JPH0157956B2 - - Google Patents

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JPH0157956B2
JPH0157956B2 JP58002773A JP277383A JPH0157956B2 JP H0157956 B2 JPH0157956 B2 JP H0157956B2 JP 58002773 A JP58002773 A JP 58002773A JP 277383 A JP277383 A JP 277383A JP H0157956 B2 JPH0157956 B2 JP H0157956B2
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JP
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glucose
glucosone
enzyme
fructose
oxidase
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JP58002773A
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JPS58190394A (ja
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Ruisu Neidoruman Sooru
Furederitsuku Amon Juniaa Uiriamu
Geigaato Jon
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Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Original Assignee
Cetus Corp
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Publication date
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Publication of JPH0157956B2 publication Critical patent/JPH0157956B2/ja
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C29/00—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring
    • C07C29/09—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by hydrolysis
    • C07C29/10—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by hydrolysis of ethers, including cyclic ethers, e.g. oxiranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D301/00—Preparation of oxiranes
    • C07D301/02—Synthesis of the oxirane ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は概して、グルコースから１段階工程即
ち酵素による酸化により、フルクトース製造の中
間体であるＤ−グルコーソンの製造方法に関す
る。 結晶性フルクトースの商業規模における製造面
では種々の重要な問題に直面して来た。これらの
問題の最大の一つは製造経費の点である。現在の
発明に匹敵する唯一の商業的に実行可能な生産方
法は、先ずグルコース（グルコースイソメラーゼ
を用いるあるいはアルカリ異性化を行うことによ
り）あるいは庶糖（転化糖を経由して）から、グ
ルコース−フルクトース混合シロツプを生産す
る、次に２種の糖を物理的に分離する（イオン交
換あるいは選択的カルシウム塩沈澱による）そし
て、最終的に、水溶液中から結晶状（種を植える
かメタノール沈澱により）1フルクトースを回収す
るという工程に基ずいている。２種の糖の物理的
分離処理が必要とされる。その理由はもし実質上
すべてのイオン性物質、残余のグルコースおよび
他の夾雑物を除かない場合、結晶フルクトースを
水溶液から回収すること15が最も困難であり、し
ばしば不可能となるからである。その様な処理を
行うには費用がかさみ、それ故フルクトースに対
する市場価格が高いものになり一食用として角砂
糖に太刀打ち出来ない値段になる。 文献によればフルクトースはグルコーソンから
低濃度であるが作られ得る。1889年という初期の
文献にフルクトースはＤ−グルコーソンを酢酸水
溶液中亜鉛末で還元することにより生成された。6
この還元は種々の生体物質中のＤ−グルコーソン
の検出用分析試験として行われて来ている。8,10,12,
Ｄ−グルコーソンのＤ−フルクトースへの還元は
ナトリウムボロハイドライドでも達成される。Ｄ
−グルコーソンのフルクトースへの転換は−
CHO→CH2Oを行う還元酵素が既知となつて以
来、実行可能な酵素反応となつた。 又グルコーソンがグルコースから低濃度作られ
得るという文献によれば、グルコースを酸化す
る。種々の方法即ちH2O2 4あるいは酢酸銅5で行
うものが報告されている。これらの反応それぞれ
