JP3145711B2 - 固定化グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの存在下における，グリコール酸の酸化によるグリオキシル酸の製造 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 1.発明の分野： 本発明は、グリコール酸の酵素触媒酸化による、グリ
オキシル酸の製造の改良された方法に関する。より具体
的には、本発明は、触媒としての、一種類の不溶性の担
体上に固定化されたグリコレートオキシダーゼ及びカタ
ラーゼの使用に関する。

2.関連技術分野の説明： 葉の多い緑色植物及び哺乳類の細胞中に一般的に認め
られる酵素の一種であるグリコレートオキシダーゼは、
過酸化水素を同時に製造しながら、グリコール酸のグリ
オキシル酸への酸化の触媒作用をもたらす。N.E.Tolber
t等はJ.Biol.Chem.,Vol.181,905−914（1949）におい
て、中間的にグリオキシル酸を生成することによる、グ
リコール酸のギ酸及びCO₂への酸化の触媒作用をもたら
す、タバコの葉から抽出された酵素につき最初に報告し
た。エチレンジアミンのようなある種の化合物の添加は
前記中間体のグリオキシル酸の更なる酸化を抑制した。
前記酸化はpHが約８で、具体的には約３−40mM（ミリモ
ル）の濃度のグリコール酸を使用して実施された。この
グリコレートの酸化に最適なpHは8.9であると報告され
た。シュウ酸（100mM）はグリコレートオキシダーゼの
触媒作用を阻害すると報告された。同様にK.E.Richards
on及びN.E.TolbertはJ.Biol.Chem.,Vol.236,1280−1284
（1961）において、グリコール酸のグリコレートオキシ
ダーゼ触媒による酸化において、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン含有の緩衝液はシュウ酸の生成を阻
害することを示した。C.O.Clagett、N.E.Tolbert及びR.
H.BurrisはJ.Biol.Chem.,Vol.178,977−987（1949）に
おいてグリコール酸のグリコレートオキシダーゼ触媒に
よる、酸素による酸化に対して最適なpHは約7.8−8.6で
あり、そして最適な温度は35℃−40℃であると報告し
た。I.Zelitch及びS.OchoaはJ.Biol.Chem.,Vol.201,707
−718（1953）において、そしてJ.C.Robinson等はJ.Bio
l.Chem.,Vol.237,2001−2009（1962）において、ホウレ
ンソウのグリコレートオキシダーゼにより触媒作用を受
けるグリコール酸の酸化における、ギ酸及びCO₂の生成
は、H₂O₂とグリオキシル酸との非酵素的な反応によりも
たらされると報告した。彼らはH₂O₂の分解に触媒作用を
もたらす酵素の一種のカタラーゼを添加すると、ギ酸及
びCO₂の生成を抑制することによってグリオキシル酸の
収率を著しく改善する事を認めた。FMN（フラビンモノ
ヌクレオチド）の添加も又グリコレートオキシダーゼの
安定性を著しく増加させることも認められた。

N.A.Frigerio及びH.A.HarburyはJ.Biol.Chem.,Vol.23
1,135−157（1958）において、ホウレンソウから単離し
たグリコール酸オキシダーゼの製法及び性状につき報告
した。前記の精製酵素は溶液中では非常に不安定である
ことが発見された；この不安定性は、この酵素の活性部
位に対するフラビンモノヌクレオチド（FMN）の比較的
弱い結合、並びに、酵素学的に活性な前記酵素の四量体
及び／又は八量体が、不可逆的に凝集しそして沈澱する
酵素学的に不活性な単量体及び二量体に解離することが
原因とされた。前記酵素の溶液へのFMN（フラビンモノ
ヌクレオチド）の添加はその安定性を著しく増加させ、
そして高いタンパク質濃度又は高いイオン強度がその酵
素を八量体もしくは四量体として保持した。

グリコール酸オキシダーゼの触媒作用によるグリコー
ル酸の酸化については他に幾多の参考文献がある，例え
ば： 前記酵素の単離（通常、アッセイ法を含む）： I.ZelitchによるMethods of Enzymology.Vol.1,Acade
mic Press,New York,1955.p.528−532におけるホウレン
ソウ及びタバコの葉からの酵素。

M.Nishimura等によるArch.Biochem.Biophys.,Vol.22
2,397−402（1983）におけるカボチャの子葉からの酵
素。

H.Asker及びD.Daviesによる、Biochim.Biophys.Acta,
Vol.761,103−108（1983）におけるラットの肝臓からの
酵素。

M.J.Emes及びK.H.Erismannによる、Int.J.Biochem.,V
ol.16,1373−1378（1984）におけるレムナミノールＬ
（Lemna Minor L）からの酵素。

前記酵素の構造： E.Cederlund等、Eur.J.Biochem.,Vol.173,523−530
（1988）。

Y.Lindquist及びC.Branden、J.Biol.Chem.Vol.264,36
24−3628（1989）。

発明の要約 本発明は、一種類の不溶性の担体上に固定化されたグ
リコレートオキシダーゼ（（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オ
キシダーゼ、EC1.1.3.15）及びカタラーゼ（EC1.11.1.
6）から成る一種類の触媒の存在下で、グリコール酸（H
OCH₂COOH）（200から約2500mM）と酸素を水溶液（pH7か
ら10）中で反応させる、グリオキシル酸（OCHCOOH）の
製造方法に関する。最適な条件下ではグリコール酸の高
率の転化により非常に高収率でグリオキシル酸が得ら
れ、そして前記固定化酵素触媒は回収され再利用するこ
とができる。

