KR920009515B1 - 안트라사이클린 유도체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

안트라사이클린 유도체의 제조방법
제1도, 제2도 및 제3도는1H-NMR에 관한 도이다.
본 발명은 다음 일반식(1)의 화합물을 미생물학적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
Figure kpo00001
상기식에서, R은 수소 또는 히드록실이고, R1및 R2는 동일하거나 다르며, 당 조합인 -Roa-dF-CinA, -Roa-dF-Acu, -Roa-dF=CinB, -Roa-Rod-CinA 또는-R oa-Rod-Acu이거나, 또는 R2가 상기한 바와 같고, R1이 당조합인 -Roa-dF-Rod, -Roa-dF-CinB, Roa-dF-Acu, Roa-Rod-Acu, -Roa-dF-CinA, -Roa-Rod-Rod 또는 -Roa-Rod-CinA이며, Roa는 로도사민이고, dF는 데옥시퓨코오즈이고, Rod는 로디노오즈이고, Acu는 아큘로오즈이고, CinA는 시네룰로오즈 A이고, CinB는 시네룰로오즈B이고, dF=CinB는 통상적인 글리코사이드 결합이외에 추가의 에테르 결합으로 결합된 데옥시퓨-코오즈 및 세네룰로오즈 B의 두 당 단위이다.
본 발명에 따른 공정은, 일반식(Ⅱ)의 화합물을 특정 옥시도리덕타아제와 반응시킨 다음 그 자체로 공지된 통상적 방법으로 추출함으로써 반응 매질로부터 생성된 화합물을 분리하고 정제하는 것이다.
Figure kpo00002
상기식에서, R은 수소 또는 히드록실이고, R3및 R4는 동일하거나 다르면, 당 조합인-Roa-dF-Rod, -Roa-Rod-Rod, -Roa-dF-CinA, 또는 -Roa-Rod-CinA이거나, R3및 R4중 단지 하나가 상기한 바와 같고, 그 나머지 -치환체가 당 조합인 -Roa-dF-Rod, -Roa-dF-CinB, Roa-dF-Acu, Roa-Rod-Acu, -Roa-dF-CinA, -Roa-Rod-Rod Roa-Rod-CinA이다.
옥시도리덕타아제와 반응시킴으로써 안트라 사이클린 트리글리코사이드중의 말단 당분자를 산화시키는 것은 공지되어 있다[참조:A.Yoshimoto등, The Journal of Antibiotics, Vol ⅩⅩⅩⅡ, 472(1979)]. 그러나 이 문헌에 기술된 안트라사이클린 유도체는 단지 한쪽 편에만 트리글리코사이드로 치환되어 있다.
놀랍게도, 이러한 공정은 분자상에 두 개의 트리글리코사이드 쇄로 치환된 안트라사이클린 유도체에 적용하는 경우, 말단 당분자의 선택적 산화가 가능하다. 따라서, 예를 들어, 일반식(Ⅱ)의 시트로딘올 스트랩토마이세스 갈릴리우스(streptomyces galilaeus; ATCC 31133)의 배양물 여액으로부터 수득된 옥시도리덕타아제 생성물과 반응시키는 경우, 단지 저급 트리글리코사이드 측쇄(=R3)만이 산화된다.
적절한 옥시도리덕타아제는, 예를 들어, 바람직하게는 스트랩토마이세스 푸르푸라센스(streptomyces purpurascens; DSM 2658)또는 스트랩토마이세스 갈릴리 우스(streptomyces galilaeus; ATCC 31133)와 같은 미생물의 배양물 여액으로부터 통상적 방법으로 분리된 세포막 현탁액과 같은 산화효소 및 효소 생성물이다.
본 발명에 따른 효소적 공정은 20 내지 45℃, 바람직하게는 37℃, 및 pH4 내지 7, 바람직하게는 pH 5내지 6에서 수행한다. 반응시간은 수시간 내지 3일이다. 또한 수율을 높이기위하여 효소를 추가로 가할 수 있다. 반응이 종결되었을때, 목적하는 화합물을 반응 매질로부터 추출시켜 분리하고, 경우에 따라서는 칼럼크로마토그래피(바람직하게는 실리카겔 또는 화학적으로 결합된 역상 흡착제상에서 수행함)또는 소적 역류 크로마토그래피(droplet Countercurrent chromatography)에 의해 분리하고 정제한다.
본 발명에 따른 공정에 의해 다음과 같은 화합물을 수득한다.