において変換収量が低く（30％以下）、多くの副
生成物が出来ている。グルコースをＤ−グルコー
ソンへ変換するのは、先ずグルコースの誘導体を
製造し（例えばフエニルヒドラジンと反応させグ
ルコサゾン6を作るか或はパラトルイジンと反応
させる7）、それからその誘導体を化学的に処理し
て、Ｄ−グルコーソンを製造するやり方で行つて
来た。これらの反応では収率が50％以上にならな
かつたし、又試薬が回収不可能なため、市販の目
的には高価につき過ぎる。加うるに、芳香族化合
物を含む試薬を使用すると、食品としての品質の
糖を得るために種々の問題が生じる。 グルコースのＤ−グルコーソンへの変換は又酵
素反応も知られている。1932年、グルコースをＤ
−グルコーソンへ酸化するのに軟体動物の一種、
サクシドームスギガンテウス（Saxidomus）
giganteous）8という結晶状物を用いた記載があ
る。1937年に、Ｄ−グルコーソンの製造が、グル
コース、澱粉、マルトースあるいは庶糖を２種の
かび即ちアスペルギルスパラジテイクス
（Aspargillus parasiticus）およびアスペルギス
フラブス・オリーザエ（Aspargillus flauus
oryzae）の原形質離解物で酸化することにより
行われると報告された。1956年には、グルコース
のグルコーソンへの酵素による酸化が紅藻類の一
種イリドフイクスフラシドウム（Iridophycus
flaccidum）10により行われるという報告があつ
た。グルコースをＤ−グルコーソンに酸化する炭
水化物酸化酵素が坦子菌類ポリポルスオブツスス
（Polyporus obtusus）の菌糸体から単離された。
収率については言及されていない。終りに、1978
年に、グルコース−２−酸化酵素活性が坦子菌
類、オウデマンシエラムシダ（Oudemansiella
mucida）において、他の木材腐敗病菌類12と同
様に検出された。最上の収率が50％より高くなか
つた。これらの場合すべてにおいてＤ−グルコー
ソンの生成には過酸化水素の発生を伴うと信じら
れている。 下記の図式は本発明のＤ−グルコーソンを中心
とする工程図式である。 プロピレンハロパーオキシダ−ゼー ―――――――――――――→ ハライドプロピレンハロヒドリン ハロヒドリン ―――――――→ エポキシダーゼプロピレンオキシド （過酸化水素） グルコース炭水化物 ――――――→ オキシダ−ゼＤ−グルコーソン 化学的 ―――→ 還元フルクトース 下記式はＤ−グルコースの分子構造式を表して
いる。 下記式はＤ−グルコーソンの分子構造式を表し
ている。 下記式はＤ−フルクトースの分子構造式を表し
ている。 Ｄ−グルコーソンの分子構造式に関して、他の
幾つかの分子構造式が水溶液中で存在することが
推定されることが、この分野の専門家に認められ
るであろう。これらの多くは環状構造式である。2
，３ こゝに用いられている「グルコース」「Ｄ−グ
ルコース」および「デキストローズ」という用語
はこのモノサツカライドの溶液中あるいは乾燥状
態のいずれの形態をも包含し、交代に用いられ
る。式はグルコースを表わしている。 こゝに用いられている「Ｄ−グルコーソン」お
よび「Ｄ−アラビノ−２−ヘキソースウロース」
の用語は交代に用いられる。式はＤ−グルコー
ソンを表わしている。 こゝに用いられている「フルクトース」、「Ｄ−
フルクトース」および「レブロース」の用語はグ
ルコースより甘いグルコースの異性体に対して言
うために交代に用いられる。「結晶フルクトース」
の語は無水状態におけるこのモノサツカライドを
包含する意味の応用で用いられる。式はフルク
トースを表わしている。 本発明によれば、一般的に言つて、水溶液中に
おけるグルコースは炭水化物オキシダ−ゼあるい
はグルコース−２−オキシダ−ゼの如き適当な酵
素で、酵素的にＤ−グルコーソンへ変換される。
この変換は自発的に、急速にそして実質的に完全
に進行させられる。Ｄ−グルコーソンは予め単離
しておかずに、適当な化学的水素化によつてフル
クトースへ変換される。この変換も又、急速にそ
して本質的に完全に進行させられる。得られたフ
ルクトースはグルコースおよび他の糖類すべてを
実質的に含まない状態で、水溶液あるいは固体か
いずれかの形で回収される。 上記に言及され、参照された、グルコースから
Ｄ−グルコーソンへおよびＤ−グルコーソンから
フルクトースへの低収率の変換は科学文献で既知
であるが、グルコースからフルクトースを製造す
るこれらの２種の反応を結合させる概念は現在ま
で他の文献に見られていない。加うるに、経済
的、商業的に有用な工程で、グルコースから結晶
フルクトースを製造するためこれらの２種の反応
を用いるのに成功したことは、我々の発明に先立
つて報告されていない。グルコースからＤ−グル
コーソンへの変換もＤ−グルコーソンからフルク
トースへの変換のどちらの報告にも、グルコース
から結晶フルクトースを製造する概念は考察され
ていなかつた。Ｄ−グルコーソンは化学的標品と
して必要とされたので化学的に合成された。Ｄ−
グルコーソンは生物系で、無意識的に（例えば研
究中に生化学経路における未知成分として）かあ
るいは意識的に（例えば血液中グルコースの生化
学的酸化の研究の一部として）発見された。Ｄ−
グルコーソンはＤ−グルコーソンの検出のための
はん点試験として、フルクトースへ還元された。 本発明において得られたＤ−グルコーソンの収
率はこの酵素に対して文献に報告された収率を超
えている。Ｄ−グルコーソンへの変換率が高いこ
とにより、残余の未変換グルコースを物理的に分