発明の詳細な記述 本発明はグリコール酸（ヒドロキシ酢酸）からのグリ
オキシル酸の製造のための、固定化酵素触媒の製造及び
使用につき記載する。グリコール酸と酸素の、酵素によ
る触媒反応は何年も以前から知られていたが、グリオキ
シル酸への高い選択性（¢99％）はこれまで得られてお
らず、又グリコール酸の酸化は0.20Mから2.5Mの濃度で
は実施されていない。以前の、共通して譲渡された出願
で、1989年10月16日出願の米国特許第07/422,011号明細
書の「グリコール酸からのグリオキシル酸の製造」に
は、酸素、アミン緩衝液、及び可溶性酵素のグリコレー
トオキシダーゼ及びカタラーゼの存在下での、グリコー
ル酸のグリオキシル酸への酵素による転化方法について
記載されている。この方法は、カタラーゼ（副生成物の
過酸化水素を分解するため）及び生成されるグリオキシ
ル酸と付加化合物を形成することができるアミン緩衝剤
（それ以上の酸化を制限する）の両者を使用することの
予想外の相乗効果を示し、そしてその方法はそのような
目的で、引用することにより本明細書の内容とされる。
カタラーゼもしくはアミン緩衝剤の別個の添加によって
は、両者の併存時に認められた高い選択性は認められ
ず、そして得られたグリオキシル酸のほとんど定量的な
収率は、カタラーゼ又はアミン緩衝液の単独の使用の単
純な加算効果から期待される量以上のものであった。本
発明は、この方法に固定化された酵素触媒が提供される
点において、前記の方法の改良法と見なされる。

以前に報告された、触媒としての可溶性酵素の使用は
幾つかの問題を提出する：すなわち再利用のための触媒
の回収の実施が容易ではなく、触媒の安定性が固定化酵
素により得られるもの程良好でなく、そして可溶性酵素
は酸素の反応混合物への散布（酸素の溶解率及びそれに
より反応速度を増加するために必要）に対して安定でな
い。今日、二種類の酵素；すなわち、グリコレートオキ
シダーゼ（例えば、ホウレンソウもしくはビートの葉か
ら、単離又は市販源から得られる）及びカタラーゼ（例
えば、アスペルギルス・ニガー［Aspergillus nige
r］、アスペルギルス・ニジュランス［Aspergillus nid
ulans］、サッカロマイセス・セレビシエ［Saccharomyc
es cerevisae］（Bayker's yeast社）、あるいは牛の肝
臓、単離又は市販源から得られる）を、一種類の固体の
担体（例えば、市販のオキシランアクリルビーズ）上に
同時に固定化することを含む、触媒の製造方法が開発さ
れた。前記の方法において、この固定化酵素触媒の使用
により幾つかの利点が提唱される：すなわち １）この固定化酵素は反応終結時に再利用のために反応
混合物から容易に回収されるが、一方可溶性酵素は回収
が非常に困難で活性を喪失する； ２）この固定化触媒は、反応終結時又は水性緩衝液中に
長期間保存後に回復される酵素活性についてと同様に、
可溶性酵素に対して得られる触媒代謝回転数について
も、可溶性酵素よりも安定であり；そして ３）最も重要なことであるが、この固定化触媒は、酸素
の溶解速度及び反応速度を増加させるために、反応混合
物中に酸素を散布する反応条件に対して安定であり、一
方同様の反応条件下で、可溶性グリコレートオキシダー
ゼは急速に分解する。

ある特定の酵素に対して、その固定化が成功すること
を期待して一つの固定化法を選択することはできない。
更に、１種類を越える酵素の共固定化の成功の期待は一
層予知が困難である。一般的に当業者にとって、ある１
種類の酵素の有効な固定化は、多種多様の方法のスクリ
ーニング、及び試行錯誤により得られた最適な結果によ
り発見されねばならないことが認められている。グリコ
レートオキシダーゼの場合には、固定化の試みについて
の報告はない。酵素の固定化は下記を含む多種多様の方
法を用いて実施することができる：すなわち（１）共有
結合、物理的吸着、静電気結合、又は親和力結合によ
る、酵素の、キャリア（carrier）もしくは担体（suppo
rt）への結合、（２）二官能性のもしくは多官能性の試
薬との架橋、（３）ゲルマトリックス、ポリマー、エマ
ルション、もしくはある種の形態の膜中への取り込み、
及び（４）これらの方法のいずれかとの組み合わせであ
る。酵素固定化の多くのこれらの方法の詳細な説明、及
び固定化の方法の選択に影響を与える幾多の因子は、Mt
hodsin Enzymology,K.Mosbach（ed.）,Academic Press,
New Yorkの下記の巻にまとめられている：すなわちVol.
44（1976）、Vol.135（1987）、Vol.136（1987）、Vol.
137（1988）、及びそれらの参考文献である。

グリコレートオキシダーゼの固定化の多種多様の方法
が試験され、そしてこれらの幾つかの方法の最適な結果
を実施例中に記載する。オキシランアクリルビーズ（Eu
pergit C）への共有結合、臭化シアン活性化アガロー
ス、及びトリエチレンテトラミン（PAN−500）と架橋し
たポリ（アクリルアミド−co−Ｎ−アクリルオキシスク
シンイミド）ゲルへの、このタンパク質の共有結合は、
樹脂のXAD−８及びフェニルアガロースへの物理的吸着
と同様に、活性な固定化酵素を生成した。このタンパク
質とグルタルアルデヒド、ジメチルアジピミダート、ジ
メチルスベリミダート、もしくは1,4−ブタンジオール
ジグリシジルエーテルとの架橋結合の試みと同様に、種
々の担体へのイオン結合は不成功であった。活性な固定
化グリコレートオキシダーゼの異なった形態のうち、オ
キシランアクリルビーズ−酵素のみがグリコール酸の酸
化に対する触媒として有用であった。物理的に吸着され
た酵素はpH9.0で0.75Mのグリコール酸及び0.79Mのエチ
レンジアミンを含有する反応混合物中で、担体から早急
に脱離し、一方臭化シアン活性化アガロースはエチレン
ジアミンと反応して共有結合した酵素を反応混合物中に
再度放出した。PAN−500ゲルに結合した酵素の比活性は
余りにも低いので反応における実際的な触媒としては有
用でなかった。

