JPS6044917B2 - ２−ケト−ｄ−グルコン酸及び過酸化水素の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は過酸化水素の製法に関連している。

詳細には、過酸化水素及びそれと同時に有益な生成物を
製する方法に関している。本発明の工程において同時に
得られる有益な生成物は２−ケト−Ｄ，ーグルコゾ酸（
Ｆｉｓｃｈｅｒ法に従つた番号づけ）である。多くの工
業的方法は反応物として過酸化水素を用いる。

いくつかの場合、濃縮又は希釈した形で別々に製した過
酸化水素を使用するのが適当で、実用的てある。しかし
高価格（単離、濃縮、精製、入手、運搬、取り扱い等に
おける。）あるいは工程または用途を考えると別々に製
した過酸化水素を使用することが適当でない場合がある
。この工程または用途の関係において例えば、酸素源３
として過酸化水素を必要とする酵素的変換法において用
いられるいくつかの酵素は、過酸化水素自体により有害
な影響を受ける。これは過酸化水素が、酸素分子の、あ
る限定された部位を酸化し、その機能を破壊して効果を
減少させるためである。上述の理由て、数々の条件下、
過酸化水素を製造する方法を堤供する事は有益であ。

この方法は他の過酸化水素を用いる工程と連結して行う
。ここで発生する過酸化水素を、その発生とほぼ同速度
で過酸化水素を利用して用いるように企画する事が出来
る。こうすれば高濃度の過酸化水素の蓄積をさける事が
出来る。しかし従来の過酸化水素ノ発生法は経済的に効
果的でない。米国特許第４２４７６４１号（１９８１年
１月２７日、発布）において、グルコン経由の有益なり
−フルクトースが共に得られる過酸化水素の製造工程が
開示されている。

本工程はアルケンからハロヒドリンを経由してエポキサ
イドを製する酵素的方法法と共同して利用されて来た。
この工程はエポキシ工程で酸素源としてフルクトース工
程により発生した過酸化水素を用いるものである。これ
らの工程の組合せはうまく操業できるが、他の商業的な
共に得られる生成物も生産出来れば、市場適応性を増す
ので望ましい。したがつて本発明の目的は、高い商業価
値を持つ有益な、化学的生成物と共に過酸化水素源を製
する改善された協同的工程（ＣＯ−ＰｒＯｃｅｓｓ）を
堤供することである。

本発明の、さらに一般的な目的は過酸化水素を用いる工
程と組合せた、有益な共に得られる生成物とともに過酸
化水素を製する協同的工程を堤供する事である。

さらに本発明の目的は共に得られる有益な生成物ととも
に、過酸化水素源を堤供する協同的工程を堤供してこれ
により高収率の過酸化水素を得ることである。

本発明の目的は周知のとおり次の図式の記述から明らか
になるであろう。

図式１は本発明の工程の良好な形態を概要したものであ
る。

図式２は本発明をさらに具象化したものである。

一般的に、本発明は過酸化水素を用いる工程と組合せた
、過酸化水素源として働き、過酸化水素とともに得られ
る有益な生成物を供給するような協同的工程を堤供する
。

Ｄ−グルコースの第一及一ひ第二炭素の一方を酵素的に
酸化し過酸化水素と中間生成物を得る。中間体生成物の
第一及ひ第二炭素のもう一方を酵素的に酸化して過酸化
水素と２−ケト−Ｄ−グルコン酸を製する。本発明の一
つの態様として、中間体生成物はＤ−グルコソンてある
。他の態様においては中間体生成物はＤーグルコノ−δ
−ラクトンである。後者の場合２ーケト−Ｄ−グルコン
酸は、Ｄ−イソアスコルビン酸との混合物として得られ
る。さらに詳細には、図式１に、本発明の良好な形態を
示してある。

一番下側の横線は過酸化水素を消費する工程を示してい
る。典形的に、本工程は前もつて単離した過酸化水素を
加えるのが経済的でなく、望ましくないような場合に行
う。このような工程の１ツの例として米国特許第４２４
７６４１号（１９８１年１月２７日発行、本願の出願人
に譲渡）中に記載されている。その明細書中にはオレフ
インからエポキサイド又はグリコールの製造について記
述されている。オレフインをハロゲン化酵素素、酸化物
、ハロゲンイオン源の反応混合物と十分な時間反応せし
せめてハロヒドリンに化せしめる。ハロヒドリンをエポ
キサイド又はグリコールに変える。、酸化剤は典形的に
は過酸化水素てある。過酸化水素をそのまま、そこで発
生させるための上述の特許明細書中に記述されている工
程で酵素系を用いる事を言及している。

このような酵素系は、周知のものであり、この中にはグ
ルコース存在下のグルコース−１−オキシダーゼ、メタ
ノール存在下でのメタノールオキシダーゼが包含される
。過酸化水素発生系の酵素は非固定又は固定状態て存在
する。グルコース−１−オキシダーゼ、５メタノールオ
キシダーゼを用いた、そのままそこでの過酸化水素の発
生にともない、共に得られる生成物はグルコース−１−
オキシダーゼの場合Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン、メタ
ノールオキシダーゼの場合ホルムアルデ下である。