離する必要がない。 或種のオキシドレダクターゼはグルコースの２
番目の炭素にある水酸基を酸化することに関し
て、即ち水酸基をケト基に酸化することを促進す
る、例えば式の構造を式の構造へ変換する如
き触媒活性を有する。こゝに記した実施例におけ
る特別なオキシドレダクターゼ酵素は「グルコー
ス−２−オキシダ−ゼ」、「ピラノース−２−オキ
シダ−ゼ」および「炭水化物オキシダ−ゼ」の如
き多種を意味するが、本発明はその様に示された
酵素に限定される訳ではない。グルコース−２−
オキシダ−ゼは基質のグルコースに対して高度な
特異性を有しているが、一方炭水化物オキシダ−
ゼは適当な基質としてグルコースが挙げられる
が、より広い基質特異性を有している。グルコー
スの第２の炭素にある水酸基をケト基に変換し得
て、グルコース分子の他の基に実質的に影響を及
ぼさないような酵素はいずれも我々の発明の範疇
である。その様な酵素はグルコース−２−オキシ
ダ−ゼ活性を有する酵素の１種として明記され得
る。 適当な炭水化物オキシダ−ゼ酵素は微生物ポリ
ポールスオブツスス（Polyporus Obtusus）に由
来するものである。グルコース−２−オキシダ−
ゼの原料は他の数種の微生物、上記の軟体動物お
よび紅藻類を含む。これらの酵素およびその原料
は単に示されているだけで、本発明の範疇におけ
る適当な酵素およびその原料をすべて包含してい
ることを意味しない。 議論を容易にするために、本発明の種々の様相
は特徴的にしかし絶対的でなく、ポリポルスオブ
ツスス（Polyporus Obtusus）の適当な炭水化物
オキシダ−ゼおよびアスペルギルスオリザエのグ
ルコース−２−オキシダ−ゼを用いることに関連
して述べられるであろう。徴生物は常法により、
常温で振とう、深部培養を行う。酵素は振とう、
深部培養条件下培養した徴生物の菌糸体から製造
される。 本酵素はそのまゝの酵素でも用いられ得るが、
むしろ固定化して用いられる。酵素の固定化工程
はこの分野の専門家によく知られたもので、処理
あるいは未処理有機および無機坦体の広範囲の表
面の一部と酵素溶液を反応させることよりなる。
坦体の中にはポリアクリルアミド、エチレンマレ
イン酸共重合体、メタアクリル塩基性重合体、ポ
リペプチド、スチレン−塩基重合体、ポリペプチ
ド、スチレン−塩基重合体、ポリペプチド、スチ
レン−塩基重合体、アガロース、セルロース、デ
キストラン、シリカ、多孔性のガラス玉、活性炭
あるいはカーボンブラツク、木材およびおがく
ず、水酸燐灰石および水酸化アルミニウムあるい
は水酸化チタンが含まれる。この形態の酵素は安
定性を増加し、耐久性および有用性および再生能
力を拡大する。固定化酵素を用いて行う反応はカ
ラム中を通すことあるいは反応タンクあるいは他
の適当な反応器中で行われ得る。 炭水化物オキシダ−ゼあるいはグルコース−２
−オキシダ−ゼ酵素に加えて、酵素原料が必要と
される。又、過酸化水素の除去あるいは利用法
が、グルコースのＤ−グルコーソンへの変換反応
を最も効果的に行うために必要である。このこと
は過酸化水素が酵素分子のある決定的部位を酸化
してその機能を損傷するからである。過酸化水素
を除去する処理は(1)酵素カタラーゼによる分解(2)
既知の化学的手法による分解、そして(3)オキシド
レダクターゼ酵素のための固定化坦体と同じ酸化
マンガンあるいはカーボンブラツク16,17の如き分
解用鋳型を用いて分解する。別の適当な方法は生
成した過酸化水素を分解するよりむしろ、貴重な
副産物を作るために消費されてもよい。上記図式
に示される通り、Ｄ−グルコーソンの製造とプロ
ピレンハロヒドリンあるいはプロピレンオキシド
の製造とを組合せることは好適実施例である。 グルコースからＤ−グルコーソンへの酵素によ
る変換は水溶液中、ほゞ中性のPHで行われるのが
望ましいが、適当な緩衝液を用いて、PH領域約３
から約８以内で行われ得る。この変換は室温で行
われるのが適当であるが、約15℃から約65℃の温
度範囲で行われ得る。気圧条件は大気圧が適当で
あるが大気圧以下あるいは以上に変動することも
出来る。化学的あるいは酵素的手段でグルコース
を製造するどんな炭水化物物質でも、Ｄ−グルコ
ーソンへの変換およびフルクトース合成のための
グルコースの適当な原料である。これらの物質は
以下のものを含むが、これらのみに限定されな
い：セルロース、澱粉、庶糖、とうもろこしシロ
ツプ、HFCSおよびグルコースおよびフルクトー
スを種々の量比で含有する他のシロツプ。 本発明の糖の分析のために用いられた分析法は
以下に示される： １ 薄層クロマトグラフイー（TLC）。アビセル
被覆ガラス板で、イソプロパノール：ピリジ
ン：酢酸：水の容量比８：８：２：４の溶媒系
で展開する。グルコースおよびフルクトースは
Rf0.5〜0.6；Ｄ−グルコーソンはRf0.4〜0.5の
条痕を示す。（Rf＝物質の原点からの移動距
離／溶媒の原点から先端までの距離）プレート
にトリフエニルテトラゾリウムクロライド（２
％TTC0.5N水酸化ナトリウム溶液）を噴霧す
ると、Ｄ−グルコーソンおよびフルクトース両
者とも即時赤色スポツトを生ずる。グルコース
は100℃10分間加熱する時のみ赤色スポツトを
生ずる。プレートにジフエニルアミン／アニリ
ン／燐酸／酢酸エチル試薬（0.15ｇ／0.8ml／
11ml／100ml）を噴霧すると、グルコースは褐
色スポツトを生ずる；Ｄ−グルコーソンは紫色
の条痕を生ずる；およびフルクトースは95℃10
分間加熱する時黄色スポツトを生ずる。 ２ 高性能液体クロマトグラフイボ（HPLC）A.