オキシランアクリルビーズのEupergit C及びEupergit
C−250L（Rohm Pharma社）へのグリコレートオキシダ
ーゼの固定化は、その反応条件に対して安定で、そして
この使用目的に有用な十分に高い比活性（酵素活性単位
／触媒１グラム）を有する触媒をもたらした。カタラー
ゼも又オキシランアクリルビーズ上に固定化され、そし
て二種の別個の触媒を一緒に使用するか、あるいは両方
の酵素を同じ担体上に共固定化してからこの単一の触媒
を反応混合物中に添加した（後者の方法が好適であ
る）。

前記固定化酵素触媒を使用することにより、可溶性酵
素の多くの欠点が排除された。水性緩衝液中での固定化
グリコレートオキシダーゼの安定性は可溶性酵素よりも
ずっと大きい（硫酸アンモニウム沈澱酵素の安定性に近
い）。共固定化触媒の回収及び再利用は、その反応混合
物から触媒を単に濾取し、そしてそれを新規の反応混合
物に再利用することにより容易に実施することができ
る；この方法で固定化グリコレートオキシダーゼに対す
る代謝回転数（すなわち、酵素の不活性化前の触媒分子
１モル当たりの、生成物分子に転化される基質分子の
数）は10⁷（モル／モル）の高い値が得られた。最後
に、酵素触媒の性状を変化させずに反応混合物中に酸素
を吹き込むことが可能なために反応速度を少なくとも10
倍増加させ、そしてこの速度増加は本方法の製造経費を
著しく軽減する。

反応中に使用される固定化グリコレートオキシダーゼ
は有効な濃度で、通常は約0.001から約10.0IU/mL、好適
には約0.1から約4IU/mLの濃度で存在しなければならな
い。IU（国際単位）とは１分間に１マイクロモルの基質
の変換の触媒作用をする酵素の量と定義される。この酵
素のアッセイ法はI.Zelitch及びS.OchoaによるJ.Biol.C
hem.,Vol.201,707−718（1953）に認められる。この方
法は又、回収又は再利用されたグリコレートオキシダー
ゼの活性のアッセイにも使用される。

反応溶液のpHは７と10の間、好適には8.0と9.5の間に
なければならない。酵素活性はpHにより変化するので、
pHは緩衝液により保持することができる。反応のpHは反
応が進行するに従って僅かに減少するので、酵素活性が
最大であるpH領域の最高端の近く、約9.0−9.5で反応を
開始し、そして反応の経過中に低下させることは多くの
場合有用である。1989年10月16日出願の米国特許出願第
07/422,011号明細書に以前に記載されたように、生成物
の選択性を最大にするために、グリオキシル酸と複合体
を生成することができる（化学的もしくは酵素による酸
化に対してより安定なイミンを生成することにより）ア
ミン緩衝液が、カタラーゼと共に使用される。エチレン
ジアミン、あるいはそれほど好適ではないが、トリス
（ヒドロキシメチル）メチルアミン（以後TRISと称す
る）、ピペラジン、又はグリシルグリシンはグリオキシ
ル酸の収率を改善した。これらのアミン類はアミン／グ
リコール類のモル比（出発量）が1.0から3.0で、好適に
は1.05から1.33で使用される。この範囲内で正確な値に
調整して希望のpHを得ることができる。グリコール酸に
対するアミンの高い比率で使用される、非常に塩基性の
強いアミンについては、例えば塩酸又は硫酸のような酸
を添加すること等により、pHを調節することが必要であ
ろう。TRISのようなそれほど塩基性の強くないアミンの
場合には、希望のpHを維持するために塩基を添加するこ
とが必要かも知れない。

固定化カタラーゼの濃度は50から100,000IU/mL,好適
には、350から14,000IU/mLでなければならない。それら
の酵素は、その反応に添加する触媒の量を抑制するため
に共固定化し、そしてカタラーゼとグリコレートオキシ
ダーゼの濃度を、カタラーゼ：グリコレートオキシダー
ゼの比率（それぞれIUで測定された）が少なくとも約25
0:1となるような前述の範囲内に調整することが好適で
ある。フラビンモノヌクレオチド（FMN）は、0.0から2.
0mMの濃度で、好適には0.01から0.2mMの濃度で使用され
る、任意の添加成分である。

反応速度は、酸素が水性溶媒に溶解することができる
速度により、少なくとも部分的に制御される。酸素は大
気中の酸素として反応に添加することができるが、比較
的純粋な形態の酸素を使用し、そして高圧を使用するこ
とが好適である。酸素圧の上限は知られていないが、50
気圧までの酸素圧は使用可能であり、そして15気圧の上
限が好適である。酸素の高い溶解速度（及びそれによ
り、高い反応速度）を維持するために、反応混合物中に
酸素を散布する（吹き込む）ことが必要である。酸素は
１分間に、反応混合物の体積当たり0.05から５容量（容
量／容量・分）の、好適には0.2と２容量／容量・分の
間の酸素量（大気圧下で測定）の速度で反応混合物中に
吹き込まれる。更に、かきまぜのような便利な撹拌の形
態が有用である。

反応温度は、それが反応速度及び酵素類の安定性に影
響を与えるので重要な可変因子である。０℃から40℃の
反応温度を使用することができるが、好適な反応温度範
囲は５℃から15℃である。好適な温度範囲で処理する
と、反応の終結時に回収される酵素活性が最大となる。

反応を終結し、酵素触媒を濾過又は遠心分離により除
去する際、アミン緩衝液はイオン交換樹脂の使用により
除去すると最も便利ある。適切な酸性の陽イオン交換樹
脂には「AMBERLITE」CG120又は「AMBERLITE」IR120（Ro
hm＆Haas社）、及び「DOWEX」50（Dow Chemical社）が
含まれる。次いでそのアミンは回収され、そして更にそ
の樹脂を強塩基で処理することにより再利用することが
出来る。

生成物のグリオキシル酸は、イオン交換樹脂中に、そ
して医薬品工業における酸触媒として（Ullmanns社）使
用されると共に、バニリン及びエチルバニリンの製造に
おいて有用である。それは通常50％（重量パーセント）
水溶液として販売されている。本出願明細書におけるグ
リオキシル酸への言及は、特にグリオキシル酸が、pHが
約2.3より大きい溶液中に存在する再にはグリオキシラ
ートの陰イオンをも意味する可能性があることも又理解
して頂きたい。

