CN1319585A - 酰胺化合物的精制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了含酰胺化合物溶液中的不纯物的有效除去方法,该方法是将含酰胺化合物的溶液,特别是将用含有腈类水合酶的微生物菌体或该微生物菌体的处理物,在腈类化合物的水合反应中制备的含酰胺化合物的溶液,在酸性条件下,与活性炭相接触处理。
Description
本发明涉及酰胺化合物的精制方法。更具体地说，本发明涉及用活性炭处理含酰胺化合物的溶液，高效率得到高纯度酰胺化合物的方法。
酰胺化合物，特别是在腈类化合物由水合反应得到的酰胺化合物的生成液中，因制备方法的不同而不同，通常存在高分子物质、表面活性剂、着色剂、溶出物或其它的不纯物等。为除去这些杂质，已经公开了下述的方法，例如，特开昭61-115495号和61-122253号(EP-A-182578)公开了用活性炭精制处理的方法，而特开昭61-115058号公开了用离子交换膜精制处理的方法，特开昭61-22227号(EP-188068)公开了用多孔的中空纤维膜精制处理的方法。
但是，上述的离子交换膜或中空纤维膜精制处理的方法必须有特殊的精制装置等，在其实施中不可避免的存在经济方面的缺陷。
在用活性炭精制的方法中，通常不需要特殊的设备，但是在制品中仍存在杂质，效果不好。特别是，用有腈类水合能酶的腈类水合酶等直接水合腈类化合物制备酰胺化合物的情况下，按照上述现有技术的活性炭精制方法，混入反应溶液中的来自微生物的蛋白质等的除去不充分，其结果，即使其量是微量，反应液也易发泡，其量为大量时，反应液变成白浊状，制品的质量低劣。
因而，本发明的目的是提供高效率地除去酰胺化合物溶液中不纯物的方法。更具体地说，本发明是提供在从腈类化合物制备相应的酰胺化合物时，得到含酰胺化合物的溶液，用活性炭处理该溶液，简便而高效的精制方法。
本发明人对用活性炭精制上述含有酰胺化合物的溶液进行了深入的研究，发现在酸性条件下，使含酰胺化合物的溶液与活性炭相接触，特别是在特定的pH值范围与活性炭相接触，能够高效率地除去该含酰胺化合物溶液中的不纯物，特别是蛋白质。
特别是从现有技术中可知，酰胺化合物是含有不饱和键的物质时(例如，工业上比较重要的化合物是丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺等)，在酸性范围易发生聚合反应，化合物不稳定，为了避免聚合反应发生，含酰胺化合物的溶液必须保持中性。根据这样的观点，在上述条件下的精制技术得到了现有技术怎么也想不到的效果。
即，本发明是：
(1)在酸性条件下，使含酰胺化合物的溶液与活性炭相接触为特征的精制酰胺化合物的方法。
(2)按上述(1)所述的精制方法，含酰胺化合物的溶液是按相应的腈类化合物的水合反应得到的生成溶液。
(3)按上述(2)所述的精制方法，酰胺化合物的碳原子数是2-20个碳原子。
(4)按上述(3)所述的精制方法，酰胺化合物含有不饱和结合的物质。
(5)按上述(2)或(3)所述的方法，酰胺化合物是用含腈类水合酶的微生物菌体，或该微生物菌体的处理物，按腈类化合物的水合反应制备的。
(6)按上述(5)所述的精制方法，微生物菌体是在任意宿主中发现的微生物纯株培养的腈类水合酶遗传因子的形质转换体。
(7)按上述(4)所述的精制方法，酰胺化合物是用含腈类水合酶的微生物菌体，或该微生物菌体的处理物，按腈类化合物的水合反应制备的物质。
(8)按上述(7)所述的精制方法，微生物菌体是在任意宿主中发现的微生物纯株培养的腈类水合酶遗传因子的形质转换体。
(9)按上述(7)所述的精制方法，酰胺化合物是丙烯腈或甲基丙烯腈。
(10)按上述(8)所述的精制方法，酰胺化合物是丙烯腈或甲基丙烯腈。
(11)按上述(9)或(10)所述的精制方法，与活性炭相接触时的含酰胺化合物溶液pH值为3.5-6.5。
(12)按上述(11)所述的精制方法，其特征是用酸离解常数为3.5-5.5的有机酸或用该有机酸和碱调节含酰胺化合物的溶液的酸性。
