JPS6115690A - 酵素固定樹脂組成物並びにその製造方法及び再生法 - Google Patents
酵素固定樹脂組成物並びにその製造方法及び再生法Info
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- JPS6115690A JPS6115690A JP13453484A JP13453484A JPS6115690A JP S6115690 A JPS6115690 A JP S6115690A JP 13453484 A JP13453484 A JP 13453484A JP 13453484 A JP13453484 A JP 13453484A JP S6115690 A JPS6115690 A JP S6115690A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵素固定樹脂組成物並びにその製造法及び再生
法に関する。本発明の酵素固定樹脂組成物は巨大網目構
造を有し、窒素を有するイオン交換基が活性水素を有し
ないスチレン−ジビニルベンゼン系塩基性イオン交換樹
脂のマクロポア内に多価アルデヒドでお互いに架橋され
た酵素を包含してなることを特徴とする。
法に関する。本発明の酵素固定樹脂組成物は巨大網目構
造を有し、窒素を有するイオン交換基が活性水素を有し
ないスチレン−ジビニルベンゼン系塩基性イオン交換樹
脂のマクロポア内に多価アルデヒドでお互いに架橋され
た酵素を包含してなることを特徴とする。
従来吸着法による固定化酵素の製造に際してはマクロ多
孔型又は巨大網目構造の陰又は陽イオン交換樹脂が用い
られているが次のごとき問題点がある。
孔型又は巨大網目構造の陰又は陽イオン交換樹脂が用い
られているが次のごとき問題点がある。
例えばポリフェノール系の弱塩基性陰イオン交換樹脂で
あるデュオライトΔ７を用いる方法（特開昭４９−８０
１６０）では吸着が強いので溶出し難く再生が困難であ
る。このためさらに親水性基を導入して疎水性に基づく
吸着を弱める工夫がなされているが（特開昭５３−８５
８９０＞十分でない。
あるデュオライトΔ７を用いる方法（特開昭４９−８０
１６０）では吸着が強いので溶出し難く再生が困難であ
る。このためさらに親水性基を導入して疎水性に基づく
吸着を弱める工夫がなされているが（特開昭５３−８５
８９０＞十分でない。
一方、スチレン−ジビニルベンゼン系の弱塩基性陰イオ
ン交換樹脂であるアンバーライトＩＲへ−９０４などを
用いる方法（特開昭５０−５３５８４＞では一般に酵素
の吸着がゆるく使用中に徐々に離脱し、又多糖類の優先
吸着が生ずる（特開昭５４−１４７９９２）。
ン交換樹脂であるアンバーライトＩＲへ−９０４などを
用いる方法（特開昭５０−５３５８４＞では一般に酵素
の吸着がゆるく使用中に徐々に離脱し、又多糖類の優先
吸着が生ずる（特開昭５４−１４７９９２）。
又固定化酵素を用いる連続反応では反応槽での雑菌汚染
が問題となることが多く、この対策として高基質濃度、
中高温度の条件設定が行われる。
が問題となることが多く、この対策として高基質濃度、
中高温度の条件設定が行われる。
しかしこの措置は同時に樹脂の劣化（例えば不可逆的に
吸着した多糖類等による基質と酵素との接触の妨害等）
をもたらすことが多い。
吸着した多糖類等による基質と酵素との接触の妨害等）
をもたらすことが多い。
上記事情にかんがみ本発明者らは樹脂の劣化が少なく、
可逆的吸着の容易なスチレン−ジビニルベンゼン系の塩
基性陰イオン交換樹脂を選び、吸着の弱い欠点を多価ア
ルデヒドによる架橋でカバーすることにより高基質濃度
、中高温度での連続使用に耐え、かつ再生使用の可能な
酵素固定樹脂組成物を得ることができることを見い出し
本発明を完成した。多価アルデヒドは酵素中の官能基、
特にアミノ基と化学結合することにより酵素を架橋する
。この観点から、樹脂中の窒素を有する官能基は活性水
素を有しないことが必要である。
可逆的吸着の容易なスチレン−ジビニルベンゼン系の塩
基性陰イオン交換樹脂を選び、吸着の弱い欠点を多価ア
ルデヒドによる架橋でカバーすることにより高基質濃度
、中高温度での連続使用に耐え、かつ再生使用の可能な
酵素固定樹脂組成物を得ることができることを見い出し
本発明を完成した。多価アルデヒドは酵素中の官能基、
特にアミノ基と化学結合することにより酵素を架橋する
。この観点から、樹脂中の窒素を有する官能基は活性水
素を有しないことが必要である。
次に本発明をさらに詳しく説明する。
巨大網目構造を有し、窒素を有するイオン交換基が活性
水素を有しないスチレン−ジビニルベンゼン系塩基性陰
イオン交換樹脂としては１００〜２０００人、特に２０
０〜１０００人の平均マクロポア半径及び０．１ｍｌ／
ｇ以上、特に０．２〜１．０ｍｌ／ｇのマクロポア容量
