HUT70980A

HUT70980A - Dna isolation method

Info

Publication number: HUT70980A
Application number: HU9403751A
Authority: HU
Inventors: Anil K Jhingan
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 1993-03-23
Filing date: 1994-03-22
Publication date: 1995-11-28
Also published as: JP2619228B2; EP0647269A1; US5352777A; NZ263944A; HU9403751D0; WO1994021782A2; WO1994021782A3; JPH07508422A; CA2097254A1

Description

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US94/03010

A nemzetközi közzététel száma: WO 94/21782

80720-1045-Gi

A találmány tárgya DNS izolálása teljes növényből, növényi sejtekből, szövetekből és részekből, élesztőkből, baktériumokból, továbbá állati sejtekből és szövetekből.

A biotechnológiában a DNS fingerprint szétválasztási technikája, a restrikciós fragmenshosszúság polimorfizmus (RFLP) analízis, Southern lenyomatok és genomkönyvtárak készítése és transzformációs kísérletek végzése növekvő igényével a nagy molekulatömegű (HMW) DNS izolálása Jelentős problémává kezd válni. A nagy molekulatömegű (HMW) DNS izolálására számos eljárást írtak le. Ezek az eljárások általában a sejtek vagy szövetek fizikai szétzúzásából, és detergenst, EDTA-t, Tris-t és egyéb reagenseket tartalmazó pufferekben végzett extrakcióból állnak. Az alkalmazott reagensek némelyike reagál a különböző sejtorganellumokkal, míg a többi funkciója ismeretlen.

A korábbi eljárások általában időigényesek, nem reprodukálhatók, s eltérő hozamokat eredményeznek, miközben több ügyességet igényelnek, mint tudást. Az izolált DNS-ek tisztaságukat illetően is különbözőek, s valamennyi eljárás a DNS fenolos tisztítását foglalja magában. A fenol denaturálja a fehérjéket.

ezáltal veszélyes a vele dolgozóra. Végül, bizonyos növényvagy állatcsoport esetében hatásos DNS kivonási eljárás gyakran más növények vagy állatok esetében nem alkalmazható.

Az utóbbi időben a proteinek eltávolítására szolgáló fenol ··· · ··

- 3 helyettesítéseként szilikagélt tartalmazó, és felületén hidroxilcsoportokkal rendelkező, szilárd fázisú extraháló anyagot írtak le. Ezen anyag előállítsa azonban nehézségekbe ütközik, miközben a DNS kivonásához még mindig szükség van a szövet szétzúzására.

E nehézségek ismeretében továbbra is szükség van egy olyan sokoldalú eljárásra, amellyel kiküszöbölhetők a problémák.

A találmány tárgya egy ilyen eljárás.

A DNS növényekből, élesztőkből és baktériumokból történő izolálása, részben a kemény sejtfal jelenléte miatt (amely sok poliszacharidot tartalmaz, s ezáltal a hagyományosan alkalmazott pufferekkel nehéz tökéletesen felbontani), nehézségekbe ütközik. A sejtfal enzimekkel történő eltávolítása fárasztó, s nem mindig valósítható meg.

A jelenlegi módszerekkel végzett egyes kivonások alkalmával nyert DNS-ek eltérő hozama és minősége valószínűleg a sejtfal különböző fokú szétzúzásából ered. Ilyenformán, a sejtfal szétzúzásának alapos, mégis körülhatárolt új technikájára van szükség, mely lehetővé teszi a DNS reprodukálható izolálását, anélkül. hogy szükség lenne a sejtek vagy szövetek homogenizálására.

A többértékú alkoholokat, beleértve a cellulózt, régebben fém-xantátokká való átalakítással szolubilizálták. Ezt a módszert 1815-ben Zeise fedezte fel, s a textiliparban • · elterjedten szabályozott oldhatóságát alkalmazzák. A xantátokat a fém-xantátok pH-tartományban mutatott alacsony és eltérő kihasználva széles körben alkalmazzák számos fémion elválasztásában és mennyiségi meghatározásában is.

