JP2679929B2 - Ｒｎａ、ｄｎａおよび蛋白の同時単離法 - Google Patents

Ｒｎａ、ｄｎａおよび蛋白の同時単離法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】本発明は、長期保存可能な溶媒溶液
と、生物試料からＲＮＡ、ＤＮＡおよび蛋白を同時に単
離する方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】分子生物学とバイオテクノロジーの分野
で広範囲の研究と開発が急速に進行しているため、実験
および／または商業生産に使用できるリボ核酸（ＲＮ
Ａ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および蛋白に対す
る需要が増加している。すべての生物試料はＲＮＡ、Ｄ
ＮＡおよび蛋白を含有する；しかし多くの臨床および研
究への応用のためには、組織および細胞培養物からこれ
らの成分を単離し性状解析することが必要である。例え
ば、医学や農業の分野で重要な遺伝子（例えばインスリ
ン遺伝子、成長ホルモン遺伝子、および植物の生産性を
上げるための遺伝子）の分子クローニングには、ＲＮＡ
とＤＮＡの単離が必要である。さらにヒトのゲノムの分
子的欠陥の早期検出および遺伝子発現の研究のために
は、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび蛋白の単離と性状解析が必要
である。多くの場合同じ生物試料からＲＮＡ、ＤＮＡお
よび蛋白を単離することが必要であるかまたは好まし
い。しかし組織試料が非常に小さい場合（例えば生検の
場合）、および試料が分割できない場合そして各成分を
異なる単離法で使用することができない場合は、これは
不可能ではないにしても非常に困難である。
【０００３】生物試料からＲＮＡを単離するには多くの
公知の方法がある。例えば本出願人による米国特許第
４，８４３，１５５号（この内容は参考のため本明細書
中に引用されている）は、生物組織試料からＲＮＡを単
離するための有効な生成物と方法を開示している。この
特許の生成物と方法を用いることにより、ＲＮＡは約４
時間で単離することができる。この特許は、ＲＮＡを単
離するための他のいくつかの方法について記載している
が、その各々はそれぞれ欠点を有する。さらにこの特許
およびその中で言及されている他の方法のどれも、同じ
組織試料からＲＮＡ、ＤＮＡおよび蛋白を同時に単離す
る方法については記載していない。
【０００４】ＲＮＡとＤＮＡの同時単離の他の方法が知
られている。例えば米国特許第５，０１０，１８３号は
種々のソース（例えば細胞、細胞溶解液、ウイルス、組
織、血液および他の体液）から、陽イオン性界面活性剤
を用いて核酸と複合体を作らせてＤＮＡとＲＮＡを単離
する方法を開示している。ＲＮＡとＤＮＡの同時単離の
他の方法は以下の文献に記載されている：チャン（Cha,
V.T.-W.）ら：Anl. Biochem. 168, 16-24(1988)；ニコ
ライデス（Nicolaides, N.C.）ら：Biotechniques, 8
(2), 154-156(1990)；およびラハ（Rhaha, S. ）ら：Ge
ne Anal. Techn.(7), 173-177(1990) 。これらの記載さ
れた各方法では、界面活性剤（例えばノニデット（NONI
DET ）Ｐ−４０、ラウリル硫酸ナトリウムおよびラウリ
ルサルコシンナトリウム（Sodium lauryl sarcosine
））、およびＲＮａｓｅインヒビターを補足したフェ
ノールを含む抽出溶液を用いて抽出している。
【０００５】生物試料からのＲＮＡ、ＤＮＡおよび蛋白
の同時単離法は、クームス（Ｃｏｏｍｂｓ，Ｌ．Ｍ．）
ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８，３３８−３４
３（１９９０）に記載されている。この方法は本出願人
の米国特許第４，８４３，１５５号で言及されているチ
ルグウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）らの方法の変法であ