を有するもの、例えばアイマックＡ２０Ｓ、Δ２０Ｒ〔
デュオライトインターナショナル社（フランス）の商品
名〕、レバチッ）ＭＰ５００ＡＣバイエル社（西ドイツ
）の商品名〕、デュオライトＡ３７８．Ａ３６９． 八
３６ｇ Ｃダイヤモンド″ジャムロック社（アメリカ）
の商品名〕）ＩＰＡ７５．ＨＰＡ２５ Ｃ三菱化成工業
■の商品名〕等が好ましく使用される。
水素を有しないスチレン−ジビニルベンゼン系塩基性陰
イオン交換樹脂としては１００〜２０００人、特に２０
０〜１０００人の平均マクロポア半径及び０．１ｍｌ／
ｇ以上、特に０．２〜１．０ｍｌ／ｇのマクロポア容量
を有するもの、例えばアイマックＡ２０Ｓ、Δ２０Ｒ〔
デュオライトインターナショナル社（フランス）の商品
名〕、レバチッ）ＭＰ５００ＡＣバイエル社（西ドイツ
）の商品名〕、デュオライトＡ３７８．Ａ３６９． 八
３６ｇ Ｃダイヤモンド″ジャムロック社（アメリカ）
の商品名〕）ＩＰＡ７５．ＨＰＡ２５ Ｃ三菱化成工業
■の商品名〕等が好ましく使用される。
多価アルデヒドとしては特に限定はないが、炭素数２〜
１０の飽和脂肪族ジアルデヒドが好適に用いられる。例
えばグリオキサーノペマロンアルデヒド、スクシンアル
デヒド、グルクルアルデヒド、アジポアルデヒド等であ
る。
１０の飽和脂肪族ジアルデヒドが好適に用いられる。例
えばグリオキサーノペマロンアルデヒド、スクシンアル
デヒド、グルクルアルデヒド、アジポアルデヒド等であ
る。
本発明で使用する酵素としては特に限定はなく、酸化還
元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラ
ーゼ、リガーゼなどがあげられる。
元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラ
ーゼ、リガーゼなどがあげられる。
特にグルコースイソメラーセ、グルコアミラーゼ、フマ
ラーゼ、アスパルターゼ、リパーゼ、インベルターゼ、
プロテアーゼ、ウレアーゼ、アミノ酸オキシダー七等が
好適である。
ラーゼ、アスパルターゼ、リパーゼ、インベルターゼ、
プロテアーゼ、ウレアーゼ、アミノ酸オキシダー七等が
好適である。
次に本発明の酵素固定樹脂組成物の製造に？いて述べる
。本酵素固定樹脂組成物は巨大網目構成を有し、窒素を
有するイオン交換基が活性水素を有しないスチレン−ジ
ビニルベンゼン系塩基性陰イオン交換樹脂を酵素含有液
に接触させて該樹脂に酵素を吸着させ、ついで該樹脂を
該酵素の基質溶液に接触させ、さらに該樹脂を多価アル
デヒド溶液に接触させることにより得ることができる。
。本酵素固定樹脂組成物は巨大網目構成を有し、窒素を
有するイオン交換基が活性水素を有しないスチレン−ジ
ビニルベンゼン系塩基性陰イオン交換樹脂を酵素含有液
に接触させて該樹脂に酵素を吸着させ、ついで該樹脂を
該酵素の基質溶液に接触させ、さらに該樹脂を多価アル
デヒド溶液に接触させることにより得ることができる。
酵素含有液としては菌体破砕液もしくはその濾液、濾液
の硫安沈澱、溶媒沈澱により得た粗酵素の水又は緩衝液
溶液、該溶液をさらに透析したもの、精製酵素溶液など
が用いられる。
の硫安沈澱、溶媒沈澱により得た粗酵素の水又は緩衝液
溶液、該溶液をさらに透析したもの、精製酵素溶液など
が用いられる。
酵素溶液の濃度は蛋白として０．０１〜２００ｍｇ／ｌ
の範囲が適当である。
の範囲が適当である。
樹脂の使用量は吸着させる酵素量として規定でき、通常
０．１〜１００ｍｇ−蛋白／ｍｌ−樹脂の範囲が適当で
ある。
０．１〜１００ｍｇ−蛋白／ｍｌ−樹脂の範囲が適当で
ある。
酵素の吸着は通常ハツチ式で攪拌下０〜４０℃で３０分
〜７２時間行う。カラムに樹脂を充填して酵素溶液を通
塔して吸着させてもよい。
〜７２時間行う。カラムに樹脂を充填して酵素溶液を通
塔して吸着させてもよい。
ｐＨは酵素の安定ｐＨ域で行うが、ｐＨ調整は緩衝液に
よるのが好ましい。
よるのが好ましい。
ついで固液分離するか又はすることなく樹脂を該酵素の
基質溶液と接触させる。これは基質と活性中心とを一時
的に結合させて後の多価アルデヒド処理において活性中
心が影響を受けることを予防するためである。接触の方
式は酵素の吸着と同様バッチ式でもカラム式でもよい。
基質溶液と接触させる。これは基質と活性中心とを一時
的に結合させて後の多価アルデヒド処理において活性中
心が影響を受けることを予防するためである。接触の方
式は酵素の吸着と同様バッチ式でもカラム式でもよい。
基質としては各酵素の基質を用いればよく、例えばフマ
ラーゼではフマル酸、リンゴ酸、これらのナトリウム、
アンモニウム、カリウム塩等、グルコースイソメラーゼ
ではグルコース、フラクトース等、グルコアミラーゼで
は可溶性澱粉、マルトース、グルコース、マルトトリオ
ース等カ用いられる。基質溶液としては基質の水溶液、
