JP2000060591A - キトサンオリゴ糖の製造方法 - Google Patents
キトサンオリゴ糖の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】５糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖を、効率よ
く、選択的に、しかも低コストで製造する方法を提供す
る。 【解決手段】限外濾過膜をキトサンの加水分解反応に応
用し、酵素反応開始後の限外濾過を開始する時間、ある
いは仕込み液量と透過液量との比率等について種々検討
を行った結果、酵素反応により生成した５糖乃至６糖の
キトサンオリゴ糖を最適な条件下で反応系外に取り出す
ことにより、目的とする５糖乃至６糖のキトサンオリゴ
糖を選択的に、効率よく、かつ工業的に利用可能な製造
する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
く、選択的に、しかも低コストで製造する方法を提供す
る。 【解決手段】限外濾過膜をキトサンの加水分解反応に応
用し、酵素反応開始後の限外濾過を開始する時間、ある
いは仕込み液量と透過液量との比率等について種々検討
を行った結果、酵素反応により生成した５糖乃至６糖の
キトサンオリゴ糖を最適な条件下で反応系外に取り出す
ことにより、目的とする５糖乃至６糖のキトサンオリゴ
糖を選択的に、効率よく、かつ工業的に利用可能な製造
する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、キトサナーゼを用
いてキトサンの加水分解反応を行う場合において、限外
濾過膜を有する反応槽内で純度の高い５糖乃至６糖のキ
トサンオリゴ糖を連続的に製造する方法に関する。
いてキトサンの加水分解反応を行う場合において、限外
濾過膜を有する反応槽内で純度の高い５糖乃至６糖のキ
トサンオリゴ糖を連続的に製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】キトサンを加水分解物して得られるキト
サンオリゴ糖のなかで、５糖乃至６糖のキトサンオリゴ
糖は抗菌作用、抗腫瘍作用等を示す生理活性物質として
注目されている。通常、キトサンオリゴ糖はキチンの脱
アセチル体であるキトサンの塩酸による加水分解によっ
て作られているが、塩酸による加水分解は廃水処理コス
トが高いという難点がある。一方、酵素による加水分解
では排水処理に問題がなく収率も良いこと等の理由か
ら、最近ではキトサンオリゴ糖の製造は酵素による加水
分解法に移行しつつある。
サンオリゴ糖のなかで、５糖乃至６糖のキトサンオリゴ
糖は抗菌作用、抗腫瘍作用等を示す生理活性物質として
注目されている。通常、キトサンオリゴ糖はキチンの脱
アセチル体であるキトサンの塩酸による加水分解によっ
て作られているが、塩酸による加水分解は廃水処理コス
トが高いという難点がある。一方、酵素による加水分解
では排水処理に問題がなく収率も良いこと等の理由か
ら、最近ではキトサンオリゴ糖の製造は酵素による加水
分解法に移行しつつある。
【０００３】酵素によるキトサンオリゴ糖の製造は、原
料であるキトサンに通常その加水分解酵素であるキトサ
ナーゼを作用させることによって行われているが、キト
サンオリゴ糖の収率をあげるために反応時間を長くする
と、キトサンは最終的には２糖もしくは３糖にまで分解
されてしまうため、通常のバッチ法で酵素反応を行うと
５糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖の生産性は低くなって
しまう。
料であるキトサンに通常その加水分解酵素であるキトサ
ナーゼを作用させることによって行われているが、キト
サンオリゴ糖の収率をあげるために反応時間を長くする
と、キトサンは最終的には２糖もしくは３糖にまで分解
されてしまうため、通常のバッチ法で酵素反応を行うと
５糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖の生産性は低くなって
しまう。
【０００４】したがって、効率的に５糖乃至６糖のキト
サンオリゴ糖を製造するためには、目的とするオリゴ糖
の生産がピークに達した時点で酵素反応を速やかに止め
ることが必要となっている。
サンオリゴ糖を製造するためには、目的とするオリゴ糖
の生産がピークに達した時点で酵素反応を速やかに止め
ることが必要となっている。
【０００５】酵素反応を停止するには加熱等の方法が採
られているが、効率的な酵素の再利用を目的として、酵
素を固定化して反応液と酵素とを効率よく分離する等の
方法も検討されている。(日本生物工学会平成９年度講
演要旨集 P.235)しかし、酵素を固定化する方法を用い
ても、５糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖を選択的に製造