시토로딘 U(R1이 -Roa-Rod-Rod이고, R2가 -Roa-dF=CinB인 일반식(Ⅰ)의 화합물)
시토로딘 V(R1이 -Roa-Rod-Rod이고, R2가 -Roa-Rod-Acu인 일반식(Ⅰ)의 화합물)
시토로딘 P(R1-Roa-Rod-Acu이고, R2가 -Roa-Rod-CinA인 일반식(Ⅰ)의 화합물)
시트로딘 D(R1-Roa-Rod-Acu이고, R2가 -Roa-dF=CinB인 일반식(Ⅰ)의 화합물)
1-히드록시-시토로딘V, 1-히드록시-시토로딘 P, 1-히드록시-시토로딘D 및 1-히드록시-시토로딘B( R1-Roa-Rod-Rod이고, R2가 -Roa-dF-CinA인 일반식(Ⅰ)의 화합물).
본 발명에 따라 수득된 시토로딘은 세포병변 치료활성이 현저히 높다.
R이 수소인 일반식(Ⅱ)의출발화합물은스트랩토마이세스 푸르푸라센스 (Strept omyces purpurascens; DSM 2658)를 발효시킨 다음 분리하여 수득할 수 있다[참조 : 독일연방 공화국 공개 공보 제3, 323, 025호].
상기 공개공보에 따르면, 스트랩토마이세스 푸르푸라센스(DSM 2658)균주를 약 24내지 40℃, pH6.5.내지 8.5 및 호기적 조건을 유지시키며 영양 배지중에서 통상적으로 발효시킨다. 분리된 균사체로부터 안트라사이클린 화합물(시토로딘)을, 예를 들어, pH3.5에서 수성 아세톤으로 추출하고, 아세톤을 제거한 다음, 수상을 pH 7.5에서 에틸아세테이트로 추출한다. 배양물 여액을 pH7.5에서, 바람직하게는 에틸아세테이트로 추출한다. 균사체 및 배양물 여액으로부터의 에틸 아세테이트 추출물을 합하고 증발건조시켜 조질의 잔사를 수득한다. 바람직하게는 언급된 독일 특허 명세서에 기술된 바와 같은 방법으로 마무리 처리한다.
따라서 조질의 잔사를 톨루엔에 용해시키고, 아세테이트 완충액(pH 3.5)으로 추출하여 톨루엔상과 수상을 수득한다. 수상을 다음과 같이 마무리 처리한다 : pH를 7.5로 조정한 후 에틸아세테이트로 다시 추출하고, 에틸 아세테이트상을 농축시켜 시토로딘 조(粗)혼합물을 수득하고, 이로부터 크로마토그래피하여 일반식(Ⅱ)의 안트라-사이클린 유도체(시토로딘)를 수득할 수 있다.
R이 OH인 일반식(Ⅱ)의 출발화합물은 상기와 유사한 공정으로 제조하며 [참조:독일 연방공화국 특허원 제 P 34 25 357.2호], 차이점은 증가된 통기율(0.8내지 1.2vvm)에서 70내지 130시간, 바람직하게는 90 내지 110시간에 걸쳐 발효시키는 것이다.
본 발명은 다음의 실시예로서 더욱 상세히 설명된다.
[실시예1]
스트랩토마이세스 갈릴리우스(ATCC 31133)로부터 옥시도리덕타아제의 분리
스트랩토마이세스 갈릴리우스(ATCC 31133)를 다음과 같은 조성의 영양 용액 500㎖를 사용하여 2, 000㎖들이 원추형 플라스크중에 포자 현탁액으로 준배양시키고, 회전 진탕기에서 48시간 동안 배양시킨다(28℃, 200rpm).
영양용액
용성 전분 15g
글루코오즈 10g
대두분 10g
효모 추출물 1g
K2HPO41g
NaCI 3g
증류수 1ℓ
pH 7.4
이러한 예비 배양물 900ml를 12ℓ들이 발효조중의 배양 용액 9ℓ에 접종한다.
배양용액 :
용성 전분 15g
글루코오즈 10g
대두분 30g
효모추출물 1g
K2HPO41g
MgSO4×7H2O 1g
NaCl 1g
미량원소 1ml
증류수 1ℓ
pH 7.4
미량원소용액
CoCI2×6H2O 0.25g
NiCL2×6H2O 0.01g
CuCl2×2H2O 0.01g
ZnCl20.1g
H 3 BO3(붕산) 0.5g
Na2MoO4×2H2O 0.3g
NaSeO3×3 H2O 0.1g
FeSO4×7 H2O 0.2g
Hcl을 사용하여 pH 2 내지 3으로 조정함.
