DK153571B - Fremgangsmaade til fremstilling af d-glucosone - Google Patents

Description

DK 153571 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af D-glucoson.

D-glucoson er et velegnet udgangsmateriale til fremstilling af 5 krystallinsk fructose. De enestående fysiske, kemiske og metaboliske egenskaber af krystallinsk fructose giver særlige anvendelsesmuligheder, som ikke findes for g 1ucoseisomerase-fremstillet majssirup med højt fructoseindhold (HFCS), som typisk indeholder 42% fructose, 50% dextrose og 8% polysacchari-der. Medens HFCS er omtrent så sød som saccharose, er krystallinsk fructose ca. 50% sødere og kan anvendes i lavere koncentrationer til frembringelse af den samme sødhed. HFCS konkurrerer primært på de direkte omkostninger med flydende sukkerarter i en lang række traditionelle næringsmiddelanvendelser i 15 enten tør eller flydende form, primært til farmaceutiske anvendelser og i næringsmidler, hvor der ønskes en reduktion af kalorieindholdet pr. sødhedsenhed. Krystallinsk fructose anvendes i diætslik og is og kan hensigtsmæssigt supplere eller erstatte glucose, saccharose eller HFCS i drikkevarer.

20

Fremstillingen af krystallinsk fructose i kommerciel målestok har stødt på en række alvorlige problemer.

Et af de største problemer er fremstillingsprisen. Den eneste kommercielt acceptable produktionsmetode hidtil var baseret på 25 først at fremstille en glucose-fructose-sirupblanding ud fra glucose (under anvendelse af enten glucoseisomerase eller alkalisk isomerisering) eller saccharose (via invertsukker), derpå fysisk at separere de to sukkerarter (ionbytning eller selektiv calciumsaltudfældning) og endelig at udvinde fructo-30 sen fra den vandige opløsning i krystallinsk form (podning eller metanoludfældning).! Den fysiske separeringsbehandling af de to sukkerarter er nødvendig, da krystallinsk fructose i bedste fald vanskeligt og hyppigt umuligt kan udvindes fra en vandig opløsning, med mindre i alt væsentligt alle ioniske 35 stoffer, restglucose og andre forureninger fjernes.15 En sådan behandling er dyr og resulterer derfor i en høj markedspris for fructose - en pris, som ikke kan konkurrere med rørsukker.

2

DK 153571B

Litteraturen angiver, at lave koncentrationer af fructose kan fremstilles ud fra glucose. Så tidligt som i 1889 blev fructose dannet ved reduktion af D-glucoson med zinkpulver i vandig eddikesyre.6 Denne reduktion er blevet anvendt som en analytisk 5 test til bestemmelsen af D-glucoson i adskillige biologiske stoffer.8»'12 Reduktion af D-glucoson til D-fructose er også blevet gennemført med natriumborhydrid.I8 Omdannelse af D-glucoson til fructose er en mulig enzymatisk reaktion, da re-duktaser, som gennemfører reduktionen af -CHO--CH2OH, ken- 10 des.I*

Litteraturen angiver også, at lave koncentrationer af glucoson kan fremstilles ud fra glucose. Der er blevet beskrevet adskillige metoder til at oxidere glucose - med 1^024 eller med 15 kobberacetat.5 I hver af disse reaktioner er omdannelsesudbytterne lave (<30%), og der opstår mange biprodukter. Glucose er blevet omdannet til D-glucoson ved først at fremstille et derivat af glucosen (f.eks. ved omsætning med phenyl hydrazin til fremstilling af glucosazon6 eller ved omsætning med p-to-20 luidin7) og derpå kemisk behandle dette derivat til dannelse af D-glucoson. I disse reaktioner var udbytterne ikke over 50%, og de reagenser, der ikke genvindes, er for dyre til kommerciel brug. Anvendelsen af aromaholdige reagenser kunne desuden give problemer i forbindelse med opnåelse af sukkerarter 25 af rimelig kvalitet.

Omdannelse af glucose til D-glucoson er også en kendt enzymatisk reaktion. Så tidligt som i 1932 blev det anført, at glucose blev oxideret til D-glucoson af den krystallinske form for en mollusk, Saxidomus giganteous.8 I 1937 blev det anført, 30 at D-glucoson dannes ved oxidationen af glucose, stivelse, maltose eller saccharose med plasmolyserede præparater af to skimmelsvampe, Aspergillus parasiticus og Aspergillus flavus-oryzae.