これらの、共に用いられる生成物は各々商業的には有益
であるがエポキサイド、グリコールの製造を大規模で行
うとそこに発生する過酸化水素により生成される。

共に得られる生成物の量が、市場要求性を実質的に超過
する結果になると考えられる。前述の如く、米国特許第
４２４７６４１号においてそこに記載されたエポキサイ
ド及びグリコール製法により用いる事が出来、過酸化水
素に加えでＤ−ｌフルクトースを製する協同的工程につ
いて記述している。

本発明の工程は、過酸化水素を利用出来る丁程と平行及
び同時に、協同的工程として用いられるべきものである
。

そこに発生する過酸化水素に加えて本発明の工程は２−
ケト−Ｄ−グルコン酸を生成せしめる。商業規模での２
−ケト−Ｄ−グルコン酸の生成には、今まで経済的限界
があつた。従来、２−ケト−Ｄ−グルコン酸はプソイド
モナス種（ＰｓｅｕｄＯｍＯｎａｓ）又はセラチアマル
セツセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）
の発酵によりＤ−グルコースから製造していた。（米国
特許第３２８２７９５：：１９６岬）、これらの既知の
方法によれば転化率と収率は良好であるが、この工程で
は貴重で有益な、共に得られる生成物である過酸化水素
を放棄する事になる。２−ケト−Ｄ−グルコン酸は種々
の商業的な用途を持つ。

カルシウム塩として写真、特に、現象液製剤に用いられ
る。又、他の商業的に有益な生成物、例えばフルフラー
ル２Ｄ−イソアスコルビン酸３、Ｄ−アラビノース４Ｄ
−リブロース４に容易に変換出来る。又、食品の防腐剤
として有益である。図式１に示す如く、本発明の良好な
形態においてこの工程はＤ−グルコースを出発物質とし
て利用する。

Ｄ−グルコースは種々の比較的低価な多くのＤ−グルコ
ース源から得られる。本発明の協同的工程の第一段階に
おいて、Ｄ−グルコースを空気又は酸素を用いて、その
第二炭素を、酵素触媒酸化が効果的になるよう反応せし
める。第一段階ては、中間生成物としてＤ−グルコソン
を生成し加えて過酸化水素を得る。反応は水溶液中、中
性のＰＨで行うと良いがＰＨ３〜８の範囲で緩衝液その
他のＰＨを調節するものを用いて行う事が出来る。この
転化反応は室温が効果的であるが１５゜Ｃ〜６５゜Ｃの
範囲で行う事が出来る。反応圧は、大気圧が良好である
が大気圧の上下でも行う事が出来る。この反応を触媒す
る事の出来る既知の酵素はグルコース−２−オキシダー
ゼ又はピラノース−２−オキシダーゼである。

ピラノース−２−オキシダーゼは微生物ポリポラスオブ
ツスス（ＰＯｌｙｐＯｒｕｓＯｂｔＵＳＬｌＳ）により
得られるし、グルコース−２−オキシダーゼは担子菌オ
ウデマンシーラ ムシダ（０Ｌ１ｄｅｍａｎｓｉｅ１１
ａｍｕｃｉｄａ）あるいはアスペルギルス●オリザエ（
ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓＯｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣＮＯ．
７２５２から得られる。

微生物は従来の方法により室温で攪拌培養により成長す
る。これらの酵素のさらにくわしい酵素源及び製造法は
米国特許第４２４７６４１号中に記載されている。これ
らの酵素は固定形で用いるものが良好であるが遊離の酵
素も用いる事が出来る。

酵素固定法はこの分野で精通した者にとつて一般的なも
のであり酵素の溶液を広範囲の表面処理又は未処理の支
持体の１ツと反応処理せしめるものであり、この支持体
は、ポリアクリルアミド、エチレンマレイン、酸共重合
体、メタアクリツク一塩基ポリマー、ポリペプチド、ス
チレン一塩基ポリマー、アガロース、セルロース、デキ
ストリン、シリカ、多孔性ガラスビーズ、木炭、カーボ
ン黒、ヒドロキシアパタイト、アルミナ又はチタンヒド
ロキサイドを包含する。この形の酵素は安定性が増大し
、その寿命が延長し、有益性及び回収能力が増す。固定
化穀酵素を用いる反応はカラム中又は反応タンク、ある
いは他の適当な反応装置で行う事が出来る。中間生成物
Ｄ−グルコソンを製した後、更に反応を行う。

これは、Ｄ−グルコソンの第一炭素を酵素的に酸化して
過酸化水素及び２−ケト−Ｄ−グルコン酸を製するもの
である。例えば微生物、アスペルギニス ニガ一（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉ？ｒ）から製した酵素グルコー
ス−１−オキシダーゼはＤ−グルコンと反応して２−ケ
トグルコン酸及び過酸化水ｖを生成する事を発見した。
反応の第二工程における反応圧、温度、ＰＨは第一工程
と関連して記述したものと本質的に同じである。２つの
変換工程の結果、１モルの、過酸化水素と１モルの２−
ケト−Ｄ−グルコン酸が各１モルのＤ−グルコースから
生成される。