EDTA(Titriplex Ⅲ ) 0.05g
증류수 1ℓ
3 내지 4일 동안 28℃에서 발효시킨 후(400rpm, 통기율 0.5vvm), 배양물용액을 수거하고 원심분리시킨 다음 배양물 여액을 10배로 농축시킨다. 이러한 농축물을 황산 암모늄으로 50%포화시킨 다음 상등액을 폐기하고 침전물을 수득한다. 수득된 침전물을 pH 7.4(10mM)의 트리스-Hcl)완충액에 용해시키고 동일한 완충액의 100배되는 부피로 투석한다. 효소 용액을 음이온 교환기 DE 52(whatman)와 배치식으로 교반하고 NaCl(20mM)을 가하여 비결합된 단백질을 상기 완충액과 함께 세척하여 제거시키고, NaCl(250mM)을 가하여 특정 옥시도리덕-타아제를 동일한 완충액으로 용출시킨 다음, 황산암모늄(80%)으로 침전시켜 농축한다. 130mu/mg의 단백질을 함유하는 생성된 효소 용액을 동결건조시키고 -18℃에서 저장한다. 옥시도리덕-타아제의 활성은 기질 시토로딘 B와 함께 생성되고 연쇄 반응중 퍼옥시다아제에 의해 0-페닐렌-디아민으로 전환되는 H2O2를 측정하여 결정한다. 생성된 황색 염료의 농도는 효소에 의해 생성된 H2O2의 양에 정비례한다. 1IU(International Unit)의 효소활성은 분 당 1마이크로물의 기질을 전환시키는 것에 상응한다.
[실시예2]
스트랩토마이세스 푸르푸라센스(DSM 2658)로부터 옥시도리덕타아제의 제조
스트랩토마이세스 푸르푸라센스(DSM 2658)를 다음과 같은 조성을 갖는 효모-맥아 한천 배지상에 접종한다
효모-맥아 한천 배지 :
맥아 추출물 10g
효모 추출물 4g
한천 15g
증류수 1g
pH 7.0g
이러한 경우, 배지를 루(Roux)의 병(bottle)에 분배하고 121℃에서 30분동안 멸균한 다음 냉각시키고, 포자 현탁액으로 접종한 후 25℃에서 7내지 14일동안 배양한다. 이 후 생육과 포자 형성이 양호함을 알 수 있다. 이러한 스톡(stock)배양물로부터 멸균 NaCI(강도 0.8%)중의 포자 현탁액(107포자/ml)을 제조한다. 포자 현탁액2ml를 다음과 같은 조성의 예비 배양 배지 50ml에 접종한다.
예비 배양 배지 :
글루코오즈 15g
대두분 15g
콘스팁(고체) 5g
CaCO32g
NaCl 5g
증류수 1ℓ
pH 7.0
상기 배지의 50ml분획을 300ml 들이 원추형 플라스크에 분비하고 121℃에서 30분동안 멸균한다. 접종된 플라스크를 회전진탕기에서 2 내지 3일동안 배양시킨다 (25℃, 200rpm).
배양된 10ml의 예비배양물을 다음과 같은 조성을 갖는 본 배양 배지에 접종한다.
글루코오즈 20g
맥아추출물 10g
효모추출물 4g
증류수 1ℓ
pH 6.8
상기 배지의 500ml분획을 2, 000ml들이 원추형 플라스크에 분배하고 121℃에서 30분동안 멸균시킨다. 접종된 플라스크를 회전 진탕기에서 4내지 5일동안 배양한다(25℃, 200rpm)
배양물을 수거하고 원심분리한 다음 세포를 NaCl로 세척한다.
이러한 세포의 전체 또는 세포막 분획을 효소 반응에 사용할 수 있다.
[실시예]
[시토로딘 U의 제조]
35mg의 시토로딘 B(일반식(Ⅱ)에서 R3가 -Roa-Rod-Rod이고, R4가 -Roa-dF-CinA인 화합물)를 3ml의 에탄올(강도96%)에 용해시키고 30ml의 시트레이트 -NaOH완충액(pH 5.5)으로 충전한 다음 스트렙토마이세스 갈릴리우스로부터의 옥시도리덕 타아제(1.6U/ml)1.4ml를 가한 후 혼합물을 37°C, 150rpm에서 교반한다. 반응은 HPLC로 관찰한다. [리크로소르브 Si 60(Lichrosorb(R)Si60) , 7μ( 머르 크 (Merck), 클로로포름 : 메탄올 : 아세트산(96%) : 물 : 트리에틸아민=80 : 10 : 2 : 0.01, 유동속도 0.5내지 1.5ml, 495nm에서 유동 포토메터로 검측함]. 48시간 후, 출발물질은 더 이상 검측되지 않았다.
반응 용액에 200μl의 0.1M EDTA용액을 가하고, 1N NaOH를 사용하여 PH 7.5로 조정한 다음 혼합물을 각각 10ml의 에틸아세테으트로 3회 추출한다. 에틸아세테이트상을 No2SO4로 건조시키고 탈수제를 제거 한 다음 진공하에 가볍게 증발시킨다.
