背景技术
利用具有酶活性的生物催化剂的化合物的制造方法,由于具有为了使反应条件稳定而能简化反应过程,以及副产物少而使得反应生成物纯度高或者能简化精制过程等优点,近年来在许多化合物的制造中被使用。
自从发现将腈化合物转化成酰胺化合物的酶——腈水合酶以来,使用生物催化剂进行化合物的制造也在酰胺化合物的制造中广为研究。使用生物催化剂的酰胺化合物的制造已在例如特开昭54-129190号公报、特开昭54-143592号公报、特开昭61-162193号公报、特开平2-470号公报、特开平5-103681号公报、特开平11-89575号公报和特开平11-123098号公报等中公开。
使用生物催化剂的酰胺化合物的制造方法,目前从操作性、安全性、经济性等观点来看作为优良的反应过程,在丙烯酰胺、烟酰胺等的工业生产中得以应用。
伴随而来的,需要研究从水溶液(反应液)中将生物催化剂分离的方法,水溶液(反应液)中含有因使用生物催化剂而获得的酰胺化合物。对于从酰胺水溶液中将生物催化剂分离的方法,可以例举例如特公平5-49273号公报所示的由中空膜过滤的方法、特开2001-78749号公报公开的利用气泡除去的方法。
但是,在水性介质中使用生物催化剂制造酰胺化合物时,即使将生物催化剂从酰胺化合物水溶液中分离出来,在酰胺化合物的水溶液中也会残存发泡性的杂质(发泡成分)。由于酰胺化合物水溶液具有发泡性,在随后的工序中或使用中(例如酰胺化合物水溶液的搬运时、填充到容器时),酰胺化合物水溶液中会产生气泡。因此,存在酰胺化合物水溶液的使用困难或者使用操作中效率下降的问题。
特别是,酰胺化合物是丙烯酰胺的情况下,还会有如下问题。在由丙烯酰胺制造聚丙烯酰胺时,为了降低残留的氧的浓度,向丙烯酰胺水溶液中通入氮气。这时,在丙烯酰胺水溶液具有发泡性的情况下,会产生诸如为了防止气泡的吹出溢出必须使用大的容器、气泡喷出的不利情况。
由于上述的问题,希望发泡性小的酰胺化合物水溶液。
作为发泡性小的酰胺化合物水溶液的制备方法,本发明人在特开2001-299376号公报中提供了降低所使用微生物菌体量的方法,在特开2001-78749号公报中提供了将发泡成分形成气泡而除去的方法。
但是,菌体使用量大多由其催化剂的性能来决定,在经济的催化剂使用量下制造酰胺化合物时,充分降低发泡性是困难的。
另一方面,将发泡成分形成气泡来除去的方法,由于以除去发泡成分为目的,是非常好的有效率的优选方法。但是,将发泡成分形成气泡而除去的方法,需要特殊的装置,而且存在的缺点是,为了稳定除去发泡成分,需要熟练控制供给的气/液的比例。
还有,对于丙烯酰胺水溶液的精制方法,在特开昭55-62054号公报中公开了使用超滤膜的例子。但是,该方法称为铜催化剂法,在容易形成丙烯酰胺的杂质的反应条件下除去生成的丙烯酰胺水溶液中的杂质(丙烯酰胺的低聚物、交联性物质),该方法,即使直接应用于由使用生物催化剂获得的丙烯酰胺水溶液,也不能充分分离发泡性杂质。
因此,对于由生物催化剂获得的酰胺化合物的水溶液,由超滤膜进行精制的例子至今还没有报告。本来涉及由生物催化剂得到的发泡成分的报告就几乎没有,何况超滤膜的截留分子量(molecular weight cut-off)与发泡成分的除去性的关系更是全然不知。
发明内容
本发明的目的是提供杂质含量少、发泡性小的酰胺化合物水溶液,和可以制备这样的酰胺化合物水溶液的酰胺化合物水溶液的精制方法,以及酰胺化合物的制造方法。
本发明人假设发泡成分可能是由生物体带来的多糖类、蛋白质类或者其复合体,对这样的发泡成分的除去方法进行了认真研究,结果是,惊奇地首次发现,通过使用截留分子量小于10000的超滤膜可以除去发泡成分。
即,本发明的酰胺化合物水溶液的精制方法,其特征在于,将含有由生物催化剂获得的酰胺化合物的水溶液,通过截留分子量大于等于1000、小于10000的超滤膜进行过滤。
通过本发明,可以获得杂质少、发泡性小的酰胺化合物水溶液。
还有,本发明的酰胺化合物水溶液的精制方法,优选超滤膜的截留分子量大于等于1000、小于5000。
还有,酰胺化合物优选丙烯酰胺或者是烟酰胺。
此外,生物催化剂优选微生物菌体、固定化菌体或者固定化酶。
另外,本发明的酰胺化合物水溶液,是含有由使用生物催化剂获得的酰胺化合物的水溶液,其特征在于,通过截留分子量大于等于1000、小于10000的超滤膜过滤。
还有,本发明的酰胺化合物的制造方法,其特征在于,具有以下工序:在水介质中使用生物催化剂、由腈化合物制备酰胺化合物的工序和使用截留分子量大于等于1000、小于10000的超滤膜对含有酰胺化合物的水溶液进行过滤的工序。
具体实施方式
以下通过适当的实施例对本发明进行说明,但是,本发明并不限定于以下各实施例。
本发明的酰胺化合物水溶液,是把包含了由生物催化剂制备的酰胺化合物的水溶液,通过使用截留分子量大于等于1000、小于10000的超滤膜进行过滤的精制方法而得到的水溶液。具体而言,该酰胺化合物水溶液经过了在水介质中用生物催化剂由腈化合物制备酰胺化合物的反应工序和含有酰胺化合物的水溶液(反应液)通过超滤膜过滤处理的精制工序。
本发明中所述的“水性介质”是指以水做为溶剂的水溶液。在这样的水性介质中包括不溶于水溶液的液体、固体在水中或者水溶液中分散后的溶液。
本发明所述的“生物催化剂”是指含有具有催化剂能力的酶的物质。这些生物催化剂可以例举如,酶本身、含有酶的微生物菌体和细胞、或者通过包括法、交联法、载体结合法等将这些酶、菌体或者细胞固定化后的物质(固定化酶、固定化菌体、固定化细胞)。其中,由于考虑到催化剂的添加、催化剂浓度控制、催化剂分离等操作简便程度,微生物菌体、固定化菌体或者固定化酶是适宜的。
作为固定酶、菌体或者细胞的固定化载体,可以例举如玻璃小球、硅胶、聚氨酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、角叉胶(carrageenan)、藻朊酸、琼脂、明胶等。
本发明所述的催化剂能力,是指将腈化合物进行水和转变成酰胺化合物的能力。具有这种能力的酶,一般称为腈水合酶。目前从多种微生物中发现有腈水合酶。
具有腈水合酶活性的微生物中,例如已知杆菌属(Bacillus)、巴克特利蒂姆(Bacteridium)属、微球菌属(Micrococcus)和短杆菌属(Brevibacterium,参照特公昭62-21519号公报)、棒杆菌属(Corynebacterium)和诺卡氏菌属(Nocardia,参照特公昭56-17918号公报)、假单胞菌属(Pseudomonas,参照特公昭59-37951号公报)、红球菌属(Rhodococcus)和微小杆菌属(Microbacterium,参照特公平4-4873号公报)。
本发明中的酰胺化合物限定于在腈水合酶的作用下由腈化合物转变而来的酰胺化合物,其他没有特别限定。至于腈化合物,可以例举如乙腈、丙腈、琥珀腈、己二腈之类的脂肪族饱和腈;丙烯腈、甲基丙烯腈之类的脂肪族不饱和腈;苯甲腈、苯二甲腈之类的芳香族腈;以及3-氰基吡啶、2-氰基吡啶之类的杂环式腈。
适合于使用生物催化剂制造的酰胺化合物的代表化合物,从化学、物理的性质优秀的角度,或者从经济的角度,优选丙酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、烟酰胺,特别优选丙烯酰胺、烟酰胺。
在反应工序中使用的反应装置,可以例举出固定床、移动床、流化床、搅拌槽等。另外,也可以是间歇反应方式的反应装置、连续反应方式的反应装置中的任何一个。
如果根据反应基质(腈化合物)、反应液、目标化合物(酰胺化合物)等的物性、生产规模等来选择反应模式,可以设计反应装置。例如由连续反应来制造的情况下,通常,生物催化剂由于反应基质或反应生成物而受到反应阻碍或失活的情况很多,另外为了优选使反应温度、pH值的控制简单的反应装置,优选连续地连接两个或其以上搅拌槽的多槽连续搅拌槽。
精制工序使用的超滤膜,其截留分子量大于等于1000、小于10000。超滤膜的截留分子量小于10000的话,可以除去由生物体带来的多糖类、蛋白质类或者这些的复合体而形成的发泡成分。还有,为了更完全除去发泡成分,超滤膜的截留分子量最好小于5000。
超滤膜的截留分子量越小能除去更多的杂质,从这个角度来讲是优选的,但是分子量越小,一般过滤的速度就会变慢,结果是需要大型的过滤设备。所以,能够得到过滤速度适合于工业酰胺化合物生产的超滤膜的截留分子量要大于等于1000。
本发明中所述的截留分子量大于等于1000、小于10000的超滤膜是指在对膜不进行特意的吸收的条件下,分子量为14200的α-乳白蛋白的阻止率为大于等于85%。还有,对于截留分子量大于等于1000、小于5000的超滤膜是指在对膜不进行特意的吸收的条件下,水中溶解的无机盐或前述的酰胺化合物的阻止率小于等于5%,并且分子量为14200的α-乳白蛋白的阻止率为大于等于90%。
这里所述的“阻止率”是指:过滤后处理水中的浓度/过滤前原水中的浓度×100(%),通常,使用100ml/L(升)左右的低浓度水溶液来测量。阻止率随时间变化的情况下,不使用处理刚开始后的值,而使用反复过滤处理后阻止率稳定后的值。
另外,在本发明中,为了有效除去发泡成分在用超滤膜进行处理之前,可以预先进行其它公知的精制方法。
实施例
以下通过实施例,对本发明进行进一步详细说明。
实施例1、比较例1
生物催化剂的调制:将具有腈水合酶活性的Rhodococcus rhodochrousJ1(FERM BP-1478)在含有2%葡萄糖、1%尿素、0.5%胨(peptone)、0.3%酵母提取物、0.05%氯化钴(均为质量%)的培养基(pH7.0)中,在30℃进行好气培养。将其由50mM(mol)的磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗净后,得到菌体的悬浊液(含干燥菌体15质量%)。
在菌体作用下由3-氰基吡啶转变为烟酰胺的反应:5L的玻璃烧杯中加入15质量%的3-氰基吡啶水溶液(50mM磷酸缓冲液,pH7)1L,向其中加入调试好的菌体悬浊液25mL,在30℃的水槽中缓慢搅拌。24小时后,得到17%的烟酰胺水溶液。使用孔径为0.45μm的膜滤器(アドバンテツク(株)制造,纤维素混合酯型,47mmΦ)进行过滤,得到透明的烟酰胺水溶液(样品1)。
反应液的精制:所得的烟酰胺水溶液由截留分子量为3000的超滤膜(ポ一ル社制造,OS003C11,α-乳白蛋白阻止率公称为大于等于96%)过滤处理,得到精制的烟酰胺水溶液(样品2)。