することは難しく、収率も十分期待する水準には至って
いない。
られているが、効率的な酵素の再利用を目的として、酵
素を固定化して反応液と酵素とを効率よく分離する等の
方法も検討されている。(日本生物工学会平成９年度講
演要旨集 P.235)しかし、酵素を固定化する方法を用い
ても、５糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖を選択的に製造
することは難しく、収率も十分期待する水準には至って
いない。
【０００６】一方、限外濾過膜を酵素反応に用いる試み
は比較的多く行われている(化学工業社、分離を伴うバ
イオリアクター,1987)が、以下のようなメリットを有し
ていることが理由と思われる。 酵素と反応生成物との分子量の差で容易に分離する
ことができる。 固定化と同様の効果が得られる。 固定化等の煩雑な作業が不要である。 固定化による酵素の失活が防げる。 反応槽の形式を選択することによって、反応面積
(酵素と基質の接触面積)を大きく取ることが可能とな
る。 しかし、酵素による高分子物質の低分子化反応に、この
限外濾過膜を応用した研究はそれほど多くは行われてお
らず、本発明に近い報告としては特開平５−６８５８０
号がある。しかし、上記特許に記載された方法では、基
質に対する全オリゴ糖の変換効率は40％と低く、更に５
糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖は生産された全オリゴ糖
の36.7％にしかすぎず、５糖乃至６糖のキトサンオリゴ
糖の最終変換率は約15％程度であり、５糖乃至６糖のキ
トサンオリゴ糖を効率よく選択的に生産しているとは言
い難い。また、目的以外のオリゴ糖である4糖以下ある
いは7糖以上のキトサンオリゴ糖の比率が高いため、精
製工程における操作が煩雑になるとともに、収率の点で
問題を有している。
は比較的多く行われている(化学工業社、分離を伴うバ
イオリアクター,1987)が、以下のようなメリットを有し
ていることが理由と思われる。 酵素と反応生成物との分子量の差で容易に分離する
ことができる。 固定化と同様の効果が得られる。 固定化等の煩雑な作業が不要である。 固定化による酵素の失活が防げる。 反応槽の形式を選択することによって、反応面積
(酵素と基質の接触面積)を大きく取ることが可能とな
る。 しかし、酵素による高分子物質の低分子化反応に、この
限外濾過膜を応用した研究はそれほど多くは行われてお
らず、本発明に近い報告としては特開平５−６８５８０
号がある。しかし、上記特許に記載された方法では、基
質に対する全オリゴ糖の変換効率は40％と低く、更に５
糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖は生産された全オリゴ糖
の36.7％にしかすぎず、５糖乃至６糖のキトサンオリゴ
糖の最終変換率は約15％程度であり、５糖乃至６糖のキ
トサンオリゴ糖を効率よく選択的に生産しているとは言
い難い。また、目的以外のオリゴ糖である4糖以下ある
いは7糖以上のキトサンオリゴ糖の比率が高いため、精
製工程における操作が煩雑になるとともに、収率の点で
問題を有している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、５糖
乃至６糖のキトサンオリゴ糖を、効率よく、選択的に、
しかも低コストで製造する方法を提供することである。
乃至６糖のキトサンオリゴ糖を、効率よく、選択的に、
しかも低コストで製造する方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ある一定
の分子量以上の分子は通過できないがそれ以下の分子は
自由に膜を透過出来るという特徴を有している限外濾過
膜に着目し、限外濾過膜をキトサンの加水分解反応に利
用することを試みた。この限外濾過膜を用いた加水分解
条件を検討する過程で２から６糖のキトサンオリゴ糖の
生成比率を経時的に分析した結果、５糖乃至６糖のキト
サンオリゴ糖は加水分解反応における中間的な生成物で
あり、反応液中に長く留まれば酵素によって更に加水分
解されてしまうことを見出した。
の分子量以上の分子は通過できないがそれ以下の分子は
自由に膜を透過出来るという特徴を有している限外濾過
膜に着目し、限外濾過膜をキトサンの加水分解反応に利
用することを試みた。この限外濾過膜を用いた加水分解
条件を検討する過程で２から６糖のキトサンオリゴ糖の
生成比率を経時的に分析した結果、５糖乃至６糖のキト
サンオリゴ糖は加水分解反応における中間的な生成物で
あり、反応液中に長く留まれば酵素によって更に加水分
解されてしまうことを見出した。
【０００９】その知見をもとに、酵素反応開始後の限外
濾過を開始する時間、あるいは仕込み液量と透過液量と
の比率等について種々検討を行った結果、酵素反応によ
り生成した５糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖をある条件
下で反応系外に取り出すことにより、目的とする５糖乃
至６糖のキトサンオリゴ糖を高い収率で得ることに成功
した。
濾過を開始する時間、あるいは仕込み液量と透過液量と
の比率等について種々検討を行った結果、酵素反応によ
り生成した５糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖をある条件
下で反応系外に取り出すことにより、目的とする５糖乃
至６糖のキトサンオリゴ糖を高い収率で得ることに成功
した。
【００１０】すなわち、キトサナーゼによるキトサンの
加水分解反応に限外濾過膜を利用することにより高価な
キトサナーゼの再利用が可能となり、更にその最適な条
件を設定することにより５糖乃至６糖からなるキトサン
オリゴ糖を選択的に、効率よく、かつ工業的に利用可能
な製造する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
加水分解反応に限外濾過膜を利用することにより高価な
キトサナーゼの再利用が可能となり、更にその最適な条
件を設定することにより５糖乃至６糖からなるキトサン
オリゴ糖を選択的に、効率よく、かつ工業的に利用可能
な製造する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明における限外濾過膜
を有する反応槽を用いたキトサンを基質としたキトサナ
ーゼによる５糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖の製造方法
について詳細に説明する。
を有する反応槽を用いたキトサンを基質としたキトサナ
ーゼによる５糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖の製造方法
について詳細に説明する。
【００１２】本発明で使用する酵素反応装置は、限外濾
過膜を有する反応槽と基質供給槽から構成される。上記
限外濾過膜は、キトサナーゼを透過せず、生成した５乃
至６糖のキトサンオリゴ糖が透過可能であるならば、い
ずれの膜でもかまわない。限外濾過膜には平膜型、多段
平膜型、中空糸型等のタイプがあるが、いずれの型式で
もかまわない。平膜型では、適切な濾過速度を確保する
ためには槽内を加圧することが必要である。加圧するに
は窒素ガス、ヘリウムガス、空気等を用いることが好ま
しい。また、必要に応じて反応槽内にインペラーを設置
することが好ましい。液の撹拌を行うことで、膜表面の
目詰まりを防止し、よりよい濾過速度を維持することが
できる。一方、多段平膜型、中空糸型の場合はポンプを
用いて基質供給槽から反応槽へ輸液することで、適切な
濾過圧力と線速度を保持し、よりよい濾過速度を維持す
ることができる。
過膜を有する反応槽と基質供給槽から構成される。上記
限外濾過膜は、キトサナーゼを透過せず、生成した５乃
至６糖のキトサンオリゴ糖が透過可能であるならば、い
ずれの膜でもかまわない。限外濾過膜には平膜型、多段
平膜型、中空糸型等のタイプがあるが、いずれの型式で
もかまわない。平膜型では、適切な濾過速度を確保する
ためには槽内を加圧することが必要である。加圧するに
は窒素ガス、ヘリウムガス、空気等を用いることが好ま
しい。また、必要に応じて反応槽内にインペラーを設置
することが好ましい。液の撹拌を行うことで、膜表面の
目詰まりを防止し、よりよい濾過速度を維持することが
できる。一方、多段平膜型、中空糸型の場合はポンプを
用いて基質供給槽から反応槽へ輸液することで、適切な
濾過圧力と線速度を保持し、よりよい濾過速度を維持す
ることができる。
【００１３】反応槽には基質溶液をあらかじめ仕込み、
所定の反応温度で酵素を加えることにより加水分解反応
を開始する。反応温度及び反応pHは酵素反応がおこる温
度及びpHであれば特に限定されないが、用いる酵素の最
適温度及びpHが好ましい。加水分解物を含む反応液は限
外濾過膜を透過することにより、酵素及び高分子基質と
分離し反応槽から排出する。基質供給槽には基質となる
キトサンの水溶液を仕込み、ここから膜透過量と等しい
量の基質を反応槽に供給し、反応槽内の反応液、基質濃
度を一定に保ちつつ加水分解反応を続行する。
所定の反応温度で酵素を加えることにより加水分解反応
を開始する。反応温度及び反応pHは酵素反応がおこる温
度及びpHであれば特に限定されないが、用いる酵素の最
適温度及びpHが好ましい。加水分解物を含む反応液は限
外濾過膜を透過することにより、酵素及び高分子基質と
分離し反応槽から排出する。基質供給槽には基質となる
キトサンの水溶液を仕込み、ここから膜透過量と等しい
量の基質を反応槽に供給し、反応槽内の反応液、基質濃
度を一定に保ちつつ加水分解反応を続行する。
【００１４】本発明で使用する酵素はキトサンをエンド