Megállapítottuk, hogy a DNS kivonásához jelenleg alkalmazott reagensek xantát-képző vegyületekkel történő helyettesítése megvalósítható, és igen előnyös. Abból indultunk ki, hogy ezek a vegyületek a sejtfal jelentős hányadát képező poliszacharidok hidroxilcsoportjaival vízben oldható poliszacharid-xantátokat képezve feloldják a növényi sejtfalat. A xantát-képző vegyületek aminokkal való reakcióját is leírjuk. A xantát-képző vegyületek a fentieken kívül a fémionokat is megköthetik, miáltal gátolják a DN-áz aktivitást. Ezek eredményeként a xantát-képző vegyületek képesek s sejtorganellumok közül szelektíven oldani a DNS-t, miközben a szennyező proteinek, fémionok és egyéb vegyületek oldhatatlan anyagként maradnak vissza. A DNS ezután a felülűszóból csapható ki.

Ugyanezen xantát-képző vegyületek hatásosan alkalmazhatók a DNS állati sejtekből és szövetekből történő kivonására. Az izolált DNS mentes a restrikciós enzimes emésztést akadályozó szennyezésektől.

A találmány szerinti xantát-képző vegyületek közé olyan vegyületek tartoznak, amelyek a növényi sejtek sejtfalát képező poliszacharidokkal reakciótermékek xantát

kialakítására képesek. Ezen vegyületek közé Jellemzően a széndiszulfid és bázisos. szerves származékai tartoznak. Miközben e reakció ipari méretű alkalmazásához (viszkóz műselyem eljárás) használt álalános reagens a széndiszulfid a DNS találmányunk szerinti analitikai izolálásához a széndiszulfid bázisos, szerves származékai az előnyben részesítettek. A széndiszulfid bázisos, szerves származékai kifejezésen az (I) álalános képlet szerinti vegyületeket értjük, melyben R jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil-, alkenil- vagy aralkilcsoport, előnyösen metil-, etil-, propil-, butil-, hexil-, izoamil-. vinil-, allil-, 2,3-dihidroxi-propil-, fenil-etil-, 4morfolinil-metil- és hidroxi-fenil-etilcsoport: illetve M jelentése alkálifém vagy NH₄. előnyösen nátrium vagy kálium. E vegyületeket széndiszulfid megfelelő lúggal és alkohollal végzett reakciójával állítjuk elő:

CSz + MOH + ROH

ROC(S)SM + HsO

E vegyületek közül a legelőnyösebb, a ditio-karbonsav-oetil-észter nátrium sója (nátrium-etil-xantogenát: R = CsHs, M = Na) standart módszerekkel állítható elő, s kálium analógja a Fluka-tól vásárolható meg. A találmányban alkalmazható vegyületek teljes csoportja (beleértve a szén-diszulfidőt is) a (II) képlettel ábrázolható, melyben n = 0 v. 1; R jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált alkil-, alkenil- vagy aralkilcsoport, előnyösen metil-, etil-, propil-, butil-, hexil-, izoamil-. vinil-, allil-,

2,3-dihidroxi-propil-, fenil-etil-. 4- morfolinil-metil- és ***ΐ ·’ »· .· * · * · ♦ · . ·. .··. : : ,· ·· «· ·· ····

- 6 hidroxi-fenil-etilcsoport: illetve amennyiben n = 1, M jelentése alkálifém vagy NH4. előnyösen nátrium vagy kálium, amennyiben η = 0, M jelentése egy második kötés a szén- és a kénatom között.

A találmányban leírt, a fenti vegyületeket alkalmazó eljárásokkal a DNS izolálása a szövetek homogenizálása és a proteinek eltávolítása nélkül válik lehetővé.

1. példa

Szővetaprításos eljárás

Harminc napos kukoricapalántákból származó friss levélanyagot (0,6-0,63 g) folyékony nitrogén fürdőben nagyon törékeny állapot eléréséig fagyasztottunk, s a fagyott anyagot üveghomogenizátorban finom porrá őröltük. A port 15 ml-es propilén csőben puffereit extraháló reagensben (694 mM ditio-karbonsav-o-etil-észter nátrium-só, 100 mM Tris, pH =

7,5, 700 mM NaCl oldat, 10 mM EDTA, pH = 8; vagy 625 mM ditio-karbonsav-o-etil-észter kálium-só, 100 mM Tris, pH =

7,5, 700 mM NaCl oldat, 10 mM EDTA) oldottuk fel. 65^cC-on 5 perces inkubálás után a levéltörmeléket Miracloth filteren végzett szűréssel távolítottuk el. A szürletből a DNS-t kétszeres térfogat etanol hozzáadásával csaptuk ki, s 4 °Con 10 percig 3 K-val centrifugáltuk.