35 i 1956 blev den enzymatiske oxidation af glucose til glucoson i en rød alge, Iridophycus flaccidum,10 beskrevet. En carbohy-dratoxydase blev isoleret fra mycelium af Basidiomyceten, Po-lyporus obtusus, som oxiderede glucose til D-glucoson.** Der 3

DK 153571B

blev ikke angivet noget om udbytter. Endelig blev der i 1978 påvist glucose-2-oxidase-aktivitet i basidiomyceten, Oudeman-siella mucida, såvel som i andre træforrådnende svampe.oe bedste udbytter, der blev angivet, var ikke over 50%. I alle 5 disse tilfælde antages det, at D-glucosonproduktionen er ledsaget af dannelsen af hydrogenperoxid.

Det har nu vist sig, at der kan fremstilles D-glucoson i højt udbytte ud fra glucose ved en fremgangsmåde, som er ejendom-1Q melig ved, at man tilvejebringer en vandig opløsning af glucose og omdanner ca. 95% af glucosen i opløsning til D-gluco-son ved enzymatisk oxidation med et oxidoreduktaseenzym i nærværelse af oxygen, mens man fjerner eller udnytter co-produce-ret hydrogenperoxid.

15

Opfindelsen forklares nærmere under henvisning til de medfølgende tegninger, hvori fig. 1 er et skematisk diagram over et foretrukket eksempel på fremgangsmåden ifølge opfindelsen, 20 fig. 2 viser molekylstrukturen af D-glucose, fig. 3 viser molekylstrukturen af D-glucoson, og fig. 4 viser molekylstrukturen af D-fructose.

25

Med hensyn til molekylstrukturen af D-glucoson vil fagfolk på dette område vide, at det er blevet hævdet, at der eksisterer adskillige andre former af molekylet i vandig opløsning. En række af disse er cykliske.2'3 30 I den foreliggende beskrivelse anvendes udtrykkene "glucose", "D-glucose" og "dextrose" skiftevis til at omfatte dette møno-saccharid i en eller anden form - opløsning eller tør. Figur 2 betegner glucose.

35 I den foreliggende beskrivelse anvendes udtrykkene "D-glucoson" og "D-arabino-2-hexosulose" i flæng. Figur 3 betegner D-glucoson.

4

DK 153571B

I den foreliggende beskrivelse betegner udtrykkene "fructose", "D-fructose" og "levulose" ensbetydende den isomer af glucose, som er sødere end glucose. Udtrykket "krystallinsk fructose" anvendes i den foreliggende tekst til at betegne 5 dette monosaccharid i vandfri form. Figur 4 viser fructose.

Ifølge den foreliggende opfindelse omdannes generelt sagt glucose i vandig opløsning enzymatisk til D-glucoson med et passende enzym såsom carbohydratoxidase eller giucose-2-oxidase. j0 Denne omdannelse får lov til at forløbe spontant, hurtigt og i alt væsentligt fuldstændigt. D-glucoson kan så uden yderligere isolering omdannes til fructose ved passende kemisk hydrogenering.

Som nævnt og henvist til ovenfor kendes 1avkoncentrationsom-1 5 dannelse af glucose til D-glucoson. Ifølge den foreliggende opfindelse omdannes glucose let og fuldstændigt til D-glucoson under anvendelse af et renset oxidoreduktaseenzym såsom carbohydratoxidase eller giucose-2-oxidase. Det ved den foreliggende opfindelse opnåede udbytte overstiger det i litteraturen 20 beskrevne for dette enzym. Denne høje omdannelse til D-glucoson fjerner behovet for fysisk at separere eventuelt reste rende uomdannet glucose.

Visse oxidoreduktaser har katalytisk virkning med hensyn til 25 at oxidere hydroxylgruppen på det andet carbon af glucose, idet de fremmer oxidationen af denne hydroxylgruppe til en keto-gruppe, f.eks. ved omdannelse af strukturen i fig. 2 til strukturen i fig. 3. Disse specifikke oxidoreduktaseenzymer, der er beskrevet i eksemplerne heri, omtales varierende som 30 "glucose-2-oxidase", "pyranose-2-oxidase" og "carbohydratoxi dase", men opfindelsen er ikke nødvendigvis begrænset til således betegnede enzymer. Giucose-2-oxidase besidder en høj specificitet over for glucose som substrat, hvorimod carbohydratoxidase, selv om det har glucose som foretrukket substrat, 35 har en bredere substratspecificitet. Ethvert enzym, som er i stand til at omdanne hydroxylgruppen på det andet carbon af glucose til en ketogruppe og ikke ellers væsentligt påvirke resten af giucosemolekylet, falder inden for den foreliggende op- 5

DK 153571B

findelses omfang. Et sådant enzym kan specificeres som et enzym, der har glucose-2-oxidaseaktivitet.

Et foretrukket carbohydratoxidaseenzym er afledt af mikroorga-5 nismen Polyporus obtusus. Kilder for glucose-2-oxidase omfatter adskillige andre mikroorganismer, mollusker og røde alger, som refereret ovenfor. Disse enzymer og deres kilder er kun indikative og skal ikke betragtes som omfattende alle egnede enzymer og deres kilder inden for den foreliggende opfindelses omfang.