型に加水分解する活性を持つ酵素ならば、何れの酵素で
もかまわないが、キトサナーゼを用いることが好まし
い。更に、目的とする５糖乃至６糖を効率よく製造する
には、キトサナーゼBN−262(明治製菓研究年報 第35号
P.28(1996) or 日本農芸化学会要旨集 P. 454(1987))
を用いることがより好ましい。キトサナーゼBN262はBac
illus pumilus BN−262株（微工研菌寄第8814号 FERMP
−8814）由来の酵素であり、特開昭63-63382記載の方法
により得ることができる。
型に加水分解する活性を持つ酵素ならば、何れの酵素で
もかまわないが、キトサナーゼを用いることが好まし
い。更に、目的とする５糖乃至６糖を効率よく製造する
には、キトサナーゼBN−262(明治製菓研究年報 第35号
P.28(1996) or 日本農芸化学会要旨集 P. 454(1987))
を用いることがより好ましい。キトサナーゼBN262はBac
illus pumilus BN−262株（微工研菌寄第8814号 FERMP
−8814）由来の酵素であり、特開昭63-63382記載の方法
により得ることができる。
【００１５】酵素反応は単なる水でも行うこともできる
が、pHを安定させるため各種緩衝液（リン酸緩衝液、酢
酸緩衝液、トリス-塩酸等の緩衝液、ホウ酸緩衝液等）
を用いることが好ましい。また、その濃度は0.001Ｍか
ら２Ｍが好ましく、0.05Ｍから0.5Ｍが更に好ましい。
反応液のpHは酵素反応が進行する値であればよいが、好
ましくはpH４〜８、更に好ましくはpH５〜７である。
が、pHを安定させるため各種緩衝液（リン酸緩衝液、酢
酸緩衝液、トリス-塩酸等の緩衝液、ホウ酸緩衝液等）
を用いることが好ましい。また、その濃度は0.001Ｍか
ら２Ｍが好ましく、0.05Ｍから0.5Ｍが更に好ましい。
反応液のpHは酵素反応が進行する値であればよいが、好
ましくはpH４〜８、更に好ましくはpH５〜７である。
【００１６】前記した酵素反応装置に、0.1〜10％、好
ましくは0.2〜１％の濃度になるように緩衝液で溶解し
たキトサン溶液を所定量仕込み、そこに、0.15U/ml〜３
U/ml、好ましくは0.3U/ml〜1.5U/ml、より好ましくは0.
6U/ml〜１U/mlとなるようにキトサナーゼを添加し、加
水分解反応を開始する。反応開始後、一定時間毎に反応
液を分析し、反応槽内の５糖乃至６糖のキトサンオリゴ
糖の合計が、基質として加えたキトサンの20％〜30％、
好ましくは30％以上になった時点で、酵素反応装置に圧
力をかけるかあるいは基質を供給することにより濾過を
開始する。基質供給槽から酵素反応槽への基質の供給は
限外濾過を開始する前でも、後でも構わない。また、そ
の供給速度は濾過速度と同速度であることが望ましい
が、異なっても構わない。限外濾過膜透過液が一定量集
まった時点で、この透過液からキトサンオリゴ糖を精製
する。
ましくは0.2〜１％の濃度になるように緩衝液で溶解し
たキトサン溶液を所定量仕込み、そこに、0.15U/ml〜３
U/ml、好ましくは0.3U/ml〜1.5U/ml、より好ましくは0.
6U/ml〜１U/mlとなるようにキトサナーゼを添加し、加
水分解反応を開始する。反応開始後、一定時間毎に反応
液を分析し、反応槽内の５糖乃至６糖のキトサンオリゴ
糖の合計が、基質として加えたキトサンの20％〜30％、
好ましくは30％以上になった時点で、酵素反応装置に圧
力をかけるかあるいは基質を供給することにより濾過を
開始する。基質供給槽から酵素反応槽への基質の供給は
限外濾過を開始する前でも、後でも構わない。また、そ
の供給速度は濾過速度と同速度であることが望ましい
が、異なっても構わない。限外濾過膜透過液が一定量集
まった時点で、この透過液からキトサンオリゴ糖を精製
する。
【００１７】なお、平膜タイプの限外濾過膜を用いた場
合、長期間反応を継続すると限外濾過膜の目詰まり等の
理由から濾過速度が低下するが、反応槽内にインペラー
を設置し反応液を攪拌することにより限外濾過膜の目詰
まりが抑制され、濾過速度を長く維持することができ
る。
合、長期間反応を継続すると限外濾過膜の目詰まり等の
理由から濾過速度が低下するが、反応槽内にインペラー
を設置し反応液を攪拌することにより限外濾過膜の目詰
まりが抑制され、濾過速度を長く維持することができ
る。
【００１８】以上のことから、滞留時間などの条件を種
々変化させることにより変換効率も変化するが、投入し
た基質量に対する５糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖の生
成割合を、好ましい条件では20％から50％以上、更に好
ましい条件では40％から50％以上、とすることができ
る。
々変化させることにより変換効率も変化するが、投入し
た基質量に対する５糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖の生
成割合を、好ましい条件では20％から50％以上、更に好
ましい条件では40％から50％以上、とすることができ
る。
【００１９】
【実施例】次に、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるも
のではない。本発明において使用することのできる限外
濾過膜を有する酵素反応装置（メンブランバイオリアク
ター）の一例を図−１に示す。この酵素反応装置は反応
槽と基質供給槽から構成され、反応槽の底部には限外濾
過膜が装着されている。反応槽には膜の目詰まりを予防
するため、インペラーが設置されており撹拌が可能とな
っている。また、底に備えたインキュベーターにより反
応温度の制御が可能となっている。酵素反応槽は基質供
給槽とつながっており、この基質供給槽をガス等により
加圧することにより基質を供給するとともに酵素反応槽
は加圧される。この圧力により酵素反応槽より反応液が
限外濾過膜を透過する。したがって、透過して減少した
反応液量と同量の基質溶液が連続的に基質供給槽から供
給される。以下の実施例では特に断らない限り次の条件
を基本に実験を行った。 ・基質供給槽への圧力 4Kg／cm3 ・供給する基質濃度 0.5％キトサン溶液（pH 5.6
酢酸緩衝液） ・反応温度 35℃ ・反応槽内の攪拌速度 500rpm ・使用した酵素の比活性 40.1U/mg ・使用した限外濾過膜 GR−90PP（DDS社製分画分子量2
000） ・限外濾過装置（反応槽） UHP−62K（アドバンテック社製 有効膜面積 27.0c
m3） UHK−63K（アドバンテック社製 有効膜面積 11.5c
m3）
するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるも
のではない。本発明において使用することのできる限外
濾過膜を有する酵素反応装置（メンブランバイオリアク
ター）の一例を図−１に示す。この酵素反応装置は反応
槽と基質供給槽から構成され、反応槽の底部には限外濾
過膜が装着されている。反応槽には膜の目詰まりを予防
するため、インペラーが設置されており撹拌が可能とな
っている。また、底に備えたインキュベーターにより反
応温度の制御が可能となっている。酵素反応槽は基質供
給槽とつながっており、この基質供給槽をガス等により
加圧することにより基質を供給するとともに酵素反応槽
は加圧される。この圧力により酵素反応槽より反応液が
限外濾過膜を透過する。したがって、透過して減少した
反応液量と同量の基質溶液が連続的に基質供給槽から供
給される。以下の実施例では特に断らない限り次の条件
を基本に実験を行った。 ・基質供給槽への圧力 4Kg／cm3 ・供給する基質濃度 0.5％キトサン溶液（pH 5.6
酢酸緩衝液） ・反応温度 35℃ ・反応槽内の攪拌速度 500rpm ・使用した酵素の比活性 40.1U/mg ・使用した限外濾過膜 GR−90PP（DDS社製分画分子量2
000） ・限外濾過装置（反応槽） UHP−62K（アドバンテック社製 有効膜面積 27.0c
m3） UHK−63K（アドバンテック社製 有効膜面積 11.5c
m3）
【００２０】実施例１ 酵素濃度の検討１
反応容積（反応槽における仕込み液量）を50mlとしたと
きの最適酵素濃度の検討を実施した。反応開始後ほぼ定
常的な生産が行われるようになった12〜14時間後におけ
る、２〜６糖のキトサンオリゴ糖の合計濃度、５糖と６
糖の合計濃度、２糖と３糖の合計濃度及び透過流束に対
する酵素濃度の影響を図−２に示した。この結果から、
透過流束は酵素濃度10〜25μg/mlの範囲でほぼ一定であ
るが、酵素濃度が低い条件では、透過流束がやや低くな
っている。これは、酵素濃度が低い条件では、反応が比
較的進んでおらず高分子のオリゴ糖により、膜のファウ
リング（Fouling 目詰まり）がおきたためと考えられ
る。オリゴ糖２〜６糖合計濃度は酵素濃度の増加に伴い
増加した。また、ここで目的とする５糖と６糖の生産は
酵素濃度15μg/mlで最大となった。
きの最適酵素濃度の検討を実施した。反応開始後ほぼ定
常的な生産が行われるようになった12〜14時間後におけ
る、２〜６糖のキトサンオリゴ糖の合計濃度、５糖と６
糖の合計濃度、２糖と３糖の合計濃度及び透過流束に対
する酵素濃度の影響を図−２に示した。この結果から、
透過流束は酵素濃度10〜25μg/mlの範囲でほぼ一定であ
るが、酵素濃度が低い条件では、透過流束がやや低くな
っている。これは、酵素濃度が低い条件では、反応が比
較的進んでおらず高分子のオリゴ糖により、膜のファウ
リング（Fouling 目詰まり）がおきたためと考えられ
る。オリゴ糖２〜６糖合計濃度は酵素濃度の増加に伴い
増加した。また、ここで目的とする５糖と６糖の生産は
酵素濃度15μg/mlで最大となった。