잔사 (25mg)를 상기 언급한 이동상에 용해시키고 35g의 실리카겔 리크로소르브(R)Si60, 7μ(머르크)상에서 크로마토그래피한다. (16×250mm 강철 칼럼, 유동속도 10ml/분). 분석용 HPLC에 있어서 시토로딘 U를 함유하는 분획 60 내지 70 (각각2ml)을 합하고 진공하에 농축시켜 잔사를 수득하고, 이것을 4ml의 Na아세테이트 용액(pH 3.5)에 용해시킨다. 이 용액에 0.1ml의 1mM EDTA용액을 가하고 혼합물을 톨루엔으로 세척하여 지방과 가소제를 제거한 다음, 1N NaOH를 사용하여 pH 7.5로 조정하고 조 생성물을 메틸렌 클로라이드로 추출한다.
Na2SO4상에서 건조시키고 진공하에 증발시켜 순수한 시토로딘 U(1mg)를 수득한다.
시토로딘 U : 적색의 무정형 물질 메탄올, 에틸 아세테이트, 클로로포름 및 톨로엔에 쉽게 용해되며 물과 헥산에는 불용성이다. 강도 1%의 수성 D-글루콘산 또는 D-락토비온산에 용해된다.
박층크로마토그래피 : 실리카겔 60 F254-예비 코우팅된 판＂머르크＂ ; 클로로포름 : 메탄올 : 아세트산 (96%) : 물 =80 : 10 : 10 : 2 ; Rf=0.25
1H-NMR : 제1도
흡수 스팩트럼 :
a)234(4.67) 253(SH) 295(3.86) 495(4.10)
b)235(4.68) 253(SH) 295(3.92) 495(4.18)
c)244(4.70) - 290(SH 3.8), 580, 610(4.18)
C60HY84N2O21(계산된 분자량 = 1, 168) (FAB-MS로 확인)
시토로딘 U는 R1이 -Roa - Rod - Rod이고, R2가 -Roa - dF = Cin인 일반식 (Ⅰ)의 화합물이다.
[실시예4]
[시토로딘 V의 제조]
69mg의 시토로딘 A (일반식(Ⅱ)에서 R3및 R4각각 - Roa - Rod-Rod인 화합물)를 D - 글루코네이트(시토로딘 A유리 염기 54mg에 상응함)로서 4ml의 시트레이트 - NaOH 완충액 (pH 5.5)에 용해시키고, 스트렙토마이세스 갈리리우스로부터의 옥시도리덕타아제 용액 2ml를 첨가한 후, 혼합물을 37℃, 150rpm에서 교반한다. 반응을 HPLC로 관찰한다. 48시간 후, 35％의 출발 화합물이 반응하였다. 반응 옹액을 냉동 상태에서 저장한다. 해동시킨 후, 0.2ml의 0.1mM EDTA용액을 가하고 1N NaOH를 사용하여 pH7.5로 조정한 다음 혼합물을 각각 30ml의 에닐아세테이트로 3회 추출한다. 유기상을 분리해내고 Na2SO4로 건조시킨 다음 감압하에 증발시킨다.
잔사(33mg)를 이동상에 용해시키고, 실시예 3에서와 같이 크로마토그래피하고 제조용 HPLC로 분리한다.
분획 30내지는 반은 생성물을 함유하고 분획 90내지 120은 미반응된 출발화합물을 함유한다.
반은 생성물을 실시예 3에서와 같이 세척하여 지방과 연화제를 제거하고 무정형 적색 분말 (1.0mg)로서 분리한다.
[시토로틴V]
적색의 무정형 물질 메탄올, 에틸 아세테이트 클로로포름 및 톨루엔에 쉽게 용해되며 물과 헥산에는 불용성이다. 강도1%의 수성 D-글루콘산 또는 D-락토비온산에 용해된다.
박층 크로마토그래피 :
실시예 3과 같음, Rf=0.21,1H-NMR : 제2도
흡수 스팩트럼
a) 235(4.72) 254(SH 4.48) 290(4.04) 495(4.20)
b) 235(4.73) 254(SH 4.48) 290(4.06) 494(4.24)
c) 244(4.61) 268(4.63) - 570(4.22)
610(4.19)
C60H84N2O20(계산된 분자량=1, 152)
(FAB-MS로 확인)
시토로딘 V는 R1이 - Roa - Rod이고 , R2가 - Roa - Rod - Acu인 일반식(Ⅰ)의 화합물이다.