加うるに、過酸化水素を必要とする他の工程と平行及び
同時の操作に容易に適応するような反応温度及び圧ん水
溶液中で過酸化水素の発生が起きる。このように本発明
におけるように、過酸化水素を発生させる工程と、オレ
フインから上述の如くエポキサイドとグリコールを製す
る工程とを結合させる事によリオレフインエポキサイド
が生成し、有益な生成物２−ケト−Ｄ−グルコン酸も生
成する。図式２に言及すれば、本発明の第２の具象例が
示される。

第１の具象例における場合の如く図式２に示された相互
工程は二段階工程である。第１工程において、Ｄ−グル
コースの第１及び第２炭素の一方を酸化する。しかし図
式１の相互工程の如く第２炭素を酸化する代りに図式２
においては第１工程でＤ−グルコースの第１炭素を酸化
する。この場合図式１に関して記述したものと本質的に
同じ条件下で酵素、グルコース−１−オキシダーゼを利
用して行う。結果として中間体Ｄ−グルコノ−δ−ラク
トンが生成する。図式２の第２工程は、Ｄ−グルコノ−
δ−ラクトンの第２炭素を酵素ピラノース−２−オキシ
ダーゼを用いて酵素酸化するものである。

Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンが酸性物質であるため、本
反応はＰＨ調節が必要で、混合物はピラノース−２−オ
キシダーゼとの反応のための中性ＰＨに近い値に保つた
めに緩衝化する。生成物は２−ケト−Ｄ−グルコン酸と
Ｄ−イソアスコルビン酸の混合物である。図式２の両酵
素酸化反応工程において過酸化水素が生成する。それ故
１モルのＤ−グルコースより２モルの過酸化水素と１モ
ルの２−ケト−Ｄ−グルコン酸とＤ−イソアスコルビン
酸の混合物が得られる。図式１及び２において第１及び
第２工程の両方に空気又は酸素を加える。

各図におけるカツコは生成物及び、第１、第２工程に必
要な反応物を示す。Ｄ−イソアスコルビン酸は食品の抗
酸化剤として商業的に有益な化合物であり、フルフラー
ルの如き他の有益な最終生成物を製するための中間体と
して有益である。

実際には２−ケト−Ｄ−グルコン酸とＤ−イソアスコル
ビン酸の混合物は二生成物を分離せずにフルフラールに
変換できる。図式２の工程において利用された両方の酸
化はそれぞれ個々に従来から知られたものである。５，
６これらの酸化は２−ケト−Ｄ−グルコン酸とＤ−イソ
アスコルビン酸の混合物を得るために単一の工程では行
われなかつた。

さらにこのような工程が単一で起きたが、現実に発見出
来なかつたのであるとは考えれない。なぜならば酵素グ
ルコース−１−オキシダーゼとピラノース−２−オキシ
ダーゼは、それぞれ関係のない微生物より得られたもの
であるからである。次の実施例は本発明の特異的な応用
を例示したものであるが、本発明の形態は特許請求の範
囲で明示したものである。

次の実施例は、本発明の形態を限定するものではない。
実施例 １ 本実施例はグルコース−１−オキシダーゼを用いて、Ｄ
−グルコソンから２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２ＫＧＡ
）の製造を示す。

これは図１の第２酸化工程である。ここにおいて協同的
工程において生成した過酸化水素の利用は酵素、カタラ
ーゼによる分解で模擬する。Ｄ−グルコソン（１ｇ）を
１００ｍ１パイレツクスフラスコ中の０．２Ｍリン酸カ
リウム緩衝液（ＰＨ６．Ｏ）２０ｍ１に加える。

糖溶液を攪拌する。フラスコ中に酸素ガスを連続的に導
入する。カタラーゼ（１”７Ｆ！９）、シグマ化学社（
ＳｉｇＭａＣｈｅｍｉｃａｌＣＯｍｐａｎｙ）（ＮＯ．
ＣｌＯ、牛肝臓からの精製粉末）から入手、を加えるる
。シグマ化学社（ＮＯ．Ｇ６５ＯＯｌアスペルギルス
ニガ一（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇａｒ）から製し
たもの）から入手したグルコース−１−オキシダーゼ（
イ）．１ｍｔ：１０００単位／ｍｌ）を加える。試料を
回収し、残つたＤ−グルコソンと生成した２−ケト−Ｄ
−グルコン酸を分析する。

結果を分析するために、高速液体クロマトグラフイ一を
・用いる。ウオータース社（ＷａｔｅｒｓＡｓｓＯｃｉ
ａｔｉＯｎ）より入手したμｍボンダパツクーカーボハ
イドレート （μｍＢＯｎｄａｐａｋ一ＣａｒｂＯｈｙ
ｄｒａｔｅ）カラムをウオータース社の二重検出機（折
屈計及び′ＵＶ／ＬＳ（λ１９２ｎｍ））装備のＦＩＰ
ＬΩ置に接続する。

