JP2619228B2 - Ｄｎａの単離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、植物全体および植物細胞、組織および器
官、ならびに酵母および細菌、ならびに動物細胞または
組織からのDNAの単離に関する。

発明の背景 バイオテクノロジーにおける、DNAフィンガープリン
ト法、制限断片長多型（RFLP）分析、サザンブロッティ
ング、ゲノムライブラリーの構築および性質転換実験の
必要性の増加にともなって、高分子量（HMW）DNAの単離
は主要な問題となっている。HMW DNAの単離のいくつか
の方法が報告されてきたが、それらの全ては、様々な理
由で欠点を有する。方法には一般に細胞の物理的粉砕が
含まれ、続いてEDTA、界面活性剤、トリスおよび他の試
薬を含む緩衝液での抽出が行われる。使用される試薬の
いくつかは、様々な細胞小器官と反応するが、他の試薬
の機能は未知である。

従来の技術の方法は、科学というよりむしろ技術を必
要として、しばしば時間がかかり、再現性がなく、DNA
の収量が変化する。得られるDNAは純度に関してもさま
ざまであり、全ての方法には、ユーザーには危険になり
得る、フェノールすなわち、タンパク質変性剤によるDN
Aの精製が含まれる。結局は、１つの植物または動物群
で有効なDNAの抽出方法は、他の植物または動物に用い
られる時にはたびたび失敗する。

ごく最近まで、シリカを含有しその表面にヒドロキシ
ル基を有する固相抽出材料が、フェノールの代用として
タンパク質の除去用に報告されてきた。しかしながら、
この材料の調製は面倒であり、組織の粉砕は、依然とし
て必要である。

これらの難点に関して、これらの問題を解決し得る有
用な方法が、引き続き必要となっている。

本発明の目的はこのような方法を提供することであ
る。

発明の開示 理論により制限されることを意図していないが、植
物、酵母および細菌からのDNAの単離は、多糖類に富ん
だ硬い細胞壁の存在により部分的に難しく、そのため通
常に使用される緩衝液で完全に破壊するのは難しい。酵
素による細胞壁の除去は面倒であり、いつも可能である
とは限らない。現在の方法を用いた抽出の繰り返しでの
DNAの収量および質の変化は、おそらく、細胞壁の破壊
のいろいろな程度から生ずる。従って、細胞または組織
をホモゲナイズすることなく、再現性を有するようにDN
Aの単離をし得る、徹底的であるが限界が定められた方
法によって細胞壁を破壊する、新しい方法が必要とされ
ている。

多価アルコール（セルロースを含む）は、キサントゲ
ン酸金属塩への転換により従来は溶解されてきた。この
方法は、1815年にZeiseにより発見され、繊維産業では
広く用いられてきた。キサントゲン酸金属塩は、pH条件
を調整して、低溶解性および種々の溶解性を利用して、
多くの金属イオンを分離および定量するのに広く適用さ
れることが見いだされている。

キサントゲン酸塩形成化合物によるDNA抽出用試薬へ
の、現在ある試薬の代用は、可能であり、非常に優れて
いると、現在では確信されている。これらの化合物が、
植物細胞壁の実質的な部分を構成する多糖類のヒドロキ
シル基と水溶性の多糖キサントゲン酸塩を形成すること
により植物の細胞壁を溶かすと考えられてきた。キサン
トゲン酸塩形成化合物とアミンとの反応もまた報告され
ている。さらに、キサントゲン酸塩形成化合物はまた、
金属イオンに結合してDNAアーゼ活性を阻害し得る。結
果として、これらの化合物は、混入しているタンパク
質、金属イオンおよび多の化合物を不溶性の残留物とし
て残し、細胞小器官からDNAを選択的に溶解し得る。次
に、DNAは上清から沈澱され得る。

同じキサントゲン酸塩形成化合物が、動物細胞および
組織からのDNAの効率的な抽出のために用いられ得る。
単離したDNAには、制限酵素消化を妨害する不純物が含
まれない。

キサントゲン酸塩形成化合物 本発明の「キサントゲン酸塩形成化合物」には、植物
細胞の細胞壁の多糖類を用いてキサントゲン酸塩反応生
成物を形成し得るあらゆる化合物が含まれる。これらに
は明らかに、二硫化炭素およびその有機アルカリ誘導体
が含まれる。この反応（ビスコースレーヨンの製造方
法）の工業的使用において使用される一般的な試薬は二
硫化炭素であるが、本発明に従うDNAの分析用の単離に
は、二硫化炭素の有機アルカリ誘導体がより好ましい。
「二硫化炭素の有機アルカリ誘導体」とは下記の一般式
の化合物を意味する。

ここでＲは、置換されないかまたは置換されたアルキ
ル基、アルケニル基またはアラルキル基で、好ましく
は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、イ
ソアミル、ビニル、アリル、２−３−ジヒドロキシプロ
ピル、フェネチル、４−モルホリニルメチル、およびヒ
ドロキシフェネチルから選択され、ここでＭは、アルカ
リ金属またはNH₄、好ましくはNaまたはＫである。これ
らの化合物は、二硫化炭素と対応するアルコール性アル
カリとを反応させて形成される： CS₂＋MOH＋ROH−−＞ROC（Ｓ）SM＋H₂O. これらの化合物で最も好ましいのは、カルボノジチオ
イン酸Ｏ−エチルエステルであり、そのナトリウム塩
（Ｒ＝C₂H₅,M＝Na;エチルキサントゲン酸ナトリウム）
は標準法で調製し得、そのカリウムアナログは、Fluka
から商業的に入手可能である。本発明における有用な化
合物の全クラス（二硫化炭素を含めて）は、下記の式に
より表し得る： ここでＮは、０または１であり、Ｒは、置換されない
かまたは置換されたアルキル基、アルケニル基またはア
ラルキル基で、好ましくは、メチル、エチル、プロピ
ル、ブチル、ヘキシル、イソアミル、ビニル、アリル、
２−３−ジヒドロキシプロピル、フェネチル、４−モル
ホリニルメチル、およびヒドロキシフェネチルから選択
され、そしてここでｎが１のときはＭはアルカリ金属ま
たはアンモニウム、好ましくはNaまたはＫであり、そし
てｎが０のときは、炭素への他の結合である。

これらの化合物を用いる本明細書に記載の方法は、組
織をホモゲナイズしたり、タンパク質を除去することな
く、有効なDNAの単離を可能にする。

実施例Ｉ 組織を粉砕するプロトコール 13日齢のトウモロコシ幼苗の新鮮な葉（0.6−0.63g）
を、非常にこわれやすくなるまで液体窒素浴で凍らせ、
ガラス製のホモゲナイザーを用いて細かい粉末に粉砕し
た。その粉末を、15mlのプロピレン管中の4mlの緩衝化
抽出試薬（694mMカルボノジチオイン酸Ｏ−エチルエス
テルのナトリウム塩、100mMトリス、pH7.5、700mM NaC
l、10mM EDTA、pH8、または625mMカルボノジチオイン酸
Ｏ−エチルエステルのカリウム塩、100mMトリス、pH7.
5、700mM NaCl、10mM EDTA）に懸濁した。65℃で５分間
インキュベートした後、葉の破片を、Miraclothに通し
てホモゲネートを濾過することにより除去した。DNA
は、濾液に２倍容量のエタノールを加えて沈澱させ、４
℃、3Kで10分間遠心分離した。

沈澱したタンパク質およびキサントゲン酸金属塩を除
去する前に、ペレットを100μｌのTE中に懸濁させ、３
分間遠心分離した。上清を1.5mlのエッペンドルフチュ
ーブに移して５分間遠心分離した。DNAを、2MのNH₄OAc
で調整し、エタノールを２倍容量加えることにより再び
上清から沈澱させた。DNAを、735gで５分間遠心分離し
てペレットにした。上清をデカンテーションして除いた
後、ペレットを高速真空器（speed vac）で乾燥し、100
μｌのTE緩衝液に再溶解した。DNAの収量は20〜40μｇ
であった。

実施例II 粉砕しないプロトコール カルボノジチオイン酸Ｏ−エチルエステルのナトリウ
ム塩を含む抽出緩衝液4ml中で、1gの新鮮な葉を20分
間、65℃でインキュベートし、そして濾過する。DNAを
濾液から沈澱させ、上記のように再沈澱させる。トウモ
ロコシに適用したこの粉砕しない方法では、葉の組織1g
当り2.56〜6.68μｇのDNAの収量であった。

