HU195537B

HU195537B - Microbiological process for producing anthracyclin derivatives

Info

Publication number: HU195537B
Application number: HU851527A
Authority: HU
Inventors: Werner Aretz; Gerhard Huber; Hans G Berscheid; Hans P Kraemer; Hans-Wolfram Fehlhaber
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1984-04-26
Filing date: 1985-04-19
Publication date: 1988-05-30
Also published as: NO851655L; GR851003B; PT80357B; KR850007613A; PT80357A; ATA124185A; HUT37818A; DE3415544A1; ES8603576A1; MX7305E; KR920009515B1; FI851613L; ES542523A0; FI851613A0; CA1247028A; AT388175B

Description

A találmány tárgya eljárás az (1) általános képletű vegyületek mikrobiológiai előállítására - a képletben R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport és R¹ jelentése a következő összetételű cukorkombinációk valamelyike:

Roa-Rod-Rod vagy Roa-Rod-Acu,

R² jelentése a következő összetételű cukorkombinációk valamelyike:

— Roa dF = CinB — Roa-Rod-Acu — Roa-dF-CinA — Roa-Rod-CinA amelyekben a rövidítések jelentése a következő: Roa: rodozamin, dF: dezoxi-fukóz, Rod: rodinóz, Acu: akulóz, CinA: cinerulóz A és CinB: cinerulóz B és dF = CinB azt jelentik, hogy mindkét cukormolekula alkotó, vagyis a dezoxi-fukóz és a cinerulóz B, a szokásos glikozidos kötés mellett még éteres kötéssel is kapcsolódik — azzal jellemezve, hogy egy (II) általános képletű vegyületet — a képletben

R jelentése az (1) általános képletnél már megadott és R³ jelentése a következő összetételű cukorkómbinációk valamelyike:

— Roa-dF-Rod vagy — Roa-Rod-Rod és R⁴ jelentése a következő összetételű cukorkombinációk valamelyike — Roa-dF-Rod — Roa-dF-CinA — Roa-Rod-Rod vagy — Roa-Rod-CinA — átalakítunk egy specifikus oxjd-reduktázzal, és a reakcióközegből a keletkezett vegyületet ismert módon, extrakcióval elválasztjuk és tisztítjuk. A cukorkombinációkat az (1)-(6) képletek mutatják be.

Már ismert a terminális cukormolekuláknak az oxidoreduktázzal végzett oxidációja antraciklin-triglikozidokká. [A. Yoslümoto, The Journal of Antibiotics Vol. XXXI1,472 (1979)]. Ebben az irodalomban egy, az egyik oldalon triglikoziddal helyettesített antraciklin-származékról van szó. Meglepő módon ebben az eljárásban azonban mégis lehetséges a molekulában két triglikozid láncot tartalmazó antraciklin-származékoknál a terminális cukormolekulák szelektív oxidációja. így például a (II) általános képletű citorhodinnak - a képletben R, R³ és R⁴ jelentése a már megadott - a Streptomyccs galileus (ATCC 31133) tenyészet szűrletéből előállított oxidoreduktáz készítménnyel végzett átalakitásában csak az egyik triglikozid-oldallánc oxidálódik (R³):

Oxidoreduktázként megfelelőek az olyan oxidáló 2θ enzimek és enzim-készítmények, amelyeket a Streptomyces galileus vagy — purpurascens fajba tartozó mikroorganizmusok, előnyösen Streptomyces purpurascens (DSM 1658) vagy Streptomyces galilaeus (ATCC 31133) tenyészetének szűrletéből a szokásos módon elválasztunk.

A találmány szerinti enzimes eljárást 20—45 C, előnyösen 37 ^eC hőmérsékleten és 4-7 pH, előnyösen 5 -6 pH-jú közegben folytatjuk le. A reakcióidő tarthat néhány órától 3 napig.

A kitermelés növelése érdekében további enzimet adagolhatunk a rendszerhez. A reakció lezajlása után a kívánt vegyületeket a reakcióközegből extrakcióval elváksztjuk és adott esetben oszlopkromatógráfiával, előnyösen szilikagélen vagy kémiailag kötött fordított fázison (,,reversed-phase”-adszorbenseken) vagy cseppellenáramú krornatográfiával elválasztjuk és tisztítjuk. A találmány szerinti eljárással például a következő vegyületeket állítjuk elő:

Citorhodin U (az (I) általános képletű vegyület, a kép40 letben R¹ jelentése Roa-Rod-Rod és R² jelentése -Roa-dF = CinB);

Citorhodin V (az (I) általános képletű vegyület, a képletben R¹ jelentése -Roa-Rod-Rod és R²jelentése -Roa-Rod-Acu);

Citorhodin P (az (I) általános képletű vegyület, a képletben R¹ jelentése -Roa-Rod-Acu és R²jelentése -Roa-dF-CinA);

Citorhodin D (az (I) általános képletű vegyület — a képletben R¹ jelentése -Roa-Rod-Acu és R² jelentése -Roa-dF = CinB);

I-hidroxi-citorbodin V 1-hidroxi-citorhodin P 1-hidroxi-citorhodin D

-t- 1-hidroxi-citorhodin B (az (I) általános képletű vegyüict - a képletben R* jelentése -Roa-Rod-Rod és R² jelentése -Roa-dF-CinA).

A találmány szerinti citorhodint erős citosztatikus θθ hatás jellemzi. A (II) általános képletű kiindulási vegyületet — a képletben R jelentése hidrogénatom, R³ és R⁴jelentése a már megadott — a 33 23 025 számú NSZKbeli közzétételi irat szerint Streptomyces purpurascens (DMS 2658) mikroorganizmussal végzett fermentációval, és az ezt követő elválasztással állítjuk elő,

195 537

Ugyanezen közzétételi irat alapján a Streptomyces pufpurascens törzset (DSM 2658) ismert módon tápoldatban fermentáljuk, miközben 24-40 °C hőmérsékletet, 6,5-8,5 pH-jú közeget és aerob körülményeket biztosítunk. A leválasztott micellától extrakcióval választjuk el az antraciklin vegyületeket (citorhodin). Az extrakció során például vizes acetonnal 3,5 pH-jú közegben extraháljuk, az acetont eltávolítjuk, és a vizes fázist

7,5 pH-jú közegben etil-acetáttal extraháljuk. A tenyészet szűrletét 7,5 pH-jú közegben, előnyösen etil-acetáttal extraháljuk. A micellából és a tenyészet szőriéiből készített etil-acetát extraktumokat összeöntjük és száraz bepárlás után nyers maradék keletkezik. Előnyösen a maradékot éppúgy dolgozzuk fel, mint ahogy azt a német szabadalmi bejelentésben leírták. Eszerint a nyers maradékot toluolbaii feloldjuk és acélát pufí’crrcl (pH => = 3,5) extraháljuk, miközben egy toluolos, és egy vizes fázis keletkezik. A vizes fázist a következő módon tovább feldolgozzuk: A pH-t 7,5-re beállítjuk, majd ismételten etil-acetáttal extraháljuk és töményítjük az etil-acetát fázist, aniikoris úgynevezett nyers citorhodin keveréket kapunk, amelyből a (II) általános képletű antraciklin-származékokat (citorhodinokat) kromatográfiai úton elválasztjuk.

A (II) általános képletű kiindulási vegyületeket - a képletben R jelentése“hidroxilcsoport, R³ és R⁴ jelentése a már megadott - (a 34 25 357.2 számú német szabadalmi bejelentés szerint) az előbbiekben leírt eljáráshoz hasonlóan állítjuk elő, csak azzal a különbséggel, hogy a fermentációt megnövelt levegőztetési rátán 0,81,2 térf./térf. és 70—130 óra, előnyösen 90—110 óra alatt folytatjuk le. A találmány tárgyát közelebbről megvilágítják a következő példák, A példákban közölt „U” az enzim aktivitásra nemzetközileg elfogadott mértékegység (U = 1 pmót szubsztrátunr átalakítása percenként és 1 mg proteinként) mU = milliegység.

1. példa

Óxidoreduktáz elválasztása az. ATCC 31 133 számú

Streptomyces galilaeus törzstől

Az ATCC 31 133 Streptomyces galilaeus törzset spóraszuszpenzióként átoltottuk egy 2000 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 500 inl tápoldatba. A tápoldat összetétele a következő volt:

oldódó keményítő 15 g glükóz 10 g szójaliszt 10 g élesztőextraktum 1 g

K₂HPO₄ 1 g

NaCl 3 g desztillált víz J I

PH 7,4

A spóraszuszpenziót 48 órán keresztül inkubáltuk 28 °C hőmérsékleten és 200 ford/perc fordulatszámú rotációs rázógépen.

Ebből az előtenyészetből 900 ml-t alkalmaztunk oltóanyagként egy 9 liter tenyész-oldattal megtöltött 12 literes fermentorban. A tenyészoidat összetétele a következő volt:

oldódó keményítő	15 g
glükóz	10 g
síójaliszt	30 g
élesztő extraktum	1 8
KH₂PO₄	1 g
MgSO₄X7H₂O	1 8
NaCl	1 8
nyomelemek	1 ml
desztillált víz	1 1
pH	7,4
nyomelemeket tartalmazó oldat:
CoCI₂X6H₂O	0,25 g
NiCI₂X6H₂O	0,01 g
CuCI₂X2H₂O	0,01 g
ZnCI₂	0,1 g
H₃BO₃ (bórsav)	0,5 g
Na₂MoO₄X2H₂O	0,3 g
NaSeO₃X3H₂O	0,1 g
FeSO₄X7H₂O	0,2 g

a pH-t 2—3-ra állítjuk be sósav oldattal EDTAfT)triplex(IlI)] 0,05 g desztillált víz 1 1

Három-négy napig, 28 °C hőmérsékleten, 400 főid/ /perc fordulaton és 0,5 térf./térf. levegőztetési ráta mellett végzett fermentáció után kinyerjük a tenyészoldatot, centrifugáljuk és a tenyészet szűrletét tízszeresére sűrítjük. Á sűrítményhez 50%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, a felülúszót elöntjük, az üledéket pedig feloldjuk 7,4-es pH-jú (10 mmól) TriszHCl-pufferban és az elegyet ugyanilyen, 100-szoros térfogatú pufcrral szemben dializáljuk. Az enzim oldatot ezután összekeverjük DE 52 anioncserélővei (Whatman), a nem kötődött fehérjéket a már megadott puferral végzett mosással eltávolítjuk, miközben a pufferhez 20 mmól/i NaCl-t adunk, majd ezt követően az oxidoreduktázt ugyanezzel a pufferral 250 mmól/1 NaCl hozzáadagolása közben eluáljuk és 80 %-os ammónium-szulfáttal végzett kícsapással koncentráljuk az elegyet.

A keletkezett 130 mU/ing fehérjét tartalmazó enzim o*datot liofilizáljuk és —18 °C hőmérsékleten tároljuk. Az oxidoreduktáz aktivitásának mérését a citorhodin B szubsztráttal keletkező H₂O₂ mérésével végezzük. A H₂0₂-t, egy csatolt reakcióban peroxídázzal átvisszük az o-fenilén-diaminra és a keletkező sárga színanyag koncentrációja egyenesen arányos az enzim által keletkezett H₂O₂ mennyiségével.

2. példa

Oxidoreduktáz készítmény előállítása Streptomyces purpurasccns DSM 2658 törzsből

A DSM 2658 Streptomyces purpurascens törzset a következő összetételű élesztő-maláta-garra tesszük:

malátaextraktum	10 g
élesztőextraktum	4g
glükóz	4g
agar	15 g
desztillált víz	11
pH	7,0

195 537

Ezt a közeget szétosztottuk Roux-üvegekbe és 21 °C hőmérsékleten 30 percig sterilizáltuk, lehötöttük, spóraszuszpenzióval beoltottuk és 25 °C hőmérsékleten 714 napig inkubáltuk. Ez idő múltával jó fejlődést, és spóraképződést állapíthattunk meg. Ebből a tenyészetből előállítottunk steril 0,8%-os NaCl oldatban 10⁷spóra/ml koncentrációjú spóraszuszpeuziót. A következő 50 ml előtenyészet közegéhez oltóanyagként 2 ml spóraszuszpenziót használtunk fel:

glükóz 15 g szójaliszt 15 g kukoricalekvár (szilárd) 5 g

CaCO₃ ' 2 g

NaCl 5 g desztillált víz 1 1 pH 7,0

A megadott közegből 50-50 ml-t öntöttünk 300 ml-es Erlenmeyer-lombikokba és 121 °C hőmérsékleten 30 percig sterilizáltuk. A beoltott lombikokat 25 °C hőmérsékleten, 200 ford/perc fordulattal 2—3 napig rotációs rázógépen inkubáltuk.

A kifejlődött tenyészetből 10 ml-t használtunk fel oltóanyagként a következő tenyészethez:

glükóz 20 g maláta extraktum 10 g élesztő extraktum 4 g desztillált víz . II pH 6,8

A megadott közegből 500-500 ml-t öntöttünk 2000 ml-es Erlenmeyer-lombikokba és 121 °C hőmérsékleten 30 percig sterilizáltuk. A beoltott lombikokat 4-5 napig 25 C hőmérsékleten 200 ford/perc fordulattal rotációs rázógépen inkubáltuk.

A kifejlődött tenyészetet leszedtük, centrifugáltuk, és a sejteket NaCl oldattal mostuk.

Az enzimes átalakításhoz vagy az összes sejtet, vagy ezeknek a sejteknek a membrán-frakcióit használtuk fel.

3. példa

A citorhodin U előállítása mg citorhodin B-t [a (II) általános képletű vegyület képletében R³ jelentése -Roa-Rod-Rod és R⁴ jelentése -Roa-dF-CinA] feloldottunk 3 ml 96%-os etanolban, majd az elegyet 30 ml 5,5 pH-jú citrát-NaOH pufferral feltöltöttük és összekevertük 37 °C hőmérsékleten, 150 ford/perc fordulattal 1,4 ml Str. galilalcaus (1,6 U/ml) törzsből előállított oxidoreduktázzal. Az átalakítást HPLC-vel ellenőriztük: kromatográfiás kolonna (Lichrosorb (^R)Si 60,7 μ (Merck); eluens: kloroform metanol: 96 %-os ecetsav :víz :trietil-amin 80:10:10:2:0,01; eluensáram: 0,5-1,5 ml/min; detektálás 495 nm-en; a detektálás átfolyásos fotométerrel történt. 48 óra elteltével a kiindulási vegyületet már nem lehetett kimutatni.

A reakcióoldatot 200 μΐ 0,1 mól/1 EDTA-oldattal összekevertük, majd az elegy pH-ját 7,5-re beállítottuk 1 n NaOH oldattal és háromszor extraháltuk 10—10 ml etil-acetáttal. Az etil-acetátos fázist Na₂SO₄-tal víztelenítettük, majd a víztelenítőszert elválasztottuk, és az oldatot vákuumban óvatosan bcpároltuk.

A 25 mg maradékot a már megadott eluensben feloldottuk és 35 g Lichrosorb (^R)Si 60, 7 μ (Merck) szilikagéllel töltött 16X250 nm-es acéloszlopon 10 ml/min áramlási sebességgel kromatografáltuk. Az analitikai HPLC-vel kapott citorhodin U vegyületet tartalmazó 60—70 frakciókat (2 mi kénti) összeöntöttük, vákuumban bcpároltuk és a maradékot feloldottuk 4 ml 3,5 pH-jú Na-acetát oldattal. Az oldatot összekevertük 0.1 ml 1 mmól/1 EDTA oldattal és toluoííal zsír- és lágyítómentesre mostuk, majd a pH-t 7,5-re beállítottuk 1 n NaOH oldattal, és a nyersterméket metilén-kloriddal cxtraháltuk. A szokásos Na₂SO₄ felett végzett víztelenítés és vákuumos bepárlás után 1 mg tiszta citorhodin U-t állítottunk elő.

Citorhodin U: piros, amorf anyag, könnyen oldódik metanolban, etil-acetátban, kloroformban és toluolban, oldhatatlan vízben és hexánban, oldódik 1%-os vizes Dglükonsav oldatban vagy D-laktobíonsav oldatban.

Rétcgkromatográfia: Réteglap: Merck szilikagél 60 Fj_S4-készréteglap; oldószer-rendszer: metanol: 96%-os ecetsav:víz 80:10 :10 :2; Rf=0,25.

’H-NMR: 1. ábra mutatja a vegyület tömegspektrogiáfiás felvételét.

A vegyület abszorpciós spektruma:

a) 234 (4,67) 253 (SCH) 295 (3,86) 495 (4,10) bl 235 (4,68) 253 (SCH) 295 (3,92) 495 (4,18) _c) 244 (4,70) - 290 (SCH) (3,84) 580, 610 (4,18) (FAB — tömegspektrográffal történt a meghatározás) C₅oH₈₄N₂0₂₁ molekulatömeg 1168

Citorhodin U esetében a (1) általános képletben R¹jelentése -Roa-Rod-Rod és R² jelentése-Roa-dF = CinB.

4. példa

Citorhodin V előállítása mg citorhodin A-t [a (II) általános képletben R³ és R⁴ jelentése -Roa-Rod-Rod] D-glükonátként (megfelel 54 mg citorhodin A szabad bázisnak) feloldottunk 45 mi

5,5 pH-jú citrát-NaOH pufferban és összekevertük 37 °C hőmérsékleten 150 ford/perc fordulattal 2 ml Streptomyces galilaeus törzsből készített oxidoreduktáz oldattal. Az átalakítást HPLC-vel ellenőriztük. 48 óra elteltével a kiindulási vegyületnek 35%-a átalakult. A reakcióoldatot megfagyasztva tároltuk. A felengedés után hozzáadtunk a reakcióoldathoz 0,2 ml 0,1 mmól/1 EDTA oldatot, a pH-t 1 n NaOH oldattal 7,5-re beállítottuk, és az elegyet etil-acetáttal (háromszor 30—30 ml-rel) cxtraháltuk. Az elválasztott szerves fázist Na₂SO₄-tal víztelenítettük és csökkentett nyomáson óvatosan bepároltuk.

A maradékot (33 mg) a 3. példához hasonlóan az eluensben feloldottuk és preparatív HPLC-vel elválasztottuk.

A 30—45 frakció az átalakítási, terméket, a 90—120 frakció a nem átalakított kiindulási terméket tartalmazta.

Az átalakítási terméket a 3. példa szerint zsír és lágyítómentesre mostuk, és amorf, piros porként elválasztottuk (1,0 mg).

Citorhodin V: piros, amorf anyag, könnyen oldódik metanolban, ctil-acctátban, kloroformban és toluolban,

195 537 oldhatatlan vízben és hexánban; oldódik 1%-os vizes D-glükonsav vagy D-laktobionsav oldatban. A 4. példa szerinti rétegkromatográfiával az R_f = 0,21.

’ H—NMR: A 2. ábra mutatja a vegyület tömegspektrográfiás felvételét. A vegyület abszorpciós spektruma

a) 235 (4,72), 254 (SCH 4,48), 290 (4,04), 495 (4,20)

b) 235 (4,73), 254 (SCH 4,48), 290 (4,06), 494 (4,24)

c) 244(4,61), 268(4,63) - 570(4,22)

601 (4,19)

CgoH^NjO^o molekulatömeg 1152 (FAB-tömegspektrográffal történt a meghatározás).

Citorhodin V esetében az (I) általános képletben R¹jelentése -Roa-Rod-Rod és R² jelentése -Roa-Rod-Acu.

5. példa

A citorhodin Pés D előállítása mg citorhodin B-t [a (II) általános képletben R³jelentése -Roa-Rod-Rod és R⁴ jelentése -Roa-dF-CinA] feloldottuk 3 ml 90%-os etanolban és összekevertük 20 ml 5,5 pH-jú citrát-NaOH pufferral, és a citorhodin B 37°C-on 2,5 ml Streptoinyces purpurascens (DSM 2658)ből előállított sejtmembrán szuszpcnzióval (0,5 g/ml) végzett keverés (150 ford/perc) közben oxidálódott. A HPLC-vel kapott eredmények szerint 24 óra elteltével a kiindulási vegyületből még 21 % nem alakult át, és a képződött citorhodin P és citorhodin D vegyületek aránya 5 :1. A termékkeveréket a 3. és a 4. példa szerint elválasztottuk a reakcióoldatból, preparatív HPLC-vel elkülönítettük és a terméket tiszta formában előállítottuk.

Az eljárással megkaptuk a tiszta citorhodin D (0,7 mg) és a tiszta citorhodin P (1,9 mg) vegyületeket, és az átalakulatlan citorhodin B (1,2 mg) vegyületet,

Citorhodin P: piros, amorf, anyag, könnyen oldódik metanolban, etil-acetátban, kloroformban és toluolban, oldhatatlan vízben és hexánban, oldódik a D-glükonsav, vagy a D-laktobionsav 0,1 %-os vizes oldatában.

A 4. példa szerinti rétegkromatográfiával az Rf = = 0,27.

’H-NMR: A 3. ábra mutatja a vegyület tömegspektrográfiás felvételét.

A vegyület abszorpciós spektruma:

a) 235 (4,63), 254 (SCH 4,33), 293 (3,90), 494 (4,13)

b) 235 (4,60), 254 (SCH 4,31), 293 (3,85), 494 (4,12)

c) 244(4,33) - 570(3,59)

620(3,71)

C6oH₈₂N₂0₂₎ molekulatömeg 1164 (FAB-tömegspektrográffal történt meghatározás).

A citorhodin P esetében az (I) általános képletben R¹jelentése -Roa-Rod-Acu és R² jelentése -Roa-dF-CinA.

A citorhodin D esetében az (I) általános képletben R¹jelentése -Roa-Rod-Acu és R² jelentése -Roa-dF = CinB.

6. példa

1-hidroxi-Citorhodin U és 1-hidroxi-Citorhodin B előállítása mg 1-hidroxi-citorhodin N [a (II) általános képletű vegyület képletében R³ jelentése Roa-dF-Rod és R⁴ jelentése Roa-Rod-Rod] és 1-hidroxi-citorhodin 0 [a (II) általános képletű vegyület képletében R³ jelentése -Roa-Rod-Rod és R⁴ jelentése -Roa-dF-Rod] 1:1 arányú elegyet feloldottuk 3 ml 96 %-os etanolban, majd feltöltöttük 30 ml 5,5 pH-jú citrát NaOH pufferral és összekevertük 2 ml Str. galilaeus törzsből készített oxidoreduktázzal (1,6 U/ml) 37 °C hőmérsékleten 150 ford/perc fordulaton. Az átalakítást HPLC-vel ellenőriztük: szilikagél oszlopon (Lichrosorb Si 60, 7 μ (Merck), kloroform: metanol: 96 %-os ecetsav: víz: trictil-ainin 80:10:10:2:0,01 összetételű clucnssel, az áramlási sebesség 0,5 -1,5 ml/min volt. A detektálás 495 nm hullámhosszon történt átfolyásos fotométerrel. Tizenhét óra elteltével a kiindulási vegyületeket már nem lehetett kimutatni és a képződött 1-hidroxi-citorhodin B és 1-hidroxi-citorhodin U vegyületek aránya :6 volt.

A reakcióoldatot összekevertük 200 μΐ, 0,1 mól/1 EDTA oldattal, majd az oldat pH-ját 1 n NaOH oldattal 7,5-re beállítottuk és 3X extraháltuk 10-10 ml etilacetáttal. Az etil-acetátos fázist Na₂SO₄-tal víztelenítettük, majd a szárítószert eltávolítottuk és az oldatot óvatosan vákuumban bepároltuk.

A maradékot (45 mg) feloldottuk az előbbiekben megadott fázisban és kromatografáltuk szilikagél oszlopon, amelyet 35 g Lichrosorb Si 60, 7 μ (Merck) szilikagéliel töltöttünk meg, az acéloszlop 16X250 mm-es méretű, az áramlási sebesség pedig 10 ml/min volt.

Az analitikai HPLC-vel kapott frakciókat (2—2 ml) összeöntöttük, vákuumban bepároltuk, a maradékot ml 3,5 pH-jú Na-acetát oldatban feloldottuk. Az oldatot összekevertük 0,1 ml 1 mmól/l EDTA oldattal, és toliollal zsír és lágyítószer mentesre mostuk, az oldat pH-ját 7,5-re állítottuk be 1 n NaOH oldattal, és a piros terméket metilén-kloriddal extraháltuk, A szokásos Na₂SO₄-os víztelenítés után és a vákuumban végzett bcpárlás után megkapjuk a tiszta 1-hidroxi-citorhodin U-t (3,5 mg) és a tiszta 1 -hidroxi-citorhodin B-t (2 mg).

t -hidroxi-citorhodin U és 1-hidroxi-citorhodin B:

Piros-lila színű amorf anyag, könnyen oldódik metanolban, etil-acetátban, kloroformban és toluolban, oldhatatlan vízben és hexánban; oldódik D-glükonsav vagy D-laktobionsav 1 %-os vizes oldatában. Rétegkromatográfia: szilikagél kész réteglap 60 F ₂₅₄ (Merck); oldószer-rendszer : kloroform : metanol: 96 %-os ecetsav :víz 80 10 :10 :2; az R_f érték 0,25 (1-hidroxi-citorhodin U) és R_f = 0,18 (1-hidroxi-citorhodin B).

1-hidroxi-citorhodin U:

Abszorpciós spektrum:

a) 240 (4,63), 296 (3,82), 523 (4,12), 550 (4,10),

562(4,11)

b) 240 (4,64), 296 (3,80), 522 (4,20), 550 (4,15),

562(4,16)

c) 243 (4,70), 270 (SCH), 590 (4,23), 635 (4,30) (FAB-tömegspektrográffal történt a meghatározás). C_6CH84N₂O₂₂ molekulatömeg: 1184.

Az 1-hidroxi-citorhodin U esetében az (I) általános képletben R¹ jelentése -Roa-Rod-Rod és R² jelentése -Roa-dF = CinB.

195 537

1-hidroxi-citorhodín B:

Abszorpciós spektrum:

a) 259 (4,42), 290 (3,66), 522 (3,95), 549 (3,82),

562 (3,85)

b) 238 (4,45), 298 (3,57), 522 (4,03), 549 (3,91),

562 (3,93)

c) 244 (4,41), 280(3,62), 590(3,93), 632(4,01) (FAB-tömegspektrográffal történt a meghatározás). ^6οΗ86Ν₂0₂₂ molekulatömeg: 1186Az 1-hidroxi-citorhodin B esetében az (I) általános képletben R¹ jelentése -Roa-Rod-Rod és R² jelentése -Roa-dF-CinA.

7. példa

Az 1-hidroxi-citorhodin P és az 1-hidroxi-citorhodin

D előállítása mg 1-hidroxi-citorhodin B-t [a (II) képletű vegyület képletében R³ jelentése -Roa-Rod-Rod és R⁴ jelentése -Roa-dF-CinA] feloldjuk 3 ml 90%-os etanolban, és összekevertük 20 ml 5,5 pH-jú citrát-NaOH pufferral, és 37 C hőmérsékleten 2,5 ml Streptomyces purpurascens (DSM 2658) (2, példa) törzsből készített sejtmembrán szuszpenzióval keverés közben (150 ford/perc) oxidáltuk. A HPLC eredményei alapján 24 óra elteltével még kb. 22% kiindulási vegyület nem alakult át, és a keletkezett citorhodin P és citorhodin D vegyületek aránya 4,5 : l volt.

A termék keveréket a 3—6. példákban leírtak szerint választottuk el a reakcióoldatból, majd preparativ HPLCvel elkülönítettük és a terméket tiszta formában előállítottuk.

Az eljárással megkaptuk a tiszta 1-hidroxi-citorhodin D (0,9 mg) citorhodin P (3,2 mg) vegyületeket, és az átalakulatlan citorhodin B (1,5 mg) vegyületet.

1-hidroxi-citorhodin P és -D:

Lila színű, amorf anyag, könnyen oldódik metanolban, etil-acetátban, kloroformban és tokióiban, oldhatatlan vízben és hexánban, oldódik G-glükonsav vagy Dlaktobionsav 1 %-os vizes oldatában. A 4. példa szerinti rétegkromatográfiával az R_f érték 0,27 (1-hidroxi-citorhodin P) és 0,35 (1-hidroxi-citorhodin D).

1-hidroxi-citorhodin P:

Abszorpciós spektrum:

a) 238 (4,58), 292 (3,77), 522 (4,03), 549 (3,92)

b) 237 (4,63), 296 (3,77), 522 (4,17), 549 (4,03),

561 (4,03)

c) 243 (4,65), 275 (3,85), 590 (4,11), 632 (4,17) ^6οΗ₈₂Ν₂0₂₂ molekulatömeg: 1182. FAB-tomcgspektrogröffal történt a meghatározás.

8. példa

1-hidroxi-citorhodin V előállítása mg 1-hidroxi-citqrhodin A-t [a (II) általános képletű vegyület képletében R³ és R⁴ jelentése -RoaRod-Rod] mint D-glükonátot (37 mg 1-hidroxi-citorhodin A szabad bázisnak felel meg) feloldottunk 40 ml 6 j

5,5 pH-jú citrát-NaOH pufferban és 2 ml Streptomyces galilacus törzsből készített oxidoreduktáz oldat hozzáadása után kevertük az elegyet 37 °C hőmérsékleten 150 ford/perc fordulattal.

Az átalakítást HPLC-vel ellenőriztük. 48 óra elteltével a kiindulási vegyület 35 %-a átalakult. A reakció oldatot összekevertük 0,2 ml (0,1 mmól/1) EDTA oldattal, az elegy pH-ját 7,5-re állítottuk be 1 n NaOH oldattal, és háromszor extraháltuk 30—30 ml etil-acetáttal. Az elválasztott szerves fázist Na₂SO₄-tal víztelenítettük, és óvatosan bepároltuk csökkentett nyomáson.

A maradékot (35 mg) a 3. példa szerint feloldottuk az eluensben és preparativ HPLC-vel elválasztottuk.

A 32-47. frakciók az átalakulási terméket tartalmazták, a 88-110. frakciók pedig az átalakulatlan kiindulási anyagot.

Az átalakulási terméket a 3. példa szerint zsír- és lágyítószer mentesre mostuk és amorf piros porként elválasztottuk (2,0 mg).

1-hidroxi-citorhodin V:

Piros-lila színű amorf anyag, könnyen oldódik metanolban, etil-acetátban, kloroformban, és toluolban, oldhatatlan vízben és hexánban; oldódik D-glükonsav vagy D-laktobionsav 1 %-os vizes oldatában.

A 4. példa szerinti rétegkromatográfiás vizsgálat szerint az Rf=0,21.

Abszorpciós spektrum:

a) 237 (4,54), 295 (3,72), 522 (4,03), 548 (4,86),

561 (3,68)

b) 237 (4,57), 295 (3,79), 522 (4,10), 548 (3,93),

561 (3,93)

c) 244 (4,46), 280 (3,76) 590 (3,99), 630 (4,04) €₆₀H₈₈N₂O₂i molekulatömeg: 1168. FAB-tömegspektrográfiával történt a meghatározás.

Az itt felsorolt példákban a komponensek meghatározása a következő mérési módszerrel történt:

A protonok rezonancia spektrumát (*H-NMRspektrumok) 270 MHZ-en egy HX-270 BRUKER típusú Fourier transzformációs magrezonancia spektrográffal vettük fel. A koncentráció 2-4 mg/0,5 ml volt a 99,8%-os CDCI₃-ban; az oldatokat a készítés után rögtön összeráztuk 0,1 ml 5 %-os Na₂CO₃-nak 99,5 %-os D₂O-ban készített oldatával. Az ábrákban csillaggal megjelölt csúcsok a kismolekulájú szennyeződésektől, és az oldószermaradékoktól származnak.

A tömegspektrumokat MS-902 S AEI típusú tömegspektrográffal mértük FAB (Fast-Atom-Bombardment)ionforrás felhasználásával.

A triglicerides közegben lévő anyagokat az ionforrásba helyeztük, apránként ammónium-kloridot adtunk hozzá. Az abszorpciós spektrumokat a következő oldatban mértük 200—700 nm hullámhossz-tartományban: n) víz-metanol 1 :9

b) 10%-os metanolos 1 n HC1

c) 10%-os metanolos 1 n NaOH

Az anyag koncentrációja 10-30 mg/1 volt. Megadtuk nm-ben az abszorpciós maximumokat és a moláris extinkciós koefficienst (lóg e).

A citotoxikus aktivitás meghatározása

A találmány szerinti vegyületek citosztatikus hatásának a meghatározását L 1210 egér leukémiás sejteken

195 537 végeztük. Részletesen a következő vizsgálati rendszert alkalmaztuk:

a) proliferációs vizsgálat

Ennél a módszernél meghatároztuk, hogy a sejteknek különböző koncentrációjú teszt anyaggal történt in vitro inkubálása után a sejtek milyen mértékben képesek beépíteni a radioaktív DNS előfutárt (például a ”C jelzésű timidint). A kezeletlen L1210 sejteket hasonló körülményeknek vetjük alá, amelyek kontroll anyagként szolgálnak. A továbbiakban röviden leírjuk a módszert:

Az L 1210 exponenciálisan növekvő-fázisú sejteket (5X10³/ml RPMI 1640-ben) mikrotiter lemezen különböző koncentrációjú teszt anyaggal inkubáljuk (37 °C hőmérsékleten, 5% CO₂, 95% relatív páratartalom). Λ kontroll anyagok olyan sejtek, amelyeket csak friss közeggel inkubálunk. Az összes meghatározást négyszeres meghatározásként végezzük el. 65 óra elteltével hozzáadunk 50 pl ¹⁴ C-timidint (55,5 kBq/ml) azért, hogy a sejtek DNS-eit radioaktívvá tegyük. Hét órás inkubálás után Icszívatjuk a sejteket, a DNS-ckct 5%-os triklór-ccetsavval kicsapatjuk és egymásután mossuk vízzel, illetve metanollal.

°C hőmérsékleten végzett szárítás után és 5 ml szcintillációs folyadék hozzáadása után megvizsgáljuk á DNS-be beépült radioaktivitást. Az eredményeket a teszt anyaggal végzett inkubálás után adjuk meg a kezeletlen kontroll anyagokra vonatkoztatott %-ban, a szcintillációs index arányaként.

Az így kapott mérési eredményekből meghatározzuk a dózis-hatás görbéket és grafikusan megadjuk az IC₅₀-t, azaz azt a koncentrációt, amely a vizsgálati körülmények között a radioaktív timidin beépülését a kontroll anyaggal széniben 50%-kal csökkentette.

A találmány szerinti vegyületeknek az adriamicinhez (ADM) hasonlított IC_SO értékeit az 1. táblázatban foglaltuk össze.

b) kolónia képzés

Az L1210 leukémiás sejtek kolónia képzése lágy agaron.

Ezzel a módszerrel kimutatható a teszt anyagnak több generáción keresztül a sejtnövekedésre kifejtett hatása (10—12 órás sejt-ciklus idő esetén 7 napos vizsgálati idő alatt kb. 14 egymásután következő generációt figyeltünk meg).