緩衝溶液等を使用する。
ラーゼではフマル酸、リンゴ酸、これらのナトリウム、
アンモニウム、カリウム塩等、グルコースイソメラーゼ
ではグルコース、フラクトース等、グルコアミラーゼで
は可溶性澱粉、マルトース、グルコース、マルトトリオ
ース等カ用いられる。基質溶液としては基質の水溶液、
緩衝溶液等を使用する。
接触時の基質濃度は０．１ｍＭ〜１．ＯＭとし、基質が
電解質である場合はそれによる酵素の脱着を防ぐため０
，２Ｍ以下とするのが好ましい。
電解質である場合はそれによる酵素の脱着を防ぐため０
，２Ｍ以下とするのが好ましい。
基質の使用量は多価アルデヒドと競争して活性中心を保
護する目的に照らして多価アルデヒドを基準にその１０
〜１０００倍モル程度とするのが適当である。
護する目的に照らして多価アルデヒドを基準にその１０
〜１０００倍モル程度とするのが適当である。
処理温度、ｐＨは酵素の吸着の場合と同様でよく、時間
は基質および多価アルデヒドの量により１０分〜１０時
間程度変わりうるが通常３０〜６０分である。
は基質および多価アルデヒドの量により１０分〜１０時
間程度変わりうるが通常３０〜６０分である。
次に固液分離することなく混合物を多価アルデヒド溶液
と接触させる。接触方式は基質処理の場合と同様でよい
。多価アルデヒド溶液としては通常多価アルデヒドの水
溶液、水に難溶性の場合はメタノーノペエタノール溶液
等を用い、接触時の濃度は１〜１００ｍＭとするのが適
当である。
と接触させる。接触方式は基質処理の場合と同様でよい
。多価アルデヒド溶液としては通常多価アルデヒドの水
溶液、水に難溶性の場合はメタノーノペエタノール溶液
等を用い、接触時の濃度は１〜１００ｍＭとするのが適
当である。
多価アルデヒドの使用量は酵素に対して蛋白１ｍｇ当り
０．００．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲で用いる。
０．００．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲で用いる。
多価アルデヒド処理は通常Ｏ〜４０℃で１分〜４８時間
行う。又ｐＨは緩衝液等を用いて酵素の安定領域で一定
にコントロールするのが好ましい。
行う。又ｐＨは緩衝液等を用いて酵素の安定領域で一定
にコントロールするのが好ましい。
多価アルデヒド処理後、緩衝液又は水、メタノール、エ
タノール等にて洗浄して未反応の多価アルデヒド、未反
応の蛋白等を除き酵素固定樹脂組成物を得る。
タノール等にて洗浄して未反応の多価アルデヒド、未反
応の蛋白等を除き酵素固定樹脂組成物を得る。
本酵素固定樹脂組成物は活性発現が良好で副反応を実際
上伴わない。また耐熱性の向上が認められ、例えば４０
〜７０℃での長期連続使用でも活性を維持し得る。
上伴わない。また耐熱性の向上が認められ、例えば４０
〜７０℃での長期連続使用でも活性を維持し得る。
又一定期間使用し劣化した酵素固定樹脂組成物を０．２
〜５Ｍの塩を含有する鉱酸水溶液に接触させることによ
り、多価アルデヒドによる架橋を切り離し酵素を脱着し
て樹脂を再生することができる。
〜５Ｍの塩を含有する鉱酸水溶液に接触させることによ
り、多価アルデヒドによる架橋を切り離し酵素を脱着し
て樹脂を再生することができる。
塩としては強酸の強アルカリ塩もしくは弱アルカリ塩、
特に強アルカリ塩が好ましい。例えば硫酸、塩酸、リン
酸等のアルカリ金属塩（塩化ナトリウム、硫酸ナトリウ
ム等）、アルカリ土金属塩（塩化カルシウム等）、アン
モニウム塩（塩化アンモニウム等）が用いられる。
特に強アルカリ塩が好ましい。例えば硫酸、塩酸、リン
酸等のアルカリ金属塩（塩化ナトリウム、硫酸ナトリウ
ム等）、アルカリ土金属塩（塩化カルシウム等）、アン
モニウム塩（塩化アンモニウム等）が用いられる。
鉱酸としては硫酸、塩酸、リン酸等が用いられる。
接触の態様としてはバッチ式で攪拌する、カラムに充填
した樹脂組成物に再生液を通塔する等が適用される。
した樹脂組成物に再生液を通塔する等が適用される。
接触時の操作条件は鉱酸、濃度０．５〜６規定、４０〜
９５℃が適当である。
９５℃が適当である。
再生樹脂に再び前記と同様の酵素固定化操作を施すこと
により酵素固定樹脂組成物を得ることができ、このもの
の活性、特性は新樹脂使用の場合とほぼ同様の水準を維
持している。さらに２回、３回の再生、再使用について
も同様の条件の特性を維持できる。
により酵素固定樹脂組成物を得ることができ、このもの
の活性、特性は新樹脂使用の場合とほぼ同様の水準を維
持している。さらに２回、３回の再生、再使用について
も同様の条件の特性を維持できる。
担体の再生、再使用については電解質塩水溶液処理及び
酸処理による方法があるが（特開昭５ｌ−７０８７１）
、架橋を切って再生するには塩含有鉱酸水溶液によるこ
とを要し、本発明の再生方法は上記特開昭の方法とは根