[실시예 5]
[시토로딘 P 및 D의 제조]
25mg의 시토로딘 B (일반식(Ⅱ)에서 R3가 - Roa - Rod이고, R4가 - Roa - dF - CinA인 화합물)를 3ml의 에탄올 (강도 90%)에 용해시키고 20ml의 시트레이트 - NaOH 완충액(pH 5.5)을 가한 다음, 스트렙토마이세스 푸르푸라센스 - DSM 2658(실시예 2)로부터의 세포막 현탁액(0.5/ml) 2.5ml로 37℃에서 교반하며(150rpm) 산화시킨다. HPLC에 따르면 24시간후 21%의 출발 화합물이 존재하며 시토로딘P와 시토로딘 D는 약 5 : 1의 비율로 생성된다.
실시예 3 및 4에서와 같이 생성물의 혼합물을 반응 용액으로부터 분리하도 제조용 HPLCfh 분리한 다음 생성물을 순수한 형태로 분리한다.
수득된 순수한 화합물은 시토로딘 D(0.7mg), 시토로딘 P(1.9mg) 및 미반은된 시토로딘 B (1.2mg)이다.
시토로딘 P :
적색의 무정형 물질, 메탄올, 에틸 아세테이트, 클로로포름 및 톨루엔에 쉽게 용해되며 몰과 헥산에는 불용성이다. 강도 1%의 수성 D-글루콘산 또는 D-락토비온산에 용해된다.
박층 크로마토그래피 :
실시예 3와 같음, RF= 0.27
1H - NMR : 제3도
흡수 스펙트럼 :
a) 235(4.63) 254(SH 4.33) 293(3.90) 494(4.13)
b) 235(4.60) 254(SH 4.31) 293(3.85) 494(4.12)
c) 244(4.33) - 570(3.59)
620(3.71)
C60H82N2O21(계산된 분자량=1, 164)
(FAB-MS에 의해 확인)
시토로딘 P는 R1이-Roa-Rod-Acu이고, R2가-Roa-dF-CinA인 일반식(Ⅰ)의 화합물이다.
시토로딘 D는 R1이-Roa-Rod-Acu R2가 - Roa - dF=CinB인 일반식(Ⅰ)의 화합물이다.
[실시예 6]
1-히드록시-시토로딘 U 및 1-히드록시-시토로딘 B의 제조
1-히드록시 -시토로딘 N(일반식(Ⅱ)에서 R3가 Roa-dF-Rod이고, R4가 -Roa-Rod-Rod인 화합물)과1-히드록시-시토로딘 0(일반식(Ⅱ)에서 R3가-Roa-Rod-Rod이고, R4가-Roa-dF-Rod인 화합물)의 1:1혼합물50mg을 3ml의 에탄올(강도 96%)에 용해시키고 30ml의 시트레이트-NaOH완충액(pH5.5)으로 충진한 다음, 스트렙토마이세스 갈릴리우스로 부터의 옥시도리덕타아제(1.6U/ml) 2ml를 가한 후 혼합물을37℃, 150rpm에서 교반한다. 반응은 HPLC로 관찰한다. [리크로소르브(R)Si 0.5ml, 495nm에서 유동 포토메터로 검측함]. 17시간 후, 출발화합물은 더 이상 검측되지 않았으며 1-히드록시-시토로딘 B와 1-히드록시-시토로딘U는 3:6의 비율로 생성된다.
반응용액에 200μl의 0.1M EDTA용액을 가하고 1N NaOH를 사용하여 pH7.5로 조정한 다음 혼합물을 각각 10ml의 에틸 아세테이트로 3회 추출한다. 에틸 아세테이트상을 Na2SO4로 건조시키고 탈수제를 제거한 다음 진공하에 가볍게 증발건조시킨다.
잔사(45mg)를 상기 언급한 상에 용해시키고 35mg의 실리카겔 리크로소르브(R)Si 60, 7μ(머르크)상에서 크로마토그래피한다(16×250mm 강철 칼럼, 유동속도 : 10ml/분). 분석용 HPLC에 의하여 새로운 화합물을 함유하는 분획(각각 2ml)을 합하고 진공하에 농축시킨 다음 잔사를 4ml의 Na아세테이트 용액(pH3.5)에 용해시킨다. 이 용액에 0.1ml의 1mM EDTA용액을 가하고 혼합물을 톨루엔으로 세척하여 지방과 연화제를 제거한 다음 1N NaOH를 사용하여 pH7.5로 조정하고 조생성물을 메틸렌 클로라이드로 추출한다. Na2SO4상에서 건조시키고 진공하에 증발시켜 순수한 1-히드록시 -시토로딘U(3.5mg)와 1-히드록시-시토로딘 B(2mg)을 수득한다.
1-히드록시-시토로딘 U 및 1-히드록시-시토로딘 B;
적자색의 무정형 물질, 메탄올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 톨루엔에 쉽게 용해되며 물과 핵산에는 불용성이다. 1%강도의 수성 D-글로콘산 또는 D-락토비온산에 용해된다.