A pelletet 100 μΐ TE-ben szuszpendáltuk, és a fentiek szerint 3 percig centrifugáltuk, hogy eltávolítsuk a ···· • · · · SÍ.· ·· ·® .· ····

- 7 kicsapódott proteineket és fém-xantátokat. A felülúszót 1,5 ml-es Eppendorf-csóbe töltöttük, s 5 percig centrifugáltuk.

A DNS-t 2M ammónium-acetáttal kezelve és kétszeres térfogat etanol hozzáadásával a felülúszóból ismét kicsaptuk. A DNS-t 735 g-vel 5 percig végzett centrifugálással pelleteztük. A felülúszó dekantálása után a pelletet vákumban szárítottuk, és 100 μΐ TE pufferben oldottuk. Az izolált DNS mennyisége 20-40 pg volt.

2. példa

Szövetaprítás nélküli eljárás g friss levelet 65 ’C-on, ditio-karbonsav-o-etil-észter nátrium-sóját tartalmazó 4 ml extraháló pufferben 20 percig inkubáltunk, majd az anyagot leszűrtük. A DNS-t kicsaptuk a szűrletből, s az 1. példában leírtak szerint ismételt kicsapást végeztünk. Ezzel az eljárással a kukorica esetében g levélszövetből 2,56-6,68 pg DNS-t vontunk ki.

3. példa

Az 1. és 2. példában leírt eljárások értékelése érdekében az izolált DNS-t 6 órán keresztül BamHI, HindlII, AcoRI és SstI restrikciós enzimekkel emésztettük, s agaróz gélelektroforézissel vizsgáltuk. Az emésztetlen DNS látszólagos molekulatömege a 23 kD-os lambda markerénél nagyobb volt. A nagy molekulatömegü DNS hiányából, és az emésztett minták elektroforézisével kapott foltok

- 8 jelenlétéből arra következtethetünk, hogy a DNS emésztése teljes volt, és a DNS minta a restrikciós enzimes emésztést akadályozó szennyezőanyagoktól mentes volt.

4. példa

A DNS-készítmények minőségét Southern-lenyomat kísérletekkel tovább vizsgáltuk. Az izolált DNS-t BamHI enzimmel emésztettük, elektroforizáltuk, MSI membránra vittük, s ³²P-izotóppal jelölt egyszálú próbákkal hibridizáltuk.

Az emésztetlen és emésztett DNS a várt hibridizációs eredményeket adta. Az emésztett mintákban a különálló sávok megjelenése megerősítette, hogy az enzim teljesen megemésztette a DNS-t. s hogy a próbával végzett hibridizálás sikeres volt. Ez a DNS minőségét illetően fontos kitétel.

5. példa

Az izolált DNS molekuláris biológiai alkalmazásokhoz való minőségének további igazolása érdekében a kivont DNS-t polimeráz láncreakcióval (PCR) vizsgáltuk. Izolálás után a DNS-t amplifikáltuk, s a termékeket agarózgélen futtattuk. Kontroll kísérletet is végeztünk, melyben a PCR-hez templát DNS-t nem alkalmaztunk. A kontroll mintában a várt sáv hiánya, és a fentebb leírt eljárások szerint kivont DNS mintában mutatott jelenléte tovább bizonyította a DNS • · · · · • · · · · « *·» ·· ···· megfelelő minőségét.

6. példa

A találmány szerinti DNS kivonási eljárás kitermelését és hatékonyságát szövetapritásos eljárással teszteltük. A homogenizálás előtt a levélmintához ismert mennyiségű (20 pg) DNS-t adtunk, s a fentebb leírtakkal megegyező lépések elvégzésével legalább 81 % DNS-t kaptunk. Ebből arra következtethetünk, hogy az enzimatikus, illetve mechanikus lebomlásból eredő DNS veszteség minimális volt.

7-12. példa

Amint azt agaróz gélelektroforézissel és Southern lenyomatokkal meghatároztuk, a szövetapritásos eljárást DNS 30 napos szójabab, cirok, napraforgó, lucerna és dohánypalántákból történő kivonásához is sikeresen alkalmaztuk. Az eredményeket az I. táblázatban mutatjuk be.