10

For at lette omtalen vil forskellige træk ved den foreliggende opfindelse blive beskrevet specielt, men ikke udelukkende i forbindelse med anvendelsen af den foretrukne carbohydratoxi- dase fra Polyporus obtusus og glucose-2-oxidasen fra Aspergil- 1 5 lus oryzae. Mikroorganismerne kan dyrkes i bevæget, neddyppet kultur ved stuetemperatur ved hjælp af sædvanlige metoder. Enzymet fremstilles ud fra mycelier af mikroorganismen, der dyrkes under betingelser for bevæget, neddyppet kultur.

20 Enzymet anvendes fortrinsvis i immobi1iseret form, selv om frit enzym også kan anvendes. Fremgangsmåderne til enzymimmobilisering er velkendte for fagfolk på dette område og består af omsætning af en opløsning af enzymet med et af et stort antal overfladebehandlede eller -ubehandlede organiske og uorga-25 niske støttematerialer. Indbefattet heri er polyacrylamid, ethylenmaleinsyrecopolymerer, methacrylbaserede polymerer, po-lypeptider, styrenbaserede polymerer, agarose, cellulose, dex-tran, silica, porøse plasperler, trækul eller carbon black, træ og savsmuld, hydroxyapatit og aluminium- eller 30 titanhydroxid. Enzymer i denne form har forøget stabilitet, forlænget levetid og anvendelighed og udvi ndelighéd. Reaktioner, hvori der anvendes immobi1iserede enzymer, kan gennemføres i søjler eller reaktionsbeholdere eller andre egnede reaktorer .

35

Foruden carbohydratoxidase- eller giucose-2-oxidaseenzymerne behøves en kilde for oxygen. En fremgangsmåde til hydrogenper-oxidfjernelse eller -udnyttelse kræves også i reaktionen til 6

DK 153571B

omdannelse af glucose til D-glucoson på den mest effektive måde. Dette skyldes, at H2O2 oxiderer visse kritiske steder på enzymmolekylet, hvilket beskadiger dets funktion. Fremgangsmåder til hydrogenperoxidfjernelse omfatter (1) dekomponering 5 ved hjælp af enzymet katalase, (2) dekomponering ved hjælp af kendte kemiske midler og (3) dekomponering ved anvendelse af dekomponeringsmatrikser såsom manganoxid eller carbon black16'17 som det immobi1iserende støttemateriale for oxidoreduktaseenzymet. I en foretrukket alternativ metode kan 10 det dannede hydrogenperoxid, fremfor at blive dekomponeret, blive forbrugt til fremstilling af et værdifuldt co-produkt. Sammenkobling af D-glucosonfremst i 11 ing med propylenhalohy-drin- eller propylenoxidfremsti 11ing er et foretrukket eksempel som vist i fig. 1.

15

Den enzymatiske omdannelse af glucose til D-glucoson gennemføres fortrinsvis i vand ved omtrent neutral pH-værdi, men kan gennemføres inden for pH-værdiinterval let fra ca. tre til ca. otte ved anvendelse af passende puffere. Denne omdannelse gen-,0 nemføres fortrinsvis ved omgivelsernes temperatur, men kan gennemføres inden for temperatur interval1 et fra ca. 15°C til ca. 65°C. Trykket er fortrinsvis atmosfærisk tryk, men kan variere fra tryk under til tryk over atmosfæretryk. Ethvert carbohy-dratmateri ale, som ad kemisk eller enzymatisk vej giver glu-25 cose, er en egnet kilde for glucose til omdannelse til D-glucose. Disse stoffer omfatter, men er ikke begrænset til følgende: cellulose, stivelse, saccharose, majssirup, HFCS og andre sirupper indeholdende forskellige mængder af glucose og fructose.

30

Prøverne, som anvendtes til at analysere sukkerarterne, er givet nedenfor: 1. Tyndt 1agskromatografi (TLC). Avicelbel agte glasplader fremkaldes med et 8:8:2:4 (efter volumen) isopropanol:pyridin:ed-35 dikesyre:vand-opløsningsmiddelsystem. Glucose har en Rf-værdi på 0,5-0,6. D-glucoson har en Rf på 0,4-0,5 streg. (Rf = den afstand, som stoffet vandrer fra begyndelsespunktet/opløs-ningsmiddelfrontafstanden fra begyndelsespunktet). Når pla- 7

DK 153571B

derne sprøjtes med tri phenyltetrazoliumchlorid (2% TTC i 0,5N NaOH), giver D-glucoson øjeblikkeligt røde pletter; glucose giver kun en rød plet efter opvarmning i 1Q min ved 100°C, Når pladerne sprøjtes med diphenylamin/ani1 in/phosphorsyre/ethy1-5 acetat-reagens (0,15 g/0,8 ml/11 ml/100 ml), giver glucose en brun plet, og D-glucoson giver en purpurfarvet streg.