本的に相違する。
酸処理による方法があるが（特開昭５ｌ−７０８７１）
、架橋を切って再生するには塩含有鉱酸水溶液によるこ
とを要し、本発明の再生方法は上記特開昭の方法とは根
本的に相違する。
以下実施例をもって本発明を説明する。
実施例１゜
グルコース１０％、リン酸−カリウム０．５％、尿素０
．６％、硫酸マグネシウム（７水塩）０．０５％、ヘフ
トン２％、肉エキス０．０・５％、ビオチン５０ ｒ／
Ｉｌを含む培地３０ Ｑｍｌを２００ Ｑｍｌ容三角フ
ラスコに入れフマラーゼ産生菌コリネバクテリウム・グ
ルクミカムＡＴ、ＣＣ２１５１３を接種して培養温度３
０℃で４８時間振盪培養を行う。
．６％、硫酸マグネシウム（７水塩）０．０５％、ヘフ
トン２％、肉エキス０．０・５％、ビオチン５０ ｒ／
Ｉｌを含む培地３０ Ｑｍｌを２００ Ｑｍｌ容三角フ
ラスコに入れフマラーゼ産生菌コリネバクテリウム・グ
ルクミカムＡＴ、ＣＣ２１５１３を接種して培養温度３
０℃で４８時間振盪培養を行う。
培養液から菌体を集菌、洗浄し、凍結乾燥後９ｇの菌体
を１尋る。、菌体を５０ｇ／βの濃度に０．１ Ｍリン
酸緩衝液（ｐ Ｈ６，０）に分散し、超音波処理を行う
。
を１尋る。、菌体を５０ｇ／βの濃度に０．１ Ｍリン
酸緩衝液（ｐ Ｈ６，０）に分散し、超音波処理を行う
。
担体としては、本発明にがかる担体としてアイマックＡ
２Ｏ３（デュオライト・インターナンヨナル社、フラン
ス）、対照としてデュオライト八６（ダイヤモンドシャ
ムロツタ社、アメリカ）を用いる。いずれの担体につい
てもレジン水にて充分洗浄後、０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐ）１６．０）で緩衝化する。次に上記で調製した粗酵
素懸濁液を活性値として２００Ｕ／ｍｌ樹脂の割合で室
温にて１６時間接触させる。蛋白の吸着量はいずれも９
０％以上である。その後、酵素の安定化剤として０．１
Ｍフマール酸ナナトリウム水溶液樹脂と同量加える。上
清液を抜き取った後樹脂と同量の０．２％グルタルアル
デヒド水溶液を樹脂に加え室温３０分間反応させる。樹
脂を充分洗浄後固定化酵素担体Ａ（アイマックＡ２０３
）、Ｂ（デュオライト八６）を得る。この固定化酵素を
１０ｍ１容量のジャケット付カラムに充填し５０℃流速
Ｓ■−０，３（供給容量／担体容量ｈｒ）でＩＭフマー
ル酸す） ＩＪウム水溶液を通塔する。担体Ａで約８０
％、担体Ｂで約７８％のリンゴ酸への転換率が２０日間
にわたって得られ、連続生産が可能である。
２Ｏ３（デュオライト・インターナンヨナル社、フラン
ス）、対照としてデュオライト八６（ダイヤモンドシャ
ムロツタ社、アメリカ）を用いる。いずれの担体につい
てもレジン水にて充分洗浄後、０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐ）１６．０）で緩衝化する。次に上記で調製した粗酵
素懸濁液を活性値として２００Ｕ／ｍｌ樹脂の割合で室
温にて１６時間接触させる。蛋白の吸着量はいずれも９
０％以上である。その後、酵素の安定化剤として０．１
Ｍフマール酸ナナトリウム水溶液樹脂と同量加える。上
清液を抜き取った後樹脂と同量の０．２％グルタルアル
デヒド水溶液を樹脂に加え室温３０分間反応させる。樹
脂を充分洗浄後固定化酵素担体Ａ（アイマックＡ２０３
）、Ｂ（デュオライト八６）を得る。この固定化酵素を
１０ｍ１容量のジャケット付カラムに充填し５０℃流速
Ｓ■−０，３（供給容量／担体容量ｈｒ）でＩＭフマー
ル酸す） ＩＪウム水溶液を通塔する。担体Ａで約８０
％、担体Ｂで約７８％のリンゴ酸への転換率が２０日間
にわたって得られ、連続生産が可能である。
実施例２゜
実施例１の担体を更に１力月運転を続けると転換率は担
体Δで約７８％、同Ｂで約７５％に低下するが、雑菌の
汚染は全くない。更に、樹脂をカラムより抜き取り０，
５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．５Ｎ硫酸を加え７０℃
に加熱し、２時間保持する。樹脂をレジン水で洗浄後、
再び実施例１と同じ方法で酵素固定化を試みる。粗酵素
懸濁液を実施例１と同様に調製し、２００Ｕ／ｍｌ樹脂
の割合で酵素液と吸着させる。蛋白の吸着量はＡ担体で
９０％、Ｂ担体で４０％である。同様にフマール酸ナト
リウム溶液を加え実施例１と同様にグルタルアルデヒド
を用いて架橋固定化する。充分洗浄した固定化酵素担体
Ａ及びＢをそれぞれｌ ９ｍｌカラムに充填し、５Ｖ＝
０．３でＩＭフマール酸ナナトリウム水溶液通塔する。
体Δで約７８％、同Ｂで約７５％に低下するが、雑菌の
汚染は全くない。更に、樹脂をカラムより抜き取り０，
５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．５Ｎ硫酸を加え７０℃