実施例III 実施例ＩおよびIIのプロトコールを評価するために、
単離されたDNAを、BamH IとHind IIIとで、およびEcoR
IとSst Iとで６時間消化し、アガロースゲル電気泳動に
より分析した。消化されなかったDNAは、23kbであるλ
マーカーよりも明らかに大きい分子量を示した。消化さ
れたサンプルにおいて高分子量DNAが存在しないことお
よびスミア（smear）の存在は、DNAが完全に消化され、
制限酵素の消化を妨害する不純物のないことを示唆し
た。

実施例IV DNA調製物の質を、サザンブロッティングによりさら
に評価した。単離されたDNAをBamH Iで消化し、電気泳
動にかけてMSI膜に移動させ、32pシングルコピープロー
ブとハイブリダイズさせた。

未消化および消化DNAは、予想されたハイブリダイゼ
ーションパターンを与えた。消化サンプルの分離したバ
ンドの外観は、DNAが酵素により完全に消化され、プロ
ーブとのハイブリダイゼーションが成功したことを確証
した。これは、DNAの質には重要な基準である。

実施例Ｖ 分子生物学適用のために単離したDNAの質をさらに確
実にするために、抽出したDNAを、ポリメラーゼ連鎖反
応（PCR）により分析した。単離の後、DNAを増幅し、産
物をアガロースゲル上に流した。コントロールの実験は
また、鋳型DNAをPCR反応に含めないで行った。コントロ
ールでは、予測される目的のバンドがないこと、および
前述のプロトコールにより得たDNAサンプルではそのバ
ンドが存在することによって、さらにDNAの質を確実に
した。

実施例VI これらの抽出手順での収量および効率を、粉砕するプ
ロトコールでテストした。ホモゲナイズするのに先だっ
て葉のサンプルにDNAの既知の量（20μｇ）を加え、そ
の後同様の工程を行って、最終工程で少なくとも81％の
DNAの収量があった。このことは、酵素分解または機械
的分解によるDNAの損失が最小であることを示唆した。

実施例VII−XII この粉砕する方法はまた、アガロースゲル電気泳動お
よびサザンブロッティングにより測定されたように、ダ
イズ、モロコシ類、ヒマワリ、ムラサキウマゴヤシ、お
よびタバコの13日齢幼苗からのDNAの単離にうまく用い
られた。結果を表１に示す。

実施例XIII−XXIV これらの２つの方法（粉砕するおよび粉砕しない）の
融通性を、さらに、ムラサキウマゴヤシ、オオムギ、カ
ノラ、モロコシ類、ダイズ、ヒマワリ、タバコ、コム
ギ、ペチュニア、ホウレンソウ、酵母、およびE.coliで
比較した。酵母およびE.coliについては、粉砕するプロ
トコールでのホモゲナイゼーションは省略した。表２は
DNAの収量を示す。

実施例XXV−XXVI 本発明の方法はまた、以下の植物からのDNAの単離で
もうまく適用された：実施例 植物 XXV ノゲイトウ XXVI ニワナズナ 粉砕しない方法の容易さは、DNA単離の自動化および
専門家以外によるDNA単離が要求される分析および診断
法の分野での使用を容易にし得る。本発明の粉砕する方
法の広い適用性は、植物細胞からのDNA単離の一般方法
としての可能性がある。抽出は、種々の濃度および量の
緩衝液を用いた、さまざまなpH下で、異なる濃度の基質
を用いて、様々な温度で試みられてきた。

粉砕しない方法による、2mlの緩衝液／試薬を用いて
のムラサキウマゴヤシ、トウモロコシ、モロコシ類およ
びレタスは、DNAの高い収量と質を与えた。一方では、
エチルキサントゲン酸ナトリウムを用いたダイズ、ヒマ
ワリおよびコムギからのDNAの単離は、清浄なDNAを得る
のに２倍の量を必要とした。カノラ、タバコおよびペチ
ュニアでは、インキュベーションの前にやや穏やかにホ
モゲナイズすることが、よりよいDNAの質および収量を
得るのに役だった。従って、本発明の方法の多くの特定
の実施例は、配慮の下に、特定のインビボまたはインビ
トロ系に適用するように効果的に利用し得る。