2. Højeffektiv væskekromatografi (HPLC). En μ-Bondapak-carbo-hydratsøjle indkøbt hos Waters Associates køres med 15% vandig acetonitril indeholdende 0,001 M kaliumphosphatpuffer, pH-vær-di 7, ved en strømningshastighed på 2 ml/min. Glucose har en retentionstid R* på 11,5 og D-glucoson en R* på 14,0. Der gennemføres forsøg på et spektra physics SP8000-instrument under anvendelse af både en Waters Associates-brydningsindeksdetek-tor og en Schoeffel-UV-detektor med variabel bølgelængde indstillet til 192 nm.

3. Massespektrometri (MS). Den følgende derivatiseringsproto-kol anvendes til at gøre de kemiske komponenter flygtige: 20 (a) Til ca. 100 mg af den lyofi 1 iserede prøve sættes 110 mg N,N-di phenylhydraziη (H2NN02) og 1 ml 75% vandig ethanol. Reaktionsblandingen omhvirvles og får derpå lov til at henstå natten over ved stuetemperatur.

(b) 3 ml vand sættes til reaktionsblandingen, og det resulte- 2 5 rende bundfald skilles fra supernatanten ved centrifugering og dekantering. Til dette bundfald sættes 1 ml af en l:l-blanding af pyridin/eddikesyreanhydrid. Reaktionsblandingen anbringes i et 35-40°C vandbad i 15 min med lejlighedvis omrystning.

30 (c) 2 ml vand tilsættes for at standse reaktionen, og derpå ekstraheres blandingen 2 gange med 3 ml portioner af ethyl-ether. Etheren tørres over en ringe mængde vandfrit natriumsulfat, og derpå afdrives etheren ved svag opvarmning (-40°C) og strømmende nitrogen.

35 (d) Det resulterende faste stof eller den resulterende sirup er klar til massespektrometrisk analyse.

8

DK 153571B

Forventede reaktioner: -CHO -CH=NNø2 >C=0 (1) h2NNø2-^ ^C=0 (upåvirket) 5 -OH (2) Ac20, pyridin -OAc

Glucose giver en molekylion ved masse 556 (C28H32N2°lo) °S en baseion ved masse 168 (Nø2-ionfragment); D-glucoson giver en molekylion ved masse 512 (C2gH28N20g) og en intens diagnostisk fragmention ved masse 223 (OC-CH=N-Nø2-ionfragment). Forsøg 10 foretages på et Finnigan GC/MS/DS Model 4023-instrument indstillet til 70 eV elektron-impact-ionisering og til en sendetemperatur på 220°C.

4. Kolometrisk testrørsprøve. Analysen af D-glucoson i nærvæ-15 relse af et overskud af glucose bestemmes let ved hjælp af to kolometriske metoder. Under anvendelse af triphenyltetrazoli-umchlorid (TTC) er bestemmelsesmetoden baseret på en differential reduktionshastighed af de to sukkerarter. Til et 20 ml testrør sættes 0,5 ml prøve plus 0,1 ml 1% vandig TTC plus 0,4 20 ml 6N NaOH. Efter nøjagtigt 5 min forløb tilsættes 15 ml eddi-kesyre/ethanol (1:9), og indholdet i testrøret omhvirvles. Med vand som blindprøve måles absorbansen ved 480 nm under anvendelse af en Varian 635 UV/VIS-spektrometer. Glucose reducerer TTC til et rødt pigment, en triphenylformazan, ca. 100 gange 25 langsommere end en ækvivalent mængde D-glucoson. Under anvendelse af diphenylamin/anilin/phosphorsyrereagens er bestemmelsesmetoden baseret på de forskellige farver, der dannes med sukkerarter af forskellige strukturer. Til et 20 ml testrør sættes 0,2 ml prøve plus 5 ml af den følgende reagensblanding: 30 diphenylamin 0,15 g anilin 0,80 ml isopropanol 100 ml phosphorsyre 11 ml 35

Testrørene anbringes i 37°C vandbad i 60 min. Glucose giver en gulfarvet opløsning; D-glucoson giver en purpurfarvet opløsning.

9

DK 153571B

Kilder for de rene sukkerarter, der anvendes i de forskellige analytiske aspekter, er angivet nedenfor: 1. D-glucose blev indkøbt fra Applied Science Laboratories, c 99% rent.