ミユーボンダパツク（μ−Bondapak）−炭水
化物カラム〔ウオータースアソシエイツ
（Waters Associates）社から講入した〕を
0.001Mリン酸カリウム緩衝液（PH７）を含む
15％アセトニトリル水溶液を用い２ml／分の流
速で展開する。グルコースろRt11.5、Ｄ−グル
コーソンはRt14.0、フルクトースはRt9.5（Rt＝
保持時間）を有している。分析はウオータース
アソシエイツ（Waters Associates）屈折率検
出器およびシエツフエル（Schoeffel）波長可
変紫外線検出器（192nｍ）の両者を用いて、
スペクトル物理エスピー8000機器（Sp−ectra
Physics SP8000 instrument）で実験される。 ３ 質量分析法（MS）。次の様な誘導体製造工
程が揮発性化学成分を作るために使われる： (a) 凍結乾燥した試料約100mgへＮ，Ｎ−ジフ
エニルヒドラジン（H2NNΦ2）110mgおよび
75％エタノール水１mlを加える。反応混合物
を撹拌し、室温１夜放置する。 (b) この反応混合物へ水３mlを加え、生ずる沈
澱を遠心分離および傾瀉により上澄から分離
する。この沈澱へピリジン−無水酢酸１：１
混合液１mlを加える。この反応混合物を35゜
〜40℃の水浴中に15分間放置し、時々振とう
する。 (c) 反応を停止するために水２mlを加え、それ
から混合物をエチルエーテル３mlずつで２回
抽出する。このエーテル液を少量の無水硫酸
ナトリウムで乾燥し、それからエーテルを穏
やかに加熱し（〜40℃）、窒素を吹きつけて
飛ばす。 (d) 得られた固形物あるいはシロツプを質量分
析のために準備する。 予想反応： −CHO −CH＝NNＯ／2 ＞Ｃ＝Ｏ(1) −OH (2)H2NNＯ／2 ――――――――→ AC2O、ピリジン＞Ｃ＝Ｏ(未変化物) −OAC グルコースは556マス（C28H32N2O10）に
分子イオン、168マス（ＮＯ／2イオンフラグメ
ント）にベースイオンを生ずる；フルクトー
スは390マス（C16H22O11）に分子イオンを
生ずる；Ｄ−グルコーソンは512マス
（C26H28N2O9）に分子イオンそして223マス
（OC−CH＝Ｎ−ＮＯ／2イオンフラグメント）
に強い、特徴的なフラグメントイオンを生ず
る。分析はフインニガン（Finnigan）ガス
クロマトグラフイー／質量分析／濃度計
（GC／MS／DS）型式4023機器で、70eVで
電子衝撃イオン化、そして試料温度220゜で実
験を行う。 ４ 試験管比色分析。Ｄ−グルコース過剰量の存
在下Ｄ−グルコーソンの分析は２種の比色法で
容易に定量される。トリフエニルテトラゾリウ
ムクロライド（TTC）を用いて、２種の糖の
還元速度の差に基ずく検出法がある。20mlの試
験管内に試料0.5ml、１％TTC水溶液0.1ml、お
よび6N NaOH0.4mlを加える。正確に５分後、
酢酸：エタノール（１：９）15mlを加え、試験
管内容物を撹拌する。空試験として水を使用
し、バリアン（Varian）635紫外／可視
（UV／VIS）スペクトロメーターを用い、
480nｍで吸光度を測定する。グルコースが
TTCを還元して赤色々素−トリフエニルホル
マザンにするのはＤ−グルコーソンの等量より
約100倍も遅い速度である。ジフエニルアミ
ン／アニリン／リン酸試薬を用いて行う検出法
は糖の構造の違いにより異なる呈色をすること
に基いている。20mlの試験管に試料0.2mlおよ
び次の試薬混合物を５ml加える： ジフエニルアミン 0.15ｇ アニリン 0.80ml イソプロパノール 100ml 燐 酸 11ml 試験管を37゜の水浴中に60分間入れておく。
グルコースでは黄色溶液となる；Ｄ−グルコー
ソンでは紫色溶液となる。 本発明の種々の分析的観点で用いられる純品の
糖の出所は以下の通りである： １ Ｄ−グルコースはアプライド・サイエンス・
ラボラトリーズ（Applied Science
Laboratories）から講入した99％純品。 ２ Ｄ−フルクトースはアプライド・サイエン
ス・ラボラトリ公ズから講入した99％以上純
品。 ３ Ｄ−グルコーソンは次の方法により化学的に
合成された：グルコース20ｇを氷酢酸27mlを含
む蒸留水１と混合する。フエニルヒドラジン