【００２１】酵素濃度と透過液中の各オリゴ糖濃度との
関係を図−３に示した。この図に示されているように、
酵素濃度が高くなるに従い２糖,３糖のオリゴ糖が増加
している。これは、酵素濃度が高くなるほど分解反応速
度が増し、５糖〜６糖のオリゴ糖が更に加水分解して低
重合度のオリゴ糖の生産が多くなるためと考えられる。
このため反応の中間生成物である５糖及び６糖のオリゴ
糖が少なくなっていると考えられる。また、酵素濃度の
低い条件では加水分解反応が十分進行していないため５
糖と６糖のオリゴ糖の生成比率が高くなっている。
関係を図−３に示した。この図に示されているように、
酵素濃度が高くなるに従い２糖,３糖のオリゴ糖が増加
している。これは、酵素濃度が高くなるほど分解反応速
度が増し、５糖〜６糖のオリゴ糖が更に加水分解して低
重合度のオリゴ糖の生産が多くなるためと考えられる。
このため反応の中間生成物である５糖及び６糖のオリゴ
糖が少なくなっていると考えられる。また、酵素濃度の
低い条件では加水分解反応が十分進行していないため５
糖と６糖のオリゴ糖の生成比率が高くなっている。
【００２２】実施例２ 酵素濃度の検討２
反応容積を100mlとしたときの最適酵素濃度の検討を実
施した。ほぼ定常的な生産がおこなわれるようになった
12〜14時間後の２〜６糖のキトサンオリゴ糖の合計濃
度、５糖と６糖の合計濃度、２糖と３糖の合計濃度及び
透過流束に対する酵素濃度の影響を図−４に示した。こ
の結果から、透過流束は酵素濃度10〜25μg/mlの範囲で
ほぼ一定であるが、酵素濃度が低い条件では透過流束が
やや低くなっている。これは、酵素濃度が低い条件では
反応が比較的進んでおらず、高分子のオリゴ糖により膜
のファウリングがおきたためと考えられる。２〜６糖の
オリゴ糖の合計濃度は酵素濃度の増加に伴い増加した。
また、ここで目的とする５糖と６糖の生産は酵素濃度20
μg/mlで最大となった。
施した。ほぼ定常的な生産がおこなわれるようになった
12〜14時間後の２〜６糖のキトサンオリゴ糖の合計濃
度、５糖と６糖の合計濃度、２糖と３糖の合計濃度及び
透過流束に対する酵素濃度の影響を図−４に示した。こ
の結果から、透過流束は酵素濃度10〜25μg/mlの範囲で
ほぼ一定であるが、酵素濃度が低い条件では透過流束が
やや低くなっている。これは、酵素濃度が低い条件では
反応が比較的進んでおらず、高分子のオリゴ糖により膜
のファウリングがおきたためと考えられる。２〜６糖の
オリゴ糖の合計濃度は酵素濃度の増加に伴い増加した。
また、ここで目的とする５糖と６糖の生産は酵素濃度20
μg/mlで最大となった。
【００２３】この酵素濃度20μg/mlの条件における２〜
６糖のキトサンオリゴ糖の合計濃度、５糖と６糖の合計
濃度、２糖と３糖の合計濃度及び透過流束の経時変化を
図−５に示した。この結果を時間で積分することにより
得られた基質投入量、５糖と６糖の合計生成量、及び２
〜６糖の合計生成量の経時変化を図−６に示した。各時
間における基質投入量に対する５糖と６糖への変換率
は、時間の経過とともに大きくなっていった。これは、
反応槽内の未反応基質の増加により透過流束が低下し、
その結果、反応槽内の基質の滞留時間が増加したことに
よると考えられる。反応開始後、15時間経過時の基質投
入量に対する５糖と６糖への変換率は37.1％であった。
６糖のキトサンオリゴ糖の合計濃度、５糖と６糖の合計
濃度、２糖と３糖の合計濃度及び透過流束の経時変化を
図−５に示した。この結果を時間で積分することにより
得られた基質投入量、５糖と６糖の合計生成量、及び２
〜６糖の合計生成量の経時変化を図−６に示した。各時
間における基質投入量に対する５糖と６糖への変換率
は、時間の経過とともに大きくなっていった。これは、
反応槽内の未反応基質の増加により透過流束が低下し、
その結果、反応槽内の基質の滞留時間が増加したことに
よると考えられる。反応開始後、15時間経過時の基質投
入量に対する５糖と６糖への変換率は37.1％であった。
【００２４】実施例３ 反応容積の影響
反応容積を変化することによって反応槽内の基質の滞留
時間が変化し、透過液中のオリゴ糖の濃度やオリゴ糖組
成に影響を与えることが考えられる。酵素濃度20μg/ml
と固定し反応容積を変えた時の生成還元糖濃度、透過流
束の経時変化を図−７に示した。反応容積を200mlとし
たときの方が100mlの場合よりも生成還元糖濃度が定常
に達するのに時間を要している。これは基質の置換に時
間がかかるためである。しかし、滞留時間の増加は反応
時間の増加につながり、生成還元糖濃度が増加したもの
と考えられる。100mlと比較して、200mlの時の生成還元
糖量が高いが、その差はわずかである。また、定常時に
おける100mlと200mlでの生成還元糖量と５糖と６糖の合
計濃度及び２糖と３糖の合計濃度の比較を図−８に示し
た。100mlに対して、200mlでは２糖と３糖の合計濃度が