O

2. D-glucoson blev syntetiseret kemisk ved hjælp af følgende metode: 20 g glucose blandes med 1 liter destilleret vand indeholdende 27 ml iseddike. 44 g phenylhydrazin tilsættes. Reaktionen gennemføres i 3 timer ved 80°C under kraftig omrøring 10 ved hjælp af en mekanisk omrører og afkøles derpå til stuetemperatur natten over. Det faste stof filtreres fra og vaskes med 10% eddikesyre, vand og derpå ethylether. Det faste stof tørres omhyggeligt i en vakuumovn ved 50eC. Forsøgsudbyttet er 16,1 g glucosazon. Glucosazonet anbringes i en 3-halset, 3 15 liter kolbe, og 450 ml ethanol, 750 ml destilleret vand og 9 ml iseddike tilsættes. 27,8 g frisk benzaldehyd tilsættes og bringes til tilbagesvaling med kraftig omrøring ved hjælp af en mekanisk omrører. Reaktionen tilbagesvales i 5 timer. Svaleren vendes, og 450 ml destilleres over, idet der tilsættes 2 0 750 ml destilleret vand (via en tildrypningstragt) til kolbén. Reaktionsblandingen afkøles natten over for at tillade udfældning af benzaldehydphenylhydrazon. Opløsningen filtreres, og resten vaskes med destilleret vand (~1 liter), indtil vandet bliver klart. Filtratet plus vaskevæskerne koncentreres til 25 500 ml og ekstraheres derpå med 10 gange 300 ml portioner ethylether. For at slippe af med resterende ethylether i den vandige opløsning anbringes den på en rotationsfordamper i 30 min. Den vandige opløsning ledes gennem en 4 gange 100 cm søjle indeholdende omhyggeligt acetone-vasket Amberlite XAD-2.

30 Søjlen vaskes med yderligere 200 ml vand for at fjerne resterende glucoson. De forenede vandige portioner lyofi 1iseres. Forsøgsudbytte af glucoson er 3,4 g (16% samlet udbytte).

De følgende eksempler belyser fremgangsmåden ifølge opfindel-35 sen. Med mindre andet er anført, er alle temperaturerne omgivelsernes temperatur (ca. 25°C) og alle tryk omgivelsernes tryk (ca. 1 atm).

10

DK 153571B

Eksempel 1 I alt væsentligt fuldstændig omdannelse af · glucose til D-glu-coson under anvendelse af immobi1iseret carbohydratoxidase er 5 vist i dette eksempel.

Glucose (2 g) sættes til 20 ml destilleret vand i en 100 ml Pyrex-kolbe, og sukkeropløsningen omrøres. Oxygengas bobles ind i kolben, og 3 mg katalase (Sigma Chemical Co., C-40, fra okselever) tilsættes. Agaroseimmobi1iseret carbohydratoxidase 10 fremstillet som angivet nedenfor ud fra 200 ml kultur sættes også til kolben.

Til fremstilling af enzymet dyrkes mycelpuder af Polyporus ob-tusus ATCC nr. 26733 på skråstivnede gær/maltekstraktagarsub-15 strater som følger: gærekstrakt (3 g), maltekstrakt (3 g), agar (20 g), pepton (5 g) og glucose (10 g) sættes til destilleret vand (1 liter), og pH-værdien indstilles på 6,7. Mediet steriliseres ved 121eC i 15 min. pH-værdien indstilles så på 6,4. Organismen podes på de skråstivnede agarsubstrater og 20 . dyrkes i 7 dage ved 25°C. Den på det skråstivnede substrat dyrkede organisme anvendes derpå til podning af gær/maltek-straktmedium (20 ml medium i 125 ml Erlenmeyerkolbe), fremstillet som ovenfor (men uden tilsætning af agar). Organismen dyrkes i 9 dage på et roterende rysteapparat ved 25°C. Kultu-25 ren vakuumfiltreres gennem Whatman papir nr. 541 i en Buchner-tragt. De på filterpapiret tilbageholdte mycelier indeholder enzymet.

Mycelierne, opnåede af 400 ml kultur, vaskes to gange med 0,05M 30 kal iumphosphatpuffer ved pH-værdi 7,0. Mycelierne anbringes så i et Waringblandeapparat, som indeholder 70 ml 0,05M kalium-phosphatpuffer ved pH-værdi 7,0 og homogeniseres derpå i 3 min. Blandingen centrifugeres så ved 6000 omdr. pr. min i 20 min, og supernatanten dekanteres fra det faste stof. Til su-35 pernatanten, anbragt i en 500 ml Erlenmeyerkolbe, sættes 19 g polyethylenglycol (vægt 4000), og opløsningen omrøres i 30 min. Suspensionen centrifugeres så ved 7000 omdr. pr. min i 20 min. Supernatanten dekanteres fra og kasseres. 15 ml 0,2M na-

DK 153571B

π triumchlorid plus 15 ml 0,05 M kaliumphosphatpuffer ved pH-værdi 7,0 sættes derpå til bundfaldet og omhvirvles. Opløsningen får lov til at henstå i 30 min, i hvilket tidsrum der dannes et bundfald. Blandingen centrifugeres ved 14000 omdr.

