BRPI0814603B1 - Process to produce maltobionato - Google Patents

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BRPI0814603B1
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Description

“PROCESSO PARA PRODUZIR MALTOBIONATO” CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção apresenta uma forma de conservação de produtos alimentícios e rações com antioxidantes produzidos diretamente a partir do amido ou maltose já presente no produto alimentício, utilizando um processo enzimãtico. A invenção também apresenta um processo para produzir maltobionato a partir de amido ou produtos contendo amido. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A prevenção da degradação oxidativa de produtos alimentícios e rações é muito importante para a conservação da qualidade dos produtos. Os processos de oxidação dos produtos podem levar a alterações na cor, sabor, aroma ou outras alterações organolépticas inaceitáveis. Além disso, a oxidação poderá provocar danos nos aminoácidos essenciais e resulta na perda de vitaminas. Especialmente os produtos alimentícios contendo ácidos graxos poli-insaturados são suscetíveis à oxidação, resultando potencial mente em produtos alimentícios estragados.
Ocorre uma oxidação quando uma molécula do alimento, por exemplo, um ácido graxo, é combinada com o oxigênio na presença de radicais livres; traços de metais, tais como Fe e Cu; ou espécies de oxigênio reativo, tais como oxigênio livre, peróxidos ou hidroperóxidos. Os antioxidantes são utilizados para neutralizar estas reações. Exemplos de antioxidantes utilizados geralmente são butilidroxianisola (BHA) e butilidroxitolueno (BHT), que são principal mente utilizados em alimentos com alto teor de gordura e óleos, assim como sulfitos, que são usados principalmcnte como antioxidantes para evitar ou reduzir a perda de cor dc frutas e vegetais. No entanto, BHA e BHT são suspeitos de provocarem tumores quando utilizados em concentrações elevadas, e portanto poderão não ser seguros para a saúde humana, e os sulfitos são conhecidos como destruindo a vitamina B. Por estas razões, os antioxidantes biológicos ou naturais, tais como Tocoferol (vitamina E), ácido L- ascórbico, ácido cítrico, melanoidina, flavonóides e ácido gálico, geralmente são preferidos. Os agentes quelantes, tais como EDTA, siderorores (agentes quelantes de ferro de microorganismos), ácido cítrico e ácido lactobiônico também têm sido utilizados para enfrentar problemas com a oxidação, devido a sua habilidade de evitar que traços metálicos provoquem oxidação. A patente US de número 3.899.604 apresenta a produção de ácido malto-biônico a partir de maltose, através de oxidação fermentativa, utilizando uma espécie Pseudomonas graviolens e o uso do ácido malto-biônico como um aditivo alimentício; o ácido malto-biônico tem um sabor suavemente ácido e também contribui para a viscosidade dos produtos alimentícios nos quais ele é contido. Além disso, o ácido malto-biônico poderá aumentar o cheiro e o gosto naturais de certos produtos alimentícios (promotor de sabor) conforme descrito na patente US de número 3.829.583. No entanto, não existe nenhuma indicação de que o maltobionato contribua com um efeito antioxidante no alimento. A patente européia de número 0 384 534 BI apresenta a produção de ácido malto-biônico a partir de maltose por oxidação fermentativa utilizando uma família de Pseudomonas cepacia.
A oxidação não é somente um problema durante estocagem prolongada, mas também pode provocar alterações indesejáveis em um produto durante a produção, especialmente quando o oxigênio está presente durante a produção. Em conseqüência, seriam desejáveis métodos para a produção de antioxidantes naturais durante a produção de alimentos. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção atual apresenta um método para impedir reações de oxidação em produtos alimentícios e rações através da produção de maltobionato a partir de amido ou maltose presentes no alimento ou ração, por intermédio de um processo enzimático.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
De acordo com a invenção atual, as reações oxidativas em produtos alimentícios e rações podem ser evitadas ou impedidas durante a sua produção pelo maltobionato. De acordo com o nosso conhecimento, é a primeira vez que o maltobionato é utilizado como um antioxidante em alimentos ou rações durante e após a sua produção.
Além disso, a invenção atual apresenta um método de produção de maltobionato a partir do componente de amido do produto alimentício ou ração, onde ele atua como antioxidante. Assim sendo, o antioxidante da invenção atual pode ser produzido diretamente a partir dos componentes no produto, dessa forma produzindo um antioxidante 100 % natural e omitindo a produção separada e a adição de antioxidante.
Definições: O termo "suplemento" é entendido como parte do grão moído que não é malte de cevada. O suplemento poderá ser constituído de um material de planta rico em amido, por exemplo, grão moído não maltado, como cevada, arroz, milho, trigo, centeio, sorgo, açúcar e/ou xarope rapidamente fermentável.
Conforme utilizado aqui, o termo "uma fração isolada de um processo de produção de alimento ou ração" deve ser entendido como uma porção isolada que contém essencialmente todos os ingredientes normalmente utilizados na parte do processo onde ele é isolado. De preferência, a fração contém uma quantidade aumentada de amido, comparada com aquela que está normalmente presente na parte do processo do qual ele é isolado. A fração pode ser obtida em qualquer etapa durante o processo de produção, e também pode ser o produto final. No caso de ser desejada uma quantidade aumentada de amido, uma quantidade adicional do ingrediente contendo amido do processo ou de amido puro pode ser adicionada na fração isolada.