る。この方法は要約すると以下のようである：細胞また
は組織試料を４Ｍのグアニジニウム中でホモジェナイズ
する。このホモジェネートは塩化セシウム（ＣｓＣｌ）
勾配上に重層する。１１０，０００−１５０，０００ｇ
で１８時間遠心分離すると、一番上のグアニジニウム層
は蛋白を含み、上のＣｓＣｌ層はＤＮＡを含み、ＲＮＡ
は遠心分離管の底に集まる。塩化セシウム勾配からのＲ
ＮＡ、ＤＮＡおよび蛋白画分の精製は、次の１２−２４
時間に行われる。この方法は極めて時間がかかり（完了
するのに２−３日かかる）、同時にはほんのわずかの数
の試料しか処理ができない高価な装置である超遠心分離
機が必要であるため、この方法は有利ではない。
【０００６】従って同じ生物試料からのＲＮＡ、ＤＮＡ
および蛋白の同時単離の効率的で正確な方法に対する確
実なニーズがある。
【０００７】発明の要約 本発明は、同じ生物試料からのＲＮＡ、ＤＮＡおよび蛋
白の同時単離のための長期保存可能な溶媒溶液と方法に
関する。この溶媒溶液と方法は、同じ生物組織から実質
的に純粋で分解されていないＲＮＡ、実質的に純粋で分
解されていないＤＮＡ、および蛋白を抽出するための、
有効で正確な方法を与える。ここで「単離される」とい
う用語は、標準的な精製法を用いて測定した場合他の成
分の混入が検出されない程度に、ある特定の目的成分
（すなわちＲＮＡ、ＤＮＡまたは蛋白）が他の成分から
分離または単離されていることを意味する。さらに「分
解されていない」という用語は、目的の成分が標準的な
精製法を用いて測定した場合、目的の成分が、検出でき
るほどには分解されていないことを意味する。
【０００８】一般に本発明の溶媒溶液は、同じ生物試料
から実質的に純粋で分解されていないＲＮＡ、実質的に
純粋で分解されていないＤＮＡ、および蛋白を抽出する
ためのフェノールおよびグアニジニウム化合物を組合せ
で含む。この有効で驚くべき結果（１−２時間のオーダ
ーで、超遠心分離を必要としない）は迅速、有効かつ正
確であり、これまでは達成されなかった。本出願人の米
国特許第４，８４３，１５５号は、フェノールと２−５
Ｍの濃度範囲のグアニジニウム化合物を含む方法と溶媒
溶液を開示している。この溶媒溶液は実質的に純粋で分
解されていないＲＮＡを約３時間で単離することができ
るが、実質的に純粋で分解されていないＤＮＡや蛋白を
単離することは目的としていないし、また可能でもな
い。
【０００９】本発明において、特に０．５−２Ｍの濃度
範囲のグアニジニウム化合物とともに有効量のフェノー
ルを使用することにより、ＲＮＡやＤＮＡが分解から充
分に保護され、ＲＮＡがより効率的に単離されまたＤＮ
Ａと蛋白成分が単離されることが、予想外に明らかにな
った。本発明のこの新規の溶媒溶液は長期保存可能であ
る。使用可能な保存期間は室温で約２カ月であり、４℃
では約９−１２カ月であって、この間酸化や分解が起き
てフェノールが単離工程において不安定になることはな
い。
【００１０】本発明の溶媒溶液においてグアニジニウム
化合物は酸性グアニジニウム化合物またはその塩であ
り、チオシアン酸グアニジニウムや塩酸グアニジニウム
よりなるが、これらに限定されない。塩酸グアニジニウ
ムはＲＮＡやＤＮＡ成分を分解から保護し、水性の溶媒
溶液中でフェノールを溶液状態に維持するのに役立つ。
このフェノールは水層から蛋白を抽出するのに有用であ
り、ＲＮＡの分解を起こすＲＮａｓｅや他の汚染してい
る酵素の作用を阻害する。
【００１１】本発明の溶媒溶液は、チオシアン酸アンモ
ニウムやチオシアン酸ナトリウムのような追加のチオシ
アン酸成分を含んでいてもよい。この追加のチオシアン
酸成分は生物試料からのＲＮＡの抽出を増強すると考え
られている。さらにこの溶媒溶液は緩衝性成分（例えば
酢酸ナトリウムやクエン酸ナトリウム）を、約４−６の
ｐＨを維持するのに充分な量で含んでいてもよい。さら
に溶媒溶液はフェノールを特に４℃で溶液に維持して、
単一相溶液としての溶媒を維持するための追加の可溶化
剤を含んでいてもよい。適当な可溶化剤１つはグリセロ
ールである。
【００１２】好適な実施態様において、本発明の溶媒溶
液は約４−６の範囲のｐＨを有し、フェノール、グアニ
ジニウム化合物、チオシアン酸化合物およびフェノール
可溶化剤を含む。好適なグアニジニウム化合物はチオシ
アン酸グアニジニウムであり、好適なチオシアン酸化合
物はチオシアン酸アンモニウムであり、好適なフェノー
ル可溶化剤はグリセロールである。
【００１３】本発明の溶媒溶液と方法を用いて、実質的
に純粋で分解されていないＲＮＡの単離は約１時間で達
成される。この単離されたＲＮＡは、ノーザン（Northe
rn）分析、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の単離、
および酵素的測定法（ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣ
Ｒ）を含む）に適しており余分な精製工程は必要ではな
い。本発明の溶媒溶液と方法を用いてＤＮＡ成分は約１
−１．５時間で単離される。高収率のＤＮＡが抽出さ
れ、このＤＮＡ（実質的に純粋で分解されていない）は
制限分析やサザン（Southern）分析に適している。さら
に本発明の方法はＲＮＡおよび／または蛋白単離のため
に取られた試料中のＤＮＡ含量の定量を可能にする。こ
れは単離されたＤＮＡの光学密度を読むことにより達成
される。最後に本発明の溶媒溶液と方法を用いることに
より、蛋白は約１時間で単離される。単離された蛋白は
その抗原性を保持し、ウェスタン分析のための充分な純
度を保持していると考えられている。
【００１４】好適な実施態様において、本発明の方法
は、あらかじめ決められた量の溶媒溶液中の生物試料を
ホモジェナイズしてホモジェネートを形成させることよ
りなる。次に水不溶性の有機溶媒（例えばクロロホル
ム）をこのホモジェネートに加え、ホモジェネートを攪
拌して沈澱させて、実質的に純粋で分解されていないＲ
ＮＡを含有する水層、蛋白を含有する有機層、および実
質的に純粋で分解されていないＤＮＡを含有する中間層
よりなる混合物を形成させる。水層に低級アルコールを
加えて水層からＲＮＡを沈澱させ、沈澱したＲＮＡを沈
降法により回収する。有機層の蛋白はここに低級アルコ
ールを加えて沈澱させ、沈降法により回収する。最後に
ＤＮＡは、あらかじめ決められた量の溶媒溶液で中間層
を洗浄し、ＤＮＡを沈降させＤＮＡからフェノールと塩
の汚染物を除去することにより回収される。
【００１５】別の実施態様において、ホモジェナイズと
沈降に引き続いて、有機層と中間層は水で抽出し、塩化
セシウム、クエン酸ナトリウム溶液および低級アルコー
ルを加えて、中間層からＤＮＡを沈澱させる。得られた
混合物は遠心分離し、沈降したＤＮＡを回収する。この
実施態様においては、前記の実施態様で記載したよう
に、水層からＲＮＡを回収し有機層から蛋白を回収す
る。
【００１６】別の実施態様においては、本発明の溶媒溶
液中の生物試料のホモジェナイズに引き続いて、ＤＮＡ
は溶媒溶液に不溶性であるため、実質的に純粋で分解さ
れていないＤＮＡはホモジェネートから沈降される。次
にこの沈降したＤＮＡは、あらかじめ決められた量の溶
媒溶液で洗浄し、ここから汚染しているフェノールおよ
び／または塩を除去する。残存するホモジェネート（こ
れはＲＮＡと蛋白を含む）に水不溶性の有機溶媒（例え
ばクロロホルム）を加え、ホモジェネートを攪拌し沈降
させて、実質的に純粋で分解されていないＲＮＡを含有
する水層、蛋白を含有する有機層よりなる混合物を形成
させる。前記の実施態様のように、低級アルコールを加
えて水層からＲＮＡを沈澱させ、沈降法により回収す
る。同様に低級アルコールを加えて蛋白を有機層から沈
澱させ、沈降法により回収する。
【００１７】図面の簡単な記述 図１Ａはノーザンブロッティングによる総ＲＮＡの分析
結果を示す。図１ＢはサザンブロッティングによるＤＮ
Ａの分析結果を示す。図１Ｃはウェスタンブロッティン
グによる蛋白の分析結果を示す。
【００１８】発明の詳細な記述 好適な実施態様において、長期保存可能な本発明の溶媒
溶液は、溶媒溶液の総量を基準として約０．５−２Ｍの
濃度範囲のチオシアン酸グアニジニウム；溶媒溶液の総
量を基準として約０．１−０．６Ｍの濃度範囲のチオシ
アン酸アンモニウム；溶媒溶液のｐＨを約４−６の範囲
に維持するのに充分な量の緩衝液（好ましくは酢酸ナト
リウム）；溶媒溶液の総量を基準として約３−１０容量
％の量のグリセロール；および溶媒溶液の総量を基準と
して約３０−５０容量％の量のフェノールよりなる。
【００１９】溶媒溶液のさらに好適な実施態様において
は、チオシアン酸グアニジニウムの濃度は好ましくは約
０．８Ｍであり、チオシアン酸アンモニウムの濃度は好
ましくは約０．４Ｍであり、酢酸ナトリウム緩衝液は溶
媒溶液の総量を基準として約０．１Ｍの濃度で存在し、
溶液のｐＨは約５．０である。さらに溶媒溶液は約５容
量％のグリセロールと約３８容量％のフェノールよりな
る。
【００２０】以下の例において本発明の方法のいくつの
実施態様を例示する。
【００２１】例１ 前述した好適な溶媒溶液２ｍｌ中で１００ｍｇの組織試
料をホモジェナイズする。次にホモジェネートに０．４
ｍｌのクロロホルムを加えて攪拌し、１２，０００ｇで
１０分間沈降させる。沈降後、実質的に純粋で分解され
ていないＲＮＡを含有する水層、蛋白を含有する有機
層、および実質的に純粋で分解されていないＤＮＡを含
有する中間層よりなる混合物が形成する。水層を集め、
２ｍｌのイソプロパノールと一緒にして１２，０００ｇ
で１０分間遠心分離する。全ＲＮＡを含有する沈降物を
２ｍｌの７５％エタノールで洗浄し、８０００ｇで６分
間遠心分離し、水に溶解する。前述したようにＲＮＡの
単離は約１時間かかる。
【００２２】ＤＮＡは以下の３つの方法のうちの１つを
用いて単離される。１つの実施態様においては、有機層
と中間層は１ｍｌの水で抽出される。次に４．５Ｍの塩
化セシウム１００μｌ、０．５Ｍのクエン酸ナトリウム
溶液および１ｍｌのエタノールを加えて中間層からＤＮ
Ａを沈澱させる。得られた混合物を遠心分離し、沈降し
たＤＮＡを２ｍｌの７５％エタノールで４回、そして２
ｍｌの水で１回洗浄する。
【００２３】別の実施態様においては、中間層を有機層
から取って新しいチューブに入れ、０．５ｍｌの溶媒溶
液で洗浄する。ＤＮＡに汚染しているフェノールおよび
／または塩を、７５％エタノール、３０％エタノール／
２．８ＭのＮａＢｒ溶液、そして最後に７５％エタノー
ルで連続的に洗浄して除去する。
【００２４】ＤＮＡは溶媒溶液には溶解しないため、別
の実施態様においては、クロロホルムを加える前に最初
のホモジェネートからＤＮＡを沈降させる。沈降したＤ
ＮＡを０．５ｍｌの溶媒溶液で洗浄し、ＤＮＡに汚染し
ているフェノールおよび／または塩を、７５％エタノー
ル、３０％エタノール／２．８ＭのＮａＢｒ溶液、そし
て最後に７５％エタノールで連続的に洗浄して除去す
る。上記方法のＤＮＡの単離は約１−１．５時間で達成
される。
【００２５】蛋白は２倍量のイソプロパノールを加える
ことにより有機層から沈澱する。懸濁物を遠心分離し、
蛋白沈澱物をエタノールで２回洗浄し、０．５％のドデ
シル硫酸ナトリウム溶液に溶解する。蛋白の単離は約１
時間で完了する。
【００２６】例２ 本発明の方法の別の具体的な例では、テフロンガラスの
ホモジェナイザー中で１５２ｍｇのラットの乳腺を、前
記の３ｍｌの好適な溶媒溶液とともにホモジェナイズす
る。ホモジェナイズした後ホモジェネートに０．６ｍｌ
のクロロホルムを加える。混合物を攪拌し、４℃で１
２，０００ｇで１０分間遠心分離する。遠心分離後ホモ
ジェネートは水層、中間層および有機層を形成する。
【００２７】ＲＮＡの単離 水層を新しいチューブに移し、１．５ｍｌのイソプロパ
ノールを加えてＲＮＡを沈澱させ、４℃で８０００ｇで
８分間遠心分離する。全ＲＮＡを含む沈降物を３ｍｌの
７５％エタノールで洗浄し、８０００ｇで５分間遠心分
離し、水に溶解する。全ＲＮＡの収率は０．６２ｍｇで
あり、ジフェニルアミンによる試験（バートン（Burto
n, K.）：Biochem. J., 62:315-322(1956) ）と、フォ
リン（Folin ）試薬（ピーターソン（Peterson, G.
L.）：Methods in Enzymology, 91:95-98(1983) ）で
は、それぞれＤＮＡや蛋白の汚染は検出されない。
【００２８】ＤＮＡの単離 有機層と中間層を１．５ｍｌの水で抽出し、混合物を３
０００ｇで５分間遠心分離する。水層を取り、そこから
４．５Ｍの１５０μｌのＣｓＣｌ、０．５Ｍのクエン酸
ナトリウム溶液、そして１．５ｍｌのエタノールを連続
的に添加してＤＮＡを沈澱させる。混合物を１５秒間攪
拌して、３０００ｇで３分間遠心分離する。有機層を含
有する得られた上清を蛋白分析のためにとっておく。ペ
レットになったＤＮＡを３ｍｌの７５％エタノールとボ
ルテックスさせて４回洗浄し、３０００ｇで３分間遠心
分離する。次にＤＮＡペレットを３ｍｌの１００％エタ
ノールに懸濁し、３０００ｇで３分間遠心分離して水に
溶解する。ＤＮＡの収率は０．４１ｍｇであり、フォリ
ン試薬による試験では蛋白の汚染は検出されない。
【００２９】別の測定法では、単離したＲＮＡとＤＮＡ
の純度を、汚染剤として3 Ｈ ＲＮＡと 32 Ｐ ＤＮＡ
を用いて試験する。ＲＮＡ調製物中には放射性ＤＮＡは
検出されず、ＤＮＡ調製物中には放射性ＲＮＡは検出さ
れない。
【００３０】蛋白の単離 ＤＮＡの単離工程で取っておいた有機層を６ｍｌのイソ
プロパノールと混合する。この混合物を室温に５分間置
き、沈澱した蛋白を１０，０００ｇで１０分間遠心分離
する。蛋白のペレットをボルテックスにより３ｍｌのエ
タノールに懸濁し、次に室温に５分間置き、次に１０，
０００ｇで１０分間遠心分離する。この洗浄／遠心分離
工程を３回繰り返す。最後のエタノールによる洗浄の後
に、蛋白ペレットを短時間（１０分間）空気乾燥し、水
に溶解する。蛋白の収率は６．３ｍｇである。
【００３１】この例で単離されるＲＮＡ、ＤＮＡおよび
蛋白の質は、標準的ノーザン分析、サザン分析およびウ
ェスタン分析により試験される。ノーザン分析、サザン
分析およびウェスタン分析は、アウスベル（Ausbell,
F.M. ）ら（編）の方法（Current Protocols in Molecu
lar Biology, ウィリーインターサイエンス（Wiley Int
erscience）、ニューヨーク(1990)）（これは参考のた
め本明細書中に引用されている）の記載する方法により
行われる。
【００３２】ノーザン分析では、単離された全ＲＮＡの
５μｇを、１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル中で
電気泳動し、「ニトラン」（"Nytran"）膜に移し、ニッ
クトランスレーションしたラクトアルブミンｃＤＮＡと
ハイブリダイズさせる。図１Ａに示すようにラクトアル
ブミンｍＲＮＡの分解されていないバンドの存在は、単
離された全ＲＮＡが分解されていないことを示すと考え
られる。
【００３３】サザン分析においては、単離されたＤＮＡ
の５μｇをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、１％アガロー
スゲルで電気泳動し、「ニトラン」（"Nytran"）膜に移
し、ニックトランスレーションしたラクトアルブミンｃ
ＤＮＡとハイブリダイズさせる。図１Ｂに示すように分
解されていないラクトアルブミン遺伝子のバンドの存在
は、単離されたＤＮＡが分解されていないことを示すと
考えられる。
【００３４】ウェスタン分析においては、単離された５
０μｇの蛋白を１０％のアクリルアミド−ＳＤＳゲルで
電気泳動し、ニトロセルロース膜に電気移動させる。ラ
クトアルブミンの存在は、ウサギ抗−ラットラクトアル
ブミン抗体とペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧを用
いて検出する。図１Ｃに示すように単離物中の特異的蛋
白の存在はラクトアルブミンの検出により例示される。
【００３５】本発明の範囲はここに示した具体例に限定
されるものではなく、特許請求の範囲により限定され
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａはノーザンブロッティングによる総ＲＮＡの
分析結果を示す。ＢはサザンブロッティングによるＤＮ