(13)按上述(12)所述的精制方法，有机酸是丙烯酸或甲基丙烯酸。
(14)按上述(13)所述的精制方法，活性炭是以木质或棕榈壳作原料的活性炭。
(15)按上述(14)所述的精制方法，与活性炭相接触时的温度为10-50℃。
(16)按上述(15)所述的精制方法，其特征是含酰胺化合物的溶液与活性炭接触后，从含酰胺化合物的溶液中分离活性炭，使分离出的溶液在饱和温度以下析出结晶。
本发明中含酰胺化合物的溶液没有特别的限制，具体地说，可以举出碳原子数为2-20的腈类化合物进行水合反应得到的含酰胺化合物的生成溶液。供水合反应的腈类化合物，可以是宽范围的腈类化合物，例如脂肪族腈类化合物、芳香族腈类化合物等的腈类化合物。脂肪族腈类化合物可举出碳原子数为2-6的饱和或不饱和腈类，例如乙腈、丙腈、丁腈、异丁腈、戊腈、异戊腈、己腈等脂肪族单腈类；乙二腈、丁二腈、己二腈等脂肪族饱和二腈类；丙烯腈、甲基丙烯腈、丁烯腈等的脂肪族不饱和腈等。芳香族腈类化合物可举出苄腈、隣-、间-和对-氯苄腈、隣-、间-和对-氟苄腈、隣-、间-和对-腈类苄腈、隣-、间-和对-甲基苄腈、苄基氰化物等，特别是对于由丙烯腈和甲基丙烯腈等有不饱和键的腈类得到的含有丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺的水溶液，本发明的方法特别适合。
在本发明中，关于作为处理对象的含酰胺化合物的溶液，不管是从哪种已知水合方法制备的含酰胺化合物的溶液。即，不管是由硫酸水合法或由含雷内铜催化剂等的金属铜的催化剂的接触水合法制备的含酰胺化合物的溶液，用有水合能力使腈类化合物的酶(腈类水合酶)和含有这些酶的微生物菌体，或用其酶和微生物体处理物等进行水合反应等都是可以的。
但是，用有使腈类化合物进行水合能力的酶即腈类水合酶、腈类水合酶的处理物、含腈类水合酶的微生物菌体或该微生物菌体处理物得到的含酰胺化合物的溶液，本发明的方法是特别适合的。
上述的腈类水合酶称为具有腈类化合物加水分解生成相应的酰胺化合物能力的酶。
在本发明中，含有腈类水合酶的微生物没有特别的限制，只要具有使腈类化合物加水分解产生有生成相应酰胺化合物能力的腈类水合酶，而且在30重量％的丙烯酰胺水溶液中保持腈类水合酶活性的微生物就行。作为适合的实例，可以具体举出诺卡氏菌属、棒杆菌属、芽孢菌属、好热性杆菌属、假单胞菌属、微球菌属、红球菌种为代表的红球菌属、不动杆菌属、黄色杆菌属、链霉菌属、根瘤菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、欧文氏菌属、气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、维氏无色杆菌属、琼脂杆菌属或嗜热性菌种代表的假诺卡氏菌属的微生物。
在本发明中，在任意宿主中发现的该微生物纯菌株培养的腈类水合酶遗传因子的形质转换体也含于本发明所述的微生物中。而且，本申请中所述的任意宿主可列举出后述实施例的大肠杆菌作代表，但是大肠杆菌并不特别限定包含枯草杆菌等的杆菌属菌、酵母菌或放线菌等，也含其它的微生物菌株。这种微生物菌株的实例，可以举出MT-10882(根据关于特许手续上的微生物寄存的国际承认的布达佩斯条约，该菌株于1996年2月7日寄存在茨城县っㄑば市东1街第3号的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，寄存号为FERM BP-5785)。另外，使用DNA重组技术，该酶构成中的一或两个以上氨基酸，可以用其它的氨基酸插入、置换、缺失、削除，发现提高了酰胺化合物稳定性、温度稳定性的变异型的腈类水合酶的形质转换体也包含在本发明所述的微生物中。