Conforme utilizado aqui, o termo "grão moído" é entendido como o material contendo amido ou açúcar que é a base para a produção de cerveja, por exemplo, malte de cevada e o suplemento. O termo "enzima isolada" utilizado aqui refere-se a um polipeptídeo com a atividade enzimática descrita, onde o polipeptídeo é pelo menos 20% puro, de preferência, pelo menos 40% puro, mais de preferência, pelo menos 60% puro, ainda mais de preferência, pelo menos 80% puro, mais de preferência, pelo menos 90% puro, e ainda mais de preferência, pelo menos 95% puro, conforme determinado pela SDS-PAGE. O termo "malte" é entendido como qualquer grão moído de cereal maltado, especialmente, cevada. O termo "maltobionato" utilizado aqui, refere-se ao ácido malto-biônico (CAS Reg. No. 534-42-9; ácido 4-O-alfa-D-glucopiranosil-D-glucônico) ou sais dos mesmos. Sais adequados incluem, mas não são limitados a, maltobionato de Na, maltobionato de Ca, maltobionato de NH4 e maltobionato de K. O termo "pasta" deve ser entendido como uma suspensão contendo o amido, constituída de grãos moídos impregnados com água. O termo "maltose pura" deve ser entendido como uma composição que contém somente maltose, água, sais inorgânicos e potencialmente um agente de solução tampão, como sais inorgânicos (por exemplo, sal de fosfato, sal de carbonato, sal de hidróxido, etc, sais orgânicos (por exemplo, fosfato citrato, acetato de sódio, etc) e outras soluções tampão orgânicas (por exemplo, HEPES, Tris, etc.). O termo base "fraca" contra "forte" refere-se à habilidade da base de se dissociar. No contexto atual, uma base fraca é definida como uma base tendo um valor pKb pelo menos de 3,5 (para bases dipróticas, tais como CO32" este valor pKb refere-se à primeira etapa). O termo "mosto" é entendido como o licor não fermentado que sai após a extração do grão moído durante a formação da pasta.
Enzimas O maltobionato pode ser gerado por oxidação de maltose. A oxidação pode ser executada utilizando-se brometo, no entanto isto não é desejável em um processo de produção de alimentos.
Na invenção atual, a conversão de maltose em maltobionato é o produto de uma reação enzimática, onde uma oxidorredutase que tem especificidade de substrato para maltose, catalisa a conversão. As oxidorredutases são enzimas que catalisam a transferência de elétrons de uma molécula para a outra. As desidrogenases e as oxidases pertencem à classe de enzima de oxidorredutases. Geralmente as desidrogenases necessitam a presença de um cofator, como por exemplo, NAD/NADP ou uma coenzima flavina, como FAD ou FMN, e este poderá também ser o caso das oxidases. A não ser que seja sugerida alguma coisa mais, as enzimas descritas abaixo e em toda a descrição, são enzimas isoladas com cofator, se for requerido.
Uma categoria de oxidorredutases adequada para uso na invenção atual, são oxidases que catalisam uma reação de oxidação/redução envolvendo oxigênio molecular (O2) como o receptor de elétrons. Nestas reações, o oxigênio é reduzido a água (H2O) ou peróxido de hidrogênio (H2O2). Especialmente, as carboidrato oxidases que catalisam a conversão de maltose em maltose-delta-lactona que são imediatamente decompostas em água para formar maltobionato. O processo gera peróxido de hidrogênio. O esquema líquido de reação poderá ser descrito como: maltose + O2 + H2O —*■ maltobionato + H2O2 (equação 1) É conhecida uma quantidade de carboidrato oxidases adequadas capazes de converterem maltose em maltobionato, e são disponíveis para a pessoa adestrada. Exemplos de tais carboidrato oxidases são aldose oxidase, celobiose oxidase (EC 1.1.99.18), piranose oxidase (EC 1.1.3.10), e hexose oxidase (EC1.1.3.5). Estudando-se a EC 1.1.3.-, EC 1.2.3.-, EC 1.4.3.-, e EC 1.5.3.- ou classes de enzima semelhantes com base nas recomendações do "Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)”, outros exemplos de carboidrato oxidases úteis são facilmente reconhecidos por uma pessoa adestrada na arte.
Uma carboidrato oxidase preferida é uma carboidrato oxidase microbiana, especialmente uma carboidrato oxidase isolada. A Hexose oxidase (EC1.1.3.5) é uma carboidrato oxidase capaz de oxidar vários sacarídeos, incluindo glicose, galactose, maltose, celobiose e lactose. As enzimas que pertencem à classe das hexose oxidases são enzimas preferidas na invenção atual. As hexose oxidases são produzidas naturalmente por várias espécies de algas marinhas. Tais espécies são, i.e., são encontradas na família Gigartinaceae que pertence à ordem Gigartinales. Exemplos de espécies de algas que produzem a hexose oxidase pertencentes à Gigartinacea, são Chondrus crispus e iridophycus flacci. As espécies de algas da ordem Cryptomeniales, incluindo as espécies Euthora cristata são também fontes em potencial adequadas para a hexose oxidase para uso na invenção atual. Especialmente, as hexose oxidases adequadas para uso na invenção atual, por exemplo, são extraídas da alga vermelha iridophycus flaccidum (Bean and Hassid, 1956, J Biol Chem 218: 425 - 436) ou são extraídas da Chondrus crispus, ou Euthora cristata conforme descrito na WO 96/40935, que descreve ainda mais a clonagem e a expressão recombinante da hexose oxidase a partir de Chondrus crispus mostrada como SEQID NO's 30 e 31 na WO96/40935. A celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) é uma carboidrato oxidase capaz de oxidar diversos sacarídeos, incluindo celobiose, celo-oligossacarídeos solúveis, lactose, xilobiose e maltose. As enzimas que pertencem à classe de celobiose oxidases são também enzimas preferidas na invenção atual. A celobiose oxidase é uma enzima extracelular produzida por vários fungos de degradação de madeira, tais como o fungo “míldeo branco” Phanerochaete Chrysosporium, o fungo “míldeo castanho” Coniphora Puteana e os fundos “míldeo esponjoso” como Monillia sp., Chaetomium, cellulolyticum, Myceliophtora (Sporotrichum) thermophila, Sclerotium rolfsii eHumicola insolens (Schou et al., 1998, Biochemical Journal 330: 565 - 571).
Outras carboidrato oxidases adequadas podem ser derivadas, por exemplo, de uma Pyrenomycetes, como Acremonium, especialmente, A. strictum depositado com a ATCC 34717 ou A. strictum TI (Lm et al., 1991, Biochimica et Biophysica Acta 1118: 41 - 47); A. fusidioides depositada com a IFO 6813; ou A. potronii depositada com a IFO 31197. Em uma realização preferida, a carboidrato oxidase é obtida da fonte apresentada em (Lin et al., 1991, Biochimica et Biophysica Acta 1118: 41 - 47) assim como na JP 5084074.