Ａの分析結果を示す。Ｃはウェスタンブロッティングに
よる蛋白の分析結果を示す。

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物組織から実質的に純粋で分解されて
    いないＲＮＡ、実質的に純粋で分解されていないＤＮＡ
    および蛋白を抽出するための溶媒溶液であって、 ａ）溶媒溶液の総量に基づき３０〜５０容量％のフェノ
    ール、 ｂ）溶媒溶液の総量に基づき３〜１０容量％のグリセロ
    ール、 ｃ）溶媒溶液の総量に基づき０．５〜２Ｍ（モル）濃度
    のチオシアン酸グアニジニウム、 ｄ）溶媒溶液の総量に基づき０．１〜０．５Ｍ（モル）
    濃度のチオシアン酸アンモニウムおよび（または）チオ
    シアン酸ナトリウム、および ｅ）溶媒溶液のｐＨを４〜６に維持するための溶媒溶液
    の総量に基づき０．０２〜０．２Ｍ（モル）濃度の緩衝
    剤、からなる溶媒溶液。
  2. 【請求項２】 緩衝剤が酢酸ナトリウムである請求項１
    に記載の溶媒溶液。
  3. 【請求項３】 酢酸ナトリウムが溶媒溶液の総量に基づ
    き０．１Ｍ（モル）の濃度で存在し、かつまた溶媒溶液
    のｐＨが５．０である請求項１または２のいずれか１項
    に記載の溶媒溶液。
  4. 【請求項４】 チオシアン酸アンモニウムおよび（また
    は）チオシアン酸ナトリウムの濃度が溶媒溶液の総量に
    基づき０．４Ｍ（モル）である請求項１〜３のいずれか
    １項に記載の溶媒溶液。
  5. 【請求項５】 チオシアン酸グアニジニウムの濃度が溶
    媒溶液の総量に基づき０．８Ｍ（モル）である請求項１
    〜３のいずれか１項に記載の溶媒溶液。
  6. 【請求項６】 生物組織から実質的に純粋で分解されて
    いないＲＮＡ、実質的に純粋で分解されていないＤＮＡ
    および蛋白を単離するための方法であって、 （ａ）組織試料を請求項１に記載の溶媒溶液中でホモジ
    ェナイズしてホモジェネートを生成させ、 （ｂ）上記ホモジェネートに水に不溶性の有機溶媒を加
    え、ホモジェネートを沈降させ、実質的に純粋で分解さ
    れていないＲＮＡを含有する水性層、蛋白を含有する有
    機層および実質的に純粋で分解されていないＤＮＡを含
    有する中間層からなる混合物を形成させ、 （ｃ）この水性層に低級アルコールを添加して、水性層
    からＲＮＡを沈殿させ、沈殿したＲＮＡを沈降法により
    採取し、 （ｄ）この有機層に低級アルコールを添加して、有機層
    から蛋白を沈殿させ、沈殿した蛋白を沈降法により採取
    し、 （ｅ）この中間層を予め決められた量の前記溶媒溶液で
    洗浄し、ＤＮＡを沈降させ、夾雑フェノールおよび塩類
    をＤＮＡから除去して、この中間層からＤＮＡを採取す
    る、工程からなる方法。
  7. 【請求項７】 生物組織から実質的に純粋で分解されて
    いないＲＮＡ、実質的に純粋で分解されていないＤＮＡ
    および蛋白を単離するための方法であって、 （ａ）組織試料を請求項１に記載の溶媒溶液中でホモジ
    ェナイズしてホモジェネートを生成させ、 （ｂ）上記ホモジェネートに水に不溶性の有機溶媒を加
    え、ホモジェネートを沈降させ、実質的に純粋で分解さ
    れていないＲＮＡを含有する水性層、蛋白を含有する有
    機層および実質的に純粋で分解されていないＤＮＡを含
    有する中間層からなる混合物を形成させ、 （ｃ）この水性層に低級アルコールを添加して、水性層
    からＲＮＡを沈殿させ、沈殿したＲＮＡを沈降法により
    採取し、 （ｄ）この有機層と中間層とを水で抽出し、 （ｅ）有機層に低級アルコールを添加して、有機層から
    蛋白を沈殿させ、沈殿した蛋白を沈降法により採取し、 （ｆ）この中間層にＣｓＣｌ、クエン酸ナトリウム溶液
    および低級アルコールを添加して、中間層からＤＮＡを
    沈殿させ、沈殿したＤＮＡを沈降法により採取する、工
    程からなる方法。
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