に加熱し、２時間保持する。樹脂をレジン水で洗浄後、
再び実施例１と同じ方法で酵素固定化を試みる。粗酵素
懸濁液を実施例１と同様に調製し、２００Ｕ／ｍｌ樹脂
の割合で酵素液と吸着させる。蛋白の吸着量はＡ担体で
９０％、Ｂ担体で４０％である。同様にフマール酸ナト
リウム溶液を加え実施例１と同様にグルタルアルデヒド
を用いて架橋固定化する。充分洗浄した固定化酵素担体
Ａ及びＢをそれぞれｌ ９ｍｌカラムに充填し、５Ｖ＝
０．３でＩＭフマール酸ナナトリウム水溶液通塔する。
流出液のリンゴ酸への転換率は担体Δで２０日間８０％
が維持でき、担体Ｂでは１日目２５％、１００日目１５
．２００回目１１％と急速に低下する。
が維持でき、担体Ｂでは１日目２５％、１００日目１５
．２００回目１１％と急速に低下する。
更に、固定か酵素担体Ａの再生・再使用をくり返す場合
、２回目、３回目の再使用においても流出液のリンゴ酸
への転化率は２０日間８０％を維持できる。
、２回目、３回目の再使用においても流出液のリンゴ酸
への転化率は２０日間８０％を維持できる。
実施例３゜
ストレプトマイセス・フェオクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）
Ｉ Ｆ Ｏ３１０５含水菌体２５ｇをｐＨ８，０，０
２Ｍリン酸緩衝液中で自己消化させたのち、濾過してグ
ルコースイソメラーゼ酵素液を得る。
ｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）
Ｉ Ｆ Ｏ３１０５含水菌体２５ｇをｐＨ８，０，０
２Ｍリン酸緩衝液中で自己消化させたのち、濾過してグ
ルコースイソメラーゼ酵素液を得る。
ｐＨ８に緩衝化したデュオライトＡ３７８ （ダイヤモ
ンド・ンヤムロック社、アメリカ）を酵素液に懸濁させ
ｐＨ８，２に調整したのち、約１６時間室温でゆるやか
に攪拌する。ついで上清を除きグルコース１％水溶液を
５０ｍ１加え１０分ゆるく攪拌後上浦を抜き去り、０．
２％グルクルアルデヒド水溶液５０ｍ１を加え室温にて
３０分間ゆるく攪拌し、架橋を行う。
ンド・ンヤムロック社、アメリカ）を酵素液に懸濁させ
ｐＨ８，２に調整したのち、約１６時間室温でゆるやか
に攪拌する。ついで上清を除きグルコース１％水溶液を
５０ｍ１加え１０分ゆるく攪拌後上浦を抜き去り、０．
２％グルクルアルデヒド水溶液５０ｍ１を加え室温にて
３０分間ゆるく攪拌し、架橋を行う。
樹脂をカラムに移してよく水洗した後、この不溶性酵素
カラムにＭｇＳＯ４０，０５Ｍ、ＣｏＣｌ１゜５Ｘ１０
−’Ｍ含んだぶどう糖０．５Ｍ液を６０℃で１時間に５
００ｍ１ （ＳＶ−１０）（’）速度で通液する。流出
液の果糖（システィンカルバゾール法）は３０ｍｇ／ｍ
ｌである。
カラムにＭｇＳＯ４０，０５Ｍ、ＣｏＣｌ１゜５Ｘ１０
−’Ｍ含んだぶどう糖０．５Ｍ液を６０℃で１時間に５
００ｍ１ （ＳＶ−１０）（’）速度で通液する。流出
液の果糖（システィンカルバゾール法）は３０ｍｇ／ｍ
ｌである。
５Ｖ＝４にて通塔した場合果糖は４６ｍｇ／ｍ＋、ぶど
う糖（グルコースオキシダーゼ法）は４４ｍｇ／ｍｌと
５１％の異性化率が得られる。更に糖液を５Ｖ−４にて
２０日間連続通塔する。異性化率は２０日後で４９％で
ある。ここで樹脂をカラムより抜き出し、よく水洗した
後０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５ Ｎ硫酸を加え
７０℃に加熱し、２時間保持する。樹脂を洗浄後、最初
の固定化上同様に再固定化を試みた。同様に固定化した
担体に５ｖ−１０で通塔した流出液の果糖は３１＋ｎｇ
／ｍｌであり新しい樹脂と同等の活性発現が認められる
。
う糖（グルコースオキシダーゼ法）は４４ｍｇ／ｍｌと
５１％の異性化率が得られる。更に糖液を５Ｖ−４にて
２０日間連続通塔する。異性化率は２０日後で４９％で
ある。ここで樹脂をカラムより抜き出し、よく水洗した
後０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５ Ｎ硫酸を加え
７０℃に加熱し、２時間保持する。樹脂を洗浄後、最初
の固定化上同様に再固定化を試みた。同様に固定化した
担体に５ｖ−１０で通塔した流出液の果糖は３１＋ｎｇ
／ｍｌであり新しい樹脂と同等の活性発現が認められる
。
実施例４゜
グルコアミラーゼ（長潮産業■製）をｐ Ｈ４，５の０
．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解して、１ｍｌあたり酵素を蛋白
として１！ｍｇ含有する溶液を調製する。練液１０ｍ１
をＨＰＡ７５樹脂（三菱化成工業＠）５ｍｌに加えて３
７℃の恒温槽で１６時間振盪すると樹脂１ｍｌ当り２２
ｍｇの蛋白が吸着される。
．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解して、１ｍｌあたり酵素を蛋白