使用上述的微生物制备酰胺化合物时，通常利用该微生物的菌体或菌体处理物。菌体优选利用分子生物学、生物工程学、遗传工程学区域内公知的一般方法调制。例如，可以举出在LB培养基或M9培养基的通常液体培养基植菌该微生物后，在适当的培养温度培养(一般情况下，为20-50℃，但在嗜热菌的情况下，为50℃以上)，此后，用离心分离法使该微生物与培养液分离、回收的方法。
本发明中的微生物菌体处理物，是指上述的微生物菌体的提取物或磨碎物，分离精制该提取物或磨碎物的腈类水合酶活性部分得到的后分离物，将该微生物菌体或该菌体的提取物、磨碎物、后分离物用适当的担体固定的固定化物，其中有腈类水合酶活性的部分相当本发明菌体处理物。
作为本发明精制对象的酰胺化合物中，利用包含腈类水合酶的微生物菌体或该微生物菌体的处理物水合腈类化合物得到酰胺化合物时的反应形式，使相应的腈类化合物进行间歇式反应的方法，或连续反应的方法。反应的形式没有特别的限制，例如，可在沸腾床进行，也可在固定床进行。此时，在反应液中的催化剂，例如微生物菌体或菌体处理物的浓度、水性介质和腈类化合物的混合没有障碍，没特别的限制。
如上所述，在开始反应时添加腈类化合物的情况下，腈类化合物的浓度为该腈类化合物的饱和浓度以上。一方面，浓度的上限没有特别的限制，可根据反应结束时预定的酰胺化合物的浓度和腈类化合物的浓度任意决定。
未反应的腈类化合物可以通过反应后蒸馏等方法从反应液中除去。因此，即使达到预定反应结束时的酰胺化合物浓度的时间点，也可以添加腈类化合物使腈类化合物过剩。
具体地说，例如，腈类化合物是丙烯腈的情况下，在20℃温度下本化合物对水的饱和浓度为约7重量％，在约7重量％以上是非常适合的。在甲基丙烯腈或丁烯腈是腈类化合物的情况下，在20℃温度下这些化合物对水的饱和浓度为约2重量％，在约2重量％以上是非常适合的。
上述的酰胺化反应通常在常压下进行，为了提高在水介质中腈类化合物的溶解度可在加压下进行。反应温度在水性介质的凝固点以上没有特别的限制，但是，在催化剂含腈类水合酶时，优选在0-50℃、更优选10-30℃的温度范围内进行。
上述酰胺化反应时反应液的pH值，要求保持腈类水合酶的活性，没有特别的限制，但是，pH值优选在6-10、更优选在7-9的范围。
在本发明中酰胺化合物的精制，是在酸性条件下，优选pH2以上、更优选pH3.5-6.5范围内与活性炭相接触进行。
在本发明中，含酰胺化合物的溶液为酸性，通常该含酰胺化合物溶液必须添加酸，但是，酸的种类可以使用不影响酰胺化合物的稳定性的各种各样的酸，例如硫酸和硝酸等的无机酸，或乙酸和丙烯酸之类的有机酸，可以两种以上组合使用。即使这样，在本发明中，调节pH容易保持稳定，但是，从得到更高的精制效果和酰胺化合物的稳定性上考虑是使用弱酸的效果好，而且，从保持pH缓冲效果上考虑，优选用弱酸或碱或两者调节上述的pH值。
考虑pH值控制的范围，优选使用的弱酸是酸的离解常数(Ka:25℃，水中)优选为2.0-6.0，更优选为3.5-5.5的酸。这些酸的实例是乙酸、丙酸、辛酸、戊酸等脂肪族饱和一元羧酸、丙烯酸、丁烯酸、甲基丙烯酸等的脂肪族不饱和单羧酸、草酸、己二酸、丁二酸、马来酸等的脂肪族多元酸、安息香酸等的芳香族羧酸等。上述的碱优选强碱，例如氢氧化钠和氢氧化钾。
在本发明中，作为处理对象的酰胺化合物，特别是在持有不饱和键的酰胺化合物作为处理对象的情况下，在精制后进行聚合反应时，得到的聚合物中残存有酸，或发生游离不适合的情况。为此，以有上述不饱和结合物的酰胺化合物作精制对象时，酸具有不饱和键时，可能与该酰胺化合物进行共聚合，具体使用丙烯酸和甲基丙烯酸，或丁烯酸等。
在本发明中，上述的酸或上述的酸和碱的浓度，根据含酰胺化合物溶液的性质和酸的pKa值，相对含酰胺化合物溶液换算成酸，酸的用量通常在10重量ppm-5重量％范围。
不管是何种调节方法，在本发明中，在上述酸性条件下使含酰胺化合物的溶液与活性炭相接触，而活性炭与含酰胺化合物的溶液接触时该溶液变成酸性，或酸性的形式，没有特别限制，活性炭与含酰胺化合物的溶液同时添加调节酸性。