44ｇを加える。反応を撹拌器により激しく撹拌
しながら80℃で３時間続け、その後室温まで一
夜冷却する。固形物を過し、10％酢酸水で、
次いでエチルエーテルで洗滌する。固形物を真
空乾燥器中50℃で充分に乾燥する。実験収量は
グルコサゾン16.1ｇである。このグルコサゾン
を３の三頚フラスコに入れ、エタノール450
ml、蒸留水750mlおよび氷酢酸９mlを加える。
新製ベンツアルデヒド27.8ｇを加え、撹拌器に
より激しく撹拌しながら還流にまで導く。この
反応を５時間還流させ続ける。コンデンサーを
逆にして、蒸留水（添加漏斗を経由して）750
mlをフラスコに加えながら、450ml蒸留する。
本反応を一夜冷却して、ベンツアルデヒドフエ
ニルヒドラゾンを沈澱させる。この溶液を過
し、残渣を洗液が澄明になる迄、蒸留水（約１
）で洗滌する。液と洗液を500mlまで濃縮
し、エチルエーテル300mlずつで10回抽出する。
水溶液中にある残りのエチルエーテルを取り除
くために、ロータリーエバポレーターに移して
30分留去する。この水溶液は厳密にアセトンで
洗滌したアンバーライト（Amberlite）XAD
−２を含む４×100cmのカラムに通過させる。
このカラムは残りのグルコーソンを除くため
に、更に200mlの水で洗滌する。水溶液を集め
て凍結乾燥する。グルコーソンの実験収量は
3.4ｇ（全体の収量16％）。 次の実施例は本発明の種々の特徴を説明する
が、しかし付加した特許請求の範囲に定義されて
いる本発明の範囲に限ることを意味するのでは全
くない。もし他に指示がない場合、温度はすべて
室温（約25℃）であり、圧力はすべて常圧（約１
気圧である。 実施例 １ 固定化炭水化物オキシダ−ゼを用いて、グルコ
ースのＤ−グルコーソンへの実質的に完全な変換
がこの実施例で示されている。 グルコース（２ｇ）を100mlのパイレツクス
（Pyrex）フラスコ中の蒸留水20mlへ加え、この
糖溶液を撹拌する。酸素ガスをフラスコ中へ吹き
込み、カタラーゼ〔シグマ化学（Sigma
Chemical Co.、）、Ｃ−40、牛の肝臓より製造〕
３mgを加える。培養液200mlから以下の様に製造
されたアガロース固定化炭水化物オキシダ−ゼも
又このフラスコ中に加える。 この酵素を製造するために、ポリポルスオブツ
スス（Polyporus obtusus）ATCC＃26733の菌
糸体を以下の様に酵母／麦芽エキス寒天斜面培地
上に発育させる：酵母エキス（３ｇ）、麦芽エキ
ス（３ｇ）、寒天（20ｇ）、ペプトン（５ｇ）およ
びグルコース（10ｇ）を蒸留水（１）中へ加
え、そしてPHを6.7に調整する。培地を121℃15分
間で滅菌する。PHをそれから6.4に調整する。こ
の寒天斜面培地に菌を接種し７日間25℃で生育さ
せる。この斜面で生育した菌を次に、上記の様に
（しかし寒天を加えずに）調整した酵母／麦芽エ
キス培地（125mlのエルレンマイヤーフラスコ
（Erlenmeyer flask）中培地20ml）に接種する。
この菌は回転振とう器で25℃９日間生育させる。
この培地をブフナー（Buchner）漏斗で＃541ワ
ツトマン（Watman）紙を通して吸引過す
る。紙上に保持された菌糸体にこの酵素が含ま
れる。 培地400mlから得られた菌糸体をPH7.0の0.05N
燐酸カリ緩衝液70mlを含むワーリングブレンダー
（Waring blender）に入れ、３分間ホモジナイズ
する。混合物を6000rpmで20分間遠沈し、上澄液
を固形物から傾瀉法で分離する。500mlのエルレ
ンマイヤーフラスコに入れた上澄液にポリエチレ
ングリコール（分子量4000）19ｇを加えて、溶液
を30分間撹拌する。それから懸濁液を7000rpmで
20分間遠心分離する。上澄液を傾斜分離して棄て
る。 0.2M塩化ナトリウム15mlと0.05M燐酸カリウ
ム緩衝液（PH7.0）15mlをこの沈澱物に加え、撹
拌する。溶液を30分放置するとその間に沈澱が生
成する。この混合物を14000rpmで20分間遠心分
離する。細胞不含の純品の酵素を含む不透明な白
色上澄液が傾斜法で分離される。 この酵素のアガロースへの固定化は以下の様に
行われる：細胞不含の純品の酵素を蒸留水500ml
に対して一晩透析させる。それからPH8.0で0.1M