として１！ｍｇ含有する溶液を調製する。練液１０ｍ１
をＨＰＡ７５樹脂（三菱化成工業＠）５ｍｌに加えて３
７℃の恒温槽で１６時間振盪すると樹脂１ｍｌ当り２２
ｍｇの蛋白が吸着される。
更に、樹脂を洗浄後、上清を除き可溶性デンプン１％水
溶液５ｍｌを加えゆるく攪拌後上清を抜き取す、ついで
０．２％グルタルアルデヒド水溶液５ｍｌを加え室温に
て３０分間ゆるく攪拌し架橋を行う。
溶液５ｍｌを加えゆるく攪拌後上清を抜き取す、ついで
０．２％グルタルアルデヒド水溶液５ｍｌを加え室温に
て３０分間ゆるく攪拌し架橋を行う。
樹脂カラムに移してよく水洗した後、この不溶性酵素カ
ラムに可溶性デンプン１０％水溶液をＳ Ｖ−Ｌ、 ０
１５０℃にて通塔する。通塔液のグルコース濃度は３日
目８５ｇ／ＬＩＯ日目８３ｇ／βである。更に５０日通
塔するとグルコース濃度は８０ｇ＃と若干低下するが雑
菌汚染は顕著には認必られない。更にこの樹脂を抜き取
り、水洗した後０．５ Ｍ塩化す） ＩＪウムを含む０
．５Ｎ硫酸を加え７０℃に加熱し、２時間保持する。樹
脂を洗浄後、新樹脂と同様に扱い再固定化を行う。得ら
れる樹脂をカラムに移してこの不溶性酵素カラムに可溶
性デンプン１０％水溶液をＳ Ｖ ＝ １．０．５０℃
にて通塔する。通塔液のグルコース濃度は３日目８５ｇ
／４２．１００日目８３／、ｆ４である。
ラムに可溶性デンプン１０％水溶液をＳ Ｖ−Ｌ、 ０
１５０℃にて通塔する。通塔液のグルコース濃度は３日
目８５ｇ／ＬＩＯ日目８３ｇ／βである。更に５０日通
塔するとグルコース濃度は８０ｇ＃と若干低下するが雑
菌汚染は顕著には認必られない。更にこの樹脂を抜き取
り、水洗した後０．５ Ｍ塩化す） ＩＪウムを含む０
．５Ｎ硫酸を加え７０℃に加熱し、２時間保持する。樹
脂を洗浄後、新樹脂と同様に扱い再固定化を行う。得ら
れる樹脂をカラムに移してこの不溶性酵素カラムに可溶
性デンプン１０％水溶液をＳ Ｖ ＝ １．０．５０℃
にて通塔する。通塔液のグルコース濃度は３日目８５ｇ
／４２．１００日目８３／、ｆ４である。
対照としてデュオライ）Ａ７樹脂を用いて前述の固定化
を試みる。得られる酵素固定樹脂をカラムにつめ可溶性
デンプン１０％水溶液をＳ Ｖ−１，０，５０℃にて通
塔する。通塔液のグルコース濃度は３日目８０ｇ／Ｒ１
１０日目７８ｇ／βである。
を試みる。得られる酵素固定樹脂をカラムにつめ可溶性
デンプン１０％水溶液をＳ Ｖ−１，０，５０℃にて通
塔する。通塔液のグルコース濃度は３日目８０ｇ／Ｒ１
１０日目７８ｇ／βである。
更に２０日後には４０ｇ／βまてに低下する。ついで前
述の実施例と同様に再生、再固定化を行う。
述の実施例と同様に再生、再固定化を行う。
再固定化担体を用いた通塔液のグルコース濃度は３日目
３０ｇ／β、１００日目２５／ｊ！と再生イ吏用には充
分な結果が得られない。また新たにデュオライ）Ａ７酵
素固定化樹脂を上と同様に調製し、可溶性デンプン１０
％水溶液を５Ｖ−１，０，４０℃にて通塔する。この場
合には雑菌汚染が徐々に進行し、グルコース濃度は３日
目にて７５ｇ／β、１００日目は６０ｇ／βと低下する
。これはアイフックＡ２０ＳＵ樹脂でも全く同様である
。
３０ｇ／β、１００日目２５／ｊ！と再生イ吏用には充
分な結果が得られない。また新たにデュオライ）Ａ７酵
素固定化樹脂を上と同様に調製し、可溶性デンプン１０
％水溶液を５Ｖ−１，０，４０℃にて通塔する。この場
合には雑菌汚染が徐々に進行し、グルコース濃度は３日
目にて７５ｇ／β、１００日目は６０ｇ／βと低下する
。これはアイフックＡ２０ＳＵ樹脂でも全く同様である
。
更にデュオライトΔ７樹脂を用いるグルタルアルデヒド
を用いない固定化法と比較する。デュオライ）Ａ７樹脂
１０ｍ１をグルコアミラーゼ溶液（前述の蛋白として１
４ｍｇ／ｍｌ濃度に０．１ Ｍ ｐＨ４５酢酸緩衝液を
用いて調製したもの）２０ｍｌと混合し、３７℃に１６
時間振盪固定化する。蛋白は２３ｍｇが吸着される。樹
脂を各５ｍｌずつ２本のカラムにつめ洗浄後、この不溶
性酵素カラムに可溶性デンプン１０％水溶液を５Ｖ−１
，０にて通塔する。１本のカラムでは温度を５０℃（実
験Ａ）に、他方は４０℃（実験Ｂ）に保持する。実験Δ
では流出液のグルコース濃度は３日目７８ｇ／β、１０
０日目６５＃！と活性低下が大きい。実験Ｂでの流出液
のグルコース濃度は３日目７３ｇ／Ａ’、１００日目５
８／βと低下し雑菌汚染が認められる。
を用いない固定化法と比較する。デュオライ）Ａ７樹脂
１０ｍ１をグルコアミラーゼ溶液（前述の蛋白として１
４ｍｇ／ｍｌ濃度に０．１ Ｍ ｐＨ４５酢酸緩衝液を
用いて調製したもの）２０ｍｌと混合し、３７℃に１６
時間振盪固定化する。蛋白は２３ｍｇが吸着される。樹
脂を各５ｍｌずつ２本のカラムにつめ洗浄後、この不溶