ホウレンソウの葉から抽出したグリコレートオキシダー
ゼの精製 ホウレンソウから抽出したグリコレートオキシダーゼ
は硫酸アンモニウムによる選択的分別、及びそれに続く
DEAEセルロースを使用する、抽出物のバッチ吸着を使用
して精製した。後者の方法によりグリコレートオキシダ
ーゼを除く、実質的にすべての植物タンパク質の吸着が
もたらされた。精製のすべての段階は、特記されない場
合は４℃で実施した。25℃で、新鮮なホウレンソウ２ブ
ッシェル（16kg）を、0.5インチの網目スクリーンのつ
いたフィッツミル粉砕機（Fitz Mill grinder）を用い
て微細片に截断した。生成するパルプの流体部分（約6
L）を４枚のチーズクロスでしぼることにより単離し
た；代替法として、ジュース絞り器（Vitantonio社）を
使用することができる。前記流体部分にジチオトレイト
ール5.6g（最終濃度5mM）を添加し、次いで20％酢酸を
５−20mL添加することによりpHを5.2に調整した。10分
間温置後、GS−３ローター（Sorvall社）を用いて４℃
で25分間13,000gで生成混合物を遠心分離した。そのペ
レット部分は廃棄し、そして6Nの水酸化カリウム15−20
mLを用いて上澄み液のpHを7.5−8.0に調整した（Zelitc
h,I.,Ochoa,S.,J.Biol.Chem.,Vol.201,707（1953）;Fri
gerio,N.A.,Harbury,H.A.,J.Biol.Chem.,Vol.231,135
（1958））。次いで、100,000MWの膜カセットを備えた
ペリコン（Pelicon）（Millipore社）限外濾過器を用い
て、上澄み液（約5.5L）を５倍に濃縮した；濃厚液の最
終容量はおよそ1.1Lであった。次いで10分間に渡りゆっ
くりとその濃厚液に固体硫酸アンモニウム（154g）を添
加した。すべての硫酸アンモニウムを溶解した後、生成
する沈澱物を13,000gで25分間遠心分離することにより
除去した。そのペレット部分を廃棄し、そして硫酸アン
モニウム77gを上澄み液（約1.1L）に添加し、次いで前
述のように遠心分離した。生成したタンパク質ペレット
を回収し、上澄み液を廃棄した（Zelitch（1953）;Frig
erio（1958））。

前記タンパク質のペレットを20mMのビシン（bicine）
緩衝液（pH8.0）約200mLに溶解した。スペクトロポル
（Spectropor）２透析管（12,000−14,000MWCO）を用い
て、2mMのFMN含有の20mMビシン緩衝液（pH8.0）4Lに対
して、前記タンパク質を16時間透析した。伝導度メータ
ーを用いて、新鮮なビシン緩衝液の伝導度と比較して前
記タンパク質溶液の伝導度を測定し、そしてもしその読
み取り値が同じでない場合はそのタンパク質溶液を更に
４時間透析し、次いで前と同様にテストした。透析した
タンパク質溶液（約250ml）はマグネチック撹拌棒もし
くは頭上撹拌機を用いてビーカー内で撹拌し、次いで前
以て膨潤させたDEAEセルロース（（Sigma社）25g（Ker
r,M.W.,Groves,D.,Phytochemistry,Vol.14,359−362（1
975））を添加しそして生成した混合物を10分間温置し
た。樹脂へのタンパク質の結合は、ブラッドフォード
（Bradford）アッセイ（Bio−Rad社）を用いて、溶液の
タンパク質濃度の減少を追跡することにより監視した。
上澄み液のタンパク質濃度が痕跡レベル（0.2mg/mL）に
減少した時に、直径13cmのブックナー（Buchner）漏斗
（Cole−Parmer社）中の11cmのホワットマン（Whatma
n）＃１濾板を通した真空濾過により、非結合タンパク
質を混合物から回収した。酵素の回収を最大にするため
に、樹脂ケークを20mMのビシン緩衝液（pH8.0）100mLで
洗浄した。前記タンパク質溶液にフラビンモノヌクレオ
チド（FMN、Sigma社）を2mMの最終濃度になるまで添加
し、次いで5Nの水酸化カリウムを滴加してpHを8.0に保
ちながら、その酵素溶液（約400mL）に固体硫酸アンモ
ニウム240gを、撹拌しつつ15分に渡り徐々に添加した。
生成した沈澱グリコレートオキシダーゼは必要な時まで
４℃の暗所に保存した。

新鮮なパン酵母（Bakers Yeast）から抽出したカタラー
ゼの精製 すべての精製段階は４℃で実施された。新鮮なパン酵
母（11b.,Universal Food−Red Star社）を、フェニル
メチルスルホニルフルオリド（PMSF、Sigma社）1mM含有
の20mMトリス（Tris）緩衝液（pH7.5）450mL中に懸濁さ
せた。前記酵母懸濁液の200mLを、ガラスの小粒（直径
0.5mm−Biospec Products社）200mLを含有する400mL容
量のビーズビーター（Bead Beater）ブレンダーに移
し、そして５分間の継続的な混合の後に、その溶解物を
受容器（氷上）に移した。残りの酵母懸濁液を同様に処
理した。

GS−３ローター（Sorvall社）中で13,000gで45分−１
時間、４℃でその抽出物を遠心分離することにより細胞
片を除去した。上澄み液（400mL）を収集し、その溶液
に固体硫酸アンモニウム90.4gを溶解して40％飽和液に
し、次いで氷上で10分間温置後、その懸濁液をGSAロー
ター（Sorvall社）中で13,000gで25分間４℃で遠心分離
した。ペレットは廃棄し、次いで上澄み液（400mL）に
固体硫酸アンモニウム48gを添加して最終的な60％飽和
液をもたらした（Seah,T.C.M.,Kaplan,J,G.J.Biol.Che
m.Vol.218,No.8,2880（1973））。この混合液を前述の
ように温置、遠心分離し、そして生成したタンパク質ペ
レットを20mMのTRIS（pH7.5）の最少量に溶解した。ス
ペクトロポール（Spectropor）２透析管を用いて、前記
タンパク質溶液を20mMのTRIS（pH7.5）で透析し；透析
緩衝液を16時間後に廃棄し、補充した。透析は更に４時
間継続し、次いで透析タンパク質（100mL）を回収し
た。