Em outra realização, a carboidrato oxidase é uma carboidrato oxidase obtida de um fungo que pertencia ao gênero Microdochium, mais de preferência, onde o fungo é Microdochium nivale, e ainda mais de preferência, onde o fungo é o Microdochium nivale depositado com a CBS 100236. A oxidase isolada da CBS 100236 é descrita em detalhes na WO 99/31990 (SEQ ID NO: 1 e 2 da WO 99/31990 são incorporadas aqui como referência). A geração de maltobionato por fermentação de bactéria do gênero Pseudomonas que cresce em um substrato contendo maltose, foi descrita anteriormente (US 2.496.297 ,US 3.862.005, US 3.899.604 e EP384534). Também é possível utilizar-se as desidrogenases da Pseudomonas, especialmente da P. ovalis, P. schuylkilliensis, P. graveolens (por exemplo, depositada com a IFO 3460), P. fragi, P. iodinum, P. amyloderamosa (por exemplo, depositada com a ATCC e 21262) ou P. cepacia (por exemplo, depositada com a CBS 659,88 ou CBS 658,88). A quantidade de oxidase/desidrogenase a ser utilizada geralmente dependerá dos requisitos específicos e da enzima específica. A quantidade de adição de oxidase, de preferência, é suficiente para gerar o grau desejado de conversão de maltose em maltobionato dentro de um tempo especificado. Tipicamente, uma adição de oxidase na faixa de cerca de 1 a cerca de 10.000 OXU/kg de substrato é suficiente, especialmente de cerca de 5 a cerca de 5000 OXU/kg de substrato, e mais especialmente, de cerca de 5 a cerca de 500 OXU/kg de substrato. Está dentro do conhecimento geral da pessoa adestrada, ajustar a quantidade de enzima especifica requerida para a conversão de maltose em maltobionato.
Na literatura, uma unidade de oxidase (OXU) normalmente é definida como a quantidade de enzima que oxida um micro- mol de maltose por minuto sob condições específicas. No entanto, nos exemplos apresentados aqui, a OXU é definida como 1 mg de enzima oxidase pura - conforme medido em relação ao padrão de enzima.
Em um outro aspecto da invenção atual, o maltobionato é produzido por uma reação catalisada por duas enzimas. A primeira reação forma maltose a partir dos componentes de amido presentes durante a produção de alimentos ou rações, utilizando uma enzima amilase. A segunda reação é a oxidação de maltose em maltobionato conforme descrito no aspecto acima. As duas reações podem ser feitas simultaneamente ou em seqüência. Em uma realização preferida, a reação de amilase é feita primeiramente, seguida pela reação de maltose em maltobionato. A amilase é capaz de hidrolisar o amido para formar oligossacarídeos como um produto principal, especialmente, maltose, um processo que é bem conhecido pela pessoa adestrada. A amilase poderá ser derivada de uma bactéria ou fungo, especialmente, de uma família de Aspergillus, de preferência, uma família de A. niger ou A. oryzae, ou de uma família de Bacillus. Alguns exemplos são alfa-amilase, por exemplo, de Bacillus amyloliquefaciens, e amyloglucosidase, como por exemplo, de A. niger. Os produtos comerciais incluem BAN e AMG (produtos da Novo Nordisk A/S, Dinamarca), Grindamyl A 1000 ou A 5000 (disponível da Grindsted Products, Dinamarca) e Amilase H e Amilase P (produtos da Gist-Brocades, Países Baixos). Da mesma forma, podem ser utilizadas a beta-amilase, ou outras enzimas de degradação de amidos resultantes da formação de maltose.
Em um outro aspecto da invenção, a catalase (EC 1.11.1.6) é adicionada para evitar a limitação da reação controlada pela carboidrato oxidase para eliminar o H202 indesejado no produto final. Uma catalase é uma enzima que catalisa a reação: 2 H202 —► 02 + 2 H20 (equação 2).
Conforme descrito acima, a carboidrato oxidase é dependente de oxigênio, mas produz peróxido de hidrogênio. A vantagem de se adicionar catalase no processo da invenção atual é que a carboidrato oxidase é fornecida com oxigênio e ao mesmo tempo, o peróxido de hidrogênio que tem propriedades oxidantes fortes, é removido. Isto é especialmente importante se o maltobionato é produzido como uma parte integrada do processo de produção de alimentos ou rações.
Uma quantidade de catalases adequadas é conhecida pela pessoa adestrada, por exemplo, a catalase disponível comercialmente, Catazyme® da Novozymes A/S.
Produção A produção de maltobionato por fermentação, por exemplo, utilizando bactéria do gênero Pseudomonas que cresce em um substrato contendo maltose, geralmente é conhecida na arte (US 2.496.297, US 3.862.005, US 3.899.604, e EP 384534). Adicionalmente a WO 99/31990 descreve a oxidação de maltose pura em maltobionato utilizando-se a carboidrato oxidase.
Um aspecto da invenção refere-se à produção de maltobionato, através do processamento de amido e/ou maltose presentes naturalmente em uma produção de alimentos ou rações, em uma reação separada da produção real de alimentos ou rações. O processo para produzir maltobionato é composto das seguintes etapas: i) obtenção de um substrato contendo amido e/ou maltose aplicável em um processo de produção de rações ou alimentos; ii) a conversão do amido em maltose através de reação enzimática; e iii) a conversão de maltose em maltobionato através de uma reação enzimática. A fração contendo amido pode ser purificada para enriquecer o conteúdo de amido antes da conversão em maltose. A reação enzimática na etapa ii) de preferência, é catalisada por uma amilase. Se o substrato na etapa i) contém maltose, a etapa ii) pode ser omitida. A reação enzimática na etapa iii) é catalisada por uma oxidorredutase/desidrogenase, de preferência, por uma das carboidrato oxidases descritas acima, ainda mais de preferência, por uma hexose oxidase descrita acima, e mais de preferência, pela carboidrato oxidase obtenível do Microdochium nivale depositada com a CBS 100236. A etapa ii) e a etapa iii) podem ser executadas como um processo de uma etapa ou de duas etapas, pelo fato da amilase e da carboidrato oxidase poderem ser adicionadas na mistura da reação em conjunto, ou a amilase pode ser deixada agir sobre o amido em uma etapa separada antes de ser adicionada a carboidrato oxidase na mistura da reação. O processo descrito resulta em uma conversão quase completa de amido/maltose em maltobionato, de preferência, 80%, mais de preferência, 85%, mais de preferência, 90%, ainda mais de preferência, 95%, mais de preferência, 99%, e ainda mais de preferência, 100% de amido e/ou maltose no substrato é convertida em maltobionato. O maltobionato pode ser adicionado de volta para o produto alimentício ou ração em uma quantidade desejada. Opcionalmente, o maltobionato obtido no processo descrito acima pode ser purificado, se a pureza é insuficiente.