移動相は０．００３Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ６）
を含む２０％アセトニトリルであり、２ｍ１／分でカラ
ムを通過させる。Ｄ−グルコソンの標準試料（米国特許
第４２４７６４１号に記載されている如く、ポリポラス
オブツスス（ＰＯｌｙｐＯｒｕｓＯｂｔＵＳｌｌＳ）よ
り酵素的に製する。

）２ＫＧＡの標準試料（シグマ化学社（ＳｉｇＩｌｌａ
ＣｈｅｍｉｃａｌＣＯｍｐａｎｙ）より入手）を比較の
ために検査する。Ｄ−グルコソンは保持時間は１紛、２
ＫＧＡは１１分である。残りの物質及び生成した化合物
をＷ波長λ１９２１１ｍてのピークの部位を定量する。
次の結果が得られる。

グルコン酸への完全な転化が得られる。

実施例 本実施例はＤ−グルコースからＤ−グルコソンを経て２
−ケト−Ｄ−グルコン酸の製造を示す。

ここては相互工程における過酸化水素の利用は酵素、カ
タラーゼによる分解で模擬する。１００ｍｔパイレツク
スフラスコ中０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ６）
２０ｍ１にＤ−グルコース（１ｇ）を加える。

フラスコ中に酸素ガスを連続的に導入する。２ｍ９のカ
タラーゼ（シグマ化学社（ＳｉｇＭａＣｈｅｍｉｃａｌ
ＣＯｍｐａｎｙ）、牛肝臓から精製した粉末）を加える
。

アガロース一固定ピラノース−２−オキシダーゼ（５ｇ
湿潤重量）を以下に記すように製して、これをフフラス
コに加える。ポリポラス オブツスス（ＰＯｌｙｐＯｒ
ＪｓＯｂｔＵＳＵＳ）ＡＴＣＣＮＯ．２６７３３の菌体
をイースト／モルト抽出物寒天培地で成長させる。この
培地は、イースト抽出物（３ｇ）、モルト抽出物（３ｇ
）、寒天（２０ｇ）、ペプトン（５ｇ）、グルコース（
１０ｇ）、を蒸留水（１リツトル）に加えＰＨ６．７に
調節して製する。培地を１２１℃、１紛間滅菌する。次
にＰＨを６．４にし、微生物を寒天培地に接種し２５℃
で７日間培養する。このスラントに成長した微生物を、
イースト／モルト抽出物培地（１２５ｍ１エーレンマイ
ヤーフラスコ中２５ｍ１）（上述の如く製する。たた七
寒天を除く）に接種する。ロータリーシューカーで２５
除Ｃ９日間培養する。ブフナーロート中ＮＯ．５４ｌホ
ワツトマン沖紙を用いて減圧沖過する。僅紙上の菌体に
酵素が含まれている。４００ｍｔの培養物から得た菌体
を０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液てＰＨ７．Ｏにて２
回洗浄する。

次に菌体を、０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液７０ｍＬ
（ＰＨ７．Ｏ）を含むワーリングブレンダ一中に入れ、
３分間ホモケナイズする。混合物を６０００ｒ′Ｐｍて
２０分間遠心分離し、上澄と固形物を分離する。上澄を
５００ｍ１のエーレンマイヤーフラスコ中に入れ、１９
ｇのポリエチレングリコール（分子量４０００）を加え
これを３０分間攪拌する。次に懸濁液を７０００ｒ′Ｐ
ｍで２吟間遠心分離する。上澄をデカントして除く。沈
澱物に１５ｍＬ（７）０２Ｍ塩化ナトリウム及び１５ｍ
Ｌ（７）０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液の混液（ＰＨ
７。Ｏ）を加え、ボルテツクスミキサ一で混合する。溶
液を３吟間放置する。この間に沈澱が出来る。混合物を
１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。無細胞系精
製酵素を含む不透明白色上澄をデカントして取る。アガ
ロースへの酵素の固定化は次の如く行う。

無細胞系精製酵素を５００ｍ１の蒸留水中で一夜透析す
る。０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム５ｍ１をＰＨ８．Ｏで
加える。

この溶液に、５ｇの活情連Ｈ−セフアローズ４Ｂ（１ｍ
ＭＨＣ１５００ｍ１を用いてガラスフイルタ一上で洗浄
、及び再膨潤させる）を加える。エンド−オーバーエン
ド（Ｅｎｄ−０ｖｅｒ−Ｅｎｄ）ミキサーを用いゲル懸
濁液を２５℃で１時間混合する。ゲル懸濁液を初め４０
ｍ１（７）０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ＰＨ８．Ｏ）
次に４０ｍ１の００．０５Ｍトリス緩衝液（４）．痔塩
化ナトリウム含有）（ＰＨ８．Ｏ）で洗浄し、次に０．
５Ｍ塩化ナトリウム含有の０．５Ｉ１！４ギ酸ナトリウ
ム緩衝液（ＰＨ４．Ｏ）で洗浄する。反応混合物の試料
を種々の時間で回収し、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルコソ
ンを、実施例１で用いたＨＰＬＣ法を用いて分析する。

保持時間１紛のピーク（Ｄ−グルコース）、１紛のピー
ク（Ｄ−グルコソン）を屈折計（ＲＩ）を用いて定量す
る。次に示す結果を得る。本質的にＤ−グルコソンへの
変換が完全に行われる。

この時点でシグマ化学社から入手したグルコース−１−
オキシダーゼ（イ）．１ｍＬ：１０００単位／ＭＬ）（
アスペルギルス ニガ一（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉ
ｇａｒ）から製したもの）を加える。

反応混合物の試料を種々の時間で回収し、Ｄーグルコソ
ン、２−ケト−Ｄ−グルコン酸を、実施例１て記述した
Ｉ｛ＰＬＣ法て分析する。

保持時間１５分のピーク（Ｄ−グルコソン）、１１分の
沙℃ＡのピークをＷ検知器でλ１９２ｒ１ｍにて定量す
る。次の結果が得られる。本質的にＤ−グルコソンは完
全に２−ケト−Ｄ−グルコン酸に転化する。

このようにＤ−グルコースは、本質的には完全に２ＫＧ
Ａに転化される。

実施例 本例はＤ−グルコースからＤ−グルコノ−δ−ラクトン
から２−ケト−Ｄ−グルコン酸及びＤ−イソアスコルビ
ン酸の両者を製する事を示す。

ここでは発生する過酸化水素を酵素カタラーゼで分解す
る。１００ｍ１のパイレツクスフラスコ中の０．２Ｍの
リン酸カリウム緩衝液（ＰＨ６．Ｏ）２０ｍ１にＤ−グ
ルコース（１ｇ）を加える。

フラスコ中に連続的に酸素ガスを導入する。３ｍ９のカ
タラーゼ（シグマ化学社、牛肝臓から精製）を加える。

シグマ化学社より入手したグルコース−１−オキシダー
ゼ（４）．１ｍＬ：１００師位／ｍｌ）を加える。（ア
スペルギルスニガ一（Ａｓｐｅｒ炉１１ｕｓｎｉ？ｒ）
より精製。反応混合物の試料を種々の時間で取り、Ｄ−
グルコース、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンについて、実
施例１で記述したＩ｛ＰＬＣ法で分析する。Ｄ−グルコ
ースの標準試料（アプライドサイエンス社（Ａｐｐｌｊ
ｅｄＳｃｊｅｎｃｅＩｎｃ．）より入手）、Ｄ−グルコ
ノ−δ−ラクトン（パルツアンドバウア一社（Ｐｆａｌ
ｔｚａｎｄＢａｕｅｒＣＯｍｐａｎｙ）より入手）の標
準試料のために検査する。保持時間１吟のピークはＤ−
グルコースで５分のピークは（Ｄ−グルコノ−δ−ラク
トン）によるものである。この保持時間のピークを屈折
計（ＲＩ）にて定量する。次の結果を得る。Ｄ−グルコ
ースは本質的に完全にＤ−グルコノ−δ−ラクトンに転
化される。この時点でアガロース一固定ピラノース−２
−オキシダーゼ（６ｇ１湿潤重量）を実施例の如く製し
てこれを加える。

反応混合物の試料を種々の時間で取りＤ−イソアスコル
ビン酸、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン、２ＫＧＡについ
て実施例１で述べた方法を用いてＦ［ＰＬＣ法で分析す
る。

保持時間５分（Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン）、１１分
（２ＫＧＡ）、６分（Ｄ一イソアスコルピン酸）の各ピ
ークをＵ検出器でλ１９２ｎｍにて定量する。次の結果
が得られる。

Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンは本質的に２ＫＧＡ及びＤ
−イソアスコルビン酸の１１：１混合物に完全に転化さ
れる。

このように、Ｄ−グルコースは本質的に２ＫＧＡ及びＤ
−イソアスコルビン酸に完全に転化される。

実施例 本実施例は、Ｄ−グルコースからＤ−グルコソノンを経
由して２−ケト−Ｄ−グルコン酸の製造、及びそこに生
成する過酸化水素を消費してプロピレンブロモヒドリン
及びエポキサイドを生成する事を示す。

ここでは過酸化水素の製造は、米国特許第′）４２４７
６４１中で記載されている概念に従いプロピレンオキサ
イド合成における中間体であるプロピレンブロモヒドリ
ンの製造と連結される。

Ｄ−グルコースと固定化した、ポリポラス オブツスス
（ＰＯｌｙＰＯｒｌ］ＳＯｂｔｕｓｕｓ）ＡＴＣＣＮＯ
．２６７３３のピラノース一２−オキシダーゼとの反応
でＤ−グルコソンを製し、コラリナ Ｓｐ．（ＣＯｒａ
Ｉｉｒｌａｓｐ．）かうの固定化した海草パーオキシダ
ーゼと、臭素及びプロピレンの存在下過酸化水素との反
応に連結せしめプロピレンブロモヒドリンを製する。本
反応は最終的には、Ｄ−グルコソンから２ＫＧＡに変換
し、プロピレンブロモヒドリンを容易にプロピレンオキ
サイドに変換する。無細胞系精製海草パーオキシダーゼ
酵素は次の如く製する。

米国カリフオルニア州ラホラ（ＬａＪＯｌｌａ）の海辺
で採集したコラリナ Ｓｐ．（ＣＯｒａｌｌｎａｓｐ．
）を蒸留水中バーチス（Ｖｉｒｔｉｓ）４５ホモゲナイ
ザ一中で粉砕する。

このホモゲネートを２０分間２００００ｒｐｍで遠心す
る。

上澄をデカントして取る。ペレツトを蒸留水中に再び懸
濁させもう一度遠心する。溶液を初め３３％次に５５％
の硫酸アンモニウム中に入れる。この場合遠心して各％
の段階でベレツトを分離する。３３〜５５％ペレツト分
画をＤＥＡＥカラム中で０．３Ｍ〜１Ｍリン酸緩衝液（
ＰＨ６．Ｏ）の密度こう配で通過させる。

１Ｍで流出する分画を２０ｒＴ１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ
６．Ｏ）中で一夜透析する。

固定化海草パーオキシダーゼは次の如く製する。

１ｇのガラスビーズをを１８ｍ１の脱イオン水中に懸濁
させて活性化する。

（ガラスビーズはシグマ化学社から得たもの。ＰＧ−７
００−２００）１０％（／）のα−アミノ−プロピルト
リエトキシシラン２ＴｎＬを加え、混合物のＰＨｆ！−
６ＮＨＣ１で３〜−５に調節する。混合物を７５℃で２
時間振とうする。次にガラスビーズを８０゜Ｃで１夜真
空乾燥する。３．２ｍ１の上述の如く製した精製コラリ
ナ Ｓｐ（ＣＯｒａｌｉｎａｓｐ．）酵素及び５０ｍ９
の水溶性カルボジイミドをガラスビーズに加える。

ＰＨを４．５にし、．混合物を４゜Ｃで１夜振とうする
。生成物（酵素でコーチングしたビーズ）を水洗する。
活性は２モノクロロジメドン単位／ビーズ１ｇとして測
定する。アガロースに固定したピラノース−２−オキシ
．ダーゼは実施例で製した如く、１０ｍ１の無細胞系、
精製酵素から製する。

次の成分を含む反応混合物を１００ｍ１パイレツクス
フラスコ中に入れる。

ａガラスビーズにコーチングした海草パーオキ・シダー
ゼ １ｇｂ上述の如く製した固定化ピラノース−２−オ
キシダーゼＣ７ＯＯｍ９の臭化カリウム ＤＯ．２ＯＭリン酸カリウム緩衝液、ＰＨ６．Ｏ２Ｏｍ
Ｌフラスコ中にプロピレン及び酸素を導入する。

反応は０．５ｇ（７）Ｄ−グルコースにより開始される
。ｍ時間後、反応混合物をサンプリングし、Ｄ−グルコ
ースとＤ−グルコソンにつき、実施例で述べたＨＰＬＣ
法により分析する。生成したプロピレンブロモヒドリン
も次の如く分析する：フイニガム（Ｆｉｎｎｉｇａｍ）
４０２１ガスクロマトグラムーマススペクトロメータ；
６フイート×１／４インチ、コイル状ガラスカラム、テ
ナツクス（Ｔｅｎａｘ）−ＧＣ（８０／１００メツシユ
）充てん。

３０ｍ１／分ヘリウム流。

カラム温度２００℃、プロピレンブロモヒドリンは保持
時間１紛である。プロピレンブロモヒドリンの標準試料
はパルツ アンドバウア一（ＰｆａｌレＡｎｄＢａｕｅ
ｒ）社より入手。フレームイオン化検出機（ＦＩＤ）に
よるピークて定量する。１ＴＰＬＣ分析ではＤ−グルコ
ースからＤ−グルコソンへの転化が本質的に完全に起つ
ている事を示している。

５０１ｍ９のＤ−グルコソンを測定。ＧＣ−ＭＳ分析で
は、本質的に、過酸化水素が完全に消費され、プロピレ
ンブロモヒドリンが生成した事を示している。３６３ｍ
９のプロピレンブ肩モヒドリンを測定。

この時点で、シグマ化学社から入手したグルコース−１
−オキシダーゼをセフアローズで固定し反応フラスコ中
に加える。

固定化グルコース−１−オキシダーゼは次の如く製する
。

グルコース−１−オキシダーゼはシグマ化学社から入手
。

ＡＨ−セフアローズ心の不溶性ビーズをフアルマシアフ
アインケミカル社（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅ
ｍｉｃａｌＣＯｍｐａｎｙ）より入手。酵素とビーズを
ＰＨ５．Ｏに調節する。酵素をビーズに固定するため、
０．２ｍ１のグルコース−１−オキシダーゼと１ｍ１の
ビーズを混合する。反応を２ｍ１（７）Ｎ−シクロヘキ
シル−Ｎ″−（２−（４−メチル−モルホリノ）一エテ
ル）カルボジイミド溶液（１００ｍｇ／２ｍ１）を加え
て開始する。反応混合物を４℃で１液インキユベートす
る。次にビーズを０．０３Ｍのリン酸緩衝液（ＰＨ４．
４）で洗浄し、グルーコスオキシダーゼ一ＡＨ−セフア
ローズ？ビーズを４゜Ｃで保存する。反応１峙間後反応
混合物を取り、実施例て述べたＨＰＬＣ法で、Ｄ−グル
コソン及び２ＫＧＡについて分析する。