炭酸水素ナトリウム５mlを加える。この溶液に活
性化CH−セフアロース（Sepharose）4B（洗滌
し、１ｍＭ HCl500mlを用いて半融グラスフイ
ルター上、再膨潤させておく）を加える。 エンドオーバーエンドミキサー（end−over−
end mixer）を用いて、ゲル懸濁液を25℃で１時
間撹拌する。それからゲル懸濁液を先ず0.1M炭
酸水素ナトリウム（PH8.0）40mlで洗滌し、次に
0.5M塩化ナトリウムを含む0.05Mトリス（Tris）
緩衝液（PH8.0）40mlで、次に0.5M塩化ナトリウ
ムを含む0.5M蟻酸ナトリウム緩衝液（PH4.0）で
洗滌する。 反応混合物のサンプルは何か変化がある度に引
出され、グルコースとＤ−グルコーソンの分析が
なされた。HPLCを用いて、Rt11.5分（グルコー
ス）とRt14.0分（Ｄ−グルコーソン）におけるピ
ーク面積を定量し、存在する糖の程度を計算す
る。次の様な結果が得られた：
【表】 反応の全経過を追つて、グルコースのＤ−グル
コーソンへの実質的変換はRf0.58（グルコース）
のスポツトが消えて、Rf0.43−0.49（Ｄ−グルコ
ーソン）のすじの出現によつても又示され、
TTCの試験管比色分析を用いて、反応の経過と
共に480nｍの吸収の増加により示される。 生成物が確実にＤ−グルコーソンであるという
ことは前述の通り質量分析により追跡したフラグ
メンテーシヨンによつて確められる。 512マス（分子イオン）と223マス（OC−CH＝
Ｎ−ＮＯ／2イオンフラグメント）における特徴的
なＤ−グルコーソンのマスイオンがこの生成物に
対し得られる。 実施例 本実施例はグルコース−２−オキシダ−ゼを用
いて、グルコースをＤ−グルコーソンへ本質的に
完全な酵素的変換を行うことを示す。 実施例（固定化坦体としてアガロースを用
う）の反応と条件を、炭水化物オキシダ−ゼに代
つてグルコース−２−オキシダ−ゼを用いて繰返
す。反応開示５時間後、99％以上のグルコースが
Ｄ−グルコーソンへ変換された。 グルコース−２−オキシダ−ゼ酵素を作るため
に、アスベルギルスオリザエATTC＃7252の菌
糸体培養を以下の如き牛、酵母エキス／トリプト
ン培地で行う：牛エキス（５ｇ）、酵母エキス
（５ｇ）、トリプトン（３ｇ）、デキストローズ
（１ｇ）およびデイフコ（Difco）澱粉（24ｇ）
を蒸留水（１）中に加え、PHを7.3に調整する。
培地を121℃で35分滅菌する。常法で得られた胞
子を用いて、培地に約３×104胞子／mlの量接種
し、回転振とう機（180rpm）で30℃２日間生育
させる。この培養物を＃541ワツトマン紙でブ
フナー斗を用いて吸引過し、水で数回洗滌す
る。紙に残つた菌糸体にこの酵素が含まれる。 本酵素の精製および固定化は実施例の処理を
用いて進め得る。 実施例 実施例においてＤ−グルコーソン生成と関連
して炭水化物オキシダ−ゼとグルコースの反応に
よつて生成する遊離の過酸化水素のレベルをカタ
ラーゼにより過酸化水素を分解して最低にさせ
た。遊離の過酸化水素のレベルを最低にする他の
方法は適当な（有益な）副産物を生産する過酸化
水素利用反応にこの生成法を結びつけることであ
る。 本実施例において、過酸化水素の生成をプロピ
レン−ブロモヒドリン（著者のアメリカ特許出願
第39337号および米国特許第4247641号に詳述され
た理論によりプロピレンオキシド合成の中間体で
ある）の製造と結びつける。グルコースとポリポ
ルスオブツススATCC＃26733の固定化した炭水
化物オキシダ−ゼと処理して、Ｄ−グルコーソン
と過酸化水素を生成する反応はブロマイドとプロ
ピレンの存在下コラリーナ種（Coralinasp.）か
ら得た固定化した海藻パーオキシダ−ゼの反応と
結合させることにより、プロピレンブロモヒドリ
ンを生成する。それからこの結合反応の最終結果
はフルクトースの製造のためのグルコーソンと特
許出願第39337号および第42219号に記した通り容
易にプロピレンオキシドに変化しやすいプロピレ
ンブロモヒドリンの共同生産である。過酸化水素
の生成と連合してグルコースの炭素２の水酸基を
酸化しうるどんな酵素でも、著者の先行の参考文
献である出願中の特許の教えに従つて、アルケン
−ハロヒドリン製造のために用いられる複合物と