本发明中所使用的活性炭没有特别地限制，粉末状和粒状的活性炭都可使用。对于进行精制处理的装置，根据所使用的活性炭的粒度选用。例如，在使用粉末状活性炭的情况下，溶液可在槽中搅拌，可以使用间歇式和连续式的装置进行。使用粒状活性炭时，除上述的形式外，也可使用填充塔进行连续处理。
活性炭一般用煤、木材和椰子壳等为原料，吸附能没有特别的限制，只要可以使用就行。
但是，作为处理对象的酰胺化合物含有不饱和键的情况下，考虑该酰胺化合物的保存稳定性和聚合难易等因素，优选使用金属含量少的活性炭，优选使用以木材或棕榈壳为原料的活性炭。
在本发明中，酰胺化合物进行精制处理时所使用的活性炭量太少时难得到优良的精制效果，太多时，也不经济，相对含酰胺化合物溶液，活性炭的用量通常为0.01-20重量％，更优选为0.05-10重量％。
使用粉末状活性炭时，活性炭可以任意直接添加入含酰胺化合物的溶液中，或一旦将活性炭分散在水等的介质中，以浆料的形式加入或提供给含酰胺化合物的溶液。
在本发明中，用活性炭精制处理含酰胺化合物溶液时的温度，以酰胺化合物不析出结晶，保持在不影响稳定性的范围，没有特别地限制，但是，通常0-80℃的温度下进行。特别是含丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺化合物溶液，精制有不饱和键的酰胺化合物溶液时，为防止发生聚合反应引起凝胶化，温度保持在60℃以下，优选在10-50℃温度范围进行与活性炭接触。根据处理形式和活性炭的用量，与活性炭接触处理的必要时间，通常在0.5-20小时范围。
接着，从活性炭中分离按本发明上述处理的含酰胺化合物的溶液，得到精制的含酰胺溶液。分离活性炭的方法，一般采用使用固液分离装置的方法，没有特别地限制，例如，一般使用加压过滤器、减压过滤器或离心分离器，而且不管是间歇式和连续式方法。
在本发明中，冷却分离上述活性炭后的含酰胺化合物的溶液，采用结晶析出溶液中目的酰胺方法，可以得到更精制的酰胺化合物。
在本实施例中，可以将持有腈类水合酶活性的氨基酸置换体进行部位特异的变异。但是，按照在实施例公开的变异点和被置换的碱基的种类中，用部位特异的变异以外的方法构筑重组的质体，将其导入宿主细胞中，可能得到与本实验相同的结果。
例如，在和实施例中公开的变异点相当区域的DNA碱基序列是在合成器中合成有和氨基酸置换后的序列的那样的碱基序列的DNA碎片，将得到的碎片分离和相当区域的另一方法分离的PPT-DBl的该碎片置换，就可以取得所需的重组质体。
实施例
下面，通过实施例更详细地说明本发明，但是，本发明不受以下实施例的限制。
在下文中，反应液的HPLC分析，使用ULTRON 80G(50×8φmm)柱进行，展开液是10mM磷酸水溶液，丙烯酰胺在220nm处检出吸光度。为了确认本发明的效果，分析得到含酰胺化合物溶液的蛋白质。含酰胺化合物的溶液用半透膜透析除去酰胺化合物后，蛋白质的浓度用バイォラフト社制的蛋白质分析仪定量，求出蛋白质的除去率。
实施例1
在500毫升带缓冲瓶的三角烧瓶中调制下述组成的培养基100毫升，在121℃用灭菌器灭菌20分钟。这种培养基的最终浓度达50微克/毫升，添加氨苄青霉素后，将MT-10822株(FERM BP-5785)的一白色菌耳植菌，在37℃于130转/分转速下培养20分钟。从培养液中离心分离(15000转/分×15分钟)菌体，接着用50毫升生理盐水将该菌体再悬浊后再次进行离心分离，得到湿菌体。
培养基的组成
酵母提取液 5.0克/升
细菌培养基用的胨 10.0克/升
氯化钠 5.0克/升
氯化钴六水合物 10.0克/升
硫酸亚铁七水合物 40.0克/升
pH 7.5
将上述得到的湿菌体1.5克在98.5克的0.3mM氢氧化钠水溶液中悬浊，向这种悬浊液中总共添加36克丙烯腈，在10℃温度下搅拌并反应。从反应开始24小时后用HPLC对反应液进行分析。其结果，反应液中只有丙烯酰胺存在(浓度=35重量％)，认为没有丙烯腈。这种反应液的pH值是8.0。
