びモナコリンｊの製造法 | |
| US4568645A (en) | Fungal pyranose-2-oxidase preparations | |
| JP3146640B2 (ja) | ベンゾイルギ酸の製造方法 | |
| NO155700B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av d-flukoson fra glukose. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |