JP3003008B2 - 耐酸、耐熱性グルコースイソメラーゼ、その製造法及びそれを用いるフラクトースの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酸性下でＤ−グルコー
ス（以下、グルコースと記載）をＤ−フラクトース（以
下、フラクトースと記載）に変換する新規な耐酸、耐熱
性グルコースイソメラーゼ、その製造法及びそれを用い
るフラクトースの製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】フラクトースは天然に存在する糖の中で
最も甘味の強い糖であり、甘味料として使用されてい
る。フラクトースは、現在、澱粉を原料として製造され
るグルコースをグルコースイソメラーゼで異性化して製
造されており、一般に、異性化糖と呼ばれ、フラクトー
ス４２〜４５％を含む液糖として市販されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかるに、現在、異性
化糖の製造に使用されている公知のグルコースイソメラ
ーゼは最適ｐＨが８〜９付近にあるため、酸性下で不安
定で、工業的規模でのグルコース異性化反応は、通常、
ｐＨ８付近で行われている。一方、澱粉からグルコース
の製造において、α−アミラーゼによる、澱粉の液化反
応はｐＨ６付近で行われ、グルコアミラーゼによる液化
澱粉の糖化反応はｐＨ４．５付近で行われている。

【０００４】このように、澱粉から異性化糖の製造にお
いて、澱粉の液化、液化澱粉の糖化、グルコースの異性
化の各工程の反応ｐＨは、それぞれの工程において使用
される酵素の作用条件と安定性から、ｐＨ６→４．５→
８と変化させて行うという、煩雑かつ非能率的な方法が
採られているのが現状である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、澱粉から異
性化糖の製造を効率的かつ経済的に行うため、グルコア
ミラーゼによる液化澱粉の糖化条件と一致した条件で作
用する耐酸性のグルコースイソメラーゼの検索を行って
きた結果、土壌中より分離し、ストレプトマイセス・エ
スピーＧ−２７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．
Ｇ−２７）と同定した微生物がｐＨ５付近においても効
率的にグルコースをフラクトースに異性化する耐酸性の
グルコースイソメラーゼを生産することを認めた。この
酵素を用いることによって異性化反応の作用ｐＨ条件
を、現在、澱粉の液化に使用されているバチルス属のα
−アミラーゼや、液化澱粉の糖化に使用されているアス
ペルギルス属又はリゾープス属のグルコアミラーゼの作
用ｐＨ条件と適合させることができ、実質的に一貫した
条件で液化、糖化及び異性化などの反応を行うことがで
きるため、澱粉から能率的かつ経済的に異性化糖を製造
することが可能となった。本発明はこの知見に基づいて
なされたものである。

【０００６】以下、本発明の内容を更に具体的に説明す
る。本発明のグルコースイソメラーゼ（以下、本発明の
酵素という）の理化学的性質は下記の通りである。 ａ）作用：酸性下でＤ−グルコースをＤ−フラクトース
に変換する。 ｂ）基質特異性：Ｄ−グルコースとＤ−フラクトースの
相互変換を行う他、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース
とＤ−リボースをそれぞれ対応するケトースに異性化す
る。しかしＤ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−ア
ラビノースなどには実質的に作用しない。 ｃ）作用ｐＨ：４〜８である。 ｄ）最適ｐＨ：７付近に認められるが、ｐＨ５付近でも
よく作用し、約３０％の活性を示す。 ｅ）最適温度：０．１Ｍグルコースを基質としｐＨ８、
１０分反応での最適温度は８５〜８７℃である。 ｆ）安定ｐＨ：０．１Ｍ緩衝液（酢酸又はリン酸緩衝
液）の下で、室温（約２５℃）で 時間放置後、残存活
性を測定した。その結果、ｐＨ４〜１２の範囲で安定で
あった。 ｇ）熱安定性：酵素水溶液を各温度で加熱した結果、８
０℃、８５℃では、３０分間加熱しても失活は認められ
ず、むしろ活性の増加が認められた。又、９０℃、１０
分間の加熱では約３０％失活した。 ｈ）Ｋｍ値：グルコースに対するＫｍは約０．０８３
Ｍ、Ｄ−キシロースに対するＫｍは約０．１３Ｍで、本
酵素はＤ−キシロースよりもＤ−グルコースに対してよ
り親和性が大きい。 ｉ）賦活剤：Ｃｏ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺などにより賦活さ
れる。その活性の強さは、５×１０^-3ＭにおいてＣｏＣ
ｌ₂を１００％としたとき、ＭｇＳＯ₄約４２％、ＭｎＳ
Ｏ₄約１７％であった。 ｊ）阻害剤：５×１０^-3ＭのＨｇＣｌ₂、ＡｇＮＯ₃、Ｃ
ｕＳＯ₄、ＣａＣｌ₂などにより阻害された。 ｋ）精製法：硫酸アンモニウムによる分画、ＤＥＡＥ−
セファロースカラムクロマトグラフィー及びセファデッ
クスＧ−１５０ゲルろ過などにより電気泳動的に単一ま
で精製することができる。 ｌ）活性測定法：０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）、０．０１Ｍ ＭｇＳＯ₄及び０．２Ｍのグルコー
スを含む溶液０．５ｍｌに、適量の酵素を加え、水で全
量を１．０ｍｌとし、６０℃で反応させる。そして生成
したフラクトースをシステイン−カルバゾール法で定量
する。この条件で、１分間に１マイクロモルのフラクト
ースを生成する酵素量を１単位とした。

【０００７】本発明の酵素は、現在、工業的に広く使用
されているストレプトマイセス・ルビジノサス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）のグル
コースイソメラーゼ（以下、酵素Ａという）〔Ｙ． Ｔ
ａｋａｓａｋｉ， アグリカルチャル・バイオロジカル
・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．），３３巻，１５２３頁（１９６９）〕及びストレ
プトマイセス・フェオクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｄｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）のグル
コースイソメラーゼ（以下、酵素Ｂという）〔Ｎ．Ｔｓ
ｕｍｕｒａら，アグリカルチャル・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２
９巻，１１９２頁（１９６５）〕に比べ、以下に記載す
る酵素的性質の差異が認められた。

【０００８】すなわち、 （１）本発明の酵素の最適ｐＨは７付近にあるが、図１
に示す通り、ｐＨ５以下でもよく作用する。一方、酵素
Ａの最適ｐＨは８．５付近にあり、ｐＨ６における活性
はｐＨ８．５のときの約３０％である。そして、ｐＨ５
以下では不安定で実質的に作用しない。又、酵素Ｂの最
適ｐＨはよりアルカリ側のｐＨ９．３〜９．５に認めら
れていおり、そして同様にｐＨ５以下では実質的に作用
しない。

【０００９】（２）本発明の酵素の最適温度は８５〜８
７℃にあり、酵素Ａ及び酵素Ｂに比べ５〜７℃高い。

【００１０】（３）本発明の酵素は８５℃で３０分加熱
しても失活が認められないが、酵素Ａは８０℃、１０分
の加熱で約３０％失活し、酵素Ｂは７０℃、１０分の加
熱で８０〜８５％失活する。

【００１１】（４）本発明の酵素は、Ｄ−グルコースの
他、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｌ−アラビノース
などにも作用し、それぞれ対応するケトースに異性化す
る。すなわち、本酵素は巾広い基質特異性を示すのに対
し、酵素ＡはＤ−グルコースとＤ−キシロースのみに作
用し、酵素ＢはＤ−グルコース、Ｄ−キシロースとＬ−
アラビノースに作用する。

【００１２】（５）酵素Ａ及び酵素Ｂは、Ｄ−グルコー
スに対するＫｍ値がＤ−キシロースに対するＫｍより大
きく、Ｄ−グルコースよりもＤ−キシロースに対する親
和性の方が大きいのに対し、本発明の酵素は、Ｄ−グル
コースに対するＫｍは約０．０８３Ｍ、Ｄ−キシロース
に対するＫｍは約０．１３Ｍであり、 Ｄ−キシロ
ースよりもＤ−グルコースに対してより親和性が大き
い。

【００１３】（６）酵素Ａ及び酵素ＢはＭｇ²⁺により最
も強く賦活されるのに対し、本発明の酵素はＭｇ²⁺より
Ｃｏ²⁺によって強く賦活される。

【００１４】本発明の酵素の理化学的性質のうち、主な
性質について、公知のグルコースイソメラーゼと比較し
た結果を表１に示す。

【００１５】

【表１】

【００１６】以上のとおり、本発明の酵素は作用ｐＨ、
熱安定性などの性質において、公知のグルコースイソメ
ラーゼに比べ重要な差異が認められ、耐酸性と耐熱性に
優れた新規なグルコースイソメラーゼと考えられるもの
である。

【００１７】本発明において使用されるストレプトマイ
セス・エスピー Ｇ−２７は新たに土壌から発見、分離
されたものであり、その菌学的性質は下記の通りであ
る。尚、本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第１２０３６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２０３６）
として寄託されている。

【００１８】Ａ．形態 （１）基生菌糸は樹枝状に分岐し発育、液体・固体をと
わず、いかなる培地においても、断裂しない。 （２）気菌糸は単純分枝で、直状の長い胞子連鎖を形成
する。培養が長期となると先端部でゆるく波状になる
が、らせん状は稀である。 （３）胞子柄は基生菌糸から形成されるが、認められる
ほど長くない（１０μｍ以下）。分枝は菌糸の主軸に対
し２０〜４０℃、分枝数は通常１〜３本。 （４）胞子嚢、菌核、球状体は形成しない。 （５）胞子は気菌糸上にのみ生じ、出来る方向は求心
的。胞子の表面は平滑で、卵円形又は円筒系、１．０×
１．５〜２．０μｍ、通常５０個以上の直状の連鎖とな
る。 （６）基生菌糸、気菌糸の幅はそれぞれ１．０〜１．５
μｍ。

【００１９】 Ｂ．各培地における生育状態 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 培 地 発 育 気菌糸 裏面の 溶解性 色調 色素 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− イースト・麦芽 良好 拡散性 盛上り 豊富 絨毯状 黄褐色 なし 寒天培地 皺 淡黄白色 淡桃→灰色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− オートミール 良好 拡散性 平坦 中庸 絨毯状 黄 色 なし 寒天培地 黄色 淡桃→灰色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− スターチ・無機 良好 拡散性 平坦 中庸 絨毯状 黄白色 なし 塩寒天培地 淡黄白色 淡桃→灰色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− グリセリン・ア 良好 拡散性 盛上り 中庸 粉状 黄 色 なし スパラギン寒天 黄色 灰白色 培地 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− チロシン寒天 良好 拡散性 平坦 豊富 線状 黒褐色 なし 培地 皺 淡黄白色 白色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− シュクロース・ 弱い 拡散性 平坦 なし 黒 色 なし 硝酸塩培地 無色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− グルコース・ア 良好 拡散性 平坦 中庸 線状 黄 色 なし スパラギン寒天 黄白色 淡桃→灰色 培地 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 栄養寒天培地 中庸 局限性 平坦 なし 黄白色 なし 黄白色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ベネット寒天 良好 拡散性 盛上り 中庸 粉状 黄 色 なし 培地 皺 黄白色 淡桃→灰白色 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ペプトン・イー 中庸 局限性 平坦 なし 黄 色 なし スト・鉄寒天 皺 黄白色 培地 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− スターチ合成寒 微 拡散性 無色 なし 無 色 なし −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００２０】Ｃ．生理学的性質 （１）リトマスミルク：凝固なく消化、リトマス還元な
し （２）ゼラチン液化：なし （３）抗酸性：陰性 （４）グルコース酸化（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ）：
陽性 （５）温度生育性：至適温度３９℃、生育温度範囲１５
〜４５℃ （６）ｐＨ生育性：最適ｐＨ７．２、生育ｐＨ範囲４．
８〜９．５ （７）耐塩性：７％ （８）硝酸塩の還元：陽性 （９）硫化水素の生成：陽性 （１０）カゼイン分解（Ｆｒａｉｚｅｒ法）：陽性 （１１）デンプンの加水分解：陽性 （１２）エスクリン加水分解：陽性 （１３）リンゴ酸石灰の溶解：陽性 （１４）アデニン分解：陽性 （１５）キサンチン分解：陰性 （１６）チロシン分解：陰性 （１７）フェニールアラニン脱アミノ：陰性 （１８）ウレアーゼ：陽性 （１９）カタラーゼ：陽性 （２０）細胞壁タイプ： ＬＬ−ジアミノピメリン酸 ＋ ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸 − グリシン ＋ リジン − アラビノース − ガラクトース − （２１）窒素源の利用性：アスパラギン酸ナトリウム、
カゼミノ酸、β−アラニン、ペプトン、グルタミン酸ナ
トリウム（＋＋＋）良く利用する Ｌ−アルギニン、硫安、塩安、ＤＬ−メチオニン、Ｌ−
バリン（＋＋） 利用する 硝酸カリ、硝酸ナトリウム、尿素（＋）弱く利用する （２２）炭素源の利用性：Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロ
ース、Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フラク
トース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−ラフィノース、Ｄ−マ
ンニット、ｉ−イノシトール、シュクロース（＋＋＋）
良く利用する サリシン（＋）利用する

【００２１】以上の菌学的諸性質についてバージェイス
・マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
（第７版）及びＴｈｅ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ
（２巻、１５２〜２９２頁）を参照し、本菌をストレプ
トマイセス・エスピー Ｇ−２７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｓｐ． Ｇ−２７）と同定した。

【００２２】本菌を培養してグルコースイソメラーゼを
生産するには、窒素源として、コーンスティープリカ
ー、肉エキス、ペプトン、ブイヨン、カゼイン、大豆
粕、酵母、酵母エキスなど、通常、微生物の培養に使用
される有機窒素源、あるいは塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源
を単独又は有機窒素源に補足して使用される。

【００２３】炭素源としては、キシロース、又はその原
料であるキシラン及びその派生物が使用される。この
他、ソルビトール、グリセリン、マンノース、グルコー
ス、シュークロースなども有効である。

【００２４】以上の窒素源と炭素源の他に、補足する培
地成分としてリン酸塩、マグネシウム塩、コバルト塩、
マンガン塩などが添加される。

【００２５】培養は、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ５．
５〜８、温度２５〜５０℃、好ましくは３０℃で１〜４
日間程度行われる。グルコースイソメラーゼは菌体内に
生産される酵素であるので、培養後、ろ過又は遠心分離
により菌体を回収し、そのまま、又は適当な固定化処理
を使用するか、超音波又は自己消化法により該酵素を抽
出し使用される。抽出された酵素は必要により、濃縮
し、硫酸アンモニウム、アセトン、メタノール、エタノ
ールなどで沈殿し、乾燥保存する。

【００２６】本発明の酵素を用い、グルコースからフラ
クトースを生成する反応は、２０〜６０％のグルコース
溶液又はグルコース含有液、例えば、澱粉糖化液が使用
され、ｐＨ４．５〜８、温度５０〜９０℃で行うことが
できる。すなわちアスペルギルス・ニガー又はリゾープ
ス属のグルコアミラーゼを用い、ｐＨ４．５〜５．５で
糖化された糖化液を、実質的にｐＨを調整することな
く、そのまま異性化原料として使用するか、又は、澱粉
液化液又はデキストリン含有液を原料とし、グルコアミ
ラーゼが作用する条件（ｐＨ４．５〜５．５、温度５５
〜６０℃）で、グルコアミラーゼによる糖化と本発明の
酵素による異性化を同時に行うことができる。又、澱粉
を原料とし、α−アミラーゼによる液化、グルコアミラ
ーゼによる糖化と本発明の酵素による異性化の、３つの
反応を、ｐＨ５〜６、温度５５〜６０℃で同時に行い、
澱粉から直接、異性化糖を製造することも可能である。

【００２７】さらに又、本発明の酵素は耐酸と耐熱性に
優れているため、公知のグルコースイソメラーゼで平衡
まで異性化した糖液を、ｐＨ５〜６、８０〜９５℃で短
時間処理することにより、フラクトース側に平衡を移動
させ、フラクトース含有量の高い異性化糖を製造する目
的にも使用することができる。

【００２８】尚、異性化した反応物の糖組成の分析は高
速液体クロマトグラフィーによるか、又は、フラクトー
スはシステインーカルバゾール法による比色定量によ
り、グルコースはグルコースオキシダーゼを用いる酵素
法により、そして全糖量はアンスロン法又はフェノール
−硫酸法による比色定量法により行われる。

【００２９】以下、実施例により本発明の詳細を説明す
る。

【実施例】

実施例１ コーンスティープ・リカー１．５％、各種の炭素源１
％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．３％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．
１％、ＣｏＣｌ₂ １×１０^-3Ｍからなる培地（ｐＨ
６）４ｍｌを計１８ｍｍの試験管に入れ、常法により殺
菌後、ストレプトマイセス・エスピー Ｇ−２７（微工
研菌寄第１２０３６号）を接種し、３０℃で２日間振盪
培養した。培養後、２０ＫＣ超音波で細胞を破砕し、抽
出されたグルコースイソメラーゼ活性を測定した。得ら
れた結果を表２に示す。

【００３０】

【表２】

【００３１】表２から明らかなように、キシロースの
他、グリセリン、ソルビトールなどによってもグルコー
スイソメラーゼが生産された。

【００３２】実施例２ 炭素源としてキシロースとグリセリンの混合比を種々変
え（全量、１％）、コーンスティープ・リカー１．５
％、とＫ₂ＨＰＯ₄ ０．３％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．
１％、ＣｏＣｌ₂ １×１０^-3Ｍからなる培地（ｐＨ
６）を用い、実施例１と同様、４ｍｌを試験管に入れ、
常法により殺菌後、ストレプトマイセス・エスピー Ｇ
−２７（微工研菌寄第１２０３６号）を接種し、３０℃
で２日間振盪培養した。培養後、実施例１と同様にし
て、生産されたグルコースイソメラーゼ活性を測定した
結果は表３に示す通りであった。

【００３３】

【表３】

【００３４】表３から明らかなように、キシロース０．
６％とグリセリン０．４％添加したとき生産量が最も高
かった。

【００３５】キシロース０．６％、グリセリン０．４
％、コーンスティープ・リカー１．５％、Ｋ₂ＨＰＯ₄
０．１％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．１％、ＣｏＣｌ₂
１×１０^-3Ｍからなる培地（ｐＨ６）で培養した菌体
から抽出された酵素液に、硫酸アンモニウムを６０％飽
和になるように加え、生成した沈殿を透析し、ＤＥＡＥ
−セファロースカラムクロマトグラフィー、セファデッ
クスＧ−１５０カラムクロマトグラフィーを行って精製
酵素を調製した。精製採取された本発明のグルコースイ
ソメラーゼは電気泳動的に単一であった。

【００３６】実施例３ 実施例２に従って培養し、得られた本発明のグルコース
イソメラーゼを用いグルコース異性化反応の条件につい
て試験した。 （１）反応ｐＨの影響 グルコース各２００ｍｇ、各ｐＨの酢酸又はリン酸緩衝
液０．０８Ｍ、ＭｇＳＯ₄ ５×１０^-3Ｍ、ＣｏＣｌ₂
１×１０^-3Ｍ、グルコースイソメラーゼ０．１１単位、
全量１．０ｍｌで、６０℃で反応した。得られた結果は
図１に示す通りであった。

【００３７】図１から明らかなように、本酵素はｐＨ５
付近でもよく作用し、効率的に反応が進行した。

【００３８】（２）反応温度の影響 グルコース各４００ｍｇ、ｐＨ５．０の酢酸酸緩衝液
０．０８Ｍ、ＭｇＳＯ₄１×１０^-2Ｍ、ＣｏＣｌ₂ １×
１０^-3Ｍ、グルコースイソメラーゼを基質１ｇ当たり２
単位加え、全量１．０ｍｌで、６０℃、６５℃、７０℃
で反応した。得られた結果は図２に示す通り、７０℃に
おいて最も効率的に反応が進行した。

【００３９】実施例４及び実施例５においては、本発明
のグルコースイソメラーゼとグルコアミラーゼを用いデ
キストリンから糖化と異性化反応を同時に行った結果に
ついて示す。

【００４０】グルコアミラーゼとしては、市販のアスペ
ルギルス・ニガー〔製品名：グルクザイムＮＬ，天野製
薬（株）製造〕及びリゾープス・デレマー〔製品名グル
クザイム６０００、天野製薬（株）製造〕の生産するも
のを使用した。 実施例４

【００４１】デキストリン約３０％、ＭｇＳＯ₄ １×
１０^-2Ｍ、ＣｏＣｌ₂ １×１０^-3Ｍ、アスペルギルス
・ニガーのグルコアミラーゼを基質１ｇ当たり３６単
位、及び実施例２に従い調製した本発明の酵素を基質１
ｇ当たり４単位加え、ｐＨ５．０で、６０℃で４８時間
反応した。得られた結果を表４と図３に示す。４８時間
後、異性化率４６．９％の異性化糖液が得られた。

【００４２】

【表４】

【００４３】実施例５ デキストリン約３０％、ＭｇＳＯ₄ ２×１０^-2Ｍ、Ｃ
ｏＣｌ₂ １×１０^-3Ｍ、リゾープス・デレマーのグル
コアミラーゼを基質１ｇ当たり１８単位、及び実施例２
に従い調製した本発明の酵素を基質１ｇ当たり４単位加
え、ｐＨ５．０、ｐＨ５．２５及び５．５において６０
℃で７２時間反応した。得られた結果を表５に示す。ｐ
Ｈ５．２５において、糖化反応が最も効率的に進行し、
糖化率９４．３％、異性化率４５．９％の糖液が得られ
た。

【００４４】

【表５】

【００４５】実施例６ バレイショ澱粉約３０％、ＭｇＳＯ₄ １×１０^-2Ｍ、
ＣａＣｌ₂ １×１０^-3ＭをｐＨ５．５で９０℃に加熱
後、バチルス・ズブチリスのα−アミラーゼ〔製品名ア
ミラーゼＡＤアマノ：天野製薬（株）製造〕を基質１ｇ
当たり１０単位加え、澱粉を液化し、次いで該液化澱粉
（ｐＨ５．５）を６０℃に冷却後、実施例５で使用した
リゾープス・デレマーのグルコアミラーゼを基質１ｇ当
たり３６単位加え糖化した。得られた糖化液（ｐＨ５．
５）に実施例２に従い調製した本発明の酵素を基質１ｇ
当たり４単位加え、６０℃で４８時間反応したところ、
異性化率４６．９％の異性化糖液が得られた。

【００４６】

【発明の効果】本発明の耐酸性、耐熱性グルコースイソ
メラーゼは、澱粉の液化に使用されているα−アミラー
ゼ及び液化澱粉の糖化に使用されているグルコアミラー
ゼの作用条件に適している。そのため実質的に一貫した
条件で液化、糖化及び異性化などの反応を行うことがで
きるため、澱粉から能率的かつ経済的に異性化糖を製造
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素を用いた異性化反応条件での反応
ｐＨの影響を示している。図中−○−はｐＨ４．７、−
●−はｐＨ４．９、−△−はｐＨ５．２、−黒三角−は
ｐＨ５．５及び−□−はｐＨ６．８の場合をそれぞれ示
す。

【図２】本発明の酵素の最適温度を示している。

【図３】本発明の酵素の熱安定性を示している。図中−
○−は８０℃、−●−は８５℃及び−□−は９０℃の場
合をそれぞれ示す。

【図４】本発明の酵素を用いた異性化反応条件での反応
温度の影響を示している。図中−○−は６０℃、−●−
は６５℃及び−□−は７０℃の場合をそれぞれ示す。

【図５】デキストリンを基質とし、グルコアミラーゼに
よる糖化反応と本発明の酵素による異性化反応を同時に
行った結果を示している。図中−○−はフラクトース量
及び−●−は全糖量をそれぞれ示す。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する耐酸、耐熱
   性グルコースイソメラーゼ。 ａ）作用：酸性下でＤ−グルコースをＤ−フラクトース
   に変換する。 ｂ）基質特異性：Ｄ−グルコースとＤ−フラクトースの
   相互変換を行う他、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース
   とＤ−リボースをそれぞれ対応するケトースに異性化す
   る。しかしＤ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−ア
   ラビノースなどには実質的に作用しない。 ｃ）作用ｐＨ：４〜８である。 ｄ）最適ｐＨ：７付近である。 ｅ）最適温度：８５〜８７℃である。 ｆ）安定ｐＨ：ｐＨ４〜１２付近である。 ｇ）温度安定性：ｐＨ７において８０〜８５℃で３０分
   で安定である。 ｈ）Ｋｍ値：グルコースに対するＫｍは約０．０８３
   Ｍ、Ｄ−キシロースに対するＫｍは約０．１３Ｍであ
   る。 ｉ）賦活剤：コバルトイオン、マグネシウムイオン、マ
   ンガンイオンなどにより賦活される。 ｊ）阻害剤：水銀イオン、銀イオン、銅イオン及びカル
   シウムイオンで阻害される。
2. 【請求項２】 請求項１記載の耐酸、耐熱性グルコース
   イソメラーゼ生産能を有するストレプトマイセス属菌を
   培養し、該グルコースイソメラーゼを生産し、これを採
   取することを特徴とする耐酸、耐熱性グルコースイソメ
   ラーゼの製造法。
3. 【請求項３】 請求項１記載の耐酸、耐熱性グルコース
   イソメラーゼをグルコース含有液に作用させ、得られる
   フラクトース含有液を採取することを特徴とするフラク
   トースの製造法。