さらにプロピレンブロモヒドリンの生成は本実施例で記
述した如き上述の方法で分析する。ＨＰＬＣ分析では、
本質的に、Ｄ−グルコソンから２ＫＧＡへの転化が完全
に起つている事を示している。

４８４ｍ９の２ＫＧＡを測定した。

ＧＣＭＳ分析では本質的に、第２段階での過酸化水素が
完全に消費される事を示している。

３４７ｍ９のプロピレンブロモヒドリンを測定。

このようにＤ−グルコース１モルに対し２モルの過酸化
水素が発生して消費してプロピレンブロモヒドリンを製
する。

（全 ７１０ｍｇ；発生した過酸化水素の９５％以上の
の消費に比しい）。生成したプロピレンブロモヒドリン
は米国特許４２４７６４１で述べた如く、プロピレンエ
ポキサイドに容易に転化される。実施例 本実施例ではＤ−グルコースからＤ−グルコノ−δ−ラ
クトンを経由して２−ケトグルコン酸及びＤ−イソアス
コルビン酸、及び発生する、過酸化水素を消費してプロ
ピレンブロモヒドリン、及びエポキサイドを製造する事
を示す。

ここでは過酸化水素の生成は、米国特許第４２４７６４
１号中に記載された概念に従い、プロピレンオキサイド
製造の中間生成物プロピレンブロモヒドリンの製造と連
結している。

Ｄ−グルコースとアスペルギルス ニガ一（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）の固定化グルコース−１−オ
キシダーゼの反応によりＤ−グルコノ−δ−ラクトンを
製する。過酸化水素は、臭素及びプロピレンの存在下、
コラリナ Ｓｐ．（ＣＯｒａｌｌｎａｓｐ．）からの固
定化した海草パーオキシダーゼと反応しプロピレンブロ
ムヒドリンを生成する。最終的にこの反応はＤ−グルコ
ノ−δ−ラクトンの生成から２ＫＧＡ及びイソアスコル
ビン酸へ転化され、プロピレンブロモヒドリンは容易に
プロピレンオキサイドに転化されることとなる。固定化
、無細胞系精製海草パーオキシダーゼ酵素は実施例の如
く製する。

固定化グルコース−１−オキシダーゼは次の如く製する
。

グルコース−１−オキシダーゼ（１０００単位／ｍｌ）
はシグマ化学社より入手。

ＡＨ−セフアローズ心の不溶性ビーズはフアルマシアフ
アインケミカル社から入手。酵素とビーズを、ＰＨ５．
Ｏに調節する。酵素をビーズ上に固定するために０．２
ｍＬのグルコース−１−オキシダーゼ及び１ｍ１のビー
ズを混合する。反応は２ｍｔ（７）Ｎ−シクロヘキシル
−Ｎ″−（２−（４−メチル−モルホリノ）一エチル）
カルボジイミド溶液を加えて（１００ｍ９／２ｍ１）開
始する。反応混合物を４℃で１液インキユベートする。
次にビーズを０．０３Ｍリン酸緩衝液で洗浄し（ＰＨ４
．４）、グルコースオキシダーゼＡＨーセフアローズ４
Ｂビーズを４℃で保存する。次の成分を含む反応混合物
を１００ｍｔパイレツクスフラスコ中に入れる。ａ海草
パーオキシダーゼでコーチングしたガラスビーズ １ｇ
ｂ上で製した固定化グルコース−１−オキシダーゼ゛Ｃ
７ＯＯｍ９の臭化カリウム ＤＯ．Ｏ２Ｍリン酸カリウム緩衝液ＰＨ６．Ｏ２ＯｍＬ
プロピレン及び酸素をフラスコ中に連続的に導入する。

反応は０．５ｇ（７）Ｄ−グルコースで開始される。時
間後反応混合物を取り、実施例で記述したＨＰＬＣ法を
用いＤ−グルコース及びＤ−グルコノ−δ−ラクトンに
ついて分析する。

生成したプロピレンブロモヒドリンは、実施例で記述し
たＧＣＭＳ法で分析する。１｛ＰＬＣ分析では本質的に
Ｄ−グルコースからＤ−グルコノ−δ−ラクトン−の変
換が完全に進行した事を示している。