ハロゲン化用過酸化酵素とを結合することが出来
る。 細胞不含の精製海藻パーオキシダ−ゼ酵素は以
下の様に製造される。 カリホルニアのラジヨラ（La jolla）海岸沿い
で得られたカロリナ種（Coralina sp.）をビルテ
イス（Virtis）45ホモゲナイザーに入れ蒸留水中
５分間摩砕する。均質化物を20000rpm20分間遠
心機にかける。上澄を傾斜法で移し保存する。残
渣の塊を蒸留水で再懸濁し再度遠沈する。この上
澄と前の上澄を合する。この溶液を硫酸アンモニ
ウムを加えて、先ず33％、次に55％飽和にする。
遠沈および塊の分離の操作を各段階で行う。この
33％〜55％の塊のフラクシヨンをDEAEカラムに
かけ、0.3Mから1Mリン酸緩衝液（PH6.0）を用
いてこう配溶出を行う。1M濃度で溶出したフラ
クシヨンを20ｍＭリン酸緩衝液（PH６）に対して
一夜透析を行う。 固定化された海藻パーオキシダ−ゼを以下の様
に製造する： ガラスビーズ（シグマケミカルカンパニー
（Sigma Chemical Company）より入手、PG−
700−200）を脱イオン水18ml中ガラスビーズ１ｇ
を懸濁することにより活性化させる。10％（容
量／容量）α−アミノプロピルトリエトキシシラ
ン２ml加え、混合物のPHを6N HClで３〜５に調
整する。混合物を75℃２時間振とうする。ガラス
ビーズを80℃一夜真空乾燥する。上記の通り製造
した精製カロリナ種（Coralina sp.）酵素3.2ml
および水溶性カルボジイミド50mgをガラスビーズ
に加える。PHを4.5に調整し、混合物を４℃一夜
振とうする。この生成物（酵素被覆ビーズ）を水
洗する。このものの活性は２モノクロロジメドン
単位／ビーズの重量ｇとして測定される。 アガロースに固定化した炭水化物オキシダ−ゼ
は実施例と同様、細胞不含精製酵素10mlから製
造される。 次の様な成分を含む反応混合物を100mlパイレ
ツクスフラスコ中に整える： (a) 海藻パーオキシダ−ゼ被覆ガラスビーズ、１
ｇ、 (b) 上記の如く製造した固定化炭水化物オキシダ
−ゼ、 (c) 臭化カリ800mgおよび (d) 0.01Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）20ml。 このフラスコにプロピレンと酸素の両者を連続
的に吹き込む。この反応を２ｇｍのグルコースで
開始する。20時間後反応液から試料を採取し、残
渣のグルコース、Ｄ−グルコーソン、およびプロ
ピレンブロモヒドリンに対して分析を行う。製造
したプロピレンブロモヒドリンは以下の様に分析
される： 反応混合物5μをヘウレツト・パツカード
（Hewlett−Packard）型式402ガスクロマトグラ
フに６−フイート×1/8インチのガラスカラムに
ポラパツク（Porapak）Ｒ（80／100メツシユ）を
つめたものへ注入する。流速はヘリウムガスに対
し30ml／分に調整し、カラム温度200℃にする。
プロピレンブロモヒドリンの保持時間は１−ブロ
モ−２−プロパノールは９分、２−ブロモ−１−
プロパノールは10分である。 生成物の同定はプロピレンブロモヒドリンの標
品と比較することにより確認する：１−ブロモ−
２−プロパノールはブラツシ・エンド・バウエル
社（Pfaltz and Bauer、Inc.）から購入された
もの。２−ブロモ−１−プロパノールは１−ブロ
モプロピオニルクロライドの水素化リチウムアル
ミニウム還元により合成される。反応生成物と標
品は同一保持時間と同一質量分析結果を示す：臭
素は等しい強度のＭおよびＭ＋２同位元素群の存
在により同定される：異性体の両者に対する分子
イオンはイソブタン試薬のガスで化学的にイオン
化させることにより確められる（M+；ｍ／e138
＋140）；１−ブロモ−２−プロパノールに対する
主なフラグメンテーシヨンはCH2Brが失われた
と予測されるフラグメントで、一方２−ブロモ−
１−プロパノールでは主なフラグメンテーシヨン
はCH3CHBrの欠損と予測されるものである。 試料の分析結果により、グルコースからＤ−グ
ルコーソンへの変換は99％以上であり、プロピレ
ンブロモヒドリン製造は20ｇｍ／であると見積
られる。 実施例 この実施例は、実施例で示された概念を更に