评价:所得的两种样品各20mL,各装入24mmΦ的试管中,用硅胶塞封口后,用手上下剧烈摇动,在样品产成气泡后,静置,测量到气泡消失为止的时间,结果如表1所示。
表1
|
样品 |
过滤处理 |
到气泡消失为止的时间 |
实施例1 |
样品2 |
截留分子量3000 |
3秒 |
比较例1 |
样品1 |
0.45μm |
12秒 |
实施例2、3、4,比较例2、3
生物催化剂的调制:与实施例1相同制备具有腈水合酶活性的Rhodococcus rhodochrous J1(FERM BP-1478)菌体悬浊液(含干燥菌体15质量%)。
另外,制备丙烯酰胺30质量%、亚甲基双丙烯酰胺1质量%以及2-二甲胺基丙基甲基丙烯酰胺4质量%的单体水溶液。
接着,菌体悬浊液、单体水溶液、10质量%的N,N,N’,N’-四甲基乙二胺水溶液以及10重量%的过硫酸氨水溶液,各自以5L/hr、2L/hr、0.1L/hr、0.1L/hr的顺序线性混合,其流出液分别盛入300×300×30mm的容器,在容器中,单体进行聚合,形成菌体固化凝胶块(gel sheet)。
所得的菌体固化凝胶块用刀细分割成0.5mm左右的四方形,获得固定化菌体粒子。让这种固定化菌体粒子一边流动,一边用0.1质量%的丙烯酸钠水溶液(pH调整到7)进行通液洗净,得到固定化菌体催化剂。
在固定化催化剂作用下由丙烯腈向丙烯酰胺的反应:在内容积为5L的带套管的可分隔的烧瓶(separable flask)中,加入0.2g/L的丙烯酸钠水溶液3510g,并加入上述的固定化菌体催化剂3g。将其控制在pH7.0、温度10℃,同时使用两个翼长120mm、翼宽20mm的平板搅拌翼在80rpm下进行搅拌。在其中,连续供给丙烯腈,使得丙烯腈的浓度一直保持为2质量%,进行蓄积反应直到丙烯酰胺的浓度达到40质量%。
然后,停止供给丙烯腈,使反应继续进行直到无法从反应液中检测出丙烯腈为止。使用网眼为300μm的金网将固体化菌体催化剂与溶液分离,得到丙烯酰胺的浓度约为40质量%的丙烯酰胺水溶液(样品3)。
反应液的精制:将所得的丙烯酰胺水溶液,用截留分子量为10000的超滤膜(ポ一ル社制造,OS010C11,α-乳白蛋白阻止率公称为小于等于80%)进行过滤处理,得到精制的丙烯酰胺水溶液(样品4)。
同样,未精制的丙烯酰胺水溶液,用截留分子量为5000的超滤膜(ポ一ル社制造,OS005C11,α-乳白蛋白阻止率公称为大于等于96%)进行过滤处理,得到精制的丙烯酰胺水溶液(样品5)。
同样,未精制的丙烯酰胺水溶液,用截留分子量为3000的超滤膜(ポ一ル社制造,OS003C11,α-乳白蛋白阻止率公称为大于等于96%)进行过滤处理,得到精制的丙烯酰胺水溶液(样品6)。
同样,未精制的丙烯酰胺水溶液,用截留分子量为1000的超滤膜(ポ一ル社制造,OS001C11)进行过滤处理,得到精制的丙烯酰胺水溶液(样品7)。
评价:将样品50mL装入100mL的量筒中,使用木下式玻璃球过滤器(G-3)从底部通入20mL/min的空气,使样品产生气泡,测定气泡的高度,结果如表2所示。
表2
|
样品 |
过滤处理 |
气泡高度 |
比较例2 |
样品3 |
无 |
130mm |
比较例3 |
样品4 |
截留分子量10000 |
120mm |
实施例2 |
样品5 |
截留分子量5000 |
60mm |
实施例3 |
样品6 |
截留分子量3000 |
13mm |
比较例4 |
样品7 |
截留分子量1000 |
13mm |