5 pr. min i 20 min. Oer afdekanteres en uigennemsigtig, hvid supernatant indeholdende cellefrit, renset enzym.

Immolibisering af enzymerne på agarose kan gennemføres som følger: Det cellefri rensede enzym dialyseres mod 500 ml de-10 stilleret vand natten over. Derpå tilsættes 5 ml 0,1 M natrium-bicarbonat ved pH-værdi 8,0. Til denne opløsning sættes 5 g aktiveret CH-sepharose 4B (vasket og genopkvældet på et sintret glasfilter under anvendelse af 500 ml ImM HC1). Under anvendelse af et ende-over-endeblandingsapparat blandes gelsus-pensionen i en time ved 25°C. Gelsuspensionen vaskes så først med 40 ml 0,1M natriumbicarbonat ved pH-værdi 8,0, derpå med 40 ml 0,05M Tris puffer ved pH-værdi 8,0 indeholdende Q,5M na-triumchlorid og derpå med 0,5M natriumformiatpuffer ved pH-værdi 4,0 også indeholdende 0,5M natriumchlorid.

20

Prøve af reaktionsblandingen udtages på forskellige tidspunkter og analyseres for glucose og D-glucoson. Under anvendelse af HPLC foretages kvantitativ bestemmelse af spidsarealerne af spidserne ved Rt på 11,5 min (glucose) og Rt på 14,0 min (D- glucoson), og koncentrationer af tilstedeværende sukker bereg- 25 nes. Der opnås følgende resultater:

Reaktionstid, Glucose, Q-glucoson, % glucose omdannet timer_g_g_til D-glucoson 0 2,0 0,0 0 30 1 1,2 0,8 40 2 0,5 1,5 75 3 0,2 1,8 90 4 0,1 1,9 99+ 35 Den væsentlige omdannelse af glucose til D-glucoson vises også ved forsvinden af pletten ved Rf på 0,58 (glucose) og tilsynekomsten af stregen ved Rf på 0,43-0,49 (D-glucoson) i løbet af reaktionen og ved forøgelsen af absorbansen ved 480 nm i

DK 15357TB

12 løbet af reaktionen under anvendelse af TTC-kolorimetritestrørsprøven .

At produktet helt bestemt er D-glucoson, bekræftes ved deriva-^ tisering efterfulgt af massespektrometri som beskrevet tidligere, De diagnostiske D-glucosonmasseioner ved masse 512 (molekyl ion) og masse 223 (0C-CH=N-Nø2-ionfragment) opnås for produktet.

Eksempel 2 10

Det følgende repræsenterer et eksempel på i alt væsentligt fuldstændig omdannelse af glucose til D-glucoson ved indvirkning af immobi1iseret carbohydratoxidase.

Glucose (1 g) sættes til 50 ml destilleret vand i en 250 ml 1 o

Pyrexkolbe, og sukkeropløsningen omrøres. Agarose-immobi1 i seret carbohydratoxidase, fremstillet som i eksempel 1 af 50 ml cellefrit, renset enzym, sættes så til kolben sammen med 1 mg katalase (som i eksempel 1).

20

Atten timer senere dekanteres den vandige opløsning fra det faste stof. Analyse af denne opløsning viser, at 99% af gi u-cosen er blevet omdannet til D-glucoson.

Eksempel 3 25

Dette eksempel viser i alt væsentligt fuldstændig enzymatisk omdannelse af glucose til D-glucoson under anvendelse af giucose-2-oxidase.

Reaktionen og betingelserne fra eksempel 1 (under anvendelse 30 af agarose som det immobi1iserende støttemateriale) gentages, idet giucose-2-oxidase anvendes i stedet for carbohydratoxidase. Efter 5 timers reaktion var mere end 99% af glucosen omdannet til D-glucoson.

35 Til fremstilling af enzymet giucose-2-oxidase dyrkes mycelkul-turer af Aspergillus oryzae ATCC no. 7252 i kød, gærekstrakt/-tryptonmedium som følger: kødekstrakt (5 g), gærekstrakt (5 g), trypton (3 g), dextrose (1 g) og Difco-stivelse (24 g) sættes DK 15357 13 til destilleret vand (1 liter), og pH-værdien indstilles p 7,3. Mediet steriliseres ved 121°C i 35 min. Under anvendeis af sporer opnået på almindelig kendt måde podes mediet til op nåelse βf ca. 3 x 10* sporer/ml og dyrkes i et roterende ry 5 steapparat (180 omdr. pr. min.) ved 30°C i 2 dage. Kulture vakuumfiltreres gennem Whatmanpapir nr. 541 i en Buchnertrag og vaskes adskillige gange med vand. Mycelierne, der er til bage på filterpapiret, indeholder enzymet.