Uma vantagem deste processo é que os componentes usados são aqueles que são usados de qualquer forma na produção de alimentos ou rações, e portanto o maltobionato não é derivado de quaisquer aditivos. De preferência, a fração contendo amido e/ou maltose obtidas de um produto alimentício ou ração, é constituído de 5% a 60%, mais de preferência, entre 10% e 40%, ainda mais de preferência, entre 15% e 30%, ainda mais de preferência, entre 20% e 25% de amido e/ou maltose. Uma vantagem adicional do processo descrito é que os outros componentes do produto alimentício ou ração não complicam o processo.
As complicações de processo de outros componentes no produto alimentício ou ração, por exemplo, podem ser a formação de espuma, porque a reação da carboidrato oxidase poderá requerer a adição de oxigênio na mistura da reação, o que pode criar espuma nas misturas de reação contendo proteína.
As condições para a conversão de amido em maltose utilizando a amilase, geralmente são conhecidas na arte. A pessoa adestrada será capaz de escolher as condições que serão compatíveis com as condições para a conversão de maltose em maltobionato, conforme descrito abaixo, se for desejado.
Um substrato que é constituído de amido e/ou maltose, por exemplo, pode ser obtido de processos de produção de alimentos ou rações que utilizam, por exemplo, araruta, cevada, mandioca, milho, cereais, feno, aveia, batatas, arroz, centeio, sagu, soja, sorgo, batata-doce, e/ou trigo no processo. Os processos de produção de alimentos onde o amido e/ou maltose estão naturalmente presentes, por exemplo, são cervejaria, algumas produções de vinho ou espíritos, produção de refrigerantes, bolos, batatas fritas ou produção de petiscos. Especialmente, no processo de cervejaria, a maltose está naturalmente presente, porque o processo de produção do mosto produz maltose para a fermentação. Especialmente o mosto tem um alto teor de maltose. O substrato contendo amido e/ou maltose a ser usado com os métodos da invenção atual pode ser uma matéria-prima contendo o amido puro, conforme mencionado acima, de preferência, essa matéria prima é triturada, por exemplo, através de trituração ou moagem, e é colocada em suspensão em um líquido. Altemativamente, ela pode ser uma fração obtida de um processo de produção de alimentos ou ração, como uma pasta, um “mosto”, um petisco, uma batata frita, e uma preparação para a produção de um refrigerante. De preferência, o substrato contendo o amido e/ou maltose, a ser usado como os métodos da invenção atual, não é constituído de maltose pura. O processo para produzir maltobionato deve ser executado sob condições que permitem que a carboidrato oxidase converta a maltose em maltobionato. Tais condições incluem, mas não são limitadas a temperatura, pH, oxigênio, quantidade e características da carboidrato oxidase, outros aditivos, tais como catalase e tempo de reação/incubação.
Um tempo de incubação adequado deve permitir que o grau de conversão de maltose em maltobionato seja interessante. Geralmente, um tempo de incubação adequado é escolhido na faixa de 1/2 h a 3 dias, de preferência, de 2hr a 48 h, mais de preferência, de 5 h a 24h, mais de preferência, de 8 h a 18 h.
Oxigênio é um fator importante no processo atual porque a conversão de maltose em maltobionato consome oxigênio (veja a equação 1 acima). Assim sendo, se o oxigênio é monitorado durante a reação enzimática, geralmente se observa uma queda inicial na quantidade de oxigênio, a qual, por exemplo, se for fornecido ar constantemente, retomará para aproximadamente o nível inicial, quando termina a reação da enzima. Quando o oxigênio retoma a mais de 90% do nível inicial a reação enzimática terminou, ou pelo menos foi significativamente reduzida, indicando que todo o substrato (por exemplo, amido, dextrina e/ou maltose) foi processado para maltobionato. Assim sendo, um tempo de incubação adequado, de preferência, podería ser um tempo que pelo menos dure até que o nível de oxigênio na batelada de produção retome para mais de 90% do nível inicial, especialmente se é desejada uma conversão máxima de maltose. Altemativamente, a reação pode ser monitorada pela quantidade de base requerida para manter constante o pH. Quando a quantidade de base requerida para manter o pH é reduzida, isso é uma indicação de que a reação terminou ou pelo menos foi significativamente diminuída. Um declínio na reação de enzima poderá, no entanto, não somente ser devido à exaustão do substrato. A estabilidade da enzima ao longo do tempo é também um parâmetro que poderá afetar a reação. Em conseqüência, se a enzima é degradada ao longo do tempo, isto também poderá fazer com que a reação seja diminuída. Neste caso a adição de substrato não resultaria em uma redução renovada em oxigênio e pH.
As fontes adequadas de oxigênio e incluem ar atmosférico (aproximadamente 20% de oxigênio), ar atmosférico enriquecido por oxigênio (teor de oxigênio > 20%) e oxigênio puro. A execução do processo em uma pressão maior do que uma atmosfera aumenta a solubilidade do oxigênio e poderá ser preferida sempre que for aplicável. O oxigênio poderá ser fornecido para o processo, por exemplo, através da mistura contínua de ar para dentro da mistura da reação durante a incubação.