Ebben a vizsgálatban a citosztatikus hatású anyagok a kezeletlen kontroll anyagokhoz viszonyúvá a megfigyelhető kolóniák számának csökkenését idézték elő. A vizsgálatot részletesen a következőképpen folytattuk le:

Lemezenként 500 leukémiás sejtet inkubáltunk egy óra alatt, 37 °C hőmérsékleten, a tesztanyag különböző koncentrációival. Ezt követően a sejteket kétszer mostuk McCoy5A közeggel (McCoy és munkatársai, Proceedings Soc. Exp. Bioi. Med. 100 (1959), 115. old.; Iwakata és munkatársai, N. Y. State Journal Med. 64(1961), 2279. old.), és végezetül 0,3 % agar hozzáadása után kiöntöttük Petri-csészébe. A kontroll anyagokat csupán friss közeggel inkubáltuk.

Az egy órás inkubálás helyett néhány esetben a felső agar-réteg tesztanyagának különböző koncentrációit kevertük hozzá, hogy így a teljes inkubálási idő alatt a sejtek folytonos expozícióját érjük el. Az agar megszilárdulása után a lemezeket 7 napra 37 °C hőmérsékletre inkubátorba tettük (5% CO₂, 95% relatív párata talom). Végezetül megszámoltuk a keletkezett 60 μ átmérőjű kolóniákat. Az eredményeket a kezelt agarlemez kolóniaszámaként adtuk meg a kezeletlen kontroll anyagra vonatkoztatott %-ban.

Az így kapott dózis-hatás görbékből megadtuk az IC_S0 értéket, mint az anyag hatásosságának mértékét. A találmány szcrinli vegyületeknek az adriamicinhez hasonlított eredményeit az 1. táblázatban foglaltuk össze.

1. táblázat

Proliferációs vizsgálat 1C_5O (Mg/ml)

Kolónia képzés •C₅₀ (Mg/ml) nap 1 óra inkubálás

ADM	6,0X10^-3	2,2X10^-2	4,4 XIO^-2
Ci'.orhodin U	2,5 XiO^-3	2,7X10^-3	2.8X10^-2
Ciiorhodin V	2,8X10^-4	3 X10^-3	1,1 X10^-2
Ciiorhodin P	2.6X10^-3	3,2X10^-4	2.8X10^-3
1-OH
Ci’orhodin U	2,8X10^-3	4,5 X10^-4	2,4X10^-3
1-OH
Ci’orhodin V	2,8X10^-3	4,5 X10^-3	2.4X10^-3
1-OH
Ci’orhodin B	5 X10^-3	3 X10^-3	2,5 XIO^-3

³⁰ SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

1. Eljárás (I) általános képletű vegyületek előállítására — a képletben

35 R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport és

R¹ jelentése a következő összetételű cukorkombinácíók valamelyike - Roa-Rod-Rod vagy

40 — Roa-Rod-Acu és R² jelentése a következő összetételű cukorkombinációk valamelyike:

— Roa-dF = CinB — Roa-Rod-Acu

45 — Roa-dF-CinA vagy — Roa-Rod-CinA amelyekben a rövidítések jelentése a következő: Roa: rodozamin; dF: dezoxi-fukóz; Rod: rodinóz; Acu: akulóz; CinA: cinerulóz A és CinB: cinerulóz B és dF = CinB

50 azt jelenti, hogy mindkét cukor építőelem, a dezoxifukóz és a cinerulóz B, a szokásos glikozidos kötés mellett még egy éter-kötéssel is kötődik — azzal jellemezve, hogy valamely (II) általános képletű vegyületet — a képletben

R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport és

R³ jelentése a következő összetételű cukorkombinációk valamelyike:

— Roa-dF-Rod ⁶⁰ - Roa-Rod-Rod és R⁴ jelentése a következő összetételű cukorkombinációk valamelyike:

— Roa-dF-Rod

55 — Roa-dF-CinA

195 537 — Roa-Rod-Rod vagy — Roa-Rod-CinA — átalakítjuk egy Streptomyces purpurascens vagy Streptomyces galilaeus eredetű specifikus oxidoreduktázzal, és a keletkezett vegyületet, illetve vegyületeket a reakcióközegből extrakcióval elválasztjuk és tisztítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzimes átalakítást 20-45 °C hőmérsékleten, 4-7 pH-jú közegben és néhány órától három napig terjedő reakcióidő alatt folytatjuk le.

3. Az, 1. vagy a 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces galilaeus (ATCC 31133) vagy a Streptomyces purpurascens (DSM 2658) törzs tenyészetének szűrletéből előállított oxidoreduktázt alkalmazzuk.

4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy olyan (I) általános képletű vegyületet a képletben R¹ jelentése a következő összetételű cukorkombináció valamelyike !

— Roa-Rod-Rod vagy — Roa-Rod-CinA és R² jelentése a következő összetételű cukorkombinációk valamelyike:

5 — Roa-dF-CinA -- Roa-dF = CinB — Roa-Rod-CinA vagy — Roa-Rod-Acu úgy állítjuk elő, hogy egy (II) általános képletű vegyiiθ letet — a képletben R³ jelentése R¹ jelentésével megadott szubsztitucusekkel megegyezik és R* jelentése a következő összetételű cukorkombináció:

— Roa-dF-Rod — Roa-dF-CinA — Roa-Rod-Rod vagy — Roa-Rod-CinA átalakítunk a Streptomyces galilaeus (ATCC 31133 törzs) tenyészetének szűrletéből előállított oxidoredukin tázzal.