Rensning og immobilisering af enzymet kan så forløbe under an vendelse af fremgangsmåden fra eksempel 1.

Eksempel 4 I eksempel 1 blev koncentrationen af frit hydrogenperoxid 15 dannet ved omsætningen af glucose med carbohydratoxidase forbindelse med D-glucosondannelsen, holdt så lav som muli ved anvendelse af katalase til dekomponer ing af hydrogenper oxidet. En alternativ metode til at holde koncentrationen a frit hydrogenperoxid så lav som mulig er at koble fremstillin 20 gen heraf til en hydrogenperoxidudnyttende reaktion, som give et ønskeligt (værdifuldt) co-produkt.

I dette eksempel kobles hydrogenperoxidproduktionen til pro duktionen af propylenbromhydrin, et mellemprodukt ved propy 25 lenoxidsynthesen ifølge begreber, som er angivet detaljeret US patentskrift nr. 4.284.723 og US patentskrift nr 4.247.641. Omsætningen af glucose og den immobi1iserede carbo hydratoxidase fra Polyporus obtusus ATCC no. 26733 til dan nelse af D-glucoson og hydrogenperoxid kobles til omsætninge 30 af immobi1iseret tang- eller algeperoxidase fra Coralina sp.

nærværelse af bromid og propylen til dannelse af propylenbrom-hydrin. Slutresultatet af denne koblede reaktion er så co-produktionen af glucoson og af propy1enbromhydrin, som let omdannes til propylenoxid, som beskrevet i US patentskrift nr. 35 4.284.723 og US patentskrift nr. 4.247.641. Ethvert enzym, som er i stand til at oxidere hydroxy1 gruppen på 2-carbonatomet i glucose med ledsagende produktion af hydrogenperoxid, kan kobles til enhver halogenerende peroxidase og det sammensatte

DK 15357 IB

14 stof anvendes til alken-halohydrinproduktion i overensstemmelse med læren i de førnævnte US patentskrifter.

Cellefrit, renset tang- eller algeperoxidaseenzym fremstilles 5 som følger:

Coralina sp., opnået fra kysten af La Jolla, Californien, formales i en Virtis 45 homogen isator i 5 min i destilleret vand. Homogenatet roteres ved 20.000 omdr. pr. min i 20 min. Super-natanten dekanteres fra og gemmes. Pillen respuspenderes i de- 10 stilleret vand og centrifugeres igen. Supernatanten og den tidligere nævnte supernatant forenes. Opløsningen bringes først til 33¾ og derpå til 55¾ mætning i ammoniumsulfat. Centrifugering og separering af pillen gennemføres i hvert trin.

Den 33^55¾ pillefraktion sendes gennem en DEAE-søjle under 15 anvendelse af en 0,3M-1M phosphatpuffer-(pH-værdi 6,0)-gradi-ent. Fraktionen, som eluerer ved 1M, dialyseres mod 20 mM pho-sphatpuffer {pH-værdi 6) natten over.

Den immobi1 i serede tang- eller algeperoxidase fremstilles som 20 følger:

Glasperler (opnået fra Sigma Chemical Company, PG-700-200) aktiveres ved at suspendere 1 g plasperler i 18 ml deioniseret vand. 2 ml 10¾ (v/v)a-amino-propyltriethoxysilan tilsættes, og 25 blandingens pH-værdi indstilles på 3-5 med 6N HC1. Blandingen omrystes ved 75°C i 2 timer. Plasperlerne vakuumtørres så natten over ved 80°C. 3,2 ml renset Coralina sp.-enzym, fremstillet som ovenfor, og 50 mg vandopløseligt carbodiimid sættes til plasperlerne. pH-værdien indstilles på 4,5, og blandin-30 gen omrystes så ved 4eC natten over. Produktet (enzymbelagte perler) vaskes med vand. Aktiviteten måles som 2 monochlordi-medonenheder/g perler.

Immobi1iseret carbohydratoxidase på agarose fremstilles som i eksempel 1 af 10 ml cellefrit, renset enzym.

En reaktionsblanding indeholdende følgende bestanddele anbringes i en 100 ml Pyrexkolbe: 35 i. *

DK 15357TB

15 a) 1 g glasperler overtrukket med tang- eller algeperoxi-dase, b) den ovenfor fremstillede immobiiiserede carbohydrat-oxidase, 5 c) 800 mg kaliumbromid og d) 20 ml 0,01M kaliumphosphatpuffer, pH-værdi 7,0.

