JP2001161371A - アデノウイルス血清型別検出用プライマー - Google Patents
アデノウイルス血清型別検出用プライマーInfo
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- JP2001161371A JP2001161371A JP34998299A JP34998299A JP2001161371A JP 2001161371 A JP2001161371 A JP 2001161371A JP 34998299 A JP34998299 A JP 34998299A JP 34998299 A JP34998299 A JP 34998299A JP 2001161371 A JP2001161371 A JP 2001161371A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】 特定の塩基配列又は該塩基配列に相補的
な配列を有するアデノウイルス血清型別検出用プライマ
ー、並びにこれを用いたアデノウイルス血清型別検出方
法及び検出用試薬。 【効果】 血清型別検出、判定が迅速、簡便かつ正確に
できる。
な配列を有するアデノウイルス血清型別検出用プライマ
ー、並びにこれを用いたアデノウイルス血清型別検出方
法及び検出用試薬。 【効果】 血清型別検出、判定が迅速、簡便かつ正確に
できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アデノウイルスの
血清型別検出、同定に有用なＤＮＡプライマー並びにこ
れを用いた当該血清型別検出方法及び検出用試薬に関す
る。
血清型別検出、同定に有用なＤＮＡプライマー並びにこ
れを用いた当該血清型別検出方法及び検出用試薬に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ヒトアデノウイルスは、血清型から４９
種に、また遺伝子相補性から６つの亜型に分類されてい
る。このウイルスは、上気道感染症、下気道感染症、胃
腸炎、急性出血性膀胱炎、流行性角結膜炎等多臓器感染
症としてしばしば大流行を起こす。また、院内感染の起
因ウイルスとしても重要なものといわれている。しか
し、このような疾患は、様々な原因が考えられ、臨床症
状からアデノウイルスによって引き起こされていると診
断することは非常に困難である。そこで、迅速にかつ簡
便にアデノウイルスの検出及び同定をすることは臨床的
に重要である。
種に、また遺伝子相補性から６つの亜型に分類されてい
る。このウイルスは、上気道感染症、下気道感染症、胃
腸炎、急性出血性膀胱炎、流行性角結膜炎等多臓器感染
症としてしばしば大流行を起こす。また、院内感染の起
因ウイルスとしても重要なものといわれている。しか
し、このような疾患は、様々な原因が考えられ、臨床症
状からアデノウイルスによって引き起こされていると診
断することは非常に困難である。そこで、迅速にかつ簡
便にアデノウイルスの検出及び同定をすることは臨床的
に重要である。
【０００３】これまでのアデノウイルスの検出及び型判
定は、ウイルス分離法が主であった。しかし、ウイルス
分離法は、時間がかかり、かつ分離されない例も少なく
ない。近年、技術の進歩に伴い様々な検体からアデノウ
イルスをＰＣＲ(PolymeraseChain Reaction) 法によっ
て検出、更に同定する方法が開発された。この同定法は
ウイルスＤＮＡをＰＣＲによってその遺伝子を増幅後、
制限酵素で切断し、アクリルアミドゲル上で電気泳動
し、その切断パターンからウイルスの型を判定するもの
である。
定は、ウイルス分離法が主であった。しかし、ウイルス
分離法は、時間がかかり、かつ分離されない例も少なく
ない。近年、技術の進歩に伴い様々な検体からアデノウ
イルスをＰＣＲ(PolymeraseChain Reaction) 法によっ
て検出、更に同定する方法が開発された。この同定法は
ウイルスＤＮＡをＰＣＲによってその遺伝子を増幅後、
制限酵素で切断し、アクリルアミドゲル上で電気泳動
し、その切断パターンからウイルスの型を判定するもの
である。
【０００４】しかしながら、従来用いられているプライ
マーはアデノウイルスの血清型に対する特異性が低く、
特に院内感染による肺炎等急激な全身症状により重篤な
症状をもたらすとされるアデノウイルス７型や、急性出
血性膀胱炎の原因ウイルスとして臓器あるいは骨髄移植
時に問題となっているアデノウイルス１１型に対しては
特異性の高いプライマーが見出されていない。
マーはアデノウイルスの血清型に対する特異性が低く、
特に院内感染による肺炎等急激な全身症状により重篤な
症状をもたらすとされるアデノウイルス７型や、急性出
血性膀胱炎の原因ウイルスとして臓器あるいは骨髄移植
時に問題となっているアデノウイルス１１型に対しては
特異性の高いプライマーが見出されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、アデノウイルスの血清型に特異的なプライマー並び
にこれを用いた当該血清型別検出方法及び検出用試薬を
提供することにある。
は、アデノウイルスの血清型に特異的なプライマー並び
にこれを用いた当該血清型別検出方法及び検出用試薬を
提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らはアデ
ノウイルス遺伝子の塩基配列のうち、Hexon 領域に着目
してプライマーを設計したところ、血清型に特異的なプ
ライマーが得られ、このプライマーを用いれば、ＰＣＲ
法により短時間で正確にアデノウイルス血清型別検出が
可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
ノウイルス遺伝子の塩基配列のうち、Hexon 領域に着目
してプライマーを設計したところ、血清型に特異的なプ
ライマーが得られ、このプライマーを用いれば、ＰＣＲ
法により短時間で正確にアデノウイルス血清型別検出が
可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、配列番号１〜２６か
ら選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有
するアデノウイルス血清型別検出用プライマーを提供す
るものである。また本発明は、これらのプライマーの１
又は２以上を含有することを特徴とするアデノウイルス
血清型別検出用試薬を提供するものである。更にまた、
本発明は、検体から抽出したＤＮＡに対してこれらのプ
ライマーの１又は２以上を用いて遺伝子増幅反応を行う
ことを特徴とするアデノウイルス血清型別検出方法を提
供するものである。
ら選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有
するアデノウイルス血清型別検出用プライマーを提供す
るものである。また本発明は、これらのプライマーの１
又は２以上を含有することを特徴とするアデノウイルス
血清型別検出用試薬を提供するものである。更にまた、
本発明は、検体から抽出したＤＮＡに対してこれらのプ
ライマーの１又は２以上を用いて遺伝子増幅反応を行う
ことを特徴とするアデノウイルス血清型別検出方法を提
供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明プライマーは、ヒトアデノ
ウイルスの血清型ごとの遺伝子の塩基配列のうち、Hexo
n 領域に着目し、血清型に特異的な配列を選定すること
により設計されたものである。本発明プライマーのう
ち、配列番号１と２のプライマーは、アデノウイルス２
型に特異的なプライマーであり、配列番号１は２型ＤＮ
Ａの１９４９８−１９５２５に相当し、配列番号２は２
型ＤＮＡの１９６２４−１９６４６に相当する。また、
配列番号１をセンスプライマーとし、配列番号２をアン
チセンスプライマーとして、これらを組み合せて用いる
のが好ましく、これらを用いてＰＣＲ反応を行った場合
にはアデノウイルス２型の１９４９８−１９６４６に相
当する１４９塩基が増幅する。
ウイルスの血清型ごとの遺伝子の塩基配列のうち、Hexo
n 領域に着目し、血清型に特異的な配列を選定すること
により設計されたものである。本発明プライマーのう
ち、配列番号１と２のプライマーは、アデノウイルス２
型に特異的なプライマーであり、配列番号１は２型ＤＮ
Ａの１９４９８−１９５２５に相当し、配列番号２は２
型ＤＮＡの１９６２４−１９６４６に相当する。また、
配列番号１をセンスプライマーとし、配列番号２をアン
チセンスプライマーとして、これらを組み合せて用いる
のが好ましく、これらを用いてＰＣＲ反応を行った場合
にはアデノウイルス２型の１９４９８−１９６４６に相
当する１４９塩基が増幅する。
【０００９】配列番号３〜６のプライマーは、アデノウ
イルス３型に特異的なプライマーであり、配列番号３は
３型ＤＮＡの４１１−４３８に相当し、配列番号４は３
型ＤＮＡの７３９−７５９に相当し、配列番号５は３型
ＤＮＡの５０２−５３２に相当し、配列番号６は３型Ｄ
ＮＡの６８５−７１０に相当する。従って、配列番号３
〜６のうちの任意の２つの組み合せにより、アデノウイ
ルス３型が特異的に検出できる。これらの任意の組み合
せのうち、配列番号３と４の組み合せ及び配列番号５と
６の組み合せが特に好ましい。配列番号５と６の組み合
せは、配列番号３と４の組み合せの内側の配列に相当す
るプライマーであるから、まず配列番号３と４の組み合
せによりＰＣＲ反応を行い、次いで配列番号５と６の組
み合せによるnested ＰＣＲを行うことができる。ま
た、配列番号３と４の組み合せによるＰＣＲ反応の後、
配列番号３と６の組み合せ、又は配列番号４と５の組み
合せによるseminested ＰＣＲを行うこともできる。
イルス３型に特異的なプライマーであり、配列番号３は
３型ＤＮＡの４１１−４３８に相当し、配列番号４は３
型ＤＮＡの７３９−７５９に相当し、配列番号５は３型
ＤＮＡの５０２−５３２に相当し、配列番号６は３型Ｄ
ＮＡの６８５−７１０に相当する。従って、配列番号３
〜６のうちの任意の２つの組み合せにより、アデノウイ
ルス３型が特異的に検出できる。これらの任意の組み合
せのうち、配列番号３と４の組み合せ及び配列番号５と
６の組み合せが特に好ましい。配列番号５と６の組み合
せは、配列番号３と４の組み合せの内側の配列に相当す
るプライマーであるから、まず配列番号３と４の組み合
せによりＰＣＲ反応を行い、次いで配列番号５と６の組
み合せによるnested ＰＣＲを行うことができる。ま
た、配列番号３と４の組み合せによるＰＣＲ反応の後、
配列番号３と６の組み合せ、又は配列番号４と５の組み
合せによるseminested ＰＣＲを行うこともできる。
【００１０】配列番号７〜１０のプライマーは、アデノ
ウイルス５型に特異的なプライマーであり、配列番号７
は５型ＤＮＡの１１４５−１１７３に相当し、配列番号
８は５型ＤＮＡの１２４８−１２７２に相当し、配列番
号９は５型ＤＮＡの１１４１−１１７０に相当し、配列
番号１０は５型ＤＮＡの１４７２−１４９８に相当す
る。従って、配列番号７又は８と配列番号９又は１０と
を組み合せることにより、アデノウイルス５型が特異的
に検出できる。これらの組み合せのうち、配列番号７と
８の組み合せ及び配列番号９と１０の組み合せが特に好
ましい。
ウイルス５型に特異的なプライマーであり、配列番号７
は５型ＤＮＡの１１４５−１１７３に相当し、配列番号
８は５型ＤＮＡの１２４８−１２７２に相当し、配列番
号９は５型ＤＮＡの１１４１−１１７０に相当し、配列
番号１０は５型ＤＮＡの１４７２−１４９８に相当す
る。従って、配列番号７又は８と配列番号９又は１０と
を組み合せることにより、アデノウイルス５型が特異的
に検出できる。これらの組み合せのうち、配列番号７と
８の組み合せ及び配列番号９と１０の組み合せが特に好
ましい。
【００１１】配列番号１１〜２０のプライマーはアデノ
ウイルス７型に特異的なプライマーであり、配列番号１
１は７型ＤＮＡの４０６−４３４に相当し、配列番号１
２は７型ＤＮＡの７１５−７４３に相当し、配列番号１
３は７型ＤＮＡの５１１−５３７に相当し、配列番号１
４は７型ＤＮＡの６１９−６４４に相当する。また、配
列番号１５は７型ＤＮＡの４０１−４２９に相当し、配
列番号１６は７型ＤＮＡの７９０−８１１に相当し、配
列番号１７は７型ＤＮＡの５０８−５３４に相当し、配
列番号１８は７型ＤＮＡの７２４−７４８に相当する。
また、配列番号１９は７型ＤＮＡの７９２−８１２に相
当し、配列番号２０は７型ＤＮＡの１２４８−１２７７
に相当する。従って、配列番号１１−２０のうち任意の
２つの組み合せによって、アデノウイルス７型が特異的
に検出できる。これらの任意の組み合せのうち、配列番
号１１と１２の組み合せ、配列番号１３と１４の組み合
せ、配列番号１５と１６の組み合せ、配列番号１７と１
８の組み合せ、配列番号１９と２０の組み合せが特に好
ましい。配列番号１３と１４の組み合せは、配列番号１
１と１２の組み合せの内側の配列に相当するプライマー
であるから、まず配列番号１１と１２の組み合せにより
ＰＣＲ反応を行い、次いで配列番号１３と１４の組み合
せによるnested ＰＣＲを行うことができる。また、配
列番号１１と１２の組み合せによるＰＣＲ反応の後、配
列番号１１と１４の組み合せ、又は配列番号１２と１３
の組み合せによるseminested ＰＣＲを行うこともでき
る。一方、配列番号１７と１８の組み合せは、配列番号
１５と１６の組み合せの内側の配列に相当するプライマ
ーであるから、前記同様にこれらの組み合せによるnest
ed ＰＣＲができる。更に、配列番号１５と１６の組み
合せによるＰＣＲ後、配列番号１５と１８の組み合せ又
は配列番号１６と１７の組み合せによるseminested Ｐ
ＣＲもできる。
ウイルス７型に特異的なプライマーであり、配列番号１
１は７型ＤＮＡの４０６−４３４に相当し、配列番号１
２は７型ＤＮＡの７１５−７４３に相当し、配列番号１
３は７型ＤＮＡの５１１−５３７に相当し、配列番号１
４は７型ＤＮＡの６１９−６４４に相当する。また、配
列番号１５は７型ＤＮＡの４０１−４２９に相当し、配
列番号１６は７型ＤＮＡの７９０−８１１に相当し、配
列番号１７は７型ＤＮＡの５０８−５３４に相当し、配
列番号１８は７型ＤＮＡの７２４−７４８に相当する。
また、配列番号１９は７型ＤＮＡの７９２−８１２に相
当し、配列番号２０は７型ＤＮＡの１２４８−１２７７
に相当する。従って、配列番号１１−２０のうち任意の
２つの組み合せによって、アデノウイルス７型が特異的
に検出できる。これらの任意の組み合せのうち、配列番
号１１と１２の組み合せ、配列番号１３と１４の組み合
せ、配列番号１５と１６の組み合せ、配列番号１７と１
８の組み合せ、配列番号１９と２０の組み合せが特に好
ましい。配列番号１３と１４の組み合せは、配列番号１
１と１２の組み合せの内側の配列に相当するプライマー
であるから、まず配列番号１１と１２の組み合せにより
ＰＣＲ反応を行い、次いで配列番号１３と１４の組み合
せによるnested ＰＣＲを行うことができる。また、配
列番号１１と１２の組み合せによるＰＣＲ反応の後、配
列番号１１と１４の組み合せ、又は配列番号１２と１３
の組み合せによるseminested ＰＣＲを行うこともでき
る。一方、配列番号１７と１８の組み合せは、配列番号
１５と１６の組み合せの内側の配列に相当するプライマ
ーであるから、前記同様にこれらの組み合せによるnest
ed ＰＣＲができる。更に、配列番号１５と１６の組み
合せによるＰＣＲ後、配列番号１５と１８の組み合せ又
は配列番号１６と１７の組み合せによるseminested Ｐ
ＣＲもできる。
【００１２】配列番号２１〜２６のプライマーはアデノ
ウイルス１１型に特異的なプライマーであり、配列番号
２１は１１型ＤＮＡの２４７−２７４に相当し、配列番
号２２は１１型ＤＮＡの６０５−６３４に相当し、配列
番号２３は１１型ＤＮＡの３６５−３９４に相当し、配
列番号２４は１１型ＤＮＡの５１０−５３２に相当す
る。また、配列番号２５は１１型ＤＮＡの１１０８−１
１３３に相当し、配列番号２６は１１型ＤＮＡの１４５
２−１４７３に相当する。従って、配列番号２１〜２６
のうちの任意の２つの組み合せによって、アデノウイル
ス１１型が特異的に検出できる。これら任意の組み合せ
のうち、配列番号２１と２２の組み合せ、配列番号２３
と２４の組み合せ、配列番号２５と２６の組み合せが特
に好ましい。配列番号２３と２４の組み合せは、配列番
号２１と２２の組み合せの内側の配列に相当するプライ
マーであるから、まず配列番号２１と２２の組み合せに
よるＰＣＲ反応を行い、次いで配列番号２３と２４の組
み合せによるnested ＰＣＲを行うことができる。ま
た、配列番号２１と２２の組み合せによるＰＣＲ反応
後、配列番号２１と２４の組み合せ又は配列番号２２と
２３の組み合せによるseminested ＰＣＲを行うことも
できる。
ウイルス１１型に特異的なプライマーであり、配列番号
２１は１１型ＤＮＡの２４７−２７４に相当し、配列番
号２２は１１型ＤＮＡの６０５−６３４に相当し、配列
番号２３は１１型ＤＮＡの３６５−３９４に相当し、配
列番号２４は１１型ＤＮＡの５１０−５３２に相当す
る。また、配列番号２５は１１型ＤＮＡの１１０８−１
１３３に相当し、配列番号２６は１１型ＤＮＡの１４５
２−１４７３に相当する。従って、配列番号２１〜２６
のうちの任意の２つの組み合せによって、アデノウイル
ス１１型が特異的に検出できる。これら任意の組み合せ
のうち、配列番号２１と２２の組み合せ、配列番号２３
と２４の組み合せ、配列番号２５と２６の組み合せが特
に好ましい。配列番号２３と２４の組み合せは、配列番
号２１と２２の組み合せの内側の配列に相当するプライ
マーであるから、まず配列番号２１と２２の組み合せに
よるＰＣＲ反応を行い、次いで配列番号２３と２４の組
み合せによるnested ＰＣＲを行うことができる。ま
た、配列番号２１と２２の組み合せによるＰＣＲ反応
後、配列番号２１と２４の組み合せ又は配列番号２２と
２３の組み合せによるseminested ＰＣＲを行うことも
できる。
【００１３】本発明においては配列番号１〜２６から選
ばれる塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを用
いることもできる。また、これらの配列を有する限り、
これらの配列の両側に１〜数個の塩基を有するものであ
ってもよい。
ばれる塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを用
いることもできる。また、これらの配列を有する限り、
これらの配列の両側に１〜数個の塩基を有するものであ
ってもよい。
【００１４】本発明のプライマーは、その塩基配列に従
い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成することができ
る。
い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成することができ
る。
【００１５】本発明のプライマーは、前記の如く、アデ
ノウイルス血清型、特に２型、３型、５型、７型及び１
１型に特異的であることから、これらのプライマーを用
いて検体が、抽出されたＤＮＡに対して遺伝子増幅反応
を行い、当該遺伝子増幅生成物を検出すればアデノウイ
ルスの血清型別検出、判定が可能である。
ノウイルス血清型、特に２型、３型、５型、７型及び１
１型に特異的であることから、これらのプライマーを用
いて検体が、抽出されたＤＮＡに対して遺伝子増幅反応
を行い、当該遺伝子増幅生成物を検出すればアデノウイ
ルスの血清型別検出、判定が可能である。
【００１６】検体としては、培養液、コロニー、患者に
より得られる喀痰、鼻汁、唾液、糞便、血清、尿、咽頭
拭い液、結膜拭い液等が挙げられる。検体からＤＮＡを
抽出するには、グアニジン法（Rappolee et al., J. Ce
ll Biochem 39(1989)1-11）、ボイリング法（Wang et a
l, ＦＥＭＳ Microbiology letters １２４（１９９
４）２２９−２３８）、酵素法（John C. Hierholzer e
t al., J. C. Microb(1993)31, 1886-1891）、アルカリ
溶解法（Jiwa et al., Transplantation, 48(1989)72-7
6）等により行うのが好ましい。抽出したＤＮＡを鋳型
ＤＮＡとし、この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組
み合せ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮ
Ａ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このように
して得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と
用いたプライマーからアデノウイルス血清型を同定する
ことができる。なお、遺伝子増幅反応としては、通常の
ＰＣＲの他、nested ＰＣＲ、seminested ＰＣＲ、リ
アルタイムＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法が挙げられ
る。ＰＣＲの条件は、例えばPring Akerblom et al., R
es. Virol(1994)145,25.の記載に従って行うのが好まし
い。
より得られる喀痰、鼻汁、唾液、糞便、血清、尿、咽頭
拭い液、結膜拭い液等が挙げられる。検体からＤＮＡを
抽出するには、グアニジン法（Rappolee et al., J. Ce
ll Biochem 39(1989)1-11）、ボイリング法（Wang et a
l, ＦＥＭＳ Microbiology letters １２４（１９９
４）２２９−２３８）、酵素法（John C. Hierholzer e
t al., J. C. Microb(1993)31, 1886-1891）、アルカリ
溶解法（Jiwa et al., Transplantation, 48(1989)72-7
6）等により行うのが好ましい。抽出したＤＮＡを鋳型
ＤＮＡとし、この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組
み合せ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮ
Ａ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このように
して得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と
用いたプライマーからアデノウイルス血清型を同定する
ことができる。なお、遺伝子増幅反応としては、通常の
ＰＣＲの他、nested ＰＣＲ、seminested ＰＣＲ、リ
アルタイムＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法が挙げられ
る。ＰＣＲの条件は、例えばPring Akerblom et al., R
es. Virol(1994)145,25.の記載に従って行うのが好まし
い。
【００１７】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明は何らこれらに限定されるものではな
い。 実施例１ プライマーの設計及び合成 アデノウイルス２型、３型、５型、７型及び１１型のHe
xon 領域に基づいてプライマーの設計を行った。設計し
た塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを
合成した。合成したプライマーを表１のように組み合せ
た場合の増幅血清型、増幅サイズ及びターゲットサイト
を表１に示す。
するが、本発明は何らこれらに限定されるものではな
い。 実施例１ プライマーの設計及び合成 アデノウイルス２型、３型、５型、７型及び１１型のHe
xon 領域に基づいてプライマーの設計を行った。設計し
た塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを
合成した。合成したプライマーを表１のように組み合せ
た場合の増幅血清型、増幅サイズ及びターゲットサイト
を表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】実施例２ （方法）コントロール用のアデノウイルスＤＮＡとして
中和抗体価試験に用いられているアデノウイルス株から
ＤＮＡを抽出した。これらのアデノウイルスは、細胞に
よって継代培養されており、この培養上清を回収し、ソ
ニケーターを用いて細胞を破壊し、ウイルス粒子を含む
培養液をウイルス液とした。ウイルスＤＮＡの回収は、
このウイルス液を超遠心（２０Ｋ、１６時間）をかけ、
上清を捨て、沈澱物をLysis buffer（０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ pH７．４，０．０１Ｍ ＥＤＴＡ，０．０
５Ｍ ＮａＣｌ，０．６％ＳＤＳ，０．１μｇ Ｐｒｏ
ｔｅａｓｅＫ）で懸濁し、室温で１時間反応させた後、
フェノールクロロホルムで処理し、エタノール沈澱を行
った。抽出したＤＮＡはＴＥ（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌpH８．０，１mM ＥＤＴＡ pH８．０）に溶解した。
アデノウイルスＤＮＡが回収できているかどうかは、全
型を増幅することのできるＰＣＲプライマー（J.Clin.
Microbiol. ３１：１８８６−１９８１（１９９３））
を用いて確認した。用意したコントロール用のアデノウ
イルスは、１型、２型、３型、４型、５型、６型、７
型、８型、１１型及び１９型の１０種類である。
中和抗体価試験に用いられているアデノウイルス株から
ＤＮＡを抽出した。これらのアデノウイルスは、細胞に
よって継代培養されており、この培養上清を回収し、ソ
ニケーターを用いて細胞を破壊し、ウイルス粒子を含む
培養液をウイルス液とした。ウイルスＤＮＡの回収は、
このウイルス液を超遠心（２０Ｋ、１６時間）をかけ、
上清を捨て、沈澱物をLysis buffer（０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ pH７．４，０．０１Ｍ ＥＤＴＡ，０．０
５Ｍ ＮａＣｌ，０．６％ＳＤＳ，０．１μｇ Ｐｒｏ
ｔｅａｓｅＫ）で懸濁し、室温で１時間反応させた後、
フェノールクロロホルムで処理し、エタノール沈澱を行
った。抽出したＤＮＡはＴＥ（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌpH８．０，１mM ＥＤＴＡ pH８．０）に溶解した。
アデノウイルスＤＮＡが回収できているかどうかは、全
型を増幅することのできるＰＣＲプライマー（J.Clin.
Microbiol. ３１：１８８６−１９８１（１９９３））
を用いて確認した。用意したコントロール用のアデノウ
イルスは、１型、２型、３型、４型、５型、６型、７
型、８型、１１型及び１９型の１０種類である。
【００２０】臨床検体からのウイルスＤＮＡの抽出は以
下のように行った。咽頭拭い液、結膜拭い液、及び尿の
検体については、コントロール用ＤＮＡの回収と同様に
超遠心を行った後、フェノールクロロホルム処理をし、
エタノール沈澱を行った。血漿及びウイルス分離操作後
の培養上清を検体とした場合には、ＱＬＡＧＥＮ社のウ
イルスＲＮＡ抽出キットを用いた。アデノウイルス１１
型の臨床検体については、アデノウイルス分離培養を行
った。
下のように行った。咽頭拭い液、結膜拭い液、及び尿の
検体については、コントロール用ＤＮＡの回収と同様に
超遠心を行った後、フェノールクロロホルム処理をし、
エタノール沈澱を行った。血漿及びウイルス分離操作後
の培養上清を検体とした場合には、ＱＬＡＧＥＮ社のウ
イルスＲＮＡ抽出キットを用いた。アデノウイルス１１
型の臨床検体については、アデノウイルス分離培養を行
った。
【００２１】プライマーの検討は以下のようにして行っ
た。各型のコントロール用アデノウイルスＤＮＡ溶液を
２μＬに対して表１のそれぞれのプライマーセットを用
いてＰＣＲを行い、目的の型のみを増幅することができ
るかを確かめた。ＰＣＲ反応は、ウイルスＤＮＡ２μＬ
に９８μＬのマスターミックス（１０μＬ、１０ＸＰＣ
Ｒｂｕｆｆｅｒ（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．
３，５００mM ＫＣｌ，１５mM ＭｇＣｌ2）、２μＬ
１０mM ｄＮＴＰ，５μＬ、２０μＭセンスプライマ
ー，５μＬ、２０μＭアンチセンスプライマー，７５．
５μＬＨ2Ｏ，０．５μＬ ５ｕｎｉｔ／μＬ Ｔａｑ
ポリメラーゼ）を加え、混和後直ちに９４℃にしておい
たＰＣＲ装置（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ、２４００）
に入れた。ＰＣＲのサイクルは、９４℃５分に次いで、
９４℃１分、６４℃２分、７２℃３分を４０サイクルさ
せた後、７２℃７分とした。反応後、ＰＣＲ産物を２％
アガロースゲルにて電気泳動を行い、どの型のアデノウ
イルス遺伝子が増幅されたかを確認した。nested ＰＣ
Ｒ用に設計したプライマーも予めこの方法によって個別
に検討を行った後、nested ＰＣＲを実際に行い、遺伝
子の増幅を確認した。nested ＰＣＲでの反応は、１回
目の反応は、９４℃５分に次いで、９４℃３０秒、６４
℃３０秒、７２℃１分を４０サイクルさせた後、７２℃
７分とし、２回目も同様に反応を行った。
た。各型のコントロール用アデノウイルスＤＮＡ溶液を
２μＬに対して表１のそれぞれのプライマーセットを用
いてＰＣＲを行い、目的の型のみを増幅することができ
るかを確かめた。ＰＣＲ反応は、ウイルスＤＮＡ２μＬ
に９８μＬのマスターミックス（１０μＬ、１０ＸＰＣ
Ｒｂｕｆｆｅｒ（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．
３，５００mM ＫＣｌ，１５mM ＭｇＣｌ2）、２μＬ
１０mM ｄＮＴＰ，５μＬ、２０μＭセンスプライマ
ー，５μＬ、２０μＭアンチセンスプライマー，７５．
５μＬＨ2Ｏ，０．５μＬ ５ｕｎｉｔ／μＬ Ｔａｑ
ポリメラーゼ）を加え、混和後直ちに９４℃にしておい
たＰＣＲ装置（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ、２４００）
に入れた。ＰＣＲのサイクルは、９４℃５分に次いで、
９４℃１分、６４℃２分、７２℃３分を４０サイクルさ
せた後、７２℃７分とした。反応後、ＰＣＲ産物を２％
アガロースゲルにて電気泳動を行い、どの型のアデノウ
イルス遺伝子が増幅されたかを確認した。nested ＰＣ
Ｒ用に設計したプライマーも予めこの方法によって個別
に検討を行った後、nested ＰＣＲを実際に行い、遺伝
子の増幅を確認した。nested ＰＣＲでの反応は、１回
目の反応は、９４℃５分に次いで、９４℃３０秒、６４
℃３０秒、７２℃１分を４０サイクルさせた後、７２℃
７分とし、２回目も同様に反応を行った。
【００２２】（結果）全てのプライマーセットで、目的
の型のみを増幅することができた。アデノウイルス７型
特異的プライマー（外側：配列１１と１２、内側：配列
１３と１４）を用いて各型のコントロール用ＤＮＡにつ
いてnested ＰＣＲを行った例を図１に示す。アデノウ
イルス７型のみを増幅することができた。今回検討を行
った他のプライマーを用いたときの検出結果を表２に示
す。臨床検体として咽頭拭い液と結膜拭い液を２症例か
ら採取し、ウイルスＤＮＡを抽出した後アデノウイルス
７型特異的プライマーで検出した結果を表３に示す。ま
た臨床検体１３例のウイルス培養実験後の培養上清、更
に６例の尿からウイルスＤＮＡを抽出した後、１１型特
異的プライマーを用いて検出した結果を表４に示す。こ
の１９検体については同様にウイルス分離検査も行っ
た。
の型のみを増幅することができた。アデノウイルス７型
特異的プライマー（外側：配列１１と１２、内側：配列
１３と１４）を用いて各型のコントロール用ＤＮＡにつ
いてnested ＰＣＲを行った例を図１に示す。アデノウ
イルス７型のみを増幅することができた。今回検討を行
った他のプライマーを用いたときの検出結果を表２に示
す。臨床検体として咽頭拭い液と結膜拭い液を２症例か
ら採取し、ウイルスＤＮＡを抽出した後アデノウイルス
７型特異的プライマーで検出した結果を表３に示す。ま
た臨床検体１３例のウイルス培養実験後の培養上清、更
に６例の尿からウイルスＤＮＡを抽出した後、１１型特
異的プライマーを用いて検出した結果を表４に示す。こ
の１９検体については同様にウイルス分離検査も行っ
た。
【００２３】その結果、本発明のプライマーは、アデノ
ウイルスの２型、３型、５型、７型及び１１型に特異的
であり、簡便かつ迅速に血清型別検出が可能であること
がわかる。
ウイルスの２型、３型、５型、７型及び１１型に特異的
であり、簡便かつ迅速に血清型別検出が可能であること
がわかる。
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
【発明の効果】本発明プライマーを用いた遺伝子増幅反
応による検出法によれば、ヒトアデノウイルスの血清型
別検出、判定が迅速、簡便かつ正確にできる。
応による検出法によれば、ヒトアデノウイルスの血清型
別検出、判定が迅速、簡便かつ正確にできる。
【００２８】
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO.,LTD <120> Primer for identification of serotype of ade
noviruses <130> P05051112 <160> 26 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 1 cagtggaacg aagctgatgc taatgcgg 28
noviruses <130> P05051112 <160> 26 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 1 cagtggaacg aagctgatgc taatgcgg 28
【００２９】<210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 2 agaggcaccc ctttttcatc cgg 23
【００３０】<210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 3 tacaacaaat ggggacaatg cagtaact 28
【００３１】<210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 4 agtttcaacc cctccttcgg t 21
【００３２】<210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 5 caaattggga aagacattac cactactgaa g 31
【００３３】<210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 6 ccccctttta tgttgtaggt cttgac 26
【００３４】<210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 7 ggaaggtaac tcacgagaac taatgggcc 29
【００３５】<210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 8 ccgccagaac acccatatta cccgt 25
【００３６】<210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 9 ttaaggaagg taactcacga gaactaatgg 30
【００３７】<210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 10 gtctctgtat taatcacacc tcccagt 27
【００３８】<210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 11 atagttacag caggagaaga aagagcagt 29
【００３９】<210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 12 acatctcctt cggttggttt tacttttct 29
【００４０】<210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 13 aaagacatta ctgcagacaa caagccc 27
【００４１】<210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 14 gctggtttaa gagctctacc tccaaa 26
【００４２】<210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 15 agtggatagt tacagcagga gaagaaaga 29
【００４３】<210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 16 gcgaaaaagc gtcacgagct tc 22
【００４４】<210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 17 gggaaagaca ttactgcaga caacaag 27
【００４５】<210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 18 tctcaacatc tccttcggtt ggttt 25
【００４６】<210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 19 agctcgtgac gctttttcgc c 21
【００４７】<210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 20 tcccatccat tgtctttaga tttaatgcct 30
【００４８】<210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 21 aatacaactg gtgaggaaca cgtaacag 28
【００４９】<210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 22 ccgcatcaaa aaactccatg tcgatatcat 30
【００５０】<210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 23 tggaagtttc agatgaagaa agtaaaccga 30
【００５１】<210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 24 caaaggaccc gtagcatggt ttc 23
【００５２】<210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 25 ccaaatggag acaatgcgcc taattg 26
【００５３】<210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on adenovirus gene <400> 26 acgtccgtta cccagaagca tg 22
【図１】コントロール用アデノウイルス血清型ＤＮＡを
用いた本発明７型特異的プライマーによる検出結果を示
す電気泳動写真である。図中、左側から、レーン１：マ
ーカー、２：ＡＤＶ１型、３：ＡＤＶ２型、４：ＡＤＶ
３型、５：ＡＤＶ４型、６：ＡＤＶ５型、７：ＡＤＶ６
型、８：ＡＤＶ７型、９：ＡＤＶ８型、１０：ＡＤＶ１
１型、１１：ＡＤＶ１９型、１２：陰性コントロール。
用いた本発明７型特異的プライマーによる検出結果を示
す電気泳動写真である。図中、左側から、レーン１：マ
ーカー、２：ＡＤＶ１型、３：ＡＤＶ２型、４：ＡＤＶ
３型、５：ＡＤＶ４型、６：ＡＤＶ５型、７：ＡＤＶ６
型、８：ＡＤＶ７型、９：ＡＤＶ８型、１０：ＡＤＶ１
１型、１１：ＡＤＶ１９型、１２：陰性コントロール。
フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA20 HA11 4B063 QA13 QA18 QA19 QQ03 QQ10 QR08 QR32 QR39 QR42 QR62 QS16 QS25 QX01
Claims (6)
- 【請求項１】 配列番号１〜２６から選ばれる塩基配列
又は該塩基配列に相補的な配列を有するアデノウイルス
血清型別検出用プライマー。 - 【請求項２】 配列番号１と２の組み合せ、配列番号３
〜６から選ばれる２種以上の組み合せ、配列番号７〜１
０から選ばれる２種以上の組み合せ、配列番号１１〜２
０から選ばれる２種以上の組み合せ、配列番号２１〜２
６から選ばれる２種以上の組み合せ又はこれらの塩基配
列に相補的な配列を有する組み合せである請求項１記載
のプライマー。 - 【請求項３】 配列番号１と２、配列番号３と４、配列
番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列
番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と
１６、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０、配列
番号２１と２２、配列番号２３と２４及び配列番号２５
と２６から選ばれる組み合せ又はこれらの塩基配列に相
補的な配列を有する組み合せである請求項１記載のプラ
イマー。 - 【請求項４】 アデノウイルス血清型の２型、３型、５
型、７型及び１１型を検出するためのものである請求項
１〜３のいずれか１項記載のプライマー。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項記載のプラ
イマーの１又は２以上を含有することを特徴とするアデ
ノウイルス血清型別検出用試薬。 - 【請求項６】 検体から抽出したＤＮＡに対して請求項
１〜４のいずれか１項記載のプライマーの１又は２以上
を用いて遺伝子増幅反応を行うことを特徴とするアデノ
ウイルス血清型別検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34998299A JP2001161371A (ja) | 1999-12-09 | 1999-12-09 | アデノウイルス血清型別検出用プライマー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34998299A JP2001161371A (ja) | 1999-12-09 | 1999-12-09 | アデノウイルス血清型別検出用プライマー |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001161371A true JP2001161371A (ja) | 2001-06-19 |
Family
ID=18407437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34998299A Pending JP2001161371A (ja) | 1999-12-09 | 1999-12-09 | アデノウイルス血清型別検出用プライマー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001161371A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111057753A (zh) * | 2019-12-24 | 2020-04-24 | 武汉艾迪康医学检验所有限公司 | 检测b型腺病毒的引物、试剂盒和方法 |
| CN114277185A (zh) * | 2021-11-06 | 2022-04-05 | 江汉大学 | 一种腺病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 |
-
1999
- 1999-12-09 JP JP34998299A patent/JP2001161371A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111057753A (zh) * | 2019-12-24 | 2020-04-24 | 武汉艾迪康医学检验所有限公司 | 检测b型腺病毒的引物、试剂盒和方法 |
| CN114277185A (zh) * | 2021-11-06 | 2022-04-05 | 江汉大学 | 一种腺病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 |
| CN114277185B (zh) * | 2021-11-06 | 2023-09-08 | 江汉大学 | 一种腺病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 |
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