Uma opção alternativa para a produção de O2 é através da adição de H2O2 na presença de catalase (ver a equação 2 acima). Altemativamente, poderá ser utilizado o H202 produzido naturalmente pela carboidrato oxidase. O uso de H2O2 como uma fonte de oxigênio poderá ser especialmente preferido quando 0 processo é executado utilizando-se enzimas imobilizadas, onde a adição de oxigênio é mais difícil, ou onde a formação de espuma, por exemplo, em misturas da reação contendo proteína, é um problema devido a adição de oxigênio pela mistura de ar para dentro da reação. A catalase poderá ser adicionada em qualquer tempo adequado, por exemplo, juntamente com a carboidrato oxidase, ou durante a reação, quando o nível de O2 é reduzido, de preferência, a catalase é adicionada no início da incubação (tempo = 0). Uma vantagem de adicionar-se uma catalase juntamente com a carboidrato oxidase é que o requisito de oxigênio pode ser significativamente reduzido (em até 50%). Assim sendo, o suprimento de oxigênio, por exemplo, na forma de ar poderá ser significativamente reduzido. Na realidade, adicionando-se uma quantidade adequada de catalase juntamente com H2O2 é possível evitar- se completamente a suplementação de oxigênio. Este H2O2 adicionado a mais poderá ser proveniente de qualquer fonte comercial.
Assim sendo, uma realização preferida da invenção atual é onde essencialmente todo o oxigênio requerido para a oxidação de maltose em maltobionato é obtido pela adição de uma catalase, que gera o oxigênio requerido pela conversão do H202 disponível. Se a quantidade de H2C>2 limita o processo, pode ser adicionado mais Η202.
No contexto atual, a expressão "essencialmente todo o oxigênio) é usada para descrever o suprimento de oxigênio requerido para a reação enzimática trabalhar adequadamente e especialmente, não é necessário adicionar-se ativamente mais oxigênio durante o processo.
Em uma realização preferida, é adicionada catalase em uma quantidade que reduz a concentração de H202 quando comparada com um processo semelhante sem a catalase. Mais de preferência, a quantidade de catalase adicionada no processo conforme descrito aqui, é uma quantidade que é suficiente para a obtenção, pelo menos de 25%, 50%, 75%, 85% ou 95% de redução na quantidade de H2C>2 comparada com um processo de controle comparativo onde a única diferença comparativa é que não é adicionada catalase, mesmo mais de preferência, a quantidade de catalase adicionada no processo conforme descrito aqui, é uma quantidade que é suficiente para a obtenção de uma redução de 100% na quantidade de H202 quando comparada com um processo de controle comparativo, onde a única diferença comparativa é que não é adicionada catalase. De preferência, a catalase é adicionada em uma quantidade que também é melhora o grau de conversão de maltose em maltobionato. A temperatura de incubação geralmente dependerá da carboidrato oxidase utilizada e tipicamente é escolhida de acordo com a temperatura ótima de reação para a carboidrato oxidase. No entanto, como a solubilidade do oxigênio é reduzida com o aumento de temperatura, outros fatores devem ser levados em consideração para a obtenção de um processo ótimo. A pessoa adestrada saberá como controlar a temperatura ótima com relação, por exemplo, à atividade enzimática e à solubilidade de oxigênio. Geralmente, uma temperatura adequada estará na faixa de cerca de 0°C a cerca de 99°C, mais de preferência, na faixa de 5°C a 90°C, ainda mais de preferência, na faixa de 15°C a 85°C, mais de preferência, na faixa de 25°C a 80°C, ainda mais de preferência, na faixa de 30°C a 60°C. O pH ótimo pode variar, dependendo da carboidrato oxidase usada. No entanto, a análise da cinética da carboidrato oxidase do Microdochium nivale (Nordkvist et al., 2007, Biotechnol Bioeng 97: 694 -707) indica que o uso de bases fortes (NaOH) poderá afetar a estabilidade da carboidrato oxidase. Além disso, a 97/004082 descreve que podem ser obtidos rendimentos aumentados de lactobionato utilizando carboidrato oxidase quando o processo é executado em um pH estável. Assim sendo, para aumentar o rendimento de maltobionato do processo atual, poderá ser desejável manter-se o pH durante a conversão de maltose em maltobionato (etapa iii acima), através da adição adequada de uma base, em um nível estável. Em realizações específicas, o nível estável de pH é mantido na faixa r de cerca de 3,0 a cerca de 9,0 através da adição de uma base. E possível manter-se o pH dentro das faixas prescritas utilizando-se qualquer base. Em princípio, qualquer substância capaz de neutralizar o ácido produzido será aplicável no processo. As pessoas adestradas conhecem várias bases que podem ser aplicadas no processo da invenção, como por exemplo, bases fortes tais como Ca(OH)2, KOH, NaOH e Mg(OH)2. Em uma realização preferida, uma base fraca ou carbonato é utilizada para manter o pH em um nível estável. Exemplos de bases fracas incluem, mas não são limitadas a, CaC03, Na2CC>3, K2C03, (NH4)2C03 e NH4OH. Atualmente, as bases fracas preferidas sãoNEUOH e Na2C03. O valor preferido de pH estável para um processo específico de interesse será, conforme será visto pela pessoa adestrada, dependente de vários fatores. Por exemplo, se o produto alimentício é cerveja, o pH de produção do mosto é conhecido como sendo ao redor de 5,0 a 5,7, de preferência, ao redor de 5,1 a 5,3. Assim sendo, será preferível manter-se o pH em um nível estável ao redor de 5,3, como um pH de 5,0 a 5,6. As faixas preferidas de pH para outros produtos alimentícios/rações poderá estar na faixa de pH de 3,0 a 4,0, por exemplo, para sucos ou refrigerantes como colas, ou na faixa de 4,0 a 5,0, por exemplo, para cerveja ou maionese ou coberturas, ou na faixa de 5,6 a 6,5, por exemplo, para produtos de carne, ou na faixa de 6,6 a 7,5 para produtos laticínios e ovos.