박층크로마토그래피 : 실시예3과 같음
Rf=0.25(1-히드록시-시토로딘 U)
Rf=0.18(1-히드록시-시토로딘 B)
1-히드록시-시토로딘 U :
흡수 스펙트럼 :
a)240(4.63) 296(3.82) 523(4.12) 550(4.10) 562(4.11)
b)240(4.64) 296(3.80) 522(4.20) 550(4.15)562(4.16)
c)243(4.70) 270(SH) 590(4.23) 635(4.30)
C50H84N2O22(계산된 분자량=1, 184)
(FAB-MS에 의해 확인)
1-히드록시-시토로딘U는 R1이 -Roa-Rod-Rod이고, R2가 -Roa-dF= Cin B 인 일반식(Ⅰ)의 화합물이다.
1-히드록시-시토로딘 B
흡수 스펙트럼 :
a)259(4.42) 290(3.66) 522(3.95) 549(3.82) 562(3.85)
b)238(4.45) 298(3.57) 522(4.03) 549(3.91) 562(3.93)
c)244(4.41) 280(3.62) 590(3.93) 632(4.01)
C60H86N2O22(계산된 분자량=1, 186)
(FAB-MS에 의해 확인)
1-히드록시-시토로딘 B는 R1이 -Roa-Rod-Rod이고, R2가 -Roa-dF-CinA 인 일반식(Ⅰ)의 화합물이다.
[실시예7]
1-히드록시-시토로딘P 및 1-히드록시-시토로딘D의 제조
25mg의 1-히드록시-시토로딘 B(일반식Ⅱ)에서 R3가 -Roa-Rod-Rod이고, R4가 -Roa-dF-CinA인 화합물)를 3ml의 에탄올(강도90%)에 용해시키고, 20ml의 시트레이트-NaOH완충액(pH5.5)을 가한 다음, 스트랩토마이세스 푸르푸라센스-DSM 2658(실시예2)로부터의 세포막 현탁액(0.5g/ml)2.5ml로 37℃에서 교반하면서 (150rpm)산화시킨다. HPLC에 따르면, 24시간 후 약22%의 출발화합물이 존재하고 시토로딘 P와 시토로딘 D는 4.5:1의 비율로 생성된다.
실시예3 내지 6에 기술한 바와 같이 생성물의 혼합물을 반응용액으로부터 분리하고, 제조용 HPLC로 분리한 다음 생성물을 순수한 형태로 분리한다.
수득된 순수한 화합물은 1-히드록시-시토로딘 D(0.9mg), 1-히드록시-시토로딘 P(3.2mg) 및 미반응된 시토로딘B(1.5mg)이다.
1-히드록시-시토로딘 P 및 D : 자색의 무정형 물질.
메탄올, 에틸 아세테이트, 클로로포름 및 톨루엔에 쉽게 용해되며 물과 핵산에는 불용성이다. 강도 1%의 수성D-글루콘산 또는 D- 락토비온산에 용해된다.
박층 크로마토그래피 : 실시예 3과 같음
Rf=0.27(1-히드록시-시토로딘 P)
Rf=0.35(1-히드록시-시토로딘 D)
1-히드록시-시토로딘P :
흡수 스펙트럼
a)238(4.58) 292(3.77) 522(4.03) 549(3.92)
b)237(4.63) 296(3.77) 522(4.17) 549(4.03) 561(4/03)
c)243(4.65) 275(3.85) 590(4.11) 632(4.17)
C60H82N2O22(계산된 분자량=1, 182)
(FAB-MS로 확인)
[실시예 8]
1-히드록시-시토로딘 V의 제조
50mg의 1-히드록시-시토로딘 A(일반식(Ⅱ)에서 R3및 R4가 각각-Roa-Rod-Rod인 화합물)를 D-글루코네이트(37mg의 1-히드록시-시토로딘 A 유리 염기에 상응함)로서 40ml의 시트레이트-NaOH 완층액(pH 5.5)에 용해시키고, 스트렙토마이세스 갈릴리우스로부터의 옥시도리-덕타아제 용액 2ml를 가한 후, 혼합물을 37℃, 150rpm에서 교반한다. 반응을 HPLC로 관찰한다. 48시간후, 약 35%의 출발화합물이 반응하였다. 0.2ml의 0.1mM EDTA용액을 반응 용액에 가하고 1N NaOH를 사용하여 pH 7.5로 조정한 다음 각각 30ml의 에틸 아세테이트로 3회 추출한다. 유기상을 분리해 내고 Na2SO4상에서 건조시킨 다음 감압하에 증발시킨다.
잔사(35mg)를 이동상에 용해시키고, 실시예3에서와 같이 크로마토그래피하고 제조용 HPLC롤 분리한다.
분획 32내지 47은 반응 생성물을 함유하며 분획 88내지 110은 미반응된 출발화합물을 함유한다.