用10％的硫酸水溶液将这种反应液调整pH值为5，相对反应液添加2重量％的活性炭(三仓化成(株)制粉末状活性炭PM-SX)，在25℃温度下搅拌5小时后，用滤纸进行过滤。测定得到的滤液中的蛋白质浓度，除去率在99％以上。另外，向10毫升这种滤液中加入100毫升甲醇，不生成白色沉淀，认为全部是聚合物。
实施例2
对实施例1中得到的反应液，除用10％的丙烯酸水溶液调整pH值为5外，得到的滤液进行与实施例1相同的处理。测定得到的滤液中的蛋白质浓度，除去率在99％以上。另外，向10毫升这种滤液中加入100毫升甲醇，不生成白色沉淀，认为全部是聚合物。
实施例3
为了用Met置换含有腈类水合酶活性的氨基酸转换体取得的α亚单元的6号位连接部分的Leu，按照特开平9-275978得到的pPT-DBl质体DNA作为模板，用宝酒造社制的[LA PCR体外诱变仪Kit]进行部位特异的变异导入。下文简单称[LA PCR体外诱变仪Kit]为工具箱。在下述的实施例中基本上按照工具箱的原理和操作方法。
在30毫升的试管中调制10毫升LB液体培养基，在121℃用自动灭菌器灭菌20分钟。这种培养基的最终浓度达100微克/毫升，添加氨苄青霉素后，与实施例1同样将MT-10822株的一白色菌耳植菌，在37℃温度下于300转/分转速培养20小时。在适当的离心管中分取1毫升该培养液后，离心分离(15000转/分×5分钟)该菌体。接着用碱SDS提取法调制该菌体的pPT-DBl质体DNA。
将pPT-DBl质体DNA 1微克作为模板进行两种类型的PCR反应。PCR反应1按照含序列表序列编号1记载的引物M13和引物M4(序列表的序列编号2记载的序列)各50mpol的全量(体积)50微升体系(组成根据工具箱中记载的条件)，热变性处理(98℃)15秒钟，退火(55℃)30秒钟，伸长反应(72℃)120秒钟条件进行，反复进行25个循环。按照含MUT4引物(序列表的序列编号3记载的序列)和M13引物-RV(序列表的序列编号4记载的序列)各50mpol的全量(体积)50微升体系(组成根据工具箱中记载的条件)，与PCR反应1进行同样的操作，进行PCR反应2。用PCR反应1和PCR反应2反应终了液各5微升，根据琼脂电泳(琼脂浓度1.0重量％)分析DNA增幅产物，可以确认DNA增幅产物的存在。用Microcon100(宝酒造社制)除去各个反应终了液中过剩的引物和dNTP后，加入TE调制各反应终了液的50微升溶液。调制含该TE溶液各0.5微升的全量(体积)47.5微升的退火溶液(组成根据工具箱记载的条件)，热变性处理(98℃)进行10分钟后，花费60分钟的一定速度进行冷却直到37℃，接着在37℃保持15分钟进行退火处理。向退火处理液加入TAKARALA T水溶液0.5微升，在72℃进行加热处理3分钟，完成杂(异)两个链。向这种溶液加入M13引物M4(序列表序列编号2记载的序列)和13引物-RV(序列表序列编号4记载的序列)各50pmol，使全量为(体积)50微升后，进行热变性(98℃)处理5秒钟，退火(55℃)处理30秒钟，伸长反应(72℃)120秒，将PCR反应3反复进行25个循环。用PCR反应3的反应终了液5微升的琼脂电游泳(使用シクマ社制Ⅶ型低融点琼脂；琼脂浓度0.8重量％)进行DNA增幅产物分析，可确认约2.0KbpDNA增幅产物的存在。接着，从琼脂凝胶切出约2.0kbp的DNA片段，细细地粉碎该琼脂片(约0.1克)，在1毫升的TE溶液中悬浊后，在55℃保温1小时，使琼脂完全融化。对该融化液用现有技术的通常方法苯酚/氯仿抽出，并用乙醇进行沉淀，精制该DNA片段，最终在10微升的TE中溶解。精制的约2.0kbp的DNA增幅片段用制限酶EcoRⅠ和HindⅢ切断后，对这种制限酶处理液用苯酚/氯仿抽出，并用乙醇进行沉淀，精制该DNA片段，最终在10毫升TE中溶解。同样，pPT-DBl上的唯一制限酶位置是用EcoRⅠ和HindⅢ切断pPT-DB1，进行琼脂凝胶的电泳(使用シクマ社制Ⅶ型低融点琼脂；琼脂浓度0.7重量％)，从琼脂凝胶切出约2.7kbp的DNA片段。细细地粉碎切出的琼脂片段，在1毫升TE溶液中悬浊后，在55℃保温1小时，使琼脂完全融化。对该融化液用苯酚/氯仿抽出，并用乙醇进行沉淀，精制该DNA片段，最终在10微升的TE中溶解。这样得到的增幅DNA产物和pPT-DBl片断用DNAライゲ-シ,ンキ,ト(宝酒造社制)连接后，形质转换大肠菌HB101的コンピテントセル(东洋纺绩社制)，调制大肠杆菌群。