詳しく説明することに役立つものである。この場
合は固定化グルコース−２−オキシダ−ゼを固定
化炭水化物オキシダ−ゼにおき替えている。 固定化海藻パーオキシダ−ゼ酵素は実施例と
同様に製造される。固定化グルコース−２−オキ
シダ−ゼは実施例におけると同様製造される。 反応混合物は実施例と同様に、固定化炭水化
物オキシダ−ゼの代りに固定化グルコース−２−
オキシダ−ゼにおき替えてつくられる。 20時間後、反応物から試料を採取して残余のグ
ルコース、Ｄ−グルコーソン、およびプロピレン
ブロモヒドリンに対する分析を行う。この結果は
グルコースのＤ−グルコーソンへの変換は99％以
上、プロピレンブロモヒドリン製造は19.5ｇｍ／
であることが示された。 実施例 本実施例はカラムの反応器中固定化炭水化物オ
キシダ−ゼを用いて長い反応時間をかけてグルコ
ースのＤ−グルコーソンへ高収量で変換すること
を説明する。 実施例と同様に製造した炭水化物オキシダ−
ゼ（細胞不含、精製酵素）（10ml）を以下の様に
水酸化燐灰石（リン酸水素カルシウム）に固定化
する： 細胞不含の精製酵素100mlに水酸化燐灰石20ｇ
の１ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（PH7.0）100ml溶液
を加える。混合物を30分撹拌し、それから傾瀉法
により固形物を液体から分離する。そして固形物
を先ず10ｍＭの燐酸カリウム緩衝液（PH7.0）200
mlで、次いで蒸留水200mlで洗滌する。 それからこの物質をガラスカラム（0.5cm×4.5
cm）につめる。１％グルコース溶液をこのカラム
に１時間1.5mlの流速で流す。溶出液を残余のグ
ルコースおよび生成したＤ−グルコーソンの検出
のため定期的に分析する。 ５日間連続的に流した溶出液では、グルコース
のＤ−グルコーソンへの変換が95％以上であつた
ことを示した。過酸化水素は検出されなかつた。
本研究は酵素の真の半減期を定量する前に終了し
てしまつた。この実験のように緩慢な流出速度に
おいては、酸素の利用と過酸化水素を蓄積させな
い点の両者がグルコースのＤ−グルコーソンへの
実質的に完全な変換へ導くきめ手となる。この場
合は坦体の母体である、水酸化燐灰石が過酸化水
素を分解させた。 参考文献 １ Specialized Sugars for the Food
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Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ グルコースの水溶液をつくり、該溶液状態の
    グルコースを、酵素による酸化によつて、副生成
    物の過酸化水素を除去しつつ溶液状態のＤ−グル
    コーソンに実質的に完全に転化することからなる
    Ｄ−グルコーソンの製造方法。 ２ 酵素がグルコース−２−オキシダーゼ活性を
    有するオキシドレダクターゼである特許請求の範
    囲第１項記載の方法。 ３ 酵素がアスペルギルス・オリザエ
    （Aspergillus oryzae）からのグルコース−２−
    オキシダーゼおよびポリポラス・オブツスス
    （Polyporus obtusus）からのピラノース−２−
    オキシダーゼからなる群から選択される特許請求
    の範囲第２項記載の方法。 ４ 酵素が固定化されている特許請求の範囲第３
    項記載の方法。 ５ 過酸化水素がカタラーゼによる酵素的分解に
    よつて除去される特許請求の範囲第１項記載の方
    法。 ６ グルコースの水溶液をつくり、該溶液状態の
    グルコースをグルコース−２−オキシダ−ゼ活性
    を有する固定化オキシドレダクターゼ酵素を使用
    することによつて、副生成物の過酸化水素を除去
    しつつ、実質的に完全に溶液状態のＤ−グルコー
    ソンに転化し、Ｄ−グルコーソンを実質的に純粋
    な形で回収することからなるＤ−グルコーソンの
    製造方法。 ７ カラムリアクター中で行なわれる特許請求の
    範囲第６項記載の方法。
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