Será visto que o pH do produto ou composição de maltobionato composto de maltobionato de acordo com o processo atual também pode ser ajustado para um nível preferido de pH depois ou no final de ser executada a conversão enzimática, por exemplo, quando tiver sido atingida 95% da conversão desejada de maltose, o pH podendo ser deixado cair para um nível desejado.
No contexto atual, "um nível estável de pH" deve ser entendido amplamente como o controle e a manutenção do pH durante o processo dentro de uma faixa específica, ou próximo de/em um valor específico através da adição de uma base. O controle ou ajuste/manutenção do pH durante um processo enzimático é um procedimento padrão que pode ser executado com um grau muito elevado de precisão. Assim sendo, um pH estável poderá ser um valor mantido em um nível constante com uma variação de menos de 1,5 unidades de pH, de preferência, menos de 1,0 unidades de pH, mais de preferência, menos de 0,5 unidades de pH, mais de preferência, menos de 0,3 unidades de pH, ainda mais de preferência, menos de 0,2 ou 0,1 unidades de pH. Segue-se que uma faixa ótima poderá ser definida para um processo enzimático específico de acordo com a invenção atual e o pH pode ser controlado e mantido com o grau de precisão descrito dentro desta faixa. No processo da invenção, uma faixa específica de pH ou valor específico de pH adequado é escolhida na faixa de um pH em tomo de 3 a cerca de 9. É preferível que o pH seja mantido em um nível estável de pH conforme descrito aqui, desde o início da reação enzimática. Em outras palavras, imediatamente após a adição de oxidase no produto contendo maltose é adicionada a base para manter o pH estável conforme descrito aqui.
Especialmente, se é desejada uma conversão máxima de maltose, o PH é mantido no nível estável conforme descrito aqui por um período de tempo que pelo menos dure até que o nível de oxigênio da mistura da reação retome para mais de 90% do nível inicial, ou a quantidade de base utilizada para manter o pH constante corresponda ao grau desejado de conversão.
De preferência, o pH é mantido em um nível estável de pH conforme descrito aqui durante um período de tempo de 30 minutos a 3 dias, de preferência, de 2h a 48h, mais de preferência, de 5h a 24h, mais de preferência, de 8h a 18h.
Em uma realização especifica da invenção atual, a conversão de maltose em maltobionato é feita em uma batelada de mosto obtida de um processo de produção de pasta. O mosto contendo maltobionato pode ser usado como ingrediente para uma série de bateladas de mosto para a produção de cerveja.
Em outra realização especifica da invenção atual, a conversão de amido em maltose e em maltobionato é feita em uma batelada de pasta antes do processo de produção da pasta. O processo poderá incluir a adição de amilase juntamente com a carboidrato oxidase. A pasta contendo maltobionato pode ser usada como ingrediente em uma série de processos de produção de pasta.
Um aspecto específico da invenção refere-se a um processo para a obtenção de um rendimento aumentado e/ou um tempo de reação reduzido na conversão enzimática de maltose em maltobionato. O processo é definido pelas etapas: i) adição de uma carboidrato oxidase em um substrato constituído de maltose; ii) a incubação do substrato sob condições que permitam que a carboidrato oxidase faça a conversão da maltose em maltobionato; e iii) a manutenção do pH durante a etapa ii) na faixa de cerca de 3,0 a cerca de 9,0, através da adição de uma base.
Neste aspecto específico, o substrato para uso na produção de maltobionato pode constituir maltose pura. De preferência, o substrato é obtido através da conversão do amido, por exemplo, de um processo de produção de ração ou alimentos, em maltose, através de uma reação enzimática, utilizando, por exemplo, amilase, conforme descrito acima.
Obviamente, os processos apresentados na invenção atual são úteis para uma produção industrial de maltobionato por si próprios. Os processos poderão, no entanto, também formar parte de um processo de produção para a produção de um produto alimentício ou ração, onde a maltose está naturalmente presente durante a produção.
Outro aspecto da invenção atual refere-se à produção de maltobionato diretamente (in situ) em um processo de produção de alimentos ou rações através do processamento de amido e/ou maltose que está naturalmente presente no processo. Em conseqüência, neste aspecto, o maltobionato é formado durante a produção de alimentos ou rações como tal, e não em uma reação separada conforme descrito acima. O processo para produzir maltobionato, onde o processo é integrado no processo de produção de rações ou alimentos, é constituído das seguintes etapas: i) adição de uma oxidorredutase ou desidrogenase, de preferência, uma carboidrato oxidase, em um processo de produção de alimentos ou ração; ii) a manutenção do processo sob condições que permitam a conversão enzimática de maltose em maltobionato; iii) a continuação do processo de produção de alimentos ou rações. A reação enzimática na etapa i) poderá ser precedida por uma reação de degradação de amido, por exemplo, catalisada por uma amilase, que poderá ser fornecida endogenamente (por exemplo, do malte já presente no processo) ou exogenamente (por exemplo, através da adição antes ou em conjunto com a enzima da etapa i). A carboidrato oxidase e as condições que permitem a conversão enzimática são essencialmente as mesmas descritas acima. Com relação à temperatura ótima, no entanto, deve ser considerado que a reação deve ser executada em um processo de produção de alimentos/rações. Em conseqüência, será vantajoso que a carboidrato oxidase possa trabalhar nas temperaturas ótimas para tal processo. A vantagem de geração de maltobionato diretamente durante o processo de produção de alimentos ou rações, é que tão logo o processo é utilizado, as etapas de produção em separado de geração de maltobionato se tomam supérfluas.