在30毫升试管中调制含40微克/毫升的硫酸亚铁七水合物和10微克/毫升的氯化钴二水合物的10毫升LB液体培养基(下文称活性发现培养液)，在121℃温度用灭菌器灭菌20分钟。这种培养液的最终浓度100微克/毫升，添加氨苄青霉素后，用该大肠菌群任意选择的5个菌株各植菌一白色菌耳，于37℃温度300转/分下培养20小时。分取该培养终了液1毫升，离心分离(15000转/分×5分钟)菌体。该菌体在200微升的磷酸钾缓冲液(pH7.0)悬浊，向其中添加1重量％的丙烯腈，在10℃反应2分钟。向反应液中加入与其等量的1M磷酸水溶液终止反应，生成丙烯酰胺的浓度用与实施例2相同的HPLC分析测定。其结果，在5株中的4株检测出丙烯酰胺的生成，认为保持了腈类水合酶的活性。
用提供测定腈类水合酶活性的上述培养液的残余部分1毫升分别分离该4株的菌体，用碱SDS抽出法调制各株的质体DNA。接着用ABI社制的シ-クェンシンケキ,トとォ-トシ-クェンサ-373A的引物伸缩法确定各株的腈类水合酶构造遗传因子的碱基序列。其结果，表1示出了株1中的腈类水合酶的α亚单元编号6位的Leu被Met置换。
表1
接着，为了使α亚单元的126连接部分的Phe被Tyr置换，模板株1的质体DNA，按上述相同的操作进行部位特异的变异导入。
| 株编号 | 变异部位 | 氨基酸序列变化 | 碱基序列变化 | ||
| (α亚单元内) | 置换前 | 置换后 | 置换前 | 置换后 | |
| 1 | α-6连接部分 | Leu | Met | CTG | ATG |
即，在30毫升的试管内调制10毫升的LB流体培养基，在121℃温度用灭菌器灭菌20分钟。这种培养液的最终浓度100微克/毫升，添加氨苄青霉素后，将得到的克隆的株1植菌一白色菌耳，于37℃温度300转/分下培养20小时。分取该培养终了液1毫升，于适当的离心管中后，离心分离(15000转/分×5分钟)菌体。接着按碱SDS抽出法用该菌体调制克隆的株1的质体DNA。
模板该克隆的株1的质体DNA 1微克进行两种类型的PCR反应。PCR反应4按照含序列表序列编号5记载的引物M13和引物M4(序列表的序列编号2记载的序列)各50mpol的全量(体积)50微升体系(组成根据工具箱中记载的条件)，热变性处理(98℃)15秒钟，退火(55℃)30秒钟，伸长反应(72℃)120秒钟条件进行，PCR反应4反复进行25个循环。按照含MUT4引物(序列表的序列编号3记载的序列)和M13引物RV(序列表的序列编号4记载的序列)各50mpol的全量(体积)50微升体系(组成根据工具箱中记载的条件)，进行与PCR反应4同样的操作，进行PCR反应5。用PCR反应4和PCR反应5反应终了液各5微升的琼脂电泳(琼脂浓度1.0重量％)进行DNA增幅产物的分析，可以确认DNA增幅产物的存在。此后，用完全相同的操作调制克隆株l的大肠菌群。
该大肠菌群任意选择的5个菌株，在和克隆株1的情况和相同的活性发现培养基10毫升中各植菌一白色菌耳，在37℃于300转/分转速下培养约20小时。该培养终了液1毫升分别分取于适当的离心管后，测定腈类水合酶的活性。其结果，在5株中的4株中检测出丙烯酰胺的生成，确认保持了腈类水合酶的活性。
用提供测定腈类水合酶的活性的上述培养液的残余部分1毫升分别分离该4株的菌体，用碱SDS抽出法调制各克隆株的质体DNA。接着用与克隆株1的情况同样的操作决定克隆株腈类水合酶构造遗传因子的碱基序列。其结果，表2列出了株2中的腈类水合酶的α亚单元的6号位连接部分的Leu被Met置换，α亚单元的126连接部分的Phe被Tyr置换。