실시예 3에서와 같이 반응 생성물을 세척하여 지방과 연화제를 제거하고 무정형의 적색 분말(2.0mg)로서 분리한다.
1-히드록시-시토로딘 V : 적자색 무정형 물질.
메탄올, 에틸 아세테이트, 클로로포름 및 톨루엔에 쉽게 용해되며 물과 핵산에 불용성이다. 강도 1%의 수성 D-글루콘산 또는 D-락토비온산에 용해된다.
박층 크로마토그래피 : 실시예 3과 같음
Rf=0.21
흡수 스펙트럼 :
a) 237(4.54) 295(3.72) 522(4.03) 548(4.86) 561(3.68)
b) 237(4.57) 295(3.79) 522(4.10) 548(3.93) 561(3.93)
c) 244(4.46) 280(3.76) 590(3.99) 630(4.04)
C60H88N2O21(계산된 분자량=1, 168)
(FAB-MS로 확인)
상기 실시예의 성분들은 다음과 같은 측정 조건하에 확인된 것이다.
양성자 공명 스펙트럼(1H-NMR 스펙트럼)은 HX-270 브루커 푸리에-트랜스폼 (HX-270 BRUKER Fourier-Fransform) 핵자가 공명 스펙트로메터를 사용하여 270MHz에서 측정한다. 농도는 99.8% 순도의 CDCl30.5ml당 2내지 4mg으로 한다. 제조후 즉시 용액을 99.5% 순도의 D2O중 Na2CO3(강도 5%) 0.1ml로 진탕한다.
도면에 별표로 나타낸 시그날은 10-3범위내의 저분자량의 불순물 및 용매 잔사로부터 유래된 것이다.
질량 스팩트럼은 FAB(fast atom bombardment)이온원을 사용하여 MS-902s, AEI질량 분석계로 측정한다. 물질은 티오글리세롤 매트릭스중 이온원으로 주입하고, 경우에 따라서는 염화 암모늄을 첨가한다.
흡수 스팩트럼은 200내지 700nm 범위내에서 다음과 같은 용매중에서 수행한다.
a) 물/메탄올(1 : 9)
b) 메탄올 중의 1N HCI(강도 10%)
c)메탄올 중의 1N NaOH(강도 10%)
물질 농도는 10내지 30mg/l이다. 최대 흡수대(nm) 및 몰 흡광계수(log ε)를 기록하였다.
[세포독성의 측정]
본 발명에 따른 화합물의 세포병변 치료활성은 마우스로부터의 L 1210 백혈병 세포에 대하여 측정하였다. 시험방법은 다음과 같다.
a) 증식 검정
이 방법에서, 세포를 시험물질의 각각 다른 농도에서 배양시킨 후 세포가 방사성 DNA 전구체(예 :14C로 라벨링한 티미딘)를 함유할 수 있는 정도를 시험관내에서 측정한다. 비처리된 L 1210세포에도 동일한 시험 조건을 취하고 대조로 사용한다. 방법은 다음과 같다 : 대수적 증식기(RPMI 1640중 ml당 5×103)에 있는 L 1210세포를 시험물질의 각각 다른 농도에서, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)중에서 72시간 동안 배양시킨다. (37℃, CO25%, 상대습도 95%), 대조는 시험물질을 함유하지 않은 배지로 배양된 세포로 구성된다. 모든 측정은 4배 측정으로 한다. 65시간 후, 세포의 DNA를 라벨링하기 위해 50μl 의14C-1-티미딘(1.5Uc/ml)을 가한다. 7시간 동안 배양시킨 후, 세포를 흡입여과해 내고 DNA를 강도 5%의 트리클로 아세트산으로 침전시킨 다음, 물과 메탄올로 연속 세척한다.
50℃에서 건조시킨 후, 5ml의 섬광 액체를 가한 다음 DNA로 함유된 방사성 원소를 측정한다.
결과는 시험 물질과 함께 배양한 후의 섬광지수(scimtillation index)로, 비처리된 대조에 대한 백분율로 주어진다. 용량/효과 곡선을 수득된 측정치로부터 구하며, IC50, 즉 시험조건하에서 방사성 티미딘의 함유를 대조에 비하여 50% 감소시키는 농도를 그래프로부터 구할 수 있다. 본 발명에 기술된 화합물의 IC50값이 아드리아마이신 (adriamycin:ADM)의 값과 비교되어 표1에 나타나 있다.
b) L210백혈병 세포의 연질 한천에서의 콜로니 형성이 시험은 세포가 수 세대에 걸쳐 증식하는데 대한 시험물질의 영향을 검사하기 위한 것이다(세포증식시간은 10내지 12시간이며, 7일의 시험기간동안 연속되는 14세대를 관찰할 수 있다. )
이 시험에서, 세포병변치료 활성이 있는 물질은 비처리된 대조군에 비하여 콜로니의 수를 감소시킨다. 특히, 시험은 다음과 같이 수행한다.