Em uma realização especifica da invenção atual, o maltobionato é gerado durante um sub-processo em uma produção de cerveja, como o processo de produção de pasta ou o processo de fermentação, através da adição de carboidrato oxidase e potencialmente de catalase no sub-processo. A conversão de maltose em maltobionato pode acontecer na pasta (grão moído + fluido) antes da formação da pasta, ou durante o processo de formação de pasta ou depois do cozimento do mosto antes da fermentação, ou mesmo durante a fermentação. O último, no entanto, requer enzimas aprovadas para alimentos. No entanto, é requerida a presença de maltose no mosto para a fermentação do mosto na cerveja. Assim sendo, a conversão de maltose em maltobionato deve ser utilizada de tal forma que a maltose seja convertida somente parcialmente em maltobionato. De preferência, o mosto contém até 2% de maltose, mais de preferência, até 5% de maltose, e mais de preferência, até 10% de maltose. O processo de produção de pasta aplica um aumento controlado em etapas da temperatura, onde cada etapa favorece uma ação enzimática sobre a outra, eventualmente, degradando as proteínas, as paredes das células e o amido. Os perfis de temperatura de produção de pasta geralmente são conhecidos na arte. Na invenção atual, a conversão de maltose em maltobionato, de preferência, ocorre em conexão com a etapa de sacarificação (degradação do amido) entre 55°C e 66°C. Em uma realização preferida, a carboidrato oxidase é ativa nesta faixa de temperatura. Altemativamente, o processo de produção de pasta poderá ser mantido em uma temperatura menor suficientemente longa para permitir a conversão do amido em maltose e em maltobionato em uma temperatura onde a carboidrato oxidase é ativa. Pode ser adicionada exogenamente amilase nesta etapa para facilitar a conversão de amido em maltose.
Em outra realização da invenção atual, a produção de maltobionato é feita depois da fermentação da cerveja. Neste caso a quantidade de maltose requerida deve ser fornecida juntamente com a carboidrato oxidase e potencialmente a catalase porque toda a maltose disponível foi assimilada durante a fermentação.
Em outra realização da invenção atual, o produto alimentício é um lanche, caracterizado por ter um alto teor de amido, i.e. > 25%, mais de preferência acima de 50%, e um alto teor de lipídios, i.e. >10, mais de preferência, acima de 15%. Amilase, carboidrato oxidase e potencialmente a catalase podem ser adicionados a uma preparação de lanche juntamente com ingredientes convencionais, por exemplo, proteínas, como leite ou pó de leite, glútens, e soja; ovos (ovos inteiros, gema de ovo ou clara de ovo); temperos, tais como gordura granulada ou óleo; um agente redutor como L-cisteína; um açúcar; um sal como cloreto de sódio, acetato de cálcio, sulfato de sódio ou sulfato de cálcio. A produção de maltobionato diretamente no lanche até um certo ponto poderá substituir os antioxidantes convencionais, como ácido ascórbico, bromato de potássio, iodato de potássio, azodicarbonamida (ADA) ou perssulfato de amônio. Altemativamente, o processo pode ser executado de acordo com o primeiro aspecto da invenção, onde a amilase, carboidrato oxidase e potencialmente catalase são adicionados em uma batelada de material de amido da produção de lanches. Naquele caso, uma conversão elevada de maltose em maltobionato pode ser assegurada em tal batelada e uma parte da batelada pode ser adicionada de volta para a produção de lanches.
Purificação de maltobionato: Opcionalmente, é possível purificar-se o maltobionato de qualquer forma adequada para obter-se um produto de maltobionato ou uma composição constituída de maltobionato com um grau desejado de pureza de maltobionato. A pessoa adestrada saberá executar a purificação de maltobionato, e dependendo dos requisitos específicos de interesse, poderá ser obtida uma composição constituída pelo menos de 70% de maltobionato, pelo menos 80%, pelo menos 90% de maltobionato ou mesmo pelo menos 95% ou pelo menos 99% de maltobionato. Métodos adequados para a purificação do maltobionato, incluem filtração, troca iônica, concentração e secagem.
Uma composição constituída de maltobionato poderá ser utilizada na fabricação de produtos alimentícios tais como, por exemplo, um aditivo alimentício ou um ingrediente alimentício, especialmente como um antioxidante em um produto alimentício.
Uso de maltobionato em produtos alimentícios e de rações A invenção atual também se refere ao uso de maltobionato como um antioxidante em um produto alimentício ou ração, especialmente como um agente quelante.
Em um aspecto da invenção atual, o maltobionato é adicionado a um produto alimentício ou ração em uma quantidade eficaz. A pessoa adestrada será capaz de identificar a quantidade de maltobionato necessária para a obtenção de um efeito antioxidante no produto alimentício ou ração. O maltobionato pode ser produzidos durante o processo de produção, conforme descrito acima. Em situações onde o processo de produção não é naturalmente constituído de amido ou maltose, o maltobionato pode ser adicionado durante o processo. Altemativamente, o maltobionato pode ser adicionado no produto alimentício ou ração final.
Na invenção atual, a finalidade de adicionar-se maltobionato em um produto alimentício ou ração é o seu efeito antioxidante, e não o seu efeito sobre a viscosidade de produtos alimentícios, nem a sua habilidade em aumentar o cheiro e gosto natural de certos produtos alimentícios (promotor de sabor). EXEMPLOS Exemplo 1 Produção de maltobionato O maltobionato de Na foi produzido a partir de maltose através da oxidação catalisada por carboidrato oxidase (M. Nivale CBS 100236 conforme descrito na WO 99/31990) e catalase (Catazyma 25L, Novozymes, Dinamarca). As dosagens de enzima são: carboidrato oxidase 400 mg de proteína de enzima/kg de maltose, catalase 6 g/kg de maltose. A maltose foi dissolvida em uma concentração de 10%, a 38°C. Um reator com agitação contendo uma solução de 3 litros foi utilizado para a reação. Durante a reação, foi adicionado ar atmosférico a 1 litro/minuto e o pH foi mantido constante em 6,4 através da adição contínua de uma solução 1M Na2C03. O tempo total de reação foi de 17h. Essencialmente toda a maltose foi convertida em ácido malto-biônico durante a reação.
Exemplo 2 Efeito antioxidante Ido maltobionato medido pelo ensaio de pó férrico antioxidante redutor (FRAP).
Em resumo, o ensaio FRAP funciona como se segue: O complexo de Fe3+-tripiridiltriazina (TPTZ) é reduzido a aFe2+-TPTZ em pH baixo. A forma do ferro (Fe2+) é de cor azul e pode ser medida espectrofotometricamente a 593 nm. O método é calibrado com concentrações conhecidas de soluções de Fe2+. A absorbância maior significa um estado antioxidante maior.