高く、５糖と６糖の合計濃度は低かった。
時間が変化し、透過液中のオリゴ糖の濃度やオリゴ糖組
成に影響を与えることが考えられる。酵素濃度20μg/ml
と固定し反応容積を変えた時の生成還元糖濃度、透過流
束の経時変化を図−７に示した。反応容積を200mlとし
たときの方が100mlの場合よりも生成還元糖濃度が定常
に達するのに時間を要している。これは基質の置換に時
間がかかるためである。しかし、滞留時間の増加は反応
時間の増加につながり、生成還元糖濃度が増加したもの
と考えられる。100mlと比較して、200mlの時の生成還元
糖量が高いが、その差はわずかである。また、定常時に
おける100mlと200mlでの生成還元糖量と５糖と６糖の合
計濃度及び２糖と３糖の合計濃度の比較を図−８に示し
た。100mlに対して、200mlでは２糖と３糖の合計濃度が
高く、５糖と６糖の合計濃度は低かった。
【００２５】
【発明の効果】本発明により、５糖乃至６糖のキトサン
オリゴ糖を、効率よく、特異的に、かつ低コストで製造
する方法を提供することができる。すなわち、本発明に
おける酵素反応装置において、酵素反応開始後の限外濾
過を開始する時間、あるいは仕込み液量と透過液量との
比率等を最適化することにより、５糖乃至６糖からなる
キトサンオリゴ糖の生成比率あるいはその収得量を増大
させることが可能となる。また、生産物であるキトサン
オリゴ糖と反応液中に存在する未分解のキトサン、分解
途中の高重合度のキトサンオリゴ糖とを分離して回収す
ることができることから、精製工程を大幅に短縮・簡略
化することができる。
オリゴ糖を、効率よく、特異的に、かつ低コストで製造
する方法を提供することができる。すなわち、本発明に
おける酵素反応装置において、酵素反応開始後の限外濾
過を開始する時間、あるいは仕込み液量と透過液量との
比率等を最適化することにより、５糖乃至６糖からなる
キトサンオリゴ糖の生成比率あるいはその収得量を増大
させることが可能となる。また、生産物であるキトサン
オリゴ糖と反応液中に存在する未分解のキトサン、分解
途中の高重合度のキトサンオリゴ糖とを分離して回収す
ることができることから、精製工程を大幅に短縮・簡略
化することができる。
【図−１】平膜タイプの限外濾過膜を有する酵素反応装
置（メンブランバイオリアクター）
置（メンブランバイオリアクター）
【図−２】反応容積が50mlにおけるオリゴ糖濃度及び膜
透過流束に及ぼす酵素濃度の影響
透過流束に及ぼす酵素濃度の影響
【図−３】酵素濃度と生成するオリゴ糖の重合度との関
係
係
【図−４】反応容積が100mlにおけるオリゴ糖濃度及び
膜透過流束に及ぼす酵素濃度の影響
膜透過流束に及ぼす酵素濃度の影響
【図−５】生成するオリゴ糖濃度と透過流束の経時変化
【図−６】基質投入量及びオリゴ糖生成量の経時変化
【図−７】生成還元糖濃度と透過流束の経時変化
【図−８】反応容積と生成する還元糖濃度との関係
フロントページの続き
(72)発明者 飯沼 勝春
神奈川県小田原市栢山788番地 明治製菓
株式会社薬品技術研究所内
(72)発明者 蛭田 修
神奈川県小田原市栢山788番地 明治製菓
株式会社薬品技術研究所内
Ｆターム(参考） 4B064 AF04 CA02 CA21 CB06 CC03
CC05 CD19 CE06 DA16
4D006 GA06 KA12 KA41 KA64 KE07Q
KE12R KE15Q KE16Q KE28Q
MA01 MA03 MB06 PA03 PB14
PB59 PC41 PC67 PC69
Claims (6)
- 【請求項１】キトサナーゼを用いてキトサンの加水分解
反応を行う場合において、限外濾過膜を有する反応槽内
への基質の供給と同反応槽からキトサンオリゴ糖生成物
の除去とを連続的に行うことを特徴とするキトサンオリ
ゴ糖の製造方法。 - 【請求項２】限外濾過を開始する時間を調整することを
特徴とする請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項３】反応槽内の５糖乃至６糖のキトサンオリゴ
糖の合計が、基質として加えたキトサンの30％を超した
時に、限外濾過を開始することを特徴とする請求項１か
ら請求項２のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項４】仕込み液量と透過液量との比率を制御する
ことによって反応槽内の滞留時間をコントロールするこ
とを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載
の製造方法。 - 【請求項５】生成される全キトサンオリゴ糖に対する５
糖乃至６糖のキトサンオリゴ糖の含有率が40％以上であ
ることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに
記載の製造方法。 - 【請求項６】Bacillus pumilus BN−262株（微工研菌寄