表2
接着，为了使β亚单元的212连接部分的Ser被Tyr置换，模板株2的质体DNA，用与上述相同的操作进行部位特异变异导入。
| 株编号 | 变异部位 | 氨基酸序列变化 | 碱基序列变化 | ||
| (α亚单元内) | 野生型 | 变异体 | 野生型 | 变异体 | |
| 2 | α-6连接部分α-126连接部分 | LeuPhe | MetTyr | CTGTTC | ATGYAC |
即，在30毫升的试管内调制10毫升的LB流体培养基，在121℃温度用灭菌器灭菌20分钟。这种培养液的最终浓度100微克/毫升，添加氨苄青霉素后，将得到的克隆的株2植菌一白色菌耳，于37℃温度300转/分下培养20小时。分取该培养终了液l毫升于适当的离心管中后，用离心分离(15000转/分×5分钟)菌体。接着，按碱SDS抽出法用该菌体调制克隆株1的质体DNA。
模板的该克隆的株2的质体DNA1微克进行两种类型的PCR反应。PCR反应6按照含序列表序列编号6记载的引物M13和引物M4(序列表编号2记载的序列)各50mpol的全量(体积)50微升体系(组成根据工具箱中记载的条件)，热变性处理(98℃)15秒钟，退火(55℃)30秒钟，伸长反应(72℃)120秒钟条件进行，PCR反应6反复进行25个循环。按照含MUT4引物(序列表的序列编号3记载的序列)和M13引物RV(序列表的序列编号4记载的序列)各50mpol的全量(体积)50微升体系(组成根据工具箱中记载的条件)，进行与PCR反应6同样的操作，进行PCR反应7。用PCR反应6和PCR反应7反应终了液各5微升的琼脂电泳(琼脂浓度1.0重量％)进行DNA增幅产物的分析，可以确认DNA增幅产物的存在。此后，按克隆株1的情况完全相同的操作调制大肠菌群。
该大肠菌群任意选择的5个菌株，在与克隆株1的情况的相同活性发现培养基10毫升中各植菌一白色菌耳，在37℃于300转/分转速下培养约20小时。该培养终了液1毫升分别分取于适当的离心管后，测定腈类水合酶的活性。其结果，在5株中的4株中检测出丙烯酰胺的生成，确认保持了腈类水合酶的活性。
用提供测定腈类水合酶的活性的上述培养液的残余部分1毫升分别分离该4株的菌体，按碱SDS抽出法调制各株的质体DNA。接着，用与克隆株的株1的情况同样的操作决定各克隆株腈类水合酶构造遗传因子的碱基序列。其结果，表3示出了株3中的腈类水合酶的β亚单元的212连接部分的Ser被Tyr置换。
表3
该克隆株3与实施例1同样培养，得到在反应中必要的菌体。
| 株编号 | 变异部位 | 氨基酸序列变化 | 碱基序列变化 | ||
| 野生型 | 变异体 | 野生型 | 变异体 | ||
| 3 | α-6连接部分α-126连接部分β-212连接部分 | LeuPheSer | MetTyrTyr | CTGTTCTCC | ATGTACTAC |
再者，得到的湿菌体1.5克在98.5克0.3mM的氢氧化钠水溶液中悬浊，向该悬浊液中总共添加60克的丙烯腈，在10℃搅拌并反应。从开始24小时后，按HPLC分析进行反应液的分析。其结果，在反应液中只有丙烯酰胺存在(浓度=50重量％)，认为没有丙烯腈。该反应的pH值是8.0。
用10％硫酸水溶液将该反应液的pH值调整为5，相对反应液添加2重量％的活性炭(三仓化成(株)制粉末状活性炭PM-SX)，在25℃温度下进行搅拌5小时，进行滤纸过滤。测定得到的滤液中蛋白质的除去率，除去率在99％以上。此外，该滤液10毫升加入甲醇100毫升也不白浊。认为全部是聚合物。
实施例4
对在实施例3中得到的水合反应液，除用10％的硫酸水溶液调整pH值为3外，进行与实施例1相同的处理得到滤液。测定滤液中蛋白质的除去率为75％。此外，向该滤液10毫升加入100毫升甲醇也不白浊，认为全部是聚合物。
比较例1
对在实施例3中得到的水合反应液，用10％的硫酸调整pH值为7外，进行与实施例1相同的处理得到滤液。滤液中的蛋白质除去率为25％。