前記透析タンパク質の一部の50mLを、Ｑセファロース
（Sepharose）速流イオン交換樹脂（Pharmacia社）100m
Lを充填した輻流クロマトグラフィーカラム（Sepragen
社）に充填し、そして非結合タンパク質を20mMのTRIS
（pH7.5）で10mL/分で溶出した。タンパク質の溶出は、
チャート記録計（LKB社）に接続した280nmのフィルター
（LKB社）を備えたフローセルを用いて監視した;LKBの
画分回収器を用いて10−15mLのカラム画分を回収した。
すべての非結合タンパク質をカラムから溶出したら、20
mMのTRIS（pH7.5）に溶解した０−500mMからのNaCl 40
0mLの直線勾配（linear gradient）を10mL/分で開始
し、そして画分は240nmで過酸化物の消失を監視するこ
とによりカタラーゼ活性のアッセイを実施した。カタラ
ーゼ活性を有する画分を収集し、そして硫酸アンモニウ
ムを添加して最終濃度を80％飽和度にした。生成した沈
澱カタラーゼを４℃で保存した。

この精製法は又アスペルギルス・ニジュランス（Aspe
rgillus Nidulans）及びアスペルギルス・ニガー（Aspe
rgillus Niger）から抽出されるカタラーゼの精製にも
使用された。

オキシランアクリルビーズ上に固定されたグリコレート
オキシダーゼ及びカタラーゼの酵素アッセイ法 オキシランアクリルビーズ上に固定されたグリコレー
トオキシダーゼは、マグネチック撹拌棒の入った3mL入
り石英セル中に、処理ビーズ約５−10mgを正確に秤量す
ることによりアッセイし、次いで2,6−ジクロロフェノ
ールインドフェノール0.12mM及びTRIS緩衝液（pH8.3）8
0mM含有溶液2.0mLを添加した。前記セルをゴムの膜で蓋
をし、そして窒素を５分間吹き込むことにより溶液の酸
素を抜いた。次いで前記セルにシリンジにより1.0Mグリ
コール酸/1.0MのTRIS（pH8.3）40mLを添加し、そして60
5nm（ｅ＝22,000）で、時間による吸着の変化を測定し
ながらその混合物を撹拌した。

カタラーゼ活性はマグネチック撹拌棒が入った3mL用
石英セルに処理ビーズ約２−5mgを正確に秤量し、次い
で蒸留水2.0mL、及び50mMのリン酸緩衝液（pH7.0）中59
mMの過酸化水素含有溶液1.0mLを添加しそして240nM（ｅ
＝39.4）で時間に対する吸収の変化を測定することによ
りアッセイした。固定化グリコレートオキシダーゼ及び
カタラーゼの活性はそれぞれ典型的には6IU/ビーズ１グ
ラム及び6000IU/ビーズ１グラムであった。

グリコール酸、グリオキシル酸、シュウ酸、及びギ酸の
HPLC分析 分析用サンプルは、反応混合物0.100mLを0.1NのH₂SO₄
を0.300mLと混合し、次いで生成した溶液をミリポアウ
ルトラフリー（Millipore Ultrafree）MC濾過器（10,00
0mwカットオフ）により濾過することにより用意した。
グリコール酸、グリオキシル酸、シュウ酸及びギ酸の分
析は、溶媒としてH₂SO₄（0.01N）及び１−ヒドロキシエ
タン−1,1−ジホスホン酸（0.1mM）の水溶液を1.0mL/分
で使用することにより、40℃でBio−Rad Aminex HPX−8
7Hのカラム（300×7.8mm）を使用して高速液体クロマト
グラフィー（HPLC）により実施した。その機器は510型
のポンプ、712WISP自動試料採取器の付いたWaters840HP
LCシステム、並びに、それに続き490EのUV検出器及び41
0示差屈折計であった。UV分析は210nmで実施した。シュ
ウ酸、グリオキシル酸、グリコール酸、ギ酸、及びプロ
ピオン酸（内標準）の保持時間はそれぞれ4.29分、6.09
分、7.77分、8.79分、及び11.41分であった。

実施例１ 種々の担体に対するグリコレートオキシダーゼの固定化 ポリ（エチレンイミン）（PEI）、シリカゲル上のポ
リ（エチルエンイミン）、シリカゲル上のベンジル化ポ
リ（エチルエンイミン）、ビオレックス（Bio−Rex）7
0、CHセファローズ（Sepharose）4B、XAD−４、XAD−
８、フェニルアガローズ（Pheny1 Agarose）、ユーペル
ギット（Eupergit）Ｃ−250L、及びユーペルギット（Eu
pergit）Ｃ−30Nはすべて市販源から得られた。Pollac
k,A.等によりJ.Am.Chem.Soc.,1980,102,6324−6336に記
載された方法に従い、トリエチレンテトラミンと架橋し
たPAN−500（ポリ（アクリルアミド−co−Ｎ−アクリル
オキシスクシンイミド））ゲルを用意しそしてグリコレ
ートオキシダーゼを固定化するのに使用した。タンパク
質を物理的吸着により結合する担体については、その担
体を適宜pH5−10の水性緩衝液で洗浄し、次いで５℃も
しくは25℃で前以て決められた期間その担体を酵素の緩
衝液に浸け、次いでその担体を新鮮な緩衝液で３−４回
洗浄して未吸着の酵素を除去し、そしてその担体のグリ
コレートオキシダーゼ活性を測定することにより固定化
を実施した。グルタルアルデヒドとともに使用される担
体については、酵素の添加の前に担体を５％のグルタル
アルデヒド水溶液で処理したことを除いて前述で概説し
た方法を繰り返した。Eupergit上へのグリコレートオキ
シダーゼの固定化の詳細な方法は実施例２に示す。下表
に挙げる固定化グリコレートオキシダーゼの収率は、固
定化の条件を各担体にとって最適化することにより得ら
れ、そして各方法の経過中に添加された酵素活性の総量
を基にしている。