実施例XXVII−XXVIII 本発明の方法はまた、動物組織からのDNAの単離にも
うまく適用された。乾燥させた（drained）ニワトリの
肝臓約1.0gのサンプルを乳鉢および乳棒を用いて凍結さ
せずにすりつぶした。約5mlの新鮮な緩衝化抽出試薬（6
24mMエチルキサントゲン酸カリウム;100mMトリス、pH7.
5、700mM NaCl;10mM EDTA）を乳鉢に加えた。混合物を
適当にスムースなスラリーが得られるまですりつぶし
た。このスラリーを滅菌した15mlのポリプロピレン管中
に注ぎ込み、そして65℃で15分間インキュベートした。
この管を室温まで冷却し、次いで14,460gで15分間遠心
した。

各管中の上清を、新しいポリプロピレン管中で等量の
冷イソプロパノールで沈澱させた。管を−20℃で15分間
インキュベートした。ピンク色のペレットをエタノール
でリンスし、室温で乾燥し、そして300μｌの滅菌蒸留
水中に再懸濁した。

本発明の方法を用いる1.0gの肝組織サンプルからのDN
Aの収量は、150〜159ηｇであった。これに対して、周
知のCTAB法（Saghai−Maroofら、PNAS 81:8014−8018
（1984）により教示されている、これは本明細書中に参
考として援用されている）を用いて抽出した1.0gの同じ
肝組織サンプルからのDNAの収量は、74〜88ηｇであっ
た。

本発明の方法はまた、Bethel Laboratoriesから入手
したEDTA処理ウサギ血液にも適用された。約10mlの血液
サンプルをそれぞれ15mlのポリプロピレン管中に入れ、
14,460gで20分間遠心分離にかけた。細胞ペレットはす
りつぶさず、ボルテックスにもかけなかった。ペレット
を乾燥し、3mlの緩衝化抽出試薬（624mMエチルキサント
ゲン酸カリウム:100mMトリス、pH7.5、700mM NaCl;10mM
EDTA）中に再懸濁した。この管を65℃で15分間インキ
ュベートし、次いで室温まで冷却した。DNA単離方法の
残りの工程は、最終的なDNAペレットを100μｌの滅菌蒸
留水に再懸濁したことを除いて、肝組織に関する上記方
法と同様に行った。

本発明の方法を用いる10mlの血液サンプルからのDNA
の収量は、28〜30ηｇであった。これに対して、CTAB法
を用いて抽出した同じ血液サンプル10mlからのDNAの収
量は、24〜27ηｇであった。

本発明の方法およびCTAB法を用いて肝組織およびウサ
ギ血液から単離したDNAを評価し比較するために、DNAサ
ンプルをEcoR Iで一晩消化し、そしてアガロースゲル電
気泳動により分析した。未消化のコントロールDNAサン
プルおよび消化したDNAサンプル（CTAB法または本発明
の方法のいずれかにより生成された）の両方とも同じで
あるようであった。両方ともスメアを生成しており、DN
Aは完全に消化され、そして制限酵素消化を妨害する不
純物を含まないことが示唆された。

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】動物細胞または動物組織からDNAを単離す
   る方法であって、キサントゲン酸塩形成化合物である１
   つまたは複数の化合物を含有する水溶液に該細胞または
   組織を接触させる工程、および該細胞からDNAを単離す
   る工程を包含する、方法。
2. 【請求項２】前記１つまたは複数の化合物が式 を有し、ここで、ｎが０または１であり;Rは置換されな
   いかまたは置換された低級アルキル、低級アルケニルま
   たはアラルキルで；そしてｎが１のとき、Ｍはアルカリ
   金属またはアンモニウムであり、そしてｎが０のとき、
   イオウ−炭酸結合である、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】ｎが１であって、Ｒが置換されないかまた
   は置換された低級アルキルで、そしてＭがNaまたはＫで
   ある、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】Ｒが、メチル、エチル、プロピル、ブチ
   ル、ヘキシル、イソアミル、および２−３−ジヒドロキ
   シプロピルからなる群から選択される、請求項３に記載
   の方法。
5. 【請求項５】前記１つまたは複数の化合物がエチルキサ
   ントゲン酸のナトリウム塩またはカリウム塩である、請
   求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】前記溶液から細胞破片を遠心分離によって
   除去する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方
   法。
7. 【請求項７】遠心分離した前記溶液からエタノールでDN
   Aを沈澱させる工程をさらに包含する、請求項６に記載
   の方法。