• · · ·

-ΙΟΙ . táblázat

Pld.	Növény	Hozam¹	Kiváló DNS minőség²	Southern-blot
6.	Lucerna	15-42	igen	működik
8.	Canola	8-14	igen
9.	Cirok	12-28	igen	működik
10.	Szójabab	26-37	igen	működik
11.	Napraforgó	7-30	igen
12.	Dohány	7-30	igen

¹ pg/600-630 mg friss levél ² a DNS-t a BamHI teljesen megemészti

13-24. példa

A találmány szerinti két eljárás (apritásos és aprítás nélküli) sokoldalúságát lucernán, árpán, Canola-n, cirokon, szójababon, napraforgón, dohányon, búzán. petúnián, spenóton, élesztőn és E. coli-n is összehasonlítottuk. Az élesztő és az E. coli esetében az apritásos eljárásban kihagytuk a homogenizálást. A II. táblázatban a kivont DNS mennyiségeket mutatjuk be.

• ·

- 11 II. táblázat

Pld.	Növény	Hozam¹ apritásos módszer	Hozam² aprítás nélküli módsz.
13.	Lucerna	15-42	1,50-2,80
14.	Canola	8-14	2,70-4,80
15.	Cirok	12-28	1,70-2,66
16.	Szójabab	26-37	0,45-1,14
17.	Napraforgó	7-30	0,13-1,34
18.	Dohány	7-30	1,00-3,74
19.	Petúnia	11-19	2,07-2,27
20.	Saláta	18-43	1,63-2,17³
21.	Búza	7-38	1.12-4,27
22.	E. coli	50	22-25

Eltérő sorozat:

23.	Spenót	20,64	1,4346
24.	Élesztő	1,239	2,369

¹ pg/600-630 mg friss szövet ² pg DNS/1 g friss szövet ³ pg DNS/2 g (piacon vásárolt) saláta

25—26. példa

A találmány szerinti eljárást sikeresen alkalmaztuk DNS Celosia (25. példa) és Alyssum (26. példa) növényekből történő izolálásához is.

• ·

- 12 Az szövetaprítás a DNS izolálás, nélküli eljárás egyszerűsége lehetővé teszi és a DNS izolálást igénylő, nem szakemberek által végzett analitikai és diagnosztikai eljárások szántóföldi alkalmazásának automatizálását. A találmány szerinti szővetaprításos eljárást széles körű alkalmazhatósága a növényi sejtekből történő DNS izolálás lehetséges, általános módszerévé teszi. A DNS kivonási kísérleteket különböző pH-értékeken, különböző koncentrációjú szubsztrátok, és különböző mennyiségű és koncentrációjú puffer alkalmazásával végeztük.

A szövetaprítás nélküli eljárással (2 ml puffer/reagens alkalmazásával) a lucerna, a kukorica, a cirok és a saláta esetében magas hozammal kiváló minőségű DNS-t nyertünk. Másrészt, a szójababból, napraforgóból és búzából etilxantogenát alkalmazásával végzett izoláláshoz kétszer annyi reagensre volt szükség, hogy tiszta DNS-t nyerjünk. A Canola, dohány és petúnia esetében az inkubálás előtti enyhe homogenizálás a DNS jobb minőségét és kitermelését segítette elő. Látható, hogy a találmány szerinti eljárások számos specifikus megvalósítási módja alkalmassá tehető a szóban forgó, specifikus in vivő és in vitro rendszerekben való alkalmazáshoz.

27-28. példa

A találmány szerinti eljárást sikeresen alkalmaztuk DNS állati szövetből történő izolálásához is. Hozzávetőleg 1,0 g • · ·

- 13 tömegű felolvasztott, lecsöpögtetett csirkemáj mintát mozsárban mozsártörcvel szétdörzsöltünk. A mozsárba hozzávetőleg 5 ml friss, puffereit extraháló reagenst (624 mM kálium-etil-xantogenát; 100 mM Tris, pH = 7,5; 700 mM NaCl; 10 mM EDTA) öntöttünk, s az elegyet addig dörzsöltük, míg megfelelően sima, sűrű szuszpenziót nem kaptunk. A szuszpenziót 15 ml-es steril polipropilén csőbe töltöttük, s 65 °C-on 15 percig inkubáltuk. A csöveket szobahőmérsékletre hűtöttük, majd 14460 g-vel 15 percig centrifugáltuk.