４８２ｍ９のＤ−グルコノ−δ−ラクトンを検出。

ＧＣＭＳ分析によれば、本質的に過酸化水素が完全に消
費されたプロピレンブロモヒドリンが生成される事を示
している。

３５２ｍｇのプロピレンブロモヒドリンを検出。

この時点で、実施例の如く製した、固定化ピラノース−
２−オキシダーゼを加える。

反応１２１寺間後、反応混合物を取り実施例におけるＨ
ＰＬＣ法により２ＫＧＡ及びＤ−イソアスコルビン酸に
ついて分析する。

プロピレンブロモヒドリンの生成は、実施例で述べたＧ
ＣＭＳ法により分析する。１１ＰＬＣ分析によれば、本
質的にＤ−グルコノ−δ−ラクトンから２ＫＧＡ及びＤ
−イソアスコルビン酸への転化が完全に行われた事を示
す。

２４８ｍｇの２ＫＧＡ，２２２ｍ９のＤ−イソアスコル
ビン酸を検出。

ＧＣＭＳ分析によれば、本質的に、第二工程での過酸化
水素の消費が完全に起きている事を示す。

３３６ｍ９の、プロピレンブロモヒドリンを検出。

このようにＤ−グルコース１モルから２モルの過酸化水
素が発生しこれが完全に消費されて、プロピレンブロモ
ヒドリン（６８８ｍ９、全量、これは生成した過酸化水
素の９０％以上の消費したものに等しい）。生成したプ
ロピレンブロモヒドリンは米国特許４２４７６４１で記
述されている如くプロピレンオキサイドに、容易に変換
される。

それ故、本発明は、過酸化水素が、そこで効果的に発生
され、過酸化水素を必要とする特殊な工程に、その過酸
化水素源としてこれを供給する方法を堤供している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Ｄ−グルコースを水溶液状態で酸素およびピラノー
   ス−２−オキシダーゼ、グルコース−２−オキシダーゼ
   およびグルコース−１−オキシダーゼからなる群から選
   択された第一の酵素とを反応させてＤ−グルコースの第
   一および第二炭素のうちの１方の酸化を触媒してＤ−グ
   ルコソンまたはＤ−グルコノ−δ−ラクトンである中間
   体を生成し、この中間体を水溶液状態で酸素およびピラ
   ノース−２−オキシダーゼおよびグルコース−１−オキ
   シダーゼからなる群から選択された第二の酵素と反応さ
   せて該中間体の第一および第二炭素のうちの他方の酸化
   を触媒して過酸化水素および２−ケト−Ｄ−グルコン酸
   を生成し、２−ケト−Ｄ−グルコン酸を回収することか
   らなる過酸化水素および２−ケト−Ｄ−グルコン酸を製
   造する方法。 ２ ２−ケト−Ｄ−グルコン酸と共にＤ−イソアスコル
   ビン酸が生成する特許請求の範囲第１項の方法。 ３ 中間生成物がＤ−グルコソンである特許請求の範囲
   第１項の方法。 ４ グルコース−２−オキシダーゼ及びピラノース−２
   −オキシダーゼから成る群より選んだ酵素を用いてＤ−
   グルコソンを生成する特許請求の範囲第３項の方法。 ５ グルコース−１−オキシダーゼを用いてＤ−グルコ
   ソンを２−ケト−Ｄ−グルコン酸に酸化する特許請求の
   範囲第３項の方法。 ６ 中間生成物がＤ−グルコノ−δ−ラクトンである特
   許請求の範囲第１項の方法。 ７ グルコース−１−オキシダーゼを用いてＤ−グルコ
   ノ−δ−ラクトンを生成する特許請求の範囲第６項の方
   法。 ８ ピラノース−２−オキシダーゼを用い、Ｄ−グルコ
   ノ−δ−ラクトンを酸化せしめて、２−ケト−Ｄ−グル
   コン酸を生成し、同時にＤ−イソアスコルビン酸を生成
   する特許請求の範囲第６項の方法。 ９ Ｄ−グルコースを水溶液状態で酸素およびピラノー
   ス−２−オキシダーゼおよびグルコース−２−オキシダ
   ーゼからなる群から選択される第一の酵素と反応させて
   Ｄ−グルコースの第一炭素の酸化を触媒してＤ−グルコ
   ソンを生成し、該Ｄ−グルコソンを水溶液状態で酸素お
   よびグルコース−１−オキシダーゼと反応させてＤ−グ
   ルコソンの第二炭素の酸化を触媒して過酸化水素および
   ２−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成し、該２−ケト−Ｄ−
   グルコン酸を回収することからなる過酸化水素および２
   −ケト−Ｄ−グルコン酸を製造する方法。 １０ Ｄ−グルコースを水溶液状態で酸素およびグルコ
   ース−１−オキシダーと反応させてＤ−グルコースの第
   一炭素の酸化を触媒してＤ−グルコノ−δ−ラクトンを
   生成し、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンを水溶液状態で酸
   素およびピラノース−２−オキシダーゼと反応させてＤ
   −グルコノ−δ−ラクトンの第二炭素の酸化を触媒して
   過酸化水素および２−ケト−Ｄ−グルコン酸およびＤ−
   イソアスコルビン酸を生成し、２−ケト−Ｄ−グルコン
   酸を回収することからなる過酸化水素および２−ケト−
   Ｄ−グルコン酸の製造方法。