実施例２ グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼのユーペルギ
ット（Eupergit）Ｃへの共固定化 125mL用三角フラスコ中にオキシランアクリルビーズ
（Eupergit C）10.0gを秤量した。次いでそのフラスコ
に50mMのビシン緩衝液（pH8.0）及び0.02mMのフラビン
モノヌクレオチドを含有する溶液約75mLを添加し、そし
て次いでオキシランアクリルビーズをフラスコの内容物
を渦状に撹拌しながら緩衝液中に懸濁させた。ビーズが
フラスコの底部に落ち着いた後、沈んだビーズを動かさ
ないように除去することができる、できるだけ多くの上
澄み液とともに、混合物の上部に浮いている微細物質を
ピペットで除去した。この洗浄方法を２回目も繰り返し
た。

327IUのグリコレートオキシダーゼ活性を含む（新鮮
なホウレンソウの葉から抽出された）硫酸アンモニウム
により沈殿させたグリコレートオキシダーゼ混合物100m
Lを20分間12,000rpmで（４℃で、Sorvall GSAロータ
ー）遠心分離した。上澄み液を廃棄し、ペレットを50mM
のビシン（pH8.0）、0.02mMのフラビンモノヌクレオチ
ド緩衝液50mLに溶解した。硫酸アンモニウムにより沈殿
させたアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）
カタラーゼ（Sigma C−3515）100mg（715,000IU）を含
有する混合物10mLを10分間15,000rpmで（Sorvall SS−3
4ローター）遠心分離した。上澄み液を廃棄しそしてそ
のペレットをグリコレートオキシダーゼを含有する緩衝
液に溶解した。次いでこの酵素溶液を、洗浄したオキシ
ランアクリルビーズを含有するフラスコに添加し、そし
て更に緩衝液を添加することにより最終容量を125mLに
調整した。生成した混合物は250mL用ポリプロピレンの
びんに移し、そのびんは蓋をして15℃で16時間４−5rpm
でびんローラー上に置いた。次いでその混合物をガラス
層保持体を入れたクロマトグラフィーカラムに注入し、
排水させ、そしてその固定化酵素をビシン/FMN緩衝液30
mLで３回洗浄し、この同じ緩衝液中に５℃で保存した。
この共固定化酵素触媒はグリコレートオキシダーゼ活性
7.2IU/Eupergit C1グラム及びカタラーゼ活性5680IU/Eu
pergit C1グラムを有した。

実施例３ 可溶性グリコレートオキシダーゼ及び固定化グリコレー
トオキシダーゼの相対的な安定性 オキシランアクリルビーズ（Eupergit C）上に固定化
されたグリコレートオキシダーゼに対する、固定化され
ていない（可溶性）グリコレートオキシダーゼの安定性
は、2.0mMのフラビンモノムクレオチドを含有する緩衝
液（pH8.0）中で４℃で両者の形態の酵素を保存し、次
いで時間に対する酵素活性を監視することにより測定し
た。更に、3.2Mの硫酸アンモニウム、2.0mMのフラビン
モノムクレオチド中に沈殿し、そして同様な条件下で保
存された酵素の安定性をも監視した。酵素回収率 １日 ２日 ３カ月 ６カ月 可溶性 50％ ０ ０ ０ 固定化 92％ 95％ 50％ 50％ 沈殿 100％ 100％ 95％ 85％ 実施例４ 酸素散布時の共固定化酵素の反応 20mmのポリエチレン層保持体を入れた2.5cmのID×20c
mのガラスカラム中にグリコール酸（0.25M）、エチレン
ジアミン（0.33M）、プロピオン酸（0.075M、HPLC内標
準）、及びフラビンモノムクレオチド（0.2mM）を含有
する溶液10mLを注入した。カラム及びその内容物を15℃
に冷却し、次いで2.5IUのホウレンソウのグリコレート
オキシダーゼ及び27,000IUのアスペルギルス・ニガー
（Aspergilus niger）のカタラーゼ（Eupergit Cの共固
定化）をその溶液に添加した。次いで、酸素を多孔性保
持体を通過させそして10mL/分の速度で反応混合物中に
泡状に通過させた。その反応は、定期的に反応混合物の
アリコート100mLを採取し、そのアリコートを0.1N硫酸3
00mLと混合して反応を終結させ、アリコートを濾過し、
そしてHPLCにより分析することにより監視した。5.5時
間後のグリオキシル酸、シュウ酸、及びギ酸の収率はそ
れぞれ98％、２％、及び０％であり、グリコール酸は完
全な転化を示した。グリコレートオキシダーゼ及びカタ
ラーゼの最終的活性はそれらの初期値の95％及び65％で
あった。

比較例１ 酸素散布時の可溶性酵素の反応 同量の、可溶性の、非固定化グリコレートオキシダー
ゼ及びカタラーゼを反応混合物に添加したことを除い
て、実施例４に記載の反応を繰り返した。４時間後のグ
リオキシル酸、シュウ酸、及びギ酸の収率はそれぞれ43
％、０％、及び０％であり、グリコール酸の転化率は46
％であった。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼ
の最終的活性はそれぞれそれらの初期値の_2％及び82％
であり、そしてより長時間後でもこれ以上の反応は認め
られなかった。

実施例５ 酸素散布時の別個に固定化された酵素の反応 グリコール酸（0.75M）、エチレンジアミン（0.86
M）、プロピオン酸（0.075M、HPLC内標準）、フラビン
モノヌクレオチド（0.2mM）、Eupergit C上に固定化し
たホウレンソウのグリコレートオキシダーゼ2.5IU及びE
upergit C上に固定化されたアスペルギルス・ニガー（A
spergillus niger）のカタラーゼ14,000IU（２種類の酵
素は同じ担体に共固定化されていない）を含有する溶液
10mLを用いて実施例４の反応を繰り返した。20時間後の
グリオキシル酸、シュウ酸、及びギ酸の収率はそれぞれ
99％、0.2％、及び0.5％であり、グリコール酸の転化率
は100％であった。グリコレートオキシダーゼ及びカタ
ラーゼの最終的活性はそれぞれ初期値の72％及び66％で
あった。