发明的效果
以上的说明，特别是如上述的实施例和比较例表明的那样，按照本发明的方法，与现有技术中用活性炭精制的方法相比，在酸性条件下与活性炭接触，可以高效地进行酰胺化合物的精制。特别是，按照本发明的方法精制聚合的丙烯酰胺时，可以得到高分子量、保存稳定性优良且具有高水溶性的聚丙烯酰胺。「序列表」<110>Mitsui Chemicals Inc.<120>提纯酰胺化合物的方法<130>F-1892<150>JP2000-007993<151>2000-01-17<160>6<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1aacatcatgc gcaagtcg 18<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>2caggaaacag ctatgac 17<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ggccagtgcc tagcttacat 20<210>4<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>4gttttcccag tcacgac 17<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>5aactggtaca aggagccg 18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6ccgaactaca gcgtctac 18
Claims (16)
1．酰胺化合物的精制方法，其特征是在酸性条件下，使含酰胺化合物的溶液与活性炭相接触。
2．按权利要求1所述的精制方法，其特征是含酰胺化合物的溶液是由相应的腈类化合物水合反应得到的生成液。
3．按权利要求2所述的精制方法，其特征是酰胺化合物的碳原子数是2-20。
4．按权利要求3所述的精制方法，其特征是酰胺化合物中含有不饱和键。
5．按权利要求2或3所述的精制方法，其特征是酰胺化合物是用含有腈类水合酶的微生物菌体，或该微生物菌体的处理物按腈类化合物的水合反应制备的物质。
6．按权利要求5所述的精制方法，其特征是微生物菌体是在任意宿主中发现的微生物纯株培养的腈类水合酶遗传因子形质转换体。
7．按权利要求4所述的精制方法，其特征是酰胺化合物用含腈类水合酶的微生物菌体或该微生物菌体的处理物，按腈类化合物的水合反应制备。
8．按权利要求7所述的精制方法，其特征是微生物菌体是在任意宿主中发现的微生物纯株培养的腈类水合酶遗传因子形质转换体。
9．按权利要求7所述的精制方法，其特征是酰胺化合物是丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。
10．按权利要求8所述的精制方法，其特征是酰胺化合物是丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。
11．按权利要求9或10所述的精制方法，其特征是与活性炭相接触时，含酰胺化合物溶液的pH值为3.5-6.5。
12．按权利要求11所述的精制方法，其特征是用酸离解常数为3.5-5.5的有机酸或该有机酸和碱调节含酰胺化合物溶液的酸性。
13．按权利要求12所述的精制方法，其特征是有机酸是丙烯酸或甲基丙烯酸。
14．按权利要求13所述的精制方法，其特征是活性炭是以木质或棕榈壳作原料的活性炭。
15．按权利要求14所述的精制方法，其特征是与活性炭相接触时的温度为10-50℃。
16．按权利要求15所述的精制方法，其特征是含酰胺化合物的溶液与活性炭接触后，从含酰胺的溶液中分离活性炭，使分离出的溶液在饱和温度以下析出结晶。
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