Både propyl en og oxygen bobles til kolberne kontinuerligt. Reaktionen startes med 1 g glucose. Efter 20 timers forløb ud-tages en prøve af reaktionen, som analyseres for restglucose, D-glucoson og propylenbromhydrin. Det dannede propylenbromhy-drin analyseres som følger: 5 μΐ af reaktionsblandingen indsprøjtes i en Hewlett-Packard Model 402 gaskromatograf, forsynet med en 1,8 m gange 0,32 cm 15 glassøjle, pakket med Porapak R (80/100 mesh). Strømningshastigheden indstilles på 30 ml/minut for helium, øg søjletemperaturen indstilles på 200°C. Retentionstider for propylenbrom-hydrinerne er 9 min for l-brom-2-propanol og 10 min for 2-brom-l-propanol.

20

Produktidentitet blev bekræftet ved sammenligning med autentiske prøver af propylenbromhydrin: l-brom-2-prapanol leveres af Pfaltz og Bauer, Inc.; 2-brom-l-propanol synvtetiseres ved hjælp af 1ihtiumaluminumhydridreduktion af 1-brompropionyl-25 chlorid. Reaktionsprodukterne og de autentiske prøver viser de samme retentionstider og identiske massespektra: brom identificeres ved nærværelse af M- og (M+2)-isotopbi*ndter af ens intensitet. Molekyl ionen for begge isomerer bekræftes ved kemisk ionisering med isobutanreagensgas (M+; m/e 138+140); for 30 l-brom-2-propanol er hovedfragmenteringen det forventede tab af CH2=Br, medens hovedfragmenteringen for 2-brom-l-propanol er det forventede tab af CH3CHBr.

Analysen af prøven viste en omdannelse på over 93% af glucose 35 til D-glucoson og propylenbromhydrinomdannelse på 20 g/1.

DK 153571B

16

Eksempel 5

Dette eksempel tjener til yderligere belysning af begreberne, som er angivet og vist i eksempel 4. I dette tilfælde erstatt-5 es immobi1iseret carbohydratoxidase med immobi1iseret glucose-2-oxidase.

Det immobi1iserede tang- eller algeperoxidaseenzym fremstilles som beskrevet i eksempel 4. Den immobi1iserede glucose-2-oxidase fremstilles som beskrevet i eksempel 3.

10

Reaktionsblandingen tilberedes som i eksempel 4, idet der i stedet for immobi1iseret carbohydratoxidase anvendes immobi-1iseret giucose-2-oxidase.

Efter 20 timers forløb udtages der en prøve af reaktionsblandingen, som analyseres for restglucose, D-glucoson og propy-1enbromhydrin. Resultaterne viste en omdannelse på over 09% af glucose til D-glucoson og en propylenbromhydrinproduktion på 19,5 g/liter.

20 Eksempel 6

Dette eksempel belyser en høj omdannelse af glucose til D-glucososn i løbet af et udstrakt tidsrum under anvendelse af immobi1iseret carbohydratoxidase i en søjlereaktor.

25

Carbohydratoxidase {cellefrit, renset enzym) (10 ml), fremstillet som i eksmepel 1, immobi1iseres på hydroxyapatit (kal-ciumphosphathydroxid) som følger:

Til 100 ml eellefrit, renset enzym sættes 20 g hydroxyapatit i 3 0 100 ml 1 mS*] kal iumphosphatpuffer ved pH-værdi 7,0. Blandingen omrøres i 3Θ min, hvorpå det faste stof skilles fra væsken ved dekantering, og det faste stof vaskes først med 200 ml 10 mM kaliumphospbatpuffer ved pH-værdi 7,0 og derpå med 200 ml destilleret vand.

35

Dette stof pakkes så i en glassøjle {0,5 cm x 4,5 cm). En 1% giucoseopløsning ledes gennem søjlen ved en strømningshastighed på 1,5 ml pr. time. Eluanten analyseres periodisk for restglucose og dannet D-glucoson.

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af D-glucosonf, kendetegnet ved, at man tilvejebringer en vandig opløsning af glucose og omdanner ca. 95% af glucosen i opløsning til D-glucoson ved enzymatisk oxidation med et oxidoredicktaseenzym i 20 nærværelse af oxygen, mens man fjerner eller udnytter co-produceret hydrogenperoxid.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at oxidoreduktaseenzymet er glucose-2-oxidase fra Aspergillus oryzae eller carbohydratoxidase fra Polyporus obtusus. 35

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at enzymet er immobi1iseret. DK 153571 B

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hydrogenperoxidet dekomponeres med catalase.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 5 at den gennemføres i en søjlereaktor. 3 10 15 20 25 3 0 35