性酵素カラムに可溶性デンプン１０％水溶液を５Ｖ−１
，０にて通塔する。１本のカラムでは温度を５０℃（実
験Ａ）に、他方は４０℃（実験Ｂ）に保持する。実験Δ
では流出液のグルコース濃度は３日目７８ｇ／β、１０
０日目６５＃！と活性低下が大きい。実験Ｂでの流出液
のグルコース濃度は３日目７３ｇ／Ａ’、１００日目５
８／βと低下し雑菌汚染が認められる。
いずれの担体（実験Ａ及びＢ）についても再生再固定化
を試みる。再生条件は０．５Ｍ塩化す） ＩＪウムを含
む０．５Ｎ硫酸中で７０℃に加熱する方法（実験Ａ−１
，Ｂ−１）、４Ｎ苛性ソーダを用い６０℃に加熱する方
法（実験Ａ−２，Ｂ−２）を比較する。再生した樹脂を
用い最初の固定化と同様に行う。蛋白の吸着量はＡ−１
１Ｑｍｇ、 Ｂ−１１０ｍｇ、 Ａ−２１５ｍｇ、 Ｂ
−２１３ｎ＋ｇと初回に比べて吸着能は低下し、樹脂を
カラムに充填し、１０％可溶性デンプン水溶液を４０℃
、Ｓ Ｖ−１，０にて通路すると流出液のグルコース濃
度は３日目にてＡ−１２０ｍｇ／ｍｌ、Ｂ−１１８ｍｇ
／ｍｌ、Ａ−２２５ｍｇ／ｍｌ、Ｂ−２２０ｍｇ／ｍ１
にすぎない。
を試みる。再生条件は０．５Ｍ塩化す） ＩＪウムを含
む０．５Ｎ硫酸中で７０℃に加熱する方法（実験Ａ−１
，Ｂ−１）、４Ｎ苛性ソーダを用い６０℃に加熱する方
法（実験Ａ−２，Ｂ−２）を比較する。再生した樹脂を
用い最初の固定化と同様に行う。蛋白の吸着量はＡ−１
１Ｑｍｇ、 Ｂ−１１０ｍｇ、 Ａ−２１５ｍｇ、 Ｂ
−２１３ｎ＋ｇと初回に比べて吸着能は低下し、樹脂を
カラムに充填し、１０％可溶性デンプン水溶液を４０℃
、Ｓ Ｖ−１，０にて通路すると流出液のグルコース濃
度は３日目にてＡ−１２０ｍｇ／ｍｌ、Ｂ−１１８ｍｇ
／ｍｌ、Ａ−２２５ｍｇ／ｍｌ、Ｂ−２２０ｍｇ／ｍ１
にすぎない。
実施例５゜
アイマックＡ２Ｏ３の代わりにレノ＼チットＭＰ５００
Ａを用いて実施例１と同様の操作をくり返す場合、同様
の結果が得られる。
Ａを用いて実施例１と同様の操作をくり返す場合、同様
の結果が得られる。
特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社Ｘ〜−一
Claims (9)
- （１）巨大網目構造を有し、窒素を有するイオン交換基
が活性水素を有しないスチレン−ジビニルベンゼン系塩
基性陰イオン交換樹脂のマクロポア内に多価アルデヒド
でお互いに架橋された酵素を包含してなる酵素固定樹脂
組成物。 - （２）該樹脂が１００−２０００Åの平均マクロポア半
径及び０．１ｍｌ／ｇ以上のマクロポア容量を有するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の酵素固定樹
脂組成物。 - （３）該樹脂が２００−１０００Åの平均マクロポア半
径及び０．２−１．０ｍｌ／ｇのマクロポア容量を有す
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の酵素固
定樹脂組成物。 - （４）該樹脂がアイマックＡ２０Ｓ、Ａ２０Ｒ、デュオ
ライトＡ３７８、Ａ３６９、Ａ３６８、レバチットＭＰ
５００Ａ、ダイアイオンＨＰＡ７５、ＨＰＡ２５より選
ばれる特許請求の範囲第１項記載の酵素固定樹脂組成物
。 - （５）多価アルデヒドが炭素数２−１０の飽和脂肪族ジ
アルデヒドである特許請求の範囲第１項記載の酵素固定
樹脂組成物。 - （６）該酵素が酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素
、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼより選ばれる特
許請求の範囲第１項記載の酵素固定樹脂組成物。 - （７）該酵素がグルコースイソメラーゼ、グルコアミラ
ーゼ、フマラーゼ、アスパルターゼ、リパーゼ、インベ
ルターゼ、プロテアーゼ、ウレアーゼ及びアミノ酸オキ
シダーゼより選ばれる特許請求の範囲第６項記載の酵素
固定樹脂組成物。 - （８）巨大網目構造を有し、窒素を有するイオン交換基
が活性水素を有しないスチレン−ジビニルベンゼン系塩
基性陰イオン交換樹脂を酵素含有液に接触させて該樹脂
に酵素を吸着させ、ついで該樹脂を該酵素の基質溶液に
接触させ、さらに該樹脂を多価アルデヒド溶液に接触さ
せることを特徴とする酵素固定樹脂組成物の製造法。 - （９）巨大網目構造を有し、窒素を有するイオン交換基
が活性水素を有しないスチレン−ジビニルベンゼン系塩
基性陰イオン交換樹脂のマクロポア内に多価アルデヒド
でお互いに架橋された酵素を包含してなる酵素固定樹脂
組成物を一定期間使用後０．２−５Ｍの塩を含有する鉱
酸水溶液に接触させることを特徴とする酵素固定樹脂組