実施例６ 固定層を使用する共固定化酵素の反応器 コンテスエアリフトバイオリアクター（Kontes Airli
ft Bioreactor）の中に0.75Mのグリコール酸、0.86Mの
エチレンジアミン、0.075Mのプロピオン酸（HPLC内標
準）、及び0.01mMのフラビンモノヌクレオチド（pH9.
0）含有の溶液400mLを注入した。湿った酸素の気泡をバ
イオリアクター中の溶液に通過させ、そして蠕動ポンプ
を使用してその酸素添加溶液を、バイオリアクターか
ら、Eupergit Cのオキシランアクリルビーズ上に共固定
化されたホウレンソウのグリコレートオキシダーゼ（1
3.9IU）及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus nig
er）のカタラーゼ（56,000IU）を含有する、被覆された
1cmID×30cmのクロマトグラフィーカラム（21mLの固定
層容量）を通して再循環させた。バイオリアクター及び
被覆されたクロマトグラフィーカラムの内容物は、10℃
の冷蔵浴／循環器セットを用いてリアクター及びカラム
のジャケットに50:50エチレングリコール／水を再循環
させることにより15℃に維持した。377時間後のグリオ
キシル酸、シュウ酸、及びギ酸の収率はそれぞれ93％、
０％、及び0.3％であり、グリコール酸は94％の転化率
を示した。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの
最終的活性はそれらの初期値の48％及び69％であった。

実施例７ 撹拌オートクレーブ反応器中で共固定化グリコレートオ
キシダーゼ／カタラーゼを用いたグリコール酸の酸化 300mL用EZEシール（Seal）の撹拌オートクレーブ（Au
toclave Engineers社）に、グリコール酸（0.75M）、エ
チレンジアミン（0.86M、pH9.0）、プロピオン酸（0.07
5M、HPLC内標準）、及びフラビンモノヌクレオチド（0.
01mM）を含有する溶液100mLを充填し、そしてその溶液
を15℃に冷却した。次いでそのオートクレーブに約28g
のEupergit Cに共固定化された89IUのホウレンソウのグ
リコレートオキシダーゼ及び72,600IUのアスペルギルス
・ニガー（Aspergillus niger）のカタラーゼを添加し
た。生成混合物を、100mL/分でその混合物中に酸素の気
泡を通気しながら、70psig（483kPa）の酸素下で15℃で
500rpmで撹拌した。反応は、定期的に反応混合物を100u
Lのアリコートを採取して、そのアリコートを0.1Nの硫
酸300mLと混合して反応を終結させ、そのアリコートを
濾過しそしてHPLCにより分析することにより監視した。
３時間後のグリオキシル酸、シュウ酸、及びギ酸の収率
はそれぞれ100％、０％及び０％であり、グリコール酸
は完全な転化率を示した。グリコレートオキシダーゼ及
びカタラーゼの最終的活性はそれらの初期値の100％及
び100％であった。

実施例８ 撹拌オートクレーブ反応器中での共固定化グリコレート
オキシダーゼ／カタラーゼの回収及び再利用 固定化酵素触媒は、反応混合物を、20mmのポリエチレ
ン層保持体を入れた2.5cmID×20cmのガラスカラムを通
して濾過することにより、実施例７に記載の反応から回
収した。その触媒に吸着された残りの流体は、カラムに
窒素を短時間通すことにより除去し、次いでその触媒は
グリコール酸（0.75M）、エチレンジアミン（0.86M）、
プロピオン酸（0.075M、HPLC内標準）、及びフラビンモ
ノヌクレオチド（0.01mM）を含有する新鮮な15℃の溶液
100mL中に再度懸濁させた。300mL用オートクレーブ反応
器に再度この反応混合物を充填し、そしてこの反応を繰
り返した。この触媒回収法は10回連続したバッチ反応で
実施し、そしてその反応時間、グリコレートオキシダー
ゼ（G.O.）及びカタラーゼ活性の回復率、並びにグリオ
キシル酸の収率は下表に示す。

実施例９ 撹拌オートクレーブ反応器中でのグリコール酸の、酵素
による、酸素散布による酸化の反応速度 300mL用EZE−シール（Seal）の撹拌オートクレーブ
（Autoclave Engineers社）にグリコール酸（0.75M）、
エチレンジアミン（0.86M、pH9.0）、プロピオン酸（0.
075M、HPLC内標準）、及びフラビンモノヌクレオチド
（0.01mM）含有溶液100mLを充填し、そしてその溶液を1
5℃に冷却した。次いでそのオートクレーブに約15gのEu
pergit Cに共固定化された41IUのホウレンソウのグリコ
レートオキシダーゼ及び42,800IUのアスペルギルス・ニ
ガー（Aspergilus niger）のカタラーゼを添加した。生
成混合物を、混合物中に酸素の気泡を50mL/分で通気し
ながら、35、70、105、又は140psig（242,483,724又は9
65kPa）の酸素下で15℃、400rpmで撹拌した。反応は、
定期的に反応混合物のアリコート100mLを採取し、その
アリコートを0.1Nの硫酸300mLと混合して反応を終結さ
せ、アリコートを濾過しそしてHPLCにより分析すること
により監視した。35、70、105、又は140psig（242,483,
724又は965kPa）の酸素下で実施された反応の速度はそ
れぞれグリコール酸の0.48、0.54、0.53、及び0.57mmol
/分であった。

比較例２ 撹拌オートクレーブ反応器中でのグリコール酸の、酸素
による、酸素非散布による酸化の反応速度 反応混合物中に酸素の気泡を通気しない点を除いて実
施例９における反応を撹拌オートクレーブ反応器中で繰
り返した。35、70、又は105psig（242、483、又は724kP
a）の酸素下で実施された反応の速度はそれぞれグリコ
ール酸の0.032、0.053、及び0.071mmol/分であった。