第8814号）由来のキトサナーゼBN−262を用いることを
特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載の製
造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10240393A JP2000060591A (ja) | 1998-08-26 | 1998-08-26 | キトサンオリゴ糖の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10240393A JP2000060591A (ja) | 1998-08-26 | 1998-08-26 | キトサンオリゴ糖の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000060591A true JP2000060591A (ja) | 2000-02-29 |
Family
ID=17058822
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10240393A Pending JP2000060591A (ja) | 1998-08-26 | 1998-08-26 | キトサンオリゴ糖の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000060591A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003088394A (ja) * | 2001-09-19 | 2003-03-25 | Ehime Prefecture | 有機物分解物の製造方法及び製造装置 |
| KR100396833B1 (ko) * | 2000-12-15 | 2003-09-02 | 주식회사 효성 | 바실러스 속 에이치에스비-21 균주가 생산하는키토산아제를 이용한 키토산 올리고당의 제조방법 |
| JP2005229962A (ja) * | 2004-02-23 | 2005-09-02 | Yaegaki Hakko Giken Kk | キトサン分解物の製造方法及び製造装置 |
| CN103424500A (zh) * | 2013-08-16 | 2013-12-04 | 浙江树人大学 | 离子色谱定性检测壳寡糖的方法及应用 |
| CN109985532A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-07-09 | 自然资源部第三海洋研究所 | 一种壳寡糖超薄复合膜的制备方法 |
| KR102295829B1 (ko) * | 2020-12-23 | 2021-08-30 | 조훈형 | 개선된 키토올리고당의 제조방법 |
| CN113402571A (zh) * | 2021-05-28 | 2021-09-17 | 合肥信达膜科技有限公司 | 一种膜分离工艺制备壳寡糖的方法 |
-
1998
- 1998-08-26 JP JP10240393A patent/JP2000060591A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100396833B1 (ko) * | 2000-12-15 | 2003-09-02 | 주식회사 효성 | 바실러스 속 에이치에스비-21 균주가 생산하는키토산아제를 이용한 키토산 올리고당의 제조방법 |
| JP2003088394A (ja) * | 2001-09-19 | 2003-03-25 | Ehime Prefecture | 有機物分解物の製造方法及び製造装置 |
| JP2005229962A (ja) * | 2004-02-23 | 2005-09-02 | Yaegaki Hakko Giken Kk | キトサン分解物の製造方法及び製造装置 |
| CN103424500A (zh) * | 2013-08-16 | 2013-12-04 | 浙江树人大学 | 离子色谱定性检测壳寡糖的方法及应用 |
| CN109985532A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-07-09 | 自然资源部第三海洋研究所 | 一种壳寡糖超薄复合膜的制备方法 |
| KR102295829B1 (ko) * | 2020-12-23 | 2021-08-30 | 조훈형 | 개선된 키토올리고당의 제조방법 |
| CN113402571A (zh) * | 2021-05-28 | 2021-09-17 | 合肥信达膜科技有限公司 | 一种膜分离工艺制备壳寡糖的方法 |
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