生物の再生法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13453484A JPS6115690A (ja) | 1984-06-29 | 1984-06-29 | 酵素固定樹脂組成物並びにその製造方法及び再生法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13453484A JPS6115690A (ja) | 1984-06-29 | 1984-06-29 | 酵素固定樹脂組成物並びにその製造方法及び再生法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6115690A true JPS6115690A (ja) | 1986-01-23 |
Family
ID=15130563
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13453484A Pending JPS6115690A (ja) | 1984-06-29 | 1984-06-29 | 酵素固定樹脂組成物並びにその製造方法及び再生法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6115690A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6014067A (en) * | 1992-01-22 | 2000-01-11 | Murata Manufacturing Co., Ltd. | Dielectric resonator filter having a portion of the outer surface closer to the resonators |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5325029A (en) * | 1976-08-19 | 1978-03-08 | Takashi Miura | Veranda |
| JPS5736986A (en) * | 1980-08-13 | 1982-02-27 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | Immobilized aminoacylase agent and its preparation |
| JPS5860986A (ja) * | 1981-10-05 | 1983-04-11 | Yakult Honsha Co Ltd | 新規制限酵素及びその製造法 |
-
1984
- 1984-06-29 JP JP13453484A patent/JPS6115690A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5325029A (en) * | 1976-08-19 | 1978-03-08 | Takashi Miura | Veranda |
| JPS5736986A (en) * | 1980-08-13 | 1982-02-27 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | Immobilized aminoacylase agent and its preparation |
| JPS5860986A (ja) * | 1981-10-05 | 1983-04-11 | Yakult Honsha Co Ltd | 新規制限酵素及びその製造法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6014067A (en) * | 1992-01-22 | 2000-01-11 | Murata Manufacturing Co., Ltd. | Dielectric resonator filter having a portion of the outer surface closer to the resonators |
| US6078230A (en) * | 1992-01-22 | 2000-06-20 | Murata Manufacturing Co., Ltd. | Characteristic adjusting method for dielectric filter using a grinding tool |
| US6087910A (en) * | 1992-01-22 | 2000-07-11 | Murata Manufacturing Co., Ltd. | Dielectric filter having stepped resonators with non-conductive gap |
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