実施例10 固定化グリコレートオキシダーゼと浸透可能化されたベ
ーカーズイースト（Bakers Yeast）を用いてのグリコー
ル酸の酵素酸化 Eupergit C約15g上に固定化された50IUのホウレンソ
ウのグリコレートオキシダーゼ、及びイソプロパノール
により浸透可能化され、そして100,000IUのカタラーゼ
活性を有する新鮮なサッカロマイセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）（ベイカースイースト（Bake
rs yeast）、レッドスターブランド、Universal Foods
社）4.0gを触媒として使用した点を除いて、実施例７及
び実施例８に記載の方法を繰り返した。反応混合物は、
その混合物中に20mL/分で酸素気泡を通気しながら、70p
sig（483kPa）の酸素下で15℃、400rpmで撹拌した。６
回の連続バッチ反応を実施し、そして反応時間、グリコ
レートオキシダーゼ（G.O.）及びカタラーゼ活性の回復
率、並びにグリオキル酸の収率は下表に示す。

実施例11 酸素散布速度に対するグリコール酸の酸化速度の依存性 実施例７に記載の方法を、Eupergit C約18gに共固定
化された52IUのホウレンソウのグリコレートオキシダー
ゼ及び95,000IUのアスペルギルス・ニガー（Aspergillu
s niger）のカタラーゼを使用して繰り返した。反応混
合物は５−50mL/分でその混合物中に酸素を散布しなが
ら、70psig（483kPa）の酸素下で、15℃、500rpmで撹拌
した。異なった酸素散布量におけるグリコール酸の酸化
速度を下表に示す。

mLO₂/分 mmolO₂/分 mmolグリコール酸／分 5 0.40 0.22 10 0.57 0.45 15 0.70 0.67 20 0.79 0.89 25 0.78 1.11 30 0.99 1.34 50 1.10 2.23 実施例12 オートクレーブの撹拌速度に対するグリコール酸の酸化
速度の依存性 Eupergit C約15g上に共固定化された50IUのホウレン
ソウのグリコレートオキシダーゼ及び47,000IUのアスペ
ルギルス・ニガー（Aspergullus niger）のカタラーゼ
を使用して、実施例７に記載の方法を繰り返した。反応
混合物はその混合物に20mL/分で酸素を散布しながら、7
0psig（483kPa）の酸素下で15℃で100−500rpmで撹拌し
た。異なった撹拌速度でのグリコール酸の酸化速度は下
表に示す。

rpm グリコール酸mmol/分 100 0.08 200 0.15 300 0.22 400 0.43 500 0.45 実施例13 グリコレートオキシダーゼの濃度に対するグリコール酸
の酸化速度の依存性 実施例７に記載の方法は、Eupergit C上にそれぞれ共
固定化された80、60、40、又は20IUのホウレンソウのグ
リコレートオキシダーゼ及び1,400,000、1,000,000、7
0,000、又は35,000IUのアスペルギルス・ニガー（Asper
gullus niger）のカタラーゼを使用して繰り返した。反
応混合物をその混合物に20mL/分で酸素を散布しながら7
0psigの酸素下で15℃で400rpmで撹拌した。異なった濃
度のグリコレートオキシダーゼを使用して得られたグリ
コール酸の酸化速度は下表に示す。

以上のように、本発明をある程度の具体性をもって記
述しそして例示したが、下記の請求の範囲はそのように
限定されるべきでなく、請求の範囲の各項の言葉使い及
びそれらの同義語に相応した範囲を与えるべきである点
を認識して頂きたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ガバガン，ジヨン・エドワード アメリカ合衆国デラウエア州19810ウイ ルミントン・ドーバルロード2300 (56)参考文献 国際公開91／5868（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 7/40 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (15)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（１）不溶性の担体としてのオキシランア
   クリルビーズ上に固定されたグリコレートオキシダーゼ
   及びカタラーゼを含んでなる触媒、ならびに（２）グリ
   オキシル酸と付加化合物を形成することができるアミン
   緩衝剤の存在下のpHが７〜10で温度が０℃〜40℃の水溶
   液中でグリコール酸を酸素と接触させる工程を含み、こ
   こで、グリコール酸の初期濃度が200mM〜2500mMであ
   り、そしてグリコール酸に対するアミンの初期モル比が
   1.0〜3.0の範囲内にあり、かつ、前記接触後にグリオキ
   シル酸を回収する工程を含んでなるグリオキシル酸の製
   造方法。
2. 【請求項２】グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼ
   が同じ不溶性の担体上に共固定化される請求項１記載の
   方法。
3. 【請求項３】0.01〜10.0IU/mLの固定化グリコレートオ
   キシダーゼが存在する請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】50〜100,000IU/mLの固定化カタラーゼが存
   在する請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】酸素が１〜50気圧の圧力である請求項４記
   載の方法。
6. 【請求項６】0.1〜4IU/mLの固定化グリコレートオキシ
   ダーゼが存在する請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】350〜14,000IU/mLの固定化カタラーゼが存
   在する請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】温度が５℃〜15℃である請求項７記載の方
   法。
9. 【請求項９】アミン緩衝剤がエチレンジアミン、トリス
   （ヒドロキシメチル）メチルアミン、ピペラジン、グリ
   シルグリシン、及びそれらの混合物からなる群から選ば
   れる請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】固定化カタラーゼ対固定化グリコレート
    オキシダーゼのIU尺度での比が少なくとも250:1である
    請求項１記載の方法。
11. 【請求項１１】添加されるフラビンモノヌクレオチドの
    初期濃度が０〜2.0mMである請求項１記載の方法。
12. 【請求項１２】前記アミン緩衝剤がエチレンジアミンで
    ある請求項１記載の方法。
13. 【請求項１３】前記アミン緩衝剤がトリス（ヒドロキシ
    メチル）メチルアミンである請求項１記載の方法。
14. 【請求項１４】前記アミン緩衝剤がピペラジンである請
    求項１記載の方法。
15. 【請求項１５】前記アミン緩衝剤がグリシルグリシンで
    ある請求項１記載の方法。