플레이트당 500개의 백혈병 세포를 시험 물질의 각각 다른 농도로 37℃에서 1시간동안 배양한다. 세포를 맥코이(McCoy)5A배지로 2회 세척하고 0.3%의 한천을 첨가한 후, 최종적으로 페트리(Petri)접시에 붓는다. 대조는 시험물질을 함유하지 않은 배지로 배양시킨다. 1시간동안 배양하는 대신에, 다른 농도의 시험 화합물을 한천의 최상층에 혼합하여 세포가 전 배양기간을 통하여 계속 노출될 수 있도록 한다. 한천을 고체화시킨 후, 플레이트를 배양기(37℃)에서 7일동안 배양시킨다(5% CO2, 상대습도 95%). 직경 60μ의 콜로니의 수를 센다. 결과는 비처리 대조군에 대한 처리된 한천 플레이트중의 콜로니의 수를 백분율로 나타낸다. 수득된 용량/효과 곡선으로부터, IC50을 물질의 활성으로서 측정한다. 본 발명에 따른 화합물에 대한 결과를 아드리아마이신과 비교하여 표 1에 나타내었다.
Figure kpo00003

Claims (4)

  1. 일반식(Ⅱ)의 화합물을 특정 옥시도리덕타아제와 반응시킨 다음 생성된 화합물 또는 화합물들을 반응매질로부터 추출하여 분리하고, 생성물을 정제하여 일반식(Ⅰ)의 화합물을 제조하는 방법.
    Figure kpo00004
    Figure kpo00005
    상기식에서, R은 수소 또는 히드록실이고, R1및 R2는 동일하거나 다르며, 당 조합인 -Roa-dF-CinA, -Roa-dF-Acu, -Roa-dF=CinB, -Roa-Rod-CinA또는 -Roa-Rod-Acu이거나 또는 R2가 상기한 바와 같고, R1이 당 조합인-Roa-df-Rod, -Roa -dF-CinB, -Roa-dF-Acu, -Roa-Rod-Acu, -Roa-dF-CinA, Roa-Rod-Rod또는 Roa-Rod-CinA이며, R3및 R4는 동일하거나 다르며, 당 조합인 Roa-dF-Rod, -Roa-Rod-Rod, -Roa-dF-CinA 또는 Roa-Rod-CinA이거나, R3및 R4중 단지 하나가 상기한 바와 같고, 그 나머지 치환체가 당 조합인 Roa-dF-Rod, -Roa-dF= CinB, -Roa-dF-Acu, -Roa-Rod-Acu, Roa-dF-CinA, -Roa-Rod-Rod 또는 -Roa-Rod-CinA이고, 여기서 Roa는 로도사민이고, dF는 데옥시퓨코오즈이고, Rod는 로디노오즈이고, Acu는 아클로오즈이고, CinA는 시네룰로오즈 B이고, CinB는 시네룰로오즈 B이고, dF=CinB는 통상적인 글리코사이드 결합 이외에 추가의 에테르 결합으로 결합된 데옥시퓨코오즈 및 시네룰로오즈 B의 두 당 단위이다.
  2. 제1항에 있어서, 20 내지 45℃, pH 4 내지 7, 및 수시간 내지 3일의 반응기간에 걸쳐 효소 반응을 수행하는 방법.
  3. 제1항에 또는 제2항에 있어서, 스트렙토마이세스 갈릴리우스(ATCC 31133) (Streptomycens galilaeus(ATCC 31133)) 또는 스트렙토마이세스 푸르푸라센스 (DSM 2658) (Streptomyces purpurascens (dsm 2658))의 배양물 여액으로부터 수득된 옥시도리덕타아제를 사용하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1이 -Roa-dF-Rod, -Roa-dF=CinB, -Roa-dF-Acu, -Roa-dF-CinA, -Roa-Rod-Acu, -Roa-Rod-Rod 또는 -Roa-Rod-CinA 이고, R2가 -Roa-dF-CinA.-Roa-dF-Acu, -Roa-dF=CinB, Roa-Rod-CinA 또는 -Roa-Rod-Acu인 일반식 (Ⅰ)의 화합물을 제조하기 위하여, R3가 R1에 대하여 상기한 바와 같고, R4가 -Roa-dF-Rod, -Roa-dF-CiNA, -Roa-Rod-Rod 또는 -Roa-Rod-CinA인 일반식 (Ⅱ)의 화합물을 스트렙토마이세스 갈릴리우스 (ATCC 31133)의 배양물을 여액으로부터 수득된 옥시도리덕타아제와 반응시키는 방법.
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