Para o ensaio FRAP um reagente de trabalho foi preparado a partir dos seguintes componentes: Solução tampão de acetato: 3,1 g de CH3C00Na.3H20 e 16 ml de CH3COOH conc. em aprox. 800 ml de água.
Verificar que o pH seja 3,6. De outra forma, ajustar com NaOH /CH3COOH. Adicionar água até 1 litro.
Solução TPTZ: 10 mmoles/litro de 2,4,6-tri(2-piridil)-S-triazina (TPTZ) em 40 mmoles/litro de HC1 Solução de Fe (III): 20 mM de Fe(III)Cl3.6H20.
Reagente de trabalho (preparado diariamente): 50 ml de solução tampão de acetato + 5,0 ml de solução de TPTZ + 5,0 ml de solução de Fé (III) O ensaio foi executado adicionando-se uma amostra de 50 μΐ/padrão/branco a 1,5 ml de um reagente de trabalho em 2 ml de frascos eppendorf negros, seguido pela incubação em um termo-misturador a 37°C durante 30 minutos. As amostras consistiram de maltobionato em concentrações diferentes, os padrão contêm Fe2+ e ácido ascórbico, e as soluções inócuas eram amostras de água. O ensaio foi executado em triplicata. A absorbância foi lida imediatamente a 593 nm, quanto maior a absorbância maior será o estado antioxidante (|Abs —» antioxidante f). Os resultados são apresentados na tabela 1.
Tabela 1: Maltobionato de sódio emFRAP (g/litro) Abs a 593 nm O maltobionato mostra uma capacidade de antioxidativa em termos de redução de Fe(III) e portanto criando uma alteração na absorbância devido ao complexo ferro-tripiridiltriazina. O ensaio mostrou um efeito claro de resposta à dose do antioxidante.
Exemplo 3 Efeito antioxidante da carboidrato oxidase e/ou catalase no mosto de cerveja O mosto de cerveja foi produzido de 50 g de malte de cevada bem modificado em 250 g de água a 53°C. O malte de cevada foi transformado em pasta utilizando um perfil de temperatura que consistia de 30 minutos a 52°C, aumento de l°C/minuto durante 11 minutos, 63°C durante 30 minutos, aumento de l°C/minuto durante 9 minutos,72°C durante 30 minutos, aumento de l°C/minuto durante 6 minutos, 78°C durante 15 minutos, seguido por resfriamento a 20°C.
Foi feita uma série de experiências com a adição de carboidrato oxidase e/ou catalase no mosto e comparada com uma amostra de controle. As enzimas foram adicionadas antes da etapa de produção da pasta. A carboidrato oxidase foi dosada de acordo com a atividade medida como LOXU onde um LOXU corresponde a 1 mg de proteína de enzima. A catalase foi dosada de acordo com a atividade medida como CIU. Uma CIU é a quantidade de enzima que decompõe um pmol de H2O2 por minuto em um pH = 7,0 e T = 25°C.
Para medir a capacidade antioxidante da carboidrato oxidase e/ou catalase, foi adicionado 1 mM de Fe2+ em todas as amostras. A oxidação foi medida indiretamente utilizando-se um ensaio de complexo de xilenol laranja (ensaio XO). Deste ensaio, os hidroperóxidos no mosto oxidaram o Fe2+ no complexo de xileno laranja a Fe3+ que forma um complexo colorido com xileno laranja. O complexo oxidado pode ser medido espectrofotometricamente, quanto menor for a absorbância maior será o estado antioxidante (| Abs —» antioxidante f). O reagente de trabalho XO foi preparado a partir dos seguintes componentes: A: 2,5 mM de hexaidrato de sulfato ferroso de amônio,l,0 mM de sal de xileno laranja tetrasódico (XO) em 1250 mM de H2SO4 B: 4,89 mM de hidroxitolueno butilado (BHT) em metanol.
Reagente de trabalho XO: Misturar uma parte de A com 9 partes de B. Estável durante um mês em geladeira se mantido em garrafa preta. O ensaio foi iniciado pela adição de 100 μΐ de amostra em 900 μΐ de um reagente de trabalho XO. A incubação foi feita na temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação. Cada amostra foi centrifugada a 14.000 rpm a 20°C. durante dez minutos. A absorção do sobrenadante foi medida espectrofotometricamente a 560 nm. A absorbância aumentou em todas as amostras devido ao aumento do complexo colorido XO com o Fe2+ oxidado em Fe3+. As amostras de mosto com 50 LOXU evitam a formação de oxidação, em comparação com o controle (abs = 0,410 controle e 0,257 para o 50LOXU). O efeito é pobre em meia dosagem de 25 LOXU (abs = 0,421), no entanto melhorou pela combinação de 600 CIU de catalase (abs = 0,308). 1200 CIU de catalase também evitam a formação do complexo colorido (abs = 0,264) e o efeito é dependente da dosagem porque 600 CIU são dificilmente diferentes (abs = 0,439) do controle.
REIVINDICAÇÕES

Claims (9)

1. Processo para produzir maltobionato» caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) obtenção de um substrato contendo mal tose aplicável em um processo de produção de alimentos ou rações; e b) conversão da maltose em maltobionato através de uma reação enzimática, em que o maltobionato é formado durante um sub-processo em uma produção de cerveja.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da reação enzimática na etapa b) da reivindicação 1 ser catalisada por uma oxidorredutase.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato da oxidorredutase ser uma carboidralo oxidase.
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato da carboidrato oxidase ser escolhida de hexose oxidase, celobiose oxidase, aldose oxidase e piranose oxidase,
5. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato da carboidrato oxidase ser obtida de Microdochium nivale depositado com a CBS 100236.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato da catalase ser adicionada no processo.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo falo da catalase ser adicionada na reação enzimática da etapa b) da reivindicação 1.
8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do sub-processo ser o processo de preparação de pasta.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato da etapa b) da reivindicação 1 ser mantida em um nível estável de pH através da adição de uma base durante o processo.
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