Mindegyik cső felülúszóját újabb polipropilén csövekben egyenlő térfogatú, hideg izopropanollal precipitáltuk. A csöveket -20 ’C-on 15 percig inkubáltuk. A rózsaszín pelleteket etanollal öblítettük, szobahőmérsékleten szárítottuk, és 300 μΐ steril desztillált vízben reszuszpendáltuk.

A találmány szerinti eljárás alkalmazásával 1,0 g máj szövetből 150-159 »?g DNS-t nyertünk ki. Ezzel szemben, a jól ismert CTAB eljárással (Saghai-Maroof és mtsi, PNAS, 81. 8014-8018, 1984) ugyanezen máj szövet 1,0 g mintájából a kivont DNS mennyiség 74-88 ijg volt.

A találmány szerinti eljárást a Bethel Laboratories-tól kapott, EDTA-val kezelt nyúlvérhez is alkalmaztuk. Egyenként hozzávetőleg 10 ml vérmintát 15 ml-es polipropilén csövekbe helyeztünk, s a csöveket 14460 g-vel 20 percig centrifugáltuk. A sejt pelleteket nem dörzsöltük szét és nem vortexeztük. A pelleteket kicsepegtettük, s 3 ml puffereit ex'sraháló reagensben (624 mM kálium-etil-xantogenát; 100 mM Tris, pH = 7,5; 700 mM NaCl; 10 mM EDTA) reszuszpendáltuk. A csöveket 15 percig 65 ’C-on inkubáltuk, majd szobahőmérsékletre hütöttük. A DNS izolálás további lépéseit a fentebb a máj esetében leírtak szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy az eljárás végén kapott DNS pelletet 100 pl steril desztillált vízben reszuszpendáltuk.

A találmány szerinti eljárás alkalmazásával 10 ml vérmintából 28-30 17g DNS-t vontunk ki. Ezzel szemben, a CTAB eljárás alkalmazásával ugyanezen vér 10 ml-es mintáiból kivont DNS mennyisége 24-27 qg volt.

A májszövetből és nyúlvérből a találmány szerinti és a CTAB eljárással izolált DNS értékeléséhez és összehasonlításához a DNS mintákat egy éjszakán keresztül EcoRI enzimmel emésztettük, s agaróz gélelektroforézissel vizsgáltuk. A CTAB, illetve a találmány szerinti eljárás alkalmazásával izolált emésztetlen kontroll DNS minták ée emésztett DNS minták egyaránt egyenértékűek voltak. Mindkét eljárás

alkalmazásával	izolált DNS minta gélelektroforetikus
vizsgálatával	tapasztaltunk foltot, ami arra enged
következtetni,	hogy a DNS teljesen megemésztődött, s mentes

volt a restrikciós enzimes emésztést akadályozó szennyezésektől.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás DNS állati sejtekből vagy szövetekből történő izolálására, azzal jellemezve, hogy az említett sejteket vagy szöveteket xantát-képző vegyületet vagy vegyületeket tartalmazó vizes oldattal hozzuk érintkezésbe. és a sejtekből izoláljuk a DNS-t.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett xantát-képző vegyületként vagy vegyületekként a (II) képlet szerinti vegyületet alkalmazzuk, melyben η = 1 vagy 2; R jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált, kis szénatomszámú alkil-, kis szénatomszámú alkenil- vagy aralkilcsoport: M jelentése, amennyiben n = 1, alkálifém-vagy ammóniumion, amennyiben n = 0, kén-szén kötés.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) képlet szerinti vegyületként olyan vegyületet alkalmazunk, melyben n = 1, R jelentése szubsztituálatlan vagy szubsztituált, kis szénatomszámú alkilcsoport, M jelentése pedig nátrium vagy kálium.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) képlet szerinti vegyületként olyan vegyületet alkalmazunk, melyben R Jelentése metil-, etil-, propil-, butil-, hexil-, izoamil- vagy 2,3-dihidroxi-propilcsoport.

• ·
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) képlet szerinti xantát-képző vegyületként vagy vegyületekként az etil-xantogenát nátrium- vagy kálium-sóját alkalmazzuk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként az oldatból centrifugálással eltávolítjuk a sejttörmeléket.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként a centrifugált oldatból etanollal kicsapjuk a DNS-t.